ES2657943T3

ES2657943T3 - Inhibidores de VAP-1 para el uso en el tratamiento de afecciones fibróticas

Info

Publication number: ES2657943T3
Application number: ES10815041.8T
Authority: ES
Inventors: Christopher Weston; Lee Charles Claridge; David Adams; David Smith; Nina Westerlund; Marjo Pihlavisto; Thua ÖSTERMAN
Original assignee: Biotie Therapies Corp; University of Birmingham
Current assignee: Biotie Therapies Corp; University of Birmingham
Priority date: 2009-09-08
Filing date: 2010-09-07
Publication date: 2018-03-07
Anticipated expiration: 2030-09-07
Also published as: RU2667963C1; EP2475387B1; CN107661500A; KR20180026808A; CA2773218C; KR101837117B1; WO2011029996A1; IL218535A0; US20130195883A1; US10576148B2; SI2475387T1; UA112154C2; RU2580626C2; NZ598920A; NZ706740A; JP2013503915A; HRP20180131T1; CY1119867T1; PT2475387T; PL2475387T3

Abstract

Un inhibidor de VAP-1, que es un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano que comprende de una a tres secuencias consenso de CDR seleccionadas de un grupo que consiste en SEQ ID Nºs 1 a 3 y/o un polipéptido de la cadena ligera que comprende de una a tres secuencias consenso de CDR seleccionadas de un grupo que consiste en SEQ ID Nºs 24 a 26 para el uso en el tratamiento de una afección fibrótica.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Las cantidades y regímenes para la administración de los anticuerpos anti-VAP-1 los pueden determinar fácilmente las personas de experiencia habitual en la técnica clínica para el tratamiento de trastornos relacionados con la fibrosis. En general, la dosis del tratamiento con anticuerpo anti-VAP-1 variará dependiendo de consideraciones tales como: edad, sexo y salud general del paciente a tratar; tipo de tratamiento concurrente, si existe; frecuencia del tratamiento y naturaleza del efecto deseado; grado del daño tisular; duración de los síntomas; y otras variables a ajustar por parte del médico individual. Se puede administrar una dosis deseada en una o más aplicaciones para obtener los resultados deseados. Las composiciones farmacéuticas según las presentes realizaciones se pueden proporcionar en formas farmacéuticas unitarias.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en cualquier vehículo farmacológico adecuado para la administración. Se pueden administrar en cualquier forma que lleven a cabo un efecto profiláctico, paliativo, preventivo o curativo de las condiciones fibróticas en pacientes humanos o animales.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral y tópica incluyen disolventes, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilen glicol, polietilen glicol, aceite vegetal, aceite de pescado, y ésteres orgánicos inyectables. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones agua-alcohol, que incluyen solución salina y vehículos parenterales de medio tamponado que incluyen solución de cloruro sódico, solución de dextrosa de Ringer, dextrosa más solución de cloruro sódico, solución de Ringer que contiene lactosa, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de líquidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. Las composiciones acuosas según las realizaciones pueden comprender agentes tamponadores adecuados, tales como tampones de fosfato sódico y potásico, citrato, acetato, carbonato o glicina, dependiendo del intervalo de pH deseado. También es útil el uso de cloruro sódico como agente de ajuste de la tonicidad. Las composiciones pueden incluir otros excipientes, tales como agentes estabilizantes o conservantes. Los excipientes estabilizantes útiles incluyen tensioactivos (polisorbato 20 y 80, poloxámero 407), polímeros (polietilen glicoles, povidonas), carbohidratos (sacarosa, manitol, glucosa, lactosa), alcoholes (sorbitol, glicerol, propilen glicol, etilen glicol), proteínas adecuadas (albúmina), aminoácidos adecuados (glicina, ácido glutámico), ácidos grasos (etanolamina), antioxidantes (ácido ascórbico, cisteína, etc.), agentes quelantes (sales de EDTA, histidina, ácido aspártico) o iones metálicos (Ca, Ni, Mg, Mn). Entre los agentes conservantes útiles están alcohol bencílico, clorbutanol, cloruro de benzalconio y posiblemente parabenos.

