KR20120088699A - 섬유화 상태를 치료하기 위한 ｖａｐ?１ 억제제의 용도 - Google Patents

섬유화 상태를 치료하기 위한 ｖａｐ?１ 억제제의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 VAP-1 억제제 및 섬유화 상태를 치료하는 약제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 체액 중의 가용성 VAP-1 또는 SSAO 활성의 증가된 수준에 기반하는 섬유화 상태의 진단 방법, 및 상기 진단 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.

Description

섬유화 상태를 치료하기 위한 ＶＡＰ?１ 억제제의 용도{USE OF VAP-1 INHIBITORS FOR TREATING FIBROTIC CONDITIONS}
본 발명은 VAP-1 억제제 및 이의 항-섬유화제로서의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 섬유화 상태의 진단 방법 및 상기 진단 방법에 사용하기 위한 키트(kit)에 관한 것이다.
섬유화 상태는 정신적 외상 또는 만성 염증 후, 교란된 손상치유 과정의 결과로서 주로 발생한다. 상기 섬유화 병리학은 화학적 및 생물학적 손상에 정기적으로 노출되는 장기(organ), 예를 들어, 간, 폐, 피부 및 신장에서 특히 일반적이다. 상기 장애가 급성 또는 만성인가에 관계없이, 상기 장기들은 비정상적인 섬유아세포(fibroblast) 활성화 및 세포외 기질(ECM)의 축적이라는 공통적인 특징을 공유하며, 상기 공통적인 특징은 장기 기능의 손실을 초래하는데, 이는 정상 조직이 반흔 조직으로 대체되기 때문이다. 상기 상태는, 진행성이며, 종종 나쁜 예후 및 생존률을 역전시킬 수 없다.
섬유화 반흔의 구성은 손상의 원인과는 관계없이 아주 유사하다. 섬유증의 중증도의 진단 및 검증은 예후 관점으로부터 최고로 중요한 것이다. 치료를 위한 결정 과정은 섬유증, 이의 진행 및 합병증의 발병에 대한 평가에 상당히 근거한다. 간 섬유증에서, 경피적 간 조직검사는 간 질환의 등급 및 단계를 위한 최적표준이다. 그러나, 이는 일반적으로 통증 및 불쾌감과 결부되는 몇몇 불가피한 위험 및 복잡성을 수반하는 침습적 절차이다. 이러한 절차로부터의 복잡성 때문에, 사망률은 1:1000 내지 1:10000의 범위이다(Crockett et al., 2006).
혈청 모노아민 옥시다제 활성의 수준은, 섬유증과 관련된 간경변, 만성 간염 및 간암을 앓고 있는 환자에게서 상승되는 것으로 밝혀져 있지만, 류마티스성 관절염 또는 전신성 홍반성 루푸스와 같은 염증성 결합조직 장애를 앓고 있는 환자에게서는 정상인 것으로 밝혀져 있다(McEwen and Castell 1967, J Lab Clin Med. 70:36-47; Ito et al. 1971 Digestion. 4:49-58; Ma Lin et al., 1976, Proc Soc Exp Biol Med. 151:40-3). 그러나, 상기의 상승된 혈청 모노아민 옥시다제 활성은, 조직 손상에 대한 마커(marker)로서 또는 조직 손상에 대한 반응으로서만 고려되어 왔으며, 섬유증의 발병에서의 역할을 가진다는 것은 알려져 있지 않다.
종래의 치료 연구는 코르티코스테로이드 및 면역억제 약물을 사용하여, 대체로 섬유증의 염증 과정을 표적으로 삼아왔다. 그러나, 이런 제제는 불행하게도 임상 효과가 거의 내지 전혀 없어서 섬유화 상태를 치료하기 위한 새로운 약물에 대한 명백한 필요성이 있다.
본 발명의 몇몇 목적들은, 항-섬유화제로서의 VAP-1 억제제, 섬유화 상태를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 VAP-1 억제제의 용도, 및 섬유화 상태의 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 인간 대상에서 섬유화 상태를 예방, 치료 또는 완화시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 VAP-1 억제제의 유효량을 상기 환자에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은 대상에서 섬유화 상태를 진단하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 a) 상기 대상으로부터의 체액의 샘플을 제공하는 단계, b) 상기 샘플 중의 가용성 VAP-1(sVAP-1) 또는 SSAO 활성의 양을 분석하는 단계, c) 상기 sVAP-1 또는 SSAO 활성의 양에 기초하여 섬유증을 진단하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, sVAP-1 또는 SSAO 활성의 양을 참조 체액 중의 sVAP-1 또는 SSAO 활성의 양과 비교할 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 섬유화 상태를 진단하는 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적들에 대한 몇몇 실시형태에서, 상기 VAP-1 억제제는, 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹에서 선택되는 1 내지 3개의 CDR 공통 서열, 및/또는 서열번호 24 내지 26으로 구성된 그룹에서 선택되는 1 내지 3개의 CDR 공통 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 완전 인간 항-VAP-1 항체이다. 몇몇 다른 실시형태에서, 상기 항-VAP-1 항체는 서열번호 4 내지 8로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 9 내지 13으로부터 선택된 제2 CDR 서열, 및 서열번호 14 내지 18로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및/또는 서열번호 27 내지 31로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 32 내지 36으로부터 선택된 제2 CDR 서열 및 서열번호 37 내지 41로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 갖는다.
몇몇 추가의 실시형태에서, 상기 항-VAP-1 항체는 서열번호 19 내지 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 42 내지 46으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 각각의 경쇄 가변 영역을 갖는다. 몇몇 추가의 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 47로 나타내는 중쇄 폴리펩티드 및 서열번호 48로 나타내는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 재조합 완전 인간 재조합 항체이다.
상기 목적들의 몇몇 다른 실시형태에서, 상기 VAP-1 억제제는, 히드라진 유도체, 프로페닐아민 및 프로파길아민, 4-치환된-2-부티닐아민, 할로알릴아민, 피롤린 유도체, 프로파길디아민, 알릴아민, 디아민, 4,5,6,7-테트라하이드로이미다조[4,5-c]피리딘 유도체, 티오카바모일 유도체, 카르복사미드, 설폰아미드, 티아졸 및/또는 구아니딘 유도체, 옥심 유도체, 디히드라진, 아릴알킬아민, 옥사졸리디논, 할로알킬아민, 벤포티아민, 및 이미다조피리딘 유도체로 구성된 그룹에서 선택된 화합물과 같은 SSAO 억제제이다.
상기 목적들의 몇몇 추가의 실시형태에서, 상기 섬유화 상태는 간 섬유증 및 간 섬유증에 이르게 하는 염증 상태, 즉, 급성 및 만성 간경변, 답즙 질환 및 독성 간 손상, 폐 섬유증, 당뇨병성 신장병으로부터 초래된 것을 포함하는 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부경화증, 결합 조직 질환, 반흔, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 장기 이식, 혈관 협착, 재협착, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프선 섬유증, 방광 섬유증, 흉막 섬유증 및 기도벽이 근섬유아세포 및 콜라겐의 축적에 의해 섬유화되어, 모든 섬유화 조직들처럼 수축되는 질환인 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 특정 실시형태들은 종속항들에 의해 제시된다.
본 발명의 다른 목적, 세부사항 및 이점은, 다음의 도면, 상세한 설명 및 실시예들로부터 명백해질 것이다.
아래에서 본 발명을, 첨부된 도면들을 참조하면서 바람직한 실시형태들에 의해 보다 상세히 설명할 것이며, 첨부된 도면들에 있어서,
도 1은 VAP-1 항체 BTT-1029의 투여가 CCl4 유도된 간 섬유증에 대한 거의 완전한 보호를 나타냄을 설명한다. 광물유(mineral oil)(MO, 대조군), CCl4 또는 CCl4와 VAP-1 항체를 병행하여 주사한 WT 및 VAP-1 녹아웃(knockout) 마우스들로부터의 간들에 대한 시리우스 레드(Sirius red) 염색. 섬유화 반흔의 정량 측정을, 이미지 J 역가 분석을 사용하여 수행했다. 3개의 세트로부터의 평균 ±SEM을 도시한다. 배율x10.
도 2는 VAP-1 항체 처리 간 및 VAP-1 녹아웃 간이 CCl4-섬유증 유도에도 불구하고 간염 및 괴사 구역의 현저한 결핍을 나타냄을 설명한다. 괴사성 간세포(화살촉) 및 진행중인 간염(화살)을 강조 표시한 x20 배율의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다.
도 3은 섬유화 조직에서 콜라겐 IV 및 엘라스틴 발현의 증가가, VAP-1 항체에 의해 예방되는 것을 설명한다. 콜라겐 IV, 엘라스틴 및 라미닌 염색의 정량적 측정을, 이미지 J 역가 분석을 사용하여 수행했다. 3개의 세트로부터의 평균 ±SEM을 도시한다.
도 4는 mRNA 수준이 간 성상세포(hepatic stellate cell) 및 섬유아세포에 대한 VAP-1의 조절 효과를 지시함을 설명한다. 엘라스틴, aSMA, VAP-1 및 TIMP1에 대한 정량적 RT-PCR 분석을 도시한다. 데이터는 세 마리의 마우스들로부터 3회 측정된 평균 ±SEM을 나타낸다. *p<0.05, **<0.01, ***<0.001(ANOVA).
도 5는 CCl4 유도된 간 섬유증에 반응하는 혈청 중의 가용성 VAP-1 및 SSAO 활성의 증가를 설명한다. 도 5A는 시간 분해 형광 DELFIA 분석으로 분석한 혈청 중의 가용성 VAP-1 수준에 대한 CCl4-유도된 간 섬유증의 영향을 도시한다. 도 5B는 방사화학 분석에 의해, CCl4-유도된 WT 간으로부터의 혈청에서 SSAO 활성의 증가된 수준이 발견되었음을 도시한다.
도 6은 CCl4에 의해 유도된 사구체 병변이 VAP-1 녹아웃 마우스들 및 VAP-1 항체 처리 C57BL/6 마우스들에서 제거되었음을 도시한다. 사구체를 강조 표시한 x40 배율의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다.
도 7은 CCl4 유도된 사구체 섬유증의 결과로서의 콜라겐 축적이, VAP-1 녹아웃 마우스들 및 VAP-1 항체 처리 마우스들에서 유의하게 감소된 것을 설명한다. 광물유(MO, 대조군), CCl4 또는 CCl4와 VAP-1 항체를 병행하여 주사한 WT 및 VAP-1 녹아웃 마우스들로부터의 신장의 시리우스 레드 염색을 도시한다. 섬유화 반흔의 정량 측정을 이미지 J 역가 분석을 사용하여 수행했다. 3개의 세트로부터의 평균 ±SEM을 도시한다. 배율 x40.
도 8은 비히클 치료한 담배 연기에 노출된 마우스들과 비교한, VAP-1 항체(BTT-1029) 치료한 담배연기에 노출된 마우스들로부터의 기관지폐포 세척액 중의 총 세포 계수(total cell counts)에서의 감소를 도시한다.
