KR20120057828A - 은행나무과의 형성층 유래 식물줄기세포를 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 항염증 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 DDS를 이용해 궤양성 대장염을 유발시킨 마우스 모델에 대해서도 우수한 항염증 효과를 가지는 것으로 확인된바, 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로서 유용하다.

Description

은행나무과의 형성층 유래 식물줄기세포를 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물{Anti-inflammatory Composition Comprising Plant Stem Cell Derived from Cambium of Family Ginkgoaceae}
본 발명은 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
염증(inflammation)은 병원체의 침입 또는 손상된 조직 제거를 개시하기 위해 상처부위에 대해 나타나는 지역적인 반응이다. 염증의 긍정적인 역할에도 불구하고 인간질병을 위한 가장 일반적인 발병 메커니즘의 하나가 되었다. 활성화된 백혈구(monocytes) 및 대식세포에 의한 산화질소(NO)의 생성이 강력한 염증 반응을 개시하고, 세균 병원체에 대한 초기 면역반응에서 가장 중요한 부분이 된다 (Bogdan C., Nat . Immunol., 2:907, 2001).
염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다. 따라서, 부작용 없이 과도하고 지속적인 염증 반응을 예방할 수 있는 천연 항염증제의 개발 또한 요구되었다.
이에 본 발명자들은 기존 항염증제의 부작용을 최소화하고, 항염증 활성이 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 은행나무과 은행나무속의 은행나무의 형성층 유래 줄기세포와 그 배양액이 우수한 항염증 효과가 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 항염증 활성을 나타내는 천연물 유래 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 은행나무과의 형성층에서 유래되고, 탈분화를 거치지 않은 선천적 미분화세포인 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 항염증 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 염증의 예방 또는 개선용 기능성식품을 제공한다.
본 발명은 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 조성물은 DDS를 이용해 궤양성 대장염을 유발시킨 마우스 모델에 대해서도 우수한 항염증 효과를 가지는 것으로 확인된바, 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물로서 유용하다.
도 1은 재료식물(은행나무)의 횡단면에서 형성층을 관찰한 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 줄기세포의 유도 및 분리 사진으로, 2A는 줄기세포(화살표)와 사부(phloem) 세포(별표)의 극히 다른 형태를 보이는 사진이고, 2B는 줄기세포를 분리한 후 배양 3주 후의 사진이다 (스케일 바: 1 mm).
도 3은 본 발명에 따른 줄기세포(A) 및 은행나무의 수피 절편체 유도 캘러스(B)의 고체 배양 시 사진이다 (스케일 바: 0.25 mm).
도 4는 본 배양과정의 줄기세포(A) 및 은행나무의 수피 조직에서 유도한 캘러스(B)의 세포응집정도를 관찰한 현미경 사진이다 (×100, 스케일 바: 50 ㎛).
도 5는 본 발명에 따른 줄기세포(B) 및 은행나무 체세포(B)의 현미경 사진으로 좌측하단의 스케일 바는 15 ㎛이다.
도 6은 Neutral red를 이용하여 액포를 염색 후 관찰한 본 발명에 따른 줄기세포(A) 및 은행나무 수피 조직에서 유도한 캘러스(B)의 현미경 사진으로, 우측하단의 스케일 바는 25 ㎛이다.
도 7은 본 발명에 따른 줄기세포(A) 및 은행나무 수피 조직에서 유도한 캘러스(B)의 미토콘드리아를 관찰한 사진으로 좌측하단의 스케일 바는 15 ㎛이다.
도 8은 본 발명에 따른 줄기세포의 생물반응기에서의 세포 생장곡선을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 줄기세포(stem cell) 및 은행나무 수피 조직에서 유도한 캘러스(callus)의 증식률을 나타낸 그래프이다.
도 10은 3 L 공기부양형 생물반응기(A), 20 L 공기부양형 생물반응기(B) 및 250 L 공기부양형 생물반응기(C)에서 대량배양공정(scale-up process)을 나타내는 사진이다.
도 11은 본 발명에 따른 줄기세포(stem cell) 및 은행나무 수피 조직에서 유도한 캘러스(callus)의 동결보존 후 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 줄기세포의 에탄올 추출물에 대하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 수득한 120개의 분획을 TLC 분석을 통하여 각 유사패턴을 가진 7개 분획을 획득한 결과이다.
도 13은 RAW 264.7 macrophage cell line에 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 분획 처리 후 MTT 분석을 통하여 세포생존율을 조사한 결과 그래프이다 (** p<0.01).
도 14는 RAW 264.7 macrophage cell line에 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 분획 처리 후 nitrite 농도 측정을 통해 NO 활성 억제를 확인한 그래프이다 (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 15는 RAW 264.7 macrophage cell line에 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 분획 처리 후 LPS 처리에 의한 iNOS 및 COX-2 유전자 발현량을 나타낸다.
도 16은 RAW 264.7 macrophage cell line에 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 분획 처리 후 LPS 처리에 의한 ERK 및 p38 MAP kinase 활성화 정도를 웨스턴 블라팅의 의해 확인한 사진이다.
도 17은 RAW 264.7 macrophage cell line에 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 분획 처리 후 LPS 처리에 의한 IκB 분해와 NF-κB 활성화 정도를 웨스턴 블라팅의 의해 확인한 사진이다.
도 18은 RAW 264.7 macrophage cell line에 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 분획 처리 후 LPS 처리에 의한 IL-6 (A)와 TNF-α의 발현 저해 효과를 확인한 그래프이다 (* p<0.05, ** p<0.01).
도 19는 Mouse 간에서의 Normal control, vitamin C 및 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 처리 시 GSH 농도 (A), SOD 활성 (B), catalase 활성 (C), GPx 활성 (D)를 나타내는 그래프이다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 20은 Mouse 혈액에서의 Normal control, vitamin C 및 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 처리 시 ALT 활성 (A), ALP 활성 (B), AST 활성 (C), LDH 활성 (D)를 나타내는 그래프이다(* p<0.05).
도 21은 DDS 염증모델에서의 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 투여가 장내 염증과 체중에 미치는 영향을 나타낸다.
도 22는 DDS 염증모델에서의 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 투여가 대장 내 IgA 농도에 미치는 영향을 나타낸다 (* p<0.05, ** p<0.01).
도 23은 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 MLN lymphocyte 배양액에서 cytokine 농도에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다 (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 24는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 혈액 내 IgG 와 IgA 농도에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다 (* p<0.05).
도 25는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 splenocyte에서 cytokine 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다 (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서, 유관속 "형성층"은 식물의 유관속 조직(vascular tissue) 내에 위치하는 측재분열조직으로 줄기와 뿌리에 위치한다. 형성층의 활동에 의해 식물의 비대생장이 일어나며, 그 결과 11,000년 이상의 연륜을 가진 거대 식물체가 존재할 수 있게 된다. 발생학적으로 유관속 형성층은 전형성층으로부터 기원되므로 분열조직적 연속성을 유지하면서 점진적으로 분화된 동일 분열조직으로 편의상 구분될 뿐으로 (식물형태학, 이재두 외 7인 공저, 아카데미 서적, 제10장, 1993), 본 발명에 있어서 형성층은 전형성층을 포함하는 것으로 해석된다. 이러한 형성층과 전형성층은 동일한 1기 분열조직으로서, 본 발명에 있어서 형성층 및 전형성층 조직을 사용하여 동일한 효과를 얻을 것임은 자명한 사항이다.
본원에서 "파쇄물"이란 세포를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 세포주의 "추출물"이란 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로, 증류 또는 증발을 이용하여 농축될 수 있다. 또한, 세포주 "배양액"이란 세포를 배양시킨 다음, 세포를 제외하고 남은 세포 배양용액을 의미한다. 추가적으로 본원에서 "배양물"이란 배양액 및/또는 배양된 세포주를 포함하는 물질로서, 이때 배양된 세포주는 배양조건에 의하여 분화되거나 유용물질의 생산능 및/또는 분비능이 향상된 세포주를 모두 포함하는 개념이다.
본원에서 식물 "줄기세포"(stem cell)란, 탈분화 과정을 거치지 않아 유전적으로 보다 안정한 선천적인 미분화세포를 말한다.
본원에서 "선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)"란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.
본원에서 "캘러스"란, 탈분화 과정을 통하여 분화하지 않은 상태로 된 세포 또는 세포덩어리(Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A., 99(25):15843, 2002)를 말한다.
본 발명은 일 관점에서, 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 은행나무과의 형성층에서 유래되고, 탈분화를 거치지 않은 선천적 미분화세포이다. 이는 다음 중 적어도 하나의 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a) 현탁배양 시 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 많은 수의 단세포를 포함하거나 작은 사이즈의 세포 집합체를 포함함;
(b) 다수의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄;
(c) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 활성이 증가된 미토콘드리아를 가짐;
(d) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 생장속도가 빠르고 오랫동안 성장할 수 있음; 및
(e) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐.
이때, "다수의 액포"를 가진다고 함은, 은행나무과의 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포 등과 비교하여 2배 이상의 다수의 액포를 가짐을 말한다. 아울러, 본 발명에 따른 줄기세포는 은행나무과의 캘러스로부터 유래된 세포 등과 비교하여 크기면에서 작은 액포를 가진다. 아울러, "다수의 발달된 형태의 미토콘드리아"를 가진다고 함은, 은행나무과의 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포와 비교하여 광학 현미경 BX41(Olympus, Japan)하에서 활발하게 움직이는 미토콘드리아를 2배 이상의 다수 가짐을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 2 이상의 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 3 이상의 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 4 이상의 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 아울러, 본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 (a) 내지 (e)의 특성을 모두 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 줄기세포는 (a) 은행나무과 식물로부터 형성층 함유 조직을 수득하는 단계; (b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 상기 형성층으로부터 세포들을 분리함으로써 형성층 유래 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어질 수 있는데, 이때, 상기 (b) 단계는 형성층 함유 조직을 배양하여 형성층으로부터 증식되는 형성층의 층(cambium layer)을 유도하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (c) 단계는 상기 형성층의 층(cambium layer)을 분리함으로써 형성층 유래 줄기세포를 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다. 아울러, 상기 (b)단계는 옥신(auxin)을 포함한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이때, 옥신으로는 NAA (α-naphtalene acetic acid), IAA (indole-3-acetic acid) 또는 피클로람(picloram)를 사용할 수 있으며, 이러한 옥신은 1~5 ㎎/L의 농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 (c) 단계는 형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층으로부터 상기 형성층의 층(cambium layer)을 분리함으로써 형성층 유래 줄기세포를 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 배양물은, 상기 줄기세포를 엘리시터로서 3~5 %(g/L)의 원당 또는 설탕; 또는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 키토산, 페닐알라닌(phenylalanin), 벤조익산, ABA, 살리실산(salicylic acid) 및 아세트산 나트륨(sodium acetate) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 추가로 배양하는 단계를 추가로 수행하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이때, 바람직하게는 상기 배지는 3~5 %(g/L)의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 세릭 암모니움 니트레이트(ceric ammonium nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 아세트산 나트륨(sodium acetate)로 구성되는 군에서 선택된 물질을 포함하는 배지임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 또한, 상기 줄기세포에 엘리시터로서 자외선, 열, 에틸렌, 항진균제, 항생제, 중금속 염 및 높은 염농도 등을 처리하여 물리적 화학적 스트레스를 가하여 수득된 배양물을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 또한, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (dimethyl sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 은행나무과 은행나무속(genus Ginkgo)의 은행나무(Ginkgo biloba )로부터 은행나무의 형성층 유래 줄기세포를 분리하여 항염증 활성을 확인하였으며, 이에 본 발명은 바람직하게는 은행나무속(genus Ginkgo) 식물의 형성층 유래 줄기세포를 사용하며, 더욱 바람직하게는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는, 본 발명에 따른 줄기세포 추출물 및 그 분획이 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 항산화 활성 및 항염증 활성을 가짐을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 줄기세포가 DDS를 이용하여 궤양성 대장염을 유발시킨 마우스 모델에서 매우 우수한 항염 효과를 보임을 확인하였다.
