KR20120077156A - Dna aptamer binding to sulfadimethoxine with specificity - Google Patents
Dna aptamer binding to sulfadimethoxine with specificity Download PDFInfo
- Publication number
- KR20120077156A KR20120077156A KR1020100139016A KR20100139016A KR20120077156A KR 20120077156 A KR20120077156 A KR 20120077156A KR 1020100139016 A KR1020100139016 A KR 1020100139016A KR 20100139016 A KR20100139016 A KR 20100139016A KR 20120077156 A KR20120077156 A KR 20120077156A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sulfadimethoxine
- seq
- ssdna
- dna aptamer
- dna
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/205—Aptamer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
- C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
- C12Q2541/101—Selex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 항생제 검출 앱타머(aptamer)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 설파디메톡신(sulfadimethoxine)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
The present invention relates to antibiotic detection aptamers, and more particularly to DNA aptamers that specifically bind to sulfadimethoxine.
항생제는 미생물을 죽이거나 억제하기 위해 널리 사용되어왔다. 그러나 항생제의 남용은 사람에게서 다양한 종류의 부작용을 일으키는 문제점을 낳았고, 항생제에 내성을 가진 슈퍼박테리아가 출연하게 되었다. 따라서, 적합한 양의 항생제의 바른 용법이 대단히 중요시되며, 시장에서 배포 또는 판매전에 농약잔류허용기준(Maximum Residue Limits; MRL)을 초과하는 항생제의 잔류를 포함하는 식품인지 아닌지 확인하여야한다. 식품에서 항생제의 잔류의 초과량이 심각한 문제를 발생시키기 때문에, 보다 믿을만하고, 정확한, 쉬운 탐지 시스템이 요구된다.
Antibiotics have been widely used to kill or inhibit microorganisms. However, the abuse of antibiotics has caused a variety of side effects in humans, leading to the emergence of antibiotic-resistant superbacteria. Therefore, the proper use of the appropriate amount of antibiotics is of great importance and it should be checked whether the food contains residues of antibiotics exceeding the Maximum Residue Limits (MRL) before distribution or sale on the market. Since the excess of antibiotic residue in food creates serious problems, a more reliable, accurate and easy detection system is required.
설파디메톡신(sulfadimethoxine)은 백색의 결정성 분말형태인 설폰아마이드(sulfonamide)계 항생물질로써, 화이자애니멀핼스 사(pfizer animal health)에 의해 생산되었고 경구현탁액, 정재, 볼루스(bolus)등 다양한 형태로 이용가능하며, 기도감염(respiratory), 요로감염증(urinary tract), 장염(enteric) 및 연조직감염(soft tissue infection)등 다양한 감염치료에 이용되고 있다.
Sulfadimethoxine is a white crystalline powder of sulfonamide-based antibiotic, produced by Pfizer Animal Health, and used in various forms such as oral suspension, tablets, and bolus. It is used for the treatment of various infections such as respiratory, urinary tract, enteric and soft tissue infection.
앱타머(aptamer)는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA이다. 앱타머는 타겟에 대한 친화도가 높고 열 안정성이 우수하며 시험관내(in vitro)에서 합성이 가능하기 때문에 비용면에서도 기존의 센서 분야에서 이용되는 감지물질보다도 우위에 있다. 또한, 타겟물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자, 환경호르몬 또는 항생제와 같은 작은 유기화학 물질, 그리고 박테리아 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머가 합성될 수 있다. 이렇게 타겟물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 및 바이오센스 등의 분야에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다.
Aptamers are single-stranded DNA (ssDNA) or RNA that have high specificity and affinity for specific targets. Aptamers are superior in cost to detection materials used in the field of sensors because of their high affinity for their targets, their excellent thermal stability and their ability to be synthesized in vitro . In addition, there is no restriction in the target material, aptamers for various targets such as proteins, biomolecules such as amino acids, small organic chemicals such as environmental hormones or antibiotics, and bacteria can be synthesized. Due to the properties of aptamers that specifically bind to target materials, a lot of research has recently been conducted to use aptamers in new drug development, drug delivery systems, and biosense.
기존 바이오센스 분야에서 이용되는 다양한 감지물질 중 민감도 면에서 우위에 있는 것이 항체를 이용한 타겟물질의 검출이다. 이는 검출하고자하는 타겟물질(항원)을 동물의 몸에 주입하여 생체의 면역시스템을 통해 만들어지는 항체를 확보한 후 정제 과정을 거치기 때문에 시간이 많이 들고 고비용이라는 점이 첫 번째 문제점이라 할 수 있다. 또한, 타겟물질에 있어 제약이 거의 없는 앱타머에 비해 항원으로 사용할 수 있는 타겟물질이 제한적이어서 독성물질과 같은 저분자 화합물질들에 대한 항체의 제작에 어려움이 있다. 일반적으로 항체는 그 크기가 150 K Da 이상인 매우 큰 단백질이기 때문에 전기화학 기반 등의 바이오센서로 응용 시에 신호 검출 부분에 있어 제약이 있고, 열 안전성이 DNA나 다른 화학물질에 비해 현저히 떨어지는 문제가 있다. 그러므로 기존의 혈중 바이오마커의 진단에 있어 항체를 이용한 기술은 비용과 시간 면에서 효율적이지 않고, 적용범위가 다양하지 않으며 바이오센서로 응용하는 데에 있어 제한적인 문제점들이 있다. 이러한 문제점들을 개선하기 위한 새로운 감지물질로서 다양한 타겟물질에 대해 특이적으로 높은 친화도 및 안전성을 보이며, 항체에 비해 화학적 합성 및 변경이 쉬운 앱타머를 이용하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 또한, 1990년 Gold's 그룹 및 Ellington's 그룹에 의해 the Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment(SELEX)이 개발된 이후로, 단백질과 같은 주로 거대분자가 주된 실험 표적이었으나, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 모세관 전기이동(capillary electrophoresis) 및 자성비드(magnetic beads)를 이용한 진화된 SELEX 기술의 발달로 인해 크기가 작아서 항체를 만들기 어려운 호르몬 또는 유기분자와 같은 작은 분자를 포함하는 표적 분자의 다양화를 가능하게 하였다. 따라서, 작은 분자를 위한 앱타머를 선별하여 다양한 분야에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다.