도 9는 비히클 치료한 담배 연기에 노출된 마우스들과 비교한, 대조 로플루밀라스트(roflumilast)로부터의 기관지폐포 세척액 중의 총 세포 계수에서의 감소를 도시한다.
도 10은 NaCl 0.9% 치료한 대조군과 비교한, 덱사메타손-치료 그룹 및 SSAO 억제제(BTT-2089) 치료된 두 그룹에서의 중막(media) 형성의 상당한 감소를 도시한다.
도 11은 NaCl 0.9% 치료한 대조군 그룹과 비교한, 덱사메타손-치료 그룹 및 SSAO 억제제(BTT-2089) 치료된 두 그룹에서의 신생혈관 내막 형성의 상당한 감소를 도시한다.
도 12는 헤마톡실린 플록신 사프론(HPS)으로 염색된 혈관 세그먼트의 예를 도시한다. 내강(lumen) 크기는, 대조군 A와 비교했을 때, SSAO 억제제 치료된 그룹 C 및 D에서 증가한다. A-NaCl 0.9% 그룹; B-덱사메타손; C-BTT2089 10mg/kg; D-BTT-2089 30mg/kg.
도 13은 항-VAP-1 항체 또는 동형 매치된(isotype match) 대조 항체로 염색된 정상 간, NASH 간경변의 간 및 ALD 간경변의 간으로부터의 조직을 도시한다. VAP-1 염색은, 정상 간 또는 동형 대조 간과 비교하여, NASH 간경변의 간 및 ALD 간경변의 간에서 더 짙게 나타났으며, 이는 섬유증의 구역에서의 VAP-1 발현의 증가를 반영한다.
도 14는 항-VAP-1, 항-CD31 및 항-콜라겐 IV 항체로 염색된 정상 간 및 NASH 간경변의 간으로부터의 조직을 도시한다. VAP-1 염색은 화살로 나타내었고, 이는 NASH 간경변의 간에서만 현저하게 나타나며, 이는 섬유증의 구역에서의 VAP-1 발현의 증가를 반영한다.
도 15는 항-VAP-1, 항-CD90 및 항-CD3 항체로 염색된 NASH 간경변의 간으로부터의 조직을 도시한다. VAP-1 염색은 화살로 나타내었고, 이는 NASH 간경변의 간에서 나타나며, 섬유증의 구역에서의 VAP-1 발현의 증가를 반영한다.
도 16은 항-VAP-1 및 항-평활근 액틴 항체로 염색된 간 성상세포, 및 항-VAP-1, 항-CD90 및 항-콜라겐 IV 항체로 염색된 간 근섬유아세포를 도시한다. VAP-1 염색은 화살로 나타내었고, 이는 간 성상세포 및 간 근섬유아세포에서 나타난다.
도 17은 sVAP-1 수준 및 상응하는 조직학적 섬유증 단계의 스캐터 플롯(scatter plot)이다. 라인(line)들은 중간값들을 나타낸다.
도 18은 유의한 간 섬유증(F2 내지 4)(도 18A), 진행된 간 섬유증(F3 내지 4)(도 18B) 및 간경변(F4)(도 18C)을 예측하기 위한 단독 바이오마커(biomarker)로서 사용된 sVAP-1에 대한 수신기 작동 특성 곡선(ROC)을 도시한다.
도 19는 유의한 섬유증(F2 내지 4)(도 19A), 진행된 섬유증(F3 내지 4)(도 19B) 및 간경변(F4)(도 19C)을 예측하기 위해, sVAP-1 수준, 당뇨병의 상태(status) 및 AST/ALT 비[0.837 + sVAP-1(ng/ml) x 0.001 + 당뇨병 (yes=1 no=0) x 0.591 + logAST/ALT x 0.8]로부터 계산된 섬유증 점수에 대한 수신기 작동 특성 곡선(ROC)을 도시한다.
본 발명은, 세미카르바지드-민감성 아민 옥시다제(SSAO)로도 알려지고 인간 유전자 AOC3에 의해 규명된, 혈관 부착 단백질-1(VAP-1)이 섬유화 조직의 형성에 직접적인 역할을 한다는 놀라운 결과에 기반한다. 지금까지, VAP-1은 백혈구의 조직 내 이동을 매개함으로써 다수의 염증 질환에 관여하는 것으로 밝혀져 있지만, 섬유증 자체의 발병에 직접적으로 관여하는 것으로는 밝혀져 있지 않았다.
상기 용어 "섬유증"은 장기 또는 조직 중의 과도한 결합 조직의 형성 또는 존재를 나타낸다. 이는 조직 손상 또는 염증과 같은 자극에 대한 수복 반응 또는 교체 반응으로서 발생할 수 있다.
본 발명의 근본적인 목적들 중 하나는, 각종 장기들을 섬유화 손상에 대해서 보호하는 데 있어서의 VAP-1 억제제의 역할을 조사하는 것이었다. 예를 들어, 마우스들에서 사염화탄소에 의해 발생한 만성 섬유화 간 손상에서, 담배 연기 유도된 만성 폐색성 폐 질환(COPD) 마우스 모델 및 혈관 재형성, 혈관 협착 및 신생혈관 내막 비대(섬유증)의 마우스 모델에서, 탁월한 결과를 얻었다. 따라서, VAP-1 억제제는 항섬유화제로 확실히 간주될 수 있다.
따라서 하나의 측면에서, 본 발명의 실시형태들은 섬유증의 경감 또는 치료가 필요한 인간 환자에게 VAP-1 억제제의 유효 수준을 투여함으로써, 생체내에서, 인체에서, 섬유증을 경감 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 용어 "치료" 또는 "치료하는"은, 간 섬유증, 및 간 섬유증에 이르게 하는 염증 상태, 즉, 급성 및 만성 간경변, 답즙 질환 및 독성 간 손상, 폐 섬유증, 당뇨병성 신장병으로부터 초래된 것을 포함하는 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부경화증, 결합 조직 질환, 반흔, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 장기 이식, 혈관 협착, 재협착, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프선 섬유증, 방광 섬유증, 흉막 섬유증 및 기도벽이 근섬유아세포 및 콜라겐의 축적에 의해 섬유화되어, 모든 섬유화 조직들처럼 수축되는 질환인 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)을 포함하는 장애의 예방, 개선, 예방 또는 치료를 포함할 수 있는 목적을 위해 대상에게 VAP-1 억제제를 투여함을 포함하는 것으로 의도된다.
VAP-1 억제제의 "유효 수준"은, 섬유증의 유해한 효과가 최소한 개선되는 수준을 의미한다. VAP-1 억제제의 투여를 위한 용량 및 요법은 섬유증-관련 장애 치료의 임상 분야의 숙련가들에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 모노클론 항-VAP-1 항체인 상기 VAP-1 억제제는, 일주일에 한 번 내지 3개월에 한 번의 간격으로, 용량 0.01 내지 20mg/kg의 범위로, 더 바람직하게는 0.1 내지 15mg/kg의 범위로, 가장 바람직하게는 1.0 내지 10mg/kg의 범위로 혈관내로 제공된다. 또는, 상기 VAP-1 억제제는, 일주일에 한 번 내지 3개월에 한 번의 간격으로, 용량 0.1 내지 20mg/kg의 범위로, 더 바람직하게는 0.2 내지 10mg/kg의 범위로, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5mg/kg의 범위로 피하로 제공된다.
SSAO의 억제제인 본 발명의 상기 화합물은 약 0.1μg/kg 내지 약 300mg/kg, 바람직하게는 약 1.0μg/kg 내지 10mg/kg의 용량 범위내의 유효량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독 일일 용량, 또는 kg 체중에 의해 투여될 수 있고, 총 일일 용량은 하루에 두 번, 세 번 또는 네 번의 분할된 용량으로 투여될 수 있다.
상기 측면은 대안적 방식으로 제형화될 수 있으며, 즉, 본 발명의 몇몇 실시형태는 간 섬유증, 및 간 섬유증에 이르게 하는 염증 상태, 즉, 급성 및 만성 간경변, 답즙 질환 및 독성 간 손상, 폐 섬유증, 당뇨병성 신장병으로부터 초래된 것을 포함하는 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부경화증, 결합 조직 질환, 반흔, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 장기 이식, 혈관 협착, 재협착, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프선 섬유증, 방광 섬유증, 흉막 섬유증 및 기도벽이 근섬유아세포 및 콜라겐의 축적에 의해 섬유화되어, 모든 섬유화 조직들처럼 수축되는 질환인 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)와 같은, 섬유화 상태를 예방, 치료, 및/또는 완화시키기 위한 항섬유화제로서 VAP-1 억제제를 제공한다. 따라서, VAP-1 억제제는 상기 섬유화 상태를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
상기 용어 "VAP-1 억제제"는 VAP-1 또는 이의 SSAO 활성의 기능을 차단하는 능력을 갖는 모든 화합물을 나타낸다. VAP-1 억제제는 차단 항체 및 SSAO 억제제인, 두 개의 주 카테고리들로 분할될 수 있다.
본원 명세서에 사용된, 상기 용어 "항-VAP-1 항체"(Ab) 또는 "모노클론 항-VAP-1 항체"(MAb)는 온전한 항체 및 VAP-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는, Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 다양한 측면에서 사용하기 위한 적절한 항-VAP-1 항체는 당해 분야에서 입수 가능하며 추가의 항체는 숙련가에게 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 제5,580,780호는 동결 절편 분석에서 인간 VAP-1를 인식하고 림프구가 편도선 HEV에 결합하는 것을 차단할 수 있는 모노클론 항체(mAb), 1B2를 기재한다. MAb 1B2는 뮤린(murine) lgM-항체이고, 인간 VAP-1에 특이적이다. 국제 특허 출원 공보 제WO 03/093319호는 키메릭 항-VAP-1 모노클론 항체 BTT-1002를 기재하며, 상기 항체는 상응하는 뮤린 항체에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 그러나, 키메릭 항체인 경우 이의 인간 치료법에 대한 적용 가능성은, 이의 면역원성 및 초래되는 이에 대한 항체들의 생성으로 인해, 손상된다.