이에, 본 발명에서는 상기 줄기세포 파쇄물 또는 배양액을 함유하는 조성물이 항염증 활성을 나타냄을 제시하는 구체적인 실시예가 없다 하더라도, 상기에서 살펴본 바와 같이 그 줄기세포 및 추출물이 항염증 활성을 가지는 것을 확인한바, 본 발명에 따른 줄기세포 자체나 그 파쇄물을 함유한 조성물의 경우에도 항염증 활성을 나타내어 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.
본 발명에 따른 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물은 이들을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 줄기세포 등은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
아울러, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 염증의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.
본원에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 줄기세포 또는 그 추출물, 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물 및 그 분획의 항산화 및 항염증 효과를 확인하였으나, 그 줄기세포 파쇄물 또는 배양액을 사용해서도 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포의 수득
1-1: 식물재료의 준비
은행나무과 은행나무속의 은행나무(Ginkgo biloba , 충청남도 Buyeo, Korea)는 도 1과 같이, Phloroglucinol 염색을 통하여 목부(xylem)와 사부(phloem) 섬유를 관찰할 수 있는데, 이 사이에 형성층(cambium)이 존재함을 확인할 수 있다. 이러한 은행나무로부터 상기 형성층 유래 줄기세포를 수득하기 위하여, 먼저 은행나무의 줄기를 채취한 후, 즉시 항산화제 100 ㎎/L 아스코르브산(L-ascorbic acid, DUCHEFA, The Netherlands) 용액에 침적하여 운송?보관하였다. 이때, 전형성층을 이용하여 동일한 줄기세포를 수득하기 위하여는 줄기 대신 잔가지를 채취한다.
그 후, 1% 베노밀(benomyl, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 다코닐(daconil, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 스트렙토마이신(sterptomycin sulphate, DUCHEFA, The Netherlands), 0.1% 세포탁심(cefotaxime sodium DUCHEFA, The Netherlands)의 혼합용액에 24시간 전처리 후 페놀 화합물(phenolic compound)과 잔존 화학물질을 제거하기 위하여 수돗물(tap water)로 30분간 세척하였다. 그리고, 70% 에탄올(ethanol, DC Chemical, Korea)에 1분, 30% 과산화수소(hydrogen peroxide, LG Chemical, Korea) 15분, 1% CLOROX 용액에 15분, 3% CLOROX용액에 5분 표면 살균 후 3~4회 세척하였다.
1-2: 줄기로부터 형성층 포함 절편체의 제조조직 분리
상기 실시예 1-1의 살균과정을 거친 줄기(전형성층 이용시 잔가지)의 형성층이 포함된 수피(bark) 조직을 들어올리면 목부(xylem)에서 쉽게 벗겨졌다. 벗겨진 조직들은 형성층, 사부(phloem), 피층(cortex), 표피(epidermis)를 포함하는 절편체를 구성한다.
1-3: 은행나무의 형성층 유래 줄기세포 유도단계
상기 실시예 1-2에서 준비한 형성층 포함 절편체는 표 1의 줄기세포 유도배지(배지 1)에 치상하여 배양하였다.
세포주 유도배지 (배지 1)
Composition Contents(㎎/L)
Inorganic salts

 KNO3 2500
(NH4)2SO4 134
MgSO4?7H2O 121.56
MnSO4?4H2O 10
ZnSO4 ?7H2O 2
CuSO4?5H2O 0.025
CaCl2?2H2O 113.23
KI 0.75
CoCl2?6H2O 0.025
NaH2PO4?H2O 130.44
H3BO3 3
Na2MoO4?2H2O 0.25
FeNaEDTA 36.7
Vitamin
 Myo-inositol 200
Thiamine-HCl 20
Nicotinic acid 2
Pyridoxine-HCl 2
L-ascorbic acid 50
Citric acid 75
Amino acid


 L-aspartic acid 133
L-arginine 175
Glycine 75
Proline 115
Hormone picloram 1
Sucrose 10,000
Activated charcoal 100
Gelrite 2,000
배지에 생장 조절제로서 NAA, IAA, picloram과 같은 옥신(Auxin)은 1~5mg/L의 농도로 첨가할 수 있는데, 바람직하게는 1 mg/L의 농도로 첨가한다. 배양은 25±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다.
초기 배양 4~7일째 형성층으로부터 세포 분열이 육안상으로 관찰되고, 배양 15일 이후에 사부?피층 및 표피로 이루어진 층으로부터 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 배양 30일 경과 후 배양된 형성층은 사부를 포함한 층, 즉 무정형의 캘러스층으로부터 분리되기 시작했고(도 2A: 줄기세포(화살표), 사부(pholem) 세포(별표)), 두 층이 자연스럽게 분리될 때까지 기다렸다가 완벽한 분리가 이루어지면 각기 다른 페트리디쉬(petridish)에 분리 배양하였다. 분리 후, 생장률이 좋은 희고 무른 부분을 유도배지와 동일한 새로운 배지로 매 14일째 계대배양하였다. 도 2B는 상기 형성층 유래 줄기세포를 분리하여 3주간 배양한 후의 사진이다.
한편, 비교를 위하여 은행나무의 수피(bark) 절편체를 소독한 후 상기 <표 1>의 배지에서 배양하였으며, 그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 수피(bark) 절편체는 탈분화에 의해 캘러스를 형성함을 관찰할 수 있었다. 수피 절편체에서 유도된 캘러스는 사부포함조직과 같이 여러 세포들 간의 분열 속도의 차이로 무정형을 이루었고, 생장률이 불안정하며 쉽게 갈변되는 경향을 보였다. 갈변 및 응집되어진 수피 절편체에서 유도된 캘러스는 종국에는 자신이 분비하는 페놀 화합물에 의해 생장이 둔해지다가 종국에는 괴사하였다. 즉, 6개월 후부터 수피로부터 유도된 캘러스들은 유지 및 배양이 어려웠다. 반면, 도 3A에 나타난 바와 같이, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포는 장기 배양시 세포의 생장률, 생장 패턴, 응집 정도에 변이 없이 안정적으로 유지되어 대량 배양이 가능했다.
1-4: 은행나무의 형성층 유래 줄기세포의 증식 및 특성 관찰
실시예 1-3에서 분리한 형성층 유래 줄기세포를 하기 <표 2>의 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100 rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다.
Suspension medium (배지 2)
Composition Contents(㎎/L)
Inorganic salts

 Ca(NO3)2 471.26
NH4NO3 400
MgSO4?7H2O 180.54
MnSO4?4H2O 22.3
ZnSO4 ?7H2O 8.6
CuSO4?5H2O 0.25
CaCl2?2H2O 72.5
K2SO4 990
Na2MoO4?2H2O 0.25
H3BO3 6.2
KH2PO4 170
FeNaEDTA 36.7
Vitamin
 Myo-inositol 200
Thiamine-HCl 20
Nicotinic acid 2
Pyridoxine-HCl 2
L-ascorbic acid 50
Citric acid 75
Amino acid


 L-aspartic acid 133
L-arginine 175
Glycine 75
Proline 115
Hormone picloram 1
Sucrose 30,000
광학 현미경 BX41(Olympus, Japan) 하에서 세포 응집정도를 살펴 볼 때, 본 발명에 따른 줄기세포는 도 4A에 나타난 바와 같이, 현탁배양 시 많은 수의 단세포를 포함하며, 일부는 작은 사이즈의 세포 집합체로 존재하는 것을 확인할 수 있었으나, 대조군인 은행나무의 체세포(수피 조직에서 유도된 캘러스)의 경우, 도 4B에 나타난 바와 같이 응집됨을 관찰할 수 있었다.
한편, 도 5A에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 줄기세포는 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었다. 이러한 특징은 식물체 내에 존재하는 미분화된 세포에서 압력 등과 같은 원인에 의하여 나타나는 특징으로서, 이에 본 발명에 따른 줄기세포는 미분화상태임을 확인할 수 있었다. 일반 은행나무의 체세포(수피 조직에서 유도한 캘러스)의 경우, 도 5B에 나타난 바와 같이, 이러한 특징을 확인할 수 없었다. 이를 더 상세히 살펴보기 위하여, 액포를 neutral red로 염색한 결과, 본 발명에 따른 줄기세포는 도 6A에 나타난 바와 같이 적색의 다수개의 작은 액포(vacuole)를 확인할 수 있었으며, 일반 은행나무의 체세포(수피 조직에서 유도한 캘러스)의 경우 도 6B에 나타난 바와 같이, 하나의 큰 중심액포가 존재함을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명에 따른 줄기세포는 광학현미경 BX41(Olympus, Japan)를 통해 관찰한 결과, 움직임 면에서 활성이 매우 높은 미토콘드리아를 다수 개 관찰할 수 있었다. 도 7A는 본 발명에 따른 줄기세포가 다수개의 미토콘드리아를 가짐을 나타내는 것으로 화살표는 미토콘드리아를 나타낸다. 이에 반하여, 일반 은행나무의 체세포(수피 조직에서 유도한 캘러스)의 경우, 도 7B에 나타난 바와 같이, 이러한 특징을 확인할 수 없었다.
한편, 배양기간별 증식속도를 측정하기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양형 생물반응기(airlift bioreactor, Samsung Science, Korea)를 이용하여 세포배양물의 생장속도를 측정한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 1주일 배양 시 2배, 2주일 배양 시 총 3배의 생장률을 확인할 수 있었다. 이때, 배지는 <표 2>의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1℃로 일정하게 유지하였다. 아울러, 이와 동일한 배지와 조건으로 3L의 공기 부양형 생물반응기에서 은행나무 수피조직에서 유도한 캘러스와 본 발명에 따른 은행나무의 형성층 유래 줄기세포를 배양하여 서로 비교하였다.
생장률 및 생장지수(GI) 측정결과
Cell lines Growth rate (folds) GI
Stem Cell 3.1 2.27
Callus 2.3 1.3
그 결과, <표 3> 및 도 9에 나타난 바와 같이, 은행나무 수피조직에서 유도한 캘러스의 생장속도는 2.3배이고, 생장지수 (GI) (growth index = (maximum DCW - initial DCW) / initial DCW )는 1.3에 불과하였으나, 본 발명에 따른 형성층 유래 줄기세포는 생장속도가 3.1배이고, 생장지수 (GI)가 2.27로 은행나무 수피조직에서 유도한 캘러스에 비하여 높음을 확인할 수 있었다. 통상 반응기의 경우 반응기 내에서의 생장고리 (growth ring) 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단 스트레스에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소하나, 형성층 유래 줄기세포 배양물은 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단 스트레스에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)이 거의 감소하지 않았다.
대량배양 공정 (scale-up process)
Bioreactors Max. dry cell weight (g/L)
A 3L air-lift bioreactor 11.3
B 20L air-lift bioreactor 10.1
C 250L air-lift bioreactor 11.7
아울러, <표 4> 및 도 10에서 볼 수 있듯이, 3 L 공기부양형 생물반응기, 20 L 공기부양형 생물반응기 및 250 L 공기부양형 생물반응기에서 10일간 배양한 결과, 250 L와 같이 대량배양시에도 증식됨을 확인할 수 있었으며, 250 L의 대량배양시 오히려 리터당 건조세포 양이 증가한 것으로 나타났다.
