KR20120059212A

KR20120059212A - 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법

Info

Publication number: KR20120059212A
Application number: KR1020100120865A
Authority: KR
Inventors: 정우석; 정종일; 박나영; 김진만
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-06-08
Also published as: KR101314168B1

Abstract

본 발명은 콩 품종판별을 위한 유전자 특이전 분자마커의 개발 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 유전자 염기서열을 이용하여 콩의 MYB 유사 유전자를 발굴하고, 이를 이용하여 Medicago truncatula의 게놈 유전자에서 콩 MYB 유사 유전자들의 염기서열과 유사한 유전자를 발굴하고, 이들 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 콩의 품종 간 근연관계를 판별할 수 있는 유전자 특이전 분자마커를 개발하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 전자조절단백질(transcription factor) 유전자들을 이용하여 결국 여러 콩 품종이 갖는 유전체수준에서의 특이성을 확인할 수 있는 유전자 특이적 분자마커를 개발하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따르면 PCR을 통해 증폭된 밴드 패턴으로 콩 품종별 다형성의 차이점을 발굴하고 이를 분자마커로 이용하는 것이 가능하다. 본 발명에 의하여 발굴된 분자마커는 분자생물학적인 관점에서 콩 품종 판별에 이용할 수 있다.

Description

콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법{METHOD FOR DEVELOPING GENE SPECIFIC MOLECULAR MARKERS FOR DISCRIMINATINIG SOYBEAN CULTIVARS}

본 발명은 콩 품종판별을 위한 유전자 특이전 분자마커의 개발 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 유전자 염기서열을 이용하여 콩의 MYB 유사 유전자를 발굴하고, 이를 이용하여 Medicago truncatula의 게놈 유전자에서 콩 MYB 유사 유전자들의 염기서열과 유사한 유전자를 발굴하고, 이들 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 콩의 품종 간 근연관계를 판별할 수 있는 유전자 특이전 분자마커를 개발하는 방법에 관한 것이다.

서로 다른 유전계통 간의 분자마커 개발은 육종과정에 있어 선발을 보다 효과적이고 정확하게 할 수 있는 매우 중요한 방법을 제공한다.

육종에 사용되는 기존의 분자마커로는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSR(simple sequence repeats), AFLP(amplified fragment length polymorphism) 등이 있다. 이들 마커들은 대부분 게놈상의 DNA 염기서열간의 다형성(polymorphism)을 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 통해 쉽게 확인할 수 있다는 기술적 공통성을 가지고 있으나 실제 이러한 다형성이 특정 형질의 발현에 관여하는 유전자와 관계된 것은 아니다.

위에서 언급한 바와 같이 육종과정 중 특정형질의 유무 또는 정도를 구분할 수 있는 분자마커를 이용한 선발(MAS: marker assistant selection)(Yuejin et al. 2002)은 육종의 과정을 보다 간편하게 하여 모든 육종가들이 선호하는 방법이나 이미 언급한 RFLP, RAPD, SSR, AFLP등의 방법으로는 특정형질과 관계된 분자마커를 찾는 과정이 기술적으로 상당부분 우연에 의존하고 있으며 설령 성공적으로 발견하였다 하더라도 분자표지가 생리학적으로 어떤 과정을 통해 특정형질과 관계되었는지 알 수 없는 중대한 단점이 있다.

MYB 전사조절요소(transcription factor)는 식물체2차대사, 내재해저항성, 발달과 분화, 신호전달에 관여하는 전사조절단백질로서 DNA 결합(binding) 부위에서는 MYB 유전자 간 변이가 적은(conserved) 단일 또는 복수(R2R3)의 반복되는 염기서열이 관찰된다. 애기장대(Arabidopsis)의 경우 약 130여개의 MYB 유전자가 복수(R2R3)의 반복되는 염기서열을 가지고 있으며 24개의 하위 그룹(sub group)으로 분류되기도 한다(Allan 등 2008 Trends in Plant Science 13(3):99-102).

이에, 본 발명자들은 비교유전체학의 기법을 이용하여 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 유전자들과 유사한 염기서열을 가진 유전자들을 Medicago truncatula의 염기서열 데이터베이스(sequencing database)로부터 발굴하고 이 유전자들로부터 우리나라와 외국의 여러 콩 품종이 갖는 유전체수준의 특이성을 확인하여 품종판별을 할 수 있는 유전자 특이적 분자마커를 개발하였다.

본 발명은 상기의 필요성에 의해 안출된 것으로서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 콩의 MYB 유사 유전자의 프로모터 부위의 유전적 다형성을 발굴함으로써 다양한 콩 품종의 유전체 수준에서의 특이성을 비교하고 콩 품종을 판별할 수 잇는 유전자 특이적 분자마커로 활용하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩 품종 판별을 위한 유전자 특이전 분자마커의 개발 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 분자마커의 개발 방법은 (1) 콩의 품종별 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (2) 콩(Gycine max)의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 서열번호 41로 기재되는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB R2R3 반복서열과 유사한 염기서열을 갖는 콩의 유사 MYB 유전자를 발굴하는 단계; (3) Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (2) 단계에서 발굴한 콩의 MYB 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자를 찾아내는 단계; (4) 상기 Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자의 프로모터 부위를 발굴하는 단계; (5) 상기 프로모터의 특정 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 제작하는 단계; (6) 상기 (1) 단계의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, (5) 단계의 프라이머를 이용하여 특정 유전자의 프로모터 부위를 증폭하는 단계; 및 (7) 상기 증폭된 특정 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 계통 간 분자마커로 사용될 수 있는 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 애기장대(Arabidopsis)의 MYB 전자조절단백질(transcription factor) 유전자들을 이용하여 결국 여러 콩 품종이 갖는 유전체수준에서의 특이성을 확인할 수 있는 유전자 특이적 분자마커를 개발하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따르면 PCR을 통해 증폭된 밴드 패턴으로 콩 품종별 다형성의 차이점을 발굴하고 이를 분자마커로 이용하는 것이 가능하다. 본 발명에 의하여 발굴된 분자마커는 분자생물학적인 관점에서 콩 품종 판별에 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 일실시예에 따른 콩 품종 및 유전자원계통을 종피색에 의해 분류한 표이다.
도 2는 본 발명에 일실시예에 따른 콩 품종 및 유전자원계통을 입형(종자의 크기)에 의해 분류한 표이다.
도 3은 서열번호 1로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 4는 서열번호 2로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 5는 서열번호 3로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 6은 서열번호 4로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 7은 서열번호 5로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 8은 서열번호 6로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 9는 서열번호 7로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 10는 서열번호 8로 기재되는 콩 MYB 유사 유전자 염기서열을 이용하여 Medicago truncatula sequencing database에서 발굴한 고도의 유사성을 갖는 염기서열이다.
도 11은 서열번호 9로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터 부위를 포함하는 염기서열이다.
도 12는 서열번호 10로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 13은 서열번호 11로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 14는 서열번호 12로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 15는 서열번호 13로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 16은 서열번호 14로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 17은 서열번호 15로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열이다.
도 18은 서열번호 16로 기재되는 염기서열의 5’ 말단 상위 2Kb 프로모터부위를 포함하는 염기서열 이다.
도 19는 서열번호 17(도 11)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 25, 26)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. A1은 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다. (도 19 내지 도 26에서, M:Standard marker, lane 1:남해콩, lane 2:황금콩, lane 3:보광콩, lane 4:검정콩1호, lane 5:광두, lane 6:동북태, lane 7:진품콩2호, lane 8:함안콩, lane 9:부광콩, lane 10:백운콩, lane 11:은하콩, lane 12:방사콩, lane 13:한남콩, lane 14:강림콩, lane 15:푸른콩, lane 16:신팔달콩2호, lane 17:큰올콩, lane 18:동산콩69호, lane 19:동산콩127호, lane 20:만리콩, lane 21:신농흑콩, lane 22:광안콩, lane 23:다원콩, lane 24:개척콩1호, lane 25:소명콩, lane 26:다올콩, lane 27:새올콩, lane 28:소백콩, lane 29:청자콩, lane 30:화엄풋콩, lane 31:검정콩4호, lane 32:검정올콩, lane 33:대원콩, lane 34:대풍콩, lane 35:소록콩, lane 36:태광콩, lane 37:대황콩, lane 38:삼남콩, lane 39:청두콩, lane 40:청서리태, lane 41:흑청콩, lane 42:갈미콩, lane 43:검정콩3호, lane 44:장미콩, lane 45:장원콩, lane 46:진품콩, lane 47:풍산콩, lane 48:흑서리태).
도 20은 서열번호 18(도 12)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 27, 28)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. B1, B2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 21은 서열번호 19(도 13)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 29, 30)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. C1, C2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 22는 서열번호 20(도 14)으로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 31, 32)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. D1, D2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 23은 서열번호 21(도 15)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 33, 34)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. F1, F2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 24는 서열번호 22(도 16)으로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 35, 36)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. E1, E2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 25는 서열번호 23(도 17)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 37, 38)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. G1, G2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 26은 서열번호 24(도 18)로 기재되는 프로모터의 특정부위를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머(서열번호 39, 40)와 각각의 콩 품종 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 증폭된 DNA 밴드 패턴이다. H1, H2는 NTSYS 분석에 사용된 밴드의 위치를 표시한다.
도 27은 상기 도 19 내지 26의 밴드 패턴을 NTSYS 분석하여 얻은 콩 품종 간 근연관계를 나타내는 계통수(phylogenetic tree)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 콩의 품종 판별을 위한 유전자 특이적 분자마커의 개발 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 분자마커의 개발방법은 (1) 콩의 품종별 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (2) 콩(Gycine max)의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 서열번호 41로 기재되는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB R2R3 반복서열과 유사한 염기서열을 갖는 콩의 유사 MYB 유전자를 발굴하는 단계; (3) Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (2) 단계에서 발굴한 콩의 MYB 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자를 찾아내는 단계; (4) 상기 Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자의 프로모터 부위를 발굴하는 단계; (5) 상기 프로모터의 특정 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 제작하는 단계; (6) 상기 (1) 단계의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, (5) 단계의 프라이머를 이용하여 특정 유전자의 프로모터 부위를 증폭하는 단계; 및 (7) 상기 증폭된 특정 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 계통 간 분자마커로 사용될 수 있는 패턴을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 프로모터를 발굴하는 단계는 상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자 염기서열의 5' 방향 상위 1.5 ~ 3 Kb 부위에서 발굴하는 것을 특징으로 하며, 프라이머를 제작하는 단계는 특정 유전자의 프로모터가 포함되는 개시코돈으로부터 5' 방향으로 10 Kb 내부에서 복수의 프라이머를 제작하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 발굴한 콩(Glycine max)의 MYB 유사 유전자는 서열번호 1 내지 8로 기재되는 염기서열 중에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하고, Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 찾아낸 상기 콩의 MYB 유사 유전자와 유사한 염기서열은 서열번호 9 내지 16(도3 내지 10)으로 기재된다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 9 내지 16(도3 내지 10)으로 기재되는 콩 MYB 전사조절유전자 유사 염기서열로부터 발굴한 프로모터 부위는 서열번호 17 내지 24(도11 내지 18)로 기재되는 것이며, 각각의 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 9 내지 24로 기재되는 염기서열이다.