본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO 2008/129124호는 면역원성 및 시토카인 방출이 감소된 완전 인간 항-VAP-1 항체를 기재한다. 선호되는 완전 인간 모노클론 항-VAP-1 항체의 예는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹에서 선택된 1 내지 3개의 CDR 공통서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 및/또는 서열번호 24 내지 26으로 구성된 그룹에서 선택된 1 내지 3개의 CDR 공통서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 갖는 상기 항체들을 포함한다. 다른 바람직한 항-VAP-1 항체는 서열번호 4 내지 8로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 9 내지 13으로부터 선택된 제2 CDR 서열, 및 서열번호 14 내지 18로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 및/또는 서열번호 27 내지 31로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 32 내지 36으로부터 선택된 제2 CDR 서열 및 서열번호 37 내지 41로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 갖는 상기 항체를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 완전 인간 항-VAP-1 항체는 8C10으로서 표시되고, 서열번호 19로 나타내는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 42로 나타내는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이다. 또한 다른 실시형태에서, 상기 항-VAP-1 항체는 8A4로 표시되고, 서열번호 20으로 나타내는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 43으로 나타내는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이다. 추가의 실시형태에서, 상기 항-VAP-1 항체는 3F10으로 표시되고, 서열번호 21로 나타내는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 44로 나타내는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이다. 또한 추가의 실시형태에서, 상기 항-VAP-1 항체는 5F12로 표시되고, 서열번호 22로 나타내는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 45로 나타내는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이다. 또한 추가의 실시형태에서, 상기 항-VAP-1 항체는 4B3으로 표시되고, 서열번호 23으로 나타내는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 46으로 나타내는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이다. 이들 항체는 서열번호 47로 나타내는 중쇄 폴리펩티드 및 서열번호 48로 나타내는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 재조합 r8C10(BTT-1023)과 같은 재조합 항체로서 또한 제공될 수 있다.
본 실시형태들에서 사용하기 위한 적절한 SSAO 억제제의 예는, 히드라진 유도체, 예를 들면, 알릴히드라진, 특히 페닐알릴히드라진; 및 하이드록실아민(즉, 아미녹시) 유도체를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 페닐알릴히드라진의 더 특정한 예는 2-(페닐-알릴)-히드라진, N-[2-(4'-플루오로페닐)-알릴]-히드라진 및 (E)-1-플루오로-2-페닐-3-히드라지노프로펜을 포함하지만 이에 제한되지 않는 한편, 하이드록실아민 유도체의 더 특정한 예는 2-아미노옥실-1-페닐-에탄올, 및 2-아미노옥실-1-(3',4'-디메톡시-페닐)-에탄올을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 SSAO 억제제는 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO2006/094201호 및 국제 특허 출원 공보 제WO2005/014530호에 기재되어 있다. 다른 적절한 히드라진 유도체는, 아세토히드라지드, 예를 들면, 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO2009/145360호에 기재된 2-(4-{2-[5-(4-아세틸피페라진-1-일)피리딘-2-일]에틸}페닐)아세토히드라지드를 포함하나 이에 제한되지 않고; 히드라진 알코올, 예를 들면, 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO 02/02090호에 기재된 (1R,2S)-2-(1-메틸히드라지노)-1-페닐-1-프로판올, (1R,2S)-2-(1-메틸히드라지노)-1,2-디페닐에탄올, 1-(1'-메틸히드라지노)-3-(m-메톡시페녹시)-2-프로판올, 및 (1S, 2R)-2-(1-메틸히드라지노)-1,2-디페닐에탄올(BTT-2079)을 포함하나 이에 제한되지 않으며; 그리고 히드라진 인단, 예를 들면, 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO 03/006003호 및 제WO2005/080319호에 기재된 (1S,2S)-2-(1-메틸히드라지노)-1-인단올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 실시형태들에 사용하기 위한 적절한 SSAO 억제제의 추가의 예는, 프로페닐아민 및 프로파길아민, 4-치환된-2-부티닐아민, 할로알릴아민(특히 2- 및 3- 할로알릴아민), 피롤린 유도체, 프로파길디아민, 알릴아민 및 디아민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 SSAO 억제제의 더 특정한 예는 5-페녹시펜타-2,3-디에닐아민, 4-(4-메톡시페닐)부트-3-이닐아민, 4-페닐부트-3-이닐아민, 2-페닐-3-플루오로알릴아민, S-(E)-4-(4-아미노-2-플루오로부트-2-에닐옥시)-N-(1-페닐에틸)벤즈아미드, (E)-3-플루오로-4-(4-메틸설포닐)페녹시)부트-2-엔-1-아민, (E)-3-플루오로-4-(2-메틸벤조[d]티아졸-5-일옥시)부트-2-엔-1-아민, (E)-4-(4-아미노-2-플루오로부트-2-에닐옥시)-N-(1-페닐에틸)벤젠설폰아미드 및 (E)-2-(4-플루오로펜에틸)-3-플루오로알릴아민(BTT-2089, mofegeline)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 화합물들은, 모두 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO 2007/005737호, 제WO 2005/082343호, 제WO 2009/066152호, 제WO 2009/055002호, 및 문헌[참조: Palfreyman et al., J Neural Transm. (1994), 41, 407-414)]에 기재되어 있다.
본 실시형태들에 사용되는 적절한 SSAOO 억제제의 추가의 예는 4,5,6,7-테트라하이드로이미다조[4,5-c]피리딘 유도체(본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO 02/38153호에 기재됨), 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO 2006/013209호 및 미국 특허 출원 공보 제US2007/066646호에 기재된, N-하이드록시-2-(2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)아세트아미도)아세트아미드 및 5-아미노-2-하이드록시-N-(2-하이드록시벤질)벤즈아미드와 같은 카르복사미드 및 N2-{[4-(1,1-디메틸프로필)페닐]설포닐}-N1-하이드록시세린아미드와 같은 설폰아미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 티아졸 및/또는 구아니딘 유도체, 특히 2-아실아미노트리아졸 유도체는 본 발명의 다양한 실시형태에서 사용하기에 적절하다. 이러한 SSAO 억제제의 더 특정한 예는 N-{4-[2-(4-{[아미노(이미노)메틸]아미노}페닐)에틸]-1,3-티아졸-2-일}아세트아미드, N-{4-[2-(4-{[아미노(이미노)메틸]아미노}페닐)에틸]-5-[4-(메틸설포닐)벤질]-1,3-티아졸-2-일}아세트아미드, N-{4-[2-(4-{[2-아미노-1H-이미다졸-4-일)메틸]페닐}에틸)티아졸-2-일]-아세트아미드, 2-(4-{2-[2-(아세틸아미노)-1,3-티아졸-4-일]에틸}페닐)-N-[아미노(이미노)메틸]아세트아미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 화합물들은 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO2004/087138호, 제WO2004/067521호, 제WO2006/028269호, 제WO2006/011631호, 및 제WO2005/089755호에 기재되어 있다.
또한, 다양한 옥심 유도체는 SSAO 억제제이고, 따라서 본 발명의 다양한 실시형태에서 사용될 수 있다. 이러한 옥심 유도체는 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO2010/029379호에 기재된 5-브로모-1,3-벤조디옥솔-4-카르발데히드 옥심, 6-에톡시-1,3-디메틸-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리미딘-5-카르발데히드 옥심, 1,3-디메틸-6-(메틸티오)-2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라-하이드로피리미딘-5-카르발데히드 옥심을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또한 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO2010/015870호, 제WO 2005/072738호, 문헌[참조: Lyles G. A., Int. J. Biochem. Cell Biol. Vol. 28 pp259-276 (1996), and McDonald et al., Annual reports in Med. Chem. Vol. 42 pp. 229-243 (2007)]에 기재된 디히드라진, 아릴알킬아민, 옥사졸리디논, 할로알킬아민, 및 벤포티아민(비타민 B1)은 본 발명의 다양한 실시형태에서 SSAO 억제제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 측면 및 실시형태에서 사용하기에 적절한 추가의 SSAO 억제제는 본원 명세서에 참조로서 인용되는 국제 특허 출원 공보 제WO 2010/064020호에 기재된 이미다조피리딘 유도체를 포함한다.
또한, 본 발명의 다양한 실시형태에서 사용하기 위한 적절한 SSAO 억제제는, VAP-1의 SSAO 활성화를 억제 또는 차단시키는 능력을 갖는 모든 입체이성질체, 입체이성질체들의 혼합물, E 또는 Z 형태, E 및 Z 형태들의 혼합물, 전구약물, 대사 산물, 결정성 형태, 비-결정성 형태, 수화물, 용매화합물 또는 상기 화합물들의 염을 포함한다.
다른 적절한 SSAO 억제제는 당해 분야에 공지된 SSAO 분석으로 스크리닝하여 선별할 수 있다. 이런 분석은 모노아민 옥시다제 및 관련된 효소에 대해 본질적으로 기재된 커플드(coupled) 비색 분석을 사용하는 VAP-1 SSAO 활성 분석을 포함할 수 있다(Holt, A., et al., Anal. Biochem. 244:384-392 (1997)). 상피 세포의 SSAO 활성은 앰플렉스 레드 제제(Amplex Red reagent)(10-아세틸-3,7-디하이드록시펜옥사진), H2O2에 대한 매우 민감하고 안정한 프로브를 사용하여 또한 독립적으로 측정할 수 있다(Zhou M, Panchuk-Voloshina N. Anal Biochem. 253(2):169-74 (1997)). 또한, 상기 아민 옥시다제 활성은 기질로서 [7-14C]-벤질아민 하이드로클로라이드를 사용하여 방사화학적으로 분석할 수 있다(Jaakkola et al., Am J Pathol:155(6):1953-65 (1999)). VAP-1 SSAO 효소의 공급원으로서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 세포주에서 발현된 재조합 인간 VAP-1 SSAO를 사용할 수 있다(Smith, D.J., et al., J. Exp. Med. 188:17-27 (1998)). 다른 적절한 SSAO VAP-1 효소 공급원은 영장류 및 설치류와 같은 상이한 종들로부터의 혈청 및 조직 샘플일 수 있다.
본 실시형태들에 따라 사용하기 위해, VAP-1 억제제는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 및, 활성제로서의 VAP-1 억제제를 포함하는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다. 상기 조성물은, 환자의 SSAO 활성 또는 VAP-1의 생물학적 리간드에 대한 고유 VAP-1의 결합을 길항(전체 또는 부분적으로)하는 것이 필요한 환자에서 상기와 같이 길항시키기에 충분한 양으로 VAP-1 억제제를 함유한다.
VAP-1 억제제의 투여를 위한 양 및 요법은 섬유증-관련 장애 치료의 임상 분야에서 숙련가들에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일반적으로, VAP-1 억제제 치료의 용량은 연령, 성별 및 치료받는 환자의 일반적인 건강; 만약 있다면, 동시 치료의 종류; 치료의 빈도 및 목적하는 효과의 특성; 조직 손상의 정도; 증상의 지속 기간; 및 개별 임상의에 의해 조정되는 다른 변수들과 같은 고려사항들에 따라 변할 수 있다. 목적하는 용량은 목적하는 결과를 얻기 위한 1종 이상의 투여(application)들로 투여될 수 있다. 본 실시형태들에 따른 약제학적 조성물은 단위 용량 형태로 제공될 수 있다.
상기 약제학적 조성물들은 투여를 위한 임의의 적절한 약리학적 담체에 포함되어 투여될 수 있다. 이들은 인간 또는 동물 환자에서 섬유화 상태의 예방, 완화, 예방 또는 치료 상태를 달성하는 임의의 형태로 투여될 수 있다.