즉, 본 발명에 따른 형성층 유래 줄기세포는 대량배양을 위한 생물 반응기에서 전단 스트레스에 대하여 낮은 민감성을 가지므로, 생물반응기 내에서 급속 대량 생장이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 형성층 유래 줄기세포가 은행나무의 탈분화된 캘러스 유래 세포주에 비하여 전단스트레스에 대하여 낮은 민감성을 가짐을 알 수 있었다.
한편, 은행나무 수피조직에서 유도한 캘러스와 본 발명에 따른 은행나무 형성층 유래 줄기세포에 대하여 동결보존을 실시하였다. 현탁배양물은 배양 6일에서 8일 된 것을 사용하며, 동결보존제는 0.5 M glycerol (DUCHEFA, The Netherlands)과 0.5 M DMSO (DUCHEFA, The Netherlands)와 1 M sucrose (DUCHEFA, The Netherlands) 포함된 배지이고, 5 mL cryovial(Duran, USA)에 옮겼다. 동결보존제에 처리되는 세포 접종량은 200 mg/mL 이다. 동결보존제 처리된 현탁세포는 30분간 냉동고에 유지한 다음 deep freezer에 3시간 보관 후 액체질소에 침지시켜 냉동시켰다.
그 후 해빙을 위하여 액체질소에 20분 이상 유지된 배양세포를 꺼내어 40℃ 항온수조에 넣고 1~2분간 해동시켰다. 세포 재생장을 위해, 세포 현탁액을 무균상태의 깔때기 및 여과지를 사용하였다. 여과된 세포는 filter paper가 포함된 고형생장배지상에 적용시키고 30분간 실온에서 안정화 시킨 다음, 다시 신선한 고형생장배지로 다시 옮겨졌다.
동결보존 시 생존율 측정 결과
Cell lines sample 1 sample 2 sample 3 Average survival rate(%)
Stem cell
 33/212 43/218 45/211 18.87
15.60% 19.70% 21.30%
Callus
 5/175 4/124 4/158 2.87
2.90% 3.20% 2.50%
그 결과, 도 11 및 표 5에서 볼 수 있듯이, 은행나무 수피조직에서 유도한 캘러스는 본 발명의 은행나무 형성층 유래 줄기세포에 비하여 매우 낮은 생존율을 보임을 확인할 수 있었다.
아울러, 식물줄기세포를 특징짓는 특성에는 자가재생능력(self renewal)이외에 분화능(pluripotency)이 있다. 이에 은행나무 형성층 유래 줄기세포의 도관요소 분화를 유도하기 위하여, 생장조절제가 포함된 MS medium 조건에서 25±1℃, 암조건에서 배양한 결과, 형성층 유래 줄기세포로부터 도관요소가 분화됨을 확인할 수 있었다.
1-5: 엘리시터의 처리
실시예 1-4와 같이 14일간 현탁배양한 줄기세포를 멸균수에 원당 3~5 %(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100 μM를 첨가한 배지에서 14일간 암배양한 줄기세포를 수거하여 다음의 실험을 수행하였다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포의 에탄올 추출물 제조
2-1: 에탄올 추출물의 제조
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 상기 실시예 1에서 분리된 줄기세포 2 g에 50 mL의 80% 에탄올을 섞고, 15℃에서 48시간 진탕하였다.
(ⅱ) 진탕 후 생성된 상등액을 동결건조시키고, 에탄올 추출물을 얻었다.
2-2: DMSO ( dimethyl sulfoxide ) 추출물의 제조
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 상기 실시예 1에서 분리된 줄기세포 500 g에 500 mL의 DMSO를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000 ×g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 DMSO 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기에서 얻은 DMSO 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.
(ⅳ) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 DMSO 추출물을 얻었다.
2-3: 증류수 추출물, 메탄올 추출물 및 아세톤 추출물의 제조
실시예 1에서 제조된 줄기세포로부터 다음과 같이 단계별로 유효물질을 추출하였다.
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 상기 실시예 1에서 분리된 세포주 500 g에 500 mL의 증류수를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000 ×g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기 증류수 가용성 물질을 얻은 후, 남은 증류수 불용성물질에 500 mL의 메탄올(methanol)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.
(ⅳ) 상기 용해 후, 3,000 ×g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 메탄올 가용성물질을 얻었다.
(ⅴ) 상기 메탄올 가용성물질을 얻은 후, 남은 메탄올 불용성물질에 500 mL의 아세톤(acetone)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.
(ⅵ) 상기 용해 후, 3,000 ×g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 아세톤 가용성물질을 얻었다.
(ⅶ) 상기에서 얻은 증류수, methanol, acetone 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.
(ⅷ) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 세포배양액, 메탄올, 아세톤에 녹여 증류수 추출물, 메탄올 추출물, 아세톤 추출물을 얻었다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포의 추출물 분획시료의 제조
실시예 2-1에서 제조한 에탄올 추출물로부터 다음과 같이 분획시료를 제조하였다.
에탄올 추출물에서 분획 시료를 준비하기 위해서는 column chromatography (Sephadex LH-20 column, 15 x 1260 mm, bead volume: 222 mL)를 시행하였다. 상기한 바와 같이 준비된 CMCs 80% ethanol 추출물 4.2g으로부터 활성물질을 분리하기 위하여 Sephadex LH-20(150 × 1260 mm, 100% methanol)을 이용하여 gel filtration을 수행 하였다. 분당 유속 0.8ml (SV=0.23)로 분획하여 총 120개의 분획을 얻었다. 각 분획시료는 thin layer chromatography (TLC) 분석을 통하여 Fr.Ⅰ~ Fr.Ⅶ 까지 7개 fraction (도 12)으로 정리하고 각 분획 별로 하기의 활성 검정에서 사용하였다.
Fr.Ⅰ(#1) : ( Fr. 1 ~ 7) , 2.4612g
Fr.Ⅱ(#2) : ( Fr. 8~ 11) , 0.199g
Fr.Ⅲ(#3) : ( Fr.12~ 15) , 0.141g
Fr.Ⅳ(#4) : ( Fr.16~ 23) , 0.2265g
Fr.Ⅴ(#5) : ( Fr.24~ 30) , 0.1785g
Fr.Ⅵ(#6) : ( Fr.31~ 60) , 0.3036g
Fr.Ⅶ(#7) : ( Fr.61~120) , 0.2329g
은행나무의 형성층 유래 줄기세포의 추출물 분획의 in vitro 항산화 효과 확인
4-1: Hypoxanthine / xanthine oxidase assay 를 통한 분획시료의 항산화 활성 측정
실시예 2-1에서 수득한 에탄올 추출물 또는 실시예 3에서 제조한 각 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(Cambium meristem cells, CMCs) 추출물 분획시료와 반응액(30 mM EDTA (pH 7.4), 30 mM xanthine, 1.42 mM NBT (nitro blue tetrazolium))을 50 mM PBS에 넣어준 후 xanthine oxidase (0.5 U/mL)를 첨가하여, 15분 동안 반응시켰다. 그리고 용액의 흡광도를 560 nm에서 측정하여 분획시료가 어느 정도의 항산화 효과를 가지는지 그 활성 정도를 (superoxide radical 생성 저해 정도를) 대조군과 비교하여 측정하였다. 대조군으로는 항산화제를 넣지 않고 xanthine oxidase만을 처리하였을 때 반응의 결과 나타나는 흡광도를 측정하여 결정하였으며, 각 분획 시료의 superoxide radical scavenging activity를 백분율로 환산하여 결정하였다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포 추출물 분획 시료의 superoxide radical scavenging activity (단위: % inhibition)
농도
(㎍/mL)		 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 추출물
10 8.7 18.2 70.1 81.6 80.8 74.4 56.0 50.5
100 12.5 72.6 71.9 100 100 100 100 73.9
1000 95.4 69.2 100 100 100 100 100 100
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 7개의 분획 시료 중 분획 #3, #4, #5, 그리고 #6에서 10 ㎍/mL 농도를 사용하였을 때 70% 이상의 저해 효과를 보여 이들 분획이 다른 분획에 비하여 높은 superoxide radical scavenging activity를 가짐을 알 수 있었다.
4-2: Deoxyribose assay 를 통한 분획시료의 hydroxyl radical scavenging activity 측정
유리 tube 안에 100 μM FeCl3, 104 μM EDTA (pH 7.4)를 넣어 10분간 반응시킨 다음 1.5 mM 과산화수소, 2.5 mM deoxyribose, 100 μM vitamin C를 넣어준 후 실시예 2-1의 에탄올 추출물 또는 실시예 3의 각 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 분획시료를 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 반응시료에 1.5% 2-TBA (2-thiobarbituric acid)와 2.8% TCA (trichloroacetic acid)를 넣어 잘 혼합한 다음 80℃에서 30분 동안 반응시킨 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. Fenton system (Fe3 +-ascorbate-EDTA-H2O2)으로 발생하는 hydroxyl radical에 의해 deoxyribose는 분해되며, 산성 상태에서 가열에 의해 malonaldehyde가 생성되게 된다. 생성된 malonaldehyde는 thiobarbituric acid와 반응하여 핑크색의 chromogen을 형성함으로써 흡광도를 증가시킨다. 따라서 시료 내 hydroxyl radical 소거활성이 존재하는 경우 시료 첨가에 의해 deoxyribose의 분해가 억제되며 흡광도가 감소하게 된다. 시료의 hydroxyl radical 소거활성은 시료 무첨가군의 흡광도 변화를 100%로 기준하여 시료 첨가군의 흡광도 변화를 hydroxyl radical 생성 억제율로 표시하였다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포 추출물의 분획 시료의 hydroxyl radical scavenging activity (단위: % inhibition)
농도
(㎍/mL)		 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 추출물
10 0 0 0 0 0 0 0 36.7
100 27.8 19.8 63.2 78.5 83.6 74.7 86.7 48.3
1000 63.9 69.3 100 100 100 100 100 100
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 7개의 분획 시료 중 분획 #4, #5, #6, 그리고 #7에서 100 μg/mL 농도를 사용하였을 때 70% 이상의 hydroxyl radical scavenging activity를 가짐을 알 수 있었다.
이러한 결과에 근거하여 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 7개의 분획 시료 중 두 assay에서 공통적으로 높은 in vitro 항산화 효과를 보이는 #4, #5, 그리고 #6 분획시료를 본격적인 in vitro 항염증 효과 연구의 대상 시료로 선정하였다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포의 추출물 분획 시료 처리에 의한 생존율 조사
실시예 3의 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 분획시료의 in vitro 항염증 효과는 mouse macrophage cell line인 RAW 264.7 세포주를 사용하여 확인하였다. 이에 각 분획시료가 가지는 세포 독성을 먼저 확인하고자 3-(4,5-dimethylthiazole-2yl-)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)를 이용한 세포 생존율을 조사하였다.
이에 먼저 각 분획시료와 실시예 2-1의 에탄올 추출물(crude extract, CE)를 50 μg/mL 농도로 먼저 처리한 다음 LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, CE 처리군과 LPS 처리군에서는 90% 내외, 그리고 각 분획시료 처리군에서는 50% 내외의 생존율을 보였다.
