CN108853503A

CN108853503A - 维生素d受体激动剂用于预防和/或治疗肥胖的用途

Info

Publication number: CN108853503A
Application number: CN201710330275.5A
Authority: CN
Inventors: 殷战; 彭旭艳; 尚国辉; 贺江燕; 金霞; 翟刚; 娄气永; 刘若兰
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明涉及维生素D受体激动剂用于预防和/或治疗肥胖的用途，尤其涉及维生素D受体激动剂在动物包括人类中用于预防和/或治疗动物腹部肥胖或用于调节腹部脂肪积累的用途。

Description

维生素D受体激动剂用于预防和/或治疗肥胖的用途

技术领域

本发明涉及维生素D受体激动剂用于预防和/或治疗动物肥胖的用途及其使用方法，尤其涉及维生素D受体激动剂在动物包括人类中用于预防和/或治疗腹部肥胖或用于调节腹部脂肪积累的用途及其使用方法。

背景技术

维生素D₃分子在许多进化早期的生物物种中均有发现。维生素D系列分子出现在机体中是以7-脱氢胆固醇或麦角固醇的形式出现，后者主要存在于植物中，称为维生素D₂(ergosterol)，而前者则被称为维生素D₃(vitamin D₃，cholecalciferol)，主要存在于动物体中。在动物体中，维生素D₃分子在经过肝或肾组织中的维生素D₃单羟化酶和二羟化酶，即细胞色素酶P450家族成员的CYP2R1和CYP27B1酶分子在其25位和1位进行连续的2步羟化，形成维生素D₃的活化产物——1,25位二羟化维生素D₃(1,25-二羟维生素D₃，1α,25(OH)₂D₃，calcitriol，以下简称为二羟VD₃)。一般认为，只有二羟VD₃形式的维生素D₃才能够以高亲和力结合体内维生素D₃的特异性感受受体——维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)。至今为止的研究已证明，低下的维生素D₃及其合成的二羟VD₃水平，将导致VD/VDR整个信号通路的低下，影响动物对钙、磷等矿物质的吸收与代谢，导致维生素D缺乏的佝偻病；而VDR或是CYP27B1出现的某些特定变异将可以导致遗传性的维生素D非依耐性的佝偻病。这些结论都表明二羟VD₃是调控动物体内矿物质吸收与代谢、骨骼生长的重要内分泌调控分子(Malloy and Feldman,2012)。

在已研究的许多动物体内，人们发现VDR分子实际上表达于大多数细胞中，而不仅出现在与骨骼和与矿物质代谢关联的细胞中，而同时也存在着一些研究提示着血清25-羟基维生素D(25(OH)D₃，25-羟基维生素D₃)与慢性代谢性疾病、心血管疾病、肿瘤发生性疾病存在关联(Rosen et al.,2012)。

但是在过去数十年来，有关维生素D₃与脂肪细胞生理学和脂代谢方面的潜在功能联系，更是存在着大量的相互矛盾的观察研究报道，首先，血清中低下的维生素D₃的水平，虽然普遍被观察到与人群的肥胖程度、糖尿病或代谢综合症正相关(Arunabh et al.,2003；Pittas et al.,2007；Wortsman et al.,2000)，但是，有关应用维生素D₃治疗或预防肥胖症、II型糖尿病或是代谢综合症的随机临床试验结果却是矛盾的，以至于多篇对于这类临床试验报道进行了综合分析的权威综述文章，得出了维生素D₃的添加应用对于这些疾病的预防与治疗作用无关的结论(Elamin et al.,2011；Rosen et al.,2012)或无法发现具有统计学意义的结论(George et al.,2012)。而且，在小鼠中敲除VDR，导致VD/VDR信号通路完全去除，会发现其总体脂肪含量下降、代谢能量消耗上升的表型；在缺乏CYP27B1(产生二羟VD₃(即VDR配体)的1α-羟化酶)的小鼠中观察到了相似的对脂肪组织、瘦素和食物摄取的作用(Narvaez et al.,2009)。这些观察表明似乎维生素D牵涉于脂代谢，但对其具体的生理学和药理学功能尚缺乏足够的认识。

就二羟VD₃而言，二羟VD₃在脂代谢中的活性尚没有明确的结论(Elamin et al.,2011；Rosen et al.,2012)。二羟VD₃对脂肪细胞的生物学作用仍是不清楚的，在细胞培养模型中二羟VD₃对脂肪生成的刺激和抑制作用均有报道(Narvaez et al.,2009)。

一方面，已有研究报道，二羟VD₃抑制ST13和3T3L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞，维生素D₃对前脂肪细胞分化的作用可能是由受体介导的事件导致的(Sato et al.,1988)。

另一方面，通过测定二羟VD₃在人脂肪细胞原代培养物中的作用，来测试趋钙激素作用于脂肪细胞来增加Ca²⁺和脂肪代谢的可能性，发现导致细胞内Ca²⁺的显著的持续的增加，以及相应的脂肪分解的明显抑制，这表明通过抑制二羟VD₃，膳食中的钙可以降低脂肪细胞量(Zemel et al.,2000)。美国专利US 6384087B1提供了降低、减少或治疗肥胖的方法，其包括通过施用治疗有效量的二羟VD₃拮抗剂，降低个体中的趋钙激素(二羟VD₃)的水平；还提供了提供了降低、减少或治疗肥胖的方法，其包括通过施用有效量的二羟VD₃受体拮抗剂。有强烈的证据显示，二羟VD₃调节脂肪细胞的细胞内离子化的钙的信号传导，这促进了脂肪生成的增加和脂肪分解的降低，其可能是通过抑制UCP2导致的(Rosen et al.,2012)。

综上所述，本领域大量相互矛盾的研究报道，凸显了维生素D系列信号分子作用的复杂性，使得维生素D系列信号分子在肥胖、糖尿病、代谢综合征等领域中的作用难以确定。

发明概述

维生素D₃的活化代谢形式二羟VD₃，一直以来被认为是哺乳动物重要的骨骼发育、矿物质代谢的调控因子。尽管在近30年来，也存在有大量的研究显示出维生素D₃也具有对肥胖和代谢综合症等有关的非骨骼发育机制方面的生理功能，但其能否对非骨骼肌疾病发挥预防或治疗作用仍需更多的研究工作来阐明。在哺乳类动物中，由维生素D₃形成二羟化维生素D₃的活化形式需要经过在肝、肾组织中分别完成的2个连续的羟基化过程。其中其起始步骤是由在肝细胞中的微粒体细胞色素P450酶2R1(microsomal cytochrome P450 2R1，CYP2R1)在维生素D₃的25位进行第一步羟化反应，该CYP2R1酶由cyp2r1基因所编码，其序列在所有脊椎动物中非常保守。

本发明人通过敲除硬骨鱼类模式斑马鱼的cyp2r1基因所获得的2个独立突变品系，观察与对照组相比，缺失了cyp2r1基因的斑马鱼中，血液中活性形式的二羟维生素D₃下降了约68％，而伴随出现了显著的腹部脂肪组织的积累。而这种腹部脂肪组织的增多积累症状可以被补充25(OH)D₃而减少。本发明人通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP-PCR)发现了斑马鱼VDR可以与动物体内公认的脂肪氧化代谢的促进调控蛋白因子PeroxisomeProliferator-activated Receptorγcoactivator-1alpha(PGC1a)的启动子结合，并通过调控pgc1a基因的转录和蛋白水平,进而调节斑马鱼腹部脂肪组织中线粒体合成、线粒体功能，从而使活化维生素D₃具备促进脂肪组织、尤其是腹部脂肪的氧化利用的功能。随后，本发明人也在哺乳动物的小鼠脂肪前体细胞--3T3-L1细胞系中证实了小鼠的VDR也具有结合pgc-1a启动子的能力，并且，添加活化的维生素D₃可以降低3T3-L1细胞中的脂肪含量。本发明人通过研究发现，天然的VDR受体激动剂，即二羟VD₃，可以通过VDR发挥抑制或治疗腹部肥胖的作用。

因而，在第一个方面，本发明涉及维生素D受体激动剂用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者调节、特别是减轻体重的用途。

本发明还涉及维生素D受体激动剂用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症的用途。

在第二个方面，本发明涉及维生素D受体激动剂在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者用于调节、特别是减轻体重。

本发明还涉及维生素D受体激动剂在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者用于调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。

在第三个方面，本发明涉及用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者调节、特别是减轻体重的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的维生素D受体激动剂。

本发明还涉及用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的维生素D受体激动剂。

在第四个方面，本发明涉及包含维生素D受体激动剂和钙吸收抑制剂的组合产品。优选地，本发明的组合产品中的维生素D受体激动剂不是VDR特征性激动剂，例如本发明的组合产品中的维生素D受体激动剂是1,25-二羟维生素D₃。

所述组合产品用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者调节、特别是减轻体重；优选用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。

本发明还涉及维生素D受体激动剂和钙吸收抑制剂的组合在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者用于调节、特别是减轻体重，优选用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者用于调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。

本发明还涉及用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者调节、特别是减轻体重的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的维生素D受体激动剂和钙吸收抑制剂的组合。

本发明还涉及用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的维生素D受体激动剂和钙吸收抑制剂的组合。

第五个方面，本发明涉及用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者促进腹部脂肪氧化代谢的用于非治疗目的的美容方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的维生素D受体激动剂。所述个体优选是非肥胖个体。所述个体例如是具有肥胖风险的个体。

本发明所述的腹部肥胖优选选自成年腹部肥胖、中老年腹部肥胖、成年生理性腹部肥胖、中老年生理性腹部肥胖或者1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部肥胖，更优选选自1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的腹部肥胖。

本发明所述的腹部脂肪积累优选选自成年腹部脂肪积累、中老年腹部脂肪积累、成年生理性腹部脂肪积累、中老年生理性腹部脂肪积累或者1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪积累，更优选选自1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪积累。

本发明所述的腹部脂肪氧化代谢异常优选选自成年腹部脂肪氧化代谢异常、中老年腹部脂肪氧化代谢异常或者1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪氧化代谢异常。

本发明所述的腹部脂肪氧化代谢优选选自成年腹部脂肪氧化代谢和中老年腹部脂肪氧化代谢。

本发明所述的维生素D受体激动剂优选是天然VDR配体，即1,25位二羟化维生素D₃或维生素D受体特征性激动剂。

本发明所述的维生素D受体激动剂例如是合成的维生素D受体激动剂，其选自以下一种或多种：KH1060(来沙骨化醇)、BXL-628(艾洛骨化醇)、MC1288、CB966、B\CB1093、GS1558、TX527、ED-71(艾德骨化三醇)、BXL-01-0029、度骨化醇、EB1089、帕立骨化醇和卡泊三醇。本发明所述的维生素D受体特征性激动剂例如是合成的维生素D受体特征性激动剂，其选自以下一种或多种：23-炔-维生素D₃衍生物C-1((5Z,7E)-(1R,2S,3R,20R)-2-(2-羧基乙氧基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇)、23-炔-维生素D₃衍生物D-1((5Z,7E)-(1S,2S,3R,20R)-2-(2-羧丙基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇)、23-炔-维生素D₃衍生物E-1((5Z,7E)-(1R,2S,3R,20R)-2-((2-羧基-2,2-桥亚乙基)乙氧基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇)(参见专利申请公开文本WO2012/057068，EP2634171A1)、Vida-5((1R，3R)-5-((E)-2-((3aS,7aS)-1-((R)-1-((5)-3-羟基-2,3-二甲基丁氧基)乙基)-7a-甲基二氢-1H-茚-4(2H,5H,6H,7H,7aH)-亚基)亚乙基)-2-亚甲基环己烷-1,3-二醇)、Vida-10((4R,8R)-6-((E)-2-((1S,7aS)-1-((R)-1-(3-乙基-3-羟基戊基氧基)乙基)-7a-甲基二氢-IH-茚-4(2H,5H,6H,7H,7αH)-亚基)亚乙基)螺[2.5]辛烷-4,8-二醇)(参见专利申请公开文本WO2010/120698，VidasymLLC.)、Gemini#9(1,25-二羟基-21(3-甲基-3-羟基-丁基)-19-去甲-胆钙化醇)(参见专利申请公开文本US2010222307，The University of Chicago)、Ibii(4-亚甲基-3-(2-{7α-甲基-1-[1-甲基-4-(2-甲基-丙烷-2-磺酰基)-丁-3-烯基]-3,3a5,6,7,7a-六氢-茚-4-亚基}亚乙基)-环己醇)(参见专利申请公开文本WO2011/088209，Cytochroma Inc.)、下式化合物A(参见专利公开文本WO2013/009799中的Compound 10，Beth Israel Deaconess MedicalCenter,Inc.)、Compound 31b(4-氯-N-((2-氯苯基)(2-甲基-IH-吲哚-3-基)甲基)苯胺)(参见专利申请公开文本WO2013/032960，UWM Research Foundation,Inc.)、石胆酸乙酸酯(LCA acetate，5β-胆烷酸-3α-醇-乙酸酯)、石胆酸丙酸酯(LCA propionate，5β-胆烷酸-3α-醇-丙酸酯)(参见专利公开文本EP2163557，Nihon University)和碳硼烷-1(见下式化合物B)(参见：例如Otero等(2016)Chemical Sci.7:1033-1037中的carborane 1)。本发明所述的钙吸收抑制剂例如是合成的钙吸收抑制剂，其选自以下一种或多种：2-APB(二苯基硼酸2-氨基乙酯，2-aminoethyl diphenylborinate)或双膦酸盐类药物(如氨羟二膦酸二钠)(Hofer等(2013)Bioorganic&Medicinal Chem.21:3202-3213)。

第六个方面，本发明涉及，基于VD/VDR信号通路，筛选调节脂肪氧化代谢和/或用于调节脂肪积累的物质，例如化合物的方法。本发明相应地还涉及用于筛选该化合物的试剂盒、以及所筛选的化合物用于本文所述的用途。

发明详述

二羟VD₃是维生素D的主要活化激素形式，也是其遂行生物学功能的活化分子形式。动物体内的维生素D₃最开始是合成的7-脱氢胆固醇，在小鼠中，细胞色素酶CYP2R1是其中一种主要的25位单羟化酶，在小鼠中缺失cyp2r1基因，会导致其血液中的25(OH)D₃水平下降约50％，但由于其体内的二羟化酶的补偿作用，缺失cyp2r1的小鼠血液中的二羟VD₃并未下降，使缺失cyp2r1的小鼠并未呈现任何显著的生理异常(Zhu et al.,2013)。在鱼类中，二羟VD₃也可以由肝脏产生，在模式鱼类斑马鱼中，与维生素D₃代谢合成相关的酶类基因，如cyp2r1,cyp27b1和cyp24a1已被鉴定并克隆，斑马鱼VDR的功能也已被证实参与钙离子调控(Lin et al.,2012)。

已有文献报道，在脊椎动物中呈现出的同样的维生素D系列信号分子，以及高度相似的特异性的VDR、细胞色素P450酶蛋白，表明由这些共同组成的维生素D内分泌信号体系在脊椎动物进化中高度保守(Goldstone et al.,2010；Kollitz et al.,2015)。具有相似生理功能的VDR分子已经在非洲爪蟾(Xenopus laevis，Li et al.,1997),斑马鱼(Lin etal.,2012)等许多其他硬骨鱼类,甚至七鳃鳗这样的无颌鱼类(Petromyzon marinus,Whitfield et al.,2003)中发现。在斑马鱼中已有报道显示其VD/VDR信号参入Ca²⁺的吸收调控过程(Lin et al.,2012)。

本发明人首先核实了斑马鱼中Cyp2r1蛋白与其他脊椎动物，包括哺乳动物中的对应CYP2R1蛋白，在其重要功能域存在高度的保守性；同时本发明人还发现斑马鱼二羟VD₃合成相关的细胞色素酶类基因，如cyp2r1、cyp27b1，在个体发育早期逐渐上升，直至到性成熟的3月龄时段，但自4月龄开始，cyp2r1、cyp27b1的表达水平出现了显著下降，于此相反的趋势则出现在二羟VD₃的分解代谢酶编码基因cyp24a1的表达，且性成熟后的4和6月龄的血浆二羟VD₃的水平较3月龄有不同程度的下降，分别下降75％和80％，结合本发明人观察到的斑马鱼个体脂肪含量随着性成熟后的显著上升过程，血液二羟VD₃水平与斑马鱼个体脂肪含量存在相反的关联性。我们已通过测试，证实了在健康斑马鱼血浆中，二羟VD₃水平和cyp2r1、cyp27b1出现同步类似的趋势，即在3月龄前逐步上升，自4月龄后出现显著下降。同时，本发明人也证实了斑马鱼的VDR表达较为广泛，在其肝脏组织和腹部脂肪组织中均有较高的表达。

