KR20120021401A - Ａｔｇ5 유전자를 과발현하는 수명이 연장된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법 - Google Patents
Ａｔｇ5 유전자를 과발현하는 수명이 연장된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Atg5 유전자를 과발현하여 향상된 기저 자식작용에 의해 수명이 연장된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Atg5 유전자 형질전환 동물은 평균 수명이 WT 마우스보다 더 연장되며, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 Atg5에 의해 유도된 향상된 자식작용 활성을 나타내고, 이러한 향상된 자식작용 활성이 산화적 스트레스에 의해 유도된 세포사멸에 대한 내성에 중요하며, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산 β-갈락토시다제 활성이 WT 마우스의 MEFs에 비해 감소한다. 또한, 본 발명에 따른 Atg5 형질전환 동물은 비만 억제에 탁월한 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Atg5 형질전환 동물은 Atg5 유전자를 과발현하여 향상된 기저 자식작용에 의해 수명을 연장시킬 수 있음으로, Atg5 유전자 형질전환 동물은 수명 연장 동물모델로 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 Atg5 유전자를 과발현하여 향상된 기저 자식작용에 의해 수명이 연장된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
자식작용(autophagy)은 세포질에서 리소좀(lysosome)으로 이동되는 과정을 포함하는 세포내 단백질 및 소기관을 분해하는 과정을 일컫는다. 자식작용은 세포의 생존, 분화, 발생 및 항상성 유지를 위해 필수적인 과정으로, 자식작용 조절의 이상은 암을 비롯한 퇴행성 신경질환, 간질환, 심장질환, 근질환, 감염성 질환, 노화 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 자식작용은 기본적으로 세포를 보호하는 작용이지만, 상황에 따라서 그 기능이 세포사멸을 유도하는 등 상반된 역할을 담당하기도 한다.
세포에서 리소좀 경로를 이용하는 자식작용이 존재한다는 사실은 크리스티앙 드 뒤브(Christian de Duve) 박사에 의해 이미 1960년대 밝혀졌으나, 그 후 30여 년 동안 관련 연구가 미진하였다. 그러나, 1990년대 후반 효모(yeast)와 포유류에서 자식작용 조절 유전자인 ATG(autophagy-regulated gene)들이 밝혀진 후, 이들 ATG 단백질이 다양한 질병에 직?간접적으로 연관되어 있다는 연구 결과가 발표되었으며, 이들 ATG 단백질 관련 연구가 매년 폭발적으로 증가하고 있다.
특히, ATG 단백질 중 Atg5 단백질은 세포사멸 동안 칼파인(calpain)에 의해 절단되어 세포사멸을 촉진시키고, Atg5 단백질의 과발현은 생쥐 종양 이식 모델에서 종양 억제제와 같은 작용을 보여주었다. 그러나, Atg5 단백질이 수명 연장에 미치는 효과에 대한 연구는 거의 전무한 상태이다.
일반적으로, 수명 연장이란 세포의 노화를 막는 것이다. 따라서, 최근에는 고등진핵생물 및 고등식물에서 노화에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재 가장 많이 알려져 있는 수명 연장에 관한 이론으로는, 음식물 칼로리 제한(CR, caloric restriction) 이론이다. 음식물 칼로리 제한 이론은 효모에서부터 포유동물에까지 모두 적용될 수 있으며, 음식물 섭취를 줄임으로써 대사과정에서 생기는 활성 산소 등 노화를 촉진시키는 물질 생산을 감소시켜 궁극적으로 수명 연장 효과를 나타낸다는 것이다. 즉, 칼로리 제한의 유익한 효과에서 자식작용이 중요한 역할을 하며, 이는 수명 연장에서 자식작용이 중요한 역할을 한다는 것을 제안할 수 있다.
