KR20120093838A - 아세톤 및 아세틸－ｃｏａ로부터 ３－히드록시－ｓ－메틸부티르산의 효소적 생성을 위한 방법 - Google Patents

아세톤 및 아세틸－ｃｏａ로부터 ３－히드록시－ｓ－메틸부티르산의 효소적 생성을 위한 방법 Download PDF

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Abstract

아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 3-히드록시-3-메틸부티르산으로의 효소적 전환을 포함하는, 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물로부터의 3-히드록시-3-메틸부티르산 (또한 베타-히드록시이소발레레이트 또는 HiV로도 지칭됨)의 생성 방법이 기재된다. 이 전환은 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 이용한다. 바람직하게는, 상기 방법에서 이용되는 효소는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 활성을 갖는 효소 및/또는 PksG 단백질 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제 (EC 4.1.3.4)의 활성을 갖는 효소이다. 또한 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물로부터 3-히드록시-3-메틸부티르산을 생성할 수 있는 유기체, 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 상기 언급한 효소 및 유기체의 용도, 및 또한 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 아세톤의 용도가 기재된다.

Description

아세톤 및 아세틸－ＣＯＡ로부터 ３－히드록시－Ｓ－메틸부티르산의 효소적 생성을 위한 방법 {METHOD FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF 3-HYDROXY-S-METHYLBUTYRIC ACID FROM ACETONE AND ACETYL-COA}
본 발명은 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 3-히드록시-3-메틸부티르산으로의 효소적 전환을 포함하는, 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물로부터 3-히드록시-3-메틸부티르산 (또한 베타-히드록시이소발레레이트 또는 HIV로도 지칭됨)을 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 전환은 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 이용한다. 바람직하게는, 상기 방법에서 이용되는 효소는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10) 및/또는 PksG 단백질의 활성을 갖는 효소 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제 (EC 4.1.3.4)의 활성을 갖는 효소이다. 본 발명은 또한 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물로부터 3-히드록시-3-메틸부티르산을 생성할 수 있는 유기체 및 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 상기 언급한 효소 및 유기체의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 아세톤의 용도에 관한 것이다.
3-히드록시-3-메틸부티르산 (또한 베타-히드록시이소발레레이트 또는 HIV로도 지칭됨; 도 1 참고)은 필수 아미노산인 루이신의 대사산물이며, 인체 내에서 합성된다. 이는 자몽, 알팔파 및 메기에서 소량 발견할 수 있다. 이는 또한 루이신 이화작용의 일부 대사성 장애, 즉 저발레르산혈증 (hypovaleric acidemia)에서도 나타나는 것으로 알려져 있다. 3-히드록시-3-메틸부티르산은 근육량 및 근력을 증가시키는 효과를 갖는 것일 수 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Nissen et al., J. Appl. Physiol. 81 (1996), 2095-2104]). 문헌 [Wilson et al. (Nutrition & Metabolism 5 (2008))]은 상기 작용 메카니즘으로서 이하를 제안한다:
- HMG CoA 리덕타제에 의한 전환을 통한 근섬유막 보전성의 증가
- mTOR 경로를 통한 단백질 합성 강화
- 유비퀴틴 경로의 억제를 통한 단백질 분해의 저하.
3-히드록시-3-메틸부티르산은 근육이 단백질 분해에 대항하는 것을 돕고, 근육 수복에 도움을 주며 지구력 증가를 지원하는 것으로 추측된다. 이는 병원의 중환자실에 있는 만성 폐쇄성 폐 질환 환자, HIV 및 암과 관련된 근육 소모 및 부상이 심한 외상 희생자에 도움이 되는 것으로 기재된 바 있다. 따라서, 이는 체격 형성을 위한 근육 강화제로서 및 근육 소모를 방지하는 의약으로서의 그의 용도로 인해 상업적 관심의 대상이 되고 있다. 미국 특허 제7026507호에는 나트륨 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 고형 제제의 제조 방법이 기재되어 있는데, 여기서는, 공정 첫번째 단계에서, 4,4-디메틸옥세탄-2-온을 수성 수산화나트륨과 반응시켜 나트륨 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 용액을 형성시키고, 이어서, 농축 후 적절한 경우, 용액을 이후의 공정 단계에서 합성 실리카에 적용하고, 여기서 적절할 경우, 결과적인 생성물을 건조시킨다.
무기적 생성 단계와 무관하며 살아있는 유기체에서 실시될 수 있어 친환경적이고 저비용인 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 생성 방법을 제공하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 맥락에서, 문헌 [Lee et al. (Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997), 4191-4195)]에서는 미생물 갈락토미세스 리시이 (Galactomyces reessii)를 사용하여 3-메틸부티르산을 3-히드록시-3-메틸부티르산으로 전환시킴으로써 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 생성하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이 방법이 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 생성을 가능하게 했지만, 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 특히 생물학적 방법에 의해 생성하는 효율적이면서 비용 효율적인 대안적인 방법을 제공하는 것이 여전히 필요하다.
본 발명은 3-히드록시-3-메틸부티레이트 생성의 대안적인 방법에 대한 상기 요구를 충족시키며, 생물학적 자원을 기반으로 하면서 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 시험관내에서 또는 미생물 및 다른 종에서 생체내에서 생성할 수 있게 하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 3-히드록시-3-메틸부티르산으로의 효소적 전환을 포함하는, 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물로부터 3-히드록시-3-메틸부티르산 (또한 베타-히드록시이소발레레이트 또는 HIV로도 지칭됨)을 생성하는 방법에 관한 것이다.
아세톤은 하기 화학식으로 표시된다: CH3-(C=O)-CH3. 바람직한 실시양태에서, 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물은 하기 화학식 I을 특징으로 한다.
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식 중, X는 S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C10H13N5O7P (조효소 A), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-폴리펩티드 (아실-운반 단백질), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-OH (판테테인), S-CH2-CH2-NH-CO-CH3 (N-아세틸-시스테아민), S-CH3 (메탄 티올), S-CH2-CH(NH2)-CO2H (시스테인), S-CH2-CH2-CH(NH2)-CO2H (호모시스테인), S-CH2-CH(NH-C5H8NO3)-CO-NH-CH2-CO2H (글루타티온), S-CH2-CH2-SO3H (조효소 M) 및 OH (아세트산)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 전환은 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 화학식 I에 따른 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 이용한다. 이 반응의 반응식에 따르면, 아세톤의 옥소기는 친전자체로서 반응하고, 화학식 I에 따른 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기는 친핵체로서 반응한다. 아세톤 및 화학식 I에 따른 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 전환에 대한 전반적인 반응은 도 5에 나타나 있다.
상기 반응은 1 단계로 일어날 수 있는데, 즉 3-히드록시-3-메틸부티레이트가 상기 기재된 효소에 의해 촉매되는 반응의 직접적인 생성물일 수 있다. 별법으로, 상기 반응은 두 단계를 포함할 수 있는데, 특히 아세틸 CoA가 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물로 사용되는 경우, 먼저 3-히드록시-3-메틸부티레이트와 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 부가생성물 (예를 들어 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA)이 생성되고, 이 부가생성물이 후속적으로, 예를 들어 3-히드록시-3-메틸부티레이트 및 CoA로 가수분해된다는 의미에서 그러하다. 따라서, 상기 첫번째 대안적 반응에서, 효소는 도 5에 나타난 바와 같은 완전한 반응을 촉매한다. 상기 두번째 대안적 반응에서, 효소는 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 사이의 공유 결합의 형성을 촉매하지만, X가 상기 분자 상에 잔류한다. X는 그 후 가수분해에 의해 상기 분자로부터 후속적으로 제거된다.
본 발명은 활성화된 아세틸기를 아세톤에 전달할 수 있는 효소를 이용함으로써 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 생성하는 것이 가능하다는 것을 최초로 보여준다. 선행 기술에서 균류인 갈락토미세스 리시이를 사용하여 생물전환을 통해 이소발레르산으로부터 3-히드록시-3-메틸부티레이트을 생성하는 것이 보고된 바 있다. 그러나, 이소발레르산이 루이신의 탈카르복실화를 통해 수득되며 루이신 자체는 대사과정 중에서 피루베이트 2개 분자 및 아세틸 CoA 1개 분자의 전체적인 축합으로부터 유래된다는 점을 고려하면, 이 생성 방법은 에너지 측면에서 불리하다. 본 발명의 방법은 이러한 불리한 점을 면한다.
일반적으로, 본 발명의 맥락에서 하나의 기질로서 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물 및 또한 아세톤 기를 성분으로 함유하는 기질을 수용하는 효소라면 어떠한 것이라도 사용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 효소는 아세틸 CoA를 기질로서 수용하는 효소이다. 그러한 효소의 예로는 HMG CoA 신타제, HMG CoA 리아제 또는 다른 C-C 결합 절단/축합 리아제가 있다. 그러나, 이하에서 설명할 것이지만, 또한 천연에서 아세틸 CoA와는 상이한 아세틸-공여체를 촉매하는 반응에서 정상적으로 사용되는 효소 (예를 들어 PksG 단백질)도 아세틸 CoA 또는 이의 유사체를 사용할 수 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서 효소는 X가 아실-운반-단백질 (예컨대 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서 바실라엔 (bacillaene)을 생성하는 pksX 유전자군에 의해 코딩되는 아세틸-S-AcpK 단백질)인 화학식 I에 따른 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물을 기질로서 수용하는 효소이다. 그러한 효소의 예로는 PksG 단백질이 있다. PksG 단백질은 바실러스 서브틸리스로부터의 pksX 유전자군에 의해 코딩되는 단백질 중 하나이다. PksG 단백질은 HMG CoA 신타제에 의해 촉매되는 반응과 유사한 반응에서 아세틸-S-AcpK로부터의 카르복시메틸기 -CH2-CO2H를 PksL 단백질의 티올화 도메인 중 하나에 연결된 β-케토티오에스테르 폴리케타이드 중간체에 전달하는 것을 촉매할 수 있다. 그러나, 본 발명의 맥락에서, PksG 단백질은 또한 활성화된 아세틸기의 공여체로서 아세틸-S-AcpK 단백질 대신 아세틸 CoA도 사용할 수 있는 것으로 나타났다.
한 바람직한 실시양태에서, 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물은 아세틸 CoA이다. 화학적 구조 면에서 아세틸 CoA (또한 아세틸 조효소 A로도 공지되어 있음)는 조효소 A (티올) 및 아세트산 간의 티오에스테르이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물은, X가 아실-운반-단백질, 예컨대 바실러스 서브틸리스에서 바실라엔을 생성하는 pksX 유전자군에 의해 코딩되는 아세틸-S-AcpK 단백질인 화학식 I을 갖는다.
바람직하게는, 상기 방법에서 이용되는 효소는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10) 및/또는 PksG 단백질의 활성을 갖는 효소 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제 (EC 4.1.3.4)의 활성을 갖는 효소이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 화학식 I에 따른 아세틸 CoA의 탄소 원자 C2 사이의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 이용한, 아세톤 및 아세틸 CoA의 3-히드록시-3-메틸부티레이트로의 효소적 전환을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 이용되는 효소는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 활성을 갖는 효소 또는 PksG 단백질의 활성을 갖는 효소 또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제 (EC 4.1.3.4)의 활성을 갖는 효소이다.
특히, 본 발명의 맥락에서 HMG CoA 신타제는 그의 정상 기질인 아세토아세틸-CoA 대신 아세톤을 수용할 수 있어, 아세틸-CoA (또는 화학식 I에 따른 화합물) 및 아세톤의 3-히드록시-3-메틸부티레이트로의 전환을 가능하게 하는 것으로 나타났다.
나아가, 본 발명의 맥락에서 PksG 단백질이 기질로서 Ac-S-AcpK 단백질 대신에 아세틸 CoA를 사용할 수 있어, 정상적으로는 HMG CoA 신타제에 의해 촉매되는 반응을 촉매할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 또한 HMG CoA 신타제의 반응과 유사한 반응을 촉매하는 PksG 단백질이 아세톤 및 화학식 I의 화합물의 3-히드록시-3-메틸부티레이트로의 전환을 촉매할 수 있을 것으로 고려된다. 나아가, C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제는 아세틸-CoA 및 아세톤의 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA (이는 이어서 3-히드록시-3-메틸부티레이트 및 CoA로 가수분해될 수 있음)로의 전환을 촉매할 수 있는 것으로 고려된다.
본 출원의 맥락에서 용어 "HMG CoA 신타제" 또는 "HMG CoA 신타제의 활성을 갖는 단백질/효소"는 EC 번호 EC 2.3.3.10 (이전에는, HMG-CoA 신타제가 EC 4.1.3.5로 분류되었으나, EC 2.3.3.10로 이동되었음)로 분류되는 임의의 효소를 지칭하며, 특히 이는 아세틸-CoA가 아세토아세틸-CoA와 축합되어 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA)를 형성하는 반응 (도 2 참고)을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 지칭하며, 이 용어는 또한 상기와 같은 HMG CoA 신타제로부터 유래된 것으로서 아세톤 및 상기 정의된 바의 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물 (바람직하게는 아세틸 CoA)의 3-히드록시-3-메틸부티레이트로의 전환을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 지칭한다.
아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA와 축합시켜 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA)를 형성하는 효소 활성은 당업계에 익히 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 한가지 가능한 바람직하게 사용되는 분석법은, 예를 들어, 문헌 [Clinkenbeard et al. (J. Biol. Chem. 250 (1975), 3108-3116)]에 기재되어 있다. 이 분석법에서 HMG-CoA 신타제 활성은, 아세토아세틸-CoA의 에놀레이트 형태의 아세틸-CoA-의존적 소실에 동반된 303 nm에서의 흡광도의 감소를 모니터링하여 측정한다. 바람직하게는 HMG CoA 신타제 활성은 실시예 3에 기재된 바와 같이 분석된다.
HMG CoA 신타제는 메발로네이트 경로의 일부분이다. 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)의 합성에 대한 2가지 경로가 확인되었는데, 즉 메발로네이트 경로 및 글리세르알데히드 3-포스페이트-피루베이트 경로이다. HMG CoA 신타제는 아세틸-CoA와 아세토아세틸-CoA의 생물학적 클라이젠 (Claisen) 축합을 촉매하며, 베타-케토티올라제, 지방산 신타제 (베타-케토아실 운반 단백질 신타제) 및 폴리케타이드 신타제를 포함하는 아실-축합 효소 상과 (superfamily)의 구성원이다.
다양한 유기체에 대한 HMG CoA 신타제가 기재되었다. 또한 수많은 원천으로부터의 HMG CoA 신타제를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열이 이용가능하다. 일반적으로, 상기 서열은 단지 낮은 정도의 전체 서열 동일성을 공유한다. 예를 들어, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 또는 스트렙토코커스 (Streptococcus)로부터의 상기 효소는 인간 및 조류의 HMG CoA 신타제의 서열과 불과 약 20%의 동일성을 나타낸다. 일부 자료에서는 박테리아의 HMG CoA 신타제와 동물에서의 그의 대응물이 불과 약 10%의 전체 서열 동일성을 나타내는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Sutherlin et al., J. Bacteriol. 184 (2002), 4065-4070]). 그러나, 아세틸화 및 축합 반응에 관여하는 아미노산 잔기는 박테리아 및 진핵 HMG CoA 신타제 간에 보존되어 있다 (문헌 [Campobasso et al., J. Biol. Chem. 279 (2004), 44883-44888]). 3가지 HMG CoA 신타제 효소의 3차원 구조가 결정되었는데, 이의 효소적 반응에 중대한 아미노산은 대체적으로 특징분석이 잘 되어있다 (문헌 [Campobasso et al., loc. cit.]; [Chun et al., J. Bioi.Chem. 275 (2000), 17946-17953]; [Nagegowda et al., Biochem. J. 383 (2004), 517-527]; [Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582]). 진핵생물에서는 2가지 형태의 HMG CoA 신타제, 즉 세포질 형태 및 미토콘드리아 형태가 존재한다. 세포질 형태는 콜레스테롤 및 다른 이소프레노이드의 생성에서 핵심적인 역할을 하며, 미토콘드리아 형태는 케톤체의 생성에 관여한다.
원칙적으로 본 발명의 맥락에서 임의의 HMG CoA 신타제 효소가 사용될 수 있는데, 특히 원핵 또는 진핵 유기체로부터의 것이 사용될 수 있다.
원핵 HMG CoA 신타제로서는, 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (문헌 [Campobasso et al., loc. cit.]; 유니프롯 (Uniprot) 등록 번호 Q9FD87), 스타필로코커스 에피데르미디스 (Staphylococcus epidermidis) (유니프롯 등록 번호 Q9FD76), 스타필로코커스 헤몰리티쿠스 (Staphylococcus haemolyticus) (유니프롯 등록 번호 Q9FD82), 엔테로코커스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis) (문헌 [Sutherlin et al., loc. cit.]; 유니프롯 등록 번호 Q9FD7), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium) (유니프롯 등록 번호 Q9FD66), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia) (유니프롯 등록 번호 Q9FD56), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (유니프롯 등록 번호 Q9FD61) 및 메타노박테리움 테르모아우토트로피쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum) (등록 번호 AE000857), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi) (NCBI 등록 번호 BB0683)로부터의 것이 기재되어 있다.