本发明人利用基因敲除技术构建了2个敲除了cyp2r1基因的独立品系。不同于缺失Cyp2r1小鼠血液中二羟VD₃水平未变，在缺失了cyp2r1的斑马鱼中二羟VD₃水平下降了约68％。本发明人也发现在cyp2r1缺失的斑马鱼肝、腹部脂肪组织中的二羟VD₃含量也出现了更为显著下降(分别下降了约53％和87％)。本发明人发现敲除cyp2r1，导致突变斑马鱼出现了显著的生长迟缓，并伴有腹部脂肪组织的过量积累，而这些表型能被本发明人额外添加的25位羟化的VD₃所挽救。本发明人还发现即使在饥饿条件下，并不能导致过度积累的脂肪组织在cyp2r1敲除的突变鱼中发生明显减少，表明降低的二羟VD₃会抑制腹部脂肪组织的利用。本发明人也发现，虽然缺失Cyp2r1的斑马鱼血液中二羟VD₃减少了约68％，但该突变鱼血液中的钙、磷等离子含量并未发生显著变化，暗示敲除cyp2r1基因后导致的脂肪利用能力的下降，可能与VD/VDR信号调控的钙、磷离子吸收的功能无关。于是，本发明人进一步利用染色质免疫共沉淀与基因测序结合分析技术(ChIP-PCR)，在斑马鱼中脂肪和肝脏组织中寻找斑马鱼VDR的调控基因靶点，本发明人发现斑马鱼VDR可以结合于脂肪氧化利用的关键基因Peroxisome Proliferator-activated Receptorγcoactivator-1 alpha(PGC1a)的启动子上，通过对该启动子区域的进一步分析及启动子受二羟VD3调控的研究，本发明人也利用实时定量PCR和Western Blotting技术，核实了在缺失cyp2r1的斑马鱼腹部脂肪组织中的pgc1a的mRNA和Pgc1a蛋白水平都显著下降，同时缺失cyp2r1的斑马鱼腹部脂肪组织中的线粒体基因转录水平、线粒体蛋白、线粒体膜电位及其功能活性都有显著下降，并且其脂肪氧化代谢活性也出现了显著下降，而这些指标在cyp2r1缺失的肝脏组织均未发生显著下降。这些发现都表明二羟VD₃可以在斑马鱼腹部脂肪组织中通过与pgc-1启动子结合，促进pgc1a的表达，从而促进腹部脂肪组织中的线粒体生物合成，并导致脂肪组织中脂肪的氧化代谢。

本发明人在斑马鱼模式动物开展的研究结论基础上，本发明人还利用可以诱导发生向脂肪细胞分化的小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1开展了研究，发现二羟VD₃的添加可以抑制3T3-L1向脂肪细胞的分化，使其脂肪含量下降，同时利用该细胞系为试验材料，开展的染色质免疫共沉淀技术分析，也发现小鼠VDR可以结合于小鼠Pgc1a基因的启动子区域。这些观察也表明本发明人在斑马鱼中观察到的VD/VDR通过对Pgc1a的调控，以促进脂肪的氧化代谢的生理功能具有良好的保守性。

与现有技术中有关维生素D在脂肪代谢方面的工作比较，本发明人的工作与小鼠Cyp2r1基因敲除的模式出现了部分的不同，即在敲除cyp2r1的斑马鱼中出现了突变个体体内的二羟VD₃水平的显著下降，而小鼠缺失Cyp2r1的血液中没有出现二羟VD₃的下降，这使得该小鼠的突变模型失去了观察到由于二羟VD₃的部分下降而导致的症状及其机制研究的机会，导致不能确定二羟VD₃对于肥胖、尤其是腹部脂肪积累的功效。而另一方面，由于不同于CYP2R1仅是主要的体内VD₃单羟化酶的其中一种分子，VD₃的二羟化过程的催化酶仅只有CYP27B1一种酶分子，使得敲除cyp27b1的小鼠出现了完全缺失活化形式的二羟VD₃所导致的包括缺钙的严重表型，使部分下降二羟VD₃影响脂肪代谢的表型被更严重的缺钙所导致的生理表型所掩盖，包括缺失VDR的小鼠模型也同样会导致VD/VDR信号通路的完全丧失，其导致的严重缺乏矿物质代谢调控的严重表型，使个体生理出现过度的紊乱。该两种完全缺失VD/VDR信号的模型均出现早夭表型，为获得成年个体材料，开展对脂代谢的研究，需依赖高钙饲料使个体得以维持生存。因此，由其获得的脂代谢方面的结论，存在着严重的矿物质代谢缺乏的干扰。

体内血液中维生素D₃水平与多种人群的肥胖相关，是有着大量的流行病调查的数据支持的，但是采用添加维生素D₃对人群的肥胖症的预防与干预的临床试验结论相互矛盾。依据本发明人在斑马鱼以及小鼠中的数据，有理由相信在人类组织中，成年以后，尤其是中年以后，体内有关VD₃的二羟化过程的酶类基因表达也有可能出现了显著下降，这与人类中年以后较易出现腹部脂肪积累相符，因此，在过去大量的临床干预试验都是采用的补充VD₃，而非补充二羟VD₃，因此，在遭遇到体内CYP2R1或是CYP27B1等酶类表达已显著下降的情况下，起不到着有效的提高体内活化形式——二羟VD₃的水平的显著提升的作用，这些因素使由这些大量的人群参与的VD₃补充的临床试验带来了多种不确定性，使前期的补充VD₃干预人类肥胖的研究结论充满迷茫。而且本发明人的工作首次在脊椎动物，也包括哺乳动物小鼠中，发现了VDR直接对脂肪代谢的重要调控基因PGC1a的调控机制，这指明了与过去对VD/VDR信号通路对钙、磷等矿物质代谢调控相互区别的另一新的调控机制，使得可以利用VDR激动剂来治疗和干预包括人类在内的动物肥胖或超重、尤其是腹部肥胖或腹部脂肪积累；另外，基于VD/VDR信号通路还可以进一步筛选和开发用于治疗和干预包括人类在内的动物肥胖或超重、尤其是腹部肥胖或腹部脂肪积累的物质，例如化合物。

基于本发明的研究结果，本发明进一步提供了以下实施方案：

在一个实施方案中，本发明提供了维生素D受体激动剂在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者用于调节、特别是减轻体重。

在一个实施方案中，本发明提供了维生素D受体激动剂在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗腹部肥胖，用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，用于调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。所述产品优选用于促进成年腹部脂肪氧化代谢或中老年腹部脂肪氧化代谢。

本发明人发现，本发明的VDR激动剂、尤其是二羟VD₃对脂肪氧化的促进作用是钙非依赖的，因而根据本发明，施用VDR特征性激动剂(其仅激活VDR信号下游的与钙吸收无关的信号活性)，以及采用VDR激动剂与钙吸收抑制剂组合有益于防止血钙过高相关的风险。

在一个实施方案中，本发明提供了包含维生素D受体激动剂和钙吸收抑制剂的组合产品。优选地，本发明的组合产品中的维生素D受体激动剂不是VDR特征性激动剂，例如本发明的组合产品中的维生素D受体激动剂是1,25-二羟维生素D₃。钙吸收抑制剂优选是降钙素、2-APB、双膦酸盐类药物(如氨羟二膦酸二钠)或其组合。

这两种活性成分的适当的比例可由本领域技术人员利用常规试验来测定。这两种活性成分的比例将随着所采用的具体的活性剂、所涉及的病症或状态、所涉及的病症的严重程度、个体的年龄和相关健康状况、施用途径和形式、或者主治医师或兽医从业者的判断等因素而变化。通常，维生素D受体激动剂和钙吸收抑制剂的比例可以为约100:1至1:100。

在一个实施方案中，本发明提供了维生素D受体激动剂与钙吸收抑制剂的组合在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，用于调节、特别是减轻体重，或者优选用于预防和/或治疗腹部肥胖，用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，用于调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。所述产品优选用于促进成年腹部脂肪氧化代谢或中老年腹部脂肪氧化代谢。

在一个实施方案中，腹部肥胖选自1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部肥胖、成年腹部肥胖、中老年腹部肥胖、成年生理性腹部肥胖或者中老年生理性腹部肥胖。

在一个实施方案中，腹部脂肪积累选自1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪积累、成年腹部脂肪积累、中老年腹部脂肪积累、成年生理性腹部脂肪积累或者中老年生理性腹部脂肪积累。

在一个实施方案中，腹部脂肪氧化代谢异常选自成年腹部脂肪氧化代谢异常、中老年腹部脂肪氧化代谢异常或者1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪氧化代谢异常。

在一个实施方案中，本发明所述的食物产品可以选自保健食品、营养组合物、营养制品、食品补充剂、饮料、膳食补充剂、功能性食品、全餐、点心、饼干、能量棒、替代餐和宠物食品等。

在一个实施方案中，本发明提供了用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者促进腹部脂肪氧化代谢的用于非治疗目的的美容方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的维生素D受体激动剂。所述个体优选是非肥胖个体。

在一个实施方案中，本发明所述的维生素D受体激动剂优选是1,25-二羟化维生素D₃。

在一个实施方案中，本发明所述的维生素D受体激动剂优选是合成的维生素D受体激动剂，其选自以下一种或多种：来沙骨化醇、艾洛骨化醇、艾德骨化三醇、度骨化醇、西奥骨化醇、帕立骨化醇和卡泊三醇。

在一个实施方案中，本发明所述的维生素D受体激动剂优选是维生素D受体特征性激动剂。所述维生素D受体特征性激动剂优选是合成的维生素D受体特征性激动剂，其选自以下一种或多种：(5Z,7E)-(1R,2S,3R,20R)-2-(2-羧基乙氧基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(5Z,7E)-(1S,2S,3R,20R)-2-(2-羧丙基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(5Z,7E)-(1R,2S,3R,20R)-2-((2-羧基-2,2-桥亚乙基)乙氧基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(1R，3R)-5-((E)-2-((3aS,7aS)-1-((R)-1-((5)-3-羟基-2,3-二甲基丁氧基)乙基)-7a-甲基二氢-1H-茚-4(2H,5H,6H,7H,7aH)-亚基)亚乙基)-2-亚甲基环己烷-1,3-二醇、(4R,8R)-6-((E)-2-((1S,7aS)-1-((R)-1-(3-乙基-3-羟基戊基氧基)乙基)-7a-甲基二氢-IH-茚-4(2H,5H,6H,7H,7αH)-亚基)亚乙基)螺[2.5]辛烷-4,8-二醇、1,25-二羟基-21(3-甲基-3-羟基-丁基)-19-去甲-胆钙化醇、4-亚甲基-3-(2-{7α-甲基-1-[1-甲基-4-(2-甲基-丙烷-2-磺酰基)-丁-3-烯基]-3,3a 5,6,7,7a-六氢-茚-4-亚基}亚乙基)-环己醇、下式化合物A、4-氯-N-((2-氯苯基)(2-甲基-IH-吲哚-3-基)甲基)苯胺、石胆酸乙酸酯、石胆酸丙酸酯和下式化合物B

在一个实施方案中，腹部肥胖或腹部脂肪积累是由CYP2R1的表达降低引起的。

在一个实施方案中，腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常的个体的血钙、磷水平基本正常。

在一个实施方案中，在出现成年腹部肥胖、中老年腹部肥胖、成年腹部脂肪积累和中老年腹部脂肪积累的个体中，CYP2R1的表达降低，其中该降低优选是年龄相关的降低。例如，CYP2R1表达的降低是生理性的降低。

在一个实施方案中，腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常是由1,25-二羟维生素D₃合成不足或者1,25-二羟维生素D₃的活化和/或代谢异常介导的。

在一个实施方案中，本发明的化合物或本发明的组合还可任选地与一种或多种其他治疗剂和/或一种或多种营养素、营养补充剂和/或食品补充剂组合使用。

在一个实施方案中，本发明的药物产品还可包含一种或多种可药用载体。

在一个实施方案中，本发明的食物产品还可包含一种或多种食品添加剂。

在一个实施方案中，本发明的药物产品或食物产品可以是固体、半固体或液体形式。

本发明的药物产品可以是药物组合物或药物制剂。本发明的化合物或本发明的组合可以被配制为药物组合物或药物制剂的形式。

本发明的化合物或本发明的组合可以用于在个体中预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者调节、特别是减轻体重；优选用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。

本发明的化合物或本发明的组合可以用于减轻体重、特别是腹部肥胖或腹部脂肪积累，而不必须减少食物摄取。因此，可以实现减肥同时保持满足身体需要的食物摄取。因而，避免了降低食物摄取时营养素供给不足的风险。

减轻体重还有助于降低发展为代谢性疾病或障碍、例如2型糖尿病的风险。

本文所述个体可以是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人或宠物。

本文所述个体例如是但不限于超重、肥胖或糖尿病个体，优选腹部肥胖个体、具有腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常的个体，或者具有发生前述疾病或状况的风险的个体。

在一个实施方案中，本发明提供，筛选和开发用于治疗和干预包括人类在内的动物肥胖或超重、尤其是腹部肥胖或腹部脂肪累积的物质，例如化合物的方法。所述化合物可以用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者调节、特别是减轻体重；优选用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。

本发明所述的各个实施方案以及各个实施方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样。

定义

除非另有说明，否则本申请(包括说明书和权利要求书)中所用的下列术语具有下文所给出的定义。

本申请中的单数形式的词包括其复数形式，除非上下文清楚显示并非如此。因此，提及的单数术语和“该”、“所述”通常包括各术语的复数。术语“包括”和“包含”应解释为包含在内，而不应进行排除性解释。

当术语“约”与数值或数值范围一起使用时，其通过向上和/或向下延长所述数值的边界来调整该数值或数值范围。例如，术语“约”旨在将数值向所述值的上和下修正≤20％、更优选≤10％。

本文所有的数值范围应当被理解为公开了在该范围内的每个数值和数值子集，而不论其是否被具体另外公开。例如，提及任何一个数值范围时，应当视为提及了该数值范围内的每一个数值，例如该数值范围内的每一个整数。本发明涉及落入这些范围的所有值、所有更小的范围以及数值的范围的上限或下限。

本文使用的术语“治疗”定义为将本发明的化合物或本发明的组合产品应用或施用(单独或与另外的物质混合，例如载体或辅助剂或其他活性成分)至个体，或者将本发明化合物或本发明的组合应用或施用至(从个体的分离的或工程化的)离体组织或细胞(例如，用于诊断或离体应用)，目的为治疗、治愈、减轻、缓解、解除、改变、纠正、改进、改善或影响本发明所述疾病或状况(例如，肥胖，腹部肥胖、腹部脂肪积累、腹部脂肪氧化代谢异常、中老年腹部肥胖、中老年腹部脂肪积累、由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症等)，或者减轻个体的体重或减肥。

本文中任何具体疾病、病症或状况的“预防”是指在疾病、病症或状况的任何症状变得明显之前向个体施用本发明的化合物或本发明的组合产品。

本文使用的术语“个体”是包括人和非人动物在内的脊椎动物。非人动物包括例如家畜和宠物，诸如羊、牛、猪、犬、猫和鼠科哺乳动物，以及鱼类。优选地，患者或个体是哺乳动物、更优选是人。术语“个体”不表示特定的年龄或性别。例如，本发明的化合物或本发明的组合可施用于年龄在至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80岁以上的人。

术语“宠物”意指家养动物，例如猫、狗、兔、豚鼠、雪貂、仓鼠、小鼠、沙鼠、马、牛、山羊、绵羊、驴、猪、鱼等。

本文所用的“成年”是指属于相对成熟的年龄的个体，优选是指性成熟且能繁衍的个体，其包括青年个体和中老年个体(中年个体和老年个体)。如果个体已经超过他们出生国的平均预期寿命的三分之二、例如已经超过他们出生国的平均预期寿命的四分之三、已经超过他们出生国的平均预期寿命的五分之四，则认为所述个体属于本文所述的“老年”。