비경구 및 국소 투여를 위한 약제학적 조성물은 멸균 수성 또는 비-수성 용매, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 유, 어유(fish oil), 및 주사가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 물, 염수를 포함하는 물-알코올 용액, 및 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로스 용액, 덱스트로스에 염화 나트륨을 더한 용액, 락토스를 함유한 링거 용액, 또는 고정유를 포함한 완충된 중막 비경구 비히클을 포함한다. 정맥내 비히클은 링거 덱스트로스 등에 기반한 물질들과 같은 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물을 포함한다. 상기 실시형태들에 따른 수성 조성물은 표적 pH-범위에 의존하는, 인산나트륨 및 인산 칼륨, 시트레이트, 아세테이트, 카보네이트 또는 글리신 완충제와 같은 적절한 완충제를 포함할 수 있다. 긴장성 조절제(tonicity adjuster)로서의 염화 나트륨의 사용이 또한 유용하다. 조성물은 안정제 또는 보존제와 같은 다른 부형제를 포함할 수 있다. 유용한 안정화 부형제는 계면활성제(폴리소르베이트 20 & 80, 폴록사머 407), 중합체(폴리에틸렌 글리콜, 포비돈), 탄수화물(수크로스, 만니톨, 글루코스, 락토스), 알코올(소르비톨, 글리세롤 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜), 적절한 단백질(알부민), 적절한 아미노산(글리신, 글루탐산), 지방산(에탄올아민), 항산화제(아스코르브산, 시스테인 등), 킬레이트제(EDTA 염, 히스티딘, 아스파르트산) 또는 금속 이온(Ca, Ni, Mg, Mn)을 포함한다. 유용한 보존제 중에는 벤질 알코올, 클로로부탄올, 벤잘코늄 클로라이드 및 가능하게는 파라벤이 있다.
상기 약제학적 조성물은, 요구에 따라서 재구성될 농축된 형태 또는 분말의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 경우, 상기에 기재된 주사/주입 부형제를 위한 용액을 위한 분말의 제형이 사용될 수 있다. 동결 건조의 경우, 중합체(포비돈, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란), 당(수크로스, 글루코스, 락토스), 아미노산(글리신, 아르기닌, 글루탐산) 및 알부민을 포함하는, 몇몇 저온보호물질이 바람직하다. 만약 재구성을 위한 용액이 패키징에 추가된다면, 이는 예를 들어, 주사를 위한 순수(pure water) 또는 염화 나트륨 용액 또는 덱스트로스 또는 글루코스 용액으로 구성될 수 있다.
상기 치료학적으로 유용한 항-VAP-1 항체는, 화학적으로 또는 유전공학에 의해 다른 제제에 접합될 수 있으며, 이는 목적하는 작용 부위에 대한 상기 항체들의 표적화를 제공한다. 또는, 상기 항체를 향상시키거나 상기 항체에 대한 추가의 특성, 특히, VAP-1 결합에 의해 매개되는 유해 효과의 완화를 촉진하는 항체의 능력을 향상시키는 특성을 제공하기 위해서, 상기 항체에 화학적으로 또는 유전공학에 의해 다른 화합물이 접합될 수 있다.
상기 항-VAP-1 항체는, 검출가능한 항체를 제공하기 위해 화학적으로 또는 유전공학에 의해 표지될 수 있다. 이런 표지된 항체는 인간에서 섬유화 부위를 이미징하는, 특히 섬유화 부위의 생체내 면역신티그래픽 이미징(immunoscintigraphic imaging)을 위한 유용한 도구일 수 있다. 이미징의 목적을 위해, 항-섬유화 치료에 대한 완전 항체 접근법보다는 항체 단편의 사용이 바람직할 수 있으며, 완전 인간 항체로부터 유래한 단편이 이들의 키메릭 또는 마우스 등가체보다 훨씬 더 안전하다.
본 발명의 몇몇 측면은 섬유화 상태의 진단에 관한 것이다. 본 발명과 관련해서, 체액(예를 들면, 혈청 또는 혈장) 중의 가용성 VAP-1(sVAP-1)의 상승된 수준, 따라서, 상승된 SSAO 활성이 섬유증의 정도와 상관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명의 몇몇 실시형태는 간 섬유증, 및 간 섬유증에 이르게 하는 염증 상태, 즉, 급성 및 만성 간경변, 답즙 질환 및 독성 간 손상, 폐 섬유증, 당뇨병성 신장병으로부터 초래된 것을 포함하는 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부경화증, 결합 조직 질환, 반흔, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 장기 이식, 혈관 협착, 재협착, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프선 섬유증, 방광 섬유증, 흉막 섬유증 및 기도벽이 근섬유아세포 및 콜라겐의 축적에 의해 섬유화되어, 모든 섬유화 조직들처럼 수축되는 질환인 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)와 같은, 섬유화 상태를 진단하는 수단 및 방법을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 체액 중의 상승된 sVAP-1 수준 및/또는 SSAO 활성에 기반한 섬유화 상태의 진단은, 섬유화 상태를 위한 존재하는 예측 바이오마커의 패널의 분석과 병용될 수 있다. 이는 존재하는 바이오마커의 진단 능력을 향상시킬 수 있다. 다시 말해서, sVAP-1 수준/SSAO 활성은 섬유증의 존재를 예측하기 위한 신규한 비-침습적 시험으로서, 단독으로 또는 다른 임상적 및 생화학적 마커와 병용하여 사용될 수 있다.
혈청과 같은 체액 샘플 중의 sVAP-1의 수준은 다음의 방법에 의해 결정될 수 있다: 스트렙타비딘으로 피복된 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 상의 포획자(capturer)로서 비오틴-접합된 마우스 항-인간 VAP-1 항체 TK8-14(Biotie Therapies Corp.)를 사용하는 가용성 VAP-1의 정량화를 위한 시간 분해 원-스텝 면역형광 분석(TR-IFMA)(DELFIA). 결합된 가용성 VAP-1의 검출은 유로퓸-접합된 마우스 항-인간 VAP-1 항체 TK8-18(Biotie Therapies Corp.)을 추적자(tracer)로서 사용하여 수행된다. 상기 표지는 시간 분해 형광(Victor3 multilabel counter)으로 615nm에서 측정함으로써 검출된다. 상기 형광 카운트는 상기 샘플 중에 얼마나 많은 가용성 VAP-1이 존재하는 지와 직접적으로 상관 관계가 있다. 상기 샘플 데이터는 이후에 참조물의 표준 곡선과 비교하여 분석된다.
본 발명의 몇몇 실시형태에서, 섬유증의 진단이 필요하고/하거나 섬유증을 앓고 있는 것으로 의심되는 대상으로부터 채취한 체액 중의 SSAO 활성에 기반하여 섬유증을 진단한다. 이런 목적을 위한 하나의 적절한 방법이 문헌[참조: Li et al. in J. Chromatogr. B, 810 (2004) 277-282]에 기재되어 있다. SSAO 활성을 결정하는 다른 수단 및 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.
또한, 본 발명의 몇몇 측면은 섬유증의 진단에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는, sVAP-1, 예를 들어, 특정 항-VAP-1 항체, 예를 들어, 상기 기재된 항-VAP-1 항체들 중 하나의 양을 평가하기 위한 하나 이상의 제제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 키트는 혈청 또는 혈장과 같은 체액 중의 SSAO 활성의 평가를 위한 하나 이상의 제제를 포함한다. 예를 들어, 상기 키트는, 예를 들면, VAP-1 SSAO를 위한 기질, 벤질아민, 메틸아민, 아미노세톤 또는 다른 지방족 또는 방향족 모노아민을 적절한 SSAO 효소 활성 분석 완충제, 및 SSAO 활성을 검출하기 위한 제제들 및 방법의 세트를 포함할 수 있다. SSAO 활성은, 모노아민 기질 상에서의 SSAO 활성의 작용으로부터의 과산화수소의 발생이 측정되는 커플드 분석법(coupled assay)을 사용하여 검출할 수 있거나, 벤질아민과 같은 14C 표지된 아민 기질을 사용하여 수용성 아민의 유기 용매 가용성 알데하이드로의 전환을 모니터링함으로써 직접적으로 측정될 수 있다.
본 발명의 독창적인 개념은, 기술 향상으로서, 다양한 방식으로 시행될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 본 발명 및 이의 실시형태들은 하기에 기재된 실시예들로 제한되지 않으며 특허청구범위의 범위내에서 변할 수 있다.
실시예 1. 간 섬유증의 마우스 모델에서 VAP-1 억제제의 효과
본 연구의 목적은 마우스에서 섬유증 간 손상에 대한 VAP-1 억제제의 효과를 평가하는 것이었다.
모든 마우스들은 버밍엄 대학의 생체의학부에서 내부 규정에 따라 통상 조건하에 사육되었다. 케이지당 네 마리의 마우스들을 사육했고 실험 전 일주일 동안 상기 사육 상황에 순응시켰다. 8 내지 10주령의 암컷 C57BL/6 및 VAP-1-/- 마우스들(VAP-1을 결손한 AOC3 유전자 녹아웃 마우스들)을 본 연구에 사용했다. C57BL/6 마우스들은 버밍엄 대학의 생체의학부로부터 스톡 콜로니(stock colony)로부터 얻은 한편, VAP-1-/-(AOC3 유전자 녹아웃) 마우스들은 덴마크의 제휴 번식사 타고닉(Taconic)으로부터 얻었다.
만성 간 섬유증의 마우스 모델은, 광물유에 용해시킨 4염화탄소(CCl4; Aldrich Chemical) 1ml/kg의 용량으로 8주 동안 일주일에 2회로 복강내 투여하여 확립되었고, 대조군은 광물유만 복용시켰다. 마우스 항-마우스 VAP-1 항체 BTT-1029로 치료된 마우스들은, CCl4 투여 2주 전, 및 CCl4 투여 동안 매주 정맥내 주사 투여되었다. 동물들은 CCl4 최종 용량 후 96시간 후 사망시켰다. 혈액 샘플은 이소플루레인 마취 동안 심장천자에 의해 채취했고, 경부 탈골에 의해 마우스들을 도태시켰다. 간을 절개했고 상이한 가공들을 위해 4 부분으로 잘랐다.
통계적 분산분석(ANOVA)을 윈도우 버전 11.0에 대한 SPSS를 사용하여 수행했다. 둘 이상의 변수 그룹들에 대한 샘플들에서의 유의도 분석을 위해, 피셔의 최소 유의차 사후 검증이 뒤따르는 일원 분산분석을 사용했다.
간 시료를 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 파라핀에 포매시키고 4μm의 절편으로 잘랐다. 조직병리학 분석을 위해 절편들을 표준 절차에 따라 시리우스 레드 염색 또는 H&E 염색했다. 면역형광 염색을 위해, 고정된 마우스 간을 30% 수크로스에 함침시킴으로 동결-보호시키고, 빠르게 동결시키고 동결절편기에서 7μm로 잘랐다. 간략하게, 절편들을 0.1% 트리톤 X-100을 함유한 인산완충 염수(PBST)로 10분 동안 세척하고 0.1% PBST 중의 10% 염소 혈청으로 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 혈청-PBST에 희석된 엘라스틴, 콜라겐 IV 및 라미닌에 대한 일차 항체(Abcam)로 항온처리한 후, 슬라이드를 PBST로 세 번 세척하고 실온에서 1시간 동안 이차 항체(Invitrogen)로 항온처리했다.