나아가, 하기 표 A에는 일부 공지된 원핵생물 HMG CoA 신타제가 열거되어 있다:
[표 A]
Figure pct00002
Figure pct00003
진핵 HMG CoA 신타제로는, 예를 들어 이하로부터의 것이 기재되어 있다: 균류, 예컨대 스키조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (등록 번호 U32187 및 P54874), 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) (등록 번호 P54839), 식물, 예컨대 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) (등록 번호 X83882 및 P54873), 피누스 실베스트리스 (Pinus sylvestris) (등록 번호 X96386) 및 동물, 예컨대 카에노르하브디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans) (등록 번호 P54871), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) (미토콘드리아; 등록 번호 P54869 및 문헌 [Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582]), 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) (미토콘드리아: 등록 번호 P22791 및 문헌 [Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582]; 세포질: 등록 번호 P17425), 차이니즈 햄스터 (크리세툴루스 그리세우스 (Cricetulus griseus): 등록 번호 P13704), 수스 스크로파 (Sus scrofa) (미토콘드리아; 등록 번호 U90884 및 문헌 [Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582]), 호모 사피엔스 (Homo sapiens) (미토콘드리아: 등록 번호 P54868 및 문헌 [Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582]; 세포질: 등록 번호 Q01581), 블라텔라 게르마니카 (Blattella germanica) (세포질 형태 1; 등록 번호 P54961), 블라텔라 게르마니카 (세포질 형태 2; 등록 번호 P54870) 및 갈루스 갈루스 (Gallus gallus) (세포질; 등록 번호 P23228).
여러 유기체로부터의 HMG CoA 신타제의 예가 서열 1 내지 14에 제시되어 있다. 서열 1은 카에노르하브디티스 엘레간스 (P54871, 진 뱅크 (gene bank) F25B4.6)의 세포질 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 2는 스키조사카로미세스 폼베 (분열 효모; P54874)의 세포질 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 3은 사카로미세스 세레비시애 (빵 효모; P54839, 진 뱅크 CAA65437.1)의 세포질 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 4는 아라비돕시스 탈리아나 (애기장대 (Mouse-ear cress); P54873)의 세포질 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 5는 딕티오스텔리움 디스코이데움 (Dictyostelium discoideum) (점균류 (Slime mold); P54872, 진 뱅크 L2114)의 세포질 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 6은 블라텔라 게르마니카 (바퀴 (German cockroach); P54961, 진 뱅크 X73679)의 세포질 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 7은 갈루스 갈루스 (닭; P23228, 진 뱅크 CHKHMGCOAS)의 세포질 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 8은 호모 사피엔스 (인간; Q0158, 진 뱅크 X66435)의 세포질 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 9는 호모 사피엔스 (인간; P54868, 진 뱅크 X83618)의 미토콘드리아 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 10은 딕티오스텔리움 디스코이데움 (점균류; Q86HL5, 진 뱅크 XM_638984)의 미토콘드리아 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 11은 스타필로코커스 에피데르미디스 (Q9FD76)의 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 12는 락토바실러스 페르멘툼 (Lactobacillus fermentum) (B2GBL1)의 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 13은 히페르테르무스 부틸리쿠스 (A2BMY8)의 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 14는 클로로플렉서스 아그레간스 (B8G795)의 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 24는 락토바실러스 델브루에키 (Q1GAH5)의 HMG CoA 신타제의 서열을 제시하고, 서열 25는 스타필로코커스 헤몰리티쿠스 Q4L958의 HMG CoA 신타제의 서열 (야생형 단백질과 비교하여 I98>V 상이)을 제시한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 HMG CoA 신타제는, 서열 1 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 1 내지 14 중 어느 하나와 적어도 n% 동일한 서열을 포함하고, HMG CoA 신타제 활성을 가지며, 여기서 n은 10 내지 100의 정수, 바람직하게는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99인 효소이다.
바람직하게는, 동일성의 정도는 각각의 서열을 상기 언급한 서열번호 중 어느 하나의 아미노산 서열과 비교하여 결정된다. 비교되는 서열들의 길이가 동일하지 않은 경우, 동일성의 정도는 바람직하게는 보다 긴 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 보다 짧은 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율 또는 보다 짧은 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 보다 긴 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 서열 동일성의 정도는 당업계에 익히 공지된 방법에 따라 결정될 수 있는데, 바람직하게는 적합한 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 클러스탈(CLUSTAL)을 사용한다.
특정 서열이 참조 서열에 대해, 예를 들어, 80% 동일한지를 결정하기 위해 클러스탈 분석 방법을 사용하는 경우, 디폴트 설정을 사용할 수 있거나 또는 설정을 바람직하게는 이하와 같이 한다: 아미노산 서열의 비교에 대해서는, 매트릭스: 블로섬 (blosum) 30; 오픈 갭 페널티 (Open gap penalty): 10.0; 익스텐드 갭 페널티 (Extend gap penalty): 0.05; 딜레이 다이버전트 (Delay divergent): 40; 갭 분리 거리: 8. 뉴클레오티드 서열 비교의 경우, 익스텐드 갭 페널티를 바람직하게는 5.0로 설정한다.
바람직하게는, 동일성의 정도는 서열의 전체 길이에 대해 계산된다.
본 발명에 따른 방법에서 이용되는 HMG CoA 신타제는 천연 발생 HMG CoA 신타제일 수 있거나 또는, 예를 들어, 돌연변이 또는 다른 변경 (예컨대 효소 활성, 안정성 등을 변경 또는 개선시키는 돌연변이 또는 다른 변경)의 도입에 의해, 천연 발생 HMG CoA 신타제로부터 유래한 HMG CoA 신타제일 수 있다.
본 출원의 맥락에서 용어 "HMG CoA 신타제" 또는 "HMG CoA 신타제의 활성을 갖는 단백질/효소"는 또한, 아세톤 및 상기 정의된 바의 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물, 바람직하게는 아세틸-CoA의 효소적 전환에 의해 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 생성할 수 있으나, 기질로서의 아세토아세틸-CoA에 대해 단지 낮은 친화도를 갖거나 또는 더 이상 아세토아세틸-CoA를 기질로서 수용하지 않는, HMG CoA 신타제로부터 유래한 효소를 포함한다. 상기 바람직한 HMG CoA 신타제의 기질에 대한 상기와 같은 변형에 의해, 아세톤의 3-히드록시-3-메틸부티레이트로의 전환이 개선될 수 있고, 부-생성물 (예를 들어 HMG-CoA)의 생성이 감소될 수 있다. 단백질의 목적하는 효소 활성을 변형 및/또는 개선하는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 이로서는, 예를 들어, 무작위 돌연변이유발 또는 부위-지정 돌연변이유발 및 이어서 원하는 특성을 갖는 효소의 선별 또는 소위 "방향성 진화 (directed evolution)" 접근법이 있다. 예를 들어, 원핵 세포에서의 유전자 조작의 경우, 돌연변이유발 또는 DNA 서열의 재조합에 의한 서열 변형을 허용하는 플라스미드 내로 HMG CoA 신타제를 코딩하는 핵산 분자를 도입할 수 있다. 표준 방법 (문헌 [Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA] 참고)을 이용하면, 염기 교환의 실시 또는 천연 또는 합성 서열의 첨가가 가능하다. DNA 단편에 어댑터 (adapter) 및 링커를 적용하면, 이들을 서로 연결할 수 있다. 나아가, 적합한 제한 부위를 제공하거나 또는 잉여 DNA 또는 제한 부위를 제거하는 조작 방법도 사용가능하다. 삽입, 결실 또는 치환이 가능한 경우, 시험관내 돌연변이유발, "프라이머 수복", 제한 또는 라이게이션이 사용될 수 있다. 일반적으로, 분석 방법으로서는 서열 분석, 제한 분석 및 여타의 생화학 및 분자 생물학의 방법이 실시된다. 그 후, 생성된 HMG CoA 신타제 변이체에 대하여, 그의 효소 활성 및 특히 기질로서 아세토아세틸CoA 보다 아세톤을 선호하는 능력을 시험한다. 기질로서 아세톤을 사용하는 HMG CoA 신타제의 능력을 측정하는 분석법은 실시예 5에 기재되어 있다. 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 형성에 대한 검출은, 예를 들어 유도체화 후의 박층 크로마토그래피, LC/MS 및 비색 분석법에 의한 분리 또는 질량 분광측정법에 의한 분리 후에, 표준 화합물과 비교함으로써 실시가능하다.
특히, 반응은 40 mM 트리스-HCl (pH 8), 5 내지 50 mM 아세틸-CoA, 100 내지 500 mM 아세톤, 1 MgCl2 (미토콘드리아 HMG-CoA 신타제 제외), 0.5 mM DTT 및 0.2 내지 8 mg/ml 범위로 다양한 효소를 함유한 반응 혼합물 중에서 실시된다. 대조 반응은 기질 중 하나 및 효소의 부재 하에서 실시된다.
합성 진행 후, 30 또는 37℃에서의 인큐베이션 중에 기간을 증가시키면서 취한 분취액을 분석한다. 전형적으로, 48시간의 인큐베이션 후에 50 μl의 분취액을 취하고, 100℃에서 1분 동안 가열하여 단백질을 제거하고, 원심분리한 후, 상등액을 깨끗한 바이알로 옮겨 질량 분광측정법에 의한 HIV 검출을 실시한다. 40 mM 트리스-HCl (pH 8), 1 mM MgCl2, 0.5 mM DTT 중에서 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 용액을 준비한 후, 상기 기재한 바와 같이 가열하여, 참조로 사용한다.
샘플에 대한 분석은, PE SCIEX API 2000 삼단계 사중극자형 (triple quadrupole) 질량 분석계 상에서 이동상으로 0.1% 트리에틸아민을 함유한 H2O/아세토니트릴=60/40 및 유속 40 μl/분을 이용하여 음이온 모드로 실시한다. 각각의 상등액 10 μl를 동일한 양의 이동상과 혼합하고, 질량 분석계에 바로 주입한다. [3-히드록시-3-메틸부티레이트-H]- 이온의 존재를 모니터링한다. 3-히드록시-3-메틸부티레이트 합성은 또한 방사성 표지된 [2-14C] 아세톤의 존재 하에 실시할 수 있다. 반응 혼합물을 TLC 또는 HPLC로 분리한 후 생성물의 형성을 분석한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에서 이용되는 HMG CoA 신타제는 아세톤에 대한 KM 값이 300 mM 이하, 바람직하게는 250 mM 이하, 보다 더 바람직하게는 200 mM 이하 및 특히 바람직하게는 150 mM 이하인 효소이다. KM 값을 실시예 7에 기재된 조건 하에서 측정하는 것이 바람직하다. 또다른 바람직한 실시양태에서 본 발명에서 이용되는 HMG CoA 신타제는 기재된 반응에 대한 kcat 값이 적어도 0.1 x 10-4 sec-1, 바람직하게는 적어도 0.2 x 10-4 sec-1, 보다 더 바람직하게는 적어도 0.5 x 10-4 sec-1 및 특히 바람직하게는 적어도 1 x 10-4 sec-1, 적어도 2 x 10-4 sec-1, 적어도 3 x 10-4 sec-1 또는 적어도 5 x 10-4 sec-1이다. kcat 값을 실시예 7에 기재된 조건 하에서 측정하는 것이 바람직하다.
조류의 HMG CoA 신타제의 His264는 상기 효소와 아세토아세틸-CoA의 상호작용에서 일정 역할을 하며, 그의 Ala264 변이체는 아세토아세틸-CoA의 티오에스테르 잔기의 산소와의 상호작용이 결여되어 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다(문헌 [Misraa et al., Biochem. 35 (1996), 9610-9616]). 따라서, 기질로서의 아세토아세틸-CoA에 대한 낮은 수용도를 나타내면서 아세톤을 기질로서 수용하는 HMG CoA 신타제의 변이체를 개발하기 위해, HMG CoA 신타제 중에서 문헌 [Misraa et al. (loc. cit.)]에 기재된 조류 HMG CoA 신타제의 His264에 상응하는 히스티딘 잔기를 체계적으로 돌연변이시켜, 아세토아세틸-CoA를 기질로서 수용하지 못하게 하거나 수용하는 정도를 감소시키는 것을 고려해볼 수 있다
또한, 증가된 활성을 나타내는 HMG CoA 신타제 변이체를 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Steussy et al. (Biochemistry 45 (2006), 14407-14414)]에는, Ala110이 Gly110으로 변경되어 전체 반응 속도가 140배 증가된 엔테로코커스 파에칼리스 HMG CoA 신타제의 변이체가 기재되어 있다.
또한, 기질인 아세톤이 HMG CoA 신타제의 천연 기질인 아세토아세틸-CoA보다 더 짧다는 사실에 기인하여, 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 생성과 관련하여 개선된 효소적 특성을 갖는 변이체를 동정하는 방법을 효소/효소들의 촉매 부위에서의 입체적 및/또는 전자적 상보성을 허용하는 보조인자의 존재 하에 실시할 수 있다. 그러한 보조인자의 한가지 예는 조효소 A 또는 구조적으로 밀접히 관련된 분자, 예컨대 S-니트로소-CoA일 수 있다.
아세톤을 기질로서 수용하는 한편 아세토아세틸-CoA에 대해서는 기질로서 낮은 친화도를 갖거나 또는 아세토아세틸-CoA를 기질로서 더 이상 수용하지 않는 HMG CoA 신타제의 변형된 형태는 천연 발생 HMG CoA 신타제 또는 이미 변형되었거나, 최적화되었거나 또는 합성에 의해 합성된 HMG CoA 신타제로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 단백질에 대한 또다른 예는 PksG 단백질이다. 본 출원의 맥락에서 용어 "PksG 단백질" 또는 "PksG 단백질의 활성을 갖는 단백질/효소"는 천연적으로는 PksG 단백질에 의해 촉매되는 반응, 즉 PksL 단백질의 티올화 도메인 중 하나에 연결된 β-케토티오에스테르 폴리케타이드 중간체로의 아세틸-S-AcpK (Ac-S-AcpK)의 -CH2COO-의 전달을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 지칭한다. 이는, 포스포판테테일 잔기의 아세틸-티오에스테르가 조효소 A의 부분에가 아닌 운반 단백질에 부착된다는 점에서 차이가 있지만 HMG CoA 신타제에 의해 촉매되는 반응과 유사한 반응이다. PksG 단백질은 이 단백질이 천연적으로 촉매하는 반응에서 아세틸-S-AcpK의 아세틸기를 수용자에 전달하지만, 본 발명의 맥락에서 PksG 단백질이 또한 정상적으로는 HMG CoA 신타제에 의해 촉매되는 반응, 즉 아세토아세틸 CoA 및 아세틸 CoA로부터 출발하는 HMG CoA의 합성을 이루어낼 수 있는 것으로 밝혀졌다(실시예 3 참고; 여기서, 미코박테리움 마리눔 (B2HGT6)으로부터의 효소가 아세토아세틸 CoA 및 아세틸 CoA에 대해 작용할 수 있다는 것이 표 1에 나타나 있음).
PksG 단백질의 효소 활성은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정가능하다. 바람직하게 사용되는 한가지 가능한 분석법이, 예를 들어, 문헌 [Calderone et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006), 8977-8982)]에 기재되어 있다. 이 분석법에서는 아세토아세틸 (Acac)-S-PksL-T2가 모델 기질로서 사용되며, 이는 Ac-S-AcpK 및 PksG 단백질과 함께 인큐베이션된다. HMG-S-PksL-T2의 형성은 PksG 단백질이 Ac-S-AcpK의 카르복시메틸기 -CH2-CO2H를 (Acac)-S-PksL-T2에 전달할 수 있다는 것을 나타낸다. HMG-S-PksL-T2의 형성은 전자분무 이온화 (ESI)-FTMS 또는 자가방사법으로 측정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 상응하는 분석법을 문헌 [Calderone et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006), 8977-8982)]의 8982 페이지에 기재된 바와 같이 실시한다.
PksG 단백질은 바실라엔의 생합성을 담당하는 효소들을 코딩하는 바실러스 서브틸리스 내 pksX 경로의 일부이다 (문헌 [Butcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007), 1506-1509]). 코딩되는 단백질은 AcpK, PksC, PksL, PksF, PksG, PksH 및 PksI이다. 문헌 [Calderone et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006), 8977-8982)]에 따르면, 이들 효소는 아세토아세틸-S-운반 단백질 상에 아세테이트 유래의 β-메틸 분지를 편입시키는 작용을 한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 PksG 단백질은, 서열 15 또는 16에 나타난 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 15 또는 16과 적어도 n% 동일한 서열을 포함하고 PksG 단백질의 활성을 가지며, 여기서 n은 10 내지 100의 정수, 바람직하게는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99인 효소이다. 서열 15는 바실러스 서브틸리스 (P40830)의 PksG 단백질의 아미노산 서열을 나타내며, 서열 16은 미코박테리움 마리눔 (B2HGT6)의 PksG 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 동일성 정도의 측정에 관해서는, HMG CoA 신타제와 관련하여 상기 개시된 바와 동일한 것이 적용된다.