세포의 노화를 막고 동물의 수명을 연장시키기 위해서는 연구에 적합한 형질전환 동물 모델의 개발이 필수적이다. 특히 노화 연구는 사람의 노화를 어떻게 조절하느냐가 중요한 관건이므로 사람과 유전학적, 생리학적, 해부학적으로 유사하며 실험하기 용이한 실험동물을 택하여 연구하는 것이 매우 중요하다. 이러한 점에서 실험동물로는 마우스가 가장 적합한 것으로 알려져 있고, 연구자들에게 널리 애용되고 있다.
현재 자식작용 조절 유전자인 Atg5 유전자를 이용한 수명이 연장된 형질전환 동물에 관하여는 아직까지 개발된 바 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다. 따라서, 자식작용 조절 유전자인 Atg5 유전자를 이용한 수명이 연장된 형질전환 동물에 대한 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 Atg5 유전자를 이용한 수명이 연장된 형질전환 동물을 개발하기 위하여 연구하던 중, Atg5 유전자가 삽입된 형질전환용 벡터를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 수정란을 이용하여 Atg5 형질전환 동물을 제조하였으며, 상기 Atg5 유전자 형질전환 동물의 평균 수명이 WT 마우스보다 더 연장되고, Atg5 형질전환 마우스에서 Atg5 mRNA, Atg5-Atg12 결합체, LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준이 WT 마우스에 비해 모두 증가하며, 이중 형질전환 마우스(Atg5/GFP-LC3)에서 GFP-LC3의 형광이 GFP-LC3 형질전환 마우스에 비해 더 크게 나타나고, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산화적 스트레스에 의해 유발된 세포독성에 대해 큰 내성을 나타내며, 산 β-갈락토시다제 활성이 감소되어 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 Atg5의 향상된 발현이 수명을 연장시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 Atg5 유전자를 과발현하여 향상된 기저 자식작용에 의해 수명이 연장된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 꼬리에서 게놈 DNA를 추출하고 PCR을 수행하여 유전자형 검사(genotyping) 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스와 WT 마우스의 Kaplan-Meier 생존곡선을 나타낸 도이다[(A) 합쳐진 암컷 및 수컷의 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스(p<0.001; n=60), (B) 수컷 마우스(p<0.001; WT 마우스 (n=15), Atg5 형질전환 마우스(n=18)), 및 (C) 암컷 마우스(p<0.001; WT 마우스 (n=15), Atg5 형질전환 마우스(n=20)).
도 3은 본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스에서 Atg5 mRNA의 발현 수준을 RT-PCR 분석으로 관찰한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 Atg5 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 관찰한 도이다.
도 5는 GFP-LC3 형질전환 마우스와 Atg5/GFP-LC3 이중 형질전환 마우스에서 자식작용 활성의 형광생성을 FITC를 이용하여 관찰한 도이다.
도 6은 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)의 산화적 스트레스 유도에 의한 세포사멸을 관찰한 도이다[(A) 세포생존율, (B) 광학현미경 사진].
도 7은 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산화적 스트레스 유도에 의한 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 관찰한 도이다.
도 8은 다양한 세포사멸 신호에 대한 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)의 민감성을 비교한 도이다.
도 9는 본 발명의 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)에서 산 β-갈락토시다제 활성을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 Atg5 형질전환 마우스의 지방조직에서 Atg5 단백질과 Atg5-Atg12 결합체의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 관찰한 도이다.
도 11은 본 발명의 Atg5 형질전환 마우스에 고지방 식이를 급여한 후 마우스의 몸무게 변화를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 Atg5 형질전환 마우스에 고지방 식이를 급여한 후 마우스의 지방조직 형성 변화를 관찰한 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스와 WT 마우스의 Kaplan-Meier 생존곡선을 나타낸 도이다[(A) 합쳐진 암컷 및 수컷의 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스(p<0.001; n=60), (B) 수컷 마우스(p<0.001; WT 마우스 (n=15), Atg5 형질전환 마우스(n=18)), 및 (C) 암컷 마우스(p<0.001; WT 마우스 (n=15), Atg5 형질전환 마우스(n=20)).
도 3은 본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스에서 Atg5 mRNA의 발현 수준을 RT-PCR 분석으로 관찰한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 Atg5 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 관찰한 도이다.