또한, 본 발명은 상기 분자마커의 개발 방법에 의하여 제작된 콩 품종판별을 위한 유전자 특이적 분자마커를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 콩의 품종별 DNA 추출

공시재료는 우리나라 콩 품종 및 유전자원 48개를 사용하였으며, 구체적으로는 남해, 황금, 보광, 검정1호, 광두, 동북태, 진품2호, 함안, 부광, 백운, 은하, 방사, 한남, 강림, 푸른, 신팔달2호, 큰올, 동산69호, 동산127호, 만리, 신농흑, 광안, 다원, 개척1호, 소콩, 다올, 새올, 소백, 청자, 화엄풋, 검정4호, 검정올, 대원, 대풍, 소록, 태광, 대황, 삼남, 청두, 청서리태, 흑청, 갈미, 검정3호, 장미, 장원콩, 진품, 풍산, 흑서리태이고, 이들의 종자형질 특성인 종피색, 입형(종자의 크기) 등은 도 1 및 도 2에 정리하였다. 공시재료 중 종피색이 황색이 아닌 콩 품종 및 유전자원계통은 검정색 종피를 갖는 것이 검정1호 등 9개, 그리고 녹색, 갈색 등 기타 종피색을 갖는 것이 6개 포함되어 있다(도 1). 또한, 종자의 크기에 의한 콩 품종 및 유전자원계통의 분류는 도 2에 제시 되었다.

DNA를 추출하기 위하여 콩을 멸균조건에서 7일간 발아 시킨 후 시료를 채취하였다. 종자 멸균처리를 위해 각 종자는 95% 알코올에 1분 간 잘 흔들어 준 후 멸균수를 이용해 3번 헹구고, 다시 50% 하이포아염소산나트륨에 5분 간 잘 흔들어 준 후 멸균수를 이용해 3번 헹구었다. 이렇게 멸균처리 된 종자는 클린벤치에서 1% Bacto agar 배지가 들어있는 페트리 접시(petri dish)에 넣고 밀봉한 뒤 빛이 차단된 생육상(growth chamber)에서 30℃ 조건으로 발아시켰다.

발아시킨 콩 종자의 DNA 추출은 GENEALL사(한국)의 Plant SV mini DNA 추출 키트(kit)를 이용하였다. 발아시킨 콩 종자를 액화질소와 함께 갈아 준 후 100 mg을 취하여 마이크로 튜브(micro tube)에 넣고 여기에 키트에 있는 400 ㎕ PL buffer와 4 ㎕ RNase를 넣고 교반(vortexing)한다. 그 후 65℃로 맞춘 heating block에서 15분 간 배양(incubating)한 후 140 ㎕ PD buffer를 넣고 얼음에 5분 간 둔다. 다음으로 상기 혼합물을 13,000× g로 5분 간 원심분리(centrifuge)한 후 분리된 상징액을 Easy sep filtert column에 넣고 다시 13,000× g로 2분 간 원심분리(centrifuge)하여 컬럼(column)에 걸러져 나온 액체를 새로운 튜브에 옮겨 담는다. 걸러진 액체의 1.5배에 해당하는 BD buffer를 넣고 교반(vortexing)한 후 SV column에 옮겨 13,000× g에서 30초 간 원심분리(centrifuge)한다. 밑에 나오는 액체는 버리고 SV column에 700 ㎕의 CW buffer를 넣고 13,000× g에서 30초 간 원심분리(centrifuge)한 후, 다시 300 ㎕의 CW buffer를 넣고 13,000× g에서 2분 간 원심분리(centrifuge)한다. 그 후 SV Column의 필터 부분만 빼서 새로운 튜브에 넣고 50 ㎕ AE buffer를 넣어 실온에서 5분 간 반응시킨 후 13,000× g에서 1분 간 원심분리(centrifuge)하는 과정을 두 번 반복하여 콩 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다.

실시예 2. 콩( Glycine max )의 MYB 전사조절유전자와 유사한 염기서열을 갖는 Medicago truncatula 의 유사 유전자 발굴

애기장대(Arabidopsis thaliana)의 MYB 전사조절단백질(transcription factor) 유전자들의 암호화 부위(coding region)에서 공통적으로 발견된다고 알려진 R2, R3 반복서열(repetitive sequence)(서열번호 41, cttcg atgga ccaat tatct aagac cggac atcaa gagag gaaga ttctc gttcg aggaa gaaga aacta tcat tcagc tacac agtgt tatgg gaaac aa: Marin C and Paz-Ares J. 1998 MYB transcription factors in plant, Trends Genet 13(2):67-73)을 쿼리(query)로 하여 BLAST 탐색함으로써 이와 유사한 서열을 갖는 콩(Glycine max)의 염기서열을 GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 발굴하고, 콩의 MYB 유사 유전자로 사용하였다(서열번호 1 내지 8).

상기 염기서열을 쿼리로 하여 Medicago truncatula 서열 데이터베이스(sequencing database, GenBankk, www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST 하여 콩(Glycine max)의 MYB 전사조절유전자와 e-20 이상 수준의 유사성을 갖는 Medicago truncatula의 염기서열은 서열번호 9 내지 16(도 3 내지 도 10)으로 기재된다. 서열번호 9 내지 16(도3 내지 도10)으로 기재되는 염기서열은 각각 Medicago truncatula 서열 데이터베이스의 BAC sequencing library의 AC137831, AC153128, AC124961, AC166313, AC140544, AC140524, AC122724, AC148762에서 발굴된 것이다.

실시예 3. 콩의 MYB 유전자와 유사한 Medicago truncatula 유전자로부터 프로모터 염기서열의 발굴

상기 실시예 2에서 발굴한 콩의 MYB 전사조절유전자와 고도의 유의성을 갖는 Medicago truncatula의 염기서열 서열번호 9 내지 16(도 3 내지 도 10)을 이용하여, 각각 일치하는 염기가 시작되는 5' 말단으로부터 상부(5' 방향) 약 2 Kb 가량의 염기서열을 동일한 Medicago truncatula 게놈 서열 데이터베이스에서 추출하였으며, 염기서열 추출을 위한 프로그램은 C 언어로 프로그래밍 한, 프로그램 get_seq2를 자체 개발하여 사용하였다.

서열번호 17 내지 24(도11 내지 18)로 기재된 염기서열은 이러한 방법으로 발굴한 각각의 Medicago truncatula의 MYB 유사 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 염기서열이다. 예를 들어 도 3 내지 10의 염기서열 중 5' 말단의 밑줄 친 부분은 각각의 프로모터 부위 염기서열인 도 11 내지 18의 3' 말단의 밑줄 친 염기서열과 일치하는 부분을 표시한 것이다.

실시예 4. 콩의 품종판별을 위한 분자마커의 개발

4-1) Medicago truncatula 의 유사 MYB 유전자 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 제작

두과작물(荳科作物)의 모델 식물체인 Medicago truncatula의 게놈 DNA 서열 데이터베이스(genomic DNA sequencing database)의 염기서열을 이용하여 프라이머를 만들고, 콩의 게놈 DNA를 주형으로 하여 콩 품종 간 다형성을 발굴하는 이유는 다음과 같다. 현재, NCBI GenBank 와 Phytozome(www.phytozome.net)에 제시된 콩의 게놈 DNA 서열은 미국 에너지부(US DOE)의 Joint Genome Institute에서 수행되었던 게놈 프로젝트(genome sequencing project)의 결과로서 미국 콩 품종인 Williams82(PI518671)의 게놈 DNA 염기서열이다. 따라서 이 문헌의 게놈 DNA 서열 데이터베이스의 염기서열은 하나의 특정 콩 품종의 염기서열로서, 이를 기반으로 프라이머를 발굴하고 다른 콩 품종들과 비교하여 다양한 양적, 질적 형질과 관련된 유전체 수준에서의 다형성을 발굴하는데 활용하기에는 한계가 존재한다.

만약 Williams82의 게놈 DNA 서열 데이터베이스로부터 본 실험에서 수행한 것과 같이 특정 유전자의 염기서열에 근거하여 프로모터 염기서열을 발굴하고 그 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 작성하여 증폭된 패턴을 비교함으로써 다형성을 발굴하고자 한다면 Williams82라는 특정 콩 품종을 표준으로 여러 다양한 콩 품종을 비교하여야 한다. 이러한 방법으로는 콩 품종 간의 특정형질(표현형)과 유전체 수준에서의 다형성(유전자형)의 비교에 많은 제약과 한계를 가지게 된다.

따라서 본 발명에서는 동일한 글리신(Glycine)속이며 콩(Glycine max)과는 유전적으로 매우 유사하다고 알려진 Medicago truncatula로부터 유사 유전자의 염기서열을 발굴하고, 그것에 근거한 프로모터 염기서열을 추출하고 프라이머를 작성한 후, 비교 유전체학의 기법을 통해 Medicago truncatula의 염기서열을 기준으로 콩 품종 간 다양성을 특정유전자의 프로모터부위의 다형성으로 비교하고자 하였다.

상기 이유로 애기장대(Arabidopsis)의 R2R3 염기서열을 이용하여 발굴한 콩의 MYB 전사조절유전자와 고도의 유사성을 갖는 염기서열을 Medicago truncatula의 게놈 DNA 데이터베이스에서 발굴하고, 이들 유전자들의 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 각각 작성한 후, 이를 이용하여 여러 콩 품종의 게놈 DNA를 주형으로 하였을 때 증폭되는 밴드 패턴에서 관찰되는 다형성을 NT SYS 분석하여 콩 품종 간 근연관계를 조사하였다.