本文使用的术语“有效量”是指无毒但足以提供期望生物学结果的量。所述结果可以是减轻、缓解和/或治愈疾病的体征、症状或病因或任何其他期望的生物系统的改变，例如，个体(超重或肥胖的个体)的体重的降低，肥胖、超重、由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症、腹部肥胖的预防和/或治疗，腹部脂肪积累的减轻或抑制，腹部脂肪氧化代谢的调节或促进。任何个体情况中适当的有效量可由本领域技术人员利用常规试验来测定。“有效量”将随着所采用的具体的活性剂、所涉及的病症或状态、所涉及的病症的严重程度、个体的年龄和相关健康状况、施用途径和形式、主治医师或兽医从业者的判断等因素而变化。通常，对于成人，本发明的化合物的有效量可以为约10-55纳克/公斤体重/天。

用于本文的“食物产品”包括保健食品、营养组合物、营养制品、食品补充剂、饮料、膳食补充剂、功能性食品、全餐、点心、饼干、能量棒、替代餐、宠物食品等。

用于本文的术语“可药用载体”意指药学上可接受的材料、化合物或赋形剂，如液体固体或填充剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、增稠剂、着色剂、矫味剂、防腐剂、溶剂或包封材料，例如用于将用于发明的化合物运送或运输至患者或患者体内，以使它可执行它的期望功能。每种载体在与制剂的其它成分相容的方面上必须是“可接受的”，包括用于发明的化合物，并且对施用个体无害。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶；明胶；滑石粉；可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和药物制剂中使用的其它无毒的相容物质。如本文所用，“可药用载体”还包括包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、和吸收延迟剂等，其与用于发明内的化合物的活性相容，并且对患者是生理学上可接受的。可包括在用于本发明组合物中的其它另外的成分在本领域已知，例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Genaro、Ed.、MackPublishing Co.、1985、Easton、PA)中被描述，其通过引用被并入本文。

用于本文的术语“食品添加剂”包括以下一种或多种：酸化剂、增稠剂、用于pH调节的缓冲剂或物质、螯合剂、着色剂、乳化剂、赋形剂、食用香精、矿物质、渗透剂、防腐剂、稳定剂、糖、甜味剂、质地形成剂、维生素等。

术语“减轻体重”“体重减轻”和“减肥”可以互换使用。

“体重指数”或“BMI”意指重量(kg)除以身高(米)的平方的比例。

“超重”定义(例如对于成人)为具有约25至小于约30的BMI(根据WHO的标准)(具有该BMI的个体是具有肥胖风险的个体)。“肥胖”定义(例如对于成人)为具有大于或等于约30的BMI(根据WHO的标准)，例如大于或等于约35的BMI(大于或等于约35至小于约40称为2级肥胖)，例如大于或等于约40的BMI(或称为3级肥胖)，例如大于或等于约45、50、55或60的BMI。在亚洲国家，“超重”是指体重指数大于或等于约23至小于约25的BMI(具有该BMI的个体是具有肥胖风险的个体)；“肥胖”是指体重指数大于或等于约25，例如大于或等于约30、45、50、55或60的BMI。

本文所用的术语“超重”的含义是包括全部上述超重的定义。

本文所用的术语“肥胖”是一种状态，其中在动物、特别是人和其他哺乳动物的脂肪组织中存储的天然能量储备增加至一个与特定健康状况或增加的死亡率有关的点。本文所述的“肥胖”的含义是包括全部上述肥胖的定义，其包括但不限于肥胖症、腹部肥胖、内脏型肥胖、中心性肥胖或腹型肥胖。

本文所用的术语“腹部肥胖”包括：成年腹部肥胖、中老年腹部肥胖、成年生理性腹部肥胖、中老年生理性腹部肥胖、以及1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部肥胖，优选为1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的腹部肥胖，更优选为1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的中老年腹部肥胖，或1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的中老年生理性腹部肥胖。

1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常包括先天性或遗传性VD/VDR信号或二羟VD₃生成异常，例如人类(例如青少年、儿童或幼儿)的先天性或遗传性VD/VDR信号或二羟VD₃生成异常。

本文所用的术语“腹部脂肪积累”包括：成年腹部脂肪积累、中老年腹部脂肪积累、成年生理性腹部脂肪积累、中老年生理性腹部脂肪积累、以及者1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪积累，优选为1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪积累，更优选为1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的中老年腹部脂肪积累，或1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的中老年生理性腹部脂肪积累。

本文所用的术语“腹部脂肪积累”和“腹部脂肪蓄积”可互换使用，是指脂肪在腹部(包括胃部、肠道周围)的特别堆积，表现为腰围的增加，包括脂肪在腹壁和腹腔内蓄积过多。

本文所用的术语“腹部脂肪氧化代谢异常”优选是指腹部脂肪氧化代谢水平降低。腹部脂肪氧化代谢异常”包括：成年腹部脂肪氧化代谢异常、中老年腹部脂肪氧化代谢异常或者1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪氧化代谢异常，优选为1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪氧化代谢异常，更优选为1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的中老年腹部脂肪氧化代谢异常，或1,25-二羟维生素D₃合成不足或者其活化和/或代谢异常介导的中老年生理性腹部脂肪氧化代谢异常。

本发明所述的“减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖”涉及将本发明化合物或活性剂应用或施用(单独或与另外的物质混合，例如载体或辅助剂或其他活性成分)至个体，来降低、阻抑、缓解、解除、改变、纠正、改进、改善或影响腹部脂肪积累或腹部肥胖，包括治疗性和非治疗性目的。

本文所用的术语“由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症”包括但不限于代谢性疾病或障碍、例如代谢综合征、糖尿病、例如2型糖尿病、胰岛素抗性、高胰岛素血症、高血压、脂质相关的病症(例如动脉粥样硬化、冠心病、血脂异常)、睡眠型呼吸暂停等，其中该术语中提及的“超重”和“肥胖”如上文所定义。

本文所用的术语“由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症”包括但不限于代谢性疾病或障碍、例如代谢综合征、糖尿病、例如2型糖尿病、胰岛素抗性、高胰岛素血症、高血压、脂质相关的病症(例如动脉粥样硬化、冠心病、血脂异常)、睡眠型呼吸暂停等，其中该术语中提及的腹部肥胖、腹部脂肪积累和腹部脂肪氧化代谢异常如上文所定义。

本文所用的“调节脂肪氧化代谢”优选是指促进脂肪氧化代谢。本文所用的“调节脂肪氧化代谢”包括调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢。本文所用的“调节脂肪积累”优选是指减轻或抑制脂肪累积，更优选减轻或抑制腹部脂肪累积。

本文所述的“本发明的化合物”是指VDR激动剂，包括天然VDR配体和合成的VDR激动剂，优选是VDR特征性激动剂或1,25-二羟维生素D₃。

本文所述的“维生素D受体激动剂”或“VDR激动剂”是指直接结合并活化维生素D受体的任何化合物，其可以是合成的，也可以是天然存在的。其非限制性实例包括1,25-二羟维生素D₃、LG190090、LG9190119、LG190155、LG190176和LG190178(参见例如，Boehm等，(1999)Chemistry&Biology,6:265-275)；LY2108491和LY2109866(Ma等，(2006)JClin.Invest.,116:892-904)；2β-(3-羟基丙氧基)1α,25-二羟基维生素D₃(ED-71)(Tsurukami等，(1994)Calcif.Tiss.Int.54:142-149)；EB1089(Pepper等，(2003)Blood,101:2454-2460)；OCT(22-氧杂-骨化三醇)(Makibayashi等，(2001)Am.J.Path.,158:1733-1741)；(1αOH-2,19-去甲-25羟基维生素D₃)和(l,3-脱氧-2-CHCH2OH-19-去甲-25-羟基维生素D₃)(Posner等，(2005)Bioorganic&Medicinal Chemistry,13:2959-2966)以及Rey等(1999)J.Organic Chem.,64:3196-3206中公开的任何维生素D类似物；以及胆汁酸衍生物例如石胆酸(LCA)和熊去氧胆酸(UDCA)(参见例如，Nehring等，(2007)PNAS,104:10006-10009；Makishima等，(2002)Science,296:1313-1316；Copaci等，(2005)Rom.J.Gastroenterol.,14:259-266)。非天然存在的VDR激动剂的实例包括但不限于：KH1060(来沙骨化醇)、BXL-628(艾洛骨化醇)、MC1288、CB966、B\CB1093、GS1558、TX527([19-去甲-14,20-双表-23-炔-l,25(OH)₂D₃)、ED-71(艾德骨化三醇)、BXL-01-0029、度骨化醇、EB1089(西奥骨化醇)、帕立骨化醇、卡泊三醇及其组合。其他实例包括马沙骨化醇(OCT)、他卡西醇、阿法骨化醇、SM-10193、EB1072、EB1129、EB1133、EB1155、EB1270、MC1288、EB1213、CB1093、VD2656、VD2668、VD2708、VD2716、VD2728、VD2736、GS1500、GS1558、KH1060、ZK161422及其组合(参见WO2014/197680)。所述VDR激动剂还可以包括：1α-羟基维生素D3、1α-羟基维生素D₂、1α,25-(OH)₂-16-烯-D、1α,25-(OH)₂-24-氧代-16-烯-D、1α,24R(OH)₂-D₃、1α,25(OH)₂-22-氧杂-D₃、20-表-22-氧杂-24a,24b,-二高-1α,25(OH)₂-D₃、20-表-22-氧杂-24a,26a,27a,-三高-1α,25(OH)₂-D₃、20-表-22-氧杂-24高-1α,25(OH)₂-D₃以及1,25-(OH)₂-16,23E-二烯-26-三氟-19-去甲-D₃。所述VDR激动剂还可以选自：WO2010/120698、US9499488B2、US20160106762A1、US9278992B2、US20140378507A1、US8377913B2、US8318708B2、US20120115824A1、US20100204191A1、US20090131378A1、US20090131379A1、US20060171983A1、US20060172014A1、WO2010120698A1、WO2006019591A1、WO2005011651A2、PCT/US2004/018427等中所公开的VDR激动剂或活性维生素D化合物。本文所述的“维生素D受体激动剂”或“VDR激动剂”例如是VDR特征性激动剂。

本文所述的“VDR特征性激动剂”是指合成的特定化合物，可以与VDR结合，在相对较弱的激活钙、磷矿物质吸收的情况下，可以激活VDR所介导的其它信号通路的活性的维生素D3类似物，包括(5Z,7E)-(1R,2S,3R,20R)-2-(2-羧基乙氧基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(5Z,7E)-(1S,2S,3R,20R)-2-(2-羧丙基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(5Z,7E)-(1R,2S,3R,20R)-2-((2-羧基-2,2-桥亚乙基)乙氧基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(1R，3R)-5-((E)-2-((3aS,7aS)-1-((R)-1-((5)-3-羟基-2,3-二甲基丁氧基)乙基)-7a-甲基二氢-1H-茚-4(2H,5H,6H,7H,7aH)-亚基)亚乙基)-2-亚甲基环己烷-1,3-二醇、(4R,8R)-6-((E)-2-((1S,7aS)-1-((R)-1-(3-乙基-3-羟基戊基氧基)乙基)-7a-甲基二氢-IH-茚-4(2H,5H,6H,7H,7αH)-亚基)亚乙基)螺[2.5]辛烷-4,8-二醇、1,25-二羟基-21(3-甲基-3-羟基-丁基)-19-去甲-胆钙化醇、4-亚甲基-3-(2-{7α-甲基-1-[1-甲基-4-(2-甲基-丙烷-2-磺酰基)-丁-3-烯基]-3,3a 5,6,7,7a-六氢-茚-4-亚基}亚乙基)-环己醇、本文中所示的化合物A、4-氯-N-((2-氯苯基)(2-甲基-IH-吲哚-3-基)甲基)苯胺、石胆酸乙酸酯、石胆酸丙酸酯和本文中所示的化合物B,它们是：例如WO2012/057068、WO2010/120698、US2010222307、WO2011/088209、WO2011/079249、WO2013/009799、WO2013/032960、EP2163557等中所公开的VDR特征性激动剂。

确定化合物是否是适用于本发明的VDR激动剂的方法可以是本领域的常规的已知方法。例如，CYP24A1表达的诱导可在与测试化合物接触的表达VDR的细胞中测量，其中CYP24A1表达的提高(例如，表达提高约10倍至20倍)表示该试剂是VDR激动剂。

此外，还可以利用本说明书中描述的方法，确定化合物是否是适用于本发明的VDR激动剂。例如，可以利用pgc-1a启动子控制的荧光素酶(Luc)报告性质粒在脂肪细胞或脂肪前体细胞转染后，添加测试化合物后对pgc-1a:Luc的诱导表达的测定，使荧光素酶活性增强的测试化合物是VDR激动剂。

本文所述的“钙吸收抑制剂”是能够减轻、降低或抑制钙被个体吸收、利用的物质，包括用于截留钙的不能通过小肠被运输到血液中的吸附剂、吸收剂、配基、螯合物。例如降钙素，2-APB或双膦酸盐类药物，如氨羟二膦酸二钠、唑来膦酸，帕米膦酸钠或阿仑膦酸钠等。

本文所述的“本发明的组合产品”或“本发明的组合”是指包含本发明的化合物和钙吸收抑制剂的组合产品。其包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”意指这两种活性成分以单个实体或剂量的形式被同时施用于个体。术语“非固定组合”意指两种活性成分(例如本发明的化合物和钙吸收抑制剂)以分开的实体被同时、并行或无特定时间限制地相继施用于个体，其中所述施用在个体体内提供了两种化合物的治疗有效水平。

除非另有说明，否则本文中表述的所有比率和百分比均是以重量计的。

除非另有说明，本文所用的所有的技术和科学术语及任何缩略语与本发明普通技术人员通常理解的具有相同的意思。

将本文引用或提及的所有的专利、专利申请、出版物和其它参考文献在法律允许的范围内引入本文作为参考。讨论这些参考文献仅仅是为了总结其中提出的主张。并不承认任何这些专利、专利申请、出版物或其它参考文献或其任何部分是本发明的相关现有技术，特别保留质疑这些专利、专利申请、出版物或其它参考文献的准确性和相关性的权利。

施用/剂量/制剂

本发明的化合物或本发明的组合产品可采用常规载体或赋形剂来制备为药物制剂形式，例如本领域已知的适于口服、阴道、肠胃外、鼻、静脉内、皮下、肠或任何其他合适的模式施用的有机或无机的可药用载体制剂可被灭菌。需要时，它们也可与其他活性剂联合使用，例如其他减肥药。本发明的制剂还可与其他减轻体重的方法(例如，体育锻炼)联合使用。

本发明组合物的合适剂型包括，例如，片剂、胶囊剂、胶囊型片剂(caplet)、丸剂、软胶囊(gel cap)、分散剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、小球、贴剂、凝胶剂、散剂、微型药片(pellet)、乳浆剂(magmas)、锭剂、霜剂、糊剂、硬膏剂、洗剂、栓剂、注射剂、滴剂、用于鼻或口服施用的液体喷剂、用于吸入的干粉末或喷雾制剂等等。

本发明的化合物或本发明的组合产品的施用方法包括但不限于口服施用、局部施用、直肠施用、胃肠外、静脉内施用、肌内施用、吸入、鼻内施用。

对于口服应用，特别合适的是片剂、糖衣丸、液体、滴剂、栓剂，或胶囊、胶囊型片剂和软胶囊。预期用于口服使用的本发明的化合物或本发明的组合产品可根据本领域已知的任何方法制备，并且可包括选自适于制造所述剂型的惰性的、非毒性可药用载体的一种或多种。此类载体包括例如惰性稀释剂，诸如乳糖；成粒剂和崩解剂，诸如玉米淀粉；粘结剂，诸如淀粉；和润滑剂，诸如硬脂酸镁。片剂可以是未被包衣的，或者可通过已知技术对它们包衣，以提高美观度或延缓活性成分释放等。用于口服使用的制剂还可配制为其中活性成分与惰性稀释剂混合的硬胶囊。

可以将用于本发明的化合物或本发明的组合产品直接递送到所靶向的细胞/组织/器官，例如腹部组织。或者，本发明的化合物或本发明的组合产品可以与一种或多种促进本发明的化合物或本发明的组合产品迁移到标靶组织、器官或细胞(和/或由其摄取)的试剂一起施用到非标靶区域。体内施用可经由全身性施用至个体或者经由靶向施用至腹部组织来实现。

本发明的化合物或本发明的组合也可以配制为食物产品形式，例如保健食品、营养组合物、营养制品、食品补充剂、饮料、膳食补充剂、功能性食品、全餐、点心、饼干、能量棒、替代餐等。所述食物产品可以采用常规的食品添加剂来配制。其中活性成分的总量以重量计可以在0.01至100％的范围内。