이는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물(CE)에 비하여 각 분획 시료에서 약간의 세포 독성이 있음을 의미하며, 아마도 유효 성분 혹은 부수적으로 시료에 존재하는 성분의 농축효과에 의하여 일부 독성이 보여지는 것으로 판단되었다. 따라서 향후 분획 추출물 혹은 유효 성분의 실재 적용 시 생리활성 성분의 조화를 이루는 정확한 적용량의 결정이 필수적으로 필요할 것으로 생각되었다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포의 추출물 분획 시료의 항염증 효능 확인
6-1: LPS 의 RAW 264.7 macrophage cell line 처리에 의하여 생성되는 nitric oxide ( NO )에 대한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs ) 추출물 분획 시료의 저해 효과
LPS를 처리한 macrophage cell은 염증반응 측정의 유용한 모델로 다양하게 사용되고 있다. 특히, 이 모델에서 염증에 관련된 cytokine, MAP kinase, 그리고 NF-kB activation 등이 indicator로서 측정되고 있다. 특히, NO는 다양한 염증반응의 indicator인 iNOS에 의하여 증가하기 때문에 LPS가 처리된 macrophage cell line에서의 염증 반응에 있어서 가장 기초적으로 측정되어야 하는 물질이다. 이에 실시예 3의 각 분획시료와 실시예 2-1의 에탄올 추출물 (crude extract)를 50 μg/mL 농도로 먼저 처리한 다음 LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였으며, 이후 생성된 NO의 양을 nitrite 농도를 측정하여 확인하였다
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, RAW 264.7 macrophage cell line에 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물(CE)과 각 분획 시료를 각각 50 μg/mL 농도로 처리한 다음 1 μg/mL의 LPS를 첨가하여 24시간 배양한 결과 LPS에 의하여 유도되는 NO 농도가 CMCs CE 뿐만 아니라 모든 추출물 분획 처리에 의하여 통계적으로 유의한 수준(SigmaPlot, t- test)으로 감소함을 알 수 있었다.
도 13의 결과를 볼 때, 각 분획 시료가 실험에 사용된 macrophage cell line에 약한 세포독성을 보였기 때문에 CMCs 시료의 항염증 효과가 세포에 대한 독성일 수도 있다는 우려가 제기될 수도 있으나, 각 시료가 보이는 NO 활성 저해 효과(도 14)와 MTT assay 결과(도 13)의 세포 활성 저해 수준이 일치 않음을 보아 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출 분획 시료의 세포에 대한 독성이 NO 활성 저해의 원인이 아님을 알 수 있었다. 따라서 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 효과적인 항염증 활성을 가질 것으로 예측되었다.
6-2: LPS 의 RAW 264.7 macrophage cell line 처리에 의하여 발현되는 cyclooxygenase-2 ( COX -2)와 iNOS 유전자에 대한 CMCs 추출물 분획 시료의 저해 효과
상술한 바와 같이, 대부분의 염증반응에서 NO의 발현은 중요 indicator이며, NO의 발현에는 iNOS 효소의 작용에 의한 것으로 알려져 있다. 따라서 iNOS 유전자의 발현은 염증반응 측정의 필수적인 요소라고 할 수 있다. 또한, COX-2 역시 염증반응 유도 여부의 가장 중요한 indicator 중 하나로 알려지고 있다. 따라서, LPS를 처리한 RAW 264.7 macrophage cell line에서 발현되는 iNOS 및 COX-2 유전자가 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 분획의 처리에 의하여 얼마나 저해되는지 확인하여 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 분획의 항염증 효과를 확인하고자 하였다.
이에 RAW 264.7 cell에 실시예 3의 각 분획시료와 실시예 2-1의 에탄올 추출물(crude extract, CE)를 50 μg/mL 농도로 먼저 처리한 다음, LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였으며, 이후 발현된 COX-2와 iNOS의 양을 RT-PCR을 이용하여 확인하였다.
이때, RT-PCR은 다음과 같이 수행하였다.
먼저, 상기 배양한 RAW264.7 cell을 eppendorf tube에 수거하여 PBS를 넣어 세척한 다음 total RNA extraction kit을 사용하여 total cellular RNA를 추출하였다. 먼저 Trizol을 넣고 상온에서 5분 동안 cell을 lysis시킨 후 chloroform을 넣고 상온에서 15초 동안 vortex하였다. 2~3분 후 4℃에서 15분간 12,000 rpm으로 원심분리시킨 후 상등액을 조심히 취하여 isopropanol을 넣어 상온에서 10분 동안 반응시켰으며, 4℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심분리 하여 RNA를 침전시킨 후 상등액은 버렸다. 80% 에탄올을 사용하여 RNA pellet을 washing (4℃에서 5분 동안 12,000 rpm으로 원심분리)한 후 air dry 시켜 DEPC H2O을 넣어 RNA를 추출하였다. 총 RNA를 전기영동으로 확인 후 spectrophotometer를 이용하여 RNA를 정량한 다음 first-strand cDNA를 합성하였다.
그 다음, cDNA합성은 총 RNA (2 μg)에 0.5 μg oligo dT primer를 넣고 72℃에서 5분 동안 반응시킨 후 그 반응물 5 μL에 Reverse transcriptase mixture (5x RT buffer, 25 mM MgCl2, 2 mM dNTP, RNase Inhibitor, RTase)를 넣어 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분의 순서대로 반응 조건을 설정하여 cDNA를 합성하였다.
그 후, 1 mg cDNA에 10 mM dNTPs, 10x Ex-TaqTM polymerase buffer, 2.5 U Ex-TaqTM DNA polymerase 와 하기와 같은 specific primer를 넣어 cDNA를 증폭시켰다. Target 유전자의 증폭을 위해 사용된 primer sequence는 다음과 같다.
COX-2 유전자
Forward primer : 5'-AAG AAG AAA GTT CAT TCC TGA TCC C-3' (서열번호 1)
Reverse primer : 5'-TGA CTG TGG GAG GAT ACA TCT CTC C-3' (서열번호 2)
iNOS 유전자
Forward primer : 5'-CTG CAG CAC TTG GAT CAG GAA CCT G-3' (서열번호 3)
Reverse primer : 5'-GGG AGT AGC CTG TGT GCA CCT GGA A-3' (서열번호 4)
GAPDH 유전자
Forward primer : 5'-CCG ATG CCC CCA TGT TTG TG-3'(서열번호 5)
Reverse primer : 5'-GGC CAT GCC AGT GAG CTT CC-3' (서열번호 6)
Cycling 조건은 먼저 95℃에서 2분 동안 반응시키는데 온도가 Tm (melting temperature) 값 이하로 떨어지면 프라이머 이량체(primer dimer) 형성이나 비특이적 시작이 일어나게 되므로, 이와 같은 난점을 극복하기 위하여 Hot start하였다. Three-step program (95℃ for 1 min, 55℃ for 1 min, and 72℃ for 1.5 min)을 30 cycles 반응시킨 후, 72℃에서 10분 동안 반응시킨 PCR 산물을 4℃에 보관하였다.
PCR 반응이 끝난 산물 10 μL를 0.2 mg/mL ethidium bromide가 들어있는 1 % 아가로스 겔에 전기영동 시켜 UV transilluminator로 증폭된 DNA 밴드를 AlphaDigiDoc 1200 software를 사용하여 스캔, 분석하였으며 발현 정도는 GAPDH gene에 대한 상대적인 양을 구하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 1 mg/mL의 LPS를 처리한 RAW 264.7 cell에서는 iNOS와 COX-2 유전자 발현의 정도가 negative control에 비하여 월등하게 증가하는 것을 볼 수 있었다. 그런데, 여기에 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)의 80% 에탄올 조추출물 50 μg/mL을 처리 시 iNOS와 COX-2 유전자 발현이 현저히 감소하여 iNOS의 경우는 LPS를 처리한 대조군에 비하여 57.1%, COX-2의 경우는 LPS 대조군에 비하여 83.4%가 감소하는 것을 알 수 있었다.
또한, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 분획 시료(50 μg/mL)를 처리하였을 경우 69%에서 100%의 iNOS 및 COX-2 유전자 발현이 저해됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 실시예 6-1의 도 14의 CMCs 추출 분획 시료의 NO 생성 억제에서 나타난 결과와 같이, 이들 시료가 항염증 효과를 가짐을 나타낸다.
6-3: LPS 의 RAW 264.7 macrophage cell line 처리에 따른 MAP kinase activation에 대한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs ) 추출물 분획 시료의 저해 효과
LPS를 macrophage cell에 처리하면 염증반응에 관여하는 다양한 mediator가 생산되는 것으로 알려져 있다. 이러한 mediator에는 염증성 cytokine도 포함되는데, 이를 위해서는 LPS에 의한 자극신호가 전달되어야 하며, 이 과정에서 MAP kinase activation이 중요한 단계로 여겨지고 있다. 따라서 LPS 처리에 의한 MAP kinase의 활성화가 CMCs 추출 분획 시료의 처리에 의하여 저해되는지 확인하였다.
RAW 264.7 cell에 실시예 3의 각 분획시료와 실시예 2-1의 조추출물 (crude extract)를 50 μg/mL 농도로 먼저 처리한 다음 LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하여 30분 배양하였으며, 이후 MAP kinase의 활성 억제 효과를 웨스턴 블라닝 (western blotting_을 이용하여 확인하였다.
즉, 상기에서 배양한 RAW 264.7 cell을 micro centrifuge tube에 수거하여 PBS를 넣어 세척한 다음, 용해 완충액(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 2 mM EDTA, 1% NP-40, 10 mM VaF, 1 mM Na3VO4, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 mM PMSF, 10 mg/mL aprotinin, 10 mg/mL leupeptin, 0.1 mg/mL soybean inhibitor)으로 용해된 세포를 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. BSA를 표준시료로 사용하여 각각의 단백질을 Bradford법으로 정량하였다. 단백질은 Laemmli sample buffer (0.625 M Tris-HCl, pH 6.8, 5% β-mercaptoethanol, 2% SDS)로 녹여 20 μg의 lysate를 10% SDS-PAGE로 변성 분리하여, 젤을 0.45 mm hydrophobic PVDF (polyvinylidene difluoride) membrain (Hybond-P)에 전사시켰다. PVDF는 5% 탈지분유를 함유한 Tris buffered saline (TBS; 20 mM Tris/HCl, 137 mM NaCl, pH 7.6)으로 약 2시간 동안 blocking한 다음, 1차 항체(1:500)넣어 over night 반응한 후 TBS로 3회 세척하였다. 그 이후 HRP-conjugated anti-rabbit 2차 항체 용액(희석비율 1:1,000)으로 1시간 동안 상온에서 반응시켰으며, 상기와 동일하게 다시 세척한 후 enhanced chemiluminescence detection system western detection 용액을 사용하여 X-film에 감광시켰다. 각 단백질의 발현에 대한 대조군으로 β-actin에 대한 일차항체를 이용하여 위와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, RAW 264.7 macrophage cell line에서 1 μg/mL LPS의 처리에 의하여 ERK와 p38 MAP kinae의 activation이 현저히 증가함을 알 수 있었다. 그리고 50 μg/mL 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 시료의 처리시 ERK의 경우 27.4%, p38 MAP kinase의 경우 37.3%의 MAP kinase 활성화 저해 효과가 있음을 알 수 있었다. 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출 분획시료의 처리에 의해서도 LPS에 의하여 유도된 MAP kinase 활성화가 저해됨을 알 수 있었는데, 특히 fraction #4의 경우 LPS 대조군 대비 50%의 활성화 저해효과가 있음을 알 수 있었다. 이는 상기 NO, iNOS, 그리고 COX-2 결과와 마찬가지로 CMCs 추출 분획 시료의 항염증 효과를 일관성 있게 입증하는 결과이다.
6-4: LPS 의 RAW 264.7 macrophage cell line 처리에 따른 NF - kB activation 에 대한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs ) 추출물 분획 시료의 저해 효과
LPS를 macrophage cell에 처리하면 염증반응에 관여하는 다양한 mediator가 생산되며, 이러한 mediator인 염증성 cytokine의 생산을 위해서는 LPS에 의한 자극신호가 전달되어야 하며, 이 과정에서 MAP kinase activation이 중요한 중간단계이다. 그리고 MAP kinase 활성화에 의한 NF-kB activation이 유전자 발현의 마지막 결정 단계로 알려져 있다. 따라서 LPS 처리에 의한 IkB의 degradation과 이에 따른 NF-kB activation이 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출 분획 시료의 처리에 의하여 저해되는지 확인하였다.
RAW 264.7 cell에 실시예 3의 각 분획시료와 실시예 2-1의 조추출물 (crude extract)를 50 μg/mL 농도로 먼저 처리한 다음 LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하여 1시간 배양하였으며, 이후 p-IkB와 NF-kB 활성 억제 효과를 웨스턴 블라팅을 이용하여 확인하였다.
p-IkB의 실험방법은 실시예6-3과 동일하며, NF-kB는 NE-PER Nuclear & Cytoplasmic Extraction Reagents kit (Thermo science, Rockford, USA)를 사용하여 실험을 수행하였다.
상기에서 배양한 RAW 264.7 cell을 micro centrifuge tube에 수거하여 PBS를 넣어 세척(12,000 rpm for 5 min)한 다음, ice-cold Cytoplasmic extraction reagent I (CER I)용액을 넣어 15초간 vortex하여 cell을 풀어준 후 10분 동안 ice 상태를 유지시켰다. ice-cold Cytoplasmic extraction reagent II (CER II)용액 넣어 5초간 볼텍싱한 후 1분 동안 ice 상태를 유지하였다. 튜브를 5초간 볼텍싱한 다음 재빨리 4℃ micro-centrifuge에 옮겨 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액(cytoplasmic extract)은 미리 차갑게 해 놓은 튜브에 옮겨 -80℃에 보관하였다.
남아있는 불용성 (pellet) 분획(fraction)은 ice-cold Nuclear Extraction Reagent (NER)을 넣어 15초간 강하게 vortex하여 ice 상태를 유지하는데 매 10분 간격으로 반복하여 강하게 볼텍싱해 준다(총 4회). 완전히 용해된 용액을 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상등액(nuclear extract)을 미리 차갑게 해 놓은 튜브에 옮긴 후 다음 실험을 진행하였다. BSA를 표준시료로 사용하여 각각의 단백질을 Bradford법으로 정량하였다. 단백질은 Laemmli sample buffer (0.625 M Tris-HCl, pH 6.8, 5% β-mercaptoethanol, 2% SDS)로 녹여 20 μg의 lysate를 10% SDS-PAGE로 변성 분리하여, 젤을 0.45 mm hydrohhobic PVDF (polyvinylidene difluoride) membrain (Hybond-P)에 전이시켰다. PVDF는 5% 탈지분유를 함유한 Tris buffered saline (TBS; 20 mM Tris/HCl, 137 mM NaCl, pH 7.6)으로 약 2시간 동안 차단시킨 다음, 1차 항체(1:500)넣어 over night 반응한 후 TBS로 3회 세척하였다. 그 이후 HRP-conjugated anti-rabbit 2차 항체 용액(희석비율 1:1,000)으로 1시간 동안 상온에서 반응시켰으며, 상기와 동일하게 다시 세척한 후 enhanced chemiluminescence detection system western detection 용액을 사용하여 X-film에 감광시켰다. 각 단백질의 발현에 대한 대조군으로 β-actin에 대한 일차항체를 이용하여 위와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 1 μg/mL LPS의 처리에 의하여 RAW 264.7 macrophage cell line에서 IkB의 phosphorylation에 의한 degradation과 NF-kB activation이 현저히 증가함을 알 수 있었다. 그리고 50 μg/mL 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출 시료의 처리 시 NF-kB activation이 10.7% 정도 저해됨을 알 수 있었다. 흥미롭게 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출 시료 분획의 처리에 의해서는 LPS에 의하여 유도된 NF-kB activation이 매우 현격하게 저해됨을 알 수 있었는데, 그 저해 정도가 약 70%에 이르는 것을 알 수 있었다. 이는 상기 NO, iNOS, COX-2, 그리고 MAP kinase 활성화 저해 결과와 마찬가지로 CMCs 추출 분획 시료의 항염증 효과를 일관성 있게 입증하는 결과이다.
6-5: LPS 의 RAW 264.7 macrophage cell line 처리에 따른 염증성 cytokine 발현에 대한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs ) 추출물 분획 시료의 저해 효과
LPS를 macrophage cell에 처리하면 염증반응에 관여하는 다양한 mediator가 생산되는데, 가장 중요한 factor가 염증성 cytokine의 생산이다. 이에 가장 중요한 염증성 cytokine인 IL-6와 TNF-a의 LPS 자극에 의한 생산이 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출 분획 시료의 처리에 의하여 저해되는지 확인하였다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출 분획 시료의 염증성 사이토카인 생성억제효과를 조사하기 위하여 RAW 264.7 cell에 실시예 3의 각 분획시료와 실시예 2-1의 조추출물 (crude extract)를 50 μg/mL 농도로 먼저 처리한 다음 LPS를 1 μg/mL 농도로 처리하여 48시간 배양한 세포배양액을 사용하여 ELISA 방법으로 측정하였다.
먼저 각 사이토카인의 capture antibody를 96-well ELISA plate에 넣고 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. Plate를 0.05% Tween-20이 포함된 1xPBS (PBS-T)로 5회 세척한 다음 2% BSA가 포함된 1x assay diluent 용액으로 실온에서 2시간 blocking하였다. Plate를 1x PBS-T로 3회 세척한 다음, 세포 배양액 또는 각 사이토카인 표준단백질을 넣어 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 다시 1x PBS-T로 5회 세척하고 detection antibody를 넣어 실온에서 2시간 반응시켰다. Plate를 다시 1x PBS-T로 5회 세척하고 avidin-HRP 용액을 넣어 실온에서 30분간 반응시켰다. 이를 1x PBS-T용액으로 7회 세척한 다음 TMB 기질용액을 넣고 최종 15분간 실온에서 반응시키고 , 반응정지액(1 M H3PO4)을 첨가하여 반응을 정지 시켰다. Plate의 반응 정도를 microplate reader에서 430 nm 흡광도로 측정하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, RAW 264.7 cell에 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 에탄올 추출물과 시료를 각각 50 μg/mL농도로 처리한 다음 LPS 1 μg/mL을 첨가하여 48시간 배양한 후 배양액에 존재하는 IL-6와 TNF-a 농도를 확인한 결과, 예상한 바와 같이 LPS 만 처리한 군보다 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 시료를 처리한 군 모두에서 IL-6와 TNF-a의 발현이 유의한 정도로 감소됨을 알 수 있었다.
이러한 결과로 미루어 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물에서 마련된 분획 추출물을 LPS로 자극된 RAW 264.7 macrophage cell을 이용한 in vitro 항염증 효과 실험 결과 매우 우수한 항염증 효과를 보유함을 알 수 있었다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포 추출물의 in vitro 항산화 효과 측정
실시예 4에서 은행나무의 형성층 유래 줄기세포 추출물 분획의 항산화 활성을 측정하였던 것에 추가하여, 다음과 같이 은행나무의 형성층 유래 줄기세포 추출물 자체의 항산화 활성을 Xanthin/xanthin oxidase assay와 deoxyribose assay를 시행하여 확인하였다.
7-1: Xanthin / xanthin oxidase 저해활성 효과 분석
Xanthin/xanthin oxidase 시스템은 활성산소에 의한 산화스트레스 연구에서 O.-와 HO를 생성하기 위해 널리 이용되어왔다. Xanthin/Xanthin oxidase는 박테리아에서 인간에 이르기까지 널리 분포하고 있으며 molybdenum iron-sulfur flavin hydroxylase로 알려진 효소들 중의 하나이다. 또한 Xanthin oxidase는 생체 내 purine 대사에 관여하는 효소로써 xanthin 또는 hypoxanthin에서 요산을 형성하여 통풍을 일으키는 효소로 요산이 과도하게 생성되어 혈액 내에 증가하면 관절이나 관절주위조직 및 신장 등에 침착되어 염증을 일으키고, 이로 인하여 통증 및 신장 질환을 일으킨다. Xanthin/Xanthin oxidase는 hypoxanthine을 산화시켜 xanthine으로 전환시키고, 이것을 다시 uric acid로 산화시키는데 이 과정에서 O2 -와 H2O2가 생성 된다. X/XO 시스템은 in vitro 실험에서 O. 2 -와 H2O2에 대한 chemical probe들과 함께 사용되어 활성산소에 의한 세포수준 이하에서의 손상이나 그에 대한 방어기작(특히, 효소적 방어)의 활성을 측정하기 위해 이용될 수 있다.
Xanthin oxidase 저해활성을 측정하기 위하여, 실시예 2-1의 에탄올 추출물에 reaction mixture (30 mM EDTA (pH 7.4), 30 mM xanthine, 1.42 mM NBT(nitro blue tetrazolium))와 50 mM PBS를 넣어준 후 xanthine oxidase (0.5 U/mL)를 첨가하여, 15분 동안 반응시켰다. 그리고 용액의 흡광도를 560 nm에서 측정하여 시료가 어느 정도의 항산화 효과를 가지는지 그 저해 정도를 대조군과 비교하여 측정하였다. 대조군으로는 항산화제를 넣지 않고 xanthine oxidase만을 처리하였을 때 반응의 결과 나타나는 흡광도를 측정하여 결정하였으며, 각 분획 시료의 superoxide radical scavenging를 백분율로 환산하여 결정하였다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물과 vitamin C의 superoxide radical scavenging activity (단위: % inhibition)
Concentration (mg/mL) CMCs 추출물 Vitamin C
1
10
50
100
500		 27.78
30.95
53.97
73.8
85.72		 35.4
42.86
55.24
63.18
56.58
7-2: Deoxyribose assay
먼저 Non site-specific hydroxyl radical formation assay을 수행하였다. 즉, 유리 tube안에 100 μM FeCl3, 104 μM EDTA (pH 7.4)를 넣어 10분 동안 반응시킨 다음 1.5 mM 과산화수소, 2.5 mM Deoxyribose, 100 μM vitamin C를 넣어준 후 실시예 2-1의 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 에탄올 추출물을 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 반응시료에 1.5% 2-TBA (2-thiobarbituric acid)와 2.8% TCA (trichloroacetic acid)를 넣어 잘 혼합한 다음 80℃에서 30분 동안 반응시킨 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 다음, Site-specific hydroxyl radical formation assay은 다음과 같이 수행하였다. 모든 과정의 실험이 상기 non site-specific hydroxyl radical formation assay와 동일하나, vitamin C 대신에 같은 용량의 phosphate buffer를 넣어 실험하였다.
Sugar인 2-deoxyribose에 대한 OH.의 반응은 많은 산물들을 발생시킨다. Fenton system (Fe3 +-ascorbate-EDTA-H2O2)으로 발생하는 hydroxyl radical 에 의해 deoxyribose는 분해되며, 그 부산물이 산성 상태(낮은 pH)에서 가열에 의해 malonaldehyde (MDA)가 생성되게 된다. 생성된 malonaldehyde는 thiobarbituric acid (TBA) 와 반응하여 핑크색의 chromogen (2TBA-MDA)을 형성함으로써 532 nm에서 최대의 흡광도를 나타낸다. 따라서 시료 내 hydroxyl radical 소거활성이 존재하는 경우 시료 첨가에 의해 deoxyribose의 분해가 억제되며 흡광도가 감소하게 된다. 이러한 원리를 이용하여 ascorbic acid, H2O2, Fe(III)-EDTA, 2-deoxyribose가 함께 존재하는 모델시스템에서 여러 OH. scavengers들의 rate constant를 측정 비교할 수 있으나, 그 scavenger들과 이들 구성물들과의 반응이 없어야 한다는 조건이 부과된다. 시료의 hydroxyl radical 소거활성은 시료 무첨가군의 흡광도 변화를 100%로 기준하여 시료 첨가군의 흡광도 변화를 hydroxyl radical 생성 억제율로 표시하였다(표 9).