Among the various sensing materials used in the existing biosense field, the superiority in sensitivity is the detection of the target material using the antibody. The first problem is that the injection of the target substance (antigen) to be detected into the body of the animal to secure the antibody made through the immune system of the living body and then undergo a purification process is time-consuming and expensive. In addition, the target material that can be used as an antigen is limited compared to the aptamer which has little restrictions on the target material, which makes it difficult to prepare antibodies to low molecular weight compounds such as toxic substances. In general, since antibodies are very large proteins having a size of 150 K Da or more, there are limitations in signal detection when applied to biosensors such as electrochemistry, and thermal stability is inferior to DNA or other chemicals. have. Therefore, the existing technology using antibodies in the diagnosis of blood biomarkers is not cost and time efficient, the range of application is limited, there are limited problems in the application as a biosensor. As a new sensing material for improving these problems, a lot of researches using aptamers that show high affinity and safety specifically for various target materials and are easier to chemically synthesize and change than antibodies. In addition, since the Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) was developed in 1990 by the Gold's and Ellington's groups, large macromolecules, such as proteins, have been the main experimental targets, but affinity chromatography, capillary Advances in evolved SELEX technology using capillary electrophoresis and magnetic beads have made it possible to diversify target molecules, including small molecules, such as hormones or organic molecules, which are small in size, making antibodies difficult to make. . Therefore, a lot of research is being conducted to select aptamers for small molecules and use them in various fields.
이에, 본 발명자는 설파디메톡신에 대해 새로운 앱타머를 개발하기 위해 노력한 결과, SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술을 이용하여 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 설파디메톡신에 높은 친화도를 보이는 DNA 앱타머를 선별하였고, 상기 DNA 앱타머들의 서열 및 구조를 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have tried to develop a new aptamer for sulfadimethoxin, and thus show a high affinity to sulfadimethoxin from a chemically synthesized ssDNA library using the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) technology. DNA aptamers were selected and the present invention was completed by establishing the sequence and structure of the DNA aptamers.
본 발명의 목적은 설파디메톡신(sulfadimethoxine)에 특이적으로 결합하는 신규 DNA 앱타머(aptamer), 이의 제조 방법, 및 상기 DNA 앱타머를 이용한 설파디메톡신 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a novel DNA aptamer that specifically binds to sulfadimethoxine, a method for preparing the same, and a composition and kit for sulfadimethoxine detection using the DNA aptamer.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 설파디메톡신(sulfadimethoxine)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a DNA aptamer (aptamer) that specifically binds to sulfadimethoxine (sulfadimethoxine), characterized in that having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 13. do.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 설파디메톡신을 비드(bead)에 고정시키는 단계;1) fixing sulfadimethoxine to beads;
2) 설파디메톡신이 고정된 비드와, 양말단에 보존된 PCR용 프라이머 영역을 가지고 중앙에 30 - 50개의 임의의 염기를 가지는 ssDNA 라이브러리를 반응시켜 결합을 유도하는 단계;2) inducing binding by reacting the sulfadimethoxine-immobilized beads with an ssDNA library having 30-50 arbitrary bases in the center having a primer region for PCR preserved in the sock end;
3) 설파디메톡신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA를 분리하는 단계;3) separating ssDNA bound to the beads to which sulfadimethoxine is immobilized;
4) 분리된 설파디메톡신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA로부터 ssDNA를 분리하는 단계; 및4) separating the ssDNA from the ssDNA bound to the isolated sulfadimethoxin immobilized beads; And
5) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 ssDNA를 증폭하는 단계,5) amplifying ssDNA that specifically binds sulfadimethoxine by performing PCR using a primer pair complementary to the primer region for PCR;
를 포함하는 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공한다.It provides a method for producing a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxine comprising a.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 설파디메톡신 검출용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for detecting sulfadimethoxin comprising a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 13.
아울러, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 설파디메톡신 검출용 키트를 제공한다.
In addition, the present invention provides a kit for sulfadimethoxine detection comprising a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin, characterized in that it has a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 13.