施用方案可影响有效量。可每天或以另外的间隔地施用若干分开的剂量，或该剂量可连续输注或者进行推注。另外，制剂的剂量可根据需要按比例增加或减少。

可改变本发明的药物产品或食物产品中活性成分的实际剂量水平，以便获得针对特定个体而言所希望的响应，而对所述个体无毒性。

可使用已知的方法，以有效实现本发明所述效果的剂量和施用期将本发明组合物施用至个体、优选哺乳动物、更优选人。本发明所述效果包括：预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，调节、特别是减轻体重；优选预防和/或治疗腹部肥胖，调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。实现所述效果所需要的组合物的有效量可根据因素诸如个体的年龄、性别和体重而变化。可调整剂量方案以提供最有利的治疗响应。例如，若干分剂量可每天施用或该剂量可根据治疗情况的紧急性所示按比例减少或增加。本领域技术人员能够研究相关因素并确定组合物的有效量，而不用过度实验。

筛选方法/试剂盒

本发明人发现，VDR可以结合于pgc1a基因的启动子区域，并且二羟VD₃可以在斑马鱼腹部脂肪组织中通过VDR与pgc-1启动子结合，促进pgc1a的表达，从而促进腹部脂肪组织中的线粒体生物合成，并导致脂肪组织中脂肪的氧化代谢。本发明人也发现，在斑马鱼中观察到的VD/VDR通过对Pgc1a的调控，以促进脂肪的氧化代谢的生理功能，在脊椎动物中具有良好的保守性。

因此，在一个实施方案中，本发明提供，筛选用于调节脂肪氧化代谢和/或用于调节脂肪积累的化合物的方法，所述方法包括步骤：(a)提供包含与pgc-1a启动子有效连接的多核苷酸和表达VDR受体的细胞；(b)使化合物与所述细胞接触；(c)测定所述多核苷酸的表达水平；其中，与未加所述化合物相比，所述多核苷酸的表达改变指示，所述化合物是用于调节脂肪氧化或用于调节脂肪积累的化合物。

在一个实施方案中，使所述化合物与表达VDR的细胞接触，优选地，所述细胞为动物细胞，例如，斑马鱼细胞和哺乳动物细胞如小鼠细胞，更优选脂肪细胞或前脂肪细胞。在一个优选实施方案中，所述细胞是表达VDR受体的斑马鱼受精卵。

在一个实施方案中，所述pgc-1a启动子是脊椎动物来源的pgc-1a启动子，优选地，人的、鼠的、斑马鱼的pgc-1a启动子。在一个优选实施方案中，pgc-1a启动子具有序列SEQID NO.55(如图11所示)，或其同源序列。在另一优选实施方案中，pgc-1a启动子包含VDR结合位点和维甲酸结合位点。

在一个实施方案中，所述方法还包括，在步骤a)前，提供与pgc-1a启动子有效连接的多核苷酸，和用所述多核苷酸转化所述表达VDR的细胞。在一个实施方案中，与pgc-1a启动子有效连接的多核苷酸为报告基因。本领域公知多种适用于动物细胞的报告基因系统，例如萤火虫荧光酶、Renilla荧光素酶、绿色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶基因、分泌型碱性磷酸酶。在一个优选的实施方案中，所述多核苷酸编码PCG-1a蛋白或荧光素酶蛋白。

在一个优选实施方案中，所述方法包括：提供包含在pgc-1a启动子控制下的荧光素酶(Luc)基因的报告性质粒；提供表达VDR的脂肪细胞或脂肪前体细胞；用报告质粒转染所述表达VDR的细胞；添加测试化合物；对pgc-1a:Luc的诱导表达进行测定，其中使荧光素酶活性增强的测试化合物是用于调节脂肪氧化或用于调节脂肪积累的候选化合物。

在进一步的实施方案中，所述方法还包括步骤：将获得的调节脂肪氧化或调节脂肪积累的化合物配制成药物。

在另一方面，本发明提供用于本发明筛选方法的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包括表达VDR受体的细胞和/或与pgc-1a启动子有效连接的多核苷酸。在另一实施方案中，所述多核苷酸包含在质粒中。在再一实施方案中，所述细胞天然表达与pgc-1a启动子有效连接的PCG-1a蛋白质。在再一实施方案中，所述细胞为转化并表达与pgc-1a启动子有效连接的多核苷酸的重组细胞。

在一个实施方案中，本发明提供，通过本发明筛选方法获得的化合物在制备用于调节脂肪氧化代谢和/或用于调节脂肪积累的药物中的用途。

在一个实施方案中，本发明提供，通过本发明筛选方法获得的化合物在制备用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者调节、特别是减轻体重；优选用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症的药物中的用途。

基于本发明的公开内容，本领域技术人员将认识到，或仅用常规实验，能够确定本文描述的实施方案、实施方式、实施例和权利要求的等同或替代方式或物质。这些等同或替代方式或物质在本发明的考虑范围之内并涵盖在所附的权利要求中。

以下具体实施方式进一步说明本发明。然而，它们不以任何方式限制本文前述的本发明的公开内容。

附图说明

图1.斑马鱼Cyp2r1的鉴定与特征。(A)斑马鱼(Danio rerio,XP_691824.2),非洲爪蟾(Xenopus tropicalis,NP_001106483.2),人(Homo sapiens,NP_078790.2),和小鼠(Mus musculus,NP_796356.2)CYP2R1氨基酸序列的对比。相同的氨基酸以*标明，CYP2R1特征性的E类型细胞色素P450的保守功能域以框图显示，在CYP2R1中与亚铁血红素协同因子结合的关键半胱氨酸位点以三角标指明。(B)多种动物CYP2R1蛋白序列的进化发育系统分析。采用MEGA 5.1软件中的邻接法(neighbor-joining method)通过对采用物种的CYP2R1氨基酸序列加以分析所得。单位尺度代表着进化距离为序列中每个位置的0.05核酸碱基差异率。

图2.野生型斑马鱼(cyp2r1^+/+)中cyp2r1基因,维生素D受体基因(vdra和vdrb),以及其它3个参与VD₃代谢的细胞色素P450酶基因的表达和总体脂含量的动态模式。(A)逆转录PCR检测的cyp2r1,vdra和vdrb在斑马鱼早期各阶段的表达。(B)逆转录PCR检测的cyp2r1,vdra和vdrb在斑马鱼成年阶段(100日龄)各组织中(脑、眼、腮、心脏、肠、肾、肝、肌肉、卵巢、垂体、脾、睾丸、腹部脂肪组织VAT)的表达分布。(C,D,和E)实时定量逆转录PCR检测的在1、2、3、4、6月龄时，野生型肝组织中cyp2r1(C)、cyp27b1(D)、和cyp24a1(E)的表达水平(相对于1月龄的表达量，计算相对倍数。)。内参基因选取持家基因β-actin。(F)野生型斑马鱼在2、3、4、6月龄时的血浆1,25(OH)₂D₃含量。(G)野生型斑马鱼在1、2、3、4、6月龄时的总脂肪含量(％)。显示数据为平均值±标准差，p<0.05时认为有显著差异，条状图上不同的字母(a,b,c,d,e)代表二者有显著差异。

图3.应用转录激活因子样效应物核酸酶基因打靶技术(TALENs)敲除斑马鱼cyp2r1基因。(A)敲除靶区设计图示。敲除靶区结合于cyp2r1基因的1号外显子(E1,外显子以块表示)。下划线标明的是敲除识别的2个结合臂，大写字母显示的是一个限制性内切酶AluI的识别位点。图中M1和M2是2个独立的突变品系，而且可见突变都将导致AluI的识别位点消失。(B)测序结果证实2个突变系的转录本发生的突变。(C)线条图示表示在野生型、突变品系1和突变系2中形成的Cyp2r1多肽链基本情况，其中在突变品系1或2中，其N端的起始34个或36个氨基酸分别与野生型的Cyp2r1多肽的序列一致(以方块显示)，但其后的38个氨基酸在突变品系1或2中都是和野生型不再一样的编码氨基酸(以线表示)，而且相对于野生型肽链长度，此2个突变形式都发生了提前翻译终止。(D)显示扩增自靶区的突变cyp2r1位点的DNA序列可由AluI切除处理而筛检。图中显示的是一次F2代交配出现的典型情况。+/+：野生型；+/-,杂合突变体；-/-：纯合突变体。(E)采用实时定量逆转录PCR检测突变鱼成年肝脏组织中cyp2r1相对于其野生型姊妹群鱼相应数值的表达情况。(F)定量逆转录PCR检测cyp2r1敲除鱼和其野生型对照鱼肝组织中的cyp27a1,cyp27b1和cyp24a1表达水平。(G)cyp2r1敲除鱼苗阶段未显示与其野生型的对照鱼显著的形态差异(5日龄)。(H)cyp2r1敲除鱼至成鱼阶段(100日龄)则显示出和养殖在同一水体的野生型姊妹鱼相比显著的尺寸较小。**：P<0.01,与野生型对比。WT：野生型；M1：突变品系1；M2：突变品系2。

图4.硬骨和软骨。(A和B)阿尔新蓝染的软骨和(C)钙黄绿素染的硬骨显示14日龄的突变型和野生型斑马鱼的软硬骨情况。(D)100日龄的突变型和野生型斑马鱼的骨骼显微CT扫描图。

图5.cyp2r1敲除鱼和其野生型对照鱼血浆中的钙、磷离子含量以及鳃组织中trpv6的表达情况。(A和B)cyp2r1敲除成年鱼和其野生型对照鱼血浆中的钙(A)、磷离子(B)含量的测定(均取自100日龄个体)。结果显示在cyp2r1敲除成年鱼和其野生型对照鱼血浆中的钙、磷离子含量处于相似水平。(C)5日龄的原位杂交试验表明幼年cyp2r1敲除鱼的trpv6的表达水平和对照鱼相似。(D)100日龄鳃组织的qRT-PCR结果表明和野生型对照鱼相比，cyp2r1敲除鱼的trpv6的表达水平显著上调。**：P<0.01与野生型对照组相比。N.S.代表没有显著性差异。

图6.cyp2r1敲除导致斑马鱼腹部脂肪组织的过度积累。(A)尼罗红染料着色幼年期(25日龄)的cyp2r1敲除的斑马鱼较其同尺寸(7.6mm)的野生型体内的中性脂肪。尼罗红荧光分别用普通荧光显微镜(a1,a2)和共聚焦显微镜(a3,a4)观察。共聚焦显微镜观察下的腹部脂肪细胞个数(B)和细胞大小分布频率(C)的统计分析。成年突变型和其同尺寸野生型斑马鱼的(D)尼罗红染色和(E)横截面切片。图中箭头代表皮下脂肪，三角形代表腹部脂肪。(F)同尺寸大小的成年突变型和野生型斑马鱼腹部脂肪组织的苏木精-伊红染色的切片。(G)对图(F)中的细胞大小的分布频率分析。(H)100日龄雄性和雌性的突变型和野生型斑马鱼总体脂肪的含量(％)。**：p<0.01，N.S.代表没有显著性差异。数据显示的是均值±标准差。其中数据分析自野生型对照鱼5条，cyp2r1敲除鱼4条。实验重复3次。

图7.cyp2r1敲除鱼和其野生型对照鱼肝脏脂肪积累情况。(A和B)100日龄的cyp2r1敲除鱼和其野生型对照鱼的肝脏油红O染色(A)和甘油三脂含量(B)。N.S.代表没有显著性差异。

图8. 25(OH)D₃对cyp2r1缺陷突变鱼的挽救处理。(A)野生型对照、cyp2r1敲除的突变鱼、和经25(OH)D₃补充处理后的cyp2r1敲除突变鱼的形态学比较(均为100日龄阶段)。由图可见，经25(OH)D₃补充处理后的cyp2r1敲除突变鱼的生长迟滞和腹部脂肪积累已明显恢复。(B,C和D)量化成年阶段(100日龄)比较野生型对照、cyp2r1敲除的突变鱼、和经25(OH)D₃补充处理后的cyp2r1敲除突变鱼的体重(B)、标准体长(C)和总脂体比(D)。25(OH)D₃的浸泡自5日龄起始至100日龄。标准体长表示是从吻的最前端到尾椎骨的最末端。数据显示的是均值±标准差。其中各组分析鱼数量为11尾。p<0.05表示有显著差异，柱状图上不同的字母(a,b,c)代表二者之间有显著差异。本实验重复3次。

图9.cyp2r1敲除导致饥饿刺激腹部脂肪利用能力受损。(A-F)应用尼罗染色显示的野生型对照成鱼在正常(A)和饥饿状态下(B,C)的腹部脂肪组织情况，以及cyp2r1敲除的鱼在正常(D)和饥饿状态下(E,F)的腹部脂肪组织情况(分析均采用100日龄)。每组分析数量为4尾。实验重复二次。此图像代表着典型的腹部脂肪组织形态变化。

图10.VD/VDR信号通路对pgc1a转录的调控。(A)CHIP-PCR试验显示VDR与pgc1a近端启动子区域结合。本实验采用抗VDR的抗体(vdr-ab)，并以正常兔免疫球蛋白(IgG)处理组和加入的非免疫沉淀组织裂解物组(input)作为对照。(B)实时定量逆转录PCR实验表明在成年cyp2r1敲除突变鱼腹部脂肪组织中pgc1a转录表达水平较其对照野生型姊妹鱼相应数值显著下降，这种下降可以通过25(OH)D₃的处理得到挽救(均采用100日龄)。(C)免疫印迹杂交反应实验(一次典型结果作为代表)显示在成年cyp2r1敲除突变鱼腹部脂肪组织中Pgc1a的蛋白水平的显著下降可以被25(OH)D₃的处理所挽救(均采用100日龄)。下方的量化图采用ImageJ软件计算的灰度量化显色数量，以均值±标准差的方式显示3次独立重复实验的结果。(D)显示用pGL3-basic构建的斑马鱼pgc1a:luciferase报告性质粒的结构简图。图中灰色框表示ChIP试验中VDR结合pgc1a启动子区域的结合位置(-293至-55bp)。(E)二羟VD₃在斑马鱼胚胎中对pgc1a:Luc报告性荧光素酶的促进作用观察。注射pgc1a:luc和pRL-SV40质粒的斑马鱼受精卵在含有二羟VD₃(10nM)或仅含有溶剂对照的养殖水体中孵育24小时后，进行荧光素酶的检测。数值显示为相对于溶剂处理组(control)为1倍算得的。**P<0.01显示二羟VD₃与对照组间的比较，N.S.表示没有显著差异。数据显示的是均值±标准差。VDR,双羟VD₃受体；vdr-ab,抗双羟VD₃受体的抗体。

图11.斑马鱼pgc1a基因启动子序列图。矩形框里的“ATG”为翻译起始位点，相对位置标记为+1至+3。

图12.cyp2r1基因敲除导致斑马鱼腹部脂肪组织的线粒体生成活性，线粒体膜电位和氧化活性发生障碍。(A)应用定量逆转录PCR实验显示两个PGC1a靶基因，nrf-1和erra，pparγ以及多种线粒体特异转录本，包括ucp1，mrpl15，mrpl2，mrps10，mtfp1，mcu，和slc25a20，在野生型、突变型和25(OH)D₃处理后的突变型斑马鱼腹部脂肪组织中的相对表达数值。(B)应用定量PCR实验显示线粒体DNA相对含量在cyp2r1敲除的斑马鱼腹部脂肪组织中较野生型对照鱼对应数值显著下降。其中线粒体基因以mt-nd1和mt-nd6为代表，核基因组DNA neb和polg1为参照基因。(C)应用免疫印迹杂交实验证明线粒体特异蛋白Mtco1和CoxIV在cyp2r1敲除的斑马鱼腹部脂肪组织中较野生型对照鱼的对应数值出现显著下降(一次典型结果的展示)。下方的量化图采用ImageJ软件计算的灰度量化显色数量，以均值±标准差的方式显示3次独立重复实验的结果。(D)应用JC-1染色实验证明线粒体膜极性在cyp2r1敲除的斑马鱼腹部脂肪组织中较野生型对照鱼的对应数值出现显著下降。线粒体膜电位的消失程度是以JC-1单体/JC-1多聚体的比例作为相对比较数据。(E)同年龄的突变型和野生型斑马鱼腹部脂肪组织中的线粒体氧化(1-¹⁴C)标记的棕榈酸的能力。**：P<0.01与野生型对照组相比，柱状图上不同的字母(a,b,c)代表二者有显著差异。数据显示的是均值±标准差。

