KR20120097841A

KR20120097841A - 알긴산 분해 미생물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20120097841A
Application number: KR1020110017318A
Authority: KR
Inventors: 정승기; 방영배; 김두운; 이중헌; 이창국
Original assignee: 주식회사 바이오리쏘스
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2011-02-25
Publication date: 2012-09-05
Also published as: KR101248191B1

Abstract

알긴산 분해능을 갖는 미생물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

알긴산 분해 미생물 및 그의 용도{Microorganisms capable of lysing alginate and use thereof}

본 발명은 한국산업기술평가원의 지역산업기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다.

[과제고유번호: 70004662, 과제명: 고기능성 나노 생촉매 기술을 활용한 저분자 알긴산 올리고당 식품 소재 개발]

본 발명은 알긴산 분해능을 갖는 미생물 및 그의 용도에 관한 것이다.

알긴산은 해조 다당류의 일종이고, β-1,4결합의 D-만누론산과 α-1,4결합의 L-글루론산이 연결된 사슬구조를 갖는다. 알긴산은 점성으로 인해 식품첨가제, 유화제 등에 이용되며, 섬유화하여 수술용 실로도 이용되고 있다. 현재 가장 많이 활용되는 알긴산의 형태는 알긴산의 나트륨염으로서 물에 가용성이며 점성, 겔화성, 수화성, 보수성, Ca² ⁺과 같은 금속이온과의 반응성, 결착성, 필름형성 등과 같은 특성을 지니고 있어, 아이스크림, 시럽, 수우프, 젤리, 푸딩, 잼, 어육 연제품, 등에 널리 이용되며, 식품 산업에서뿐만 아니라 의약 산업에서도 널리 이용되고 있다. 일반적으로 시판되는 수용성 알긴산은 상온에서 용해시키는데 많은 시간이 소요되고, 알코올류가 포함되어 있는 용매에는 잘 용해되지 않으며, 침전을 일으키는 특성이 있다. 또한 알긴산의 농도가 높아짐에 따라 강한 점성을 갖게 되며, 특히 액상 식품의 경우는 0.5% 이상의 농도로 첨가되면 식품 고유의 특성을 잃게 하는 단점을 가져서 사용에 큰 제한을 받는다. 이를 극복하기 위해 알긴산은 저분자화된 알긴산의 형태로 제조되어 이용되고 있다. 생체이용률의 측면에서도, 포유동물은 알긴산 분해효소를 갖지 않기 때문에 알긴산은 그 자체로 이용될 수 없고, 생체에서 이용될 수 있도록 알긴산의 중합도를 낮추기 위해 저분자화되어야 한다. 저분자 알긴산, 또는 알긴산 올리고당은 지방축적 억제 및 지방대사 촉진에 의한 항비만 효과 및 IL-6, TNF-α와 같은 사이토카인의 분비 촉진을 통한 면역기능강화 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.

현재, 알긴산은 주로 산 가수분해법에 의해 저분자 알긴산이나 알긴산 올리고당으로 전환된다. 그러나, 산에 의한 저분자 알긴산 또는 알긴산 올리고당의 제조방법은 공정상 과도한 산 처리 때문에 내산성 장치가 요구되고 폐기되는 강산을 중화시켜 배출해야하기 때문에 다량의 알칼리가 소요되므로 공정비용 및 환경오염 등의 문제점을 갖는다. 향후 식품생명공학 산업발전, 기능성 식품제품 개발 및 품질향상, 해조 다당류 분해공정개발 등을 위해서는 환경친화적인 알긴산 올리고당의 제조 방법이 요구되며, 이를 위해서 알긴산 분해능을 갖는 미생물 및 그로부터 분리된 알긴산 분해 효소의 개발이 해결안을 제시할 수 있다. 현재 일부 알긴산 분해효소를 생산하는 미생물이 알려져 있으나, 식품이나 의약품의 제조에 보다 효율적으로 이용될 수 있는 새로운 미생물 및 알긴산 분해 효소에 대한 요구가 여전히 존재한다.