La composición farmacéutica se puede proporcionar en forma concentrada o en forma de un polvo a reconstituir según la necesidad. En tales casos, se pueden usar las formulaciones de polvo para disolución para inyección/infusión con los excipientes mencionados anteriormente. En caso de liofilización, se prefieren ciertos crioprotectores, que incluyen polímeros (povidonas, polietilen glicol, dextrano), carbohidratos (sacarosa, glucosa, lactosa), aminoácidos (glicina, arginina, ácido glutámico) y albúmina. Si se añade una solución para reconstitución al envase, puede consistir, p.ej., en agua pura para inyección o solución de cloruro sódico, o soluciones de dextrosa o glucosa.

Los anticuerpos anti-VAP-1 terapéuticamente útiles se pueden conjugar, químicamente o mediante ingeniería genética, con otros agentes, que proporcionan el transporte de los anticuerpos a un sitio deseado de acción. De manera alternativa, se pueden conjugar otros compuestos, químicamente o mediante ingeniería genética, con los anticuerpos, para aumentar o proporcionar propiedades adicionales a los anticuerpos, especialmente propiedades que aumentan la capacidad de los anticuerpos de favorecer la mitigación de los efectos perjudiciales mediada por la unión a VAP-1.

Los anticuerpos anti-VAP-1 se pueden marcar, químicamente o mediante ingeniería genética, para proporcionar anticuerpos detectables. Tales anticuerpos marcados serán herramientas útiles para la formación de imágenes de sitios fibróticos en seres humanos, especialmente para la formación de imágenes inmunoescintigráfica in vivo de los sitios fibróticos. Para fines de formación de imágenes, puede ser preferible el uso de fragmentos de anticuerpo a la aproximación de anticuerpos completos para la terapia anti-fibrótica, y los fragmentos obtenidos de anticuerpos completamente humanos deberían ser aún más seguros que sus equivalentes quiméricos o de ratón.

Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren al diagnóstico de afecciones fibróticas. Con respecto a la presente descripción, se ha descubierto que los niveles elevados de VAP-1 soluble (sVAP-1) en los fluidos corporales (tales como suero o plasma) y, por lo tanto, una actividad de SSAO elevada, se correlacionan con el grado de fibrosis. La presente descripción proporciona por tanto medios y métodos para diagnosticar afecciones fibróticas tales como fibrosis hepática y las afecciones inflamatorias que predisponen a ella, es decir, hepatitis aguda y crónica, enfermedad biliar y lesión hepática tóxica, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, que incluye la que resulta de nefropatía diabética, mielofibrosis, fibrosis pancreática, esclerodermia, enfermedades del tejido conectivo, cicatrización, fibrosis de la piel, fibrosis cardiaca, trasplante de órganos, estenosis vascular, reestenosis, fibrosis arterial, artrofibrosis, fibrosis mamaria, fibrosis muscular, fibrosis retroperitoneal, fibrosis de tiroides, fibrosis de nódulos linfáticos, fibrosis de vejiga, fibrosis pleural y EPOC, una enfermedad en la que las paredes de las vías respiratorias son fibróticas, con la acumulación de miofibroblastos y colágeno, y, como todos los tejidos fibróticos, están contraídas.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El diagnóstico de afecciones fibróticas basándose en los niveles elevados de sVAP-1 y/o actividad de SSAO en los fluidos corporales se puede combinar con el análisis de paneles existentes de biomarcadores predictivos para las afecciones fibróticas. Esto puede mejorar la capacidad de diagnóstico de los biomarcadores existentes. En otras palabras, se pueden usar los niveles de sVAP-1/actividad de SSAO solos o en combinación con otros marcadores clínicos y bioquímicos como nuevo ensayo no invasivo para predecir la presencia de fibrosis.