图13.cyp2r1基因敲除未导致斑马鱼肝脏组织的线粒体生成活性，线粒体膜极性以及氧化活性发生障碍，且突变鱼整体耗氧量显著下降。(A)免疫印迹杂交反应实验(一次典型结果作为代表)显示在成年cyp2r1敲除突变鱼肝组织中Pgc1a的蛋白水平较其对照野生型姊妹鱼相应数值出现显著上升(均采用100日龄)。下方的量化图采用ImageJ软件计算的灰度量化显色数量，以均值±标准差的方式显示3次独立重复实验的结果。(B)应用定量PCR实验显示线粒体DNA相对含量在cyp2r1敲除的斑马鱼肝组织中与野生型对照组的对应数值相似(均采用100日龄)。其中线粒体基因以mt-nd1和mt-nd6为代表，核基因组DNA以neb和polg1为参照基因。(C)应用免疫印迹杂交实验证明线粒体特异蛋白Mtco1和CoxIV在cyp2r1敲除的斑马鱼肝组织中较野生型对照对应数值出现显著上升(一次典型结果的展示)(均采用100日龄)。下方的量化图采用ImageJ软件计算的灰度量化显色数量，以均值±标准差的方式显示3次独立重复实验的结果。(D)应用JC-1染色实验证明线粒体膜极性的消失程度在cyp2r1敲除的斑马鱼肝组织中较野生型对照相应数值出现显著下降(均采用100日龄)。线粒体膜的极性状态是以JC-1单体/JC-1多聚体的比例作为相对比较数据。(E)同年龄的突变型和野生型斑马鱼肝脏组织中的线粒体氧化(1-¹⁴C)标记的棕榈酸的能力(均采用100日龄)。(F)cyp2r1敲除鱼和其野生型对照鱼的整体耗氧量(均取自100日龄个体)。**：P<0.01与野生型对照组相比，N.S.表示没有显著差异。数据显示的是均值±标准差。

图14.VD/VDR信号在小鼠脂肪前体细胞3T3-L1分化过程中的作用。(A)1,25(OH)₂D₃处理组和对照组的3T3-L1细胞油红O染色结果。(B)1,25(OH)₂D₃处理组和对照组的3T3-L1细胞的甘油三酯含量测定。(C)染色质免疫共沉淀结合实时定量PCR实验分析分化成熟的3T3-L1细胞中VDR在小鼠Pgc1a启动子区域的富集。pgc1a的转录起始位点为+1。数据显示的是均值±标准差。

具体实施方式

实施例

斑马鱼Cyp2r1、VDR及维生素D相关代谢酶特征

斑马鱼的cyp2r1基因作为人类对应的cyp2r1，已由Cheng等鉴定并报道(Cheng etal.,2003；Goldstone et al.,2010)。将斑马鱼的Cyp2r1蛋白的氨基酸序列和其他已鉴定的脊椎动物的CYP2R1蛋白进行比对，发现斑马鱼的Cyp2r1和人类和小鼠的CYP2R1的氨基酸相同率分别达到70％和69％。运用InterProScan 5分析软件分析，也发现作为细胞色素P450家族成员，斑马鱼的Cyp2r1也具有一个E类P450细胞色素酶I组所共有的特征性结构域，和一个由保守的半胱氨酸关键位点组成的结合亚铁离子协同因子的区域(图1A)(Chenget al.,2003)。通过对其cyp2r1转录本的DNA序列的系统进化比对分析，发现斑马鱼cyp2r1基因序列依次接近于河豚、非洲爪蟾、小鼠和人类的相应Cyp2r1基因，相对而言，其对应于斑马鱼自身的同一cyp2家族基因的成员，如cyp2u1和cyp2v1则显示出更大的差异(图1B)(Goldstone et al.,2010)。这些分析表明该斑马鱼的Cyp2r1蛋白是类似于哺乳类的CYP2R1，具有潜在的维生素D₃的25位单羟化酶的功能。

运用逆转录PCR方法(RT-PCR)本发明人检测了斑马鱼cyp2r1、vdra和vdrb在斑马鱼幼年与成年期的表达特征，表明这些基因的转录本在胚胎早期可能有来自母源的贡献(图2A)。而在成年阶段，cyp2r1主要表达于肝、脂肪和肌肉组织。而斑马鱼中发现的2种VDR编码基因转录本，vdra和vdrb则基本为泛表达的方式，相对而言，vdra的表达丰度较vdrb高(图2B)。

作为维生素D的活化形式，二羟VD₃，1ɑ,25(OH)₂D₃,的水平由数个关联的代谢酶所调节，它们包括CYP2R1、CYP27B1和CYP24A1,它们都是细胞色素P450酶的基因家族成员酶类(Omdahl et al.,2002；Prosser and Jones,2004；Schuster et al.,2006)。这三种酶的转录表达、野生型斑马鱼的血浆二羟VD₃水平和身体总脂肪含量的检测见图2。本发明人发现两种与二羟VD₃合成相关的酶分子的转录本，cyp2r1和cyp27b1,都在4月龄前逐渐上升其表达,而到达性成熟后的4-6月龄鱼体中，它们的表达水平出现了巨降(图2C和2D)。而作为编码分解代谢二羟VD₃的细胞色素酶cyp24a1的转录水平则在早期发育阶段较低，仅在性成熟后的4-6月龄时出现了显著的增加(图2E)。性成熟后的4和6月龄的血浆二羟VD3的水平较3月龄有不同程度的下降，分别下降75％和80％(图2F)。在野生型斑马鱼的1-2月龄发育期间，身体含脂量没有显著的变化，但在3-4月龄时，相对于2月龄的含脂量有一个近40％左右的大幅下降，然而，到6月龄时，体脂含量较4月龄时增加约50％(图2G)。这些结果表明二羟VD₃的动态变化与斑马鱼体脂含量有一定的负相关性。

cyp2r1基因敲除的斑马鱼生长受到阻滞

为了获得体内二羟VD₃含量下降的研究动物模型，以便开展对二羟VD₃在动物体内的生理功能研究，本发明人运用了锌指核酸酶技术(TALEN)特异性地敲除了斑马鱼cyp2r1基因，本发明人获得了2个由相互独立操作得到的遗传突变品系，其突变位点如图所示(图3A和3B)。两个独立的突变品系分别被命名为突变品系M1和M2，他们分别在cyp2r1编码区发生了8个和2个碱基对的缺失，从而导致了在M1和M2品系的突变鱼中的Cyp2r1仅分别含有由72个和74个氨基酸组成的缩短版的蛋白，而且其中仅有氮端侧的34个和36个氨基酸与原有的Cyp2r1蛋白序列一致(图3C)。斑马鱼cyp2r1基因原有的一个限制性内切酶AluI的识别位点由于在突变斑马鱼cyp2r1基因中的突变而消失，被本发明人利用来作为检查完全缺失cyp2r1或是杂合缺失cyp2r1的突变的简便方法，对于突变子二代的检测结果显示如图3D。本发明人利用实时定量逆转录PCR技术，发现突变的cyp2r1转录本出现了相对于其野生对照组的鱼发生的显著上调表达(图3E)。与此同时，本发明人也发现相对于对照鱼，cyp27a1和cyp27b1的转录表达都有显著的上调，而破坏二羟VD₃的cyp24a1转录水平则显著下降(图3F)。这些细胞色素P450酶类基因转录的变化，显示出了一种典型的在cyp2r1敲除导致二羟VD₃水平的下降，所引发的负反馈调控的特征(Lechner et al.,2007；Sundaram et al.,2014),在表2中，本发明人也证实了在cyp2r1突变鱼的血液、肝和腹部脂肪组织中的二羟VD₃，1α,25(OH)₂D₃，的含量具有显著下降。其中本发明人可见相对于野生型对照鱼，cyp2r1敲除的鱼的血液、肝脏、腹部脂肪组织中的1,25(OH)₂D₃含量分别下降68％、53％和87％(表2)。

本发明人观察发现5日龄的cyp2r1突变型斑马鱼和野生型没有明显的差异(图3G)，而100日龄的突变型斑马鱼比同一养殖体系中的野生型姊妹鱼长得明显短小(图3H)。统计分析发现，突变型斑马鱼的存活率没有明显变化，体重和标准体长从25日龄开始直至成年后(120日龄)都明显小于同一养殖体系中的野生型姊妹鱼(表1)。

由于维生素D传统上被认为具有对钙、磷吸收和骨骼发育起着重要作用(FHolick,2011)，所以本发明人立即开展了对cyp2r1缺失的鱼体软硬骨和血液中的钙、磷含量的测定，结果本发明人发现尽管在血液中二羟VD₃出现了约68％的下降，但14日龄的突变型鱼软硬骨和100日龄的骨骼显微CT扫描图都没有明显的差异且血液中的钙、磷水平与对照鱼相比并未发生显著的变化(图4，5A和5B)，而且和野生型对照鱼相比，5日龄的突变型鱼trpv6的转录水平没有明显变化(图5C)，100日龄鳃组织中trpv6的表达升高(图5D)。

敲除cyp2r1基因导致斑马鱼腹部脂肪的过度积累

鉴于我们前面结果显示的血浆二羟VD₃水平和总脂肪含量之间的负相关性(图2F和2G)，本发明人采用尼罗红，一种中性脂肪染色的荧光染料，清楚地观察了相同尺寸的突变型和对照鱼的中性脂含量的变化，(Flynn et al.,2009)。本发明人发现7.6mm的cyp2r1突变鱼较其对照鱼显示出较为增强的染色强度(图6A)。统计分析共聚焦显微镜观察的荧光标记的腹部脂肪细胞发现，突变型斑马鱼腹部脂肪细胞的数量(图6B)显著升高，而大小分布频率没有明显变化(图6C)，成年期H&E染色的突变型腹部脂肪组织切片的细胞大小分布频率较其同尺寸对照鱼也没有明显差异(图6F，6G)。横截面图显示成年突变型斑马鱼皮下脂肪，尤其是腹部脂肪积累增多(图6D，6E)而且，本发明人采用100日龄的雄性和雌性突变和对照鱼全鱼进行了鱼体总脂肪含量的测定，发现突变鱼较对照鱼总脂含量分别增加约63％和41％(图6H)，蛋白含量和水含量明显下降(表3)。和对照组相比，突变鱼肝组织中的脂肪积累没有明显变化(图7A)，甘油三酯含量也相似(图7B)。

25(OH)D3添加处理对突变鱼表型的有效挽救

本发明人采用CYP2R1的直接催化产物，25(OH)D₃,用来挽救cyp2r1突变鱼的病态表型。本发明人发现当本发明人采用25(OH)D₃浸泡方式，可以使突变鱼的受精卵直到100日龄，都不再会出现体型肥短的表型(图8A)，其体重、标准体长和总体脂含量的统计学数据分析见(图8B,8C和8D)，在25(OH)D₃处理的突变鱼体中，其总脂含量不再高于野生型对照鱼，甚至比野生型对照鱼低22.2％(图8D)。而且突变型斑马鱼二羟VD₃在血浆、肝脏和腹部脂肪组织中的降低也在25(OH)D₃处理的突变鱼体中得到回补(表2).这些结果说明VD₃的生物活性形式对于斑马鱼的个体生长和脂肪代谢起着重要的调控作用。

敲除cyp2r1导致腹部脂肪组织调用缺陷

动物在饥饿状态下，脂肪组织细胞可以刺激脂肪分解，将甘油三酯等降解为游离脂肪酸，并将其运至线粒体中进行脂肪酸的氧化，从而产生ATP以提供机体所需的能量，此被称为脂肪组织的调用(Eaton,2002；Finn and Dice,2006；Kerner and Hoppel,2000；O’Neill et al.,2013)。当本发明人测量血液中的游离脂肪酸水平时，本发明人发现cyp2r1突变鱼血液中的游离脂肪酸水平，无论在正常进食还是在饥饿状态下，均较野生对照斑马鱼血液中的游离脂肪酸水平高约85.7％和85.9％(表2)。而且，两种鱼在饥饿状态下均较正常进食下出现类似的血液中游离脂肪酸水平的增高比率(突变鱼增42.9％，对照鱼增42.7％)，这表明缺失cyp2r1，并未导致脂肪调动过程中的甘油三酯降解过程的异常。然而，即使在饥饿10天或35天的情况下，本发明人发现cyp2r1突变鱼的腹部脂肪组织并没有像对照鱼的腹部脂肪那样被明显利用掉(图9),表明在cyp2r1敲除的鱼体中，其脂肪组织调用的过程在甘油三酯降解步骤之外，依然存在着障碍。

VD/VDR信号通路直接调控PGC1a的表达水平

PGC1a是调控细胞内游离脂肪酸氧化活性、线粒体生成的核心调控分子(Ventura-Clapier et al.,2008)。本发明人通过染色质免疫共沉淀结合PCR技术，发现在斑马鱼肝和脂肪组织中，VDR可以结合于pgc1a基因的启动子区域(图10A，肝组织数据和此类似不再显示)。而且，本发明人通过定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western Blotting)实验也证实了在cyp2r1敲除的斑马鱼突变鱼的腹部脂肪组织中，其pgc1a转录和Pgc1a蛋白水平均较其野生型对照鱼的相应组织出现了显著的下降，且这些下降均可以在25(OH)D₃处理后得到回补(图10B，10C)，而这类下降却没有在突变鱼的肝组织中观察到(图13A)，本发明人认为这与二羟VD₃的下降程度以及VDR在不同细胞微环境中所涉及的不同协同调控因子相关。经过序列和以往核受体结合位点分析文献(Carlberg and Campbell,2013)，本发明人还发现了在本发明人发现的VDR结合的pgc1a的调控区域存在着一个VDR疑似结合核心序列元件，同时在其附近也发现了另一个RXR结合序列，为了进一步核实VD/VDR信号在斑马鱼体内对pgc1a启动子的直接调控作用，本发明人构建了由pgc-1a启动子区域调控荧光素酶表达的报告性质粒(图10D)，本发明人将此类报告质粒显微注射入野生型斑马鱼受精卵中，在添加或不添加二羟VD₃的情况下加以比较，本发明人发现二羟VD₃能有效地增强由pgc1a启动子调控的荧光素酶在斑马鱼体内表达(图10E)，这也进一步证实了VD/VDR信号调控Pgc1a转录和蛋白水平。

VD/VDR信号促进斑马鱼腹部脂肪组织的脂肪酸氧化和线粒体生成

接下来通过定量逆转录PCR技术，本发明人检测了PGC1a调控线粒体生物发生和脂肪氧化过程中的两个靶向转录因子，nrf-1(nuclear respiratory factor)和erra(estrogen-related receptor)，在突变鱼腹部脂肪组织中的转录水平。本发明人发现这两个基因在突变鱼腹部脂肪中的转录水平显著低于其在野生型对照鱼腹部脂肪中的转录水平，且他们的下降均可通过25(OH)D3的处理得到恢复(图12A)。pparγ在突变鱼腹部脂肪中的转录水平显著高于其在野生型对照鱼腹部脂肪中的转录水平。另外，本发明人对一些重要的线粒体特征性基因，包括ucp1(uncoupling protein 1),mrpl15(mitochondrialribosomal protein L15),mrpl2(mitochondrial ribosomal protein L2),mrps10(mitochondrial ribosomal protein S10),mtfp1(mitochondrial fission process 1),mcu(mitochondrial calcium uniporter)和slc25a20(solute carrier family 25(carnitine/acylcarnitine translocase),member 20)的转录水平也进行了测试，本发明人发现其在cyp2r1缺失的斑马鱼腹部脂肪组织中的表达量，相对于其对照鱼的腹部脂肪组织均出现了显著下降，且这些全部通过25(OH)D₃的处理得到恢复(图12A)。