본 발명에 따른 방법에서 이용되는 PksG 단백질은 천연 발생 PksG 단백질일 수 있고, 또는 천연 발생 PksG 단백질로부터 (예를 들어, 돌연변이 또는 다른 변경, 예컨대 효소 활성, 안정성 등을 변경 또는 개선시키는 돌연변이 또는 다른 변경의 도입에 의해) 유래된 PksG 단백질일 수 있다.
본 출원의 맥락에서 용어 "PksG 단백질" 또는 "PksG 단백질의 활성을 갖는 단백질/효소"는 또한, 아세톤 및 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물, 바람직하게는 아세틸-CoA의 효소적 전환에 의해 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 생성할 수 있는 한편, 그의 천연 기질에 대해 단지 낮은 친화도를 갖거나 또는 그의 천연 기질을 더 이상 수용하지 않는, PksG 단백질 유래의 효소를 포함한다. PksG 단백질의 바람직한 기질에 대한 상기와 같은 변형에 의해, 아세톤의 3-히드록시-3-메틸부티레이트로의 전환이 개선될 수 있고 원치않는 부-생성물의 생성이 감소될 수 있다. 단백질의 상기 목적하는 효소 활성을 변형 및/또는 개선시키는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 이에 대해서는 상기에 기재되어 있다. 그 후, 생성된 PksG 단백질 변이체에 대해 그의 효소 활성 및 특히 기질로서 아세톤을 선호하는 그의 능력을 시험한다. 기질로서 아세톤을 사용하는 PksG 단백질의 능력을 측정하는 분석법은 HMG-CoA 신타제의 경우 실시예 5에 기재되어 있다. 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 형성은 상기 기재된 바와 같이 검출할 수 있다.
3-히드록시-3-메틸부티레이트의 생성과 관련하여 개선된 효소적 특성을 갖는 변이체를 동정하는 상기 방법은 또한, 기질인 아세톤이 PksG 단백질의 천연 기질보다 더 짧다는 사실에 기인하여 효소/효소들의 촉매 부위에서의 입체적 및/또는 전자적 상보성을 허용하는 보조인자의 존재 하에 실시될 수 있다..
아세톤을 기질로서 수용하는 한편 그의 천연 기질을 더 이상 수용하지 않거나 그에 대해 낮은 친화도를 갖는 PksG 단백질의 변형된 형태는 천연 발생 PksG 단백질 또는 이미 변형되었거나, 최적화되었거나 또는 합성에 의해 합성된 PksG 단백질로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "C-C 결합 절단/축합 리아제" 또는 "C-C 결합 절단/축합 리아제의 활성을 갖는 단백질/효소"는, C-C 결합을 절단하거나 또는 축합에 의해 상기 결합을 형성시킬 수 있으며 소위 TIM (트리오스-포스페이트 이소메라제) 배럴 (barrel) 도메인을 함유하는 효소를 지칭한다. 상기 TIM 배럴 도메인은 수많은 피루베이트 결합 효소 및 아세틸-CoA 의존 효소에서 발견된다 (문헌 [Forouhar et al. J. Biol. Chem. 281 (2006), 7533-7545]). CATH 단백질 분류 데이타베이스에서 TIM 배럴 도메인의 분류 계통은 3.20.20.150이다 (www.cathdb.info/cathnode/3.20.20.150).
용어 "C-C 결합 절단/축합 리아제"에는 특히 이소프로필말레이트 신타제 (EC 2.3.3.13), 호모시트레이트 신타제 (EC 2.3.3.14) 또는 4-히드록시-2-케토발레레이트 알돌라제 (EC 4.1.3.39)로 분류되는 효소들이 포함된다. 이소프로필말레이트 신타제는 이하의 반응을 촉매한다: 아세틸-CoA + 3-메틸-2-옥소부타노에이트 + H2O
Figure pct00004
(2S)-2-이소프로필말레이트 + CoA. 상기 효소의 예로는 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus) (균주 2308; Q2YRT1)로부터의 상응하는 효소 및 하헬라 제주엔시스 (Hahella chejuensis) (균주 KCTC 2396; Q2SFA7)로부터의 상응하는 효소가 있다.
호모시트레이트 신타제 (EC 2.3.3.14)는 아세틸-CoA + H2O + 2-옥소글루타레이트
Figure pct00005
(R)-2-히드록시부탄-1,2,4-트리카르복실레이트 + CoA의 화학적 반응을 촉매하는 효소이다. 4-히드록시-2-케토발레레이트 알돌라제는 4-히드록시-2-옥소펜타노에이트
Figure pct00006
아세트알데히드 + 피루베이트의 화학적 반응을 촉매한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "HMG CoA 리아제" 또는 "HMG CoA 리아제의 활성을 갖는 단백질/효소"는 EC 번호 EC 4.1.3.4로 분류되는 임의의 효소를 지칭하며, 특히 이는 HMG CoA의 아세틸 CoA 및 아세토아세테이트로의 절단 (도 3 참고) 또는 이 반응의 역, 즉 아세틸 CoA 및 아세토아세테이트의 축합을 통한 HMG CoA의 생성을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 지칭하며, 이 용어는 또한 상기와 같은 HMG CoA 리아제로부터 유래한 것으로서 아세톤과 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물, 바람직하게는 아세틸 CoA의 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA로의 전환을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 생성된 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA는 그 후에 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 생성하도록 가수분해될 수 있다. 이는 당업자에 공지된 방법, 예를 들어 아실-CoA 히드롤라제 (EC 3.1.2.20) 또는 아실-CoA 트랜스페라제 (EC 2.8.3.8)를 이용함으로써 달성될 수 있다.
HMG CoA 리아제의 효소 활성은 당업계에 익히 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 한가지 가능한 분석법이, 예를 들어, 문헌 [Mellanby et al. (Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer Ed. (1963), 454-458)]에 기재되어 있다. 특히, 상기 효소 활성은 3-히드록시부티레이트 데히드로게나제에 의한 아세토아세테이트의 NADH-의존성 환원을 이용하여 분광광도적 분석법으로 측정된다.
바람직하게는 HMG CoA 리아제 활성은 실시예 4에 기재된 바와 같이 분석된다. 상기와 같은 분석법에서 반응 혼합물 (1 ml)은 40 mM 트리스-HCl (pH 8), 1 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.4 mM HMG-CoA, 0.2 mM NADH, 5 유닛의 3-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 함유하며, 이를 5분 동안 인큐베이션 후, 0.005 mg/mL의 HMG-CoA 리아제를 첨가하고, 이어서 340 nm에서의 흡광도 감소에 의해 반응의 진행을 모니터링한다.
HMG CoA 리아제에 의해 촉매되는 반응은 일부 경우 2가 양이온, 예컨대 Mg2+ 또는 Mn2+의 존재를 필요로 하는 것으로 기재되어 있다. 따라서, HMG CoA 리아제의 활성을 측정하는 분석법이 상기와 같은 2가 양이온을 포함하고, 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 본 발명에 따른 방법이 HMG CoA 리아제를 이용하는 경우, 상기 방법을 상기와 같은 양이온의 존재 하에서 실시하는 것이 바람직하다.
HMG CoA 리아제는 간성 케톤체생성 (hepatic ketogenesis)의 일부이다. 이는 간성 케톤체생성 중의 말단 반응을 촉매하는데, 이는 이 경로의 핵심 단계이다. 이 반응은 또한 루이신 이화작용에서도 중요한 단계이다.
다양한 유기체에 대한 HMG CoA 리아제가 기재된 바 있다. 수많은 원천으로부터의 HMG CoA 리아제를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열이 이용가능하다. 일반적으로, 이들 서열은 단지 중간 정도의 전체 서열 동일성을 공유한다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 또는 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis)로부터의 상기 효소는 인간 HMG CoA 리아제의 서열에 대해 불과 약 45%의 동일성을 나타낸다 (문헌 [Forouhar et al., J. Biol. Chem. 281 (2006), 7533-7545]). 다양한 HMG CoA 리아제 효소의 3차원적 구조가 결정되었으며, 그의 효소적 반응에 중대한 아미노산도 대체적으로 특징분석이 잘 되어있다 (문헌 [Forouhar et al., loc. cit.]; [Fu et al., J. Biol. Chem. 281 (2006), 7526-7532]). 진핵생물에서 HMG CoA 리아제는 미토콘드리아 기질 내에 위치해 있다.
원칙적으로 본 발명의 맥락에서 임의의 HMG CoA 리아제 효소가 사용될 수 있는데, 특히 원핵 또는 진핵 유기체로부터의 것이 사용될 수 있다.
원핵 HMG CoA 리아제로서는, 예를 들어, 브루셀라 아보르투스 (유니프롯 등록 번호 Q2YPL0 및 B2S7S2), 바실러스 서브틸리스 (유니프롯 등록 번호 O34873), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) (문헌 [Fu et al., loc. cit.]), 슈도모나스 시린게 (Pseudomonas syringae) (유니프롯 등록 번호 Q4ZTL2 및 Q4ZRW6), 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii) (유니프롯 등록 번호 P13703), 슈와넬라 피에조톨레란스 (Shewanella piezotolerans) (유니프롯 등록 번호 B8CRY9), 셀비브리오 자포니쿠스 (Cellvibrio japonicus) (유니프롯 등록 번호 B3PCQ7), 아조토박터 비넬란디 (Azotobacter vinelandii) (유니프롯 등록 번호 C1DJK8 및 C1DL53), 헤르미니모나스 아르세니콕시단스 (Herminiimonas arsenicoxydans) (유니프롯 등록 번호 A4G1F2) 및 부르크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia) (유니프롯 등록 번호 A2VUW7)로부터의 것이 기재되어 있다.
나아가, 하기 표 B에는 일부 공지된 원핵생물로부터의 HMG CoA 리아제가 열거되어 있다:
[표 B]
Figure pct00007
Figure pct00008
진핵 HMG CoA 리아제로는, 예를 들어, 식물, 예컨대 무 (라파누스 사티부스 (Raphanus sativus)) 및 제아 마이스 (Zea mays) (등록 번호 B6U7B9, 진 뱅크 ACG45252) 및 동물, 예컨대 인간 (호모 사피엔스; 유니프롯 등록 번호 P35914), 사이노몰거스 원숭이 (Cynomolgus monkey) (유니프롯 등록 번호 Q8XZ6), 수마트라 오랑우탄 (퐁고 아벨리 (Pongo abelii); 유니프롯 등록 번호 Q5R9E1), 래트 (라투스 노르베기쿠스; 유니프롯 등록 번호 P97519; 문헌 [Fu et al., loc. cit.]), 무스 무스쿨루스 (유니프롯 등록 번호 P38060), 오리 (아나스 (Anas) 종), 소 (보스 타우루스 (Bos taurus); 유니프롯 등록 번호 Q29448), 염소 (카프라 히르쿠스 (Capra hircus)), 비둘기 (콜룸바 리비아 (Columba livia)), 닭 (갈루스 갈루스; 유니프롯 등록 번호 P35915), 양 (오비스 아리에스 (Ovis aries)), 돼지 (수스 스크로파), 다니오 레리오 (Danio rerio) (브라키다니오 레리오 (Brachydanio rerio); A8WG57, 진 뱅크 BC154587) 및 원생동물인 테트라히메나 피리포르미스 (Tetrahymena pyriformis)로부터의 것이 기재되어 있다.
여러 유기체로부터의 HMG CoA 리아제의 예가 서열 17 내지 23에 제시되어 있다. 서열 17은 제아 마이스 (등록 번호 B6U7B9, 진 뱅크 ACG45252)의 HMG CoA 리아제의 서열을 나타내고, 서열 18은 다니오 레리오 (브라키다니오 레리오; A8WG57, 진 뱅크 BC154587)의 HMG CoA 리아제의 서열을 나타내고, 서열 19는 보스 타우루스 (유니프롯 등록 번호 Q29448)의 HMG CoA 리아제의 서열을 나타내고, 서열 20은 호모 사피엔스 (미토콘드리아, 유니프롯 등록 번호 P35914, 진 뱅크 HUMHYMEGLA)의 HMG CoA 리아제의 서열을 나타내고, 서열 21은 슈도모나스 푸티다 (Q88H25)의 HMG CoA 리아제의 서열을 나타내고, 서열 22는 아시네토박터 바우만니 (B7H4C6)의 HMG CoA 리아제의 서열을 나타내고, 서열 23은 테르무스 테르모필루스 (Q72IH0)의 HMG CoA 리아제의 서열을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 HMG CoA 리아제는, 서열 17 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 서열 17 내지 23 중 어느 하나와 적어도 n% 동일한 서열을 포함하고 HMG CoA 리아제의 활성을 가지며, 여기서 n이 10 내지 100의 정수, 바람직하게는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99인 효소이다.
서열 동일성 정도의 측정에 관해서는, HMG CoA 신타제와 관련하여 상기 개시된 바와 동일한 것이 적용된다.
본 발명에 따른 방법에서 이용되는 HMG CoA 리아제는 천연 발생 HMG CoA 리아제일 수 있고, 또는 천연 발생 HMG CoA 리아제로부터 (예를 들어, 돌연변이 또는 다른 변경, 예컨대 효소 활성, 안정성 등을 변경 또는 개선시키는 돌연변이 또는 다른 변경의 도입에 의해)유래된 HMG CoA 리아제일 수 있다.
본 출원의 맥락에서 용어 "HMG CoA 리아제" 또는 "HMG CoA 리아제의 활성을 갖는 단백질/효소"는 또한, 아세톤과 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물, 바람직하게는 아세틸-CoA의 축합에 의해 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA를 생성할 수 있는 한편, 아세토아세테이트에 대해 기질로서는 단지 낮은 친화도를 갖거나 또는 아세토아세테이트를 기질로서 더 이상 수용하지 않는, HMG CoA 리아제 유래의 효소를 포함한다. HMG CoA 리아제의 바람직한 기질에 대한 상기와 같은 변형에 의해, 아세톤의 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA로의 전환이 개선될 수 있고 부-생성물인 HMG-CoA의 생성이 감소될 수 있다. 단백질의 상기 목적하는 효소 활성을 변형 및/또는 개선시키는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 이에 대해서는 상기에 기재되어 있다.
3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA의 생성을 촉매할 수 있는 주어진 효소의 능력은 실시예 6에 기재된 분석법에서 측정할 수 있다.
아세톤을 기질로서 수용하는 한편 아세토아세테이트에 대해 기질로서 낮은 친화도를 갖거나 아세토아세테이트를 기질로서 더 이상 수용하지 않는 HMG CoA 리아제의 변형된 형태는 천연 발생 HMG CoA 리아제 또는 이미 변형되었거나, 최적화되었거나 또는 합성에 의해 합성된 HMG CoA 리아제로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 정의된 바의 단 하나의 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 단독 또는 HMG CoA 리아제 단독 또는 PksG 단백질 단독을 이용하는 것이 가능하다. 그러나, 또한 2 이상의 활성, 즉 상이한 효소, 특히 HMG CoA 신타제 및 HMG CoA 리아제 및 PksG 단백질의 임의의 조합을 이용하는 것도 물론 가능하다. 예를 들어, 시험관내 방법의 경우, 2 이상의 효소 활성을 동시에 또는 임의의 가능한 순서로 순차적으로 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 유기체, 특히 미생물을 이용하는 생체내 방법에서는, 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 효소를 발현하는 유기체, 특히 미생물을 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 상기 언급한 효소들의 임의의 가능한 조합을 발현하는 유기체/미생물을 사용하는 것도 또한 고려할 수 있다. 나아가, 하나의 유형은 하나의 효소를 발현하고, 또다른 유형은 또다른 효소를 발현하는, 2 이상의 유형의 유기체/미생물의 혼합물을 사용하는 것도 또한 가능하다. 그 후에, 이들 상이한 유형을 동시배양할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 이용되는 상기 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 PksG 단백질 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제는 해당 단백질의 천연 형태 또는 합성 단백질, 이뿐 아니라, 화학적으로 합성되거나 또는 생물학적 시스템에서 또는 재조합 방법에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 상기 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 PksG 단백질 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제는 또한, 예컨대 이의/이들의 정제 또는 지지체 상의 고정화를 용이하게 하기 위한 목적으로, 예를 들어 이의/이들의 안정성, 내성 (예를 들어 온도에 대한 내성)을 향상시키기 위해, 화학적으로 변형될 수 있다. 상기 효소/효소들은 단리된 형태, 정제된 형태, 고정화된 형태로, 상기 효소/효소들을 합성하는 세포로부터 수득한 미정제 또는 부분 정제된 추출물로서, 화학적으로 합성된 효소(들), 재조합적으로 생성된 효소(들)로서, 이들을 생성하는 미생물의 형태로 등으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 시험관내에서 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 시험관내 반응은 세포가 이용되지 않는 반응, 즉 무세포 반응으로 이해하면 된다.