예상한 대로, CCl4가 C57BL/6 마우스들에서 중증 섬유화 손상을 유도했다. 8주째에, 야생형 마우스들은 시리우스 레드 원섬유의 간내 함량의 여덟배의 증가를 나타냈고 간세포의 괴사 및 진행성 간염을 가졌다. 흥미롭게도, VAP-1 결핍 마우스 및 BTT-1029 치료된 야생형 마우스들 둘 다에서 섬유화 손상의 유의한 감소가 있었다. 이 마우스들은 단지 소량의 시리우스 레드 원섬유를 나타냈으며, 상기 간 조직검사는 괴사 구역의 완전 부재 및 단지 경미한 간염을 가져 거의 정상을 나타냈다(도 1 및 도 2). 또한, 존재하는 성숙한 대식세포의 수가 유의하게 더 적었으며, 이는 야생형에 비해 훨씬 더 적은 중증 손상을 다시 한번 나타내는 것이다(데이터를 나타내지 않음).
상기 간에서의 간 성상세포 활성화와 관련된 유전자의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 평가했다. 이를 위해, 총 RNA를 키아젠 RNAeasy 미니 키트(Qiagen RNAeasy Mini Kit)(#74104)를 사용하여 마우스 간으로부터 추출했다. RNA를 무작위 프라이머(Promega) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터의 수퍼스크립트(Superscript) III를 사용하여 cDNA 주형으로 역전사시켰다. qRT-PCR을 위한 파라미터들은 다음과 같다: 95℃에서 10분 동안 변성, 95℃에서 10초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1초, 55회 사이클로 증폭. 정량적 리얼-타임 PCR을 참조 유전자 GAPDH 및 로쉐(Roche)로부터의 프로브를 사용하여 로쉐 라이트사이클러(LightCycler)480 시스템으로 측정했다. 발현 수준을 'E-방법'(Roche)을 사용하여 정량화했다.
데이터는 간 성상세포(HSC)의 조절에 의한 간 섬유증의 진행에서의 VAP-1의 역할을 나타낸다. 활성화된 HSC는, 엘라스틴을 포함하는, 섬유화 간에서 ECM 성분을 합성하기 위한 중요 공급원으로서 간주된다. CCl4를 투여한 야생형 간은 αSMA 및 엘라스틴 mRNA 수준에서의 현저한 증가를 나타냈으며, 이는 HSC를 발현하는 αSMA의 축적 및 엘라스틴의 침착을 나타낸다(도 4). BTT-1029 치료 야생형 및 VAP-1-/1 간에서 αSMA 및 엘라스틴 둘 다의 mRNA 수준이 야생형 간에 비해 유의하게 더 낮았다. 공초점 현미경에 의해 엘라스틴 및 콜라겐 IV 발현의 차이들 또한 확인된 반면, 라미닌 수준은 변화없이 유지되었다(도 3).
결론적으로, 상기 BTT-1029 치료는 간 성상세포의 활성화를 감소시킴으로써 확립된 간 섬유증에 대한 거의 완벽한 보호를 유도하고, 이에 따라 섬유화 병변에서의 섬유아세포의 성장을 제한한다. VAP-1-/1 마우스들에서도 동일한 효과가 나타났으며, 이는 CCl4 유도된 손상에 대한 거의 완전한 보호를 나타낸다. 상기 결과는 VAP-1를, 간 성상세포에 대한 조절 효과를 통해 간 섬유증의 진행에서의 중요한 역할자로서 나타낸다. VAP-1 SSAO는 구리 아민 옥시다제이며, 따라서 엘라스틴 및 콜라겐과 같은 ECM 단백질을 가교시키는 데 책임이 있는 리실 옥시다제, 다른 구리 아민 옥시다제 효소와 유사하다. VAP-1의 SSAO 활성은 또한 ECM 단백질에서 가교의 형성에 직접적 영향을 갖는 것이 여전히 가능하다.
또한, 혈청 및 간 조직 샘플의 SSAO 활성을 [7-14C]-벤질아민 염산(spec. act. 57mCi/mmol)을 기질로서 사용하여 방사화학적으로 측정했다(도 5). 혈청(40mg/ml 단백질) 또는 조직 제제(2mg/ml 단백질)를 5μM 클로르길린 및 파르길린, 및 비-특이 결합 튜브로 또한 1mM 세미카르바지드로 37℃에서 30분 동안 선-항온처리(preincubate)했다. 분석을 [7-14C]-벤질아민을 기질로서 함유한 0.2mM Na-포스페이트 완충제(pH 7.4)의 최종 용적 200μl에서 한시간 동안 37℃에서 수행했다. 촉매 효소 활성 반응 분석을 종료하고 상기 문헌[참조: Jaakkola et al., 1999 (American Journal of Pathology, 155, 6)]에 기재되었던 대로 처리했다. 단백질 농도들을, 소혈청 알부민을 표준물로서 사용하여 문헌[참조: Bradford et al. (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem. 72, 248)]에 따라 측정했다.
결과는 CCl4-유도된 간 섬유증을 예방할 뿐만 아니라, 상기 BTT-1029 치료는 상기 간 샘플들에서 SSAO 활성을 현저히 감소시킴을 나타냈다.
실시예 2. 신장 손상의 마우스 모델에서 VAP-1 억제제의 신장보호 효과
4염화탄소에 강하게 노출되면 간 및 신장 모두에 손상을 가져온다. 따라서, 실시예 1에 기재된 CCl4 처리 동물로부터 신장을 채취하고 신장병에 대한 VAP-1 억제제의 효과를 분석했다.
신장을 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 파라핀에 포매시키고 4μm의 절편으로 잘랐다. 조직병리학 분석을 위해 절편을 시리우스 레드 염색 및 H&E 염색했다. 염색은 표준 절차에 따라 수행했다. 시리우스 레드 원섬유 양을 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 역가 분석으로써 정량화시켰다.
통계적 분산분석을 SPSS 윈도우, 버전 11.0을 사용하여 수행했다. 둘 이상의 변수 그룹들에 대한 샘플들에서의 유의도 분석을 위해, 터키 HSD's 최소 유의차 사후 검증이 뒤따르는 일원 분산분석을 사용했다.
CCl4를 투여한 마우스들은 부분적 변경(alteration) 및 전반적 변경 둘 다에 의한 국소 사구체 변화를 나타냈다. H&E 염색은 다양한 병변, 예를 들어, 혈관간 세포과다성, 팁(tip) 도메인의 협착 및 경화를 나타냈다. 그러나, 사구체의 나머지 단편에 대해서만 사구체 소방의 전반적 붕괴가 주로 보였다(데이터는 나타내지 않음). 흥미롭게도, VAP-1 녹아웃 마우스들 및 BTT-1029 치료 마우스들은 사구체 병변으로부터 완전히 보호되었다(도 6).
섬유증의 표시로서의, 사구체 주변에 콜라겐의 축적을, 시리우스 레드 염색으로 평가했다. C57BL/6 마우스들에서의 CCl4의 축적은, 사구체 소방의 주변에서의 콜라겐 축적의 거의 두 배 증가를 유도했다. 흥미롭게도, VAP-1 결손 마우스들 또는 VAP-1 억제제를 투여한 마우스들은 대조군과 유사한 콜라겐 축적의 유의한 감소를 나타냈다(도 7). 상기 결과는 CCl4 유도된 신장병에서 VAP-1의 보호 역할을 명백하게 나타낸다.
실시예 3. COPD의 마우스모델에서 VAP-1 억제제의 효과
COPD의 치료에 대한 VAP-1 억제제의 효과를 평가하기 위해 담배 연기 유도된 COPD의 마우스 모델을 사용했다.
C57BL/6J 마우스들을 연속적으로 11일 동안 담배 연기(TS)에 하루에 한 번씩 노출시켜 최종 TS 노출 후 24시간에서 폐 염증을 초래했다. 11일 후, 반응은 대식 세포, 상피 세포, 호산성 물질, 호중성 백혈구 및 림프구에서 유의한 증가로 구성된다.
마우스들을 연구 그룹(n=10)으로 무작위로 나누고 1, 3, 6, 및 9일째에 TS 노출 후 4시간 후에 비히클(5ml/kg PBS pH 7.4 + 0.1% 폴리소르베이트 80)로 또는 마우스 모노클론 항-VAP-1 항체(비히클 중의 BTT-1029 3mg/kg 또는 9mg/kg)로 정맥내 투여하여 치료했다. 다른 그룹(n=10)은 정맥내로 비히클을 투여받았고 동등한 길이의 시간 동안 공기에 노출시켰다. 마우스들(n=10)의 추가의 두 개의 그룹들에게는 다른 비히클(멸균수 중의 0.5% 카복시메틸셀룰로오스, 나트륨 염(CMC)) 또는 참조 화합물(0.5% CMC 중의 로플루밀라스트 5mg/kg)을 연속적으로 11일 동안 각각의 TS 노출 1시간 전에 하루에 한 번 경구 투여했다. 마지막 그룹(n=10)은 경구 비히클(0.5% CMC)을 투여받았고 동등한 길이의 시간 동안 공기에 노출시켰다.
모든 결과는 각 동물에 대한 개별적 데이터 값으로서 나타냈고 평균값을 각 그룹에 대해 계산했다. 정상 상태를 위한 시험이 양성으로 나타나는 경우, 데이터에 대해 먼저, 치료 그룹들 사이의 유의성을 시험하기 위한 다중 비교를 위한 본페로니 수정이 뒤따르는, 일원 분산분석 시험(ANOVA)을 수행했다. 0.05 이하의 "p" 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
모든 데이터에 대해 등분산에 대한 바틀렛(Bartlet) 시험도 수행했고, 대부분의 연구에서 분산은 대체로 동일했으나, 본 연구에서 발생한 것과 같이, 간간히 일부 치료 그룹은 양성 결과를 나타낼 수 있다. 따라서 비모수적 분석을 또한 사용했다. 데이터가 정상적으로 분산되었기 때문에 모수 분석(ANOVA)을 사용했다.
억제 백분율을 하기의 수학식을 사용하여 세포 데이터에 대한 엑셀 스프레드시트 내에서 자동으로 계산되었다:
Figure pct00001
본 연구의 1, 3, 6 & 9일째에, TS 노출 후 4시간에서 9 및 3mg/kg으로 BTT-1029를 정맥내 투여받았을 때, BAL에서 TS 유도된 세포의 증가가 유의하게 감소되었다(각각 38% 및 33% 억제, 둘 다 p<0.001)(도 8). 이는 대식 세포들에서의 현저한 감소(각각 29% 및 22% 억제, 각각 p<0.01 & p<0.05), 호중성 백혈구들에서의 현저한 감소(66 및 59% 억제, 둘 다 p<0.001), 림프구들에서의 현저한 감소(69% 및 54% 억제, 둘 다 p<0.001) 및 호산성 물질들에서의 현저한 감소(각각 93% 및 65% 억제, 각각 p<0.001 및 p<0.01)로 구성되었다.