상기 실시예 3에 의하여 Medicago truncatula의 게놈 서열 데이터베이스에서 찾아낸 가상의 프로모터 염기서열 서열번호 17 내지 24(도11 내지 18)의 특정 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머를 제작하였으며, 서열번호 25 내지 40으로 나타내었다. 서열번호 17(도 11)의 특정부위를 증폭하기 위해 제작된 프라이머 쌍은 서열번호 25와 26이며, 이하 서열번호 27과 28은 서열번호 18(도 12), 서열번호 29와 30은 서열번호 19(도 13), 서열번호 31과 32는 서열번호 20(도 14), 서열번호 33과 34는 서열번호 21(도 15), 서열번호 35와 36은 서열번호 22(도 16), 서열번호 37과 38은 서열번호 23(도 17), 서열번호 39와 40은 서열번호 24(도 18)의 특정부위를 증폭하기 위해 제작된 프라이머 쌍이다.

4-2) PCR 및 다형성( polymorphism or polymorphic pattern )의 발굴

PCR(polymerase chain reaction)은 Bioneer(Seoul, Korea)의 PCR premix를 이용하였다. 한 시료 당 반응용액 20 ㎕에 premixture와 게놈 DNA(genomic DNA) 5 ng, dH2O 16㎕, forward primer 및 reverse primer 각각 10 pmole(1 ㎕)을 첨가하였고, 상기 premixture는 Taq DNA polymerase 1 U(unit), dNTP 0.25 mM, Tris-HCL(pH9.0) 10 mM, KCl 30 mM, MgCl₂ 1.5 mM, 안정제(Stabilizer) 및 염료(tracking dye)로 구성되었다.

DNA의 증폭은 Veriti 96-well thermal cycler (Applied Biosystesm, USA)를 사용하였다. PCR 조건은 최초 94℃에서 5분 동안 변성(denaturing)한 후, 94℃에서 30초 동안 변성(denaturing), 각 프라이머의 어닐링(annealing) 온도에서 30초 동안 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 동안 증폭(amplifying) 과정을 35회(cycle) 거친 후, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 DNA 연장(DNA extension)을 수행하였다. PCR을 통해 증폭된 산물은 0.5× TBE buffer(45 mM tris-borate, 1 mM EDTA)와 브롬화 에티듐(ethidium bromide)이 포함된 1.0% 아가로스 겔(agarose gel)을 사용하여 70 V에서 2시간 동안 전기영동 하였다. 아가로스 겔은 UV 광선 하에서 사진 촬영하여 밴드의 분석에 사용하였다. 상기 전기영동 실험 결과는 도 19 내지 26에 나타내었다.

4-3) 서로 다른 콩 계통 간 유전체수준의 다형성 발굴

상기 실시예 1에서 찾아낸 R2R3 염기서열을 가진 콩의 MYB 유전자와 높은 유사성을 갖는 Medicago truncatula의 염기서열(도3 내지 10)을 근거로 하여, 이 염기서열의 5' 말단으로부터 상위(upstream) 방향으로 약 2 Kb 부위의 일정부분을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍(서열번호 25 내지 40)을 제작하고, 이를 이용하여 콩의 품종별 게놈 DNA를 PCR로 증폭한 후 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동에 의해 분리하여 여러 콩 품종 간에 나타나는 밴드의 크기와 증폭여부에 따른 다형성을 살펴보았다. 증폭된 유전자들의 프로모터에서 품종 간 다형성이 관찰되었으며, 실험 결과는 도 19 내지 26에 나타내었다. 또한 NT SYS 프로그램을 이용하여 품종 간의 유전적 근연관계를 분석한 계통수(phylogenetic tree)를 도 27에 나타내었다.

4-4) 콩 계통간 유전체수준의 다형성에 의한 콩 품종판별

본 발명에서는 유사 MYB 유전자들의 전사 및 발현에 관여하는 프로모터 부위 염기서열의 다형성을 이용하여, 여러 콩 품종이 갖는 유전체 수준에서의 고유한 특이성을 발굴함으로써 이를 마커로 활용하고자 하였다. MYB 전사조절유전자의 암호화 부위(coding region)는 크게 5' 말단 방향(N-terminal)에 위치한 DNA 결합(binding) 부위와 3' 말단 방향(C-terminal)에 위치한 다양한 기능을 갖는 부위로 나뉜다. 이 중 5' 방향 DNA 결합 부위의 염기서열은 MYB 유전자 간에 매우 유사하며, 이 부위에 위치한 3개의 반복되는 염기서열 R1, R2, R3(repeated sequence)의 존재여부에 의해 MYB 유전자 계열(gene family)에 속하는 많은 유전자들이 분류되고 있다.

본 실험에 사용된 콩의 유사 MYB 유전자들은 식물체에 많이 존재한다고 알려진 R2R3 MYB 유전자들이다. 이들 MYB 전사조절유전자에 의해 만들어지는 단백질들의 구체적인 기능에 관해서는 최근까지 소수의 기능만 보고되었다. 그러나 이들 중 본 실험에 사용된 8개의 콩 유사 MYB 전사조절유전자와 고도의 유사성을 갖는 Medicago truncatula의 유사 MYB 전사조절유전자의 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍에 의해 48개의 콩 품종 및 유전자원계통의 근연관계가 계통수(phylogenetic tree) 상에서 독립적으로 분리되는 것이 관찰되었다(도 27). 이는 상기 8개의 유전자들의 프로모터 부위를 증폭 시키는 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 PCR 밴드 패턴을 통계분석하면 48개의 우리나라 콩 품종들이 갖는 유전체 수준에서의 특이성을 판별 할 수 있음을 증명하는 결과라 할 수 있다.

이러한 결과는 위의 프로모터 부위의 다형성이 발견된 유전자들이 구체적으로 어떠한 기능을 갖는지에 대해 설명하는 것은 불가능하다 하더라도 이들 유전자들의 프로모터에서 발견되는 다형성은 각각의 콩 품종 및 유전자원들이 갖는 유전체 수준에서의 특이성은 증명해 낼 수 있다는 것을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation corp. <120> METHOD FOR DEVELOPING GENE SPECIFIC MOLECULAR MARKERS FOR DISCRIMINATING SOYBEAN CULTIVARS <130> P10-E439 <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 684 <212> DNA <213> Glycine max <400> 1 gggtctttgg tcaccagaag aagatgaaaa acttttgagg catattacta agtacggtca 60 tggatgttgg agctcagttc ctaagcaagc aggtactcca acactgtata gtctatacca 120 ccccatttag cataaaaatc aagggaagaa aactgtagtt cattttcccg tcaatgtcct 180 ttattggcag gtttgcagag gtgcggcaaa agctgcaggc ttaggtggat caattattta 240 aggcctgatt tgaagagagg tacattttca caagaggagg aaaatctcat cattgaactt 300 catgcagtgc tagggaacag gtaaatctaa caatccttct ttacatgatt ttattagtct 360 ctgactctcg gccgatggat acctgttttc ttgtgattgg gtcatcctag atatcttgac 420 atggatatcc ttttgttttc ttcttctcag atggtctcaa attgcagcac aattgccagg 480 gaggactgac aatgaaataa agaatctgtg gaattcttgc ttaaagaaga aactcaggca 540 aagaggaata gaccctgtga cacataagcc actgtcagag gttgagaatg gagaggaggg 600 caaaacgagg agccaagaat tatccaatga actgaacctc ctgaattcag agagcttcaa 660 gtcagatgaa gggtcctatg agac 684 <210> 2 <211> 1001 <212> DNA <213> Glycine max <400> 2 gtttttgaat aatgaggact caagttagta agataacttc ttaggtaact aactttgtca 60 gcatatagta aaataattct gccatcagtt tttctaagta tcaatttttt ttatcttcag 120 tcacaagcat tttttttccc ttataatgtt ttcacttgat tatgatatca gcaaaggtgt 180 cccaccattc ctgcaagagg catcaatgct cacaccttcg aaaagacatg gtacactgtt 240 tcaagtttca accccatttt tttcaccttg ccaaaataaa taaaccttcc ctcctttcaa 300 ctccgaccta tatacaacaa gaagtcctat ttcacattgt tgaatctcta tcagatagat 360 caaccatata attgtaattc gacccttaaa tacatttttt ttaaaataaa gaaaatacaa 420 ggaaccttgt tgactatgac ccttctcatg gggccttgct cttatattag ttcaacttct 480 tttctcagct gccagttcat tttccttctt catatcatct ctctcgctgt cacattctct 540 ctatctatct cagccactcc aatagctttg gttcactgcc acccctgctg acatttttct 600 cattggaata aacaaacttt gtgttaactg aaaaaggttt ttaagggaaa aagaaaaaat 660 tacaaaatgg gaaggcactc ttgttgttac aagcagaagc ttaggaaggg tctttggtct 720 cctgaggagg atgaaaaact tctgaggcat ataacaaagt atggtcatgg atgttggagt 780 tctgtgccta agcaagcagg taattaatca aattatccaa ctaagcctcc tttaatctcc 840 tttgtaacaa aaagagaaat ttttttattc atctctctgt gaatgatatg aattggcagg 900 tttgcaaagg tgtggtaaga gctgcaggct taggtggatc aattacttaa ggcctgattt 960 aaagagagga acattctcac aagaagaaga aaaccttatc a 1001 <210> 3 <211> 723 <212> DNA <213> Glycine max <400> 3 tggatgttaa gaaaggtggg tctgtagtac aagcacaagt gaagttgcag aagcataacg 60 aaaaggagat gggcatgaga aaaggtccat gggcggttga ggaggacacc attctggtca 120 attacatcgc cacacacggt gaaggccact ggaattccgt ggcacgatgt gcaggcatgc 180 atgcatctta attataattt aatttctgca tgtgccaagt aataatggta tatatgttaa 240 ttatgagatt tatcaattac aggtctaagg aggagtggga agagttgcag attaaggtgg 300 ctaaactact tgcgcccaga cgtgcggcgt ggaaatatca cactccaaga acaaatatta 360 attctcgacc ttcactctcg ctggggcaac aggtatggta taaaaatatt ccactctctc 420 tctctctcta tatatatata ttaatttgtt ttataaggtt ggatgtacac atatataaca 480 tagtatgaat gaatgaatgt tttttgatag gtggtcaaag attgctcaac agctgccagg 540 aagaacagac aacgaaataa agaactattg gaggaccaga gtgataaaac aagcgaagca 600 gctaaagtgc gatgtgaata gcaaacagtt cagagacacg ttgcgttacg tttggatgcc 660 gcgcttgctg gagcggcttc agcccacatc acaagcactg gagccaaacc aaagtggact 720 tgt 723 <210> 4 <211> 506 <212> DNA <213> Glycine max <400> 4 agacctgaag gggctaagga aaattagaag gacacacaag tataaaggcg gtgaaataaa 60 agagaaagac aagaagaaga catgggaaga ccaccttgtt gtgacaaaga aggggtcaag 120 aaagggcctt ggactcctga agaagacatc atattggtgt cttatattca ggaacatggt 180 cctggaaatt ggagggcagt tcctgccaaa acaggttaat taattagccc tacactcaat 240 ttgatgatta ttttgcataa tattggttct tgttctttgt tgtgtttatt agatcattat 300 ttaaagaagt ttctgattga aatattggcc atttgggttt cattgtttta tctttggatc 360 tgaattgatt tttccatttt ggggttattt tcagggttgt caagatgcag caagagttgc 420 agacttagat ggactaatta cctgaggcca ggaatcaaac ggggcaactt cacagaacaa 480 gaggagaaga tgataatcca tcttca 506 <210> 5 <211> 1698 <212> DNA <213> Glycine max <400> 5 atgggacgat caccatgttg cgacaaggta ggtttaaaga aaggaccatg gactcctgag 60 gaagatcaga agctcttagc ttatattgaa gaacatggcc atggaagctg gcgtgccttg 120 ccagcaaaag ctggtactaa acactttttt tggtgttagt ttgatgtata ttgtttgtgg 180 tgaaaaataa tgtgtaagtg cacatatatg aaattattgc aatgtagtgt tcatgttgtg 240 aaatggagat gcttgtgctg ttgtgtatat ataggacttc agaggtgtgg caagagttgc 300 agactaagat ggaccaatta tctcaggcct gacattaaga ggggaaagtt cagtttgcaa 360 gaagaacaaa ccatcattca actccatgcc ctcttaggaa acaggtttgg tatctttctt 420 tgttgagtag taggatatat catatatgct aattctattt ttgactttaa aatcaagtct 480 tttgcatctt agttttttct ttgagaaagg taccagatac acatattcag aactcaagac 540 ccattatgga tttttttttt ctcttttgaa aatgtgaaag tgattttttt ttccttccac 600 aaatattttc ctatgttttg gaattttaca acaaaacaaa tgaaaataat gataactatg 660 tcactgcact tcacacctca gcttgatatt tcatcccata ctcactctac actaaatatg 720 aatcattcat ttttcgtgcg agagctataa tttctcttct gttcctgtgc ccttgctgtg 780 cagcagaatg tcttaaatgc aatgacctct caatttcttc acccaactat tccaaccctc 840 ccccaacaat ttttttttca gaaactgtgc tctgtgccct gtgccatttc cttaaatttt 900 ctcccagaca tacaagtttt attcgagacg aatcttaatt gcaaaatgat atatatcata 960 ttcatatatc ttctgccaca gcaatcaaaa gcaaaaatgc aatggctata ttattatttt 1020 tataggcaaa aagcaatgtc atatagcatg tgattatcta atgctctcaa catggcatac 1080 atacacacat acatctcatc ctctcataaa ttaagtcaca tttttctttt ataaaaaatt 1140 aacattaaat tatcaattaa aaacaacaat aaataatctg ttttagtagt tgatggatta 1200 ctctagggtt taacattggc tttttgtggt gtgtctgcac tatatgcttg tgctgtcttt 1260 gtactcaggt ggtcggcaat agccacacac ttgccaaaga gaacggacaa tgagatcaag 1320 aactattgga atacgcatct taagaaaagg ttaaccaaaa tgggaattga ccctgtgaca 1380 cacaagccta aaaacgatgc acttctctct agtgacggcc aatccaaaac cgctgcaaac 1440 ctcagccaca tggctcagtg ggagagtgct cgccttgaag ctgaagcaag acttgtaaga 1500 gagtcaaaaa tacgttcaca ttcacttcag caacaatttg gaagtagttc ttctacattt 1560 gcatcttctt cttctgcatc aacttcagct tcagctctca ataataatag taataataag 1620 ccggaagcac ccccgccacc gccaccgccg ccaccaccgt cgccaccacc gtcgcgatct 1680 tctcttgatg ttctgaag 1698 <210> 6 <211> 434 <212> DNA <213> Glycine max <400> 6 tctaactcct tttgtgctat ataaagaagt agaaaagtca ccagtgttta tcactgttcc 60 cactttctcc aaaaatggga agatcaccat gctgtgacaa ggtgggtttg aagaagggac 120 catggacgcc agaggaagat cagaagctct tggcttatat tgaagaacat ggccatggaa 180 gctggcgtgc tttgccagca aaagctggta aataatctta tatacatgtt gatatataaa 240 tatcttgtaa ttaaagtaaa acttgccgtg taatttgtga agtgaattag ttgctggcta 300 ctgtgttcag gacttcagag gtgtggcaaa agctgcagat tgagatggac taattatcta 360 aggcctgata ttaagagggg gaaattcagt atgcaagaag aacaaaccat cattcaactt 420 catgctctct tagg 434 <210> 7 <211> 1596 <212> DNA <213> Glycine max <400> 7 atgggaagat caccatgctg tgacaaggtg ggtttgaaga agggaccatg gacgccagag 60 gaagatcaga agctcttggc ttatattgaa gaacatggcc atggaagctg gcgtgctttg 120 ccagcaaaag ctggtaaata atcttatata catgttgata tataaatatc ttgtaattaa 180 agtaaaactt gccgtgtaat ttgtgaagtg aattagttgc tggctactgt gttcaggact 240 tcagaggtgt ggcaaaagct gcagattgag atggactaat tatctaaggc ctgatattaa 300 gagggggaaa ttcagtatgc aagaagaaca aaccatcatt caacttcatg ctctcttagg 360 gaacaggttt ggtttctttt tcaagtctat ctaaatttta gagttgttgc tgcagtactc 420 agagaaatct aaaagttttg gtacagatag ttttagtagt tttggtatgt caagggagaa 480 agaaaaaaaa ggagagagag agagagaatt tcattctcac aaatagtact actatagcac 540 ttaagtttcc caatagaatt tctctctata tgtgttgatt agtaggttat aataattcct 600 taacatgtag caagtgttca ggtttttgtg tttggtttaa ttactggggt ttcatttgat 660 tattttaaca ttttttaatg agtatgagta caggatttga agaaaactcc gcaagattta 720 tttatttatt tgaatgagaa actgtgatat ctttgcctta ctcccgtaaa aatattttca 780 tttttgaaaa ttactagtac tactcgtata atttatgcta ctattgtatg acacaaaccc 840 ttactataag tttcagtcat tttacaacta ggagcaacta cttatttctt tgcttttcca 900 actcacttgc tgtgcagaat gtcttaaatg cgagggcatc tcaatttcta taaccacata 960 ttctatccca catttccaac acacacaaaa ctttaattgt gctctttgcc atggtcataa 1020 atttactccc tgacacgcaa tagtttgttc aagatggtcc ttaaacgcaa caaaaggatc 1080 ttcttcctca ccgccaagct aaatcaatgg tggccaatga aatgtcattt ctctcttgga 1140 cctgccatac acatttttct taatgttgca ttatagacaa tattaattaa acaaagatcg 1200 catgttgtac tttgtatttt ttttttaaaa ccaaaaaata caaccaataa aatattaaaa 1260 taattttagt atgaatttat taatttatag caatttctct ttttctctat catttcactt 1320 gctctttcca ttatccctgt ccttatatat tttagtaagt tttatgacct tatttaatga 1380 ctttctcgcc aaataaattt taactaatga aagattgtgt tacaagaaat gagttaaaga 1440 ttgtattgct aacgatcctc gtcaatagag tatttatact atagcaagtg tccaaacgtg 1500 tcattattcg attattcaag aagtagttta cagatgtatt cttgggcttt cattgatttt 1560 tatgacattt cagtattatg ttgtgttgtg actcag 1596 <210> 8 <211> 979 <212> DNA <213> Glycine max <400> 8 gtaagaagaa aatcatgaaa agagagaaaa gaagagaggg agatagatat attatagcta 60 gctagataga gattagaagc tatattatta tatacataaa gttatattat ttatattgaa 120 ctaaaagaaa gggtacaagg gaaagatggg aaggccacca tgttgtgata aaggtgtgaa 180 gaaaggacct tggactcctg aagaagacat cattttggtg tcttatattc aggaacatgg 240 tcctggcaat tggaaagctg ttcctgccaa tactggtaat tagtgaatta atcttcttcc 300 actcatcatg tgagatttta atttggtgat ttttgtgatg attgcatatt caactttttt 360 gtgtcttttc ttagcaagtt agggaaaaaa attctgaatt attgtttcat acagctgtga 420 tctgaaatta atggtactct ctttttggtt tggttttcag ggttgtcaag gtgcagtaag 480 agttgtagac ttagatggac taattacctg aggccaggaa tcaaaagggg taacttcaca 540 gaccaagagg agaagatgat tatccatctt caagcacttt tagggaacag gtaaattcat 600 tttatagctt cttaaagttc tttttttgcc ataaacccct agttattgaa tttggcatac 660 catattatat gataataaca catcttttta atataaattt agtccatttt tctttctaat 720 agtttttgcc ataaaacacc tagttattga atttggtacc atatatattt ctttataata 780 tttgattttt tggtgggaat ttaagttctt tggtttttat ttttggactc acatgctaaa 840 ctgaaacaca ttgattatgg tgcagatggg ctgcaatagc tgcttaccta ccacaaagaa 900 cagataatga cataaaaaac tattggaaca catatttgaa aaagaagctg aacaaaaaat 960 tggaagcagg ttctgatca 979 <210> 9 <211> 309 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 9 ggtatggtta tggtataatc acatcacatg tgcaatattt gtctgaacaa aaatatagtc 60 cttgatttgc tttcacttct ctggtgatta tttttgccga tctaatttgc actaattttt 120 agtgttagtc atatcatatg gcctctctta tggtctctct caagaattga atatagagag 180 ccgctgagtt tttaattcag caagtttttg aaaatgttag ttactactcc ctccatggag 240 aattttattt gttgaaatta cgtgagctct aagtaaattt tgtagaattt atataaattt 300 tgtagagat 309 <210> 10 <211> 357 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 10 gttgaacata tgtccatact atgtatacaa atttcttata agaatgtata taaatttttc 60 attaacaaag tcttaacgct gataatgaaa attgaatacg tgtctatact atttatgaat 120 caacttctta acaattgaat gacaatttta tgcattttta ttttattttt ctcgagaata 180 tattctttca cttttaaaca aagctttaat agtaaccgaa aaaaacaaag ctttaattat 240 ggacaactaa ttaactattt ggctcatatg ttgtttcact gtctaatact aacgacaatg 300 agtttattaa atctcattaa cgtcacaact attccaccgg cactgtatgg tatggtt 357 <210> 11 <211> 730 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 11 tatttgaatc aaattttaaa tcttctatac ctcaactcaa tgtctgtcat tcaattggct 60 aactattaaa cttggtaata gctaataaga atataatgga gaatcacctt agaccatttt 120 gtgtgcatcc ttcattgaaa atggaggata accatttgac cataatctct tttattccat 180 aatcgaatca caccgctaag atggtctcat gaatgtattt gaccatcatg gtcctatgtg 240 catataacca ttgattagca tctattgttg tacacactgt aaaattagaa cctctctgac 300 aaacatttgc ttgtttaatc tagattcaaa caaccttttt ggcaaaaaca tgtaggatcg 360 tgtttttttt cttctttgtg aaagtggaaa cgtggattat aagtctaaac aaaaaaaaat 420 taattaatta attccgtata agtggaaaca ttgatttttt gaaattattt tcactatttt 480 agaataatta taatctttta ataaataata atttgtattg acttatatta ttgatactaa 540 aactaatgaa ggaaaatatt gctgatcgag actaaagttg aagaaatgtt tcatacatac 600 gataaaatga aattaaaaaa aattatagag actcaaaata tatttaatcc agtttaatac 660 tataatttta tgaaaattag aatttatgaa ttgcatccta aaaaataact aaactatttt 720 tacattcttt 730 <210> 12 <211> 406 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 12 gagccttctc aaggcatgac caatacaata caaaccctaa tacgattatt gtacttttag 60 caagtacaca aaacaaattt gctattttaa acttcttaac acgtataagt tgacgcatga 120 tagaaaaatc ctattactag ttagtaccta aactattatt aatccatcaa gataagtaga 180 taacccatga gccatcattc tctctcttat ttttaattga attgagggac taacttaata 240 gatttgtaat aattcataga ctacttagta tatttatatg gacaaattga agagattata 300 ataatagttc gggaattaaa ctaatggttt attctaaaca aaaaaaaatt ataatacata 360 acataccatt tttttcggat agacggcgaa tactgatgta acaagt 406 <210> 13 <211> 387 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 13 tatggtaaga tcagtgtttt tcgtcaatct aaccgcaaca catgtcattt ttgttataaa 60 ataaataaat aaaacagtct tttttaatgt ctcctcccgt gggagaccta ttcaagtctc 120 ctaccataaa cggcgccgag attatgtctc taagtctaac catgatgatg ttatggacga 180 cgatgataat gatggagaca tgactgtttt tttttcttag aataaaagag aagagtaatt 240 tagaagtaaa gagaagagta atttagaata aaagaaagta attcggtgtg ggaggtatat 300 agtaagcatt ttgatccaaa gttaatttac ttttatccaa tggttcatat ttattttgcc 360 aaaaaaaaaa aagccatgtc tcctaca 387 <210> 14 <211> 544 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 14 ttcatattta ttttgccaaa aaaaaaaaag ccatgtctcc tacaggaaac agagccttag 60 ctttattgtt aaagagtctg tttctctttt ctgtccacaa cattgaaaaa caacaaagcc 120 atattagctg caaaaatgat cgtcgccgtt ttgaacctca tgtagaataa gcaaaccgat 180 gagggattgc cactagttat tagaaattgt acctaacaac gagtaaatat tagaaattgt 240 ggttgtgtct aacaatactc cacaaaaccg gcttatgagg gattgcctgt tcgggtcatc 300 tttcaaaaga tgtgaaattc tttaacacac cccctcacac cgagcacaat taggcttgga 360 gtgtgtatat aaatcgtgga tcgcttgata gcagaaactt gatatcaagt gatctaacaa 420 atcttaaccc aaactctgat gcaatcttag aaattgtggt tgagccgaac aatacttcac 480 aaaaccggtt tatgggatga tgattgtccc acttataaac acttattcat atcatctcta 540 ttga 544 <210> 15 <211> 457 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 15 taaatcaaat gagttggatt taactcaaac tagacaaaaa ttaattaacc tgataagaaa 60 gtgaaatcat tgtttagttt tttttttttt tgaagaaaaa tcattgttta gtttaaatag 120 tttattaagg gatcatgaaa tgagtggatt tcactaatgt caatatttaa tcataaaatc 180 tgtataataa taataataat aataataata attttgtcaa aaaaaaataa taattttgtc 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ataataataa taataataat aatagtaata ataaatatat 300 tttttgaaac aaaaatattt aataatctgt atttttaata cgtatttata ttttaaattt 360 cttaatcaat atatttatga cagatatatc atcaatatgt agaaggtcat atctagcaaa 420 ctactagtag tagtattaag gagggacaaa taattca 457 <210> 16 <211> 600 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 16 ctttcagggt tgtcaagatg cagcaaaagt tgcagactta gatggactaa ttacctaagg 60 ccaggaatca aacggggtaa cttcactgaa caagaggaga agatgattat ccatcttcaa 120 gatcttttag gaaataggta aaccttttct tcataatttg ctactacaaa aatataaatt 180 agcaacaatt ttttttattt taaggcagca acaaaacttt aagaagtgat aagtaaacta 240 tgtttctaat tctgccatct taattacaaa gaaattagca tttgatttca ttttttcagt 300 ttctaatttt tgtaaaatta aatttatgac aaaagtttga ataatggata tgtgaaacaa 360 acctgttttt aattcaataa aaaaaaatag ttatgaaaga aaaagtgttg gatttttttt 420 cctattttta atttgtgtcc ctatttctat attttttgta tattagactt atcctaaaag 480 gatttgctaa taccctaaaa aattggattt tctaatatgt ttgttttaga atttaattta 540 actttcttga tagaaaataa tataattagg tgcaaaaatt agagacttac atttttttag 600 600 <210> 17 <211> 2059 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 17 gaaaatgtac ctctttttaa atcaggcctt aagtaattaa tccacctaag cctacagctc 60 ttaccacatc tttgaagacc tatgccatgc catgccatgc caataaaata cattatatat 120 caacaacagt ttcttctcta atctcataat tatatgctaa aaggagattg aaatattaaa 180 atttggatta tatataaata tatatacctg cttgcttagg aactgaactc caacatccat 240 gaccatattt agtaatatga ttcaaaagtt tttcatcctc ctcaggtgac catagacctt 300 tcctaagctt ctgcttgtag caacaagagt gtcttcccat ttgtagtttg tttgtggttt 360 ggtccctcaa acttaaaaat acaatgaagt gcgaaagttt ttgataaaca gaaagattgt 420 tggatttgtg cagcaataaa caaagaccgt gacaggtaaa atatgagtga gagagataga 480 gagagagaga ttatattatg aagtgtgaaa gatggaaaat gaagtggcag ctgagaaaat 540 gagttgaggc cccatgaatt atgtcatata gtcattaagg taccttctat ttatcttatt 600 ttttcctttt ttgagaatat acgtgtcctt atgtttcttt atttattttt tctatctttt 660 tatttaaaat gtgtataatg acaagtgaaa tagaatacat catgcattaa aatcaaatta 720 tttgttcatt agattagata tcttgtaatg taataaaaaa gtgaaatgtt tatagaatgg 780 aaggtcattt cgtcatgctt tttccatttt tttttttata aacgttattt tattttttaa 840 agggaaagac ttaatggtac tacgatgcat gagatcaggg tcgtcttaaa caatttgttg 900 gccccgtttt aatcttataa attggccccc ggataaaaat agaaagaaaa aaaacaattt 960 tttaaagtaa attatgataa catcccaata atgtaaataa catcaaaaag tgattttatg 1020 ttcaaatcac taacatcaaa ataaacgagc cactcttcca acattttttg aatagtaacc 1080 acattttcaa gaactccaac acctagcggg agttgaatcc ctgtccatgc ggtcttgtac 1140 gtaacgctct accaccgaag tattcttaac aatttgtcaa gttctctctt tcacctctat 1200 ataacactta ctataggacc ttacatataa aaaaaaaaat atgggcccat agcctgtcag 1260 agcttgatta acgcattaat gaaaaaaaat aatcaaatta caaacttgcc ctttagcttg 1320 actttgattt caaaaagaaa agttggagtt ttttatccaa accaaaaggt gttcaatgct 1380 aaaacacaca ttctattttc ttgatgggag tttcataaca aaactatata tatatatata 1440 tatatatata tatatatata tataagtttt taatagcctt tttaaattgt agaacaagtt 1500 tttatggatg acagttaggg aatacaacca cttttgtaat tacaacaaac caattaaaaa 1560 actaaaattt ctagatgatt gaaatatttt attttttgaa aaataaagtt tatgtgagtt 1620 aggtttcaat aattcataag gatcagagta tacaatattt gtctgaacaa agtcttagcg 1680 ttgataatga aagttgaaca tatgtccata ctatgtatac aaatttctta taagaatgta 1740 tataaatttt tcattaacaa agtcttaacg ctgataatga aaattgaata cgtgtctata 1800 ctatttatga atcaacttct taacaattga atgacaattt tatgcatttt tattttattt 1860 ttctcgagaa tatattcttt cacttttaaa caaagcttta atagtaaccg aaaaaaacaa 1920 agctttaatt atggacaact aattaactat ttggctcata tgttgtttca ctgtctaata 1980 ctaacgacaa tgagtttatt aaatctcatt aacgtcacaa ctattccacc ggcactgtat 2040 ggtatggtta tggtataat 2059 <210> 18 <211> 2059 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 18 caaagattct ttatttcatt atcagtcctc cctggcaatt gtgcagcaat ttgtgaccat 60 ctaagaaaac acatcatatg catgtcaata aggtttgaaa aataaaaaga atgatccaac 120 aaccacataa caattaaaaa atacgccaga gtctaacgca agtggttggt gtgtcgtgtg 180 tgagtgttgt aaactctggt aaatcatact taaaaaagaa ggattgaatt taattaccta 240 ttccctagta ctgaatgaag ttcaatgatg agattttctt cttcttgtga aaatgtacct 300 ctttttaaat caggccttaa gtaattaatc cacctaagcc tacagctctt accacatctt 360 tgaagaccta tgccatgcca tgccatgcca ataaaataca ttatatatca acaacagttt 420 cttctctaat ctcataatta tatgctaaaa ggagattgaa atattaaaat ttggattata 480 tataaatata tatacctgct tgcttaggaa ctgaactcca acatccatga ccatatttag 540 taatatgatt caaaagtttt tcatcctcct caggtgacca tagacctttc ctaagcttct 600 gcttgtagca acaagagtgt cttcccattt gtagtttgtt tgtggtttgg tccctcaaac 660 ttaaaaatac aatgaagtgc gaaagttttt gataaacaga aagattgttg gatttgtgca 720 gcaataaaca aagaccgtga caggtaaaat atgagtgaga gagatagaga gagagagatt 780 atattatgaa gtgtgaaaga tggaaaatga agtggcagct gagaaaatga gttgaggccc 840 catgaattat gtcatatagt cattaaggta ccttctattt atcttatttt ttcctttttt 900 gagaatatac gtgtccttat gtttctttat ttattttttc tatcttttta tttaaaatgt 960 gtataatgac aagtgaaata gaatacatca tgcattaaaa tcaaattatt tgttcattag 1020 attagatatc ttgtaatgta ataaaaaagt gaaatgttta tagaatggaa ggtcatttcg 1080 tcatgctttt tccatttttt tttttataaa cgttatttta ttttttaaag ggaaagactt 1140 aatggtacta cgatgcatga gatcagggtc gtcttaaaca atttgttggc cccgttttaa 1200 tcttataaat tggcccccgg ataaaaatag aaagaaaaaa aacaattttt taaagtaaat 1260 tatgataaca tcccaataat gtaaataaca tcaaaaagtg attttatgtt caaatcacta 1320 acatcaaaat aaacgagcca ctcttccaac attttttgaa tagtaaccac attttcaaga 1380 actccaacac ctagcgggag ttgaatccct gtccatgcgg tcttgtacgt aacgctctac 1440 caccgaagta ttcttaacaa tttgtcaagt tctctctttc acctctatat aacacttact 1500 ataggacctt acatataaaa aaaaaaatat gggcccatag cctgtcagag cttgattaac 1560 gcattaatga aaaaaaataa tcaaattaca aacttgccct ttagcttgac tttgatttca 1620 aaaagaaaag ttggagtttt ttatccaaac caaaaggtgt tcaatgctaa aacacacatt 1680 ctattttctt gatgggagtt tcataacaaa actatatata tatatatata tatatatata 1740 tatatatata taagttttta atagcctttt taaattgtag aacaagtttt tatggatgac 1800 agttagggaa tacaaccact tttgtaatta caacaaacca attaaaaaac taaaatttct 1860 agatgattga aatattttat tttttgaaaa ataaagttta tgtgagttag gtttcaataa 1920 ttcataagga tcagagtata caatatttgt ctgaacaaag tcttagcgtt gataatgaaa 1980 gttgaacata tgtccatact atgtatacaa atttcttata agaatgtata taaatttttc 2040 attaacaaag tcttaacgc 2059 <210> 19 <211> 2059 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 19 cgtaaatcgg gacgcaagta gtttaaccac cttaatctac aacttttacc acttctcctc 60 aaacctgtat aattaattag ttttgtttag aatagattat gagaatcaat aagctattca 120 tgcagctatg tcataagcta ataaataaaa gagctagaag aaaatatata aatatataca 180 tgcctgcaga agatgcaagg gtattccagt gaccttcacc gtgtattgta atgtaatcaa 240 ccagaatggt gtcctcttct aacgtccaag gaccttttct tacccctgtc tcattttcct 300 ttgcagaccc acctttctga accttaatat ccatacctct catgtatgtg tagctctcaa 360 taattgttac tgaaattaaa agtgatttag ttttgtgaaa ggaagaacaa acagtatgaa 420 atatatatga gaaacgaaga aacgtgtaag attttgattt aattgatggt ttcacttatt 480 gggggcatgt ggagttattg tgtatatata ataatagagt cggataagga taggtatact 540 tcaaggtttg cactagtcta caaaatataa attaaaaggg tacggaatag tgacgacttg 600 gtacacgaat aatgcaccag tttgagtaaa tttaattaat attactactt taggattaag 660 atggaaccaa gcttatagtt tggggtttga ctggttgact cttttgttta tatttttggt 720 aagtcatgcg catggaaata ttgatgtcag tgaatactct tttcacaatc taaactgatt 780 tggctttagc tctatcagct cactgttaag aaagacaaat tttactaaaa aataataata 840 gaataaattg ttattgtaaa tttgtaatct catattgtta ttccctaact aataattaaa 900 ctcatgtgat taataaattt taattgagaa ggattcttta gaagatttga attcaaattc 960 atattcgggc agatggagac attaatgaaa gtaaaaaaaa aataaaaatt agagagaaca 1020 atcaatttag ttattatact atcattttct catcaatttg gtcttaaaat taataaattt 1080 aagtaaaaaa tccataattt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gggacaagcc aatctaaatt 1140 gaggagagtc aaacttggac cttaaaagta atagacgttc aaaccaaaac caactaaagt 1200 gagtttaaaa gaaattccat aaattttact ctcatccatc aatttgatga tctctcaatt 1260 aattagttta tgtatcaaat tgatgatgaa attatagtac aagacatttc acttgatttt 1320 aaaagtttag gaatcaaatt gacaattgat agtttatgaa ctaaatttac ttattattta 1380 tattatgtgt gagattaccg tgtaatattt gttttttttc aaagcaacta tagattgttg 1440 gttaataaag gagatttttt ccttcttttt cctactaatc cagaatggca ttgacggtag 1500 aatgagaagc aacactaaca cagcagccac caccttttca cacaagtgca taaatttata 1560 tcattcacga ttcttaagtg tttgtttgtt tcatgtaatg ttgcatcctg agaattacat 1620 ttgggcacta aaaagcttag tagtgaatag aaagacgaag aaatagactt gttgtgatta 1680 actcattaat taacgcagga ctagaaggaa gaaaattagt tgcgataatc attgcacgtt 1740 ttcactttga ccaaaacact aagaattgga aacaatccca tcgcagtcgc acgatcatgt 1800 ggatttggtt aaatacttcg tattgtctca ataataaaca aaaaattggt caaaatgccc 1860 ataagacacg ttcaagctcc aagttttcaa ggacatcata ccatcgacga caatgtacgg 1920 tgaattgttc cctccatacc caagttatat aagtaaaaaa aatatcaaag aaagttcatg 1980 tatttgaatc aaattttaaa tcttctatac ctcaactcaa tgtctgtcat tcaattggct 2040 aactattaaa cttggtaat 2059 <210> 20 <211> 2050 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 20 aggagtccat ggtccttttt taacaccttc tttgtcacaa caaggtggtc ttcccatgtt 60 tctttgtttc tcttttactt ttagtaacac ttgtatatgt tgccactaat ttctattcta 120 tagacctttt tcttcctctt cctctctcgg tgtatgatca cttatcttta atttttagtt 180 ctctctaaaa cctcttgatt tgataggttt caaaaggcaa gtgtccaagc ctaacctttc 240 catggtgtaa atatatagct aagaaaatag ggtgtattta gcataagcta ggatttttta 300 tttttttatt tttttttaaa gataagctag gaaactgact taaaaaagta gagaaaaaat 360 aaagagtcaa aatttgacag caaagagcat taactgaagg aaggaaaaag ctaaattatt 420 tactatagtt atgttgtgta ccactcaaaa ccgcgtagag cattgaatgt gtagctctat 480 tacactggga aagctcaatt ttatttcagc ttttaaagtt tctataaatt aacacaaaca 540 tgtcattaat tgtaaatttg tgatatagct gacttttgca agaaagctag taattaagct 600 atcaccatta tgtctttcta tttgcctacc tggtgatcac caatgaacaa gccctttcta 660 gatactttaa cttgtctata aaatcaatta attgcattta tattttgtta attagacagt 720 gactaaaact gacacccttg cttcattcta gaaagggata gctgatctat ttgcattatt 780 gtagtagaat tctaatatcc catattttgt taaagaaaaa tatactagta taatttaaga 840 atggtatttt tctttaagag aaaatatact agtaatatcg cattgttact gatttttgtg 900 aaataaaata ttagtcgttt aatgtttgtg cacgattatt aaggaaatga ttaattgtgt 960 tgatttcaac ggtaaaatta gtcatttact acaacaccct tattaattgt agttagtgga 1020 gtagttaagt aggatgaaat tcaataaata agggtataat agtgaaaaaa aataataaat 1080 gctgcattgg tattgtaaag tgtcaattat tttgaaaaaa agaaaaaatg ctaaagagat 1140 aataagtggg aaacggatgg agtatttttt atttaagaga aaaaaaatag gattatcaaa 1200 taaaataaac gtgtttaaat tttgggtttt gatgccctga gggcactttg ttaaggatac 1260 aaaaggggat gcttaacaag aagtgatctt tgttaagtaa aaaaccttta aggaattcca 1320 taagagatgc tctaagagca ctcgttagca cttcccttaa ataaaattat cactttataa 1380 caaaaaattt cagagattac aacttgtaaa taaaattaaa tatgtttcaa atgagtagtt 1440 gttccgagta gcttttccat aaaactaatt tttcataact ggttctaaaa aaaatatttt 1500 cattttgata atgaaatata gaataacttc tgctttaaaa aaaaaaaatc tccatcaatt 1560 tggtcttaga gttatcaccc tcttttttaa ttaatcttcg gactataaaa atatatacta 1620 atgagtttgt ctgacatgta caatattaca catgatatgg tagctaaaaa taacaacttt 1680 ttatttaaaa attatatact ccaatactaa ttttgaactt cttatttgag cttccaaaat 1740 ggaccgacaa tatactctta cgaatctaaa agacctccag aaggactttt agactctttt 1800 agaggcctca tcgtcctcca taagggctat gaggcccaag gcgcgccctc cccagggcgt 1860 cgactcaatc tgcttctagg aacctctaga aagccgccca aatacttaga tacccctgtt 1920 atttactgcc taagtaacca caaatcagac ccatagagag ctataaatac caacccttga 1980 gagccttctc aaggcatgac caatacaata caaaccctaa tacgattatt gtacttttag 2040 caagtacaca 2050 <210> 21 <211> 2057 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 21 tccggcctta gataattagt ccatcttagt ctgcagctct tgccacacct ctcaagtcct 60 gcaaaaaaat aaccaatttc ttacgatctt taacggacta tgaagcacgg tcgctccttg 120 aataagaagt gtcaccgaca catataatta cactaaatta cgtgattttc taaaattatc 180 agcggtgtcg gcgtgtcagt atctatatcc atgcttcata gtctacaacc gactttacgg 240 tgtagcccat ccattttgga gggaagaact ataaacattt tcaacaatgt tacttatata 300 tattatcaac ataattaagt gaaattacca gcttttgtag gcaaagaacg ccagcttcca 360 tgaccatgtt cttcaatgta tgataagagc ttttgatctt cctcagatgt ccatggccct 420 ttctttaaac caaccttttc acaacatggt gatctcccca ttggaaatgt tctaatgaaa 480 aactatatag taaattgtgt atatggttga gaagttggag gagaaacttg gaagagaaag 540 agaaagaaag gagaatatat aagttgatca agtagctatg tacaagaaat taatgagatg 600 ggcagagaag aatttgtcag cggcataaaa gggataagaa attaaattga tactcatcaa 660 tataaatcat tatacgagga gaatagtaaa actttaattt aactgcagta tagtacagca 720 cattcactac actttgcgca ttttttgctg catcatttat ttgcagtaca ttctacattt 780 atatgcatat aaattgggtg gtttttatga tagacaaact tacataaaca ttttttttgg 840 aaagatatct actttttttt taaggaaagg aaagatatct acttaacggc gagtaaatat 900 atttttttaa acaggtaaaa tgataatatt atcacaaaaa aaaacacaat atcaccaaat 960 cgatttagct taaaaaaaca caatatctac tttagtacaa gatatgcgag gaggaaaata 1020 gttttatatc accaaatcga aaggataaaa cataacaatt cagtcaagac ccaaacaagc 1080 aaagggttgt ttcaaccaca tcaaatgacc aaaaggaaaa ttaacatttt gagctttcag 1140 ccaccaatag gtagaaactt tcactttatc catcagcttc agaatagatt tagctttatg 1200 gctcaggcta cggtacatga cctcaatggg tctcctaccg taggtgactt gacttttttt 1260 ttttttacaa aattgatgtc aaccattgga tgtgcttgaa aacttttgaa gaccatagta 1320 ttattatact ctttaaacat tagattattt tcacactatg ttccatcatc tttctctttc 1380 cctctccata tctcttactc gcccaacaac aacaacaacg cgatgcaccg ccaccgaaaa 1440 atcacaacga caatgcgccg gaaaatcaca acaacaacga cgaatttttg gaaatcttaa 1500 tccaatcctt tcaacccaaa attgcagaaa acaacattca ttaaactcaa atttcattta 1560 atctaattca cctgaaaaca aaattgcaga aaatattgat ttcttaatta ttcaattcat 1620 tcaacccaaa gttcacatat tcatcactaa actcagatga aagtgattaa atccgtcgcc 1680 agaccaaatg ttacacaaca aaacaatcaa aatcggaatg gaaaatctca cagaactcag 1740 atctggagag ggatggtgtt taagttcaga tgtgaacaca atctggtcaa tggaaaatta 1800 cgaatgaaaa tagaataaaa agaacaaaaa aagatgtgtt ggtgttaaaa aaaaaaacga 1860 cgatttgtgt tggaggtata acaatcaaca gaaagtgcag caacaacaat ggagttgcta 1920 cagtacacgt ctctcgctta gatctaccaa atgaaaaaaa tatatatagt gtagaaggat 1980 tatggtaaga tcagtgtttt tcgtcaatct aaccgcaaca catgtcattt ttgttataaa 2040 ataaataaat aaaacag 2057 <210> 22 <211> 2054 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 22 cagatgtcca tggccctttc tttaaaccaa ccttttcaca acatggtgat ctccccattg 60 gaaatgttct aatgaaaaac tatatagtaa attgtgtata tggttgagaa gttggaggag 120 aaacttggaa gagaaagaga aagaaaggag aatatataag ttgatcaagt agctatgtac 180 aagaaattaa tgagatgggc agagaagaat ttgtcagcgg cataaaaggg ataagaaatt 240 aaattgatac tcatcaatat aaatcattat acgaggagaa tagtaaaact ttaatttaac 300 tgcagtatag tacagcacat tcactacact ttgcgcattt