은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 농도가 높아질수록 non site specific (hydroxyl radical)의 효과보다 site-specific 즉 2가 금속이온의 scavenger 효과가 농도 비례 상승하는 것으로 나타났다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 deoxyribose assay (단위: % inhibition)
CMCs concentration
(mg/mL)		 Site-specific
(% inhibition)		 Non site-specific
(% inhibition)
Control
1
10
50		 0.00
4.00±0.05
54.28±0.08
93.14±0.12		 0.00
13.00±0.06
19.19±0.11
44.12±0.10
은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs ) 추출물의 in vivo 항산화 효과
실시예 7의 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 결과에 근거하여 in vivo 항산 효과 실험을 하기 위해 다음과 같이, 대표적 항산화 물질인 vitamin C와 비교 실험하였다.
간은 영양소 및 물질 대사와 해독을 담당하는 중요한 장기로 각종 스트레스와 체내 독성 물질로 인하여 실험동물 및 인간의 간 손상을 유발시키는바, 혈액과 간 조직에서 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 시료의 활성산소 소거 효과와 과산화물 생성 억제 실험을 하였다. Mouse의 혈청과 간 조직을 이용하여 간 기능의 효소 활성, 항산화 효소 활성 등의 실험적 접근을 통한 생리 기능적 효과를 실험함으로써 은행나무의 형성층 유래 줄기세포 추출물의 항산효과를 입증하고자 하였다.
8-1: 실험동물 사육 및 실험군
은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 in vivo 항산화 효과를 위한 실험동물은 4주령의 암컷 ICR mouse 18마리를 오리엔트사(대전, 대한민국)로부터 구입하였다. 실험동물은 일정한 조건(온도: 21±2℃, 습도: 50~60%, 명암: 12시간 주기(07:00~19:00))하의 사육실에서 일반 고형사료와 물을 무제한 공급하면서 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. ICR mouse 6마리를 1군으로 하여 Normal control군과 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 군, Vitamin C군 등의 실험군으로 구분하였다. Normal control군은 증류수 0.5 mL를 3주 동안 구강투여 하였으며, 실험군은 실시예 2-1의 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 에탄올 추출물 또는 vitamin C를 3일에 1번 200 mg/kg의 농도로 증류수에 녹여 0.5 mL씩 3주 동안 구강투여 하였다.
8-2: 시료 채취
실험 시작 12시간 전에 절식시킨 mouse를 경추탈구 시키기 전에 먼저 혈청을 얻기 위하여 mouse 안와정맥에서 혈액을 채취하여 30분간 실온에서 방치, 혈액을 응고시켰다. 응고된 혈액을 4℃에서 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 얻은 상등액(혈청)을 수거하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 혈액을 채취한 mouse는 경추탈구 시킨 후 간 조직을 적출하여 차가운 생리식염수로 세척한 다음 간 조직을 세절하고 3회 수세하여 혈액을 제거한 후 조직 0.5 g을 취하여 각 조직을 homogenize tube에 넣고 5배량의 potassium phosphate buffer (pH 7.3)를 넣은 후 homogenizer로 5분간 균질화시켰다. 이 균질액을 4℃에서 원심분리(20,000 xg, 20분)하여 상등액을 취하여 시료로 사용하였다.
8-3: 간 조직을 이용한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs ) 추출물의 항산화 활성 분석
은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 in vivo 항산화 효과 분석을 위한 기초 연구로서 실시예 8-2에서 채취한 간 조직으로 항산화효소인 GSH concentration, SOD activity, Catalase activity, GPx activity를 측정하였다.
과산화가 유발된 지질은 GSH와 thiols 함유 단백질과 상호작용을 하며, 이러한 상호작용을 통해 산화적 스트레스 유발 시 GSH 감소와 thiols 함유 단백질의 불활성화를 가져온다. 세포내 대부분의 주요 효소가 활성화되기 위해 필요한 thiols에 산화가 유발되면 효소의 활성이 파괴된다. 이러한 산화적 불활성화에 의해 세포사가 유발되게 되는데 생체 내 활성산소 소거제로 알려진 GSH는 GPx에 의해 과산화수소를 제거하면서 GSSH로 전환되고, GSSH는 gluthathion reductase (GR)에 의해 NADPH를 소모하면서 다시 GSH로 환원되어 활성산소로부터 세포를 보호하는데 중요한 역할을 한다. 이에 GSH 양에 대한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 영향을 알아보기 위해 Biovision사의 gluthathion concentration assay kit를 사용하여 간 조직에서 GSH 양의 변화를 측정하여 확인하였다.
그 결과, 표 10 및 도 19A에 나타난 바와 같이, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 군, Vitamin C군의 GSH 함량이 Normal control군에 비하여 유의적으로 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 생체 내 활성산소를 소거하는 효과가 있음을 입증하는 결과이다.
한편, 세포내 SOD (superoxide dismutase)는 산소유리기의 세포손상에 대한 1차 방어선으로 산화과정에서 생성된 superoxide anion을 과산화수소로 전환시키고 과산화물을 신속히 분해시켜 활성산소로부터 세포를 보호한다. 활성산소를 제일 처음 제거시키는 효소로 활성산소와 관련된 질병을 예방하거나 치료하는 역할을 수행한다. 이에 SOD 활성에 대한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 영향을 알아보기 위해 간 조직에서 SOD 효소의 활성도 변화를 Cayman Chemical Company의 Superoxide dismutase assay kit를 사용하여 간 조직에서 SOD 활성을 측정하여 확인하였다.
그 결과, 표 10 및 도 19B에 나타난 바와 같이, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 군, Vitamin C군이 Normal control군에 비하여 유의적으로 활성이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 GSH 함량의 결과와 마찬가지로 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 생체 내 활성산소를 소거하는 효과가 있음을 입증하는 결과이다.
아울러, Catalase는 hemoprotein으로서 한 분자당 3가 철이온(Fe+++)이 4개가 있으며 효소 활성 시에는 산화 상태로 존재한다. SOD가 활성산소를 제거하면 과산화수소가 생기는데 이 과산화수소는 호기성 당 분해 산화과정의 최종산물로서 세포 독성 작용이 있으므로 세포 내에 축적되면 세포가 죽게 된다. 이 과산화수소를 가수분해하여 1차적으로 활성산소를 제거하여 방어하는 효소가 바로 이 catalase이다. 따라서, Catalase활성에 대한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 영향을 알아보기 위해 간 조직에서 catalase 효소의 활성도 변화를 Invitrogen사의 Amplex Red catalase assay kit를 사용하여 간 조직에서 catalase 활성을 측정하여 확인하였다.
그 결과, 표 10 및 도 19C에 나타난 바와 같이, Normal control군에 비하여 vitamin C군, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)군 모두 투여에 따른 변화가 관찰되지 않았다. 항산화물질에 따라 SOD가 활성산소를 제거하면 catalase와 GPx효소 모두 작용하는 물질, GPx효소만 작용하는 물질, catalase효소만 작용하는 물질 등이 있다고 하는데, vitamin C와 CMCs는 GPx 경로를 거쳐 과산화수소를 제거해주는 물질로 보여진다.
한편, SOD가 활성산소에 의해 생성된 과잉의 과산화수소는 체내 catalase와 GPx (gluthathion peroxidase)활성에 의해 물로 무독화 되는데 catalase활성은 과산화수소의 1차적 방어효소인 반면, GPx는 제거되지 못한 과산화수소를 제거하는 일종의 활성산소 잔해를 말끔히 제거하여 주는 효소가 바로 이 gluthathion peroxidase이다. 즉 언제든지 활성산소가 될 가능성을 지니고 있는 과산화수소를 제거해주는 주된 역할을 하는 물질이다. 또한 GPx는 손상된 세포를 원래 상태로 수리하고 복구하는 역할도 한다. 따라서, GPx활성에 대한 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물의 영향을 알아보기 위해 간 조직에서 GPx 효소의 활성도 변화를 Cayman Chemical Company의 gluthathion peroxidase assay kit를 사용하여 간 조직에서 GPx 효소 활성을 측정하여 확인하였다.
그 결과, 표 10 및 도 19D에 나타난 바와 같이, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)군, Vitamin C군이 Normal control군에 비하여 유의적으로 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 생체 내 과산화수소를 제거하는 효과가 있음을 입증하는 결과이다.
Mouse 간에서의 항산화 효소 활성
Group GSH (mg/mL) SOD (U/mL) Catalase (arbitary units) GPx (nM/min)
Normal control 0.5±0.04 0.59±0.06 921.1±59.3 21.2±0.52
Vitamin C 1.4±0.19 0.99±0.06 1091.2±14.1 27.5±0.29
CMCs 1.2±0.24 0.88±0.04 1495.5±23.2 27.1±0.52
8-4: Mouse 혈청을 이용한 은행나무 CMCs 추출물의 생화학적 효소활성 분석
실시예 8-2의 Mouse에서 채취한 혈청을 녹십자에 의뢰하여 간 기능의 혈액학적 간 지표물질인 ALT, AST, ALP, LDH를 측정하였다. 그 결과는 표 11 및 도 20과 같다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물 투에에 따른 혈액 내 해독 효소 활성 (* p<0.05)
Group ALT (U/L) ALP (U/L) AST (U/L) LDH (U/L)
Normal control 43.0±2.4 71.2±4.5 57.8±6.0 432.8±102.2
Vitamin C 38.5±5.0 73.2±4.4 49.0±6.1 393.0±66.7
CMCs 34.0±2.2* 73.0±3.9 53.3±4.8 408.5±44.78
ALT (alanine aminotransferase)는 심장근과 간세포 내에 있는 특성효소로서 조직세포의 손상에 의해 혈청중의 활성도가 증가되어지는데, 특히 만성간염의 경우 현저하게 증가된다. AST와 함께 간질환의 진단에 널리 사용되는 효소로서 혈청 중 간독성으로 인해 간세포의 괴사와 간조직의 파괴가 진행됨에 따라 효소가 혈중으로 유리되어 혈장 내에서 활성이 증가함으로 이 효소의 활성은 간 손상의 지표로 이용된다.
표 11 및 도 20A에 나타난 바와 같이, ALT는 Normal control군에 비하여 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)군에서 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었고 Vitamin C군보다도 감소경향을 나타내었다. 이는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 간을 보호하는 가능성이 있음을 시사한다.
한편, ALP (alkaline phosphatase)는 만성간염이나 간경변증에서도 올라갈 수 있으나, 만들어진 담즙이 간세포에서 잘 배출되지 못하거나 담도가 막혔을 때 현저히 증가한다.
표 11 및 도 20B에 나타난 바와 같이, Normal control군, Vitamin C군, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)군 모두 유사한 수치를 보여주었다.
AST (aspartate aminotransferase) 또한 심장근과 간세포 내에 있는 특성효소로서 조직세포의 손상에 의해 혈청중의 활성도가 증가되어지는데, 특히 만성간염의 경우 현저하게 증가된다. ALT와 함께 간질환의 진단에 널리 사용되는 효소로서 혈청 중 간독성으로 인해 간세포의 괴사와 간조직의 파괴가 진행됨에 따라 효소가 혈중으로 유리되어 혈장 내에서 활성이 증가함으로 이 효소의 활성은 간 손상의 지표로 이용된다.
표 11 및 도 20C에 나타난 바와 같이, Normal control군에 비하여 Vitamin C군, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)군에서 감소함을 확인할 수 있었다. 하지만, 통계적인 유의성은 나타나지 않았다.
LDH (lactate dehydrogenase)는 악성 종양세포에서 다량 생성되므로 암의 존재를 파악하는데 이용되어진다.
표 11 및 도 20D에 나타난 바와 같이, Normal control군에 비하여 Vitamin C군, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)군에서 감소함을 확인할 수 있었다. 하지만, 통계적인 유의성은 나타나지 않았다.