참조 화합물인 로플루밀라스트를 TS 노출 1시간 전에 하루에 한 번씩 경구 투여했을 때, 세포의 총 수가 또한 유의하게 감소되었다(41%, p<0.001)(도 9). 상기 억제는 호중성 백혈구에서의 감소(63% p<0.001), 상피 세포에서의 감소(51% p<0.01) 및 림프구에서의 감소(65%, p<0.001)로 구성되었다. 본 연구에서 로플루밀라스트는 BAL에서 발견된 대식 세포 및 호산성 물질의 수를 유의하게 감소시키지 않았다.
실시예 4. 혈관 벽 내의 신생혈관 내막 및 중막의 섬유증에 대한 VAP-1 억제제의 효과
신생혈관 내막 및 중막 비대는 죽상경화판 병변의 발달에서 초기 및 필수적 단계이고 재협착의 필수적 구성요소이다. 여기에는 혈관 벽 내의 신생혈관 내막 및 중막에서의 섬유화 변화가 동반된다. 본 연구는 적정한 서양 타입 식이요법을 받은 ApoE3 라이덴(Leiden) 마우스들의 대퇴동맥에서 커프(cuff)-유도 신생혈관 내막 비대(커프-유도 협착)에 대한 소분자 SSAO 억제제(mofegiline, BTT-2089)의 전신 전달(매일 복강내 주사)의 효과를 측정함으로써, 섬유화 질환에서의 SSAO 차단의 역할을 평가했다.
방법: 40마리의 수컷 ApoE3*라이덴 마우스들(12주령)을 커프 배치 수술 전에 3주 동안 부드러운 콜레스테롤과잉혈증 식이요법을 시켰다. 치료는 1) 비히클을 매일 복강내 주사; 2) 식수 중의 덱사메타손 9mg/l; 3) 매일 BTT-2089 10mg/kg을 복강내 주사; 4) BTT-2089 30mg/kg으로, 모두 수술 하루 전에 시작했고 실험기간 동안 지속했다. 0일에 수술을 수행하고, 즉, 비-수축 커프(길이 2 내지 3mm)를 마우스들의 양쪽 대퇴동맥들 주변에 위치시켰다. 각 그룹의 10마리의 마우스들을, 가속화된 죽상경화판 병변 및 신생혈관 내막 형성의 억제를 정량화하기 위한 조직형태학적 분석을 위해 2주 후에 안락사시켰다. 0.9% NaCl 치료한 대조군에 비해 덱사메타손-치료 양성 대조군 및 두 개의 BTT-2089 치료 그룹에서 중막 및 신생혈관 내막 형성에서의 유의한 감소를 나타냈다(도 10 및 11). 이는 대조군과 비교했을 때 SSAO 억제제 치료 그룹들에서 HPS 염색 혈관 세그먼트의 예들에서 증가된 내강 크기에 반영되었다(도 12).
동일한 모델에서 두번째 연구를, BTT-2089로부터 구별되는 화학적 부류로부터의 다른 SSAO 억제제로 수행했다. 상기 히드라진 기반 억제제(BTT-2079)를 매일 복강내 주사로 10mg/kg 용량으로 투여했고 BTT-2089 30mg/kg과 비교했다. 모든 다른 측면에서, 본 연구는 덱사메타손 대조군을 생략하는 것을 제외하고 동일한 방식으로 수행했다. 매일 모페길라인(mofegiline)(BTT-2089) 30mg/kg을 복강내로 다시 투여하여 SSAO를 억제시키는 것은 유익한 효과를 나타냈고 SSAO 억제 후 신생혈관 내막 형성 및 내강 협착 백분율에서 유의한 감소를 나타냈다. 매일 복강내로 SSAO 억제제 BTT-2079 10mg/kg으로 치료한 그룹은 또한 신생혈관 내막 형성에서 유의한 감소를 나타냈다. 모든 그룹들 사이에서 혈관 벽 직경, 중막 및 내강 구역에서 유의한 변화는 발견되지 않았다. BTT-2079 10mg/kg 및 BTT-2089 30mg/kg의 내막 중막 비율은 대조군에 비해 유의하게 더 적었으나, 내강 협착 백분율은 대조군에 비해 BTT-2089 30mg/kg 그룹에서만 유의하게 더 적었다. 혈관 완전성은 영향받지 않았다.
이들 연구는 SSAO 억제제의 전신 투여가 대조 치료 그룹과 비교했을 때 ApoE3 라이덴 마우스 커프 모델에서 더 적은 신생혈관 내막 비대(신생혈관 내막 섬유증)를 나타냈음을 보여준다.
실시예 5. 폐 섬유증의 마우스 모델에서 VAP-1 억제제의 효과
블레오마이신-유도 폐 섬유증은 폐 섬유증 연구를 위해 확립된 재현성있는 마우스 모델이다.
8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스들을 폐 손상을 일으키기 위해 블레오마이신(100mg/kg)을 7일 동안 알제트(Alzet) 삼투 미니펌프에 의해 전신에 처리한다. 비-폐 독성은 펌프 이식(implantation) 후 7 내지 21일 동안 관찰한다. 21일째에 조직병리학적으로 측정된 것으로서 폐에서의 섬유증이 12 내지 15%이다. 이후 증가된 호흡률 및 극심한 체중 감소에 의해 관찰될 수 있고 결국 42일 내에 사망에 이르는(만약 이전에 종료되지 않으면), 임상적 폐 손상이 뒤따른다.
마우스들을 연구 그룹들로 무작위로 나누고, 0일부터 28일까지 3일째마다 정맥내 주사로 비히클, VAP-1 억제제 또는 참조 화합물로 치료한다. 각 연구 그룹의 마우스들의 절반은 21일째에 사망시키는 한편, 나머지 반은 28일째에 사망시킨다.
부검에서, 폐를 고정시키고(10% 중성 완충된 포르말린) 섬유화 병변의 등급을 매기기 위해 조직병리학적 가공을 수행한다. 조직 절편들을 섬유증을 확인하기 위해 H&E 및 매손 트리크롬(Masson's Trichrome)으로 염색한다. 총 폐 면적에 대한 섬유화 폐 면적의 비율은 각 마우스에 대해 컴퓨터-보조 이미지 분석으로 정량화한다.
둘 이상의 변수 그룹들에 대한 샘플들에서의 유의도 분석을 위해 적절한 사후 검증이 뒤따르는 일원 분산분석을 사용한다.
대조군과 비교한 점수 매김에서 통계적으로 유의한 감소에 의해 입증되는, 폐 섬유증의 감소를 볼 수 있다.
실시예 6. 당뇨성 신장 질환의 마우스 모델에서의 VAP-1 억제제의 신장보호 효과
당뇨병은 진행성 신장 섬유증과 관련된 당뇨성 신장병(DN)을 일으킬 수 있고, 결국 기능성 신장 매스를 감소시킨다. 신장 섬유증에 대한 항-VAP-1 항체 및 SSAO 억제제의 효과를 평가하기 위해, 당뇨성 신장 질환을 위해 잘 확립된 Db/db 당뇨병 마우스 모델을 사용했다.
이들 실험의 모든 측면(사육, 실험 및 동물 폐기)은 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드(National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 일반적으로 준거하여 수행했다.
시험 품목, SSAO 억제제 BTT-2079를, 당뇨성 신장병의 마우스 모델에서의 가능한 신장보호 효과에 대해 평가했다. 시험 물질 및 비히클을 당뇨병이 완전히 확립되었을 때, 15주령의 db/db 마우스들(BKS Cg-Lepr db/Lepr db)에게 42일 동안 연속적으로 하루에 한 번씩 복강내(IP)로 투여했다. Db/m 마우스들은 제지방 정상 대조군으로 제공되었다. 상기 db/db 마우스들은 db/m 마우스들과 비교하여 손상된 신장 기능을 나타내는 상승된 혈장 크레아티닌, 및 과혈당증 및 이상지질혈증(LDL, 총 콜레스테롤 및 중성지방)을 나타냈다. 상기 당뇨병 마우스들은 비만, 다뇨, 알부민뇨 및 손상된 요세관 Na+ 재흡수를 나타내는 증가된 분획 소변 Na+ 배설(FENa)과 관련되었다. 내인성 크레아티닌 청소율(CCr), 사구체 여과율의 평가는 db/m 마우스들에 비해 당뇨병 마우스들에서 더 낮은 경향이 있었다.
수컷 db/db 비-인슐린 의존성 당뇨병 마우스들은 하기에 서술한 대로 치료 그룹에 할당되었다.
Figure pct00002
생존 단계의 종료시, 조직 수집 및 보관을 포함하는 부검을 수행했다. 모든 32마리의 동물들로부터 오른쪽 신장을 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정했다. 종단 절편을 트리밍(trimming)시키고 파라핀 블록으로 되도록 가공하고, 3 마이크론으로 절편화하고, 광현미경으로 평가하기 위해 과요오드산 쉬프(Schiff)(PAS)로 염색했다. 혈관간 기질 팽창을 하기 프로토콜에서 서술한 반-정량적 평점표에 따라 신장 당 50개의 사구체에서 점수를 매겼다.
각 신장으로부터의 50개의 사구체에 대해 하기 시스템에 따라 혈관간 기질 팽창에 대해 점수를 매겼다.
Figure pct00003

각 그룹의 혈관간 기질 팽창 점수 평균은, 각 그룹의 모든 동물에 대한 혈관간 기질 점수를 합하고 상기 그룹의 동물의 총 수로 상기 합을 나누어 유도했다. 평균 그룹 혈관간 기질 팽창 점수를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00004
정상 동물에서 경미한 사구체 혈관간 기질이 나타날 수 있지만, 혈관간 기질의 팽창은 당뇨병과 같은 다양한 질환 상태의 특징이다. 상기 혈관간 기질은 기저막 및 관련된 다중음이온 프로테오글리칸 및 과요오드산 쉬프(PAS) 방법에 의해 적색 내지 보라색으로 염색된 다른 분자들을 포함한다. 따라서, 사구체에서 PAS 양성 물질의 양은 존재하는 혈관간 기질의 양의 척도이다.