본 발명은 자성비드(magnetic bead)를 이용한 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술을 이용하여 무작위 ssDNA 라이브러리로부터 설파디메톡신(sulfadimethoxine)에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 DNA 앱타머를 개발하였다. 본 발명에 따르면 설파디메톡신에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하면 기존에 사용되고 있는 항체 기반 분석보다 더 민감하고 정확하게 설파디메톡신을 측정할 수 있을 것으로 기대되며, 또한 상기 DNA 앱타머는 항체에 비해 생산비용이 적고 표면에 고정화하기가 쉬우므로 바이오센서 칩 제작에 유리하고 인체, 식품 및 상하수원등에 잔류하는 극미량의 설파디메톡신 검출용 조성물 및 키트(kit) 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.
The present invention develops a DNA aptamer that shows specific high affinity for sulfadimethoxine from a random ssDNA library using SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) technology using magnetic beads. It was. According to the present invention, it is expected that the use of DNA aptamers capable of specifically binding to sulfadimethoxin will allow sulfadimethoxins to be measured more sensitively and accurately than antibody-based assays used in the prior art. Compared with the low production cost and easy fixation on the surface, it is advantageous for the production of biosensor chips and can be effectively used for the development of the composition and kit for detecting the trace amount of sulfadimethoxin remaining in the human body, food, and water and sewage source.
도 1은 자성비드(magnetic bead)를 이용한 SELEX를 수행하는 과정을 개략적으로 보여주는 그림이다.
도 2는 반복되는 선별 과정에서 각 단계마다 선별되는 앱타머(aptamer)의 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 3은 형광물질이 표지된 DNA 앱타머를 이용하여 설파디메톡신(sulfadimethoxine)과의 결합정도를 형광세기를 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 1 is a diagram schematically illustrating a process of performing SELEX using magnetic beads.
Figure 2 is a graph showing the binding force of the aptamer (selectamer) selected for each step in the repeated screening process.
Figure 3 is a graph showing the result of confirming the binding degree with sulfadimethoxine (sulfadimethoxine) by using the fluorescent material labeled aptamer through fluorescence intensity.
이하, 본 발명은 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 설파디메톡신(sulfadimethoxine)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공한다. The present invention provides a DNA aptamer (aptamer) that specifically binds to sulfadimethoxine, characterized in that it has a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 13.
상기 DNA 앱타머는 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The DNA aptamer more preferably has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
상기 DNA 앱타머는 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.The DNA aptamer is preferably prepared in the following steps, but is not limited thereto.
1) 설파디메톡신을 비드(bead)에 고정시키는 단계;1) fixing sulfadimethoxine to beads;
2) 설파디메톡신이 고정된 비드와 양 말단에 보존된 PCR용 프라이머 영역을 가지고 중앙에 30 - 50개의 임의의 염기를 가지는 ssDNA 라이브러리를 반응시켜 결합을 유도하는 단계;2) inducing binding by reacting sulfadimethoxine-fixed beads with an ssDNA library having 30-50 arbitrary bases in the center with primer regions for PCR conserved at both ends;
3) 설파디메톡신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA를 분리하는 단계;3) separating ssDNA bound to the beads to which sulfadimethoxine is immobilized;
4) 분리된 설파디메톡신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA로부터 ssDNA를 분리하는 단계; 및4) separating the ssDNA from the ssDNA bound to the isolated sulfadimethoxin immobilized beads; And
5) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 ssDNA를 증폭하는 단계.5) Amplifying the ssDNA that specifically binds sulfadimethoxine by performing PCR using a primer pair complementary to the PCR primer region.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 비드는 세파로즈 비드(sepharose bead) 또는 자성비드(magnetic bead) 인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.In the above method, the beads of step 1) are preferably sepharose beads or magnetic beads, but are not limited thereto.
상기 방법에 있어서, 단계2)의 PCR용 프라이머 영역은 서열번호 14 및 서열번호 15인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.In the above method, the primer region for PCR in step 2) is preferably SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, but is not limited thereto.
상기 방법에 있어서, 단계 3) 내지 단계 5)의 단계를 추가적으로 5회 내지 15회 반복하여 실시하는 것이 바람직하고, 8회 내지 13회 반복하여 실시하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
In the above method, the steps 3) to 5) are preferably performed by additionally repeating 5 to 15 times, and more preferably 8 to 13 times, but not limited thereto.
본 발명자들은 설파디메톡신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여, 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 항생물질인 설파디메톡신에 대해 자성비드(magnetic bead)를 이용한 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)기술을 이용하여 앱타머 후보 ssDNA를 선별하였다(도 1 내지 도 2 참조).In order to select DNA aptamers that specifically bind to sulfadimethoxin, the present inventors used SELEX (Systematic Evolution of Ligands) using magnetic beads for the antibiotic sulfadimethoxin from a chemically synthesized ssDNA library. Aptamer candidate ssDNA was screened using by Exponential enrichment) (see FIGS. 1 to 2).
또한, 본 발명자들은 선별된 앱타머 후보 ssDNA로부터 서열분석 및 구조를 분석한 후, 서열 및 구조적 유사성을 갖는 설파디메톡신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 확인하였다(표 1 참조).In addition, we analyzed DNA sequence and structure from the selected aptamer candidate ssDNA, and then identified DNA aptamers that specifically bind to sulfadimethoxin having sequence and structural similarity (see Table 1).