도 5는 GFP-LC3 형질전환 마우스와 Atg5/GFP-LC3 이중 형질전환 마우스에서 자식작용 활성의 형광생성을 FITC를 이용하여 관찰한 도이다.
도 6은 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)의 산화적 스트레스 유도에 의한 세포사멸을 관찰한 도이다[(A) 세포생존율, (B) 광학현미경 사진].
도 7은 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산화적 스트레스 유도에 의한 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 관찰한 도이다.
도 8은 다양한 세포사멸 신호에 대한 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)의 민감성을 비교한 도이다.
도 9는 본 발명의 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)에서 산 β-갈락토시다제 활성을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 Atg5 형질전환 마우스의 지방조직에서 Atg5 단백질과 Atg5-Atg12 결합체의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 관찰한 도이다.
도 11은 본 발명의 Atg5 형질전환 마우스에 고지방 식이를 급여한 후 마우스의 몸무게 변화를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 Atg5 형질전환 마우스에 고지방 식이를 급여한 후 마우스의 지방조직 형성 변화를 관찰한 도이다.
본 발명은 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환용 벡터를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 수정란을 이용하여 형질전환되며 Atg5 유전자를 과발현하는, 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) Atg5 유전자를 형질전환용 벡터에 서브클론한 후 형질전환 카세트를 분리하는 단계,
2) 상기 분리된 형질전환 카세트를 인간을 제외한 포유동물 배아에 주입하여 수정란을 제조하는 단계, 및
3) 상기 수정란을 인간을 제외한 대리모 포유동물에 착상시켜 형질전환 동물을 생산하는 단계를 포함하는, 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 Atg5 유전자를 과발현하는 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물은, Atg5를 엔코딩하는 전장 언태그된(untagged) cDNA를 거대세포 바이러스(cytomegalovirus) 증강제, 닭 β-actin 프로모터 및 토끼 β-글로빈 폴리(A)를 함유하는 pCAGGS 벡터에 서브클론하여 플라스미드 pCAGGS-Atg5를 제조한 후, 이를 Sal I와 Xho I를 이용하여 절단하고 형질전환 카세트를 분리한 다음, 분리된 형질전환 카세트를 인간을 제외한 포유동물 배아에 주입한 후, 수정란을 인간을 제외한 대리모 포유동물에 착상시켜 생산되는 것을 특징으로 한다.
상기 인간을 제외한 포유동물은 설취류가 바람직하며, 마우스가 가장 바람직하다.
상기 생산된 Atg5 유전자 형질전환 마우스와 WT 마우스를 재교배하여 태어난 자손세대의 마우스의 게놈 DNA를 추출하고 PCR을 수행하여 유전자형 검사를 실시한 결과, Atg5 유전자 형질전환 마우스의 경우 1kb 위치에서 밴드가 나타나는 반면, WT 마우스의 경우는 밴드가 나타나지 않는다. 따라서, Atg5 유전자 형질전환 마우스와 WT 마우스를 재교배하면 Atg5 유전자가 후대로 전달됨을 알 수 있다.
본 발명의 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 평균 수명은 WT 마우스보다 더 연장되며, Atg5 형질전환 마우스에서 Atg5 mRNA의 발현 수준이 높게 나타나고, Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스로부터 분리한 조직(뇌, 흉선, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 근육)에서 Atg5-Atg12 결합체와 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준이 WT 마우스에 비해 모두 증가하며, 이중 형질전환 마우스(Atg5/GFP-LC3)에서 GFP-LC3의 형광이 GFP-LC3 형질전환 마우스에 비해 더 크게 나타난다. 이는, Atg5 형질전환 마우스가 Atg5에 의해 유도된 향상된 자식작용 활성을 나타낸다는 것을 암시한다.