El nivel de sVAP-1 en una muestra de fluido corporal, tal como suero, se puede determinar mediante el siguiente método: El ensayo inmunofluorimétrico de una etapa de tiempo resuelto (TR-IFMA) (DELFIA) para la cuantificación de VAP-1 soluble utiliza el anticuerpo de ratón anti-VAP-1 humana TK8-14 conjugado a biotina (Biotie Therapies Corp.) como agente de captura en una placa de microtitulación revestida de estreptavidina. La detección de VAP-1 soluble unido se realiza mediante el uso del anticuerpo de ratón anti-VAP-1 humana TK8-18 conjugado con europio (Biotie Therapies Corp.) como marcador. El marcador se detecta midiendo la fluorescencia de tiempo resuelto (contador Victor3 Multilabel) a 615 nm. Las cuentas de fluorescencia se correlacionan directamente con la cantidad de VAP-1 soluble presente en la muestra. Los datos de la muestra se analizan después en comparación con la curva patrón de una referencia.

En la presente descripción, la fibrosis se puede diagnosticar basándose en la actividad de SSAO en un fluido corporal obtenido de un sujeto que necesita tal diagnóstico y/o que se sospecha que padece fibrosis. Un método adecuado para este fin lo ha descrito Li et al. en J. Chromatogr. B, 810 (2004) 277-282. Otros medios y métodos para determinar la actividad de SSAO se conocen en la técnica.

Además, la presente descripción proporciona un kit para el uso en el diagnóstico de la fibrosis. En ciertas formas, el kit comprende uno o más reactivos para determinar la cantidad de sVAP-1, tal como un anticuerpo anti-VAP-1 específico, p.ej. uno de los anticuerpos anti-VAP-1 mencionados anteriormente. En otras formas, el kit comprende uno o más reactivos para determinar la actividad de SSAO en un fluido corporal, tal como suero o plasma. Por ejemplo, el kit puede comprender un sustrato para SSAO de VAP-1, tal como bencilamina, metilamina, aminocetona u otras monoaminas alifáticas o aromáticas, junto con un tampón de ensayo adecuado de la actividad enzimática de SSAO, y un grupo de reactivos y un método para detectar la actividad de SSAO. La actividad de SSAO se puede detectar mediante el uso de un ensayo acoplado en el que se mide la generación de peróxido de hidrógeno a partir de la acción de la actividad de SSAO sobre sustratos de monoamina, o se puede medir directamente mediante la monitorización de la conversión de una amina hidrosoluble en un aldehído soluble en un disolvente orgánico mediante el uso de un sustrato de amina marcado con 14C, tal como bencilamina.

Ejemplo 1. Efectos de los inhibidores de VAP-1 en un modelo en ratón de fibrosis hepática

El objetivo del estudio fue determinar el efecto de los inhibidores de VAP-1 sobre la lesión hepática fibrótica en ratón.

Todos los ratones se mantuvieron y albergaron en condiciones convencionales en la unidad del servicio biomédico de la Universidad de Birmingham, según las normas del Ministerio del Interior. Se albergaron cuatro ratones por jaula y se aclimataron a la situación durante una semana antes de los experimentos. Se usaron ratones C57BL/6 y VAP-1/-hembra (ratones con inactivación del gen AOC3 que carecían de VAP-1) con una edad de 8-10 semanas en el estudio. Los ratones C57BL/6 se obtuvieron de una colonia de reserva de la unidad del servicio biomédico de la Universidad de Birmingham, mientras los ratones VAP-1-/-(inactivación del gen AOC3) se obtuvieron del criador bajo contrato Taconic, Dinamarca.

Se estableció un modelo en ratón de fibrosis hepática crónica mediante la administración i.p. de tetracloruro de carbono (CCl4; Aldrich Chemical) a una dosis de 1 ml/kg disuelto en aceite mineral bisemanalmente durante 8 semanas, mientras el grupo de control recibió solamente aceite mineral. Los ratones tratados con un anticuerpo anti-VAP-1 de ratón BTT-1029 recibieron semanalmente inyecciones i.v. dos semanas antes y durante la administración de CCl4. Los animales se sacrificaron 96 h tras la última dosis de CCl4. Se extrajeron muestras de sangre mediante punción cardiaca con anestesia de isoflurano, tras lo cual los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical. Los hígados se disecaron y cortaron en 4 fragmentos para diferentes procesamientos.