아울러, 본 발명자들은 각각의 DNA 앱타머의 결합정도를 확인하기 위해, 항생제가 고정화된 자성비드와 FAM 형광물질로 고정화된 DNA 앱타머를 이용하여 결합력을 분석한 결과, 서열번호 11 및 서열번호 13의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머의 결합정도가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조).In addition, the inventors of the present invention, in order to confirm the binding degree of each DNA aptamer, by analyzing the binding force using a magnetic bead immobilized antibiotic and DNA aptamer immobilized with FAM fluorescent material, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 13 It was confirmed that the binding degree of the DNA aptamer having a nucleotide sequence of significantly higher (see Fig. 3).
따라서, 본 발명의 DNA 앱타머는 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)기술을 이용하여 항생물질인 설파디메톡신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 결합력을 분석을 통해, 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 확인하였다.
Therefore, the DNA aptamer of the present invention was selected from the chemically synthesized ssDNA library to select a DNA aptamer specifically binding to the antibiotic sulfadimethoxin using SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) technology. By analyzing the nucleotide sequence, characteristics and binding capacity of the DNA aptamers, DNA aptamers specifically binding to sulfadimethoxine having any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 13 were identified.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 설파디메톡신 검출용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for detecting sulfadimethoxin comprising a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 13.
상기 DNA 앱타머는 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The DNA aptamer more preferably has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
본 발명의 DNA 앱타머는 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 SELEX기술을 이용하여 항생물질인 설파디메톡신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 결합력을 분석을 통해, 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 확인하였으므로, 이를 포함하는 설파디메톡신 검출 또는 제거용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
DNA aptamer of the present invention was selected from the chemically synthesized ssDNA library using the SELEX technology to select a DNA aptamer that specifically binds to the antibiotic sulfadimethoxin, and sequence, characteristics and binding capacity of the selected DNA aptamer Through analysis, it was confirmed that the DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxine having any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 13, useful as a composition for detecting or removing sulfadimethoxin comprising the same Can be used.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 설파디메톡신 검출용 키트(kit)를 제공한다.The present invention also provides a kit for sulfadimethoxine detection comprising a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin, characterized in that it has a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 13. do.
상기 DNA 앱타머는 서열번호 11 또는 서열번호 13의 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The DNA aptamer more preferably has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
본 발명의 DNA 앱타머는 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 SELEX기술을 이용하여 항생물질인 설파디메톡신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 결합력을 분석을 통해, 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 확인하였으므로, 이를 포함하는 설파디메톡신 검출용 키트로 유용하게 이용될 수 있다. DNA aptamer of the present invention was selected from the chemically synthesized ssDNA library using the SELEX technology to select a DNA aptamer that specifically binds to the antibiotic sulfadimethoxin, and sequence, characteristics and binding capacity of the selected DNA aptamer By analyzing the DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin having any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 13, so that it can be usefully used as a sulfadimethoxin detection kit comprising the same Can be.
상기 본 발명의 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브 또는 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일 또는 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
The kit of the present invention may include a buffer solution and containers for performing and analyzing the detection, if necessary, such as a bottle, a tub, a small sachet, an envelope, a tube or an ampoule. And the like, and they may be formed, in part or in whole, from plastic, glass, paper, foil or wax, and the like. The container may be equipped with a fully or partially separable stopper that may initially be part of the container or attached to the container by mechanical, adhesive or other means. The container may also be equipped with a stopper to access the contents by a needle. The kit may include an external package, which may include instructions for use of the components.
이하, 본 발명은 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명의 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
<< 실시예Example 1> 1> ssDNAssDNA (( singlesingle strandstrand DNADNA ) 라이브러리의 제조) Library Preparation
양 말단에 PCR 증폭 및 클로닝을 위한 보존된 프라이머의 결합서열을 가지고, 가운데 무작위의 40개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 합성 ssDNA 라이브러리[5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA(서열번호:14)-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC(서열번호:15)-3']을 설계하였다. 또한, PCR 증폭 및 ssDNA 생성을 위하여 정방향 프라이머(forward primer)[5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3'(서열번호:16)], 역방향 프라이머(reverse primer)[5'-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3'(서열번호:17)] 및 비오틴이 결합된 역방향 프라이머[5'-Biotin-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3'(서열번호:18)]을 사용하였고, 결합 분석을 위하여 FAM이 표지된 정방향 프라이머[5'-FAM- CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3'(서열번호:19)]를 사용하였다. 또한, 모든 올리고뉴클레오티드는 바이오닉스 사(한국)에서 합성 및 PAGE-정제하였다.
Synthetic ssDNA library [5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA (SEQ ID NO: 14) -N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC (SEQ ID NO: 14) having a binding sequence of conserved primers for PCR amplification and cloning at both ends and comprising a sequence of 40 random nucleotides in the middle) : 15) -3 ']. In addition, forward primer [5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3 '(SEQ ID NO: 16)], reverse primer [5'-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3' (SEQ ID NO: 17) for PCR amplification and ssDNA generation. )] And biotin-bound reverse primer [5'-Biotin-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3 '(SEQ ID NO: 18)] was used, and FAM-labeled forward primer [5'-FAM-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3' for binding analysis (SEQ ID NO: 19)]. In addition, all oligonucleotides were synthesized and PAGE-purified by Bionics (Korea).