상기 방법을 시험관내에서 실시함에 있어서, 상기 효소/효소들이 활성이 되도록 하여 효소적 전환이 일어나게 하는 조건 (완충제, 온도, 보조인자 등) 하에서 상기 반응에 대한 기질 및 상기 효소/효소들을 인큐베이션한다. 3-히드록시-3-메틸부티레이트가 생성되기에 충분한 시간 동안 반응을 진행시킨다. 3-히드록시-3-메틸부티레이트 및/또는 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA의 생성은 그의 유도체화 후 박층 크로마토그래피, LC/MS 및 비색 분석법에 의한 분리 후에 표준 화합물과 비교하여 검출할 수 있다.
상기 효소/효소들은 효소 반응이 일어날 수 있게 하는 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다. 이/이들은 정제되거나 또는 부분 정제될 수 있고, 또는 미정제 세포 추출물 또는 부분 정제된 추출물의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 효소/효소들이 적합한 담체 상에 고정화되는 것도 가능하다.
기질로서의 아세톤이 해당 효소에 의해 사용되는 천연 기질, 예를 들어 각각 HMG CoA 신타제 및 HMG CoA 리아제에 의해 사용되는 아세토아세틸-CoA/아세토아세테이트보다 일반적으로 더 짧기 때문에, 상기 효소/효소들의 촉매 부위에서 입체적 및/또는 전자적 상보성을 허용하는 보조인자를 반응 혼합물에 첨가하는 것이 유리할 수 있다. HMG CoA 신타제의 경우 그러한 보조인자의 한가지 예는 조효소 A 또는 구조적으로 밀접히 관련된 분자, 예컨대 S-니트로소-CoA일 것이다.
상기 방법을 생체내에서 실시하는 경우, 기질, 즉 아세톤 및 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물을 제공할 수 있는 적합한 유기체/미생물(들), 및 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소가 이용된다. 바람직한 실시양태에서 상기 효소는 HMG CoA 신타제 및/또는 PksG 단백질 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제이다.
따라서, 이 실시양태의 경우 본 발명에 따른 방법은, 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 전환이 아세톤을 생성할 수 있으며 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간 공유 결합을 형성할 수 있는 효소를 발현할 수 있는, 바람직하게는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 활성을 갖는 효소를 발현하고/하거나 PksG 단백질을 발현하고/하거나 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제 (EC 4.1.3.4)의 활성을 갖는 효소를 발현할 수 있는 유기체, 바람직하게는 미생물의 존재 하에서 실현되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "아세톤을 생성할 수 있는"이란, 유기체/미생물이 대사성 전구체로부터의 아세톤의 생성을 가능하게 하는 효소 활성을 제공하는 효소의 존재로 인해 세포 내에서 아세톤을 생성하는 능력을 가진 것을 의미한다.
아세톤은 특정 미생물, 예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 베이제링키 (Clostridium beijerinckii), 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰 (Clostridium cellulolyticum), 바실러스 폴리믹사 (Bacillus polymyxa) 및 슈도모나스 푸티다에 의해 생성된다. 아세톤의 합성은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰에서 특징분석이 가장 잘 되어 있다. 이는, 2개의 아세틸-CoA 분자가 아세토아세틸-CoA로 축합되는 반응 (반응 단계 1)로 시작된다. 이 반응은 아세틸-CoA 아세틸트랜스페라제 (EC 2.3.1.9)에 의해 촉매된다. 그 후, 아세토아세틸-CoA는 아세틸-CoA 또는 부티릴-CoA의 생성을 또한 가져오는 아세트산 또는 부티르산과의 반응에 의해 아세토아세테이트로 전환된다 (반응 단계 2). 이 반응은 예를 들어 아세토아세틸CoA 트랜스페라제 (EC 2.8.3.8)에 의해 촉매된다. 다양한 유기체로부터의 아세토아세틸CoA 트랜스페라제가 공지되어 있는데, 예를 들어 이. 콜리 (E. coli) (여기서 상기 트랜스페라제는 atoAD 유전자에 의해 코딩됨) 또는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (여기서 상기 트랜스페라제는 ctfAB 유전자에 의해 코딩됨)으로부터의 것이 공지되어 있다.
그러나, 또한 다른 효소도 이 반응을 촉매할 수 있는데, 예를 들어 3-옥소산 CoA 트랜스페라제 (EC 2.8.3.5) 또는 숙시네이트 CoA 리가제 (EC 6.2.1.5)가 있다.
최종적으로, 아세토아세테이트는 아세토아세테이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.4)에 의해 촉매되는 탈카르복실화 단계 (반응 단계 3)에 의해 아세톤으로 전환된다.
상기 기재한 반응 단계 1 및 2 및 이들을 촉매하는 효소는 아세톤 합성에 대해서만 특유한 것이 아니며, 다양한 유기체에서 발견할 수 있다. 이와 대조적으로, 아세토아세테이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.4)에 의해 촉매되는 반응 단계 3은 아세톤을 생성할 수 있는 유기체에서만 발견된다.
한 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 방법에서 이용되는 유기체는 천연적으로 아세톤을 생성하는 능력을 가진 유기체, 바람직하게는 미생물이다. 따라서, 바람직하게는 상기 미생물은 클로스트리디움 속, 바실러스 속 또는 슈도모나스 속, 보다 바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 종, 클로스트리디움 베이제링키 종, 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰 종, 바실러스 폴리믹사 종 또는 슈도모나스 푸티다 종에 속하는 것이다.
추가로 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 이용되는 유기체는, 천연적으로 아세톤을 생성하는 능력을 가진 것으로서 상기 정의된 바의 효소를 발현하도록 추가적으로 유전적으로 변형되었다는 의미에서 재조합인 유기체, 바람직하게는 미생물이다. 한 실시양태에서 용어 "재조합"이란, 유기체가 상기 정의된 바의 효소를 코딩하는 외래의 핵산 분자를 함유하도록 유전적으로 변형된 것을 의미한다. 바람직한 실시양태에서 상기 유기체는 상기 정의된 바의 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제, C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 또는 PksG 단백질을 코딩하는 외래의 핵산 분자 또는 상기 단백질의 임의의 가능한 조합물을 코딩하는 외래의 핵산 서열을 함유하도록 유전적으로 변형된 것이다. 본 맥락에서 용어 "외래"란 해당 핵산 분자가 상기 유기체/미생물에서 천연적으로는 나타나지 않는 것을 의미한다. 이는 상기 핵산 분자가 상기 유기체/미생물에서 동일한 구조로 또는 동일한 위치에서 나타나지 않는 것을 의미한다. 한 바람직한 실시양태에서, 외래의 핵산 분자는, 각각의 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질을 코딩하는 코딩 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 분자로서, 여기서 코딩 서열의 발현을 이끄는 프로모터가 해당 코딩 서열에 대해 이종성인 재조합 분자이다. 본 맥락에서 이종성은 해당 프로모터가 상기 코딩 서열의 발현을 천연적으로 이끄는 프로모터가 아니라 상이한 코딩 서열의 발현을 천연적으로 이끄는 프로모터인 것, 즉, 상기 프로모터가 또다른 유전자로부터 유래한 것이거나, 또는 합성 프로모터 또는 키메라 프로모터인 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 유기체/미생물에 대해 이종성인 프로모터, 즉 각각의 유기체/미생물에서 천연적으로 나타나지 않는 프로모터이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 프로모터는 유도성 프로모터이다. 상이한 유형의 유기체, 특히 미생물에서의 발현을 이끄는 프로모터는, 당업자에 익히 공지되어 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서 핵산 분자는, 코딩된 효소(들), 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 코딩된 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질이 해당 유기체/미생물에 대해 내인성이 아닌, 즉 유전적으로 변형되지 않는 경우 천연적으로는 상기 유기체/미생물에 의해 발현되지 않는다는 점에서 상기 유기체/미생물에 대해 외래적이다. 다시 말해, 코딩된 HMG CoA 신타제 및/또는 코딩된 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질은 유기체/미생물에 대해 이종성이다.
또다른 실시양태에서 용어 "재조합"은, 해당 유기체에서 천연적으로 나타나는 상기 정의된 바의 효소의 발현을 조절하는 조절 영역에서 유기체가 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체에 비해 각각의 효소의 발현이 증가되도록 유전적으로 변형되어 있는 것을 의미한다. "더욱 높은 발현"이라는 용어의 의미는 이하에서 더욱 설명된다.
상기와 같은 조절 영역의 변형은 당업자에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 한가지 예는 천연 발생 프로모터를 더욱 높은 발현을 허용하는 프로모터로 교체하는 것 또는 더욱 높은 발현을 나타내도록 천연 발생 프로모터를 변형시키는 것이다. 따라서, 이 실시양태에서 유기체는 상기 정의된 바의 효소를 코딩하는 유전자의 조절 영역에서, 상기 유기체에서 천연적으로는 나타나지 않는 것으로서 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체와 비교하여 해당 효소의 더욱 높은 발현을 초래하는 외래의 핵산 분자를 함유한다.
외래의 핵산 분자는 유기체/미생물에서 염색체외 형태로, 예를 들어 플라스미드로서 존재하거나, 또는 염색체 내에 안정적으로 통합되어 존재할 수 있다. 안정적인 통합이 바람직하다.
추가로 바람직한 실시양태에서 유기체/미생물은 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물과 비교하여 외래의 핵산 분자로 유전적으로 변형된 유기체/미생물에서 상기 정의된 바의 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질의 발현/활성이 더욱 높은 것을 특징으로 한다. "더욱 높은" 발현/활성이란, 유전적으로 변형된 미생물에서 상기 효소, 특히 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질의 발현/활성이 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물에서보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70% 또는 80% 및 특히 바람직하게는 적어도 90% 또는 100% 더 높다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서 발현/활성의 증가는 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 500%일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서 발현은 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물에서보다 적어도 10배, 보다 바람직하게는 적어도 100배 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 1000배 더 높다.
용어 "더욱 높은" 발현/활성은 또한 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물이 상응하는 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질을 발현하지 않아서, 유전적으로 변형되지 않은 유기체/미생물에서의 상응하는 발현/활성이 전혀 없는 상황을 포함한다.
세포에서 주어진 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 발현 수준에 대한 측정은 상응하는 단백질의 양을 측정함으로써 수행된다. 이에 상응하는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 여기에는 웨스턴 블롯, ELISA 등이 포함된다. 또다른 실시양태에서 발현 수준의 측정은 상응하는 RNA의 양을 측정함으로써 수행된다. 이에 상응하는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 여기에는 예를 들어, 노던 블롯이 포함된다.
상기 언급한 효소, 특히 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질 각각의 효소 활성을 측정하는 방법도 당업계에 공지되어 있으며, 이에 대해서는 상기에서 이미 기재되었다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 이용되는 유기체는, 천연적으로는 아세톤을 생성하지 않으나 아세톤을 생성하도록 유전적으로 변형된, 즉 유기체/미생물에서 아세톤의 생성을 가능하게 하는데 필요한 유전자(들)를 도입함으로써 변형된 유기체/미생물로부터 유래된 유전적으로 변형된 유기체, 바람직하게는 미생물이다. 원칙적으로 임의의 미생물을 상기 방식으로 유전적으로 변형시킬 수 있다. 아세톤의 합성을 담당하는 효소는 상기에서 기재되었다. 상응하는 효소를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 이들을 사용하여 주어진 미생물을 아세톤을 생성하도록 유전적으로 변형할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 아세톤 합성의 반응 단계 1 및 2는 대부분의 유기체에서 일어난다. 그러나, 반응 단계 3은 아세톤 합성에서 특유하며 중대한 것이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 천연적으로는 아세톤을 생성하지 않는 유기체/미생물로부터 유래된 유전적으로 변형된 유기체/미생물은, 탈카르복실화에 의한 아세토아세테이트의 아세톤으로의 전환을 촉매하는 효소, 예를 들어 아세토아세테이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.4)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하도록 변형된다. 상기 효소를 코딩하는, 여러 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (유니프롯 등록 번호 P23670 및 P23673), 클로스트리디움 베이제링키 (클로스트리디움 MP; Q9RPK1), 클로스트리디움 파스테우리아눔 (Clostridium pasteurianum) (유니프롯 등록 번호 P81336), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium) 종 (균주 BTAi1 / ATCC BAA-1182; 유니프롯 등록 번호 A5EBU7), 부르크홀데리아 말레이 (Burkholderia mallei) (ATCC 10399 A9LBS0), 부르크홀데리아 말레이 (유니프롯 등록 번호 A3MAE3), 부르크홀데리아 말레이 FMH A5XJB2, 부르크홀데리아 세노세파시아 (유니프롯 등록 번호 A0B471), 부르크홀데리아 암비파리아 (유니프롯 등록 번호 Q0b5P1), 부르크홀데리아 피토피르만스 (Burkholderia phytofirmans) (유니프롯 등록 번호 B2T319), 부르크홀데리아 종 (유니프롯 등록 번호 Q38ZU0), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) (유니프롯 등록 번호 B2TLN8), 랄스토니아 피케티 (Ralstonia pickettii) (유니프롯 등록 번호 B2UIG7), 스트렙토미세스 노갈라테르 (Streptomyces nogalater) (유니프롯 등록 번호 Q9EYI7), 스트렙토미세스 아베르미틸리스 (유니프롯 등록 번호 Q82NF4), 레지오넬라 뉴모필라 (유니프롯 등록 번호 Q5ZXQ9), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) (유니프롯 등록 번호 Q1WVG5), 로도코커스 (Rhodococcus) 종 (유니프롯 등록 번호 Q0S7W4), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) (유니프롯 등록 번호 Q890G0), 리조비움 레구미노사룸 (Rhizobium leguminosarum) (유니프롯 등록 번호 Q1M911), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei) (유니프롯 등록 번호 Q03B66), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) (유니프롯 등록 번호 Q0BLC9), 사카로폴리스포라 에리트레아에 (Saccharopolyspora erythreae) (유니프롯 등록 번호 A4FKR9), 코라르카에움 크립토필룸 (Korarchaeum cryptofilum) (유니프롯 등록 번호 B1L3N6), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (유니프롯 등록 번호 A7Z8K8), 코클리오볼루스 헤테로스트로푸스 (Cochliobolus heterostrophus) (유니프롯 등록 번호 Q8NJQ3), 술폴로부스 이슬란디쿠스 (Sulfolobus islandicus) (유니프롯 등록 번호 C3ML22) 및 프란시셀라 툴라렌시스 아종 홀락티카 (holarctica) (균주 OSU18)로부터의 adc 유전자가 있다.
보다 바람직하게는, 상기 유기체, 바람직하게는 미생물은 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 2, 즉 아세토아세틸 CoA의 아세토아세테이트로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환되도록 유전적으로 변형된다.
보다 더 바람직하게는, 상기 유기체, 바람직하게는 미생물은, 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 1, 즉 2개의 아세틸 CoA 분자의 아세토아세틸 CoA로의 축합을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환되도록 유전적으로 변형된다.
특히 바람직한 실시양태에서 유기체/미생물은, 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 1을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 2를 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 1을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 3을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 2를 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 3을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 1을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 2를 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 3을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환되도록 유전적으로 변형된다.
상기 언급한 유전적으로 변형된 유기체, 바람직하게는 미생물을 제조하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 따라서, 일반적으로, 상기 유기체/미생물은 해당 미생물에서 각각의 효소의 발현을 허용하는 DNA 구축물로 형질전환된다. 그러한 구축물은 각각의 숙주 세포에서 전사 및 번역을 가능하게 하는 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/인핸서 및/또는 전사 종결자 및/또는 리보솜 결합 부위 등에 연결된 문제의 코딩 서열을 정상적으로 포함한다. 선행 기술에서는 아세톤을 생성할 수 있도록 유전적으로 변형된 미생물이 이미 기재되어 있다. 특히, 예를 들어, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 유전자를 이. 콜리 내로 도입하여, 그에 따라 천연적으로는 아세톤을 생성하지 않는 박테리아인 이. 콜리에서 아세톤의 합성이 가능하게 되었다 (문헌 [Bermejo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079-1085]; [Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814-7818]). 특히 문헌 [Hanai et al. (loc. cit.)]은 이. 콜리에서 아세톤 생성을 달성하기 위해 아세토아세테이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산 서열 (예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 것)을 도입하는 것이 충분하다는 것을 제시하는데, 이는 상기 언급한 반응 단계 1 및 2를 촉매하는 이. 콜리 내의 내인성 효소 (즉 이. 콜리 atoB 및 atoAD 유전자의 발현 생성물)가 아세톤 생성을 위한 기질을 제공하기에 충분하다는 것을 시사한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 이용되는 유기체, 바람직하게는 미생물은, 천연적으로는 아세톤을 생성하지 않는 유기체/미생물로부터 유래된 것으로서 상기 기재된 바와 같이 아세톤을 생성하도록 유전적으로 변형되어 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 발현하는 재조합 유기체/미생물이다. 본 맥락에서 용어 "재조합"은 바람직하게는 유기체가 상기 정의된 바의 효소를 발현하도록 추가로 유전적으로 변형되었다는 의미에서 재조합인 것을 의미한다. 한 실시양태에서 용어 "재조합"은 유기체가 상기 정의된 바의 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 또는 PksG 단백질을 코딩하는 외래의 핵산 분자, 또는 상기 정의된 효소들의 임의의 가능한 조합물을 코딩하는 외래의 핵산 분자를 함유하도록 유전적으로 변형된 것을 의미한다.