이에, 본 발명자들은 알긴산 분해효소(alginate lyase)를 생산하며, 식품 가공 등에 안전하게 이용될 수 있는 미생물에 대한 연구를 수행하여, 우수한 특성을 갖는 신규한 미생물을 분리하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 알긴산 분해능을 갖는 신규한 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알긴산 분해능을 갖는 미생물의 배양에 의해 제조된 저분자화 알긴산의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 알긴산 분해 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 해수로부터 알긴산 분해효소 활성의 존재 여부에 의해 분리되었고, 바실러스 종 미생물의 형태학적 및 생리학적 특성을 보이며, 서열번호 1의 16s rRNA를 가졌다. NCBI BLAST 검색 결과, 상기 서열은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) LL3과 98%의 서열 일치를 보였으며, 이에 의해 상기 미생물을 신규한 바실러스 서브틸리스로 확인하였다. 상기 미생물을 부다페스트 조약 하에 한국생명공학연구원 미생물지원센터의 생물자원(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2011년 2월 23일자로 수탁번호 KCTC11872로 기탁하였다.

바실러스 서브틸리스는 청국장이나 낫도와 같은 발효 식품의 제조에서 이용되는 미생물로서 식용이 가능하고 식품이나 의약품의 용도에서 배양물로부터의 알긴산 올리고당의 별도의 분리나 정제 없이 배양물 자체로 이용가능하다는 장점을 갖는다. 알긴산 분해효소를 생성하는 많은 미생물들이 알려져 있지만 그 대부분은 해양 유래 박테리아이다(R.S. Doubet et al., Appl. Environ. Microbiol. 1982, 44:754-756 and V. L. von Riesen. Appl. Environ. Microbiol. 1980, 39:92-96). 알긴산 분해효소를 생성하는 토양 유래 박테리아로는 클렙시엘라 에어로게네스(Klebsiella aerogenes) (J. Boyd et al., Carbohydrate Res. 1977, 57:163-171), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)(J.B. Hansen et al., Appl. Environ. Microbiol. 1984, 47:704-709), 플라보박테리움 종(Flavobacterium sp .) 등이 있다. 그러나, 종래에 밝혀진 미생물은 모두 식용가능하지 않으며, 이들을 이용하여 최종 생성물로 저분자 알긴산을 얻기 위해서는 열을 가하여 미생물을 사멸시키거나, 또는 미생물로부터 알긴산 분해효소를 정제하고, 정제된 알긴산 분해 효소에 의한 알긴산의 처리 후 저분자 알긴산을 별도로 추출하고 정제하는 과정을 거쳐야 한다. 또한, 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)(미국특허 제5139945호)가 알긴산 분해효소를 갖는 것으로 보고되었으나, 이 균주는 최적 생장 pH가 5.7로서 알긴산의 최적 용해 pH인 7 내지 8과 크게 다르므로 배양배지 중에 알긴산을 포함시켜 저분자 알긴산을 생산하기에 적합하지 않을 수 있다. 반면에, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 알긴산 분해효소는 pH 7 내지 8에서 높은 활성을 가지며, 식용이 가능하다는 점에서 기존의 알긴산 분해 미생물에 비해 저분자 알긴산이나 알긴산 올리고당의 제조에 매우 적합하다.

상기 바실러스 서브틸리스 KCTC11872로부터 분리된 알긴산 분해효소는 약 40 kDa의 분자량을 가지며, pH 7.5 내지 8.2, 35 내지 50℃의 온도와 Fe² ⁺ 및 Mg² ⁺ 이온의 존재시 최적의 활성을 갖는다. 이와 같은 최적 활성 조건은 바실러스 서브틸리스의 포자형성능과 함께 조합되어 식품이나 의약품 가공시 유리하게 이용될 수 있다. 25 내지 30℃에서 최적의 활성을 가지며, 고온에서 활성이 저하되는 기존의 대부분의 알긴산 분해효소에 비해 고온에서의 높은 활성 유지는 식품이나 의약품 가공 공정 및 제조된 제품에서도 유리하게 이용될 수 있다. 예를 들면, 알긴산 올리고당이 도포된 기능성 쌀의 제조에서 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 알긴산에 의한 배양물이 쌀에 도포되는 경우, 쌀을 이용한 밥의 제조시에도 알긴산 분해효소의 활성은 포자 상태나 효소 상태로 유지되어 알긴산 올리고당의 함량을 높이는데 기여할 수 있다. 다양한 가공 조건 하에서 알긴산 분해효소의 활성을 유지할 수 있다는 것은 큰 장점이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 알긴산을 포함하는 배지에서 배양하여 저분자 알긴산을 포함하는 배양물을 제조하는 단계, 및

상기 배양물을 첨가하는 단계를 포함하는, 저분자 알긴산을 포함하는 식품을 제조하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 알긴산은 β(1→4)-D-만누론산과 α(1→4)-L-글루론산 잔기로 구성된 직쇄형의 우론산 중합체로 화학식은 (C₆H₈O)n이며 대표적 분자량은 20,000-240,000인 다당류를 의미한다.