<< 실시예Example 2> 2> 설파디메톡신Sulfadimethoxin (( sulfadimethoxinesulfadimethoxine )이 고정된 ) Fixed 비드의Bead 제조 Produce
Tosyl-로 활성화된 자성비드(magnetic bead)(Invitrogen, 미국)와 설파디메톡신의 1차 아민기(-NH2)와의 반응을 이용해 설파디메톡신(Sigma-Aldrich, 미국)을 비드에 고정하였다.Sulfadimethoxine (Sigma-Aldrich, USA) was immobilized on the beads using a reaction of Tosyl-activated magnetic beads (Invitrogen, USA) with sulfadimethoxine's primary amine group (-NH 2).
구체적으로, 20 μmole의 설파디메톡신을 30 mg 자성비드(megnetic bead)와 혼합한 후, 1 mL의 커플링 버퍼(0.1 M borate, 0.67 M (NH4)2SO4, pH 9.5)에서 부드럽게 교반하며 37℃에서 20시간 동안 배양한 다음, 설파디메톡신과 결합하지 않은 비드 표면의 tosyl기의 반응을 멈추기 위해 1 mL의 블로킹 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 0.05 % tween 20, pH 7.4)에서 37℃로 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 자석을 이용하여 1 mL의 워싱 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 0.01 % tween 20, pH 7.4)로 2번 세척한 후 설파디메톡신이 고정화된 자성비드를 수득하였다.
Specifically, 20 μmole of sulfadimethoxine was mixed with 30 mg of magnetic beads, followed by gentle stirring in 1 mL of coupling buffer (0.1 M borate, 0.67 M (NH 4 ) 2 SO 4 , pH 9.5). After incubation at 37 ° C. for 20 hours, 1 mL of blocking buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 1.4) was used to stop the reaction of tosyl groups on the surface of the beads that were not bound to sulfadimethoxine. mM KH 2 PO 4 , 0.05% tween 20, pH 7.4) at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, using a magnet, washed twice with 1 mL of washing buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 1.4 mM KH 2 PO 4 , 0.01% tween 20, pH 7.4) Magnetic beads immobilized with dimethoxine were obtained.
<< 실시예Example 3> 설파디메톡신 3> sulfadimethoxin 에on 특이적인 Specific 앱타머Aptamers 선별 Selection
설파디메톡신에 특이적인 앱타머를 선별하기 위해 자성비드를 이용한 SELEX를 수행하였다(도 1). SELEX using magnetic beads was performed to select aptamers specific for sulfadimethoxin (FIG. 1).
구체적으로, 먼저 자성비드에 비-특이적으로 결합하는 ssDNA를 제거하기 위해, 결합 버퍼(binding buffer, 20 mM Tris-HCL, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 8.0)에 녹아있는 ssDNA 라이브러리(500 pmole)를 자성비드와 반응시키고, 자석을 이용하여 결합하지 않은 상층액만을 분리하였다. 분리된 ssDNA 라이브러리는 설파디메톡신이 고정화된 자성비드와 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 2 번 세척 과정을 거쳐 결합하지 않은 ssDNA는 제거하고 결합한 ssDNA는 20 mM NaOH로 용출시킨 후, 용출된 ssDNA는 상기 <실시예 1>의 비오틴(biotin) 프라이머를 사용하여 PCR 과정을 통해 증폭시켰다. 그 다음, 스트렙타아비딘(streptavidin)으로 고정화된 자성비드를 이용하여 dsDNA에서 ssDNA로 분리하고, 분리된 ssDNA는 다시 설파디메톡신이 고정화된 자성비드와 반응시켰고, 상기 과정을 반복 실시하였다. 또한, 첫 번째 선별 후, 상기 선별된 ssDNA를 다음 선별에 사용하였고, 이런 선별과정을 반복하였다. 이때 다음 선별과정에서 ssDNA의 양 및 설파디메톡신에 고정된 비드에 ssDNA의 배양시간은 엄격한 선별을 위해 보다 감소시켰으며, 반복되는 각 선별과정에서 용출된 ssDNA를 UV 분광광도계(UV spectrometer)로 그 농도를 측정하여 남아있는 ssDNA의 설파디메톡신 결합정도를 확인하며 선별과정을 진행하였다.Specifically, in order to remove ssDNA that non-specifically binds to magnetic beads, it is first dissolved in a binding buffer (20 mM Tris-HCL, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 8.0). The ssDNA library (500 pmole) was reacted with magnetic beads, and only the unbound supernatant was separated using a magnet. The isolated ssDNA library was reacted with magnetic beads of sulfadimethoxine immobilized at room temperature for 1 hour. After the reaction, the washed ssDNA was removed twice and the bound ssDNA was eluted with 20 mM NaOH. The eluted ssDNA was amplified by PCR using the biotin primer of <Example 1>. I was. Then, the magnetic beads immobilized with streptavidin were separated from dsDNA to ssDNA, and the separated ssDNA was reacted with the magnetic beads immobilized with sulfadimethoxin, and the above procedure was repeated. In addition, after the first screening, the screened ssDNA was used for the next screening, and this screening process was repeated. In the next screening process, the amount of ssDNA and the incubation time of ssDNA in the beads fixed in sulfadimethoxine were further reduced for strict screening. The concentration was measured to check the degree of sulfadimethoxin binding of the remaining ssDNA and proceed with the screening process.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 결합력(%)을 각 선별과정의 단계마다 하기 <수학식 1>을 통해 계산한 결과, 각 선별과정의 단계마다의 결합력을 확인하였다(도 2).