용어 "외래의 핵산 분자"의 정의에 관해서는 상기에서 이미 개시된 바와 동일한 것이 적용된다.
또다른 실시양태에서 용어 "재조합"은, 해당 유기체 내에서 천연적으로 나타나는 상기 정의된 바의 효소의 발현을 조절하는 조절 영역에서 각각의 효소의 발현이 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체와 비교하여 증가되도록 유기체가 유전적으로 변형된 것을 의미한다. 용어 "더욱 높은 발현"의 의미는 이하에서 더욱 설명된다.
상기와 같은 조절 영역의 변형은 당업자에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 한가지 예는 천연 발생 프로모터를 더욱 높은 발현을 허용하는 프로모터로 교체하는 것 또는 더욱 높은 발현을 나타내도록 천연 발생 프로모터를 변형시키는 것이다. 따라서, 이 실시양태에서 유기체는 상기 정의된 바의 효소를 코딩하는 유전자의 조절 영역에서, 상기 유기체에서 천연적으로는 나타나지 않는 것으로서 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체와 비교하여 해당 효소의 더욱 높은 발현을 초래하는 외래의 핵산 분자를 함유한다.
바람직하게는 상기와 같은 유기체/미생물은, 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물과 비교하여 상기 재조합 유기체/미생물에서 상기 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질의 발현/활성이 더욱 높은 것을 특징으로 한다. "더욱 높은" 발현/활성이란, 유전적으로 변형된 유기체/미생물에서의 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질의 발현/활성이 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물에서보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70% 또는 80% 및 특히 바람직하게는 적어도 90% 또는 100% 더 높다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서 발현/활성의 증가는 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 500%일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서 상기 발현은 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물에서보다 적어도 10배, 보다 바람직하게는 적어도 100배 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 1000배 더 높다.
용어 "더욱 높은" 발현/활성은 또한 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물이 상기 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질을 발현하지 않아서, 유전적으로 변형되지 않은 유기체/미생물에서의 상응하는 발현/활성이 전혀 없는 상황을 포함한다.
발현 수준 또는 활성을 측정하는 방법에 관해서는, 상기에서 이미 기재된 바와 동일한 것이 적용된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "유기체"는 일반적으로 임의의 가능한 유형의 유기체, 특히 진핵 유기체, 원핵 유기체 및 고세균 (archaebacteria)을 지칭한다. 이 용어에는 동물, 식물, 균류, 박테리아 및 고세균이 포함된다. 이 용어에는 또한 상기 유기체의 단리된 세포 또는 세포 응집체 (예컨대, 조직 또는 칼루스)가 포함된다.
한 바람직한 실시양태에서, 유기체는 미생물이다. 본 발명의 맥락에서 용어 "미생물"은 원핵 세포, 특히 박테리아, 이뿐 아니라 균류, 예컨대 효모, 및 또한 조류 (algae) 및 고세균을 지칭한다. 한 바람직한 실시양태에서, 미생물은 박테리아이다. 원칙적으로 임의의 박테리아가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 이용되기에 바람직한 박테리아는 바실러스 속, 클로스트리디움 속, 슈도모나스 속 또는 에스케리키아 (Escherichia) 속의 박테리아이다. 특히 바람직한 실시양태에서 박테리아는 에스케리키아 속에 속하는 것이며, 더욱 더 바람직게는 에스케리키아 콜리 종에 속하는 것이다.
또다른 바람직한 실시양태에서 미생물은 균류이며, 보다 바람직하게는 사카로미세스 속, 스키조사카로미세스 속, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속 또는 트리코데르마 (Trichoderma) 속의 균류 및 보다 더 바람직하게는 사카로미세스 세레비시애 종, 스키조사카로미세스 폼베 종, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 종 또는 트리코데르마 리세이 (Trichoderma reesei) 종의 균류이다.
또다른 바람직한 실시양태에서 미생물은 광합성적으로 활성인 미생물, 예컨대 광합성을 수행할 수 있는 박테리아 또는 미세조류이다.
특히 바람직한 실시양태에서 미생물은 조류이며, 보다 바람직하게는 규조류에 속하는 조류이다.
본 발명의 방법의 맥락에서 미생물이 사용되는 경우, 본 발명에 따른 방법을 2가지 유형의 미생물을 이용하는 방식으로 실시하는 것을 또한 고려할 수 있는데, 즉 아세톤을 생성하는 한가지 유형 및 상기 첫번째 유형의 미생물에 의해 생성된 아세톤을 사용하여 본원에서 상기 정의된 바와 같은 효소의 도움을 받아 이를 전환하는 한가지 유형을 이용하는 것을 고려할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 각각의 효소 활성/활성들을 제공하는 미생물을 이용하여 생체내에서 실시하는 경우, 미생물을 효소 반응(들)이 일어날 수 있게 하는 적합한 배양 조건 하에서 배양한다. 특정 배양 조건은 이용되는 특정 미생물에 따라 다르나, 이는 당업자에 익히 공지되어 있다. 배양 조건은 일반적으로 각각의 반응을 위한 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 허용하는 방식으로 선택된다. 특정 배양 단계에서 특정 유전자의 발현을 향상 및 미세조정하기 위한 다양한 방법이 당업자에 공지되어 있는데, 예컨대 화학적 유도제 또는 온도 변화에 의한 유전자 발현의 유도가 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 이용되는 유기체는 광합성을 할 수 있는 유기체, 예컨대 식물 또는 미세조류이다. 원칙적으로 임의의 가능한 식물이 사용될 수 있는데, 즉 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 사용될 수 있다. 농업상 의미있는 규모로 경작될 수 있으며 대량의 바이오매스 (biomass) 생성을 가능하게 하는 식물을 사용하는 것이 바람직하다. 예로서는, 쥐보리 (Lolium)와 같은 풀, 호밀, 보리, 귀리, 수수, 옥수수와 같은 곡물, 감자와 같은 다른 전분 저장 식물 또는 사탕수수 또는 사탕무와 같은 당 저장 식물이 있다. 또한, 담배 또는 채소 식물, 예컨대 토마토, 고추, 오이, 가지 등을 이용하는 것을 고려할 수 있다. 또다른 가능한 것은 오일 저장 식물, 예컨대 유채 종자, 올리브 등을 이용하는 것이다. 또한, 나무, 특히 속성수, 예컨대 유칼립투스, 포플러 또는 고무 나무 (헤베아 브라실리엔시스 (Hevea brasiliensis))를 이용하는 것을 고려할 수 있다.
본 발명은 또한 하기 특징을 특징으로 하는 유기체, 바람직하게는 미생물에 관한 것이다:
(a) 아세톤을 생성할 수 있음; 및
(b) 상기 정의된 바와 같은 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소, 바람직하게는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 활성을 갖는 효소 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제 (EC 4.1.3.4)의 활성을 갖는 효소 및/또는 PksG 단백질을 발현함.
본 발명에 따른 유기체에서 발현되는 효소, 특히 HMG CoA 신타제, C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질의 원천, 성질, 특성, 서열 등에 관해서는, 본 발명에 따른 방법과 관련하여 상기에서 개시된 바와 동일한 것이 적용된다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 유기체는 천연적으로 아세톤을 생성하는 능력을 가진 유기체, 바람직하게는 미생물로서, 즉, 상기 언급한 특징 (a)가 상기 유기체, 바람직하게는 미생물이 천연적으로 나타내는 특징이다. 따라서, 바람직하게는 상기 유기체는 클로스트리디움 속, 바실러스 속 또는 슈도모나스 속, 보다 바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 종, 클로스트리디움 베이제링키 종, 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰 종, 바실러스 폴리믹사 종 또는 슈도모나스 푸티다 종에 속하는 미생물이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 유기체, 바람직하게는 미생물은 천연적으로는 아세톤을 생성하지 않는 유기체/미생물로부터 유래된 것으로서 해당 유기체/미생물에서의 아세톤의 생성을 가능하게 하는데 필요한 유전자(들)의 도입에 의해 아세톤을 생성하도록 유전적으로 변형된, 유전적으로 변형된 유기체/미생물이다. 원칙적으로 임의의 미생물을 상기 방식으로 유전적으로 변형시킬 수 있다. 아세톤의 합성을 담당하는 효소는 상기에서 기재되었다. 상응하는 효소를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 이들을 사용하여 주어진 유기체, 바람직하게는 미생물을 아세톤을 생성하도록 유전적으로 변형할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 천연적으로는 아세톤을 생성하지 않는 유기체/미생물로부터 유래된 유전적으로 변형된 유기체/미생물은 탈카르복실화에 의한 아세토아세테이트의 아세톤으로의 전환을 촉매하는 효소, 예를 들어 아세토아세테이트 데카르복실라제 (EC 4.1.1.4)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하도록 변형된다. 상기 효소를 코딩하는, 여러 유기체로부터의 뉴클레오티드 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 adc 유전자가 있다. 보다 바람직하게는, 상기 유기체/미생물은 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 2, 즉 아세토아세틸 CoA의 아세토아세테이트로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환되도록 유전적으로 변형된다.
보다 더 바람직하게는, 상기 유기체/미생물은, 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 1, 즉 2개의 아세틸 CoA 분자의 아세토아세틸 CoA로의 축합을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환되도록 유전적으로 변형된다.
특히 바람직한 실시양태에서 상기 유기체/미생물은, 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 1을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 2를 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 1을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 3을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 2를 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 3을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 1을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 2를 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 언급한 아세톤 합성의 반응 단계 3을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 분자로 형질전환되도록 유전적으로 변형된다.
상기 언급한 유전적으로 변형된 유기체/미생물을 제조하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 따라서, 일반적으로, 상기 유기체/미생물은 해당 유기체/미생물에서의 각각의 효소의 발현을 가능하게 하는 DNA 구축물로 형질전환된다. 그러한 구축물은 정상적으로는 각각의 숙주 세포에서 전사 및 번역을 가능하게 하는 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/인핸서 및/또는 전사 종결자 및/또는 리보솜 결합 부위 등에 연결된 문제의 코딩 서열을 포함한다. 선행 기술에서는 아세톤을 생성할 수 있도록 유전적으로 변형된 유기체, 특히 미생물이 이미 기재되어 있다. 특히, 예를 들어, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 유전자를 이. 콜리 내로 도입하여, 그에 따라 천연적으로는 아세톤을 생성하지 않는 박테리아인 이. 콜리에서 아세톤의 합성이 가능하게 되었다 (문헌 [Bermejo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079-1085]; [Hanai et at., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814-7818]). 특히 문헌 [Hanai et al. (loc. cit.)]은 이. 콜리에서 아세톤 생성을 달성하기 위해 아세토아세테이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산 서열 (예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 것)을 도입하는 것이 충분하다는 것을 제시하는데, 이는 상기 언급한 반응 단계 1 및 2를 촉매하는 이. 콜리 내의 내인성 효소 (즉 이. 콜리 atoB 및 atoAD 유전자의 발현 생성물)가 아세톤 생성을 위한 기질을 제공하기에 충분하다는 것을 시사한다.
추가로 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 유기체, 바람직하게는 미생물은 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 발현하도록 유전적으로 변형되어 있다. 본 맥락에서, 용어 "재조합"은 첫번째 측면으로 유기체가 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 외래의 핵산 분자, 바람직하게는 HMG CoA 신타제를 코딩하는 외래의 핵산 분자 또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제를 코딩하는 외래의 핵산 분자, 또는 PksG 단백질을 코딩하는 외래의 핵산 분자 또는 상기 언급한 특성을 갖는 효소들의 임의의 가능한 조합물을 코딩하는 외래의 핵산 분자를 함유하는 것을 의미한다. 본 맥락에서 용어 "외래"란 해당 핵산 분자가 상기 유기체/미생물에서 천연적으로는 나타나지 않는 것을 의미한다. 이는 상기 핵산 분자가 상기 유기체/미생물에서 동일한 구조로 또는 동일한 위치에서 나타나지 않는 것을 의미한다. 한 바람직한 실시양태에서, 외래의 핵산 분자는 상기 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질을 코딩하는 코딩 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 분자로서, 여기서 코딩 서열의 발현을 이끄는 프로모터가 해당 코딩 서열에 대해 이종성인 재조합 분자이다. 본 맥락에서 이종성은 해당 프로모터가 상기 코딩 서열의 발현을 천연적으로 이끄는 프로모터가 아니라 상이한 코딩 서열의 발현을 천연적으로 이끄는 프로모터인 것, 즉, 상기 프로모터가 또다른 유전자로부터 유래한 것이거나, 또는 합성 프로모터 또는 키메라 프로모터인 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 유기체/미생물에 대해 이종성인 프로모터, 즉 각각의 유기체/미생물에서 천연적으로 나타나지 않는 프로모터이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 프로모터는 유도성 프로모터이다. 상이한 유형의 유기체, 특히 미생물에서의 발현을 이끄는 프로모터는, 당업자에 익히 공지되어 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서 핵산 분자는, 코딩된 효소(들), 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 코딩된 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질이 해당 유기체/미생물에 대해 내인성이 아닌, 즉 유전적으로 변형되지 않는 경우 천연적으로는 상기 유기체/미생물에 의해 발현되지 않는다는 점에서 상기 유기체/미생물에 대해 외래적이다. 다시 말해, 코딩된 효소(들), 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 코딩된 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 코딩된 PksG 단백질은 해당 유기체/미생물에 대해 이종성이다.
또다른 측면에서 용어 "재조합"은, 해당 유기체에서 천연적으로 나타나는 상기 정의된 바의 효소의 발현을 조절하는 조절 영역에서 각각의 효소의 발현이 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체에 비해 증가되도록 유기체가 유전적으로 변형되어 있는 것을 의미한다. "더욱 높은 발현"이라는 용어의 의미는 이하에서 더욱 설명된다.
상기와 같은 조절 영역의 변형은 당업자에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 한가지 예는 천연 발생 프로모터를 더욱 높은 발현을 허용하는 프로모터로 교체하는 것 또는 더욱 높은 발현을 나타내도록 천연 발생 프로모터를 변형시키는 것이다. 따라서, 이 실시양태에서 유기체는 상기 정의된 바의 효소를 코딩하는 유전자의 조절 영역에서, 상기 유기체에서 천연적으로는 나타나지 않는 핵산 분자로서 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체와 비교하여 해당 효소의 더욱 높은 발현을 초래하는 외래의 핵산 분자를 함유한다.
추가로 바람직한 실시양태에서 상기 유기체/미생물은, 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물과 비교하여 상기 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질의 발현/활성이 외래의 핵산 분자로 유전적으로 변형된 유기체/미생물에서 더욱 높은 것을 특징으로 한다. "더욱 높은" 발현/활성이란, 유전적으로 변형된 유기체/미생물에서의 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질의 발현/활성이 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물에서보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70% 또는 80% 및 특히 바람직하게는 적어도 90% 또는 100% 더욱 높은 것을 의미한다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서 발현/활성의 증가는 적어도 150%, 적어도 200% 또는 적어도 500%일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서 상기 발현은 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물에서보다 적어도 10배, 보다 바람직하게는 적어도 100배 및 더욱 더 바람직한 적어도 1000배 더 높다.
용어 "더욱 높은" 발현/활성은 또한, 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 유기체/미생물이 상응하는 효소, 예를 들어 HMG CoA 신타제 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제, 및/또는 PksG 단백질을 발현하지 않아서, 유전적으로 변형되지 않은 유기체/미생물에서의 상응하는 발현/활성이 전혀 없는 상황을 포함한다.
세포에서 주어진 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 발현 수준에 대한 측정은 상응하는 단백질의 양을 측정함으로써 수행된다. 이에 상응하는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 여기에는 웨스턴 블롯, ELISA 등이 포함된다. 또다른 실시양태에서 발현 수준의 측정은 상응하는 RNA의 양을 측정함으로써 수행된다. 이에 상응하는 방법도 당업자에 익히 공지되어 있으며, 여기에는 예를 들어, 노던 블롯이 포함된다.
상기 언급한 효소, 특히 HMG CoA 신타제 및/또는 HMG CoA 리아제 및/또는 PksG 단백질 각각의 효소 활성을 측정하는 방법도 당업계에 공지되어 있으며, 이에 대해서는 상기에서 이미 기재되었다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "유기체"는 일반적으로 임의의 가능한 유형의 유기체, 특히 진핵 유기체, 원핵 유기체 및 고세균을 지칭한다. 이 용어에는 동물, 식물, 균류, 박테리아 및 고세균이 포함된다. 이 용어에는 또한 상기 유기체의 단리된 세포 또는 세포 응집체 (예컨대, 조직 또는 칼루스)가 포함된다.