본 명세서에서 저분자 알긴산 또는 알긴산 올리고당은 고분자의 알긴산을 분해하여 저분자량화하거나 (C₆H₈O)의 반복 단위의 갯수가 10개 이하로 감소된 알긴산을 의미한다. 알긴산 올리고당은 면역활성 증강효과 및 비만억제 효과를 가지며, 따라서, 기능성 식품이나 의약품의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 저분자 알긴산을 포함하는 식품을 제조하는 방법은 바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 알긴산을 포함하는 배지에서 배양하여 저분자 알긴산을 포함하는 배양물을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 배지는 1% 알긴산나트륨, 0.1% 중탄산나트륨, 0.02% 황산마그네슘, 0.001% 황산철, 및 0.3% 펩톤을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 미생물의 배양에 적합한 배지를 용이하게 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 배양은 30 내지 45℃, 50 내지 100cc/분 공기유입량, 및 pH 7 내지 8에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자는 배양 조건을 적절하게 조정할 수 있다.

본 발명에 따른 저분자 알긴산을 포함하는 식품을 제조하는 방법은 상기 배양물을 첨가하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 배양물은 알긴산을 포함하는 배지에서 배양된 배양물 자체이거나 또는 원심분리 등에 의해 균주를 분리한 후 수득된 상등액일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 배양물을 첨가하는 단계는 상기 배양물을 쌀에 도포하는 단계를 포함하고, 상기 저분자 알긴산을 포함하는 식품은 저분자 알긴산이 도포된 백미 또는 현미일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 저분자 알긴산을 포함하는 식품은 알긴산 올리고당이 함유된 어류, 육류, 곡류, 음료, 초콜렛, 스낵, 과자, 라면, 기타 면류, 껌, 아이스크림, 비타민 복합체, 발효식품일 수 있다.

본 발명에 따른 저분자 알긴산을 포함하는 식품을 제조하는 방법은 바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 알긴산을 포함하는 배지에서 배양하여 수득된 저분자 알긴산을 포함하는 배양물을 약제학적 조성물에 첨가하는 것에 의해 의약품의 제조에도 활용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 알긴산을 이용한 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 배양물을 포함하는 기능성 식품을 제공한다.

본 명세서에서, "알긴산을 이용한 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 배양물"은 바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 알긴산을 포함하는 배지 중에서 배양하여 생성된 저분자 알긴산 또는 알긴산 올리고당을 포함하는 배양물을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 기능성 식품은 어류, 육류, 곡류, 음료, 초콜렛, 스낵류, 과자류, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합체, 발효식품 등의 형태일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "기능성 식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"은 인체의 구조 및 기능에 대해 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 기능성 식품은 식품 제조에서 허용가능한 통상적인 식품 첨가제, 예를 들면, 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 알긴산을 이용한 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 배양물을 포함하는 비만치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 알긴산을 포함하는 배지에서 배양하여 수득된 배양물은 저분자 알긴산 또는 알긴산 올리고당을 포함하며, 이 올리고당은 지방축적 억제 및 지방분해 촉진 효과를 가지므로 비만치료용 조성물에서 유효성분으로 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 비만치료용 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰오로스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테라에리트 및 광물유를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 통상의 방법에 따라 정제, 캡슐, 과립제, 현탁액, 시럽 등의 다양한 제형으로 제형화되어 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 알긴산 분해능을 갖는 미생물은 알긴산의 효소에 의한 분해를 통해 저분자 알긴산을 효율적으로 및 친환경적으로 제조할 수 있게 한다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 알긴산 분해능을 갖는 미생물의 알긴산을 이용한 배양물은 저분자 알긴산을 포함하는 식품이나 의약품의 제조에서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC11872로부터 정제된 알긴산 분해효소의 pH에 따른 상대적 활성을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC11872로부터 정제된 알긴산 분해효소의 온도에 따른 상대적 활성을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC11872로부터 정제된 알긴산 분해효소의 활성의 이온 의존도를 나타낸다.
도 4는 다시마 추출 알긴산에 발명의 일 구체예에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC11872 및 다른 표준 균주 배양액의 원심분리 후 수득된 상등액을 각각 처리한 후 알긴산 올리고당의 생성을 확인하는 TLC 사진이다. 사진의 가장 좌측은 크기 마커이고, 그로부터 순서대로 다시마추출 알긴산 + 바실러스 서브틸리스 KCTC11872, 다시마추출 알긴산, 다시마추출 알긴산 + 바실러스 서브틸리스 ACTC9372, 다시마추출 알긴산 + 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) KCTC1660, 및 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) ATCC27811을 나타낸다.
도 5는 발명의 일 구체예에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC11872 배양액을 쌀에 분무하여 수득된 저분자 알긴산 함유 쌀의 투여에 의한 인 비보 항 비만 효과를 보여준다.

실시예 1. 알긴산 분해 미생물의 분리 및 동정

1-1. 분리

알긴산을 분해할 수 있는 미생물을 분리하기 위해 해수, 미역 또는 다시마와 같은 해초의 병반, 또는 전복의 소화기관을 시료로 채취하였다. 채취된 시료를 Zobell's 2216e 배지(육류 추출물, 10 g; 펩톤, 10 g; 해수, 750 ml; 수돗물, 250 ml; 및 아가 20g)에 도말하여 미생물을 분리하였다. 그 후, 알긴산 분해 효소를 생산하는 미생물을 분리하기 위해, Zobell's 2216e 배지에 1.5%의 알기네이트를 첨가하여 제조된 상층 배지에 시료로부터 분리된 미생물을 접종하였다. 알긴산의 분해에 의해 그 주변이 투명하게 된 콜로니를 분리하고 이를 알긴산 분해효소를 생산하여 알긴산 분해능을 갖는 미생물로 선별하였다.

1-2. 균주의 동정

알긴산 분해능에 의해 1-1에서 선별된 미생물을 동정하기 위해 형태적 특징, 배양 특성 및 생리학적 특성을 파악하였다. 상기 분리된 미생물은 그람 양성균으로서 호기성이며 내생포자를 형성하는 것으로 확인되었다. 또한, API 20ne, API 50CH, API ZYM 키트(bioMerieux) 및 GN2 MicroPlate(Biolog)를 이용하여 탄소원 이용 및 효소 활성을 조사하여 하기 표 1과 같은 결과를 얻었다.

반응/효소	선별된 균주	반응/효소	선별된 균주
시트레이트 이용	+	트립신	약함
아세톤 생산	+	α-키모트립신	-
젤라티나아제	+	산 포스파타아제	-
질산염의 아질산염으로의 환원	+	나트톨-AS-BI-포스포히드롤라아제	약함
β-글루코시다아제	+	리파아제(C14)	-
프로테아제	+	시스틴 아릴아미다아제	-
β-갈락토시다아제	+	β-갈락토시다아제	-
알칼리 포스파타아제	+	β-글루큐로니다아제	-
에스테라아제 (C4)	-	β-글루코시다아제	+
에스테라아제 리파아제(C8)	+	N-아세틸-β-글루코사미니다아제	-
루이신 아릴아미다아제	약함	α-만노시다아제	-
발린 아릴아미다아제	-	α-퓨코시다아제	-

분리된 미생물의 정확한 동정을 위해 계통분류학적 분석 및 서열비교 분석을 통해 16s rRNA가 서열번호 1의 서열을 가지며 바실러스 서브틸리스 LL3과 98%의 서열 일치를 갖는다는 것을 확인했다. 이에 의해, 해수로부터 분리된 알긴산 분해능을 갖는 신규한 균주를 바실러스 서브틸리스 BR-AL YoungBae로 명명하였다.

상기 미생물을 신규한 바실러스 서브틸리스로 확인되고, 부다페스트 조약 하에 한국생명공학연구원 미생물지원센터의 생물자원(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2011년 2월 23일자로 수탁번호 KCTC11872로 기탁하였다.

실시예 2. 알긴산 분해효소의 정제 및 반응조건 최적화

2-1. 알긴산 분해 효소의 정제

바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 알긴산 분해 효소를 정제하기 위해 바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 1% 알긴산 나트륨, 0.1% 중탄산나트륨, 0.02% 황산마그네슘, 0.001% 황산철, 0.3% 펩톤을 포함하는 배지(pH 8.0) 중에서 37℃에서 48시간 동안 배양하여 수득된 배양액을 4℃에서 12,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 수득된 상등액으로부터 황산암모늄 70% 포화 농도의 분획을 얻었다. 상기 분획을 투석막(MWCO 10kDa)에 넣어 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0)에 대하여 투석시키고, 원심분리 (8,000×g, 20분)하여 상등액을 취하였다. 상기 상등액을 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0)으로 평형화시킨 SP-Sepharose, Q-Sepharose, 또는 Sephacryl S-200을 충전시킨 컬럼에서 분리하고 TSK-GEL DEAE-2SW,4.6mm x 25cm)컬럼이 장착된 Shimadzu LC-20AT HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 정제하여, 알긴산 분해 효소 활성을 갖는 분획을 분리하였다. 각 분획의 알긴산 분해 효소 활성은 시료 1 ml (0.2 M Tris-HCl, pH 7.0)에 1% 알기네이트 용액 250 ㎕를 첨가하고 45℃에서 30분간 반응시킨 후 아세톤을 1 ml 가하여 원심분리 후 상등액 1 ml을 취하여 DNS법에 의해 환원당을 정량하여 측정하였다. 알긴산 분해 효소를 포함하는 것으로부터 확인된 분획으로부터 분리된 알긴산 분해 효소를 SDS-PAGE/active staining에 의해 분자량이 40 kDa인 것으로 확인하였다.

2-2. 알긴산 분해 반응의 최적 조건

2-1에서 분리 정제된 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 알긴산 분해 효소의 최적 반응 조건을 확인하였다.

최적 pH를 결정하기 위해 0.1 M 소디움 아세테이트 (pH 4.0-5.0), 0.1 M 소디움 포스페이트 (pH 6.0-7.0), 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0-9.0) 및 0.1 M 소디움 카보네이트 (pH 10.0-11.0) 완충액에 0.5%의 소디움 알기네이트를 용해시켜 0.5% 소디움 알기네이트 용액을 제조하였다. 그 후, 상기 2-1에서 정제 후 동결건조시킨 알긴산 분해효소를 완충액 중에 10 mg/ml로 조제한 후, 1ml를 상기 용액 9 ml에 첨가하였다. 그 후, 45℃에서 30분간 반응시킨 후 유리된 환원당을 DNS법으로 측정하였다. 도 1은 pH의 변화에 따른 알긴산 분해 효소의 상대적 활성을 보여준다. 도 1에 따르면, 바실러스 서브틸리스 KCTC11872로부터 분리된 알긴산 분해 효소의 최적 pH는 pH 7.5 내지 8.2이다.

또한, 최적 온도를 결정하기 위해, 최적 pH로 결정된 pH에서 반응 온도를 20 내지 70℃로 변화시키면서 전술된 바와 같이 알긴산 분해 효소의 활성을 측정하여 도 2와 같은 반응 온도에 따른 알긴산 분해 효소의 상대적 활성의 그래프를 작성하였다. 도 2에 따르면, 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 알긴산 분해 효소의 최적 온도는 38 내지 52℃였다. 이는 대부분의 알긴산 분해 효소의 최적 온도에 비해 높은 것으로 가공 식품에 적용하기에 유리할 수 있다.

알긴산 분해효소의 반응을 위해 요구되는 이온을 확인하기 위해, 이온을 포함하지 않는 대조군 대비, MgSO₄, FeSO₄, CuCl₂, MnCl₂, NaCl, KCl, MgCl₂, CoCl₂, 및 CaCl₂의 존재 하에 알긴산 분해 효소에 의한 반응을 전술된 바와 같이 수행하고, 그 활성을 측정하였다. 도 3은 바실러스 서브틸리스 KCTC11872로부터 분리된 알긴산 분해효소의 이온 의존성을 보여준다. 이에 따르면, 상기 알긴산 분해 효소는 Fe와 Mg 이온 의존성을 갖는다.

실시예 3. 바실러스 서브틸리스 KCTC11872 배양액의 이용

3-1. 저분자 알긴산 생산

바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 이용하여 알긴산으로부터 저분자 알긴산, 즉 알긴산 올리고당을 제조할 수 있다.

다시마 1kg을 믹서로 갈아 100 메쉬 크기로 세절한 후 약 1L의 0.4% HCl 용액에 넣었다. 40℃에서 1 시간 온침하고 여과시킨 후 수세하였다. 여기에 다시 1L의 0.4% NaOH 용액을 가하고, 60℃이상에서 2~3 시간 교반하면서 용해시켜 알긴산 염의 농도를 0.1%가 되도록 물로 희석시키고 거즈로 여과시켰다. 0.1%로 희석시킨 알긴산 염의 용액에 바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 1% 알긴산나트륨, 0.1% 중탄산나트륨, 0.02% 황산마그네슘 , 0.001% 황산철, 0.3% 펩톤의 배지에서 pH8.0, 37℃에서 120시간 동안 배양한 배양액을 8000 rpm으로 30분간 원심분리하여 얻은 상등액을 첨가하고 37℃에서 인큐베이션하면서 시간별로 생성된 알긴산 올리고당을 TLC에서 확인하였다. TLC의 표준 마커로 수크로오스 및 말토덱스트린을 사용하였고, 전개용매는 1-프로판올, 니트로메탄 및 물의 혼합액(5:3:2, v/v/v)이었다. 확인 결과, 48시간 처리까지는 2량체 내지 9량체까지의 알기네이트 올리고당이 생성되며, 72시간째에는 주로 2량체 당 단위로 분해되는 것으로 확인하였다. 도 4는 다시마 추출 알긴산에 바실러스 서브틸리스 KCTC11872 및 다른 표준 균주의 배양액의 원심분리 후 수득된 상등액을 처리한 후 알긴산 올리고당의 생성을 확인하는 TLC 사진이다. 다른 균주 대비, 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 배양액으로부터 수득된 상등액에 의한 저분자 알긴산의 생성을 보여준다.

3-2. 저분자 알긴산을 함유한 식품 및 항비만 효과

(1) 기능성 쌀의 제조

0.1%의 NaHCO₃에 다시마 1kg을 넣고 믹서로 분쇄하였다. 40℃에서 1 시간 온침하고 교반하면서 용출시켜 용출된 알긴산에 바실러스 서브틸리스 KCTC11872 배양액을 첨가하여 37℃에서 48시간 동안 처리 후 생성된 알긴산 올리고당을 TLC로 확인하였다. TLC의 표준 마커로 수크로오스 및 말토덱스트린(D.E 7 내지 9)을 사용하였고, 전개용매는 1-프로판올, 니트로메탄 및 물의 혼합액(5:3:2, v/v/v)이었다.

반응 48시간째에 배양액 중의 균주와 다시마 알긴산의 분해에 의해 생성된 저분자 알긴산을 쌀에 분무하고 30℃의 온도에서 30분간 건조시켜 바실러스 서브틸리스 포자 또는 생균과 저분자 알긴산 올리고당이 도포된 쌀을 제조하였다.

또한, 상기 균주와 저분자 알긴산이 생성된 배양액을 현미 500 g으로 지은 현미밥에 에 부피 기준으로 5 ml 내지 50 ml 첨가하여 반죽한 후 후레이크 제조기기에서 가열하여 후레이크를 만들거나 또는 밀가루 500 g에 5 ml 내지 50 ml 첨가하고 반죽하여 빵이나 과자류 제조에 사용할 수 있고, 음료의 제조시 첨가되어 알긴산 올리고당이 함유된 음료를 제조하기 위해 이용될 수 있다.

(2) 항비만 효과

상기 (1)에서 제조된 저분자 알긴산을 함유한 쌀을 db/db 마우스에 공급하고 이에 의한 항 비만 효과를 조사하하였다.

-대상동물의 사육

db / db 마우스는 6주령 수컷으로 Japan SLC Inc.에서 생산하여 중앙실험동물(주)를 통하여 공급받았으며, 1주일간의 검화 순화 및 적응기간 후 실험실시에 적합하고 일반증상이 없는 동물 18마리를 선별하였다. db/db 마우스는 당뇨 모델인 6주령의 C57BL/KsJ 종에서 개발된 모델로 염색체 4에 있는 한 개의 유전자가 돌연변이를 일으켜 나타나는 것으로 알려져 있으며, 지방조직의 렙틴 생산은 정상이나 시상하부 포만중추에 있는 렙틴 수용체에 결함이 있어 과식 및 체중 증가가 초래된 인슐린 비의존성 당뇨 모델이다.

정상식이를 급여한 db / db 비발현군(Lean군)을 대조군으로 정하고, 상기 18마리의 db / db 마우스를 정상 식이를 급여한 db / db 발현군(Control군), 저분자 알긴산 저함량 쌀(쌀 대비 저분자 알긴산으로서 50ppm)을 급여한 db / db 발현군(ALO-Low), 및 저분자 알긴산 고함량 쌀(쌀 대비 저분자 알긴산으로서 300ppm)를 급여한 db / db 발현군(ALO-High군)의 3군으로 나누어 6주간 사육하였다. 정상 식이는 마우스의 사육에 일반적으로 사용되는 사료를 의미하며, 저분자 알긴산 함유 쌀은 저분자 알긴산을 코팅시킨 쌀을 의미한다. 각 군을 대상으로, 6주 동안 혈중 총 콜레스테롤(Blood Total Cholesterol: BTC), 혈중 중성지방(Blood Triglyceride: BTG), HDL 및 LDL을 측정하였다. 사육실 온도는 22±1 ℃, 습도는 50±5 %로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 조절하였다. 도 5는 각 군에서 측정된 총 콜레스테롤, 중성지방함량, HDL-콜레스테롤 함량, LDL-콜레스테롤 함량, 및 총콜레스테롤 대비 HDL을 보여준다. 저분자 알긴산 함유 쌀을 공급받은 군, ALO-Low 및 ALO-High 군은 정상 식이를 급여한 Control군 대비 혈중 총콜레스테롤과 중성 지방 및 LDL 수치가 크게 감소하고, HDL 및 총콜레스테롤 대비 HDL의 비율이 크게 증가한다는 것을 보여준다. 이 결과는 저분자 알긴산 함유 쌀이 체내에서 지방 대사를 개선하여 지방의 축적을 억제하고 지방의 분해를 촉진하는 항 비만 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

한국생명공학연구원

KCTC11872

20110223

<110> Bio Resource Inc. <120> Microorganisms capable of lysing alginate and use thereof <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2395 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> rRNA <222> (1)..(2395) <223> 16S rRNA <400> 1 aggggggctg ctagtacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60 gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120 aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180 cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240 caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300 gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360 gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420 acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540 taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600 ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660 gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720 tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780 cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840 ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960 cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcctct tcgggggcag agtgacaggt 1020 ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg aagaatgttg gttaagtccc gcaacgagcg 1080 caacccttga tcctagttgc cagcatcagt ggcacctcta gggtgactgc cggtgacaac 1140 ggaaggaaag gtgggatgaa cgtcaatcat catgcccctt tatgacctgg ggctaacacc 1200 cactggtcaa ccagtcggcg gctggctcca aaaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta 1260 caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca 1320 tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 1380 gaactgagaa cagatttgtg ggattggctt aacctcgcgg tttcgctgcc ctttgttctg 1440 cccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc 1500 accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact 1560 aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg 1620 acaaccatgc accacctgtc actctgcccc cgaaggggac gtcctatctc taggattgtc 1680 agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca 1740 ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg tactccccag 1800 gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta acacttagca 1860 ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg 1920 ctcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct 1980 ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc aagttcccca 2040 gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta agaaaccgcc 2100 tgcgagccct ttacgcccaa taattcccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg 2160 ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggtg ccgccctatt 2220 tgaacggcac ttgttcttcc ctaacaacag agcttacgat cggaaaactt catcactcac 2280 gcggcgtgct cgtcagactt tcgtccatgc gaagatccct actgctgcct cccgtaggag 2340 tctgggccgg tgtctcagtc catggtgcga atcacccctc tctcaggtcg gctag 2395

Claims

알긴산을 분해하는 바실러스 서브틸리스 KCTC11872.
바실러스 서브틸리스 KCTC11872를 알긴산을 포함하는 배지에서 배양하여 저분자 알긴산을 포함하는 배양물을 제조하는 단계, 및
상기 배양물을 첨가하는 단계를 포함하는, 저분자 알긴산을 포함하는 식품을 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 배양물을 첨가하는 단계는 상기 배양물을 쌀에 도포하는 단계를 포함하고, 상기 저분자 알긴산을 포함하는 식품은 저분자 알긴산이 도포된 쌀인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 저분자 알긴산을 포함하는 식품은 알긴산 올리고당이 함유된 어류, 육류, 곡류, 음료, 초콜렛, 스낵류, 과자류, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합체, 및 발효식품으로부터 선택된 것인 방법.
알긴산을 이용한 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 배양물을 포함하는 기능성 식품.
알긴산을 이용한 바실러스 서브틸리스 KCTC11872의 배양물을 포함하는 비만치료용 약제학적 조성물.