Se llevó a cabo un ANOVA estadístico mediante el uso de SPSS para Windows, versión 11.0. Se usó un ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc de mínima diferencia significativa de Fisher para el análisis de la significación en muestras con grupos de más de dos variables.

Las muestras de hígado se fijaron en un 4% de paraformaldehído, se incrustaron en parafina y se cortaron en cortes de 4 µm. Los cortes para el análisis histopatológico se tiñeron con rojo Sirius o H&E según los procedimientos habituales. Para la tinción de inmunofluorescencia, los hígados de ratón fijados se crioprotegieron mediante inmersión en un 30% de sacarosa, se congelaron rápidamente y se cortaron en un criostato a 7 µm. Brevemente, los cortes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato que contenía un 0,1% de Triton X-100 (PBST) durante 10 minutos, y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con un 10% de suero de cabra en un 0,1% de PBST. Tras la incubación con los anticuerpos primarios hacia elastina, colágeno IV y laminina (Abcam) diluidos en suero-PBST, los portaobjetos se lavaron tres veces en PBST y se incubaron con anticuerpo secundario (Invitrogen) durante 1 hora a temperatura ambiente.

imagen6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

fragmentos residuales del glomérulo (datos no mostrados). De manera interesante, los ratones con inactivación génica de VAP-1 y los ratones tratados con BTT-1029 estuvieron completamente protegidos contra las lesiones glomerulares (Figura 6).

Se estudió la acumulación de colágeno alrededor de los glomérulos, como indicación de fibrosis, mediante tinción con rojo Sirius. La administración de CCl4 a ratones C57BL/6 indujo un incremento de casi el doble en la acumulación de colágeno alrededor del ovillo glomerular. De manera interesante, los ratones que carecieron de VAP-1 o los ratones a los que se administró inhibidor de VAP-1 mostraron una disminución significativa de los depósitos de colágeno similar al control (Figura 7). Los resultados demuestran claramente el papel protector de VAP1 en la nefropatía inducida con CCl4.

Ejemplo 3. Efectos de los inhibidores de VAP-1 en un modelo en ratón de EPOC

Se empleó el modelo de EPOC en ratón inducido con humo de tabaco para estudiar el efecto de los inhibidores de VAP-1 sobre el tratamiento de EPOC.

Se expuso a ratones C57BL/6J a humo de tabaco (TS) una vez al día durante 11 días consecutivos, lo que dio como resultado inflamación pulmonar 24 horas tras la exposición final a TS. Después de 11 días la respuesta consistió en incrementos significativos de macrófagos, células epiteliales, eosinófilos, neutrófilos y linfocitos.

Los ratones se dividieron de manera aleatoria en grupos de estudio (n=10) y se trataron con un vehículo (5 ml/kg de PBS, pH 7,4 + 0,1% de Polisorbato 80) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-VAP-1 (3 mg/kg o 9 mg/kg de BTT1029 en el vehículo) de manera intravenosa en los Días -1, 3, 6, y 9, 4 h tras la exposición a TS. Otro grupo (n=10) recibió el vehículo de manera intravenosa y se expuso a aire durante un periodo de tiempo equivalente. Dos grupos adicionales de ratones (n=10) recibieron otro vehículo (0,5% de carboximetilcelulosa, sal sódica (CMC) en agua estéril) o un compuesto de referencia (5 mg/kg de Roflumilast en 0,5% de CMC) de manera oral una vez al día durante 11 días consecutivos, 1 h antes de cada exposición a TS. Un grupo final (n=10) recibió el vehículo oral (0,5% de CMC) y se expuso a aire durante un periodo de tiempo equivalente.

Todos los resultados se presentaron como datos individuales para cada animal, y se calculó el valor medio para cada grupo. Cuando las pruebas de normalidad fueron positivas, los datos se sometieron inicialmente a un análisis unidireccional de prueba de la varianza (ANOVA), seguido de una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples para analizar la significación entre grupos de tratamiento. Un valor "p" de ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Todos los datos se sometieron también al ensayo de Bartlet para varianzas iguales, y para la mayoría de estudios las varianzas en general fueron iguales, sin embargo, como ocurrió en este estudio, ocasionalmente ciertos grupos de tratamiento proporcionarían un resultado positivo. Por lo tanto también se usaron análisis no paramétricos. Como los datos se distribuyeron normalmente, se citaron los análisis paramétricos (ANOVA).