tttgctgcat catttatttg 360 cagtacattc tacatttata tgcatataaa ttgggtggtt tttatgatag acaaacttac 420 ataaacattt tttttggaaa gatatctact ttttttttaa ggaaaggaaa gatatctact 480 taacggcgag taaatatatt tttttaaaca ggtaaaatga taatattatc acaaaaaaaa 540 acacaatatc accaaatcga tttagcttaa aaaaacacaa tatctacttt agtacaagat 600 atgcgaggag gaaaatagtt ttatatcacc aaatcgaaag gataaaacat aacaattcag 660 tcaagaccca aacaagcaaa gggttgtttc aaccacatca aatgaccaaa aggaaaatta 720 acattttgag ctttcagcca ccaataggta gaaactttca ctttatccat cagcttcaga 780 atagatttag ctttatggct caggctacgg tacatgacct caatgggtct cctaccgtag 840 gtgacttgac tttttttttt tttacaaaat tgatgtcaac cattggatgt gcttgaaaac 900 ttttgaagac catagtatta ttatactctt taaacattag attattttca cactatgttc 960 catcatcttt ctctttccct ctccatatct cttactcgcc caacaacaac aacaacgcga 1020 tgcaccgcca ccgaaaaatc acaacgacaa tgcgccggaa aatcacaaca acaacgacga 1080 atttttggaa atcttaatcc aatcctttca acccaaaatt gcagaaaaca acattcatta 1140 aactcaaatt tcatttaatc taattcacct gaaaacaaaa ttgcagaaaa tattgatttc 1200 ttaattattc aattcattca acccaaagtt cacatattca tcactaaact cagatgaaag 1260 tgattaaatc cgtcgccaga ccaaatgtta cacaacaaaa caatcaaaat cggaatggaa 1320 aatctcacag aactcagatc tggagaggga tggtgtttaa gttcagatgt gaacacaatc 1380 tggtcaatgg aaaattacga atgaaaatag aataaaaaga acaaaaaaag atgtgttggt 1440 gttaaaaaaa aaaacgacga tttgtgttgg aggtataaca atcaacagaa agtgcagcaa 1500 caacaatgga gttgctacag tacacgtctc tcgcttagat ctaccaaatg aaaaaaatat 1560 atatagtgta gaaggattat ggtaagatca gtgtttttcg tcaatctaac cgcaacacat 1620 gtcatttttg ttataaaata aataaataaa acagtctttt ttaatgtctc ctcccgtggg 1680 agacctattc aagtctccta ccataaacgg cgccgagatt atgtctctaa gtctaaccat 1740 gatgatgtta tggacgacga tgataatgat ggagacatga ctgttttttt ttcttagaat 1800 aaaagagaag agtaatttag aagtaaagag aagagtaatt tagaataaaa gaaagtaatt 1860 cggtgtggga ggtatatagt aagcattttg atccaaagtt aatttacttt tatccaatgg 1920 ttcatattta ttttgccaaa aaaaaaaaag ccatgtctcc tacaggaaac agagccttag 1980 ctttattgtt aaagagtctg tttctctttt ctgtccacaa cattgaaaaa caacaaagcc 2040 atattagctg caaa 2054 <210> 23 <211> 2057 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 23 atatctggcc taagatagtt agtccatctt aatctgcagc tcttaccaca tctttgaagc 60 cctaatttac aatatcacaa aaaccttcat taattaacaa cattaaaaac atgttatcat 120 attaaaataa aaaccttaaa cactatgaac atgttatata tactatcata tgtattattt 180 atattcataa catgtatata atatatcaaa gtgaacaaga aaaactaaac attttttttt 240 aataagttaa aatgagatat attacgaaca acagaaaagc aaaggcatca ttaccagctt 300 tagcgggcaa agcacgccaa cttccatgac catgttcatc aatataagct aagagttttt 360 gatcttcttc tggagtccat ggacctttct ttaaaccaac tttgtcacaa catggtgaac 420 gtcccatttt gtagtgagtt taacactaaa gactatagta gtttttgctc ttatttatat 480 agaacacaaa gaagaagaga agagaaagag aaatttaaag aagtacttaa cctatggtaa 540 gatagaaaaa aaagagagaa ggacataaga attttaaatg aagagatggg cagagaagaa 600 aggtcagcga cataaatggg acaataaact aatttaaccg tgtctatggg atcatatcat 660 tgttacaaaa gtacccttca ctttcaagtg aaattatctt ctatggtata ttccactttt 720 ttaggcttca tggataatat gggaaataga tcaatacttt acgctaacat tgttgtgcaa 780 ttatcaccga tcttgatcgt ttgatcttaa atcataagta gagattgttt aaaattgatt 840 tgataaaaat gttatataag tggtttgatc tcaaattaat aatcgagatt gttaatgtgt 900 tcggatctgt aaatatgaaa aatcttttaa tgaaaaaaaa tgtgaccata atctaaggac 960 tataagtttt cttatatcta taagtgtata atcacatttt ttttcctaat gctaaaaatt 1020 atgacggatt taatagtcac aaaatcatgt tatatgtacg aactttccac ttttgttaat 1080 agagactaat atgagttaga gatcaaattt tcttcatcca taagagtcgg agattgaacc 1140 ccaacaactt attaagaggt ctaaatcatt tttaatttgg actaactcat tgttgatttt 1200 gcaatacaac attttaggta tgtagatgga gtaacaaaga ccatctaaaa cccacgaaca 1260 actatgatac tctgaatttg aactcaggtt aagttgtcaa atataacaat atcaatatta 1320 ccaattgtta atcacatgtg caatacaatt ttgatggaag gataaaatgg tagattgggg 1380 aaattaagtg ataattgtct ttttatgtta ttgtcatcat tattattatt acatggggta 1440 gaattttaaa actatttaca gcaatgagct accaagttga tagccatagt tttaagagat 1500 acgtcaccac tcaccaagta tttatggcat tgttagagcc ggtttttaat tattccatca 1560 tatgggtcca tcaatccaag tttttttttt ctttatattt tcttttgtct atccaccaat 1620 cacagtagga atattattta ctttttgatg aattttttgg tgttaacttt ttgatgattt 1680 tatattaaat tatttttcta ctacttttaa ttgaaaaata catttttcca cactctcttt 1740 aactttaatt tctcaatcaa gaaaaatata atcatatata atgtggaaaa gtatatatta 1800 acccttccat ttattttctt gacccggaag aagaacacaa ctagtttaat aaagggtttc 1860 aaattagggt tcatttaaat gatcattagt atatggtcta aaatatagct attctttaat 1920 acaccatcgt cgaaaggaag gaaaaaaatt attacttaat aatgacgggt aaaagtgatt 1980 taaatcaaat gagttggatt taactcaaac tagacaaaaa ttaattaacc tgataagaaa 2040 gtgaaatcat tgtttag 2057 <210> 24 <211> 2766 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 24 cttgttacat cagtattcgc cgtctatccg aaaaaaatgg tatgttatgt attataattt 60 ttttttgttt agaataaacc attagtttaa ttcccgaact attattataa tctcttcaat 120 ttgtccatat aaatatacta agtagtctat gaattattac aaatctatta agttagtccc 180 tcaattcaat taaaaataag agagagaatg atggctcatg ggttatctac ttatcttgat 240 ggattaataa tagtttaggt actaactagt aataggattt ttctatcatg cgtcaactta 300 tacgtgttaa gaagtttaaa atagcaaatt tgttttgtgt acttgctaaa agtacaataa 360 tcgtattagg gtttgtattg tattggtcat gccttgagaa ggctctcaag ggttggtatt 420 tatagctctc tatgggtctg atttgtggtt acttaggcag taaataacag gggtatctaa 480 gtatttgggc ggctttctag aggttcctag aagcagattg agtcgacgcc ctggggaggg 540 cgcgccttgg gcctcatagc ccttatggag gacgatgagg cctctaaaag agtctaaaag 600 tccttctgga ggtcttttag attcgtaaga gtatattgtc ggtccatttt ggaagctcaa 660 ataagaagtt caaaattagt attggagtat ataattttta aataaaaagt tgttattttt 720 agctaccata tcatgtgtaa tattgtacat gtcagacaaa ctcattagta tatattttta 780 tagtccgaag attaattaaa aaagagggtg ataactctaa gaccaaattg atggagattt 840 ttttttttta aagcagaagt tattctatat ttcattatca aaatgaaaat atttttttta 900 gaaccagtta tgaaaaatta gttttatgga aaagctactc ggaacaacta ctcatttgaa 960 acatatttaa ttttatttac aagttgtaat ctctgaaatt ttttgttata aagtgataat 1020 tttatttaag ggaagtgcta acgagtgctc ttagagcatc tcttatggaa ttccttaaag 1080 gttttttact taacaaagat cacttcttgt taagcatccc cttttgtatc cttaacaaag 1140 tgccctcagg gcatcaaaac ccaaaattta aacacgttta ttttatttga taatcctatt 1200 ttttttctct taaataaaaa atactccatc cgtttcccac ttattatctc tttagcattt 1260 tttctttttt tcaaaataat tgacacttta caataccaat gcagcattta ttattttttt 1320 tcactattat acccttattt attgaatttc atcctactta actactccac taactacaat 1380 taataagggt gttgtagtaa atgactaatt ttaccgttga aatcaacaca attaatcatt 1440 tccttaataa tcgtgcacaa acattaaacg actaatattt tatttcacaa aaatcagtaa 1500 caatgcgata ttactagtat attttctctt aaagaaaaat accattctta aattatacta 1560 gtatattttt ctttaacaaa atatgggata ttagaattct actacaataa tgcaaataga 1620 tcagctatcc ctttctagaa tgaagcaagg gtgtcagttt tagtcactgt ctaattaaca 1680 aaatataaat gcaattaatt gattttatag acaagttaaa gtatctagaa agggcttgtt 1740 cattggtgat caccaggtag gcaaatagaa agacataatg gtgatagctt aattactagc 1800 tttcttgcaa aagtcagcta tatcacaaat ttacaattaa tgacatgttt gtgttaattt 1860 atagaaactt taaaagctga aataaaattg agctttccca gtgtaataga gctacacatt 1920 caatgctcta cgcggttttg agtggtacac aacataacta tagtaaataa tttagctttt 1980 tccttccttc agttaatgct ctttgctgtc aaattttgac tctttatttt ttctctactt 2040 ttttaagtca gtttcctagc ttatctttaa aaaaaaataa aaaaataaaa aatcctagct 2100 tatgctaaat acaccctatt ttcttagcta tatatttaca ccatggaaag gttaggcttg 2160 gacacttgcc ttttgaaacc tatcaaatca agaggtttta gagagaacta aaaattaaag 2220 ataagtgatc atacaccgag agaggaagag gaagaaaaag gtctatagaa tagaaattag 2280 tggcaacata tacaagtgtt actaaaagta aaagagaaac aaagaaacat gggaagacca 2340 ccttgttgtg acaaagaagg tgttaaaaaa ggaccatgga ctcctgaaga agatatcata 2400 cttgttactt atatacaaga acatggtcct ggaaattgga gggctgttcc aaccaagaca 2460 ggttaataat agttcataac tttaagaatt gcaatatttt ttcattaaaa ttatatttat 2520 tggctttttt ctttgttcta tagtatatca tagatcatta ataggagaag ttgtggatca 2580 ttaaacttgg ttttattttt attacttaac tggatctgaa tttaagtgat ttattttttc 2640 ttattatttt tattttatat acattgaagt gattaattta ttttattttt gttgtttaat 2700 ctttcagggt tgtcaagatg cagcaaaagt tgcagactta gatggactaa ttacctaagg 2760 ccagga 2766 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 tccacctaag cctacagctc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ccggtggaat agttgtgacg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 atttcattat cagtcctccc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 aacgctaaga ctttgttcag 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 gtaaatcggg acgcaagtag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 atggagggaa caattcaccg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 cacaacaagg tggtcttccc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 tttgggcggc tttctagagg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 cttagtctgc agctcttgcc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 cgagagacgt gtactgtagc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 tcacaacatg gtgatctccc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 actatatacc tcccacaccg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 agtccatctt aatctgcagc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ttccttcctt tcgacgatgg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 tggtcatgcc ttgagaaggc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 cctgtcttgg ttggaacagc 20 <210> 41 <211> 101 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 41 cttcgatgga ccaattatct aagaccggac atcaagagag gaagattctc gttcgaggaa 60 gaagaaacta tcattcagct acacagtgtt atgggaaaca a 101