또한, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs는 WT 마우스의 MEFs 보다 산화적 스트레스 유도에 의한 세포독성에 대해 유의하게 더 큰 내성을 나타내고, 산화적 스트레스 유도에 의한 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준이 더 높게 나타난다. 따라서, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 나타난 향상된 자식작용 활성이 산화적 스트레스에 의해 유도된 세포사멸에 대한 내성에 중요하다는 것을 알 수 있다. 또한, H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대해 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs가 WT 마우스의 MEFs에서 보다 완전하게 더 민감한 반면, 에토포사이드 (etoposide), 스타우로스포린(staurosporine) 및 TNF-α/시클로헥시미드와 같은 기타 사멸 신호에 의해 유발된 세포사멸에 대해서는 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 유사한 민감성을 나타낸다. 또한, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산 β-갈락토시다제 활성이 WT 마우스의 MEFs에 비해 감소한다. 따라서, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 Atg5의 향상된 발현이 수명을 연장시킨다는 것을 알 수 있다.
또한, Atg5 형질전환 마우스의 지방조직에서 Atg5 단백질과 Atg5-Atg12 결합체의 발현 수준은 WT 마우스에 비해 모두 증가하고, 고지방 식이를 급여한 후 Atg5 형질전환 마우스의 몸무게는 WT 마우스에 비해 현저히 감소하며, WT 마우스의 지방조직 무게는 Atg5 형질전환 마우스의 지방조직보다 3배 정도 높게 나타난다. 따라서, 본 발명에 따른 Atg5 형질전환 마우스는 비만 억제에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 Atg5 유전자 형질전환 동물은 평균 수명이 WT 마우스보다 더 연장되며, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 Atg5에 의해 유도된 향상된 자식작용 활성을 나타내고, 이러한 향상된 자식작용 활성이 산화적 스트레스에 의해 유도된 세포사멸에 대한 내성에 중요하며, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산 β-갈락토시다제 활성이 WT 마우스의 MEFs에 비해 감소한다. 또한, 본 발명에 따른 Atg5 형질전환 동물은 비만 억제에 탁월한 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Atg5 형질전환 동물은 Atg5 유전자를 과발현하여 향상된 기저 자식작용에 의해 수명을 연장시킬 수 있음으로, Atg5 유전자 형질전환 동물은 수명 연장 동물모델로 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
: Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 제조
1. Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 제조
설취류 Atg5를 엔코딩하는 전장 언태그된(untagged) cDNA를 거대세포 바이러스(cytomegalovirus) 증강제, 닭 β-actin 프로모터 및 토끼 β-글로빈 폴리(A)를 함유하는 pCAGGS 벡터(S1)의 Sal I 사이트로 서브클론하였다. 플라스미드 pCAGGS-Atg5를 Sal I와 Xho I를 이용하여 절단하고 형질전환 카세트를 분리하였다. 분리된 형질전환 카세트를 C57BL/6 마우스 배아에 주입한 다음, 마우스 배아(수정된 배아-세포 접합자)를 암컷 마우스(Macrogen Inc., Seoul, Korea)에 착상시켜 형질전환 마우스를 생산하였다. 상기 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 수정란을 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2010년 6월 22일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC11716BP).
2. Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 확인
상기 1에서 생산한 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 꼬리로부터 준비된 게놈 DNA를 이용하여 게놈 DNA PCR 분석으로 Atg5 mRNA 발현 정도를 측정하여 형질전환 마우스를 확인하였다. 양성 F0 마우스는 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 cDNA로부터 pCAGGS에 대응하는 합성 올리고누클레오티드(전방향, 5'-CGG CTC TAG AGC CTC TGC TAA C-3')와 올리고누클레오티드(역방향, 5'-TGA TGG CCC AAA ACT GGT-3')를 이용하여 확인하였다. 3개의 독립 원조 라인을 확인하고 야생형(WT) C57BL/6 마우스에 교배시켰다. 모든 마우스는 음식과 물을 자유로이 섭취시켰으며 12:12시간의 빛:어둠 주기 하에 유지시켰다. 모든 동물의 프로토콜은 광주과학기술원과 서울대학교 동물 상임위원회에 의해 승인받았다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 1번 레인의 크기 마커의 1kb에 위치하는 부분에서 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 경우 밴드가 나타났으나, WT 마우스의 경우는 밴드가 나타나지 않았다. 따라서, Atg5 유전자 형질전환 마우스와 WT 마우스를 재교배하면 Atg5 유전자가 후대로 전달됨을 알 수 있다.
실험예 1
: Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 수명 연장 실험
본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 수명이 연장되는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
수컷 및 암컷의 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스와 WT 마우스를 이형의 품종 쌍으로부터 생산하고, C57BL/6 성장 환경을 유지하였다. 마우스를 4개군으로 나누어 특정 병원균이 없는 조건 하에서 8마리의 동일한 한배 새끼를 사육하였으며, 각각 매일 모니터하고 한달에 한번 무게를 재었다. 60마리의 수컷 및 암컷 마우스를 이용하여 생존율을 평가하였으며, 모든 동물의 죽은 시점을 기록하였다. Kaplan-Meier 생존 곡선은 알려진 출생일 및 사망일을 이용하여 구축하였으며, P 값(군 사이의 차이)은 로그-랭크 시험을 이용하여 계산하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 합쳐진 수컷 및 암컷 마우스 중 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 평균 수명은 약 780~880일로 WT 마우스보다 약 120일(약 17%) 정도 더 연장되었다(A). 또한, 성별 분석에서 수컷 및 암컷의 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 평균 수명은 각각 120일 및 115일로 유사하게 증가하였다(B, C). 상기 결과에 의해, Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 평균 수명은 WT 마우스보다 더 연장되며, Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 수명 연장은 성별에 차이가 없음을 확인하였다.
실험예 2
: Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스에서 Atg5 mRNA 발현 수준 측정 : RT-PCR
본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 게놈 DNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로는, 24개월령의 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 심장 조직으로부터 총 RNA를 추출한 후, RT-PCR을 수행하였다. 합성된 유전자-특이적 올리고누클레오티드는 하기와 같다: Atg5[전방향: 5'-TCA CGT TGT CTG ATA TAT TCT AAA G-3', 역방향: 5'-TCA ATC TGT TGG CTG TGG GAT GAT AC-3'], FoxO3[전방향: 5'-GCT GGG TGT CAG GCT AAG AG-3', 역방향: 5'-GCA TCT TTG GAC TGC TCC TC-3']; 및 β-actin[전방향: 5'-GAG CTG CCT GAC GGC CAG G-3', 역방향: 5'-CATCT GCTGG AAGGT GGAC-3'].
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스에서 Atg5 mRNA의 발현이 높은 수준으로 관찰되었으나, WT 마우스에서는 Atg5 mRNA의 발현이 관찰되지 않았다.
실험예 3
: Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스에서 Atg5 단백질의 발현 수준 측정 : 웨스턴 블롯
본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 Atg5 단백질의 발현 수준을 확인하기 위하여, Atg5-Atg12 결합체와 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 관찰하였다. 본 실험에서 항체로는 항-LC3, 항-Atg5(다클론; Novus Bio., Littleton, USA)을 사용하였으며, 대조 항체로는 항-β-actin(Cell Signaling Technology, MA, USA)을 사용하였다.
구체적으로는, 24개월령의 WT 마우스와 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스로부터 조직(뇌, 흉선, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 근육)을 분리하여 조직 시료를 준비하였다. 상기 준비된 조직 시료를 용해 완충액[lysis buffer; 2mM DTT, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 2mM 1,2-디아미토시클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산, 25mM 트리스-HCl, pH 7.8]에 균질화시키고, Bradford(Bio-Rad) 방법을 이용하여 Atg5 단백질 수준을 측정하였다. 완충액[60 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 1% SDS, 10% 글리세롤 및 0.5% β-머캅토에탄올] 내 3~5㎍의 Atg5 단백질을 함유한 세포 추출액 시료를 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 수행한 다음, Semi-Dry Transfer System(Bio-Rad)을 이용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겼다. 막을 3% BSA(bovine serum albumin)를 함유한 TBST 완충액(20mM 트리스-Cl, pH 7.5, 150mM NaCl 및 0.2% Tween 20)으로 차단시키고, 단백질을 ECL(enhanced chemiluminescence)법을 이용하여 시각화하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스로부터 분리한 조직(뇌, 흉선, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 근육)에서 Atg5-Atg12 결합체와 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준이 WT 마우스에 비해 모두 증가하였다.
실험예 4
: Atg5 형질전환 마우스에서 자식작용 활성의 형광 생성 : FITC
본 발명에 따른 Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스에서 자식작용 활성의 형광생성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로는, Atg5 형질전환 마우스와 GFP-LC3 형질전환 마우스를 교배하여 Atg5와 GFP-LC3를 모두 발현하는 이중 형질전환 마우스를 얻었다(Atg5/GFP-LC3 이중 형질전환 마우스). 그 다음, 8주령의 수컷과 암컷 마우스의 전체 몸을 Kodak Image Station 4000MM equipped with a filter set for FITC (Kodak Molecular Imaging Software, Version 4.0)을 이용하여 시각화하여, GFP-LC3 형질전환 마우스와 Atg5/GFP-LC3 이중 형질전환 마우스에서 자식작용 활성의 형광생성을 비교하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 이중 형질전환 마우스(Atg5/GFP-LC3)는 GFP-LC3 형질전환 마우스보다 GFP-LC3의 더 큰 형광을 나타내었다. 특히, 증가된 형광은 Atg5/GFP-LC3 이중 형질전환 마우스의 근육에서 명백하게 나타났다. 이러한 결과는 Atg5 형질전환 마우스가 Atg5에 의해 유도된 향상된 자식작용 활성을 나타낸다는 것을 암시한다.
실험예 5
: Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)의 산화적 스트레스 유도에 의한 세포사멸 억제와 민감성
본 발명의 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)의 산화적 스트레스 유도에 의한 세포사멸 및 민감성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 산화적 스트레스 유도에 의한 세포사멸
WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스로부터 MEFs(Mouse embryonic fibroblasts)를 'http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/stem/culture/culture 및 http://www.pmci.unimelb.edu.au/manual/cellbiol/cb0060.htm'에 기재된 대로 분리한 후, 10% FBS(INVITROGEN, Houston, TX, USA)와 항생제(겐타마이신)가 보충된 DMEM 배지(WelGENE, Daegu, Korea)에서 배양하였다. 구체적으로는, WT 마우스(#1, open)와 Atg5 형질전환 마우스(#6, closed)의 MEFs을 항산화제인 1mM 프로필갈레이트(PG) 또는 액포의 H+ ATPase 저해제인 20nM 바필로마이신 A1(BAF)의 존재 유무에서 300μM H2O2와 함께 24시간 동안 3번 계대 배양한 후, 프로피디움 아이오다이드로 염색하여 세포생존율을 평가하였다. 또한, WT 마우스 및 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 300μM H2O2로 24시간 동안 3번 계대 배양한 후, 광학현미경으로 관찰하였다. 또한, WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs을 1mM 프로필갈레이트(PG) 또는 20nM 바필로마이신 A1(BAF)의 존재 유무에서 300μM H2O2와 함께 24시간 동안 3번 계대 배양한 후, 세포 추출액을 웨스턴 블롯을 수행하여 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준을 관찰하였다.
WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)의 산화적 스트레스 유도에 의한 세포사멸을 관찰한 결과는 도 6에 나타내었으며[(A) 세포생존율, (B) 광학현미경 사진], WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산화적 스트레스 유도에 의한 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 관찰한 결과는 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, H2O2 처리 24시간 후, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs는 단지 15%만이 사멸된 반면, WT 마우스의 MEFs는 60% 정도 사멸되었다. 따라서, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs는 WT 마우스의 MEFs 보다 H2O2 처리에 의해 유발된 세포독성에 대해 유의하게 더 큰 내성을 나타냄을 알 수 있다.
또한 도 7에 나타난 바와 같이, H2O2 처리 24시간 후, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 LC3 Ⅰ에서 LC3 Ⅱ(자식작용 활성 마커)로의 전환의 발현 수준이 WT 마우스의 MEFs에서 보다 더 높게 나타남을 확인하였다.
상기 결과에 의해, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에 나타난 향상된 자식작용 활성이 산화적 스트레스에 의해 유도된 세포사멸에 대한 내성에 중요하다는 것을 알 수 있다.
2. 다양한 세포사멸 신호에 대한 민감성
WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs을 300μM H2O2, 40mM 에토포사이드(etoposide), 20nM 스타우로스포린(staurosporine) 또는 TNF-α(30ng)/시클로헥시미드(0.5㎎/㎖)와 함께 24시간 동안 처리한 후, 프로피디움 아이오다이드로 염색하여 세포생존율을 평가하였다.
결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대해 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs가 WT 마우스의 MEFs에서 보다 완전하게 더 민감하였다. 이와 반대로, 에토포사이드(etoposide), 스타우로스포린(staurosporine) 및 TNF-α/시클로헥시미드와 같은 기타 사멸 신호에 의해 유발된 세포사멸에 대해서는 WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 유사한 민감성을 나타내었다.
실험예 6
: Atg5 형질전환 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)에서 산 β-갈락토시다제 활성 측정
본 발명의 Atg5 형질전환 마우스의 배아 섬유아세포(MEFs)에서 노화세포 표현형의 바이오마커인 산 β-갈락토시다제 활성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스로부터 MEFs(Mouse embryonic fibroblasts)를 'http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/stem/culture/culture 및 http://www.pmci.unimelb.edu.au/manual/cellbiol/cb0060.htm'에 기재된 대로 분리한 후, 10% FBS(INVITROGEN, Houston, TX, USA)와 항생제(겐타마이신)가 보충된 DMEM 배지(WelGENE, Daegu, Korea)에서 배양하였다. 증식정도(subconfluency)에 도달할 시점에서 새로운 100㎟ 접시(1:3 분할)를 계대하였다. 노화-관련 산 β-갈락토시다제 활성을 5번 계대 후 측정하였고, 세포는 광학현미경으로 관찰하였다. 즉, 세포의 산 β-갈락토시다제를 서열 β-갈락토시다제 염색 키트(Cell Signaling Technology, MA, USA)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 염색하였다. 세포를 인산염 완충액(PBS)으로 2번 세척한 다음 고정 용액에서 15분 동안 고정하였다. 그 다음, 세포를 PBS로 2번 세척하고 37℃에서 밤새도록 염색용액에서 배양한 후, 푸른색의 전개를 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 낮은 배율에서 관찰하였다. MEFs는 비가역적 성장 정지를 나타낼 때까지 배양하였으며, 계대수를 기록하였다.
결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산 β-갈락토시다제 활성이 WT 마우스의 MEFs에서 보다 감소됨을 관찰하였다(A). 또한, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산 β-갈락토시다제 양성 세포의 양은 약 12%인데 반해, WT 마우스의 MEFs에서 산 β-갈락토시다제 양성 세포의 양은 약 43%를 나타내었다 (B). 또한, 연속배양에서 Atg5 형질전환 마우스의 MEFs가 WT 마우스의 MEFs 보다 약 25% 더 증식하였다(C). 상기 결과에 의해, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 Atg5의 향상된 발현이 수명을 연장시킨다는 것을 알 수 있다.
실험예 7
: Atg5 형질전환 마우스를 이용한 비만 억제 효과
본 발명의 Atg5 형질전환 마우스를 이용하여 비만 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 웨스턴 블롯
Atg5 형질전환 마우스의 지방조직에서 Atg5 단백질과 Atg5-Atg12 결합체의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 관찰하였다.
결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, Atg5 유전자가 삽입된 형질전환 마우스의 지방조직에서 Atg5 단백질과 Atg5-Atg12 결합체의 발현 수준은 WT 마우스에 비해 모두 증가하였다. 따라서, Atg5 형질전환 마우스의 지방조직에서 Atg5 단백질과 Atg5-Atg12 결합체의 발현 수준은 Atg5의 발현에 따른 기저 수준의 자식작용이 증가한 것임을 알 수 있다.
2. Atg5 형질전환 마우스의 몸무게 변화 및 지방조직 형성 변화
WT 마우스와 Atg5 형질전환 마우스에 고지방 식이를 약 12주 동안 급여한 후, 마우스의 몸무게 변화와 지방조직 형성 변화를 관찰하였다.
Atg5 형질전환 마우스의 몸무게 변화와 지방조직 형성 변화는 각각 도 11 및 도 12에 나타내었다.
도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, Atg5 형질전환 마우스의 몸무게는 WT 마우스에 비해 현저히 감소하였으며, Atg5 형질전환 마우스의 지방조직 무게는 0.25g이고 WT 마우스의 지방조직 무게는 0.75g으로 WT 마우스의 지방조직이 Atg5 형질전환 마우스의 지방조직보다 3배 정도 높은 것을 관찰하였다. 따라서, 본 발명에 따른 Atg5 형질전환 마우스는 비만 억제에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 Atg5 유전자 형질전환 동물은 평균 수명이 WT 마우스보다 더 연장되며, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 Atg5에 의해 유도된 향상된 자식작용 활성을 나타내고, 이러한 향상된 자식작용 활성이 산화적 스트레스에 의해 유도된 세포사멸에 대한 내성에 중요하며, Atg5 형질전환 마우스의 MEFs에서 산 β-갈락토시다제 활성이 WT 마우스의 MEFs에 비해 감소한다. 또한, 본 발명에 따른 Atg5 형질전환 동물은 비만 억제에 탁월한 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Atg5 형질전환 동물은 Atg5 유전자를 과발현하여 향상된 기저 자식작용에 의해 수명을 연장시킬 수 있음으로, Atg5 유전자 형질전환 동물은 수명 연장 동물모델로 유용하게 이용할 수 있다.
Claims (7)
- Atg5 유전자가 삽입된 형질전환용 벡터를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 수정란을 이용하여 형질전환되며 Atg5 유전자를 과발현하는, 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물.
- 제 1항에 있어서, 상기 형질전환용 벡터는 거대세포 바이러스 (cytomegalovirus) 증강제, 닭 β-actin 프로모터 및 토끼 β-글로빈 폴리(A)를 함유하는 pCAGGS 벡터인 것을 특징으로 하는, 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물.
- 제 1항에 있어서, 상기 Atg5 유전자의 과발현은 Atg5 조절에 의해 유도된 자식작용 활성에 의한 것임을 특징으로 하는, 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물.
- 제 1항에 있어서, 상기 수정란은 기탁번호 KCTC11716BP의 수정란인 것을 특징으로 하는, 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물.
- 1) Atg5 유전자를 형질전환용 벡터에 서브클론한 후 형질전환 카세트를 분리하는 단계,
2) 상기 분리된 형질전환 카세트를 인간을 제외한 포유동물 배아에 주입하여 수정란을 제조하는 단계, 및
3) 상기 수정란을 인간을 제외한 대리모 포유동물에 착상시켜 형질전환 동물을 생산하는 단계를 포함하는, 제 1항의 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물의 제조방법. - 제 5항에 있어서, 상기 1)단계에서 형질전환용 벡터는 거대세포 바이러스 (cytomegalovirus) 증강제, 닭 β-actin 프로모터 및 토끼 β-글로빈 폴리(A)를 함유하는 pCAGGS 벡터인 것을 특징으로 하는, 제 1항의 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물의 제조방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 3)단계에서 수정란은 기탁번호 KCTC11716BP의 수정란인 것을 특징으로 하는, 제 1항의 수명이 연장된 인간을 제외한 형질전환 동물의 제조방법.
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