Las inhibiciones en porcentaje se calcularon automáticamente en las hojas de cálculo de Excel para los datos de las células mediante el uso de la siguiente fórmula:

Resultado del grupo de tratamiento -resultado del grupo simulado

% Inhibición = 1 -x100

Resultado del grupo de vehículo TS -resultado del grupo simulado

BTT-1029, cuando se administró de manera intravenosa a 9 y 3 mg/kg 4 horas tras la exposición a TS en los días -1, 3, 6 y 9 del estudio, redujo significativamente los incrementos de células inducidos por TS en BAL (38% y 33% de inhibición respectivamente, p<0,001 para ambos) (Figura 8). Esto consistió en reducciones notables de macrófagos, (29% y 22% de inhibición, p<0,01 y p<0,05, respectivamente), neutrófilos (66 y 59% de inhibición, p<0,001 para ambos), linfocitos (69% y 54% de inhibición, ambos p<0,001) y eosinófilos (93% y 65% de inhibición, p<0,001 y p<0,01, respectivamente).

El compuesto de referencia, Roflumilast, cuando se administró una vez al día de manera oral, 1 h antes de la exposición a TS, también redujo significativamente el número total de células (41%, p<0,001) (Figura 9). Esta inhibición estuvo compuesta de reducciones de neutrófilos (63% p<0,001), células epiteliales (51% p<0,01) y linfocitos (65%, p<0,001). En este estudio, Roflumilast no redujo significativamente el número de macrófagos y eosinófilos hallados en el BAL.

Ejemplo de Referencia 4. Efectos de los inhibidores de VAP-1 sobre la fibrosis de la neoíntima y la media en la pared vascular

El engrosamiento de la neoíntima y la media es una etapa temprana y esencial del desarrollo de lesiones ateroescleróticas, y un componente esencial de la reestenosis. Va acompañada de cambios fibróticos en la neoíntima y la media de la pared vascular. Este estudio evaluó el papel del bloqueo de SSAO en la enfermedad fibrótica evaluando el efecto de la administración sistémica (mediante inyección ip diaria) de un inhibidor de SSAO de molécula pequeña (mofegilina, BTT-2089) sobre el engrosamiento de la neoíntima inducido por manguito

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(estenosis inducida por manguito) en la arteria femoral de ratones ApoE3 Leiden que recibieron una dieta de tipo occidental moderada.

Métodos: Se alimentó a 40 ratones macho ApoE3*Leiden (edad 12 semanas) con una dieta moderadamente hipercolesterolémica durante 3 semanas antes de la colocación quirúrgica del manguito. El tratamiento fue inyecciones ip diarias con 1) vehículo; 2) dexametasona en el agua de bebida a 9 mg/l; 3) inyecciones ip diarias de BTT-2089 a 10 mg/kg; 4) BTT-2089 a 30 mg/kg, todos se iniciaron un día antes de la cirugía y continuaron durante el periodo experimental. En el día 0, se llevó a cabo la cirugía, es decir, se colocó un manguito sin constricción (2-3 mm de longitud) alrededor de ambas arterias femorales de los ratones. Se sacrificaron 10 ratones de cada grupo tras 2 semanas para el análisis histomorfométrico para cuantificar la inhibición de las lesiones ateroescleróticas aceleradas y la formación de la neoíntima. Se observó una reducción significativa de la formación de la media y la neoíntima en el grupo de control positivo tratado con dexametasona, y ambos grupos tratados con BTT-2089 en comparación con el grupo de control tratado con NaCl al 0,9% (Figura 10 y 11). Esto se reflejó en el tamaño incrementado de la luz en los ejemplos de segmentos de vasos teñidos con HPS en los grupos tratados con inhibidor de SSAO en comparación con un grupo de control (Figura 12).