상기와 같은 Mouse 실험을 통하여 간 조직의 항산화 효소의 활성, 즉 GSH concentration, SOD activity, Catalase activity, GPx activity 측정과 혈청으로부터 간 기능의 혈액학적 간 지표물질인 ALT, AST, ALP, LDH를 측정한 결과는 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 추출물이 생체 내에서 우수한 항산화 효과를 보유함을 제시한다.
은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs ) 추출물의 in vivo 항염 효과
5% dextran sodium sulfate (DSS)를 음용수에 섞어 mouse에 5~7일간 투여하면 부종, 발적 및 궤양, 혈변을 동반한 급성 대장염이 대장 전반에 걸쳐 유발된다. 초기병변은 혈변, 체중감소, 대장의 축소 등이 나타나며 시간이 지나면서 형질세포 및 림프구가 침윤하게 되고 만성염증의 소견을 띄게 된다. DSS로 대장염을 유발시킨 동물 모델이 사람의 궤양성 대장염 증상과 유사한 증상을 나타내 가장 좋은 모델임이 보고된바 있다 (Egger B, Bajaj-Elliott M, MacDonald TT, Inglin R, Eysselein VE, Buchler MW. Characterisation of acute murine dextran sodium sulfate colitis: cytokine profile and does dependency. Digestion 62: 240-248, 2000.). DSS induced colitis는 neutrophils and macrophage에 의해 주로 유도 되는 염증성 질환으로, 점막에서 염증을 유도하는 pro-inflammatory cytokine (IL-6, TNF-α)들에 의해 특징지어질 수 있다. 또한 최근 여러 연구들에서 DSS에서 유도되는 colitis는 T cell에서 분비되는 Th1 cytokine에 의해 질병이 심화 되는 것으로 알려져 있기 때문에, CD4+ effector T cell 에서 분비되는 Th1 type/Th2 type cytokines의 balance에 대한 연구는 염증성 질환 치료 및 예방에 중요 요소로 작용할 것으로 기대 된다. 본 실험에서는 CMCs 처리시 Th1 type cytokine, IFN-와 Th2 type cytokine, IL-4의 발현 양의 변화 및 pro-inflammatory cytokine (IL-6와 TNF-α)의 발현 양을 관찰함으로써 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)의 항염 효과를 입증하고자 하였다. 궤양성 대장염의 치료제로 주로 사용되는 sulfasalazine을 사용하여 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)와 비교 실험하였다.
9-1: 실험동물 사육 및 실험군
은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)의 in vivo 항산화 효과를 위한 실험동물은 4주령의 암컷 Balb/c mouse 30마리를 오리엔트사(대전, 대한민국)로부터 구입하였다. 실험동물은 일정한 조건(온도: 22±2℃, 습도: 50~60%, 명암: 12시간 주기(07:00~19:00))하의 사육실에서 일반 고형사료와 물을 무제한 공급하면서 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. Balb/c mouse를 6마리씩 5군(Normal control군, DSS군, DSS+SS군, DSS+CMCs군, CMCs+DSS+CMCs)으로 나누어 실험하였다. 증류수에 Dextran sulfate sodium(5%, W/V)을 첨가하여 5일간 식수대용으로 자유 공급시켜 급성 대장염을 유발시켰다. 그 후 DSS군(대조군)은 치료제를 공급하지 않았고, DSS+SS군(양성 대조군)은 급성 대장염을 유발시킨 후 치료제로 사용되는 sulfasalazine 사료(1 mg/day/마리)를 2주간 자유 섭취시켰다. 그리고 DSS+CMCs군은 급성 대장염을 유발시킨 후 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 사료를 2주간 자유 섭취시켰으며, CMCs+DSS+CMCs군은 DSS로 급성 대장염을 유발시키기 전에 먼저 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 사료 (100 mg/day/마리)를 1주간 먹인 후 급성 대장염을 유발시키는 동안에도 계속 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs) 사료를 2주간 자유 섭취시켰다. 이때, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)는 동결건조된 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)를 사료와 혼합하여 제형화하여 자유급식하였다.
9-2: 혈액 채취
실험 종료 시 각 군의 혈액을 안와정맥에서 채취하여 30분간 실온에서 방치, 혈액을 응고시켜 4℃에서 3,000 rpm으로 15분간 원심분리 한 후 얻은 상등액(혈청)을 수거하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
9-3: 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs )가 mouse 의 대장 길이와 상태 및 체중에 미치는 영향
혈액을 채취한 mouse는 경추탈구 시킨 후 대장을 절단하여 대장 길이를 측정하고 상태를 육안으로 확인하였다.
실험동물의 대장 길이와 그 상태를 조사한 결과, 도 21A에 나타난 바와 같이, Normal control군(56 mm)을 기준으로 대장의 길이를 살펴보면 DSS군(51 mm)은 짧아졌고 DSS+SS군과 DSS+CMCs군(56 mm)은 비슷하나 CMCs+DSS+CMCs군(64 mm)은 오히려 길어졌음을 알 수 있었다. DSS군의 대장 두께는 다른 군들에 비하여 일정하지 않고 백색에 가까운 색상을 띄고 있었으며 분변 강도 또한 가장 묽어 보였고 중앙으로만 쏠려있음을 관찰 할 수 있었다. DSS+SS군과 DSS+CMCs군의 대장 상태는 Normal control군과 유사한 경향을 보였는데 중간정도의 붉은 색상을 띄고 있으며 분변의 강도는 Normal control군 보다는 묽어 보였다. CMCs+DSS+CMCs군의 대장 상태는 밝은 선홍색을 띄고 있으며 분변의 강도는 오히려 Normal control군 보다 좋아 보였다.
또한 각 실험군의 평균 체중을 측정한 결과, 도 21B에 나타난 바와 같이, 각 실험군의 평균 체중은 급성 대장염을 유발시킨 후 CMCs+DSS+CMCs군(5일째), DSS+CMCs군(6일째), DSS+SS와 DSS 단독처리군(7일째) 점차 증가하였고, 체중의 회복정도 또한 CMCs+DSS+CMCs 군이 가장 양호하게 회복되는 것을 알 수 있었다.
9-4: 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs )가 대장 내 분변의 IgA 농도에 미치는 영향
소화관은 영양원이 되는 음식물을 소화 흡수할 뿐만 아니라 virus, 병원미생물 등 생체에 유해한 이물질을 배제하는 중요한 면역장기이다. 소화관에는 장관 상피의 임파구(lymphocyte), 점막 고유층(lamina propria)의 임파구, Payer's patch 등으로부터 구성되는 장관 관련 임파구 조직이 존재하여 효과적인 생체방어기구를 형성하고 있다. 면역 글로불린(immunoglobulin, Ig)은 항체로서의 기능을 담당하는 일군의 단백질이며 생체의 체액성 면역에 중요한 역할을 담당한다. 특히, 소화관 점막 상피세포에서 분비되는 분비형 IgA 항체는 소장에서 대량으로 생산되어 유해물질의 흡수억제, 항원에 대한 중화 및 제거 등을 통하여 점막면역기구의 중심역할을 한다.
따라서, 대장 내 분변에 들어있는 IgA의 농도를 측정하기 위하여 대장을 protease inhibitor가 들어있는 PBS 용액에 넣어 잘게 조각낸 다음 vortex로 균질화 하였다. 이 용액을 원심분리(4℃, 12,000 rpm, 10분)한 후, 상층액을 채취하여 IgA항체를 이용하여 대장 내 분변의 IgA 농도를 측정하였다.
먼저 ELISA plate 표면에 분변 상층액을 coating buffer (0.1 M carbonate, pH 9.5)로 고정시키기 위하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. Plate를 0.05% Tween-20이 포함된 1x PBS (PBS-T)로 5회 세척한 다음 2% BSA가 포함된 1x assay diluent 용액으로 실온에서 2시간 blocking하였다. Plate를 1x PBS-T로 3회 세척한 다음, alkaline phosphate (AP)가 결합된 anti-mouse Ig A를 넣어 실온에서 2시간 반응시켰다. Plate를 다시 1x PBS-T로 5회 세척한 다음 AP기질용액인 Phosphatase substrate를 넣고 Plate의 반응 정도를 microplate reader에서 405 nm 흡광도로 측정하였다. 이때 표준물질로는 mouse IgA를 사용하였다.
ELISA를 이용하여 대장 내에 있는 IgA 농도를 측정한 결과, 표 12 및 도 22에 나타난 바와 같이, DSS 단독 처리군에서만 높게 나타났다. 이 결과는 점막의 epithelial cell에 있는 polymeric immunoglobulin receptor (pIgR)에 의해 lumen으로 분비되는 IgA의 경우 normal mouse 에 비해 DSS에 의한 colitis가 유도 되었을 때 5배 이상 대장 내로 증가 된 것으로 미루어 염증질환에 의한 조직 손상을 예측 할 수 있었다. 이에 반해 DSS+SS군, DSS+CMCs군 그리고 CMCs+DSS+CMCs군의 IgA 분비량은 변화가 거의 없게 측정되었기 때문에, SS나 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)에 의한 염증 완화로 인해 점막 조직의 손상이 적게 일어났음을 알 수 있었다.
대장 내 분변 IgA 농도 (ng/mL)
Group Colon supernatant (mean ± SE)
Normal control 46.53±3.2
DSS only 304.75±18.39
DSS + SS 52.67±4.27
DSS + CMCs 67.5±19.23
CMCs + DSS + CMCs 37.74±1.07
9-5: 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs )가 Mesenteric lymph node ( MLN ) 임파구 배양액의 cytokine 농도에 미치는 영향
각 마우스 장관 임파절(MLN)을 적출한 후 collagenase solution으로 dissociation 시켜 mono cell 상태의 cell을 percoll gradient를 이용하여 lymphocyte를 분리한 다음, 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 medium에 부유시켜 24 well plate에 2x106 cells/well의 농도로 분주하고 lymphocyte의 증식을 촉진시키기 위하여 2 ㎍/mL의 농도로 Con A를 첨가한 후 5% CO2 incubator에서 24 hr(IFN-γ, TNF-α) 또는 48 hr (IL-4, IL-6) 배양하였다.
점막층은 섭취한 장 내용물들이 장관 내부에서 잘 흘러가도록 장관 내 표면에 윤활유 같은 작용을 하며, 하부에 존재하는 장관 세포에 화학적, 미생물학적, 물리적 손상이 가해질 때에 방어력을 지니는 제1차 방어선 역할을 담당하는데, 이 장관 상피세포에 강한 세균들이 침입하게 되면 염증 촉진 사이토카인과 그에 의한 mRNA들이 매우 급속도로 방출되므로, 이에 DSS 섭취에 의한 염증성 사이토카인(IL-4, IL-6: 48 hr 배양, IFN-, TNF-a: 24 hr 배양)에 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)가 어떤 영향을 미치는지 ELISA 방법으로 측정하였다.
먼저 각 사이토카인의 capture antibody를 96-well ELISA plate에 넣고 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. Plate를 0.05% Tween-20이 포함된 1x PBS (PBS-T)로 5회 세척한 다음 2% BSA가 포함된 1x assay diluent 용액으로 실온에서 2시간 blocking하였다. Plate를 1x PBS-T로 3회 세척한 다음, 세포 배양액 또는 각 사이토카인 표준단백질을 넣어 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 다시 1x PBS-T로 5회 세척하고 detection antibody를 넣어 실온에서 2시간 반응시켰다. Plate를 다시 1x PBS-T로 5회 세척하고 avidin-HRP 용액을 넣어 실온에서 30분간 반응시켰다. 이를 1x PBS-T용액으로 7회 세척한 다음 TMB 기질용액을 넣고 최종 15분간 실온에서 반응시키고, 반응정지액(H3PO4)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Plate의 반응 정도를 microplate reader에서 430 nm 흡광도로 측정하였다. 이때 표준물질로 각각의 recombinant를 사용하였다.