接下来，本发明人比较了数个在缺失cyp2r1的突变斑马鱼脂肪组织中与线粒体生成、线粒体功能和脂肪酸氧化活性的相关指标。首先，通过定量PCR技术，本发明人发现在突变鱼腹部脂肪组织中的线粒体DNA含量相对于全基因组比例较野生型对照鱼下降了约50％(图12B),而此表型并未在两种的肝组织对比中观察到(图13B)。第二，本发明人应用蛋白免疫印迹试验，证实了在突变斑马鱼腹部脂肪组织中，两种线粒体蛋白Mtco1(mitochondrialcytochrome c oxidase subunit 1,COX I,encoded by mitochondrial DNA)和Cox IV(cytochrome c oxidase IV,encoded by nuclear DNA)的表达水平也较对照鱼相应数值显著地下降了(分别下降约23％和76％)(图12C),而该对照数据在突变鱼和对照鱼的肝脏组织中没有得到对应反映(图13C)。第三，利用荧光染料JC-1染色观察技术可以检测线粒体膜电位及其功能活性(Peng et al.,2015)。本发明人发现应用此染色技术，可显示出在cyp2r1缺失的斑马鱼腹部脂肪组织中，其线粒体膜电位下降的比率，较对照鱼相应数据出现了显著的升高(图12D),而此类缺陷并未在突变鱼和对照鱼的肝组织测试中观察到(图13D)。最后，本发明人利用放射性标记的游离态脂肪酸结合分离自cyp2r1突变鱼和对照鱼的肝、腹部脂肪组织，进行离体培养及脂肪酸分解活性的检测，发现突变鱼比其对照鱼肝脏组织的游离脂肪酸氧化效率高(图13E)，而相比于对照鱼，突变鱼的腹部脂肪组织中的游离脂肪酸的氧化分解活性下降极为显著(图12E)。相比于对照鱼，突变鱼的整体耗氧量显著下降(图13F)。综上所有的结果和测试，本发明人可以得到这样的结论：在敲除cyp2r1基因而导致二羟VD₃下降的斑马鱼中，其腹部脂肪组织，而非肝组织出现了线粒体生成下降，以及相应的线粒体膜电位及其功能活性下降，导致了其对游离脂肪酸的氧化分解能力下降。

小鼠VD/VDR信号对脂肪细胞的作用

本发明人利用可以诱导发生向脂肪细胞分化的小鼠胚胎成纤维细胞系3T3-L1开展了研究，发现二羟VD₃的添加可以抑制3T3-L1向脂肪细胞的分化，使其脂肪含量下降(图14A和14B)，同时利用该细胞系为试验材料，开展的染色质免疫共沉淀结合实时定量PCR技术分析，也发现小鼠VDR蛋白富积小鼠Pgc1a启动子区域的DNA片断，显示小鼠VDR也可以结合于小鼠Pgc1a基因的启动子区域(图14C)。这些观察表明：在斑马鱼中观察到的VD/VDR通过对PGC1a的调控，以促进脂肪的氧化代谢的生理功能具有良好的保守性。

小结

脂肪组织是机体最大量的能量存储库，并为机体提供着主要能量源。当食物充足时，将脂肪贮存于脂肪组织应对能量在必要时的大量需求，对于生物的生存非常重要。因此，脂肪组织是生物一个基本和必需的组织，在体内脂肪的贮存和调动使用受到能量代谢需求的严格的调控(Zimmermann et al.,2004)。动物中脂肪组织的过度积累可以是脂肪调动过程的缺陷，包括脂肪分解、游离脂肪酸转运、或脂肪酸氧化等过程的缺陷所导致的(McMenamin et al.,2013；Zimmermann et al.,2004)。例如，在斑马鱼体内，由于生长激素基因的突变，将会导致腹部脂肪组织调动障碍，出现个体生长滞缓，并伴有过度的腹部脂肪组织积累(McMenamin et al.,2013)。

本发明人通过检测在不同年龄阶段的斑马鱼体内相关二羟VD₃的代谢过程的细胞色素P450各成员的转录表达水平，发现二羟VD₃的水平也与斑马鱼体内的总脂肪含量成反比(图2F和2G),这表明有关维生素的活化，亦即体内二羟VD₃的水平，涉及其个体的脂代谢调控。同时，作为一种脊椎动物模式，斑马鱼具有较易开展遗传操作、整体可视性观察其脂肪组织等优势，于是，本发明人采用基因打靶技术，敲除了活化VD₃的第一步的一个关键细胞色素P450酶——cyp2r1的编码基因，从而可以获得体内的二羟VD₃合成，亦即二羟VD₃水平下降的斑马鱼模型，使本发明人得以通过将这些体内二羟VD₃水平低下的突变鱼与其同源姊妹群体的野生型健康鱼体开展在体实验观察。在本实验中，本发明人证实了在敲除了cyp2r1的斑马鱼中，其血液中的二羟VD₃含量比其对照姊妹群体鱼中下降了约68％(表2)，而且发生了相对于其个体尺寸的严重腹部脂肪组织的超量积累(图6)。本发明人也发现，由于在敲除了cyp2r1基因所导致了二羟VD₃水平下降的突变鱼中，血液中的游离脂肪酸含量也出现了显著上升，并伴有在腹部脂肪组织中的线粒体生成活动、自由脂肪酸的氧化反应出现了极为显著的下降(表2,图12)。更为重要的是，PGC1a是调控细胞内游离脂肪酸氧化活性、线粒体生成的核心调控分子(Ventura-Clapier et al.,2008)。而本发明人发现体内感受二羟VD₃信号的维生素D受体分子(VDR)，可以直接结合于Pgc1a的启动子区域，本发明人进一步的试验进一步证明Pgc1a在斑马鱼体内的激活表达，需要依托VDR与Pgc1a的启动子的结合，因此，本发明人的结果证明了在斑马鱼中，活化形式的VD₃——二羟VD₃可以通过其受体结合于Pgc1a启动子，从而调控腹部脂肪组织中的脂肪细胞中的线粒体生成活性，促进自由脂肪酸在调用过程中可以被合适地氧化利用(图10和12)。

如同在哺乳动物体内一样，自低等脊椎动物中进化出现的VD₃也曾被报道具有对钙离子的吸收起着促进作用，有报道观察到VD₃可以通过激活其受体VDR，促进钙离子吸收的离子转运分子trpv6的转录表达(Lin et al.,2012)。在本发明人敲除cyp2r1基因，导致血液中的二羟VD₃水平下降68％的斑马鱼血液中，未发现血液中的钙、磷离子水平出现显著的下降(图5A和5B)，这可能与依然存在有32％的二羟VD₃有关。鳃组织是鱼类吸收钙离子的重要器官，本发明人的观察也发现，在幼鱼(5日龄)中trpv6的转录表达水平与其野生型对照姊妹群体的对照鱼中依然处在类似的水平，甚至成年(100日龄)的突变斑马鱼鳃组织中的trpv6的转录表达水平显著上调(图5C，5D)。

脂肪组织尽管一般被认为是能量的贮存组织，肝组织则常被认为是机体维持正常的整体脂肪代谢的中心，但是，脂肪组织也通过脂肪细胞的增大储存甘油三酯，使其在许多能量缺乏的状态下，如饥饿状态下，起着对脂肪能量调用的重要调控作用。而且，无论在摄食和饥饿状态下，脂肪组织中的脂肪水解循环、甘油三酯的再酰基化以及游离脂肪酸的氧化等过程都主要发生在脂肪组织中。本发明人发现斑马鱼的cyp2r1基因主要表达于肝、腹部脂肪组织和卵巢组织中,而其感受分子VDR，则以泛表达方式出现(图2B)，本发明人的试验表示二羟VD₃在斑马鱼中主要在肝、腹部脂肪组织和卵巢组织中产生。在本发明人的突变鱼中，肝脏组织中的二羟VD₃水平也出现了显著的下降(见表2)，但本发明人的病理组织观察却未发现明显的肝脏发生脂肪过度积累的现象(图7A)，与此对应的是，本发明人也发现尽管在斑马鱼的肝组织中，VDR也可结合于pgc1a的启动子区域，但肝脏组织中下降了二羟VD₃水平后，却并未导致其pgc1a的表达和蛋白水平显著下降，而且，突变鱼肝组织中的线粒体生成、脂肪氧化活性也均未下降，甚至还出现了上升(图13)。本发明人认为出现这样的结果的原因可能是由于毕竟在肝和腹部脂肪细胞中，VDR的协同作用分子的种类及微环境的不同所导致的，另外，突变鱼中，肝组织中的二羟VD₃的下降幅度毕竟没有其在腹部脂肪组织中的下降幅度大(表2)。因此，在本发明人对斑马鱼模式的研究观察中，体内的二羟VD₃水平的下降过程中，腹部脂肪组织更为敏感。

在本发明人的cyp2r1敲除的突变鱼中，本发明人仅发现血液中二羟VD₃的水平，与其野生对照鱼相比仅下降了68％左右，这点与敲除cyp2r1的小鼠模型所观察到的VD₃活化过程依然存在的情况类似，表明在斑马鱼中还有其它VD₃的一羟化酶存在(Zhu et al.,2013)。例如，本发明人发现在本发明人的cyp2r1敲除的突变鱼中，其肝脏组织中cyp27a1的表达较对照鱼的相应水平显著升高(图3F),而cyp27a1也曾被提及可能是动物肝组织中一种潜在的VD₃在25位发生羟化的酶分子(Zhu et al.,2013).另外，尽管本发明人仅能在实验室中采用的斑马鱼饵料中检测到非常低量的二羟VD₃，但毕竟也还不能完全排除外源性的少量的二羟VD₃摄入的可能性。但无论如何，在血液、肝、腹部脂肪组织中，二羟VD₃含量分别下降了大约68％、53％、和87％的情况下，将会导致过度的腹部脂肪组织的积累，以及个体生长的迟滞现象的发生，而且这一综合表型，可以被补充一羟VD₃所挽救。因此，本发明人现有的试验结果清晰地证明了在斑马鱼中，维生素D通过其受体VDR形成的信号通路，可以通过直接调控pgc1a的转录，促进腹部脂肪组织中的脂肪氧化反应。同时，本发明人还发现，因为斑马鱼的VDR对pgc1a的表达调控，也需要pgc1a基因启动子区域的RXR结合位点的存在，表明在斑马鱼中，VDR可能是通过和RXR形成异源二聚体，起到调控pgc1a基因的表达的作用方式。同时，本发明人发现小鼠VDR也可以结合于小鼠Pgc1a基因的启动子区域。可见，在斑马鱼中观察到的VD/VDR通过对Pgc1a的调控，以促进脂肪的氧化代谢的生理功能在脊椎动物中具有良好的保守性。

实验方法部分

如未进行特别说明，则本发明所使用的试剂和材料均商购可得，或可根据本领域常规的方法制备而得。

斑马鱼养殖

本研究中用的斑马鱼来源于野生AB型斑马鱼(可以商业购买，例如购自国家斑马鱼资源中心)交配的后代，养殖于温度控制在28.5℃，光照：黑暗比在14:10小时/天的循环系统中。斑马鱼每天3次喂以自孵化的丰年虫。收集以自然产卵方式产生的鱼卵，并养殖于斑马鱼孵化水中。斑马鱼的发育阶段以受精后小时数(hpf)、受精后日数(dpf)以及受精后月数(mpf)为计录方式，其所有基本流程按照《Zebrafish Protocols》(Kimmel et al.,1995)。

应用转录激活因子样效应物核酸酶基因打靶技术(TALENs)敲除斑马鱼cyp2r1基因

按照前人报道的TALEN原则(Cermak et al.,2011)，本发明人针对在美国NCBI基因库中的斑马鱼cyp2r1基因序列信息(NC_007118.6,NCBI)设计了靶向双臂(见图2A)，并采用购自Addgene(Cambridge,MA,USA)公司的Golden Gate TALEN试剂盒进行靶向臂的组装。本发明人利用针对的双臂之间存在着的一个限制性内切酶AluI的位点，作为成功诱变后对基因位点开展检测的快速筛选方式。在敲除操作时，将1-2nl终浓度均为50ng/μl的靶向臂及效应物核酸酶试剂注射入斑马鱼1-2细胞期的鱼卵中。为检验靶向敲除的效果，本发明人采用Meeker等人(Meeker et al.,2007)描述的碱法，抽提20尾3日龄的注射过敲除试剂的鱼苗的基因组DNA。采用正向引物(5’-CCCCAAGTTTGCATCTAAGA-3’，SEQ ID NO.1)和反向引物(5’-GATGCATTACACTGCTATGC-3’，SEQ ID NO.2)对靶向区域的基因组DNA进行扩增，然后采用AluI酶切反应，检测该靶向区域是否发生了该内切酶位点的消失突变，作为初筛方式。核实TALEN敲除有效以后，本发明人将注射过敲除试剂的其它鱼苗养殖至成年，然后利用剪尾抽提基因组DNA的方式，依前述方式对突变体进行初筛，对发生突变的DNA样本，再加以测序方式进一步核实。本发明人将突变阳性个体作为F0代，与野生型异性个体进行交配，通过突变位点筛选，获得稳定遗传的F1代杂合突变的品系。通过F1代杂合突变个体间的交配，本发明人如期在这样的交配子代中获得了约1/4比例的纯合子的cyp2r1突变的个体。本发明人采用上述方式，获得了2个独立的突变品系，分别名为突变系1(mutant line 1,M1)和突变系2(mutant line 2,M2)(见图2A和2B)。在本实验中，如果没有特别说明，本申请采用先获得的M1品系进行试验。同时，为了避免性别间的内分泌代谢差异对数据的影响，如果没有特别说明，本申请采用的是雄性鱼个体开展试验。

脂肪染色和总体脂测定

本发明人采用尼罗红染料对脂肪进行染色观察。染料尼罗红(Nile Red，N3013,Sigma)先溶解于丙酮中配成浓度为1mg/ml的工作母液。为观察活鱼体中的中性脂肪积累，选取类似个体尺寸的突变或野生型斑马鱼，将其浸泡在以养殖系统水稀释后获得的浓度为0.1μg/ml尼罗红溶液中，保持黑暗以及水温28℃，鱼苗需要浸泡1小时，而对于成鱼则需要12小时。在浸泡结束后先用普通养殖系统水润洗一遍，采用Olympus SZX16 FL体视荧光显微镜，在激发光源为488nm的情况下，通过拍照观察。同时采用Zeiss ISM 710双光子共聚焦显微镜更清晰的观察脂肪细胞，并对腹部脂肪细胞的大小和数目进行统计分析。对于成年的突变鱼脂肪积累的观察，本发明人还采用振动切片机横切经4％的PFA(多聚甲醛)固定的突变鱼和相同大小的野生对照鱼，另外还对这两种鱼的腹部脂肪进行了提取固定切片和苏木精伊红染色观察，统计分析了染色后的脂肪细胞的大小。结果见图6。

在测定鱼体总脂肪含量时，本发明人分别将100日龄雄性和雌性的突变鱼的野生对照鱼以及不同月龄的野生鱼在液氮中速冻3小时，并保存在-80℃中至少24小时，然后将鱼体样本在真空干燥机中维持-20℃冷冻干燥至少24小时，再将干燥过的样品称重并切成细小块，样品中的总脂肪再用氯仿：甲醇(1:2，v/v)混合有机试剂在索氏提取器中抽提出来。将抽提的总脂移至温度恒定于55℃的烘箱中，直到重量不再下降，再行称重。本发明人将此时秤得的重量除以鱼体的干燥后获得重量即获得了鱼的总脂肪与总干重比，即总脂肪含量百分数。对于1-2月龄(mpf)的鱼样本，一般2-4尾合并为1个样品，而对于3月龄(mpf)后的鱼体，可单条测定。每组比较试验，都进行了3次生物学重复。结果见图2和图6。

单羟VD3处理对cyp2r1缺失突变鱼表型的挽救试验

先将购自Sigma公司的25-羟基维生素D₃单水合物(cat.no.17938,Sigma)溶于95％乙醇配制成浓度为6mM的工作母液。在试验中，本发明人采用养殖系统水将该母液稀释至25(OH)D₃浓度为6nM的浸泡液，将5日龄的F2代鱼苗的一半放入该浸泡液中开始处理，另一半养殖在含有溶剂的普通系统水中，直到100日龄时，开始分别对雌性和雄性的25(OH)D₃处理的突变鱼和不处理的突变鱼和野生对照鱼的体重、标准体长和总体脂含量分析。结果见图8。由于雌雄统计结果类似，这里只显示雄性统计的结果。养殖浸泡水每天更新，并为避免光对25(OH)D₃的稳定性产生影响，浸泡试验放在暗处进行。

二羟VD₃和游离态脂肪酸检测

将成年斑马鱼用0.02％MS-222(Cat.no.A5040,Sigma)麻醉后，将尾巴用剪刀剪掉，自伤口处用肝素处理后的移液枪头收集血液，血浆用离心机在4℃以1500g，离心15min方式沉积，收集血浆,将其保存于-80℃待后续测试。

取自Cyp2r1敲除的斑马鱼(Cyp2r1^-/-)，其野生型对照鱼(Cyp2r1^+/+)或者25(OH)VD₃处理的敲除鱼的血浆(100ul)、腹部脂肪组织或肝组织(100mg)通过按照已报道的材料和方法进行抽提(Hedman et al.,2014；van den Ouweland et al.,2010)，使用Waters公司的超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-TQMS，Waters ACQUITY)进行二羟VD₃含量的检测。主要使用的试剂是1,25(OH)₂D₃(Sigma)和d6(26,26,26,27,27,27)-1,25(OH)₂D₃(Pelham,NH,USA)。根据标准品曲线计算得出样品的浓度。标准品和样品均重复三次。

血浆中的游离脂肪酸则以购置于Cayman Chemical Company公司的Fatty AcidFluorometric Assay kit(Cat.No.700310)试剂盒，按照制造商提供的操作指南，测试获得。

表1中显示了，在Cyp2r1敲除的斑马鱼(Cyp2r1^-/-)，其野生型对照鱼(Cyp2r1^+/+)或者25(OH)VD₃处理的敲除鱼的血浆、腹部脂肪组织或肝中检测到的1,25(OH)₂D₃和游离脂肪酸含量。

染色质免疫共沉淀-PCR(ChIP-PCR)和染色质免疫共沉淀定量PCR(ChIP-qPCR)

收集至少0.5克4月龄的成年野生型斑马鱼肝、腹部脂肪组织，后期处理按照(Haimet al.,2013)描述的方法进行。简要而言，将组织以福尔马林固定，然后通过离心将高密度沉淀、水相溶液和高含脂的组织碎片分离，然后保留组织碎片部分，重溶于脂肪细胞裂解缓冲液(500mM PIPES,80mM KCl,1％Igepal和0.1％蛋白酶抑制剂),通过匀浆和振荡以破坏细胞膜，使细胞核得以释放。将样本离心，收集细胞核沉淀物，再将其重溶于RIPA缓冲液，将悬浮液以超声波处理，以获得200-500bp的基因组DNA片段，然后以12,000g转速离心10分钟,取上清液进行下一步的免疫沉淀反应。

取300μl的前述制备的组织提取物，与VDR抗体(Abcam,ab3508)或一种阴性对照抗体(正常兔IgG)在4℃下孵育过夜，再将此孵育后的溶液与加入其中的Protein ADynabeads(一种覆盖有protein A的铁微粒)在4℃下再孵育3小时，用磁铁吸附孵育的混合液，去除上清液保留下铁微粒，再以盐缓冲液(20mM Tris Ph 8.1,150mM NaCl,2mM EDTA,0.1％SDS和1％Triton X-100)、高盐缓冲液(250mM Tris pH7.4,750mM NaCl,10mM EDTA,0.1％SDS,0.5％NP-40和0.5deoxycholate)、和PNK缓冲液(50mM Tris,20mM EGTA和0.5％NP-40)依次冲洗铁微粒，重复此冲洗循环2次。再用洗脱缓冲液(50nM Tris 8.0,10mM EDTA和1％SDS)从铁微粒上洗脱免疫沉淀物，然后在65℃下孵育过夜，以解交联接着采用RNaseA和proteinase K处理洗脱样本，并将其中的DNA片段用苯酚纯化处理，并用乙醇加以沉淀。

由染色质免疫沉淀下的DNA中的目标基因，由PCR和DNA测序进行分析。PCR采用的引物见表4。

报告性荧光素酶活性转录激活试验

由PCR扩增而获得斑马鱼基因组DNA中包含VDR结合位点的斑马鱼pgc1a的邻近区域(-1729至+1032bp，转录起始位点ATG为+1至+3)，即，近端启动子2761bp的片段(图11)，扩增采用正向引物5’CTCTCAGAATTGGGCGGTCA 3’(SEQ ID NO.3)和反向引物5’TGAGACACTCAACTAACCTCT 3’(SEQ ID NO.4)。将此扩增片段克隆插入pGL3-Basic(Promega)荧光素酶报告性载体质粒获得pGL3-basic-pgc1a-luc报告性载体质粒。本发明人将pGL3-basic-pgc1a-luc质粒和pRL-SV40质粒(作为内参照)以显微注射方式注射入单细胞期的斑马鱼受精卵。将注射后的受精卵置于含有二羟VD₃(1α,25(OH)₂D₃,cat.no.D1530,Sigma)(10nM)或对照溶剂(95％乙醇)的卵水中，在24小时后，获取15个受精卵置于溶解缓冲液(E1941，Promega)中匀浆，定量抽取上清液，用Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)进行荧光素酶活性测定，以对照溶剂处理组为1，计算出二羟VD₃处理组的相对荧光素酶活性。本实验进行了3次生物学重复。结果见图10E。

线粒体膜电位和线粒体DNA的相对含量检测

按照制造厂商提供的方法，本发明人采用Tissue Mitochondria Isolation Kit(Beyotime,China)试剂盒提取了50mg来自100日龄的突变型和野生型姊妹鱼的肝或腹部脂肪组织的线粒体。主要步骤是首先用试剂盒提供的线粒体分离液A将组织匀浆，然后将匀浆组织液以4℃下，600g转速离心，再将上清液在4℃下，以11,000g转速10分钟，将获得的沉淀物重悬浮作为线粒体母液。接下来，本发明人用MitoProbeTM JC-1 Assay Kit for FlowCytometry(Life Technologies)试剂盒，依照厂商提供的操作步骤，将分离的线粒体与含有2μM JC-1的溶液在室温下孵育10分钟。其中一部分JC-1线粒体孵育液中加入50μM的carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone(CCCP)，作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。线粒体膜电位消失的程度按照试剂盒厂商提供的方法，即是基于在细胞流速仪FACSVerse(BD Biosciences,USA)分别在488nm和633nm记录的JC-1单体与JC-1聚集体的比例计算而得。此试验进行了3次生物学重复。

为提取来自100日龄的突变型和野生型姊妹鱼肝或腹部脂肪组织中总基因组DNA，本发明人将组织置于灭菌的含有500μl裂解液(100mM Tris-base,80mM EDTA-Na2,0.5％SDS,100μg/ml proteinase K)的小管中，在55℃中孵育3小时，再将样品用RNase A处理，DNA依次采用苯酚-氯仿混合液纯化3次，再用异丙醇沉淀，DNA最后溶于无菌水中。采用SYBRGreen Real-Time PCR Mix(Toyobo)试剂，以荧光实时定量PCR的方式，通过定量扩增线粒体特异基因mt-nd1和mt-nd6的片段作为线粒体基因的代表，而以neb和polg1基因作为核DNA的代表，按照qPCR的计算原理，以neb或者polg1为内参基因，以野生型样品的数值为对照值1，计算出突变型样品中mt-nd1和mt-nd6的相对值，即得到在突变品系和野生型组织中线粒体DNA相对含量的对比数据(结果见图12B,13B)。该方法以及其扩增引物(SEQ IDNO.37-44，表4)均依据前期报道(Artuso et al.,2012)。本试验也进行了3次生物学重复。

线粒体脂肪酸的beta-氧化

线粒体脂肪酸的beta-氧化检测过程参照前期报道(Demizieux et al.,2002)。把来自100日龄的突变型和野生型姊妹鱼的肝或腹部脂肪组织匀浆。本发明人采用(1-¹⁴C)标记的棕榈酸进行试验。采用液体闪烁分析仪Tri carb 4910 TR(Perkin Elmer)检测样品的放射活性。

实时定量逆转录多聚酶链反应分析方法

总RNA抽提通常取自5尾100日龄的突变型或者野生型姊妹鱼的肝或腹部脂肪组织，提取采用TRIzol Reagent(Life Technology)试剂，并依照制造商提供的详细实验步骤。再以DNase I处理30分钟以去除其中的DNA污染，随后再采用苯酚-氯仿溶液加以纯化，然后以异丙醇沉淀总RNA，然后用灭菌的无RNA酶水加以溶解。将其中的mRNA逆转录为cDNA时，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622,Thermo)由4μg总RNA合成cDNA。本发明人使用real-time detection system(Bio-Rad)和SYBR Green Real-TimePCR Mix(Toyobo)进行实时定量多聚酶链式反应(qPCR)。作为持家基因内参的转录本采用斑马鱼β-actin。本项工作中分析的基因cyp2r1,cyp27a1,cyp24a1,pgc-1a,nrf-1,erra,ppara,ucp1,mrpl15,mrpl2,mrps10,mtfp1,mcu,slc25a20所采用的引物详见表4(SEQ IDNO.5-34).为避免个体性别间可能带来的差异，一般未明确的情况下，则均采用雄性个体进行。图12A显示了，在突变品系和野生型组织中所分析基因的相对表达水平。

免疫印迹杂交试验

采用购买的Tissue Extraction Reagent I(FNN0071，Thermo,USA)自100日龄的突变型和野生型姊妹鱼的肝组织或腹部脂肪组织提取总蛋白，其方法步骤依据制造厂家提供的方法。将抽提的总蛋白经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳加以分离，再将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上等待抗体识别。本次试验本发明人所采用的抗体及厂家如下：anti-PGC-1a(SAB2108742,Sigma),anti-MTCO1(ab14705,Abcam),anti-COXIV(ab33985,Abcam)和anti-β-actin(SC-69879,Santa Cruz Biotechnology),这些抗体作为一抗添加时，采用1:1,000的稀释倍数。本发明人采用辣根过氧化物酶标记的二抗以产生化学发光信号，采用CCD camera-based imager(Chemidoc MP Imaging System,Bio-Rad)加以信号的检测。其条带的信号强度由ImageJ软件加以量化。通常本发明人以测自野生型斑马鱼(cyp2r1^+/+)中的信号作为相对强度的基准加以量化。试验结果以3次生物学重复采信。

血浆中钙、磷离子测定

取10μL血浆置于60μL的HNO₃在灭菌后的小管中65℃硝化3小时，该裂解液用双蒸水稀释至3mL。然后采用Perkin-Elmer Optimal 8000(Perkin Elmer,MA,USA)的电感耦合等离子体发射光谱仪测定样品中的钙、磷含量。测定时以重量为基础配制一定浓度的标准品母液，再自母液中配制一系列标准曲线。每种离子的标准曲线重复3次，双蒸水稀释的2％HNO₃作为阴性对照。

测定的定标计算采用重量法为基础，自母液中配制一系列标准曲线。每种离子采用3种定标测算标准，以双蒸水配制的2％HNO₃作为阴性对照。

肝组织中甘油三酯的测定

斑马鱼肝组织中甘油三酯含量采Cayman Chemical Company生产的甘油三酯比色测试试剂盒(产品号：10010303)，方法依照制造厂家提供的详细操作方法。

整体原位杂交试验

用4％多聚甲醛溶液固定5日龄的突变鱼和野生型对照鱼，整体原位杂交试验所用的trpv6的探针序列和实验方法均参考我们实验室之前的报道进行操作(Shu et al.,2016)。

肝脏切片油红O染色

解剖100日龄的突变鱼和野生型对照鱼的肝脏经4％多聚甲醛溶液固定后切片和染色，操作流程和所用试剂参考前人报道(Oka et al.,2010)。

3T3-L1细胞培养和分化

3T3-L1细胞培养在含有89％DMEM(Sigma)、10％小牛血清(Sigma)、和1％的青霉素/链霉素(Gibco)的生长培养基里。每48小时更换一次培养基。细胞100％回合的两天后开始分化，3T3-L1细胞开始用含有0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma)、1uM的地塞米松、1.74uM的胰岛素(Sigma)、10％的胎牛血清(Sigma)、1％的青霉素/链霉素(Gibco)和87％DMEM的分化培养基里。开始分化时加入1nM的1,25(OH)₂D₃(Sigma)或者等量的溶剂(乙醇)。分化后第6天，细胞的分化程度通过镜检和油红O染色确定，甘油三脂含量采用上述的试剂盒检测。

VDR在3T3-L1细胞中Pgc1a启动子区域的富集ChIP实验参照已经报道的方法(Johnet al.,2012)。VDR抗体(Abcam,ab3508)和正常兔IgG(阴性对照抗体)富集到的DNA进行实时定量PCR，所用引物如下：-972bp至-903bp：正向引物5’CCAAGGCACTAGGGTTGGAG 3’(SEQID NO.45)和反向引物5’AGCACAGTCTTCCTCATGGC 3’(SEQ ID NO.46)；+363bp至+502bp：正向引物5’CTTGCACAGGAGAAGGGAGG 3’(SEQ ID NO.47)和反向引物5’CACACACTCATGCAGGCAAC3’(SEQ ID NO.48)；+330至+410bp：正向引物5’CCTTGGAGTGACGTCAGGAG 3’(SEQ ID NO.49)和反向引物5’AAAGTAGGCTGGGCTGTCAC 3’(SEQ ID NO.50)；-764bp至-660bp：正向引物5’CTGGGCCTGGAAGGGTTAAG 3’(SEQ ID NO.51)和反向引物5’GCAGGTGCCACTGTTTTTCC 3’(SEQID NO.52)；-1116bp至-1016bp：正向引物5’AAGCTGTTTCAGGGATGGCA 3’(SEQ ID NO.53)和反向引物5’ACTCTTGGGTTCCCCCTCAT 3’(SEQ ID NO.54)。以IgG组作为对照计算数值。

统计学分析

本发明人采用Statistical Product and Service Solution(SPSS)软件对数据开展T检验分析。数据采用平均值±标准差方式表达，p<0.05被认定为差异显著，而如果p<0.01，则被认定为差异非常显著。

表1.Cyp2r1敲除和其野生型姊妹鱼的标准体长、体重和存活率统计分析结果

**P<0.01,突变鱼中与对应的对照组数据比较；突变型斑马鱼共统计13尾，野生型姊妹鱼统计15尾。

表2. 1,25(OH)₂D₃和游离脂肪酸含量

N.D.表示没有检测；**P<0.01,突变鱼中与对应的对照组数据比较；a,b,c：每组间不同的字母代表二者有显著差异。

表3. 100日龄的突变型和野生型姊妹鱼的瘦肉率(％干重)和水份重(％湿重)。

**P<0.01,突变鱼中与对应的对照组数据比较。

表4.本实验中采用的引物信息

参考文献

Artuso,L.,Romano,A.,Verri,T.,Domenichini,A.,Argenton,F.,Santorelli,F.M.,and Petruzzella,V.(2012).Mitochondrial DNA metabolism in earlydevelopment of zebrafish(Danio rerio).Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Bioenergetics 1817,1002-1011.

Arunabh,S.,Pollack,S.,Yeh,J.,and Aloia,J.F.(2003).Body fat contentand 25-hydroxyvitamin D levels in healthy women.The Journal of ClinicalEndocrinology&Metabolism 88,157-161.

Bellows,C.G.,Wang,Y.-H.,Heersche,J.N.M.,and Aubin,J.E.(1994).1,25-Dihydroxyvitamin D3 stimulates adipocyte differentiation in cultures of fetalrat calvaria cells:comparison with the effects of dexamethasone.(Endocrinology 134:2221-2229)

Cermak,T.,Doyle,E.L.,Christian,M.,Wang,L.,Zhang,Y.,Schmidt,C.,Baller,J.A.,Somia,N.V.,Bogdanove,A.J.,and Voytas,D.F.(2011).Efficient design andassembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNAtargeting.Nucleic acids research,gkr218.

Cheng,J.B.,Motola,D.L.,Mangelsdorf,D.J.,and Russell,D.W.(2003).De-orphanization of Cytochrome P450 2R1a microsomal vitamin D 25-hydroxylase.Journal of Biological Chemistry 278,38084-38093.

Craig,T.A.,Zhang,Y.,McNulty,M.S.,Middha,S.,Ketha,H.,Singh,R.J.,Magis,A.T.,Funk,C.,Price,N.D.,and Ekker,S.C.(2012).Research resource:wholetranscriptome RNA sequencing detects multiple 1α,25-dihydroxyvitamin D3-sensitive metabolic pathways in developing zebrafish.Molecular endocrinology26,1630-1642.

Eaton,S.(2002).Control of mitochondrialβ-oxidation flux.Progress inlipid research 41,197-239.

Elamin,M.B.,Abu Elnour,N.O.,Elamin,K.B.,Fatourechi,M.M.,Alkatib,A.A.,Almandoz,J.P.,Liu,H.,Lane,M.A.,Mullan,R.J.,and Hazem,A.(2011).Vitamin D andcardiovascular outcomes:a systematic review and meta-analysis.The Journal ofClinical Endocrinology&Metabolism 96,1931-1942.

F Holick,M.(2011).Vitamin D:evolutionary,physiological and healthperspectives.Current drug targets 12,4-18.

Finn,P.F.,and Dice,J.F.(2006).Proteolytic and lipolytic responses tostarvation.Nutrition 22,830-844.

Flynn,E.J.,Trent,C.M.,and Rawls,J.F.(2009).Ontogeny and nutritionalcontrol of adipogenesis in zebrafish(Danio rerio).Journal of lipid research50,1641-1652.

George,P.,Pearson,E.,and Witham,M.(2012).Effect of vitamin Dsupplementation on glycaemic control and insulin resistance:a systematicreview and meta‐analysis.Diabetic Medicine 29,e142-e150.

Goldstone,J.V.,McArthur,A.G.,Kubota,A.,Zanette,J.,Parente,T.,M.E.,Nelson,D.R.,and Stegeman,J.J.(2010).Identification and developmentalexpression of the full complement of Cytochrome P450 genes in Zebrafish.BMCgenomics 11,1.

Haim,Y.,Tarnovscki,T.,Bashari,D.,and Rudich,A.(2013).A chromatinimmunoprecipitation(ChIP)protocol for use in whole human adiposetissue.American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism 305,E1172-E1177.

Hedman,C.J.,Wiebe,D.A.,Dey,S.,Plath,J.,Kemnitz,J.W.,and Ziegler,T.E.(2014).Development of a sensitive LC/MS/MS method for vitamin D metabolites:1,25 Dihydroxyvitamin D 2&3 measurement using a novel derivatizationagent.Journal of Chromatography B 953,62-67.

Hofer,A.,Kovacs,G.,Zappatini,A.,Leuenberger,M.,Hediger,M.A.,Lochner,M.(2013).Design,synthesis and pharmacological characterization of analogs of2-aminoethyl diphenylborinate(2-APB),a known store-operated calcium channelblocker,for inhibition of TRPV6-mediated calcium transport.Bioorganic&Medicinal Chemistry.21:3202-3213.

John,E.,Wienecke-Baldacchino,A.,Liivrand,M.,M.,Carlberg,C.,and Sinkkonen,L.(2012).Dataset integration identifies transcriptionalregulation of microRNA genes by PPARγin differentiating mouse 3T3-L1adipocytes.Nucleic acids research 40,4446-4460.

Kerner,J.,and Hoppel,C.(2000).Fatty acid import intomitochondria.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular and Cell Biology ofLipids 1486,1-17.

Kimmel,C.B.,Ballard,W.W.,Kimmel,S.R.,Ullmann,B.,and Schilling,T.F.(1995).Stages of embryonic development of the zebrafish.Developmentaldynamics:an official publication of the American Association of Anatomists203,253-310.

Kollitz,E.M.,Zhang,G.,Hawkins,M.B.,Whitfield,G.K.,Reif,D.M.,andKullman,S.W.(2015).Molecular cloning,functional characterization,andevolutionary analysis of vitamin D receptors isolated from basalvertebrates.PloS one 10,e0122853.

Lechner,D.,Kállay,E.,and Cross,H.S.(2007).1α,25-Dihydroxyvitamin D 3downregulates CYP27B1 and induces CYP24A1 in colon cells.Molecular andcellular endocrinology 263,55-64.

Li,Y.C.,Bergwitz,C.,Jüppner,H.,and Demay,M.B.(1997).Cloning andCharacterization of the Vitamin D Receptor from Xenopus laevis1.Endocrinology 138,2347-2353.

Lin,C.-H.,Su,C.-H.,Tseng,D.-Y.,Ding,F.-C.,and Hwang,P.-P.(2012).Action of vitamin D and the receptor,VDRa,in calcium handling in zebrafish(Danio rerio).Plos one 7,e45650.

Malloy,P.J.,and Feldman,D.(2012).Genetic disorders and defects invitamin D action.Rheumatic Disease Clinics of North America 38,93-106.

McMenamin,S.K.,Minchin,J.E.,Gordon,T.N.,Rawls,J.F.,and Parichy,D.M.(2013).Dwarfism and increased adiposity in the gh1 mutant zebrafishvizzini.Endocrinology 154,1476-1487.

Meeker,N.D.,Hutchinson,S.A.,Ho,L.,and Trede,N.S.(2007).Method forisolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.BioTechniques 43,610,612,614.

Narvaez,C.J.,Matthews,D.,Broun,E.,Chan,M.,and Welsh,J.(2009).Leanphenotype and resistance to diet-induced obesity in vitamin D receptorknockout mice correlates with induction of uncoupling protein-1 in whiteadipose tissue.Endocrinology 150,651-661.

O’Neill,H.M.,Holloway,G.P.,and Steinberg,G.R.(2013).AMPK regulationof fatty acid metabolism and mitochondrial biogenesis:implications forobesity.Molecular and cellular endocrinology 366,135-151.

Omdahl,J.L.,Morris,H.A.,and May,B.K.(2002).Hydroxylase enzymes of thevitamin D pathway:expression,function,and regulation.Annual review ofnutrition 22,139-166.

Oka,T.,Nishimura,Y.,Zang,L.,Hirano,M.,Shimada,Y.,Wang,Z.,Umemoto,N.,Kuroyanagi,J.,Nishimura,N.,and Tanaka,T.(2010).Diet-induced obesity inzebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalianobesity.BMC physiology 10,21.

Otero,R.,Seoane,S.,Sigüeiro,R.,Belorusova,A.Y.,Maestro,M.A.,Pérez-Fernández,R.,Rochel,N.,and A.(2016).Carborane-based design of a potentvitamin D receptor agonist.Chemical Science 7,1033-1037.

Peng,W.-H.,Lee,Y.-C.,Chau,Y.-P.,Lu,K.-S.,and Kung,H.-N.(2015).Short-Term Exposure of Zebrafish Embryos to Arecoline Leads to Retarded Growth,Motor Impairment,and Somite Muscle Fiber Changes.Zebrafish 12,58-70.

Pittas,A.G.,Lau,J.,Hu,F.B.,and Dawson-Hughes,B.(2007).The role ofvitamin D and calcium in type 2 diabetes.A systematic review and meta-analysis.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism 92,2017-2029.

Prosser,D.E.,and Jones,G.(2004).Enzymes involved in the activationand inactivation of vitamin D.Trends in biochemical sciences 29,664-673.

Rosen,C.J.,Adams,J.S.,Bikle,D.D.,Black,D.M.,Demay,M.B.,Manson,J.E.,Murad,M.H.,and Kovacs,C.S.(2012).The nonskeletal effects of vitamin D:anEndocrine Society scientific statement.Endocrine reviews 33,456-492.

Sato,M.and Hiragun,A.(1988).Demonstration of 1α,25-DihydroxyvitaminD₃ Receptor-Like Molecule in ST 13 and 3T3 L1 Preadipocytes and itsInhibitory Effects on Preadipocyte Differentiation.Journal of CellularPhysiology 135:545-550.

Schuster,I.,Egger,H.,Herzig,G.,Reddy,G.S.,Schmid,J.A.,Schuessler,M.,and Vorisek,G.(2006).Selective inhibitors of vitamin D metabolism-Newconcepts and perspectives.Anticancer research 26,2653-2668.

Shu,Y.,Lou,Q.,Dai,Z.,Dai,X.,He,J.,Hu,W.,and Yin,Z.(2016).The basalfunction of teleost prolactin as a key regulator on ion uptake identifiedwith zebrafish knockout models.Scientific reports 6.

Sundaram,K.,Sambandam,Y.,Tsuruga,E.,Wagner,C.L.,and Reddy,S.V.(2014).1α,25-dihydroxyvitamin D3 modulates CYP2R1 gene expression in human oralsquamous cell carcinoma tumor cells.Hormones and Cancer 5,90-97.

Takada,I.,and Makishima,M.(2015).Therapeutic application of vitamin Dreceptor ligands:an updated patent review.Expert opinion on therapeuticpatents 25,1373-1383.

van den Ouweland,J.M.,Beijers,A.M.,Demacker,P.N.,and van Daal,H.(2010).Measurement of 25-OH-vitamin D in human serum using liquidchromatography tandem-mass spectrometry with comparison to radioimmunoassayand automated immunoassay.Journal of Chromatography B 878,1163-1168.

Ventura-Clapier,R.,Garnier,A.,and Veksler,V.(2008).Transcriptionalcontrol of mitochondrial biogenesis:the central role of PGC-1α.Cardiovascularresearch 79,208-217.

Whitfield,G.K.,Dang,H.T.,Schluter,S.F.,Bernstein,R.M.,Bunag,T.,Manzon,L.A.,Hsieh,G.,Encinas Dominguez,C.,Youson,J.H.,and Haussler,M.R.(2003).Cloning of a functional vitamin D receptor from the lamprey(Petromyzonmarinus),an ancient vertebrate lacking a calcified skeleton andteeth.Endocrinology 144,2704-2716.

Wortsman,J.,Matsuoka,L.Y.,Chen,T.C.,Lu,Z.,and Holick,M.F.(2000).Decreased bioavailability of vitamin D in obesity.The American journal ofclinical nutrition 72,690-693.

Zemel,M.B.,Shi,H.,Greer,B.,Dirienzo,D.,and Zemel,P.C.(2000)Regulationof adiposity by dietary calcium.FASEB J.14,1132–1138.

Zhu,J.G.,Ochalek,J.T.,Kaufmann,M.,Jones,G.,and DeLuca,H.F.(2013).CYP2R1 is a major,but not exclusive,contributor to 25-hydroxyvitamin Dproduction in vivo.Proceedings of the National Academy of Sciences 110,15650-15655.

Zimmermann,R.,Strauss,J.G.,Haemmerle,G.,Schoiswohl,G.,Birner-Gruenberger,R.,Riederer,M.,Lass,A.,Neuberger,G.,Eisenhaber,F.,and Hermetter,A.(2004).Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adiposetriglyceride lipase.Science 306,1383-1386.

Carlberg,C.,and Campbell,M.J.(2013).Vitamin D receptor signalingmechanisms:integrated actions of a well-defined transcription factor.Steroids78,127-136.

Demizieux,L.,Degrace,P.,Gresti,J.,Loreau,O.,J.-P.,Chardigny,J.-M.,Sébédio,J.-L.,and Clouet,P.(2002).Conjugated linoleic acid isomers inmitochondria evidence for an alteration of fatty acid oxidation.Journal oflipid research 43,2112-2122.

Maruyama,T.,Li,J.,Vaque,J.P.,Konkel,J.E.,Wang,W.,Zhang,B.,Zhang,P.,Zamarron,B.F.,Yu,D.,and Wu,Y.(2011).Control of the differentiation ofregulatory T cells and TH17 cells by the DNA-binding inhibitor Id3.Natureimmunology 12,86-95.

Claims

1.维生素D受体激动剂在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者用于调节、特别是减轻体重。

2.维生素D受体激动剂在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗腹部肥胖，用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累，用于调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。

3.包含维生素D受体激动剂和钙吸收抑制剂的组合产品，其中所述维生素D受体激动剂优选不是VDR特征性激动剂。

4.根据权利要求3所述的组合产品，其中钙吸收抑制剂选自降钙素、二苯基硼酸2-氨基乙基酯或双膦酸盐类药物，例如氨羟二膦酸二钠。

5.维生素D受体激动剂和钙吸收抑制剂的组合在制备药物产品或食物产品中的用途，所述产品用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，用于调节、特别是减轻体重，或者优选用于预防和/或治疗腹部肥胖，用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累，用于调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。

6.根据权利要求2或5所述的用途，其中腹部肥胖选自1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部肥胖、成年腹部肥胖、中老年腹部肥胖、成年生理性腹部肥胖或者中老年生理性腹部肥胖。

7.根据权利要求2或5所述的用途，其中腹部脂肪积累选自1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪积累、成年腹部脂肪积累、中老年腹部脂肪积累、成年生理性腹部脂肪积累或者中老年生理性腹部脂肪积累。

8.根据权利要求2或5所述的用途，其中腹部脂肪氧化代谢异常选自成年腹部脂肪氧化代谢异常、中老年腹部脂肪氧化代谢异常或者1,25-二羟维生素D₃合成不足或其活化和/或代谢异常介导的腹部脂肪氧化代谢异常。

9.根据权利要求2或5所述的用途，其中所述产品用于促进成年腹部脂肪氧化代谢或中老年腹部脂肪氧化代谢。

10.根据权利要求1-2和5-9中任意一项所述的用途，其中食物产品选自保健食品、营养组合物、营养制品、食品补充剂、饮料、膳食补充剂、功能性食品、全餐、点心、饼干、能量棒、替代餐和宠物食品。

11.用于调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累，或者促进腹部脂肪氧化代谢的用于非治疗目的的美容方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的维生素D受体激动剂。

12.根据权利要求11的方法，所述个体优选是非肥胖个体。

13.根据前述任意一项权利要求所述的用途、组合产品或方法，其中维生素D受体激动剂是1,25-二羟化维生素D₃。

14.根据权利要求1-12中任意一项所述的用途、组合产品或方法，其中维生素D受体激动剂是维生素D受体特征性激动剂，例如是合成的维生素D受体特征性激动剂，其优选选自以下一种或多种：(5Z,7E)-(1R,2S,3R,20R)-2-(2-羧基乙氧基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(5Z,7E)-(1S,2S,3R,20R)-2-(2-羧丙基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(5Z,7E)-(1R,2S,3R,20R)-2-((2-羧基-2,2-桥亚乙基)乙氧基)-23-炔-9,10-闭联-5,7,10(19)-胆甾三烯-1,3,25-三醇、(1R，3R)-5-((E)-2-((3aS,7aS)-1-((R)-1-((5)-3-羟基-2,3-二甲基丁氧基)乙基)-7a-甲基二氢-1H-茚-4(2H,5H,6H,7H,7aH)-亚基)亚乙基)-2-亚甲基环己烷-1,3-二醇、(4R,8R)-6-((E)-2-((1S,7aS)-1-((R)-1-(3-乙基-3-羟基戊基氧基)乙基)-7a-甲基二氢-IH-茚-4(2H,5H,6H,7H,7αH)-亚基)亚乙基)螺[2.5]辛烷-4,8-二醇、1,25-二羟基-21(3-甲基-3-羟基-丁基)-19-去甲-胆钙化醇、4-亚甲基-3-(2-{7α-甲基-1-[1-甲基-4-(2-甲基-丙烷-2-磺酰基)-丁-3-烯基]-3,3a 5,6,7,7a-六氢-茚-4-亚基}亚乙基)-环己醇、下式化合物A、4-氯-N-((2-氯苯基)(2-甲基-IH-吲哚-3-基)甲基)苯胺、石胆酸乙酸酯、石胆酸丙酸酯和下式化合物B

15.根据权利要求1-12中任意一项所述的用途、组合产品或方法，其中维生素D受体激动剂是合成的维生素D受体激动剂，其选自以下一种或多种：来沙骨化醇、艾洛骨化醇、艾德骨化三醇、度骨化醇、西奥骨化醇、帕立骨化醇和卡泊三醇。

16.筛选用于调节脂肪氧化代谢和/或用于调节脂肪积累的化合物的方法，所述方法包括步骤：(a)提供包含与pgc-1a启动子有效连接的多核苷酸和表达VDR受体的细胞；(b)使化合物与所述细胞接触；(c)测定所述多核苷酸的表达水平；其中，与未加所述化合物相比，所述多核苷酸的表达改变指示，所述化合物是用于调节脂肪氧化或用于调节脂肪积累的化合物。

17.权利要求16的方法，其中所述pgc-1a启动子是脊椎动物来源的pgc-1a启动子，优选是人的、鼠的、斑马鱼的pgc-1a启动子，更优选地，所述pgc-1a启动子具有SEQ ID NO.55的序列。

18.权利要求16-17中任意一项的方法，还包括步骤：将获得的调节脂肪氧化代谢或用于调节脂肪积累的化合物配制成药物，所述药物例如用于预防和/或治疗肥胖、超重、或者由超重或肥胖引起的或者与超重或肥胖相关的疾病或病症，或者调节、特别是减轻体重；优选用于预防和/或治疗腹部肥胖，或者调节、特别是减轻或抑制腹部脂肪积累或腹部肥胖，或者调节腹部脂肪氧化代谢异常、特别是促进腹部脂肪氧化代谢，或者用于预防和/或治疗由腹部肥胖、腹部脂肪积累或腹部脂肪氧化代谢异常引起的或与之相关的疾病或病症。

19.用于筛选调节脂肪氧化代谢和/或用于调节脂肪积累的化合物的试剂盒，包含表达VDR受体的细胞和/或与pgc-1a启动子有效连接的多核苷酸。

20.权利要求19的试剂盒，其中所述细胞为转化并表达与pgc-1a启动子有效连接的多核苷酸的重组细胞。