Se llevó a cabo un segundo estudio, en el mismo modelo, con otro inhibidor de SSAO de una clase química diferente de BTT-2089. Este inhibidor basado en hidrazina (BTT-2079) se dosificó a un nivel de 10 mg/kg mediante inyección

i.p. diaria y se comparó con BTT-2089 a 30 mg/kg. En todos los demás aspectos, el estudio se llevó a cabo de la misma manera excepto porque se omitió el grupo de control de dexametasona. La inhibición de SSAO con mofegilina (BTT-2089) a 30 mg/kg i.p. diariamente tuvo de nuevo un efecto beneficioso, y mostró una reducción significativa de la formación de neoíntima y del porcentaje de estenosis de la luz tras la inhibición de SSAO. El grupo tratado con el inhibidor de SSAO BTT-2079 a 10 mg/kg i.p. diariamente también dio como resultado una reducción significativa en la formación de la neoíntima. No se observaron cambios significativos entre todos los grupos en el diámetro de la pared de los vasos, el área de la media y la luz. Las proporciones intima-media de BTT-2079 a 10 mg/kg y BTT-2089 a 30 mg/kg fueron significativamente menores en comparación con el grupo de control, pero el porcentaje de estenosis de la luz solamente fue significativamente menor en el grupo de BTT-2089 a 30 mg/kg en comparación con el grupo de control. La integridad vascular no se vio afectada.

Estos estudios demuestran que la dosificación sistémica con inhibidores de SSAO dio como resultado menos engrosamiento de la neoíntima (fibrosis de la neoíntima) en el modelo en ratones ApoE3 Leiden con manguito en comparación con un grupo tratado de control.

Ejemplo 5. Efectos de los inhibidores de VAP-1 en un modelo en ratón de fibrosis pulmonar

La fibrosis pulmonar inducida con bleomicina es un modelo en ratón establecido y reproducible para el estudio de la fibrosis pulmonar.

Se trató a ratones macho C57BL/6J de una edad de 8 semanas de manera sistémica con bleomicina (100 mg/kg) durante 7 días mediante minibombas osmóticas Alzet para generar un daño pulmonar. La toxicidad no pulmonar se observa durante los días 7-21 tras la implantación de la bomba. A los 21 días, hay un 12-15% de fibrosis en los pulmones, tal como se determina de manera histopatológica. Esto va seguido de un daño pulmonar clínico que se puede observar por una frecuencia respiratoria incrementada, y una pérdida drástica de peso corporal, y finalmente conduce a la muerte a los 42 días (si no se sacrifican antes).

Los ratones se dividen de manera aleatoria en los grupos de estudio, y se tratan un con vehículo, inhibidor de VAP-1

o compuesto de referencia mediante inyección i.v. cada tres días desde el Día 0 hasta el Día 28. La mitad de los ratones de cada grupo de estudio se sacrifica en el Día 21, mientras la otra mitad se sacrifica en el Día 28.

En la autopsia, se fijan los pulmones (10% de formalina tamponada neutra) y se someten a procesamiento histopatológico para clasificar las lesiones fibróticas. Los cortes de tejido se tiñen con H&E y tinción tricrómica de Masson para identificar la fibrosis. Se cuantifica la proporción de área pulmonar fibrótica respecto del área pulmonar total con un análisis de imágenes asistido por ordenador para cada ratón.

Se usa un ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc adecuada para el análisis de la significación en muestras con grupos de más de dos variables.

Se puede demostrar una reducción de la fibrosis pulmonar, tal como se demuestra mediante las reducciones estadísticamente significativas de la puntuación en comparación con los controles.

Ejemplo 6. Efectos renoprotectores de los inhibidores de VAP-1 en un modelo en ratón de nefropatía diabética

La diabetes puede provocar nefropatía diabética (DN) asociada a fibrosis renal progresiva, lo que finalmente reduce el funcionamiento de la masa renal. Para estudiar el efecto de los anticuerpos anti-VAP-1 y los inhibidores de SSAO de referencia sobre la fibrosis renal, se empleó un modelo de ratón diabético Db/db bien establecido para la nefropatía diabética.

Todos los aspectos de estos experimentos (albergue, experimentación y eliminación de los animales) se llevaron a cabo de acuerdo en general con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).

El artículo de ensayo de referencia, el inhibidor de SSAO BTT-2079, se evaluó con respecto a un posible efecto

5 renoprotector en un modelo en ratón de nefropatía diabética. Se administró la sustancia de ensayo y el vehículo de manera intraperitoneal (IP) una vez al día durante 42 días consecutivos a ratones db/db (BKS Cg-Lepr db/Lepr db) de una edad de 15 semanas cuando la diabetes se estableció completamente. Los ratones Db/m sirvieron como controles normales flacos. Los ratones db/db mostraron una creatinina plasmática elevada, lo que indicó una función renal alterada, así como hiperglucemia y dislipidemia (LDL, colesterol total y triglicéridos) en comparación con los

10 ratones db/m. Los ratones diabéticos estuvieron asociados a obesidad, poliuria, albuminuria y excreción urinaria fraccionada de Na+ (FENa) incrementada, lo que indica una reabsorción tubular de Na+ alterada. El aclaramiento de creatinina endógena (CCr), una estimación de la tasa de filtración glomerular, tendió a ser inferior en los ratones diabéticos frente a los ratones db/m.

Los ratones db/db macho con diabetes mellitus no insulinodependiente se asignaron a los grupos de tratamiento, 15 como se resume a continuación.

Tabla 1. Resumen del diseño experimental

Grupo: Animales Artículo de Ensayo Dosis (mg/kg) Número de Animales (machos)

1: db/m Vehículo 0 8

2: db/db Vehículo 0 8

3: db/db BTT-2079 5 8

4: db/db BTT-2079 15 8

db/m: heterocigotos flacos no diabéticos db/db: ratones BKS Cg-Lepr db/Lepr db; diabetes mellitus no insulinodependiente. Toda la administración del vehículo y del artículo de ensayo fue mediante inyección intraperitoneal.

Al final de la fase en vida se llevaron a cabo las necropsias, que incluyeron la recogida y conservación de los tejidos. El riñón derecho de los 32 animales se fijó en un 10% de formalina tamponada neutra. Los cortes longitudinales se

20 recortaron y se procesaron en bloques de parafina, se cortaron a 3 micras y se tiñeron con ácido peryódico-Schiff (PAS) para su evaluación mediante microscopía óptica. La expansión de la matriz mesangial se puntuó en 50 glomérulos por riñón según el esquema de puntuación semicuantitativo resumido en el protocolo siguiente.

Se puntuaron cincuenta glomérulos de cada riñón con respecto a la expansión de la matriz mesangial según el sistema siguiente.

Mínimo: grado 1, 0-25% de volumen glomerular ocupado por la matriz

Leve: grado 2, 25-50% de volumen glomerular ocupado por la matriz

Moderado: grado 3, 50-75% de volumen glomerular ocupado por la matriz

Grave: grado 4, 75-100% de volumen glomerular ocupado por la matriz

25 Se obtuvo una puntuación media de expansión de la matriz mesangial para cada grupo sumando las puntuaciones de la matriz mesangial para todos los animales de cada grupo y dividiendo la suma por el número total de animales del grupo. Las puntuaciones medias de expansión de la matriz mesangial por grupo se presentan en la siguiente tabla.

30 Tabla 2. Puntuaciones medias de expansión de la matriz mesangial por grupo

Grupo: Tratamiento Puntuaciones Medias de Expansión de la Matriz Mesangial por Grupo

1: Vehículo 54,6

2: Vehículo 96,5

5: BTT-2079, 5 mg/kg 82,4

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 7. Terapia anti-fibrótica para la nefropatía diabética

La nefropatía diabética es una causa habitual de nefropatía terminal y fibrosis, en particular la fibrosis intersticial es una característica patológica clave del riñón diabético. Un estudio clínico puede determinar si los inhibidores de VAP1 pueden reducir la nefropatía en pacientes con diabetes para prolongar la función del riñón.

Se incorporaron a un estudio pacientes adultos con diabetes tipo 1 o 2 con una tasa de filtración glomerular (GFR) de 20-75 ml/min/1,73 m2, más de 300 mg/día de proteinuria, y una tensión arterial menor o igual a 140/90 con un inhibidor de la enzima conversora de angiotensina (ACE) o un antagonista de receptores de angiotensina (ARA). Los pacientes reciben un inhibidor de VAP-1 a un nivel eficaz o un placebo durante 1 año con un régimen de dosificación adecuado que puede ser una vez al día, o con menos frecuencia. Los pacientes se asignan de manera aleatoria al grupo de placebo o de inhibidor de VAP-1. Durante el estudio, los pacientes se monitorizan con regularidad con respecto a parámetros tales como los niveles de glucosa en ayunas en sangre y orina, la tensión arterial y la bioquímica clínica. Se pueden extraer muestras de sangre adicionales para medir los niveles de SSAO de VAP-1 en suero, que pueden estar elevados en la diabetes y asociados a la progresión de la enfermedad. Además, se pueden determinar los niveles de metilamina en las muestras de suero. La metilamina elevada es un biomarcador de la inhibición de la actividad de SSAO de VAP-1. Se pide a los pacientes comprobar con regularidad su tensión arterial y la glucemia en sus hogares, y registrar los valores obtenidos para monitorizar su estado diabético. De esta manera, por medio de la administración de insulina en cantidades adecuadas, se puede mantener un buen control de la diabetes de los pacientes.

Los pacientes se mantienen con el tratamiento de referencia actual para la nefropatía diabética, que puede incluir el tratamiento con un inhibidor de ACE y/o ARA, terapia antihipertensiva con una tensión arterial objetivo menor e 130/80, y un control glucémico estricto con un objetivo ajustado de manera adecuada para HbA1C.

La función renal se estudia mediante la GFR, y el criterio de valoración primario del estudio puede ser el cambio de la función renal desde el valor inicial hasta el final del periodo de estudio. Los criterios de valoración secundarios pueden incluir el porcentaje de cambio en la excreción de albúmina urinaria a lo largo del periodo de estudio.

Ejemplo de Referencia 8. VAP-1 como marcador de diagnóstico para las afecciones fibróticas

En la presente memoria se demostró mediante inmunohistoquímica que la expresión de VAP-1 hepática se incrementa en la cirrosis con niveles muy elevados en los tabiques fibróticos (Figs. 13-15). La microscopía confocal multicolor reveló la expresión de VAP-1 en las células estrelladas hepáticas y los miofibroblastos hepáticos (Fig. 16). Las células estrelladas hepáticas (HSCs) humanas cultivadas se usaron para confirmar la expresión y secreción de sVAP-1 por las HSCs in vitro. Estos resultados sugirieron un papel potencial de VAP-1 en la fibrogénesis.

Los niveles de sVAP-1 en suero se midieron en una cohorte bien definida de 138 pacientes con enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD) con una histología hepática coincidente y clasificada (clasificación de Kleiner). Los niveles de sVAP-1 se estudiaron con respecto a la histología hepática (esteatosis, inflamación y fibrosis), los parámetros metabólicos y los marcadores serológicos de lesión hepática (Tabla 3).

Tabla 3. Resumen de la demografía y los parámetros medidos en 138 pacientes con NAFLD clasificada y estadificada histológicamente

VARIABLE: N=138

Edad (años): 49,4 +/-12,2

Sexo (M/F): 87(63%) / 51(37%)

Circunferencia de la cintura (cm): 111,4 +/-11,5

IMC (kg/m2) Normal/Sobrepeso/Obeso: 35,0 +/ -5,4 4(3%)/11(8%)/123(89%)

Diabetes: 61 (44%)

HOMA-IR: 8,6 +/-7,5

Hipertensión: 65 (47%)

Colesterol Total (mmol/l): 5,4 +/-1,4

Colesterol HDL (mmol/l): 1,2 +/-0,3

Col Total/Col HDL: 4,7 +/-1,6

Triglicéridos (mmol/l): 2,8 +/-2,4

AST (UI/l): 58,3 +/-37,9

imagen8

imagen9

Claims

imagen1