ELISA를 이용하여 점막의 면역 시스템에서 중요한 역할을 하는, MLN 임파구 배양액에서 cytokine을 측정한 결과, 표 13 및 도 23에 나타난 바와 같이, DSS에 의해 colitis가 유도됨이 IFN-γ, TNF-α와 IL-6의 발현이 증가됨을 통해 확인할 수 있었다. 질병 완화의 control로 사용된 DSS+SS군의 경우 Th2 type cytokine, IL-4의 발현이 증가 되고 상대적으로 IFN-γ, TNF-a, 와 IL-6이 감소하였기 때문에 Th2 type cytokine과 Th1 type cytokine의 발현 balance 작용에 의한 결과로 해석되며, 이러한 현상은 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)를 먹인 그룹이 보다 높은 효율로 유도된 것을 알 수 있어 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)의 염증 완화 치료제의 가능성을 확인할 수 있었다.
MLN 임파구 배양액의 IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-a 농도 측정(ng/mL)
Group IL-4
mean±st.er		 IL-6
mean±st.er		 IFN-γ
mean±st.er		 TNF-α
mean±st.er
Normal control 0.14±0.01 2.17±0.14 0 0.72±0.035
DSS only 0.025±0.005 5.72±0.16 3.815±1.35 7.23±0.07
DSS+SS 0.11±0.01 1.89±0.32 0.37±0.25 0.301±0.01
DSS+CMCs 0.087±0.003 1.83±0.42 0 0
CMCs+DSS+CMCs 0.158±0.002 1.94±0.27 0 0.269±0.01
9-6: 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs )가 혈청 IgA , IgG 농도에 미치는 영향
동물은 세균, 바이러스, 그 외의 비자기 단백질(foreign protein)등 여러 종류의 항원에 대하여 항체를 만들고 이들 항원에 대해 방어를 하게 된다. 각각의 항원에 대하여 만들어진 항체들은 주어진 항원과 반응하여 그들을 무기력화 시킨다. 항체는 immunoglobulin이라고도 불리며 포유동물의 혈액이나 침, 모유 등에서 발견된다. 분비액내의 IgA는 미생물 침입에 대한 첫번째 방어선으로 작용하며 위장 감염을 막는데 중요한 역할을 한다.
IgA는 호흡기 점막, 장점막 및 분비선에 존재하는 plasma cell에서 일차적으로 합성된 후 일부 IgA는 혈액으로 들어가며 대부분은 상피 세포내 또는 그 사이에 존재한다. 상피세포사이에 존재하는 IgA를 분비형 IgA (secretory IgA, sIgA)라 하는데 효소에 저항성을 갖는다. 또한 혈액 중 항체의 75%정도를 차지하는 것이 IgG인데 세균 항체, 바이러스 중화 항체, 침전 항체, 혈구 응집소와 용혈소의 대부분이 IgG이다.
따라서, 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)가 DSS에 의해 유도된 colitis mouse 혈청 IgA와 IgG에 어떤 영향을 미치는지 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다.
혈청의 IgA, Ig G 농도 측정 (mg/mL)
Group IgA
mean±std.err		 IgG
mean±std.err
Normal control 4.51±0.498 20.72±1.6
DSS only 7.29±0.32 12.54±1.16
DSS+SS 5.26±1.07 22.59±5.13
DSS+CMCs 5.58±0.14 17.13±4.35
CMCs+DSS+CMCs 5.70±0.09 21.13±1.1
그 결과, 표 14 및 도 24A에 나타난 바와 같이, 혈중 IgA 농도는 DSS 단독 처리군이 가장 높게 나타났고 DSS+SS, DSS+은행나무CMCs, CMCs+DSS+CMCs군이 Normal control군 보다는 높게 나타났으며, 표 14 및 도 24B에 나타난 바와 같이, 혈중 IgG 농도는 DSS only군이 가장 낮게 나타났고 DSS+SS, DSS+CMCs, CMCs+DSS+CMCs군이 Normal control군과 비슷하게 나타났다.
이전에 알려진 보고들처럼 DSS에 의해 유도된 colitis mouse 에서는 normal에 비해 IgG 발현이 적고 IgA 발현이 증가 된 것을 확인하였다. 이때, positive control인 SS나 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)를 먹인 군에서 IgA와 IgG의 정상수치로의 변화를 보아 염증완화에 의한 결과로 판단된다.
9-7: 은행나무의 형성층 유래 줄기세포( CMCs )가 비장 임파구 배양액의 cytokine 농도에 미치는 영향
각 군의 mouse spleen을 적출한 후 splenocyte를 분리하여 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 medium에 부유시켜 24 well plate에 2x106 cells/well의 농도로 분주하고 splenocyte의 증식을 촉진시키기 위하여 2 ㎍/mL의 농도로 Con A를 첨가한 후 5% CO2 incubator에서 24 hr 또는 48 hr 배양하였다.
점막층은 섭취한 장 내용물들이 장관 내부에서 잘 흘러가도록 장관 내 표면에 윤활유 같은 작용을 하며, 하부에 존재하는 장관 세포에 화학적, 미생물학적, 물리적 손상이 가해질 때에 방어력을 지니는 제1차 방어선 역할을 담당하며, 이 장관 상피세포에 강한 세균들이 침입하게 되면 염증 촉진 사이토카인과 그에 의한 mRNA들이 매우 급속도로 방출되므로, 이에 DSS 섭취에 의한 염증 사이토카인(IL-4, IL-6: 48 hr 배양, IFN-, TNF-a: 24 hr 배양)에 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)가 어떤 영향을 미치는지 ELISA 방법으로 측정하였다.
비장 임파구 배양액의 IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-a 농도 측정(ng/mL)
Group IL-4
mean±st.er		 IL-6
mean±st.er		 IFN-γ
mean±st.er		 TNF-α
mean±st.er
Normal control 0.66±0.04 0 0 0
DSS only 0.086±0.03 0.61±0.02 4.0±0.08 0.087±0.01
DSS+SS 1.705±0.12 0.89±0.07 3.0±0.14 0.07±0.004
DSS+CMCs 3.23±0.011 0.41±0.04 0.77±0.15 0
CMCs+DSS+CMCs 1.58±0.11 1.54±0.06 0.84±0.06 0.059±0.01
전신 면역 기관에서의 DSS-induced colites에 의한 Th1 type T cell들의 영향을 확인하고자 spleen 임파구 배양액으로부터 각 cytokine을 확인한 결과, 표 15 및 도 25에 나타난 바와 같이, DSS에 의해 유도된 colitis mouse에서 normal mouse에 비해 상대적으로 Th1 type cytokine 및 pro-inflammatory cytokine의 증가를 확인 하였으며, 이는 MLN의 결과와 마찬가지로 SS나 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)를 먹인 군이 Th2 type cytokine 증가에 따른 Th1 type cytokine 및 pro-inflammatory cytokine의 발현양의 감소로 인해 염증 반응이 완화된 것으로 기대된다.
DSS에 의해 유도된 colitis mouse의 은행나무의 형성층 유래 줄기세포(CMCs)를 이용한 in vivo 항염 효과(대장 조직의 육안 관찰, 대장내 분변의 IgA 농도, MLN 임파구 배양액의 cytokine 측정, 혈청에서의 IgA, IgG농도 측정, 비장 임파구 배양액의 cytokine 측정 등)를 실험한 결과 우수한 항염 효과를 보유함을 알 수 있었다.
제조예 1. 약학제제 제조예
제제예 1-1: 정제의 제조
실시예 2에서 제조된 줄기세포 추출물 100 ㎎을 옥수수 전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.
제제예 1-2: 캡슐제의 제조
실시예 2에서 제조된 줄기세포 추출물 500 ㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 1-3: 시럽제의 제조
실시예 1에서 수득한 줄기세포 1 g, 이성화당 10 g, 만니톨 5 g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100 mL의 시럽제를 제조하였다.
제제예 1-4: 주사제의 제조
실시예 2에서 제조된 줄기세포 추출물 200 ㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 ㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.
제조예 2. 기능성 식품의 제조
제조예 2-1: 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 수득한 줄기세포 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
제조예 2-2: 기능성 음료의 제조
실시예 2에서 제조한 줄기세포 추출물 200 ㎎을 96 mL 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1 g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05 g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100 mL로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> UNHWA CORPORATION <120> Anti-inflammatory composition comprising plant stem cell derived from cambium of family ginkgoaceae <130> P10-B315 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 gene Forward primer <400> 1 aagaagaaag ttcattcctg atccc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 gene Reverse primer <400> 2 tgactgtggg aggatacatc tctcc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS gene Forward primer <400> 3 ctgcagcact tggatcagga acctg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS gene Reverse primer <400> 4 gggagtagcc tgtgtgcacc tggaa 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH gene Forward primer <400> 5 ccgatgcccc catgtttgtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH gene Reverse primer <400> 6 ggccatgcca gtgagcttcc 20

Claims (22)

  1. 은행나무과(family Ginkgoaceae)의 형성층에서 유래되고, 탈분화를 거치지 않은 선천적 미분화세포인 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 항염증 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 다음 중 적어도 하나의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물:
    (a) 현탁배양 시 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 많은 수의 단세포를 포함하거나 작은 사이즈의 세포 집합체를 포함함;
    (b) 다수의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄;
    (c) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 활성이 증가된 미토콘드리아를 가짐;
    (d) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 생장속도가 빠르고 오랫동안 성장할 수 있음; 및
    (e) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐.
  3. 제2항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 두 개의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 세 개의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 네 개의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 분리된 것을 특징으로 하는 항염증 조성물:
    (a) 은행나무과 식물로부터 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 형성층으로부터 세포들을 분리함으로써 형성층 유래 줄기세포를 수득하는 단계.
  8. 제1항에 있어서, 상기 배양물은 상기 줄기세포를 3~5 %(g/L)의 원당 또는 설탕; 또는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 세릭 암모니움 니트레이트(ceric ammonium nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate) 및 아세트산 나트륨 (sodium acetate) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 추가로 배양하여 수득된 것임을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (dimethyl sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 은행나무과는 은행나무속(genus Ginkgo)인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 은행나무과는 은행나무(Ginkgo biloba)인 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
  12. 은행나무과의 형성층에서 유래되고, 탈분화를 거치지 않은 선천적 미분화세포인 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 염증의 예방 또는 개선용 기능성 식품.
  13. 제12항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 다음 중 적어도 하나의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 기능성 식품:
    (a) 현탁배양 시 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 많은 수의 단세포를 포함하거나 작은 사이즈의 세포 집합체를 포함함;
    (b) 다수의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄;
    (c) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 활성이 증가된 미토콘드리아를 가짐;
    (d) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 생장속도가 빠르고 오랫동안 성장할 수 있음; 및
    (e) 은행나무과의 탈분화된 캘러스에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐.
  14. 제13항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 두 개의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
  15. 제13항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 세 개의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
  16. 제13항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성 중 적어도 네 개의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
  17. 제13항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 상기 (a) 내지 (e)의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
  18. 제12항에 있어서, 상기 은행나무과의 형성층 유래 줄기세포는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 분리된 것을 특징으로 하는 기능성 식품:
    (a) 은행나무과 식물로부터 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 형성층으로부터 세포들을 분리함으로써 형성층 유래 줄기세포를 수득하는 단계.
  19. 제12항에 있어서, 상기 배양물은 상기 줄기세포를 3~5 %(g/L)의 원당 또는 설탕; 또는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 세릭 암모니움 니트레이트(ceric ammonium nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate) 및 아세트산 나트륨 (sodium acetate) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 추가로 배양하여 수득된 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
  20. 제12항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (dimethyl sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
  21. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 은행나무과는 은행나무속인 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
  22. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 은행나무과는 은행나무인 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
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