As a result, as shown in FIG. 2, the binding force (%) was calculated through the following <
<< 실시예Example 4> 4> 클로닝Cloning 및 염기서열 분석 And sequencing
13번째의 반복선별된 ssDNA는 변형되지 않은 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 과정을 통해 증폭하였고, pENTR/TOPO 벡터(TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후, 상기 벡터를 Escherichia coli(E. coli) TOP10 세포(Invitrogen, 미국)에 형질전환하였다. ssDNA가 삽입된 클론을 miniprep 키트(GeneAll, 한국)를 이용하여 정제한 후, 염기서열을 분석(COSMO Genetech, 한국)하였다. 상기 서열분석 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 설파디메톡신에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA의 염기서열을 확인하였다.
The 13th reselected ssDNA was amplified by PCR using unmodified forward and reverse primers, cloned into a pENTR / TOPO vector (TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, USA), and the vector was then transferred to Escherichia. coli ( E. coli ) TOP10 cells (Invitrogen, USA) were transformed. Clones into which ssDNA was inserted were purified using a miniprep kit (GeneAll, Korea), and then sequenced (COSMO Genetech, Korea). As a result of the sequencing analysis, as shown in Table 1, the nucleotide sequence of DNA specifically binding to sulfadimethoxine with high affinity was confirmed.
또한, 선별된 ssDNA의 구조적 유사성을 분석하기 위하여, Mfold 프로그램 (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)을 이용하여 2차 구조를 조사하였다.In addition, to analyze the structural similarity of the selected ssDNA, the secondary structure was investigated using the Mfold program ( http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi ).
그 결과, 대부분의 DNA 앱타머에서 stem 부분에 'AT/TA' 염기쌍과 loop 부분의 '-GAG-' 염기서열 부분이 유사하게 존재하는 2차 구조를 형성한다는 것을 확인하였고, 그 외에 stem 부분에 'ATG/CTA' 염기쌍을 갖기도 하였는데, 공통적으로 존재하는 이러한 부분들이 설파디메톡신과의 결합에 관여하는 것을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that most DNA aptamers form a secondary structure in which the 'AT / TA' base pair and the '-GAG-' sequence part of the loop part are similarly present in the stem part. They also had the 'ATG / CTA' base pairs, confirming that these common moieties are involved in binding to sulfadimethoxin.
<< 실시예Example 5> 5> ssDNAssDNA 의 결합력 확인Force of adhesion
선별된 ssDNA의 설파디메톡신에 대한 결합력을 확인하기 위하여, 형광 측정을 이용하여 분석하였다.In order to confirm the binding capacity of the selected ssDNA to sulfadimethoxin, it was analyzed using fluorescence measurement.
구체적으로, 20 μmole의 설파디메톡신을 30 mg 자성비드(megnetic bead)와 혼합한 후, 1 mL의 커플링 버퍼(0.1 M borate, 0.67 M (NH4)2SO4, pH 9.5)에서 부드럽게 교반하며 37℃에서 20시간 동안 배양한 다음, 설파디메톡신과 결합하지 않은 비드 표면의 tosyl기의 반응을 멈추기 위해 1 mL의 블로킹 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 0.05 % tween 20, pH 7.4)에서 37℃로 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 자석을 이용하여 1 mL의 워싱 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 0.01 % tween 20, pH 7.4)로 2번 세척한 후, 0.6 mg의 상기 설파디메톡신이 고정된 자성 비드를 100 mL의 결합버퍼에서 부드럽게 교반하면서 실온에서 1시간 동안 FAM이 표지된 ssDNA 앱타머와 함께 배양하고, 결합하지 않은 앱타머는 세척을 통해 제거하였다. 설파디메톡신이 고정된 자성비드에 결합된 FAM이 표지된 ssDNA 앱타머의 양은 자석을 이용하여 설파디메톡신에 결합된 FAM이 표지된 ssDNA만을 분리하여 형광측정(1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA)을 통해 측정하였다.Specifically, 20 μmole of sulfadimethoxine was mixed with 30 mg of magnetic beads, followed by gentle stirring in 1 mL of coupling buffer (0.1 M borate, 0.67 M (NH 4 ) 2 SO 4 , pH 9.5). After incubation at 37 ° C. for 20 hours, 1 mL of blocking buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 1.4) was used to stop the reaction of tosyl groups on the surface of the beads that were not bound to sulfadimethoxine. mM KH 2 PO 4 , 0.05% tween 20, pH 7.4) at 37 ° C. for 1 hour. Then, using a magnet washed twice with 1 mL of washing buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 1.4 mM KH 2 PO 4 , 0.01% tween 20, pH 7.4), 0.6 mg of the sulfadimethoxin-fixed magnetic beads were incubated with FAM-labeled ssDNA aptamer for 1 hour at room temperature with gentle stirring in 100 mL of binding buffer, and unbound aptamers were removed by washing. The amount of FAM-labeled ssDNA aptamer bound to sulfadimethoxin-fixed magnetic beads was measured by fluorescence by separating only ssDNA-labeled FAM bound to sulfadimethoxine using a magnet (1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA). Measured through.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 형광 세기를 이용한 각 DNA 앱타머의 설파디메톡신과의 결합정도를 비교한 결과, 서열번호 11 및 서열번호 13의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머의 결합력이 다른 앱타머와 비교하여 높은 것을 확인하였다(도 3).As a result, as shown in Figure 3 as a result of comparing the binding degree of each DNA aptamer with sulfadimethoxin using the fluorescence intensity, the applicability of the DNA aptamer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 13 is different It was confirmed that the high compared with the tammer (Fig. 3).