Claims

(1) 콩의 품종별 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
(2) 콩(Gycine max)의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 서열번호 41로 기재되는 애기장대(Arabidopsis)의 MYB R2R3 반복서열과 유사한 염기서열을 갖는 콩의 유사 MYB 유전자를 발굴하는 단계;
(3) Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (2) 단계에서 발굴한 콩의 MYB 유전자와 유사한 염기서열을 갖는 유전자를 찾아내는 단계;
(4) 상기 Medicago truncatula의 DNA 염기서열 데이터베이스로부터 상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자의 프로모터 부위를 발굴하는 단계;
(5) 상기 프로모터의 특정 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머(primer)를 제작하는 단계;
(6) 상기 (1) 단계의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, (5) 단계의 프라이머를 이용하여 특정 유전자의 프로모터 부위를 증폭하는 단계; 및
(7) 상기 증폭된 특정 유전자의 프로모터 부위에서 다형성을 관찰, 분석하여 계통 간 분자마커로 사용될 수 있는 패턴을 확인하는 단계;
를 포함하는 분자마커 개발 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (4) 단계는 (3) 단계에서 찾아낸 유전자 염기서열의 5' 방향 상위 1.5 ~ 3 Kb 부위에서 프로모터를 발굴하는 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (4) 단계는 특정 유전자의 프로모터가 포함되는 개시코돈으로부터 5' 방향으로 10 Kb 내부에서 복수의 프라이머를 제작하는 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 콩의 유사 MYB 유전자는 서열번호 1 내지 8로 기재되는 염기서열 중에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (3) 단계에서 찾아낸 유전자는 서열번호 9 내지 16으로 기재되는 염기서열 중에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (4) 단계에서 발굴한 프로모터 부위는서열번호 17 내지 24로 기재되는 염기서열 중에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발 방법.
제 6항에 있어서,
상기 서열번호 17로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 25 및 26으로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
제 6항에 있어서,
상기 서열번호 18로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 27 및 28로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
제 6항에 있어서,
상기 서열번호 19로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 29 및 30으로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
제 6항에 있어서,
상기 서열번호 20으로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 31 및 32로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
제 6항에 있어서,
상기 서열번호 21로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 33 및 34로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
제 6항에 있어서,
상기 서열번호 22로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 35 및 36으로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
제 6항에 있어서,
상기 서열번호 23으로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 37 및 38로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
제 6항에 있어서,
상기 서열번호 24로 기재되는 프로모터 부위를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 39 및 40으로 기재되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 분자마커 개발방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법으로 제작된 콩의 점무늬병 저항성 관련 유전자 특이적 분자마커.