각 동물로부터 50개의 사구체를 배율 200X에서 평가하고 상기에 기재된 평점 시스템을 사용하여 팽창된 혈관간 기질에 대해 점수를 매겼다. 평균 그룹 혈관간 기질 팽창 점수는 각 동물에 대해 측정된 각 사구체에 대한 점수를 합하여 계산했다. 이후에 상기 그룹의 모든 동물에 대한 혈관간 기질 팽창 점수를 합하고 그룹당 동물들의 수로 나누어 평균 그룹 혈관간 기질 팽창 점수를 얻었다. 이 데이터에 의거하면, BTT-2079를 5 및 15mg/kg으로 사용하는 치료는, db/db 비-인슐린 의존 당뇨병 마우스들(그룹 2)에서의 평균 그룹 혈관간 기질 팽창 점수와 비교하여 용량-관련 방식에서 혈관간 기질 팽창 점수를 감소시켰다.
신장 섬유증에 대한 항-VAP-1 항체 및 SSAO 억제제의 효과를 평가하기 위해, 당뇨성 신장 질환을 위해 잘-확립된 다른 마우스 모델을 사용했다: 1) 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델 2) 편측 요관 장애, 신장 섬유증 모델.
1) 스트렙토조토신-유도 당뇨병 마우스 모델. 6 내지 7주령의 수컷 마우스들(체중 20 내지 25g)을 스트렙토조토신(STZ) 주사 전 6시간 동안 금식시킨다. 당뇨병을 유발하기 위해, 갓 혼합한 STZ(구연산 나트륨 완충제 중 7mg/ml)를 각 선-금식시킨 마우스에 55mg/kg으로 복강내 주사한다. 상기 질환의 유도를 완결하기 위해, 상기 절차를 반복하여 각 마우스가 한 번의 STZ 주사를 연속 5일 동안 맞게 한다. 최종 STZ 주사 후 1주일 후에 280mg/dL미만의 비-금식 혈당을 갖는 마우스들은, 이들이 유의한 신장 손상을 일으키기에 충분한 당뇨병을 통상적으로 발병하지 않을 수 있기 때문에 본 실험에서 제외시킨다.
모든 마우스들은 연속 3주 동안 이틀마다 비히클 또는 시험 물질을 적절한 용량으로 복강내 투여받는다. 모든 동물들에게 통상의 실험 음식 및 물을 원하는 대로 제공한다.
혈액 샘플로부터 효소적 방법(무타로타제(mutarotase)-GOD)으로 혈청 화학 수준을 측정한다. 소변 알부민 배출 및 크레아티닌 청소율을 측정함으로써 생화학적으로, 그리고 추가로, 매손 트리크롬 및 과요오드산 쉬프 염색으로서 조직학적으로 신장 손상을 평가한다.
2) 편측 요관 장애- 신장 섬유증 모델. 모든 마우스들에게 비히클 또는 시험 물질로 수술 전 5일 동안 및 수술 후 7일 동안 복강내로 투여한다. 상기 억제제 및 비히클을 SSAO를 억제하기 위한 적절한 양으로 이틀마다 주사한다. 모든 동물들에게 통상의 실험 음식 및 물을 원하는 대로 제공한다.
6 내지 7주령의 수컷 마우스들(체중 20 내지 25g)을 이소플루레인(2-클로로-2-(디플루오로메톡시)-1,1,1-트리플루오로-에탄) 흡입으로 마취시키고 수술전 부프레노르핀 0.05 내지 0.1 mg/kg으로 피하로 주사한다. 상기 마우스들에 대해 편측 요관 장애(UUO) 또는 모의 수술을 수행한다. UUO 수술한 마우스들에서, 왼쪽 수뇨관을 두 개의 지점에서 4-0 실크 봉합사로 결찰시키고 요로 감염 역행을 예방하기 위해 결찰실 사이를 잘랐다. 상기 마우스들을 수술 후 7일째 안락사시킨다.
소변 알부민 배출 및 크레아티닌 청소율을 측정함으로써 생화학적으로, 그리고 추가로, 매손 트리크롬 및 과요오드산 쉬프 염색으로서 조직학적으로 신장 손상을 평가한다.
치료된 그룹과 비히클 그룹 사이의 유의한 차이를 확인하기 위해 모든 연구에서 일원 분산분석 및 던네트 시험을 사용한다. 차이는 *P<0.05에서 유의한 것으로 간주한다.
대조군과 비교하여 점수에서의 통계적으로 유의한 감소에 의해 입증되는, 신장 섬유증에서 감소를 볼 수 있다.
실시예 7. 당뇨성 신장병에 대한 항-섬유화 치료법
당뇨성 신장병은 신장 질환의 최종 단계의 공통적 원인이며, 섬유증, 특히 세포간 섬유증은 당뇨성 신장의 주요 병리학적 특징이다. 임상 연구는 VAP-1의 억제제가 당뇨병을 앓고 있는 환자에서 신장병을 감소시켜 신장 기능을 연장할 수 있는지 결정할 수 있다.
안지오텐신 전환효소(ACE) 억제제 또는 안지오텐신 수용체 길항체(ARA)를 복용하고 있는, 20 내지 75ml/분/1.73m2의 사구체여과율(GFR), 300mg/일 초과의 단백뇨, 혈압 140/90 이하인 제1형 또는 제2형 당뇨병을 앓고 있는 성인 환자가 본 연구에 등록된다. 환자들은 효과적 수준의 VAP-1 억제제 또는 플라세보를, 1일 1회 또는 이보다 덜 잦은 투여일 수 있는 적절한 용량 식이요법으로 1년 동안 투여받는다. 환자들은 플라세보 또는 VAP-1 억제제 그룹에 무작위로 배정된다. 본 연구 동안 환자들은 공복 혈당 및 요당 수준, 혈압 및 임상 화학과 같은 파라미터들에 대해 정규적으로 모니터된다. 당뇨병에서 상승될 수 있고 상기 질환의 진행과 연결될 수 있는 혈청 VAP-1 SSAO의 수준을 측정하기 위해 추가의 혈액 샘플을 취할 수 있다. 또한, 상기 혈청 샘플 중의 메틸아민의 수준을 평가할 수 있다. 상승된 메틸아민은 VAP-1 SSAO 활성의 억제에 대한 바이오마커이다. 환자들은 이들의 당뇨병 상태를 모니터하기 위해 집에서 이들의 혈압 및 혈당을 정기적으로 체크하고 얻은 값을 기록하도록 요청받는다. 이런 방식으로 적절한 양의 인슐린 투여를 통한 환자의 당뇨병의 양호한 관리가 유지될 수 있다.
ACE 억제제 및/또는 ARA로의 치료, 130/80보다 낮은 혈압 타겟에 의한 항고혈압 치료, 및 HbA1C에 대한 적절히 지정된 타겟에 의한 타이트한 혈당 관리를 포함할 수 있는 당뇨성 신장병에 대한 치료의 현재 표준으로 환자들을 유지한다.
신장 기능은 GFR에 의해 평가되고 본 연구의 일차 종료점은 본 연구 기간의 베이스라인으로부터 종료까지 신장 기능의 변화일 수 있다. 이차 종료점은 본 연구 기간에 걸쳐 소변 알부민 배출에서의 퍼센트 변화를 포함할 수 있다.
실시예 8. 섬유화 상태에 대한 진단적 마커로서의 VAP-1
본 실시예에서, 면역조직화학에 의해 간경변에서 간 VAP-1 발현이 섬유화 중격에서 매우 높은 수준으로 증가되는 것으로 나타났다(도 13 내지 15). 다색 공초점 현미경 검사법은 간 성상세포 및 간 근섬유아세포 상에서의 VAP-1 발현을 보여준다(도 16). 배양시킨 인간 간 성상세포(HSC)를 시험관내 HSC에 의한 sVAP-1의 발현 및 분비를 확인하는데 사용했다. 이들 결과는 섬유 발생에서의 VAP-1의 잠재적 역할을 시사한다.
매치시키고 등급화된 간 조직학(Kleiner classification)에 의해 무알코올성 지방간 질환(NAFLD)이 있는 138명의 환자들의 잘 정의된 코호트(cohort)에서 혈청 sVAP-1 수준을 측정했다. 간 조직학(지방증, 염증 및 섬유증), 간 손상의 물질대사 파라미터 및 혈청학적 마커에 관하여 sVAP-1 수준을 평가했다(표 3).
Figure pct00005
인슐린 저항성의 측정, AST=아스파르테이트 트랜스아미나제, ALT=알라닌 트랜스아미나제, ALP=알칼린 포스파타제, GGT=감마-글루타밀 트랜스퍼라제, CRP=C-반응성 단백질.
sVAP-1 수준은, 건강한 개인들(300 내지 500ng/ml)과 비교하여 NAFLD 코호트에서 유의하게 상승(평균 +/-SD; 945.9+/-457.6ng/ml)되었다. 가장 높은 수준은 유의한 간 섬유증(단계 F2 내지 4)을 갖는 이들에서 나타났으며 sVAP-1 수준과 섬유증 단계 사이에 분명한 선형 경향성이 있었다(도 17).
단변량 상관관계 분석으로 sVAP-1 수준 및 조직학적 섬유증 단계 사이의 유의한 상관관계를 확인했고(r=0.43, p=0.0000003)(표 4), 변수 제거 다중 로지스틱 회귀에서 섬유증 단계가 sVAP-1 수준에 기여하는 가장 유의한 독립적인 인자였다(표 5).
Figure pct00006
Figure pct00007
유의한 간 섬유증(단계 F2 내지 4)과 관련된 인자들의 단변량 및 다변량 분석 둘 다는 sVAP-1 수준이 간 효소 및 AST/ALT 비율과 같은 간 손상의 표준 생화학 마커보다 더 유의함을 시사한다(표 6 및 7).
Figure pct00008
Figure pct00009
상기 코호트에서, 만약 sVAP-1 수준이 유의한 간 섬유증(단계 F2 내지 4)의 존재를 예측하기 위한 단독 바이오마커로서 사용되었다면, 1000ng/ml 이상의 수준은 88.9%의 양성 예측 값을 가졌다. 유의한 섬유증(F2 내지4), 진행된 섬유증(F3 내지 4) 및 간경변(F4)을 예측하기 위한 수신기 작동 특성 곡선(AUROC)하 구역은 각각 0.71(95% Cl 0.62 내지 0.80), 0.68(95% Cl 0.58 내지 0.78) 및 0.75(95% Cl 0.58 내지 0.92)였다(도 18).
또한, 결과들은 간 섬유증을 예측하기 위한 sVAP-1의 민감성 및 특이성 프로파일(profile)을, 이것을 다른 임상 및 생화학 파라미터와 조합함으로써 향상시킬 가능성이 있음을 시사한다. 다변량 분석에서 간 섬유증과 독립적으로 관련되는 인자들(sVAP-1, 당뇨병 상태 및 AST/ALT 비율)에 대한 섬유증 점수(회귀 방정식으로부터 계산됨)는 유의한 섬유증(F2 내지 4), 진행된 섬유증(F3 내지 4) 및 간경변(F4)을 예측하기 위한 AUROC를 0.79(95% Cl 0.71 내지 0.87), 0.80(95% Cl 0.71 내지 0.88) 및 0.89(95% Cl 0.74 내지 1.02)로 가졌다(도 19).
상기 VAP-1 단백질은 SSAO(세미카르바지드-민감성 아민 옥시다제)라고 불리는 모노아민 옥시다제 효소 활성을 갖는다. SSAO 효소 활성이 VAP-1 단백질의 필수적인 부분이기 때문에 체액 내 sVAP-1의 수준이 체액 내(예를 들면, 혈청 또는 혈장) SSAO 활성의 양을 측정함으로써 또한 결정될 수 있다는 것이 이해된다. SSAO는, SSAO 기질, 예를 들면, 벤질아민 또는 메틸아민에 대해 작용하는 인간 혈청 및 혈장 중의 주요한 모노아민 옥시다제 활성이다. 따라서, SSAO 활성은 간 섬유증의 동등한 마커로서 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Biotie Therapies Corp. <110> The University of Birmingham <120> USE OF VAP-1 INHIBITORS FOR TREATING FIBROTIC CONDITIONS <130> 2091339KR <150> US 61/240,402 <151> 2009-09-08 <150> US 61/323,032 <151> 2010-04-12 <160> 48 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> S, N or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Y or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> A, G or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> M or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> H or S <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> V, A or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> I or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> W, G or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> F, Q, V or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> D or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> S, G or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> N, E, Y or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> E, K or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Y, D or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Y or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> K or R <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ser Val Xaa 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> A, G, K, P or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> W, F, G or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> F, G or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> G, S or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> G or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> T or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Y or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> E, F or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> F, G, S, V or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Y or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> F or I <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asn Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Ser Gly Ile His 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val Leu Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ile Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Ile Gly Val Gly Gly Gly Thr Tyr His Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Ala Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Gly Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Lys Asn Trp Gly Ile Asp Tyr 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Pro Gly Phe Gly Glu Val Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Phe Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Leu Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Arg Ser 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ile Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Asn Trp Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Pro Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Val Gly Gly Gly Thr Tyr His Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Pro Gly Phe Gly Glu Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> S or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> S or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> A, F, W or Y <400> 24 Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Leu Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> L or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> A, E or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> S, T or R <400> 25 Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> F, Y or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> N, G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> S or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Y, F, W or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> L or R <400> 26 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Asp Ala Ser Asn Leu Glu Arg 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Gln Phe Asn Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Val Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Met Glu Phe Gly Leu Asn Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Asp 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Phe Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Val 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Ala Gly Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 460 <210> 48 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Val Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Arg Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

Claims (31)

  1. 항-섬유화제로서의 VAP-1 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 모노클론 항-VAP-1 항체 및 SSAO 억제제로 구성된 그룹에서 선택되는 VAP-1 억제제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹에서 선택되는 1 내지 3개의 CDR 공통 서열, 및/또는 서열번호 24 내지 26으로 구성된 그룹에서 선택되는 1 내지 3개의 CDR 공통 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 완전 인간 항-VAP-1 항체인, VAP-1 억제제.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 4 내지 8로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 9 내지 13으로부터 선택된 제2 CDR 서열, 및 서열번호 14 내지 18로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및/또는 서열번호 27 내지 31로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 32 내지 36으로부터 선택된 제2 CDR 서열 및 서열번호 37 내지 41로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 갖는, VAP-1 억제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 19 내지 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 42 내지 46으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 각각의 경쇄 가변 영역을 갖는, VAP-1 억제제.
  6. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 47로 나타내는 중쇄 폴리펩티드 및 서열번호 48로 나타내는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 완전 인간 재조합 항체인, VAP-1 억제제.
  7. 제2항에 있어서, 상기 SSAO 억제제는 히드라진 유도체, 프로페닐아민 및 프로파길아민, 4-치환된-2-부티닐아민, 할로알릴아민, 피롤린 유도체, 프로파길디아민, 알릴아민, 디아민, 4,5,6,7-테트라하이드로이미다조[4,5-c]피리딘 유도체, 티오카바모일 유도체, 카르복사미드, 설폰아미드, 티아졸 및/또는 구아니딘 유도체, 옥심 유도체, 디히드라진, 아릴알킬아민, 옥사졸리디논, 할로알킬아민, 벤포티아민, 및 이미다조피리딘 유도체로 구성된 그룹에서 선택되는, VAP-1 억제제.
  8. 섬유화 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, VAP-1 억제제의 용도.
  9. 제8항에 있어서, 상기 VAP-1 억제제는 항-VAP-1 항체 및 SSAO 억제제로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 용도.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹에서 선택되는 1 내지 3개의 CDR 공통 서열, 및/또는 서열번호 24 내지 26으로 구성된 그룹에서 선택되는 1 내지 3개의 CDR 공통 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 완전 인간 항-VAP-1 항체인, 용도.
  11. 제9항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 4 내지 8로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 9 내지 13으로부터 선택된 제2 CDR 서열, 및 서열번호 14 내지 18로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및/또는 서열번호 27 내지 31로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 32 내지 36으로부터 선택된 제2 CDR 서열 및 서열번호 37 내지 41로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 갖는, 용도.
  12. 제9항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 19 내지 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 42 내지 46으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 각각의 경쇄 가변 영역을 갖는, 용도.
  13. 제9항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 47로 나타내는 중쇄 폴리펩티드 및 서열번호 48로 나타내는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 완전 인간 재조합 항체인, 용도.
  14. 제9항에 있어서, 상기 SSAO 억제제는 히드라진 유도체, 프로페닐아민 및 프로파길아민, 4-치환된-2-부티닐아민, 할로알릴아민, 피롤린 유도체, 프로파길디아민, 알릴아민, 디아민, 4,5,6,7-테트라하이드로이미다조[4,5-c]피리딘 유도체, 티오카바모일 유도체, 카르복사미드, 설폰아미드, 티아졸 및/또는 구아니딘 유도체, 옥심 유도체, 디히드라진, 아릴알킬아민, 옥사졸리디논, 할로알킬아민, 벤포티아민, 및 이미다조피리딘 유도체로 구성된 그룹에서 선택되는, 용도.
  15. 제9항에 있어서, 상기 섬유화 상태는 간 섬유증, 및 간 섬유증에 이르게 하는 염증 상태, 즉, 급성 및 만성 간경변, 답즙 질환 및 독성 간 손상, 폐 섬유증, 당뇨병성 신장병으로부터 초래된 것을 포함하는 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부경화증, 결합 조직 질환, 반흔, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 장기 이식, 혈관 협착, 재협착, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프선 섬유증, 방광 섬유증, 흉막 섬유증 및 기도벽이 근섬유아세포 및 콜라겐의 축적에 의해 섬유화되어, 모든 섬유화 조직들처럼 수축되는 질환인 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용도.
  16. 섬유화 상태의 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 인간 대상에서 섬유화 상태를 예방, 치료 또는 완화시키는 방법으로서, VAP-1 억제제의 유효량을 상기 환자에게 투여함을 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 VAP-1 억제제는 항-VAP-1 항체 및 SSAO 억제제로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 그룹에서 선택되는 1 내지 3개의 CDR 공통 서열, 및/또는 서열번호 24 내지 26으로 구성된 그룹에서 선택되는 1 내지 3개의 CDR 공통 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 완전 인간 항-VAP-1 항체인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 4 내지 8로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 9 내지 13으로부터 선택된 제2 CDR 서열, 및 서열번호 14 내지 18로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드, 및/또는 서열번호 27 내지 31로부터 선택된 제1 CDR 서열, 서열번호 32 내지 36으로부터 선택된 제2 CDR 서열 및 서열번호 37 내지 41로부터 선택된 제3 CDR 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 갖는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 19 내지 23으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 42 내지 46으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 각각의 경쇄 가변 영역을 갖는, 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 47로 나타내는 중쇄 폴리펩티드 및 서열번호 48로 나타내는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 완전 인간 재조합 항체인, 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 SSAO 억제제는 히드라진 유도체, 프로페닐아민 및 프로파길아민, 4-치환된-2-부티닐아민, 할로알릴아민, 피롤린 유도체, 프로파길디아민, 알릴아민, 디아민, 4,5,6,7-테트라하이드로이미다조[4,5-c]피리딘 유도체, 티오카바모일 유도체, 카르복사미드, 설폰아미드, 티아졸 및/또는 구아니딘 유도체, 옥심 유도체, 디히드라진, 아릴알킬아민, 옥사졸리디논, 할로알킬아민, 벤포티아민, 및 이미다조피리딘 유도체로 구성된 그룹에서 선택되는, 방법.
  23. 제16항에 있어서, 상기 섬유화 상태는 간 섬유증, 및 간 섬유증에 이르게 하는 염증 상태, 즉, 급성 및 만성 간경변, 답즙 질환 및 독성 간 손상, 폐 섬유증, 당뇨병성 신장병으로부터 초래된 것을 포함하는 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부경화증, 결합 조직 질환, 반흔, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 장기 이식, 혈관 협착, 재협착, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프선 섬유증, 방광 섬유증, 흉막 섬유증 및 기도벽이 근섬유아세포 및 콜라겐의 축적에 의해 섬유화되어, 모든 섬유화 조직들처럼 수축되는 질환인 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  24. 대상에서 섬유화 상태를 진단하는 방법으로서,
    a) 상기 대상으로부터의 체액 샘플을 제공하는 단계,
    b) 상기 샘플 중의 가용성 VAP-1(sVAP-1) 또는 SSAO 활성의 양을 분석하는 단계,
    c) 상기 sVAP-1 또는 SSAO 활성에 기반하여 섬유증을 진단하는 단계
    를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 sVAP-1 또는 SSAO 활성의 양을 참조 체액 중의 sVAP-1 또는 SSAO 활성의 양과 비교하는, 방법.
  26. 제24항에 있어서, sVAP-1의 양이 VAP-1 특이 항체를 사용하여 결정되는, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 체액은 혈청 또는 혈장인, 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 섬유화 상태는 간 섬유증, 및 간 섬유증에 이르게 하는 염증 상태, 즉, 급성 및 만성 간경변, 답즙 질환 및 독성 간 손상, 폐 섬유증, 당뇨병성 신장병으로부터 초래된 것을 포함하는 신장 섬유증, 골수섬유증, 췌장 섬유증, 피부경화증, 결합 조직 질환, 반흔, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 장기 이식, 혈관 협착, 재협착, 동맥 섬유증, 관절섬유증, 유방 섬유증, 근섬유증, 후복막 섬유증, 갑상선 섬유증, 림프선 섬유증, 방광 섬유증, 흉막 섬유증 및 기도벽이 근섬유아세포 및 콜라겐의 축적에 의해 섬유화되어, 모든 섬유화 조직들처럼 수축되는 질환인 COPD(만성 폐쇄성 폐질환)로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 진단은 섬유증의 정도를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  30. 제24항에 따르는 방법에 사용하기 위한 키트로서, 체액 중의 sVAP-1 또는 SSAO 활성의 양을 평가하기 위한 하나 이상의 제제를 포함하는 키트.
  31. 제30항에 있어서, 특이 항-VAP-1 항체를 포함하는, sVAP-1의 양을 평가하기 위한 키트.
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