<110> iSENS <120> DNA aptamer binding to sulfadimethoxine with specificity <130> 10P-11-65 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 1 tgagcagtcc ccatgcgtcg gtcttccccc cacgtcccat 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 2 agttcgagaa cgcgatcaag ctgaagtcat gtgggtccgt 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 3 tcacgccatc gctcctaaat accgcataca cattctgatt 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 4 taggcattgg agtaaggttt gcgttcgggt tggaagtcgg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 5 ggcttttggt gaggcttgtc tatgttttcg gtgtaggggg 40 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 6 atccgatctt agggcgcggg ttatggaggg tgcc 34 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 7 cctccaggta aggcaacgca gtggtgaggg cggacggggc 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 8 tcaggggtta aagcacgggc tggtaatgtt tggcggctac 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 9 tgacagatga agcgtatgtc gtctatctat cttagctagc 40 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 10 tataacggtg ggcttgagac ctgtctgtcc gtctctgg 38 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 11 gcgatgatgg gttagatggg aggtcatata gctggatggt 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 12 gcggctgagg aaactgtgta tctaagtagg tcgggtcgcg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 13 gggcaacgag tgtttataga gggaggtggg gggctaccag 40 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preserved region of ssDNA library <400> 14 cacctaatac gactcactat agcggatccg a 31 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preserved region of ssDNA library <400> 15 ctggctcgaa caagcttgc 19 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR amplification and ssDNA generation <400> 16 cacctaatac gactcactat agcgga 26 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR amplification and ssDNA generation <400> 17 gcaagcttgt tcgagccag 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotinylated reverse primer for PCR amplification and ssDNA generation <400> 18 gcaagcttgt tcgagccag 19 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM labeled forward primer for binding assay <400> 19 cacctaatac gactcactat agcgga 26 <110> iSENS <120> DNA aptamer binding to sulfadimethoxine with specificity <130> 10P-11-65 <160> 19 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 1 tgagcagtcc ccatgcgtcg gtcttccccc cacgtcccat 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 2 agttcgagaa cgcgatcaag ctgaagtcat gtgggtccgt 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 3 tcacgccatc gctcctaaat accgcataca cattctgatt 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 4 taggcattgg agtaaggttt gcgttcgggt tggaagtcgg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 5 ggcttttggt gaggcttgtc tatgttttcg gtgtaggggg 40 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 6 atccgatctt agggcgcggg ttatggaggg tgcc 34 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 7 cctccaggta aggcaacgca gtggtgaggg cggacggggc 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 8 tcaggggtta aagcacgggc tggtaatgtt tggcggctac 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 9 tgacagatga agcgtatgtc gtctatctat cttagctagc 40 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 10 tataacggtg ggcttgagac ctgtctgtcc gtctctgg 38 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 11 gcgatgatgg gttagatggg aggtcatata gctggatggt 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 12 gcggctgagg aaactgtgta tctaagtagg tcgggtcgcg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sulfadimethoxine binding DNA aptamer <400> 13 gggcaacgag tgtttataga gggaggtggg gggctaccag 40 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preserved region of ssDNA library <400> 14 cacctaatac gactcactat agcggatccg a 31 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preserved region of ssDNA library <400> 15 ctggctcgaa caagcttgc 19 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR amplification and ss DNA generation <400> 16 cacctaatac gactcactat agcgga 26 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR amplification and ss DNA generation <400> 17 gcaagcttgt tcgagccag 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotinylated reverse primer for PCR amplification and ssDNA generation <400> 18 gcaagcttgt tcgagccag 19 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM labeled forward primer for binding assay <400> 19 cacctaatac gactcactat agcgga 26
Claims (7)
DNA aptamer (aptamer) that binds specifically to sulfadimethoxine, characterized in that having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 13.
2) 설파디메톡신이 고정된 비드와, 양말단에 보존된 PCR용 프라이머 영역을 가지고 중앙에 30 - 50개의 임의의 염기를 가지는 ssDNA 라이브러리를 반응시켜 결합을 유도하는 단계;
3) 설파디메톡신이 고정화된 비드에 결합된 ssDNA를 분리하는 단계;
4) 분리된 설파디메톡신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA로부터 ssDNA를 분리하는 단계; 및
5) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 ssDNA를 증폭하는 단계,
를 포함하는 제 1항의 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법.