한 바람직한 실시양태에서, 유기체는 미생물이다. 본 발명의 맥락에서 용어 "미생물"은 원핵 세포, 특히 박테리아, 이뿐 아니라 균류, 예컨대 효모, 및 또한 조류 및 고세균을 지칭한다. 한 바람직한 실시양태에서, 미생물은 박테리아이다. 원칙적으로 임의의 박테리아가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 이용되기에 바람직한 박테리아는 바실러스 속, 클로스트리디움 속, 슈도모나스 속 또는 에스케리키아 속의 박테리아이다. 특히 바람직한 실시양태에서 박테리아는 에스케리키아 속에 속하는 것이며, 더욱 더 바람직게는 에스케리키아 콜리 종에 속하는 것이다.
또다른 바람직한 실시양태에서 미생물은 균류이며, 보다 바람직하게는 사카로미세스 속, 스키조사카로미세스 속, 아스페르길루스 속 또는 트리코데르마 속의 균류 및 보다 더 바람직하게는 사카로미세스 세레비시애 종, 스키조사카로미세스 폼베 종, 아스페르길루스 니게르 종 또는 트리코데르마 리세이 종의 균류이다.
또다른 바람직한 실시양태에서 미생물은 광합성적으로 활성인 미생물, 예컨대 광합성을 수행할 수 있는 박테리아 또는 미세조류이다.
특히 바람직한 실시양태에서 미생물은 조류이며, 보다 바람직하게는 규조류에 속하는 조류이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 유기체는 광합성을 할 수 있는 유기체, 예컨대 식물 또는 미세조류이다. 원칙적으로 임의의 가능한 식물이 사용될 수 있는데, 즉 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 사용될 수 있다. 농업상 의미있는 규모로 경작될 수 있으며 대량의 바이오매스 생성을 가능하게 하는 식물을 사용하는 것이 바람직하다. 예로서는, 쥐보리와 같은 풀, 호밀, 보리, 귀리, 수수, 옥수수와 같은 곡물, 감자와 같은 다른 전분 저장 식물 또는 사탕수수 또는 사탕무와 같은 당 저장 식물이 있다. 또한, 담배 또는 채소 식물, 예컨대 토마토, 고추, 오이, 가지 등을 이용하는 것을 고려할 수 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서 식물은 오일 저장 식물, 예컨대 유채 종자, 올리브 등이다. 또한, 나무, 특히 속성수, 예컨대 유칼립투스, 포플러 또는 고무 나무 (헤베아 브라실리엔시스)를 이용하는 것을 고려할 수 있다.
본 발명 또한 하기 특징을 특징으로 하는 유기체, 바람직하게는 미생물의 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 용도에 관한 것이다:
(a) 아세톤을 생성할 수 있음; 및
(b) 본원에서 상기 정의된 바와 같은 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소, 바람직하게는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 활성을 갖는 효소 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제 (EC 4.1.3.4)의 활성을 갖는 효소 및/또는 PksG 단백질을 발현함.
즉, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 유기체/미생물의 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 유기체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 또한, (i) 아세톤; 및 (ii) 본원에서 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물; 및 (iii) 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 본원에서 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 효소의 바람직한 실시양태에 대해서는, 본 발명에 따른 방법 및 유기체와 관련하여 상기에서 이미 개시된 바와 동일한 것이 적용된다.
나아가, 본 발명은 또한 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 본원에서 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소의 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 용도에 관한 것이다.
상기 효소의 바람직한 실시양태에 대해서는, 본 발명에 따른 방법 및 유기체와 관련하여 상기에서 이미 개시된 바와 동일한 것이 적용된다.
마지막으로, 본 발명은 또한, 아세톤 및 본원에서 상기 정의된 바와 같은 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 효소적 전환을 포함하는 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성에 있어서의 아세톤의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서 상기 효소적 전환은 본 발명에 따른 방법과 관련하여 상기 기재된 바와 같은 효소에 의해, 보다 바람직하게는 HMG CoA 신타제의 효소 활성을 갖는 효소 및/또는 C-C 결합 절단/축합 리아제, 예컨대 HMG CoA 리아제의 효소 활성을 갖는 효소, 및/또는 PksG 단백질에 의해 달성되며, 가장 바람직하게는 상기 전환은 본 발명에 따른 유기체를 이용하여 달성된다.
도 1: 3-히드록시-3-메틸부티르산 (또한 베타-히드록시이소발레레이트로도 지칭됨)의 화학적 구조
도 2: HMG-CoA 신타제에 의해 촉매되는 반응의 반응식
도 3: HMG-CoA 리아제에 의해 촉매되는 반응의 반응식
도 4: PksG 단백질에 의해 촉매되는 반응을 포함하는 pksX 경로의 반응의 반응식
도 5: 아세톤 및 활성화된 아세틸기를 함유하는 화합물의 3-히드록시-3-메틸부티르산으로의 전환에 대한 반응의 반응식
X는 S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C10H13N5O7P (조효소 A), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-폴리펩티드 (아실-운반 단백질), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-OH (판테테인), S-CH2-CH2-NH-CO-CH3 (N-아세틸-시스테아민), S-CH3 (메탄 티올), S-CH2-CH(NH2)-CO2H (시스테인), S-CH2-CH2-CH(NH2)-CO2H (호모시스테인), S-CH2-CH(NH-C5H8NO3)-CO-NH-CH2-CO2H (글루타티온), S-CH2-CH2-SO3H (조효소 M) 및 OH (아세트산)을 나타낸다.
도 6: 시판되는 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 질량 스펙트럼
도 7: 갈루스 갈루스 (P23228)로부터의 Hmg-CoA 신타제의 존재 하에서의 아세틸-CoA 및 아세톤으로부터의 3-히드록시-3-메틸부티레이트 형성에 대한 질량 스펙트럼.
도 8: 효소 부재의 대조 분석에서의 질량 스펙트럼.
도 9: 실시예 7에 기재된 바의 에스. 에피데르미디스의 HMG CoA 신타제를 이용한 반응에 대한 미카엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 곡선
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1
HMG-CoA 신타제 및 HMG-CoA 리아제 데이타베이스를 생성하는데 사용된 생물정보학적 방법
12개의 HMG-CoA 신타제 및 8개의 HMG-CoA 리아제의 집단을 선별하되, 진핵 유기체 도처에서 발견되는 이들 효소 부류의 다양성을 대표하도록 하기 위해 중복되지 않는 단백질 세트를 생성하도록 선별하였다. 이들 단백질에 대해서는 세계 단백질 자원 데이타베이스 (Universal Protein Resource Database) 유니프롯 (http://www.uniprot.org/)에서 다수의 서열-기반 및 문자-기반 검색을 수행하여 확인하였다. 이들은 모두 독특한 특징, 예컨대 관심 효소 부류에 특유한 보존된 단백질 도메인 및 모티프를 내포한다. 대규모의 단백질 세트를 스크리닝할 필요없이 상기 서열 다양성을 효과적으로 포함시키기 위해서, 초기의 효소 풀 (pool)을 85% 초과의 상동성을 갖는 서열 군집들로 그룹화한 후 각각의 군집을 대표하는 하나의 단일 후보 서열을 선택함으로써 이들을 축소시켰다. HMG-CoA 신타제 집단 및 리아제 집단 각각에서의 임의의 2개 단백질 간의 단백질 서열 동일성은 각각 30% 내지 80% 및 50% 내지 80% 범위였다.
동일한 접근법을 적용하여, 원핵 유기체로부터의 HMG-CoA 신타제 및 HMG-CoA 리아제를 선별하였다. 생성된 세트는 pksG 단백질을 비롯한 HMG-CoA 신타제에 상동인 50개의 단백질 및 HMG-CoA 리아제에 상동인 59개의 단백질을 포함하였다.
실시예 2
수집된 HMG-CoA 리아제 및 HMG-CoA 신타제의 클로닝, 발현 및 정제
유전자 클로닝:
진핵 유기체로부터의 HMG-CoA 신타제 및 리아제를 코딩하는 핵산 서열을 이. 콜리 코돈 선호도에 맞게 최적화시키고, 화학적 합성 (진아트 (GeneArt))에 의해 유전자를 수득하였다.
일상적인 재조합 기법에 의해 상이한 기원의 게놈 DNA로부터 원핵 유기체로부터의 HMG-CoA 신타제 및 리아제를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다. 이어서, 이들 유전자를 각각 진핵 및 원핵 유기체용인 His-태크(tag) 함유 pET 25b 및 pET 22b 벡터 (노바젠 (Novagen))에 삽입하였다.
이. 콜리에서의 과발현:
플라스미드를 전기천공으로 이. 콜리 BL21 박테리아 (노바젠) 내로 주입한 후, 이를 암피실린 함유 LB-한천 페트리 접시 상에 도말하였다. 배양물을 0.5 M 소르비톨, 5 mM 베타인, 100 μg/ml 암피실린을 함유한 TB 배지 상에서 중도의 진탕 하에서 30℃에서 성장시켰다. OD (600 nm)가 0.8에 도달했을 때, IPTG를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하고, 중도의 진탕 하에서 20℃에서 16시간 동안 발현을 진행시켰다. 그런 다음, 박테리아 세포를 4℃에서, 10.000 rpm으로, 20분 원심분리하여 수거하고, -80℃에서 동결하였다.
세포 추출물 조제:
1.6 g의 세포 펠렛을 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 8)을 함유한 5 ml의 50 mM Na2HPO4 완충제 중에 재현탁하여 세포 추출물을 조제하였다. 그런 다음, 20 μl 리소나제 (lysonase) (노바젠)을 상기 조제물에 첨가하고, 이를 실온에서 10분 동안 및 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 얼음 상의 초음파 수조에서 5분 동안 3회 음파 처리하고 각각의 펄스 사이에 추출물에 대한 균질화를 실시하여 세포 용해를 달성하였다. 이어서, 미정제 추출물을 4℃에서 10.000 rpm으로 20분 원심분리하여 정화시켰다.
단백질 정제:
6-히스티딘 미부를 지닌 단백질을 특이적으로 고정화할 수 있는 프로티노(PROTINO)-1000 Ni-IDA 컬럼 (마슈레-나겔 (Macherey-Nagel)) 상에 상기 맑은 상등액을 로딩하였다. 컬럼을 세척하고, 효소를 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 250 mM 이미다졸 (pH 8)을 함유한 4 ml의 50 mM Na2HPO4 완충제로 용리시켰다. 그런 다음, 효소를 함유한 분획을 농축시키고, 아미콘 울트라-4 (Amicon Ultra-4) 10 kDa 필터 장치 (밀리포어 (Millipore)) 상에서 탈염시키고, 0.5 mM DTT를 함유한 250 μl의 40 mM 트리스-HCl (pH 8)에 재현탁시켰다. 브래드포드 (Bradford) 방법으로 단백질 농도를 측정하였다.
정제된 효소의 균질성은 20% 내지 75%로 다양했다.
실시예 3
천연 기질인 아세토아세틸-CoA 및 아세틸-CoA를 이용한 HMG-CoA 신타제 활성의 측정
문헌 [Clinkenbeard et al. (J. Biol.Chem. 250 (1975), 3108-3116)]에 따라 HMG-CoA 신타제 활성을 측정하였다. HMG-CoA 신타제를 위한 표준 분석 배지 혼합물은 총 부피 1 ml 중 40 mM 트리스-HCl (pH 8), 1 mM MgCl2, 100 μM 아세토아세틸-CoA, 200 μM 아세틸-CoA, 0.5 mM DTT를 함유하였다. 미토콘드리아 HMG-CoA 신타제의 경우 이 효소에 대해 관찰되는 억제를 회피하기 위해 이를 MgCl2의 부재하에 분석하였다 (문헌 [Reed et al., J. Biol.Chem. 250 (1975), 3117-3123]). 0.02 mg/mL의 효소를 첨가하여 반응을 개시하였다.
대조 분석은 효소 부재 하에 수행되었다. 아세토아세틸-CoA의 에놀레이트 형태의 아세틸-CoA-의존성 소실에 동반되는 303 nm에서의 흡광도 감소를 모니터링하여 HMG-CoA 신타제 활성을 측정하였다. 아세토아세틸-CoA의 비-특이적 소실을 고려하기 위해, 시험 샘플에서 수득한 결과로부터 효소가 결여된 대조 분석에서 수득한 결과를 제하였다. 상기 분석 조건 하에서 아세토아세틸-CoA에 대한 겉보기 흡수 계수는 5600 M-1이었다.
[표 1]
Figure pct00009
실시예 4
천연 기질 HMG-CoA를 이용한 HMG-CoA 리아제 활성 측정
HMG-CoA 리아제 활성을 문헌 [Mellanby J et al. (Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer Ed. (1963), 454-458)]에 따라 측정하였다. 40 mM 트리스-HCl (pH 8), 1 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.4 mM HMG-CoA, 0.2 mM NADH, 5 유닛의 3-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 함유한 완전한 반응 혼합물 (1 ml)을 5분 동안 인큐베이션한 후, 0.005 mg/mL의 HMG-CoA 리아제를 첨가하고, 이어서, 340 nm에서의 흡광도 감소로써 반응의 진행을 모니터링하였다. 효소의 부재 하에 대조 분석을 실시하였다.
NADH의 비-특이적 소실을 감안하기 위해, 시험 샘플에서 수득한 결과로부터 효소가 결여된 대조 분석에서 수득한 결과를 제하였다. Δμmol NADH/분?mg 단백질로서 비활성 (specific activity)을 계산하였다.
[표 2]
Figure pct00010
실시예 5
3-히드록시-3-메틸부티레이트 생성
3-히드록시-3-메틸부티레이트 합성을 위한 완전한 반응은 40 mM 트리스-HCl (pH 8), 5 내지 50 mM 아세틸-CoA, 100 내지 500 mM 아세톤, 1 MgCl2 (미토콘드리아 HMG-CoA 신타제의 경우 제외), 0.5 mM DTT 및 범위가 0.2 내지 8 mg/ml로 다양한 효소를 함유하였다. 대조 반응은 기질 중 하나 및 효소의 부재 하에 실시되었다.
합성 진행 후, 30 또는 37℃에서의 인큐베이션 중에 기간을 증가시키면서 취한 분취액을 분석하였다. 전형적으로, 48시간의 인큐베이션 후에 50 μl의 분취액을 취하고, 100℃에서 1분 동안 가열하여 단백질을 제거하고, 원심분리한 후, 상등액을 깨끗한 바이알로 옮겨 질량 분광측정법에 의한 HIV 검출을 실시하였다. 40 mM 트리스-HCl (pH 8), 1 mM MgCl2, 0.5 mM DTT 중에서 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 용액을 준비한 후, 앞서 기재한 바와 같이 가열하여, 참조로 사용하였다.
샘플에 대한 분석은, PE SCIEX API 2000 삼단계 사중극자형 질량 분석계 상에서 이동상으로 0.1% 트리에틸아민을 함유한 H2O/아세토니트릴=60/40 및 유속 40 μl/분을 이용하여 음이온 모드로 실시하였다. 각각의 상등액 10 μl를 동일한 양의 이동상과 혼합하고, 이를 질량 분석계에 바로 주입하였다. [3-히드록시-3-메틸부티레이트-H]- 이온의 존재를 모니터링하였다.
하기 효소들의 경우에 3-히드록시-3-메틸부티레이트에 상응하는 피크가 관찰되었다.
블라텔라 게르마니카 (바퀴) P54961 (서열 6)
갈루스 갈루스 (닭) P23228 (서열 7)
호모 사피엔스 (인간) Q01581 (서열 8)
아라비돕시스 탈리아나 P54873 (CAA58763) (서열 4)
카에노르하브디티스 엘레간스 P54871 (서열 1)
스키조사카로미세스 폼베 (분열 효모) P54874 (서열 2)
사카로미세스 세레비시애 (빵 효모) P54839 (서열 3)
딕티오스텔리움 디스코이데움 (점균류) Q86HL5 (서열 10)
류코노스톡 메센테로이데스 Q03WZ0 (서열 )
스타필로코커스 에피데르미디스 Q8CN06 (서열 11)
락토바실러스 델브루에키 Q1GAH5 (서열 24)
스타필로코커스 헤몰리티쿠스 Q4L958 (야생형 단백질과 비교하여 I98>V 상이) (서열 25)
도 6 내지 8은, 갈루스 갈루스 (P23228)로부터의 HMG CoA 신타제를 이용한 반응 및 효소 부재의 대조 분석에서의 시판중인 3-히드록시-3-메틸부티레이트에 대한 대표적인 결과를 제시한다.
실시예 6
리아제를 이용한 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA 생성
방사성 표지된 [2-14C] 아세톤의 존재 하에서 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA 합성을 실시하였다. 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA 합성을 위한 완전한 반응은 40 mM 트리스-HCl (pH 8), 5 내지 50 mM 아세틸-CoA, 100 내지 500 mM 아세톤, 1 내지 10 mM MgCl2, 0.5 mM DTT 및 범위가 0.5 내지 7 mg/ml로 다양한 효소를 함유하였다. 반응 혼합물을 TLC 또는 HPLC로 분리한 후 생성물의 형성을 분석하였다.
또한, 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA를 TLC 방법으로 분석하였다 (문헌 [Stadtman E.R., J. Biol. Chem. 196 (1952), 535-546]). 반응 분취액을 셀룰로스 플레이트 상에 적층시키고, 에탄올/0.1 M 아세트산나트륨 pH 4.5 (1/1)로 이루어진 용매 시스템 중에서 크로마토그래피하였다. 내부 표준으로서는 Co-A 및 아세틸-CoA를 사용하였다. 3-히드록시-3-메틸부티릴-CoA에 대해 보고된 Rf는 0.88이었다.
실시예 7
HMG 신타제의 경우에 아세틸-CoA 및 아세톤 간의 효소 반응에 대한 동력학적 파라미터
이하의 조건 하에서 가변 농도의 아세톤 및 불변 농도의 아세틸-CoA (10 mM)를 이용하여 동력학적 파라미터를 측정하였다.
40 mM 트리스-HCl (pH 8)
2 mM MgCl2
0 - 1 M 아세톤
최종 pH는 8로 조정하였다.
1 ml 반응 혼합물에 정제된 효소 3 mg을 첨가하여 반응을 개시하였다. 이어서, 혼합물을 37℃에서 40시간 동안 진탕없이 인큐베이션하였다.
3-히드록시-3-메틸부티레이트 생성에 대한 분석
3-히드록시-3-메틸부티레이트의 이소부텐으로의 분해를 초래하는 열화학적 조건을 적용하였다 (문헌 [Pressman et al., JACS, 1940, 2069-2080]): 먼저, 6N HCl을 사용하여 반응 혼합물의 pH를 pH 4로 조정한 후, 샘플을 기체 크로마토그래피 바이알 (인터침(Interchim))로 옮겼다. 상기 바이알을 밀봉하고, 110℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여, 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 이소부텐으로의 분해를 유도하였다.
시판 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 사용하여 동일한 조건 하에서 검량선을 작성하였다.
1 밀리리터의 헤드스페이스 (headspace) 기체를 수집하여, FID 검출기 및 CP 실리카플롯 (SilicaPlot) 컬럼 (바리안 (Varian))이 구비된 HP5890 기체 크로마토그래프 (HP) 내로 주입하였다. 시판 이소부텐을 참조로 사용하였다. 이 이소부텐 신호로부터 샘플에 초기에 존재한 3-히드록시-3-메틸부티레이트의 양을 계산하였다.
연구된 HMG-CoA 신타제 중 몇몇에 대한 동력학적 파라미터가 이하의 표에서 제시된다.
Figure pct00011
에스. 에피데르미디스로부터의 효소의 경우, 상응하는 미카엘리스-멘텐 곡선이 도 9에 제시되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MARLIERE, Philippe <120> Method for the production of 3-hydroxy-3-methylbutyric acid from acetone and an activated acetyl compound <130> R1889 PCT S3 <150> EP 09 17 0312.4 <151> 2009-09-15 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 462 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 1 Met Ser Leu Gly Gln Leu Ser Tyr Thr Pro Val Thr Asp Val Gly Ile 1 5 10 15 Gly Ala Ile Glu Leu Tyr Phe Pro Gln Asn Phe Val Asp Gln Asn Asp 20 25 30 Leu Glu Lys Phe Asn Asn Val Ser Ser Gly Lys Tyr Thr Ile Gly Leu 35 40 45 Gly Gln Gln Gln Met Gly Phe Cys Ser Asp Asn Glu Asp Ile Val Ser 50 55 60 Ile Ser Leu Thr Val Thr Arg Lys Leu Ile Glu Thr Tyr Lys Ile Ser 65 70 75 80 Thr Asp Ser Ile Gly Cys Leu Val Val Gly Thr Glu Thr Met Ile Asp 85 90 95 Lys Ser Lys Ser Val Lys Thr Ala Leu Met Asp Leu Phe Pro Gly Asn 100 105 110 Ser Asp Ile Glu Gly Val Asp Ile Lys Asn Ala Cys Phe Gly Gly Ala 115 120 125 Gln Ala Leu Leu His Ala Ile Asp Trp Val Thr Val Asn His Pro Leu 130 135 140 Asp Lys Lys Asn Ala Ile Val Val Val Ala Asp Ile Ala Ile Tyr Glu 145 150 155 160 Glu Gly Pro Ala Arg Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ile Ala Phe Leu 165 170 175 Ile Cys Pro Asp Ala Ser Ile Pro Ile Asp Arg Gln Phe Ser Ala Cys 180 185 190 His Met Lys Asn Thr Trp Asp Phe Phe Lys Pro Ile Thr Pro Ile Pro 195 200 205 Ser Glu Tyr Pro Val Val Asp Gly Ser Leu Ser Leu Ser Ser Tyr Leu 210 215 220 Glu Ala Val Arg Met Thr Tyr Thr Tyr Phe Ile Ser Lys Val Asn Arg 225 230 235 240 His Thr Thr Gly Ile Asp Gly Leu Asn Ser Phe Asp Gly Val Phe Leu 245 250 255 His Ser Pro Phe Thr Lys Met Val Gln Lys Gly Leu Ala Val Met Asn 260 265 270 Tyr Thr Asp Ser Gln Leu Arg His Lys Gln Leu Asn Gly Asn Gly Val 275 280 285 Asp His Lys Leu Asp Glu Asn Asp Arg Ala Gly Leu Ala Lys Met Ile 290 295 300 Glu Leu Ser Ala Gln Val Trp Lys Glu Lys Thr Asp Pro Tyr Leu Val 305 310 315 320 Phe Asn Arg Arg Ile Gly Asn Met Tyr Thr Pro Ser Leu Phe Ala Gln 325 330 335 Leu Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Asp Asp Cys Val Thr Gly Glu Lys Ser 340 345 350 Ile Leu Phe Phe Ala Tyr Gly Ser Gly Leu Ala Ser Ala Ile Phe Pro 355 360 365 Gly Arg Val Arg Gln Thr Ser Asn Leu Asp Lys Ile Arg Gln Val Ala 370 375 380 Ile Arg Ala Ile Lys Arg Leu Asp Asp Arg Ile Gln Phe Thr Pro Glu 385 390 395 400 Glu Phe Thr Glu Thr Leu Gln Lys Arg Glu Val Phe Leu Arg Ser Lys 405 410 415 Glu Ile Pro Lys Ser Pro Ser Glu Thr Ser Leu Phe Pro Asn Thr Tyr 420 425 430 Phe Leu Asp Asn Met Asp Lys Leu Tyr Arg Arg Ser Tyr Thr Leu His 435 440 445 Glu Glu Pro Asn Gly Val Gln Asn Gly Asn Gly Ile His His 450 455 460 <210> 2 <211> 447 <212> PRT <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 2 Met Ser Phe Asp Arg Lys Asp Ile Gly Ile Lys Gly Leu Val Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Pro Asn Gln Tyr Val Glu Gln Ala Ala Leu Glu Ala His Asp Gly 20 25 30 Val Ser Thr Gly Lys Tyr Thr Ile Gly Leu Gly Leu Thr Lys Met Ala 35 40 45 Phe Val Asp Asp Arg Glu Asp Ile Tyr Ser Phe Gly Leu Thr Ala Leu 50 55 60 Ser Gln Leu Ile Lys Arg Tyr Gln Ile Asp Ile Ser Lys Ile Gly Arg 65 70 75 80 Leu Glu Val Gly Thr Glu Thr Ile Ile Asp Lys Ser Lys Ser Val Lys 85 90 95 Ser Val Leu Met Gln Leu Phe Gly Asp Asn His Asn Val Glu Gly Ile 100 105 110 Asp Cys Val Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Val Asn Ala Leu Phe Asn Thr 115 120 125 Ile Asp Trp Ile Glu Ser Ser Ala Trp Asp Gly Arg Asp Gly Ile Val 130 135 140 Val Ala Gly Asp Ile Ala Leu Tyr Ala Lys Gly Asn Ala Arg Pro Thr 145 150 155 160 Gly Gly Ala Gly Cys Val Ala Leu Leu Val Gly Pro Asn Ala Pro Ile 165 170 175 Val Phe Glu Pro Gly Leu Arg Gly Thr Tyr Met Gln His Ala Tyr Asp 180 185 190 Phe Tyr Lys Pro Asp Leu Thr Ser Glu Tyr Pro Tyr Val Asp Gly His 195 200 205 Phe Ser Leu Glu Cys Tyr Val Lys Ala Leu Asp Gly Ala Tyr Ala Asn 210 215 220 Tyr Asn Val Arg Asp Val Ala Lys Asn Gly Lys Ser Gln Gly Leu Gly 225 230 235 240 Leu Asp Arg Phe Asp Tyr Cys Ile Phe His Ala Pro Thr Cys Lys Gln 245 250 255 Val Gln Lys Ala Tyr Ala Arg Leu Leu Tyr Thr Asp Ser Ala Ala Glu 260 265 270 Pro Ser Asn Pro Glu Leu Glu Gly Val Arg Glu Leu Leu Ser Thr Leu 275 280 285 Asp Ala Lys Lys Ser Leu Thr Asp Lys Ala Leu Glu Lys Gly Leu Met 290 295 300 Ala Ile Thr Lys Glu Arg Phe Asn Lys Arg Val Ser Pro Ser Val Tyr 305 310 315 320 Ala Pro Thr Asn Cys Gly Asn Met Tyr Thr Ala Ser Ile Phe Ser Cys 325 330 335 Leu Thr Ala Leu Leu Ser Arg Val Pro Ala Asp Glu Leu Lys Gly Lys 340 345 350 Arg Val Gly Ala Tyr Ser Tyr Gly Ser Gly Leu Ala Ala Ser Phe Phe 355 360 365 Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Val Ser Glu Ile Ala Lys Lys Thr Asn 370 375 380 Leu Val Asn Asp Leu Asp Asn Arg His Cys Leu Thr Pro Thr Gln Tyr 385 390 395 400 Glu Glu Ala Ile Glu Leu Arg His Gln Ala His Leu Lys Lys Asn Phe 405 410 415 Thr Pro Lys Gly Ser Ile Glu Arg Leu Arg Ser Gly Thr Tyr Tyr Leu 420 425 430 Thr Gly Ile Asp Asp Met Phe Arg Arg Ser Tyr Ser Val Lys Pro 435 440 445 <210> 3 <211> 491 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Lys Leu Ser Thr Lys Leu Cys Trp Cys Gly Ile Lys Gly Arg Leu 1 5 10 15 Arg Pro Gln Lys Gln Gln Gln Leu His Asn Thr Asn Leu Gln Met Thr 20 25 30 Glu Leu Lys Lys Gln Lys Thr Ala Glu Gln Lys Thr Arg Pro Gln Asn 35 40 45 Val Gly Ile Lys Gly Ile Gln Ile Tyr Ile Pro Thr Gln Cys Val Asn 50 55 60 Gln Ser Glu Leu Glu Lys Phe Asp Gly Val Ser Gln Gly Lys Tyr Thr 65 70 75 80 Ile Gly Leu Gly Gln Thr Asn Met Ser Phe Val Asn Asp Arg Glu Asp 85 90 95 Ile Tyr Ser Met Ser Leu Thr Val Leu Ser Lys Leu Ile Lys Ser Tyr 100 105 110 Asn Ile Asp Thr Asn Lys Ile Gly Arg Leu Glu Val Gly Thr Glu Thr 115 120 125 Leu Ile Asp Lys Ser Lys Ser Val Lys Ser Val Leu Met Gln Leu Phe 130 135 140 Gly Glu Asn Thr Asp Val Glu Gly Ile Asp Thr Leu Asn Ala Cys Tyr 145 150 155 160 Gly Gly Thr Asn Ala Leu Phe Asn Ser Leu Asn Trp Ile Glu Ser Asn 165 170 175 Ala Trp Asp Gly Arg Asp Ala Ile Val Val Cys Gly Asp Ile Ala Ile 180 185 190 Tyr Asp Lys Gly Ala Ala Arg Pro Thr Gly Gly Ala Gly Thr Val Ala 195 200 205 Met Trp Ile Gly Pro Asp Ala Pro Ile Val Phe Asp Ser Val Arg Ala 210 215 220 Ser Tyr Met Glu His Ala Tyr Asp Phe Tyr Lys Pro Asp Phe Thr Ser 225 230 235 240 Glu Tyr Pro Tyr Val Asp Gly His Phe Ser Leu Thr Cys Tyr Val Lys 245 250 255 Ala Leu Asp Gln Val Tyr Lys Ser Tyr Ser Lys Lys Ala Ile Ser Lys 260 265 270 Gly Leu Val Ser Asp Pro Ala Gly Ser Asp Ala Leu Asn Val Leu Lys 275 280 285 Tyr Phe Asp Tyr Asn Val Phe His Val Pro Thr Cys Lys Leu Val Thr 290 295 300 Lys Ser Tyr Gly Arg Leu Leu Tyr Asn Asp Phe Arg Ala Asn Pro Gln 305 310 315 320 Leu Phe Pro Glu Val Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Asp Tyr Asp Glu 325 330 335 Ser Leu Thr Asp Lys Asn Ile Glu Lys Thr Phe Val Asn Val Ala Lys 340 345 350 Pro Phe His Lys Glu Arg Val Ala Gln Ser Leu Ile Val Pro Thr Asn 355 360 365 Thr Gly Asn Met Tyr Thr Ala Ser Val Tyr Ala Ala Phe Ala Ser Leu 370 375 380 Leu Asn Tyr Val Gly Ser Asp Asp Leu Gln Gly Lys Arg Val Gly Leu 385 390 395 400 Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Leu Ala Ala Ser Leu Tyr Ser Cys Lys Ile 405 410 415 Val Gly Asp Val Gln His Ile Ile Lys Glu Leu Asp Ile Thr Asn Lys 420 425 430 Leu Ala Lys Arg Ile Thr Glu Thr Pro Lys Asp Tyr Glu Ala Ala Ile 435 440 445 Glu Leu Arg Glu Asn Ala His Leu Lys Lys Asn Phe Lys Pro Gln Gly 450 455 460 Ser Ile Glu His Leu Gln Ser Gly Val Tyr Tyr Leu Thr Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asp Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Asp Val Lys Lys 485 490 <210> 4 <211> 461 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 Met Ala Lys Asn Val Gly Ile Leu Ala Met Asp Ile Tyr Phe Pro Pro 1 5 10 15 Thr Cys Val Gln Gln Glu Ala Leu Glu Ala His Asp Gly Ala Ser Lys 20 25 30 Gly Lys Tyr Thr Ile Gly Leu Gly Gln Asp Cys Leu Ala Phe Cys Thr 35 40 45 Glu Leu Glu Asp Val Ile Ser Met Ser Phe Asn Ala Val Thr Ser Leu 50 55 60 Phe Glu Lys Tyr Lys Ile Asp Pro Asn Gln Ile Gly Arg Leu Glu Val 65 70 75 80 Gly Ser Glu Thr Val Ile Asp Lys Ser Lys Ser Ile Lys Thr Phe Leu 85 90 95 Met Gln Leu Phe Glu Lys Cys Gly Asn Thr Asp Val Glu Gly Val Asp 100 105 110 Ser Thr Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Thr Ala Ala Leu Leu Asn Cys Val 115 120 125 Asn Trp Val Glu Ser Asn Ser Trp Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Ile 130 135 140 Cys Thr Asp Ser Ala Val Tyr Ala Glu Gly Pro Ala Arg Pro Thr Gly 145 150 155 160 Gly Ala Ala Ala Ile Ala Met Leu Ile Gly Pro Asp Ala Pro Ile Val 165 170 175 Phe Glu Ser Lys Leu Arg Ala Ser His Met Ala His Val Tyr Asp Phe 180 185 190 Tyr Lys Pro Asn Leu Ala Ser Glu Tyr Pro Val Val Asp Gly Lys Leu 195 200 205 Ser Gln Thr Cys Tyr Leu Met Ala Leu Asp Ser Cys Tyr Lys His Leu 210 215 220 Cys Asn Lys Phe Glu Lys Ile Glu Gly Lys Glu Phe Ser Ile Asn Asp 225 230 235 240 Ala Asp Tyr Ile Val Phe His Ser Pro Tyr Asn Lys Leu Val Gln Lys 245 250 255 Ser Phe Ala Arg Leu Leu Tyr Asn Asp Phe Leu Arg Asn Ala Ser Ser 260 265 270 Ile Asp Glu Ala Ala Lys Glu Lys Phe Thr Pro Tyr Ser Ser Leu Thr 275 280 285 Leu Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Arg Asp Leu Glu Lys Val Ser Gln Gln 290 295 300 Ile Ser Lys Pro Phe Tyr Asp Ala Lys Val Gln Pro Thr Thr Leu Ile 305 310 315 320 Pro Lys Glu Val Gly Asn Met Tyr Thr Ala Ser Leu Tyr Ala Ala Phe 325 330 335 Ala Ser Leu Ile His Asn Lys His Asn Asp Leu Ala Gly Lys Arg Val 340 345 350 Val Met Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr Met Phe Ser Leu 355 360 365 Arg Leu Asn Asp Asn Lys Pro Pro Phe Ser Ile Ser Asn Ile Ala Ser 370 375 380 Val Met Asp Val Gly Gly Lys Leu Lys Ala Arg His Glu Tyr Ala Pro 385 390 395 400 Glu Lys Phe Val Glu Thr Met Lys Leu Met Glu His Arg Tyr Gly Ala 405 410 415 Lys Asp Phe Val Thr Thr Lys Glu Gly Ile Ile Asp Leu Leu Ala Pro 420 425 430 Gly Thr Tyr Tyr Leu Lys Glu Val Asp Ser Leu Tyr Arg Arg Phe Tyr 435 440 445 Gly Lys Lys Gly Glu Asp Gly Ser Val Ala Asn Gly His 450 455 460 <210> 5 <211> 482 <212> PRT <213> Dictyostelium discoideum <400> 5 Met Thr Lys Pro Glu Asn Ile Gly Ile His Gly Ile Glu Val Tyr Phe 1 5 10 15 Pro Ser Thr Tyr Val Ala Gln Glu Asp Leu Glu Lys Phe Asp Gly Val 20 25 30 Ser Gln Gly Lys Tyr Thr Leu Gly Leu Gly Gln Thr Asn Met Ala Phe 35 40 45 Cys Gly Asp Arg Glu Asp Ile Tyr Ser Leu Ser Leu Asn Ala Val Asn 50 55 60 Asn Leu Met Asp Lys Phe Asn Val Asp Pro Asn Ser Ile Gly Arg Leu 65 70 75 80 Glu Val Gly Thr Glu Thr Val Ile Asp Lys Ser Lys Ser Val Lys Thr 85 90 95 Val Leu Met Asp Leu Phe Ala Lys His Gly Asn Thr Ser Ile Asp Gly 100 105 110 Ile Asp Thr Ile Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Thr Ser Ala Leu His Asn 115 120 125 Ala Leu Gln Trp Met Glu Ser Ser Tyr Trp Asp Gly Arg Asn Ala Ile 130 135 140 Val Val Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Glu Lys Gly Pro Ala Arg Pro 145 150 155 160 Thr Gly Gly Ala Gly Val Val Ala Met Leu Ile Gly Pro Asn Ala Pro 165 170 175 Ile Thr Phe Glu Ser Gly Leu Arg Gly Val His Met Glu Asn Val Tyr 180 185 190 Asp Phe Tyr Lys Pro Asp Met Asp Ser Glu Tyr Pro Arg Val Asp Gly 195 200 205 Lys Leu Ser Ile Ser Cys Tyr Phe Arg Ala Ile Asp Asn Cys Tyr Asn 210 215 220 Arg Tyr Ala Lys Ala Phe Glu Lys Lys Tyr Gly Lys Ser Phe Ser Leu 225 230 235 240 Asp Gln Val Asp Phe Ala Leu Phe His Ser Pro Tyr Asn Lys Leu Val 245 250 255 Gln Lys Ser Phe Gly Arg Met Leu Tyr Asn Asp Phe Leu Asn Asn Pro 260 265 270 Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Tyr Lys Asn Val Lys Pro 275 280 285 Glu Asp Thr Tyr Phe Asp Ser Val Leu Glu Lys Ala Leu Ser Ala Ile 290 295 300 Thr Lys Asn Asp Tyr Ala Thr Lys Val Ala Pro Thr Thr Leu Leu Ala 305 310 315 320 Lys Gln Leu Gly Asn Thr Tyr Cys Gly Ser Thr Tyr 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Met 370 375 380 Tyr Gly Ala Val 385 <210> 17 <211> 435 <212> PRT <213> Zea mays <400> 17 Met Leu Ala Ala Ser Thr Lys Val Gly Ser Arg Leu Ala Ser Pro His 1 5 10 15 Ala Ser Leu Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ser Ser Pro 20 25 30 Val Leu Gly Ser Gly Met Leu Pro Gly Ala Gly Phe Gly Glu Thr Gly 35 40 45 Asn His His Ala Ala Asp Ala Pro Pro Pro Leu Pro Cys Ser Ser Ser 50 55 60 Gly Asp Ser Arg Glu Tyr Tyr Gln Trp Lys Arg Leu Val Asn Gln Arg 65 70 75 80 Gln Ser Thr Leu His Val Gly Glu Val Pro Ala Ala Leu Gly His His 85 90 95 Val Phe Gly Ala Gly Cys Ser Ser Arg Lys Gln His Ile Tyr Arg Tyr 100 105 110 Phe Ser Ser Ser Ser His Gln Gly Ser Ile Trp Ala Arg Ser Lys Ile 115 120 125 Leu His Asp Leu Pro Gly Tyr Val Lys Ile Val Glu Val Gly Pro Arg 130 135 140 Asp Gly Leu Gln Asn Glu Lys Asp Ile Val Pro Thr Pro Val Lys Val 145 150 155 160 Glu Leu Ile Arg Arg Leu Ala Thr Ser Gly Leu Pro Val Val Glu Ala 165 170 175 Thr Ser Phe Val Ser Pro Lys Trp Val Pro Gln Leu Ala Asp Ala Lys 180 185 190 Asp Val 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Met Ala Ala Gly Glu Phe Ile Cys Arg His Leu Gly Arg Gln 405 410 415 Ser Gly Ser Lys Ala Ala Thr Ala Leu Ser Lys Val Thr Ala Asn Ala 420 425 430 Ser Lys Leu 435 <210> 18 <211> 335 <212> PRT <213> Danio rerio (Brachydanio rerio) <400> 18 Met Gly Asn Val Ser Ser Ala Val Lys His Cys Leu Ser Tyr Glu Thr 1 5 10 15 Phe Leu Arg Asp Tyr Pro Trp Leu Pro Arg Leu Leu Trp Glu Glu Lys 20 25 30 Cys Ser Glu Leu Pro Lys Leu Pro Val Tyr Val Lys Ile Val Glu Val 35 40 45 Gly Pro Arg Asp Gly Leu Gln Asn Glu Lys Glu Ile Val Pro Thr Glu 50 55 60 Val Lys Ile Gln Leu Ile Asp Leu Leu Ser Gln Thr Gly Leu Pro Val 65 70 75 80 Ile Glu Ala Thr Ser Phe Val Ser Ser Lys Trp Val Ala Gln Met Ala 85 90 95 Asp His Thr Ala Val Leu Lys Gly Ile Lys Arg Ser Pro Asp Val Arg 100 105 110 Tyr Pro Val Leu Thr Pro Asn Ile Gln Gly Phe Gln Ala Ala Val Ala 115 120 125 Ala Gly Ala Asn Glu Val Ala Val Phe Gly Ser Ala Ser Glu Thr Phe 130 135 140 Ser Arg Lys Asn Ile Asn Cys Ser Ile Glu Glu Ser Leu Gln Arg Phe 145 150 155 160 Glu Gln Val 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Ala Thr Cys Lys Leu 325 <210> 21 <211> 299 <212> PRT <213> Pseudomonas putida Q88H25 <400> 21 Met Ser Leu Pro Lys His Val Arg Leu Val Glu Val Gly Pro Arg Asp 1 5 10 15 Gly Leu Gln Asn Glu Ala Gln Pro Ile Ser Val Ala Asp Lys Val Arg 20 25 30 Leu Val Asn Asp Leu Thr Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Ile Glu Val Gly 35 40 45 Ser Phe Val Ser Pro Lys Trp Val Pro Gln Met Ala Gly Ser Ala Glu 50 55 60 Val Phe Ala Gly Ile Gln Gln Arg Pro Gly Val Thr Tyr Ala Ala Leu 65 70 75 80 Ala Pro Asn Leu Arg Gly Phe Glu Asp Ala Leu Ala Ala Gly Val Lys 85 90 95 Glu Val Ala Val Phe Ala Ala Ala Ser Glu Ala Phe Ser Gln Arg Asn 100 105 110 Ile Asn Cys Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys Arg Phe Glu Pro Ile Met 115 120 125 Asp Ala Ala Arg Ser His Gly Met Arg Val Arg Gly Tyr Val Ser Cys 130 135 140 Val Leu Gly Cys Pro Tyr Glu Gly Lys Val Ser Ala Glu Gln Val Ala 145 150 155 160 Pro Val Ala Arg Ala Leu His Asp Met Gly Cys Tyr Glu Val Ser Leu 165 170 175 Gly Asp Thr Ile Gly Thr Gly Thr Ala Gly Asp Thr Arg Arg Leu Phe 180 185 190 Glu 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Pro Ile 290 295 300 Pro Asp Tyr Ile Lys Ser Leu Asn 305 310 <210> 23 <211> 286 <212> PRT <213> Thermus thermophilus Q72IH0 <400> 23 Met Lys Ala Ser Val Arg Trp Val Glu Cys Pro Arg Asp Ala Trp Gln 1 5 10 15 Gly Phe Ser Arg Phe Ile Pro Thr Glu Glu Lys Val Ala Phe Leu Asn 20 25 30 Glu Leu Leu Glu Ala Gly Phe Ala His Leu Asp Leu Thr Ser Phe Val 35 40 45 Ser Pro Lys Trp Val Pro Gln Met Gln Asp Ala Glu Glu Val Leu Lys 50 55 60 Ala Leu Pro Pro Pro Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Ala Ile Val Ala Asn 65 70 75 80 Glu Lys Gly Leu Glu Arg Ala Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr His Val 85 90 95 Gly Tyr Pro Phe Ser Leu Ser Glu Thr Phe Gln Gln Arg Asn Thr Asn 100 105 110 Arg Ser Ile Glu Ala Ser Trp Pro Leu Val Gly Ala Met Val Glu Arg 115 120 125 Thr Glu Gly Arg Leu Gly Leu Val Val Tyr Leu Ser Met Ala Phe Gly 130 135 140 Asn Pro Tyr Gly Asp Pro Trp Ser Val Glu Ala Val Leu Glu Ala Leu 145 150 155 160 Ala Arg Leu Lys Glu Met Gly Val Arg Glu Ile Ala Leu Ala Asp Thr 165 170 175 Tyr Gly Val Ala Glu Pro Glu Arg Ile His 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Gly Ser Gly Ala Met Ala Glu Phe Phe Ser Gly Lys Val Val Ala 305 310 315 320 Gly Tyr Gln Lys Arg Leu Arg Pro Ala Leu His Ala Arg Met Leu Lys 325 330 335 Glu Arg Ile Arg Leu Gly Val Gly Gln Tyr Glu Asp Ile Phe Thr Glu 340 345 350 Gly Leu Glu Ala Leu Pro Glu Asn Val Glu Phe Thr Ser Asp Ala Asn 355 360 365 His Gly Thr Trp Tyr Leu Ala Gly Gln Glu Gly Tyr Val Arg Gln Tyr 370 375 380 Lys Gln Lys 385 <210> 25 <211> 388 <212> PRT <213> Staphylococcus haemolyticus <400> 25 Met Ser Ile Gly Ile Asp Lys Ile Asn Phe Tyr Val Pro Lys Tyr Tyr 1 5 10 15 Val Asp Met Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg Gln Val Asp Pro Asn Lys 20 25 30 Phe Leu Ile Gly Ile Gly Gln Thr Gln Met Ala Val Ser Pro Val Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Val Ser Met Gly Ala Asn Ala Ala Lys Asp Ile Ile Thr 50 55 60 Asp Asp Asp Lys Lys His Ile Gly Met Val Ile Val Ala Thr Glu Ser 65 70 75 80 Ala Ile Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ala Val Gln Ile His Asn Leu Leu 85 90 95 Gly Val Gln Pro Phe Ala Arg Cys Phe Glu Met Lys Glu Ala Cys Tyr 100 105 110 Ala Ala Thr Pro Ala Ile Gln Leu Ala Lys Asp Tyr Ile Glu Lys Arg 115 120 125 Pro Asn Glu Lys Val Leu Val Ile Ala Ser Asp Thr Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 Ile Gln Ser Gly Gly Glu Pro Thr Gln Gly Ala Gly Ala Val Ala Met 145 150 155 160 Leu Ile Ser Asn Asn Pro Ser Ile Leu Glu Leu Asn Asp Asp Ala Val 165 170 175 Ala Tyr Thr Glu Asp Val Tyr Asp Phe Trp Arg Pro Thr Gly His Lys 180 185 190 Tyr Pro Leu Val Ala Gly Ala Leu Ser Lys Asp Ala Tyr Ile Lys Ser 195 200 205 Phe Gln Glu Ser Trp Asn Glu Tyr Ala Arg Arg Glu Asp Lys Thr Leu 210 215 220 Ser Asp Phe Glu Ser Leu Cys Phe His Val Pro Phe Thr Lys Met Gly 225 230 235 240 Lys Lys Ala Leu Asp Ser Ile Ile Asn Asp Ala Asp Glu Thr Thr Gln 245 250 255 Glu Arg Leu Thr Ser Gly Tyr Glu Asp Ala Val Tyr Tyr Asn Arg Tyr 260 265 270 Val Gly Asn Ile Tyr Thr Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Leu Ile Ser Leu 275 280 285 Leu Glu Asn Arg Ser Leu Lys Gly Gly Gln Thr Ile Gly Leu Phe Ser 290 295 300 Tyr Gly Ser Gly Ser Val Gly Glu Phe Phe Ser Ala Thr Leu Val Glu 305 310 315 320 Gly Tyr Glu Lys Gln Leu Asp Ile Glu Gly His Lys Ala Leu Leu Asn 325 330 335 Glu Arg Gln Glu Val Ser Val Glu Asp Tyr Glu Ser Phe Phe Lys Arg 340 345 350 Phe Asp Asp Leu Glu Phe Asp His Ala Thr Glu Gln Thr Asp Asp Asp 355 360 365 Lys Ser Ile Tyr Tyr Leu Glu Asn Ile Gln Asp Asp Ile Arg Gln Tyr 370 375 380 His Ile Pro Lys 385

Claims (13)

  1. 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 하기 화학식 I에 따른 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 이용한 아세톤 및 하기 화학식 I을 특징으로 하는 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 효소적 전환을 포함하며, 여기서 상기 효소는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 활성을 갖는 효소인, 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00012

    상기 식에서, X는 S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C10H13N5O7P (조효소 A)이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전환이 아세톤을 생성할 수 있으며 제1항에서 정의된 바의 효소를 발현할 수 있는 유기체의 존재 하에서 실현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. (a) 아세톤을 생성할 수 있고;
    (b) 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 화학식 I에 따른 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 발현하고, 여기서 X는 조효소 A이고, 상기 효소는 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 효소 활성을 갖는 효소인
    특징을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  4. 제3항에 있어서, 천연적으로 아세톤을 생성하는 능력을 가진 유기체인 유기체.
  5. 제4항에 있어서, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 바실러스 (Bacillus) 속 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 속에 속하는 미생물인 유기체.
  6. 제5항에 있어서, 미생물이 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) 종, 클로스트리디움 베이제링키 (Clostridium beijerinckii) 종, 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰 (Clostridium cellulolyticum) 종, 바실러스 폴리믹사 (Bacillus polymyxa) 종 또는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 종에 속하는 미생물인 미생물.
  7. 제3항에 있어서, 천연적으로는 아세톤을 생성하지 않지만 상기 유기체에서 아세톤이 생성될 수 있게 하는데 필요한 유전자(들)의 도입에 의해 아세톤을 생성할 수 있도록 유전적으로 변형된 유기체로부터 유래한 것인 유기체.
  8. 제7항에 있어서, 광합성을 할 수 있는 유기체인 유기체.
  9. 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한, 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 유기체의 용도.
  10. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 유기체를 포함하는 조성물.
  11. (i) 아세톤; 및
    (ii) 하기 화학식 I을 특징으로 하는 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물
    <화학식 I>
    Figure pct00013

    (상기 식에서, X는 S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C10H13N5O7P (조효소 A)임); 및
    (iii) 아세톤의 옥소 (즉 C=O) 기의 탄소 원자 및 (ii)에서 정의된 상기 화합물의 메틸기에 상응하는 탄소 원자 (C2) 간의 공유 결합의 형성을 촉매할 수 있는 효소로서, HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 효소 활성을 갖는 효소
    를 포함하는 조성물.
  12. 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 제1항에서 정의된 바의 효소의 용도.
  13. 아세톤 및 하기 화학식 I을 특징으로 하는 활성화된 아세틸기를 제공하는 화합물의 효소적 전환을 포함하며, 여기서 효소적 전환이 HMG CoA 신타제 (EC 2.3.3.10)의 효소 활성을 갖는 효소에 의해 이루어지는 것인, 3-히드록시-3-메틸부티르산의 생성을 위한 아세톤의 용도.
    <화학식 I>
    Figure pct00014

    상기 식에서, X는 S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C10H13N5O7P (조효소 A)이다.
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