1) fixing sulfadimethoxine to beads;
2) inducing binding by reacting the sulfadimethoxine-immobilized beads with an ssDNA library having 30-50 arbitrary bases in the center having a primer region for PCR preserved in the sock end;
3) separating the ssDNA bound to the beads to which sulfadimethoxine is immobilized;
4) separating the ssDNA from the ssDNA bound to the isolated sulfadimethoxin immobilized beads; And
5) amplifying ssDNA that specifically binds sulfadimethoxine by performing PCR using a primer pair complementary to the primer region for PCR;
Method for producing a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin of claim 1 comprising a.
The method of claim 2, wherein the bead is a sepharose bead (sepharose bead) or a magnetic bead (magnetic bead) characterized in that the method for producing a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin.
3. The sulfadimethoxine according to claim 2, wherein the primer region for PCR in step 2) has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 14 at the N-terminus and an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 15 at the C-terminus. Method for producing a DNA aptamer specifically binding to.
The method of claim 2, wherein the steps of 2) to 5) are repeated 13 or more times.
A sulfadimethoxine detection composition comprising a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin, characterized in that it has a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 13.
A sulfadimethoxine detection kit comprising a DNA aptamer specifically binding to sulfadimethoxin, characterized by having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 13.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020100139016A KR101263449B1 (en) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | DNA aptamer binding to sulfadimethoxine with specificity |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020100139016A KR101263449B1 (en) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | DNA aptamer binding to sulfadimethoxine with specificity |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20120077156A true KR20120077156A (en) | 2012-07-10 |
KR101263449B1 KR101263449B1 (en) | 2013-06-14 |
Family
ID=46710697
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020100139016A KR101263449B1 (en) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | DNA aptamer binding to sulfadimethoxine with specificity |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101263449B1 (en) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100930973B1 (en) * | 2007-09-27 | 2009-12-10 | 고려대학교 산학협력단 | DNA aptamers that specifically bind to oxytetracycline and methods for preparing the same |
KR100961532B1 (en) * | 2008-03-27 | 2010-06-07 | 고려대학교 산학협력단 | twenty one Single-stranded DNA aptamers having high affinity to tetracycline and it's analogues with high specificity and production method thereof |
KR101024860B1 (en) * | 2009-01-15 | 2011-03-31 | 고려대학교 산학협력단 | DNA aptamer binding to Diclofenac with specificity and production method thereof |
-
2010
- 2010-12-30 KR KR1020100139016A patent/KR101263449B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101263449B1 (en) | 2013-06-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Liu et al. | An aptamer-based probe for molecular subtyping of breast cancer | |
US9562907B2 (en) | Aptamers screening method based on graphene without target immobilization and the aptamers obtained from the method | |
KR101841046B1 (en) | Novel reduced graphene oxide-based aptasensor for detecting kanamycin and use thereof | |
KR101263450B1 (en) | DNA aptamer binding to kanamycin with specificity | |
Khabbaz et al. | Detection of kanamycin by using an aptamer-based biosensor using silica nanoparticles | |
US20100209933A1 (en) | Methods and Compositions for Detection and Enrichment of Target Small RNAs | |
CN113195722B (en) | DNA aptamer specifically bound to chikungunya virus E2 and application thereof | |
CN107164383B (en) | Creatine kinase isoenzyme nucleic acid aptamer and application thereof | |
CN109837281B (en) | Aptamer specifically binding to S100P protein and screening, identification and application thereof | |
KR20150003013A (en) | Nucleic acid aptamer specifically binding to enrofloxacin or ciprofloxacin | |
US20120289411A1 (en) | Method for screening nucleic acid ligand | |
CN113227377A (en) | DNA aptamer specifically combined with yellow fever virus EDIII and application thereof | |
CN113227378B (en) | DNA aptamer specifically bound with dengue virus EDIII and application thereof | |
KR101258600B1 (en) | DNA aptamer binding to ampicillin with specificity | |
CN106011142B (en) | A kind of sequence and application of the oligonucleotides aglucon P7-26 of specific recognition PSA albumen | |
KR20180003479A (en) | Signal Probe Using Double-stranded Nucleic Acid and a Method for Detecting a Target Molecule Using the Same | |
CN114457083B (en) | Single-stranded DNA (deoxyribonucleic acid) aptamer group specifically recognizing malachite green and application thereof | |
KR101263449B1 (en) | DNA aptamer binding to sulfadimethoxine with specificity | |
KR101237858B1 (en) | Aptamer specific S.Enteritidis and use of the same | |
KR101327249B1 (en) | DNA aptamers for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS) virus | |
KR100930974B1 (en) | DNA aptamer binding to Retinol Binding Protein 4 with specificity and production method thereof | |
KR101726213B1 (en) | Nucleotide Aptamer for Use in Detection of Kanamycin | |
KR101086026B1 (en) | DNA aptamers binding to visfatin with specificity and production method thereof | |
KR101429193B1 (en) | Nucleic acid aptamer specifically binding to chlortetracycline | |
Houwena et al. | Aptamers the Chemical Antibodies |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160602 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170525 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |