KR20120019413A - 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis)의 추출물 및 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물 및 이의 분획물이 대식세포에서 인위적인 염증 유발에 의해 급격히 증가한 NO, PGE2 TNF-α의 생성억제, iNOS 및 COX-2 발현 억제, MAPK 단백질의 인산화 저해, NF-κB의 핵전이 억제, 사이토카인 IL-6와 IL-1beta의 양을 감소시킴으로써 염증을 억제하고, 카라기난 유도 마우스 모델에서 족부종 억제 효과를 나타내었고, 천식이나 알레르기에 증가되는 Th2 유형 사이토카인인 IL-4와 IL-13의 양을 현저하게 감소시키는 효과를 가짐으로써 워크리아 인시그니스 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증관련 질환, 알레르기 및 천식의 예방 및 치료를 위한 의약품, 건강식품용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising extracts and fractions of Ｗｅｒｃｋｌｅａ ｉｎｓｉｇｎｉｓ for prevention and treatment of inflammatory diseases or asthma}
본 발명은 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis) 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 염증 반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려고 하는 생체의 방어 반응과정이다. 따라서 이러한 일련의 반응에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포, 면역관여 세포 등이 포함된다고 한다. 최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인(cytokine)이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되고 있으며, 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다.
세포막에서 핵까지 신호를 전달하는 경로는 MAPK(Mitogen-activated protein kinase) cascade를 따라 이루어지고, 현재까지 잘 알려진 MAPK으로는 Erk 외에 p38 MAPK와 JNK(jun N-terminal kinase) 등이 있으며, 이들의 표적유전자는 대부분 세포를 자라게 하는데 필요한 세포분열이나 성장을 촉진하는 호르몬을 만들고 염증 반응이나 apoptosis 등에 관여하게 된다(Vanden Berghe W et al ., J. Biol . Chem ., 273:3285-3290, 1998; Yang M et al ., Am . J. Physiol . Heart . Circ . Physiol . 294:H994-1001). 염증을 유도하는 사이토카인과 매개체들은 핵의 요소에 의해 조절된다. 그 예로 NF-κB(nuclear factor-kappa B)는 Rel 유전자계(Rel gene family)의 핵단백질로서 7가지가 있고, 세포질에서는 IκB(inhibitory kappa B)와 결합되어 불활성인 형태로 존재하나, 유해산소(reactive oxygen), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)과 같은 케모카인(chemokines) 및 LPS와 같은 다양한 자극에 의해 IκB 키나제가 활성화된 후 인산화 과정을 통해 IκB가 떨어져 나가게 된다. p50과 p65의 헤테로다이머(heterodimer)로 구성된 NF-κB는 활성화 된 후, 핵으로 이동하여 염증반응을 유도하는 유전자(종양괴사인자나 사이클로옥사이드 합성효소) 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Oh GT et al ., Artherosclerosis, 159(1):17-26, 2001; Epstein FH et al ., The New England Journal of Medicine, 336(15):1066-1071, 1997; Zhang WJ et al ., FASEB J, 15(130):2423-2431, 2001; Denk A et al ., J. Biol . Chem ., 276(30):28451-28458, 2001; Sahnoun Z et al ., Phsiology, 53(4):315-339, 1998; Lindner V Pathobiology, 66(6):311-320, 1998; Landry DB et al., Am . J. Pathol., 151(4):1085-1095, 1997; ; Gerritsen ME et al., Am . J. Pathol.,147(2):p278-292, 1995).
질소산화물(NO)는 질소산화물 합성효소(NOS)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)이 산화되어 생성되는데, 염증과정의 매개체로서 병원성 DNA를 손상시키는 방어작용을 함으로써 항상성을 유지하는 역할을 한다(Kou and Schroder, Annuals of Surgery 221, 220-235, 1995). NOS 중에서 유도성 나이트릭옥사이드 합성효소(iNOS; inducible nitric oxide synthase)는 세포 내에서 NO의 과생산에 아주 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.
프로스타글란딘 E2(PGE2)과 류코트리엔 또한 아라키도닉산으로부터 생성되는 염증 매개체로서 특히, PGE2는 사이클로 옥사이드 합성효소(COX-2; cyclooxygenase-2 enzyme)에 의해 생성되며 주로 대식세포와 단핵구 세포에서 많이 생성되는데, 대식세포는 LPS와 같은 염증성 제제에 의해 빠르게 유도된다는 것이 밝혀졌다.
염증유발을 위해 동물모델에서 사용되는 물질들은 adjuvant, collagen II, carrageenan 등이 있는데, 해조류의 일종인 Chondrus cripus에서 추출한 carrageenan은 면역반응 억제 외에도 급성 염증 및 만성염증유발, DIC유발, 종양의 성장 촉진, Hageman factor와 kinin의 활성화, 보체의 불활성화 등 다양한 생물학적 작용이 있는 것으로 알려져 있다(Chan WY et al ., J. Pharmacol . Exptl . Therap ., 147: 48, 1965).
지금껏 일류가 개발한 약제 중 가장 강력한 항염작용을 지니고 있는 약제는 스테로이드 제제이다. 그러나 장기적으로 사용할 때 반드시 부작용을 수반하게 된다. 따라서 천식 치료에 있어 스테로이드제는 처음 사용할 때 놀라울 정도의 효과를 발휘하여 증상을 완전 소실시켜버리지만 이는 잠시일 뿐이고, 증상은 스테로이드 사용을 중지함과 함께 다시 나타나며 반복사용과 함께 증상은 더욱 심해져 간다. 스테로이드제는 둥근 다혈성의 얼굴, 체액의 저류, 부신억제, 감염에 대한 감수성의 증가와 기타 정신병, 백내장, 녹내장, 소화성 궤양, 창상 치유 지연, 초기 감염의 재활성화 등의 많은 부작용이 있다.
따라서, 천연식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 의약품이나, 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취할 수 있으며 염증을 억제할 수 효과가 있고, 용이하게 식품에 이용할 수 있는 물질에 대한 연구가 필요한 실정이다. 최근 아시아 경제 2010년 6월 14일 기사자료에 의하면 “SK케미칼의 천연물 분야 신약개발로서, 위염, 치매에 이어 천식치료제가 현재 임상 2상 시험을 진행 중이며, 계획대로 진행된다면 2014년 천식치료제가 발매된다."라고 보고되었으며, 대덕넷 2010년 6월 17일 기사자료에 의하면 “한국생명공학연구원의 면역제어 연구실 이형규 박사팀이 신이(자목련의 꽃봉오리)에서 추출한 NDC-052를 천식치료제로 개발, 한국신약에 이전되어 ‘아스망’이라는 상품명으로 임상시험 3상 시험을 진행 중에 있고, 올 상반기 발매된다”는 보고와, 약사공론 2006년 1월 22일 기사자료에 의하면 “영남대 약대 장현욱 교수 연구팀이 삼백초와 가죽나무의 추출물이 천식과 알레르기 치료에 효과가 있고, 19일 한국파마에 기술 선급료 1억5000만원, 경상실시료 매출액의 4%로 기술이전 계약을 체결하였다“는 보고도 있었듯이 천연식물 추출물의 연구가 활발히 진행되고 있다.
워크리아 인시그니스(Wercklea insignis Pittier & Standl.)는 아욱목 아욱과에 속하는 식물로써, 코스타리카 인근에서 자생한다. 이 식물이 속하는 아욱목, 아욱과의 식물을 염증, 알러지 치료에 이용한다는 선행문헌은 있으나(KR 10-2007-0001359, KR 10-2008-0079489, US 2004/019429 A1, US 1989/0346104 A1, WO 03/033007 A1), 워크리아 인시그니스와 동속 및 동종에 대한 문헌은 아직 보고되지 않았다.
이에, 본 발명자들은 워크리아 인시그니스의 추출물 및 이의 분획물을 제조하고, 상기 추출물 및 이의 분획물이 염증에 의해 증가한 질소산화물의 생성 저해, iNOS 발현 억제, 프로스타글란딘 생성 억제, COX-2 발현 억제, MAPK 단백질의 인산화 저해, NF-κB의 핵으로 이동 저해, IL-6 및 IL-1beta 사이토카인의 생성 저해, TNF-α 생성 저해, 비장 세포에서 Th2 유형 사이토카인인 IL-4 및 IL-13 생성 저해 및 카라기난(carrageenan) 유도 마우스 모델에서 족부종 억제 등의 우수한 항염증, 항천식 효과를 가지며, 독성이 없는 안전한 물질로, 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료를 위한 조성물로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis) 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 조성물, 건강식품용 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 워크리아 인시그니스 추출물에 유기용매를 가하여 제조한 븐획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 워크리아 인시그니스 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 워크리아 인시그니스 추출물에 유기용매를 가하여 제조한 븐획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물은 독성이 없는 안전한 물질로, 염증에 의해 증가한 질소산화물의 생성 저해, iNOS 발현 억제, 프로스타글란딘 생성 억제, COX-2 발현 억제, MAPK 단백질의 인산화 저해, NF-κB의 핵으로 이동 저해, IL-6 및 IL-1beta 사이토카인의 생성 저해, TNF-α 생성 저해, 비장 세포에서 IL-4 및 IL-13 생성 저해 및 카라기난 유도 마우스 모델에서 족부종을 억제함으로써 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 건강식품용 조성물 또는 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis) 추출물 또는 이의 분획물을 제조하는 방법을 나타낸 그래프이다.
도 2는 RAW264.7 세포에서 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharides)로 유도된 iNOS의 발현에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 억제 효과를 나타낸 그래프이다:
음성대조군: 0.2% DMSO만 투여한 군;
LPS: 1㎍/㎖의 LPS를 처리하여 염증이 유도된 양성대조; 및
LPS+WI추출물: 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 40㎍/㎖ 처리한 후 LPS로 유도한 군.
도 2a : 핵산증폭분석;
도 2b : 웨스턴 블랏팅; 및
도 2c : 면역형광분석
도 3은 RAW264.7 세포에서 리포폴리사카라이드(LPS)로 유도된 COX-2의 발현에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 억제 효과를 나타낸 그래프이다:
도 3a : 핵산증폭분석;
도 3b : 웨스턴 블랏팅; 및
도 3c : 면역형광분석.
도 4는 RAW264.7 세포에서 리포폴리사카라이드로 유도된 신호전달 단백질의 인산화에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 저해 효과를 나타낸 그림이다.
도 5는 RAW264.7 세포에서 리포폴리사카라이드로 유도된 NF-kB의 단백질의 핵으로의 이동에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 RAW264.7 세포에서 리포폴리사카라이드로 유도된 사이토카인의 생성에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 저해 효과를 나타낸 그래프이다:
# : 음성대조군에 대한 P값이 0.005 이하;
* : 양성대조군에 대한 P값이 0.05 이하; 및
** : 양성대조군에 대한 P값이 0.005 이하.
도 7은 RAW264.7 세포에서 리포폴리사카라이드로 유도된 TNF-alpha의 생성에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 카라기난(carrageenan)으로 유도된 마우스 족부종에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 저해 효과를 나타낸 그래프이다:
* : 음성대조군에 대한 P값이 0.15 이하; 및
** : 음성대조군에 대한 P값이 0.05 이하.
도 9는 비장 세포에서 ConA로 유도된 사이토카인의 생성에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 저해 효과를 나타낸 그래프이다:
# : 음성대조군에 대한 P값이 0.005 이하;
* : 양성대조군에 대한 P값이 0.05 이하; 및
** : 양성대조군에 대한 P값이 0.005 이하.
이하, 본 발명 상세히 설명한다.
본 발명은 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis) 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물은
1) 워크리아 인시그니스를 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하는 단계; 및
2) 단계 1)의 추출물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)에서는 워크리아 인시그니스는 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 알코올은 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하나, 메탄올을 이용하여 추출하는 것이 바람직하다. 추가적으로 유기물질은 100% 알코올에서 용출이 더 잘 되고 배당체는 알코올 수용액에서 용출이 더 잘 되므로 필요에 따라 알코올 또는 알코올 수용액으로 선택하여 사용할 수 있다. 상온에서 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 아울러 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 감압농축 및 건조과정은 당 업계에서 사용되는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물의 유기용매 분획물은
1) 워크리아 인시그니스 추출물의 물 현탁액을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 분획하는 단계 및
2) 단계 1)의 분획물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 워크리아 인시그니스 추출물은 상기 기재된 추출물 제조 방법에 따라 제조가 가능하나 이에 한정되지 않는다.
상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물은
1) 워크리아 인시그니스를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물로 추출하는 단계; 및
2) 단계 1)의 추출물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)에서는 워크리아 인시그니스는 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용될 수 있다.
유기물질은 100% 알코올에서 용출이 더 잘 되고 배당체는 알코올 수용액에서 용출이 더 잘 되므로 필요에 따라 에탄올 또는 에탄올 수용액으로 선택하여 사용할 수 있다. 상온에서 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 아울러 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 감압농축 및 건조과정은 당 업계에서 사용되는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물의 유기용매 분획물은
1) 워크리아 인시그니스 추출물의 물 현탁액을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 분획하는 단계 및
2) 1)의 분획물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 워크리아 인시그니스 추출물은 상기 기재된 추출물 제조 방법에 따라 제조가 가능하나 이에 한정되지 않는다.
상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물이 세포독성이 있는지 알아보기 위해, 대식세포에 대조군(DMSO), 본 발명의 추출물들을 처리한 후 배양한 다음 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물과 부탄올 분획물은 40 ㎍/㎖ 농도까지 독성이 거의 없음을 확인하였다. 그러나, 클로로포름과 에틸아세테이트 분획물은 40 ㎍/㎖의 농도에서 급격히 세포독성이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물 또는 이의 분획물은 세포독성에 안전한 물질임을 알 수 있다(표 1 참조).
본 발명자들은 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물의 염증성 질환 또는 천식에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 유도성 질소산화물(NO) 생성량, iNOS 발현량 변화 및 IL-6 저해 효과를 측정하였다. 그 결과, LPS에 의해 유발된 염증에 대하여 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물이 농도의존적으로 질소산화물과 IL-6의 생산량을 감소시키고, 물 분획물을 제외하고는 모든 분획물에서 저해효과를 나타내었다(표 2 참조). 또한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 처리한 군에서 처리농도에 따라 iNOS의 핵산 발현량(도 2a 참조) 및 단백질 발현량(도 2b 및 도 2c 참조)이 현저히 감소하였다.
본 발명자들은 워크리아 인시그니스 추출물이 염증성 질환 또는 천식에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 프로스타글란딘 E2 생성량, COX-2 발현량 변화를 측정하였다. 그 결과, LPS에 의해 유발된 염증에 대하여 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물이 농도의존적으로 프로스타글란딘 E2 생산량을 감소시키고, 특히 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물 40 ㎍/㎖을 처리한 군에서는 85.63 ± 0.69 %의 저해 효과를 나타내었다(표 3 참조). 또한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 처리한 군에서 처리농도에 따라 COX-2의 핵산 발현량(도 3a 참조) 및 단백질 발현량(도 3b 및 도 3c 참조)이 현저히 감소하였다.
본 발명자들은 워크리아 인시그니스 추출물의 신호전달 단백질의 발현 억제효과를 확인한 결과, 대식세포에 LPS와 본 발명의 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 동시에 처리한 경우 전체형태의 신호전달 단백질들의 발현은 동일한 반면, 인산화 형태의 단백질들은 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 농도의존적으로 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 4 참조)
본 발명자들은 워크리아 인시그니스 추출물이 염증성 질환 또는 천식에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 NF-κB 단백질의 핵으로 이동하는지 여부를 측정하였다. 그 결과, LPS만 처리한 세포에 비해 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 함께 처리한 세포에서 p65가 핵 내에서 적게 관찰됨을 확인하였다(도 5 참조).
본 발명자들은 워크리아 인시그니스 추출물이 염증성 질환 또는 천식에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 사이토카인 IL-6와 IL-1beta의 생성량 변화를 측정하였다. 그 결과, LPS를 처리한 군에서 IL-6와 IL-1beta의 양이 증가하였고, LPS에 의해 증가된 사이토카인의 양이 처리된 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 농도에 따라 감소함을 확인하였다(도 6 참조).
본 발명자들은 워크리아 인시그니스 추출물이 염증성 질환 또는 천식에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 TNF-α의 생성량 변화를 측정하였다. 그 결과 LPS를 처리한 군에서 TNF-α의 양이 증가하였고, LPS에 의해 증가된 TNF-α의 양이 처리된 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 농도에 따라 감소함을 확인하였다(도 7 참조).
본 발명자들은 카라기난(carrageenan) 유도 마우스 족부종에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 억제효과를 확인한 결과, 음성대조군은 카라기난에 의해 염증이 유도되어 발의 두께가 증가하였으나, 워크리아 인시그니스 추출물을 전처리한 군에서는 농도의존적으로 발의 두께가 감소함을 확인하였다(도 8 참조).
본 발명자들은 워크리아 인시그니스 추출물이 염증성 질환 또는 천식에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 비장세포에서 사이토카인 IL-4와 IL-13의 생성량 변화를 측정하였다. 그 결과, ConA에 의해 유도되는 사이토카인 IL-4와 IL-13의 양이 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 함께 처리한 군에서는 농도의존적으로 감소되었다(도 9 참조).
따라서, 본 발명의 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물 및 이의 분획물은 질소산화물의 생성 억제, 프로스타글란딘 생성 억제, MAPK 단백질의 인산화 저해, NF-κB의 핵으로의 이동 억제, 사이토카인 IL-6와 IL-1beta의 생성 억제, TNF-α의 생성 억제, 카라기난 유도 마우스 모델에서 족부종 억제 및 사이토카인 IL-4와 IL-13의 생성 억제 효과를 나타냄으로써 염증성 질환 또는 천식의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 조성물은 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한,본 발명은 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물은
1) 워크리아 인시그니스를 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하는 단계; 및
2) 단계 1)의 추출물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)에서는 워크리아 인시그니스는 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 알코올은 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하나, 메탄올을 이용하여 추출하는 것이 바람직하다. 추가적으로 유기물질은 100% 알코올에서 용출이 더 잘 되고 배당체는 알코올 수용액에서 용출이 더 잘 되므로 필요에 따라 알코올 또는 알코올 수용액으로 선택하여 사용할 수 있다. 상온에서 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 아울러 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 감압농축 및 건조과정은 당 업계에서 사용되는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물의 유기용매 분획물은
1) 워크리아 인시그니스 추출물의 물 현탁액을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 분획하는 단계 및
2) 단계 1)의 분획물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 워크리아 인시그니스 추출물은 상기 기재된 추출물 제조 방법에 따라 제조가 가능하나 이에 한정되지 않는다.
상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물 및 이의 분획물은 질소산화물의 생성 억제, 프로스타글란딘 생성 억제, MAPK 단백질의 인산화 저해, NF-κB의 핵으로의 이동 억제, 사이토카인 IL-6와 IL-1beta의 생성 억제, TNF-α의 생성 억제, 카라기난 유도 마우스 모델에서 족부종 억제 및 사이토카인 IL-4와 IL-13의 생성 억제 효과를 나타냄으로써 염증성 질환 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 분획물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물은 열수 및 에탄올을 이용하여 추출하는 것이 바람직하다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 염증성 질환 또는 천식에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 또는 천식 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 또는 천식 예방 방법을 제공한다.
상기 개체는 인간을 포함한 모든 동물이 가능하다.
상기 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 투여는 경구 투여, 또는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통한 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 투여 단위는, 개별 투여량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투여량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물 또는 이의 분획물의 제조
<1-1> 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 제조
자연건조된 워크리아 인시그니스 잎 0.6 kg을 100% 메탄올로 실온에서 24시간 간격으로 3회 추출하여 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물(이하 "워크리아 인시그니스 추출물"이라고 명명함) 29.5 g을 얻었다.
<1-2> 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 분획물의 제조
상기 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 물 1 L로 현탁시키고, 동량의 100% 헥산을 가하여 진탕 방치하기를 3회 실시하여 물층을 제거한 후 헥산추출물 8.27g을 얻었다. 헥산 추출물을 제거하고 남은 물층에 클로로포름 동량을 가하여 진탕 방치하기를 3회 반복하여 클로로포름 추출물 4.28g을 얻었으며, 다시 남은 물층에 에틸아세테이트를 동량 가하여 같은 방법으로 에틸아세테이트 추출물 1.44g을 얻었으며, 또다시 남은 물층에 부탄올을 동량 가하여 같은 방법으로 부탄올 추출물 3.31g을 얻었으며, 남은 물층을 농축하여 물 추출물 4.68g을 얻었다(도 1).
< 실험예 1> Raw264 .7 세포에서의 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물 및 이의 분획 물에 대한 세포독성실험
<1-1> 세포 배양
대식세포주 RAW264.7 세포(ATCC？ No. TIB-71)는 10% FBS(fetal bovine serum), 2 mM L-글루타민(glutamine), 100 units/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 습윤 배양기에서 배양하였다.
<1-2> 세포독성 측정
생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum) 5% 첨가한 DMEM(D㎕becco's Modified Eagle Medium, Gibco사) 배지에 1x105/㎖의 농도로 현탁하여 100 ㎕씩 96웰 플레이트(96 well plate)에 접종하여 부착하였다. 4시간 후에 추출물 및 이의 분획물을 농도별로 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 5 ㎎/㎖의 MTT용액을 웰당 10 ㎕씩 첨가한 후 4시간 더 배양을 하고, 배양이 끝난 후, 상등액을 제거하고, DMSO를 100 ㎕씩 첨가한 후 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포생존률은 DMSO를 0.1% 처리한 음성대조군를 100%로 하여 하기 수학식에 따라 계산하였다.
Figure pat00001
워크리아 인시그니스 시료 (㎍/㎖) 세포생존율 (%)
음성대조군 100.00 ± 1.53
메탄올 추출물 5 101.81 ± 0.10
메탄올 추출물 10 95.59 ± 0.35
메탄올 추출물 20 94.77 ± 0.21
메탄올 추출물 40 92.25 ± 0.36
헥산 분획물 5 99.33 ± 0.83
헥산 분획물 10 86.26 ± 4.13
헥산 분획물 20 86.12 ± 4.74
헥산 분획물 40 78.89 ± 0.76
클로로포름 분획물 5 95.19 ± 1.85
클로로포름 분획물 10 87.70 ± 0.56
클로로포름 분획물 20 92.54 ± 1.45
클로로포름 분획물 40 59.93 ± 0.44
에틸아세테이트 분획물 5 90.37 ± 1.44
에틸아세테이트 분획물 10 93.13 ± 2.23
에틸아세테이트 분획물 20 98.96 ± 3.07
에틸아세테이트 분획물 40 55.81 ± 3.74
부탄올 분획물 5 94.11 ± 0.75
부탄올 분획물 10 97.09 ± 5.50
부탄올 분획물 20 91.03 ± 2.62
부탄올 분획물 40 84.14 ± 1.29
물 분획물 5 93.14 ± 1.07
물 분획물 10 94.27 ± 0.31
물 분획물 20 98.82 ± 5.81
물 분획물 40 94.06 ± 0.62
표 1은 워크리아 인시그니스 추출물 및 이의 분획물에 대한 독성실험결과이며, 상기와 같이 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물과 부탄올 분획물은 40 ㎍/㎖ 농도까지 독성이 거의 없음을 확인하였다. 그러나, 클로로포름과 에틸아세테이트 분획물은 40 ㎍/㎖의 농도에서 급격히 세포독성이 증가하는 것을 확인하였다.
< 실험예 2> 질소산화물( NO )과 사이토카인 IL -6 생성에 관한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 저해 효과
<2-1> Raw264 . 7세포에서의 질소산화물( NO )과 사이토카인 IL -6 생성 저해 실험
Raw264.7 세포에 LPS를 처리하여 인위적으로 유발시킨 염증에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 유도성 질소산화물의 생성량을 측정하였다.
구체적으로 페놀레드(phenol-Red)가 들어있지 않은 DMEM(D㎕becco's Modified Eagle Medium, Gibco사) 배지에 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 5% 첨가하고, 세포를 1x105 세포를 현탁하여 96웰 플레이트(96 well plate)에 접종하였다. 4시간 동안 부착시킨 후, 시료를 0, 5, 10, 20 또는 40 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 1시간 동안 배양한 후에 1㎍/㎖의 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide, Sigma사)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상층액 100 μl를 회수하여 새로운 96웰 플레이트에 넣고, 그리스 시약(Griess reagent, Sigma사)을 동량 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 측정기(microplate reader, Bio-Rad사)로 540 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 소디움 나이트라이트(sodium nitrite)를 이용하여 검량선을 작성하고, 이를 기준으로 배양액 내의 질소산화물 생성량을 구하였으며, 리포폴리사카라이드를 처리한 군의 질소산화물 생성량을 100%로 하여 각 시료의 저해율을 퍼센트로 나타내었다. 또한, 리포폴리사카라이드를 처리한 Raw264.7 세포에서의 워크리아 인시그니스 추출물 및 이의 분획물의 사이토카인 생성 저해 효과를 확인하기 위하여, 리포폴리사카라이드로 유도된 IL-6의 생성량을 효소면역학적 분석키트(mouse IL-6 Enzyme Immunometric Assay Kit, Assay designs, USA)를 이용하여 측정하였다.
워크리아 인시그니스 시료 (㎍/㎖) NO 생성량 ( uM ) IL -6 생성량 ( pg /㎖) IL -6 Inhibition (%)
음성대조군 0.29 ± 0.07 -18.00 ± 1.57
LPS 21.55 ± 0.14 1341.63 ± 28.28
LPS + 메탄올 추출물 5 19.84 ± 0.12 1206.82 ± 62.85 10.05 ± 4.68
LPS + 메탄올 추출물 10 19.09 ± 0.24 954.96 ± 104.76 28.82 ± 7.81
LPS + 메탄올 추출물 20 16.85 ± 0.08 790.15 ± 26.71 41.11 ± 1.99
LPS + 메탄올 추출물 40 11.61 ± 0.20 194.59 ± 47.14 85.50 ± 3.51
LPS + 헥산 분획물 5 21.00 ± 0.19 1225.89 ± 66.26 8.63 ± 4.94
LPS + 헥산 분획물 10 21.24 ± 0.19 1181.63 ± 42.43 11.93 ± 3.16
LPS + 헥산 분획물 20 17.91 ± 0.86 908.48 ± 86.69 32.29 ± 6.46
LPS + 헥산 분획물 40 13.21 ± 0.85 149.96 ± 80.40 88.82 ± 5.99
LPS + 클로로포름 분획물 5 20.44 ± 0.76 1158.67 ± 17.81 13.64 ± 1.33
LPS + 클로로포름 분획물 10 18.26 ± 0.23 1083.67 ± 28.02 19.23 ± 2.09
LPS + 클로로포름 분획물 20 14.58 ± 1.06 736.07 ± 80.14 45.14 ± 5.97
LPS + 클로로포름 분획물 40 1.32 ± 0.03 7.74 ± 2.36 99.42 ± 0.18
LPS + 에틸아세테이트 분획물 5 20.79 ± 0.34 1228.11 ± 11.26 8.46 ± 0.84
LPS + 에틸아세테이트 분획물 10 18.65 ± 0.15 1159.59 ± 3.40 13.57 ± 0.25
LPS + 에틸아세테이트 분획물 20 12.74 ± 1.72 684.78 ± 57.35 48.96 ± 4.27
LPS + 에틸아세테이트 분획물 40 1.36 ± 0.15 -11.15 ± 2.36 100.83 ± 0.18
LPS + 부탄올 분획물 5 19.78 ± 1.09 1021.44 ± 23.83 23.87 ± 1.78
LPS + 부탄올 분획물 10 19.13 ± 0.44 910.52 ± 81.19 32.13 ± 6.05
LPS + 부탄올 분획물 20 14.77 ± 0.05 569.41 ± 74.90 57.56 ± 5.58
LPS + 부탄올 분획물 40 2.20 ± 0.02 67.93 ± 24.09 94.94 ± 1.80
LPS + 물 분획물 5 22.38 ± 0.23 1296.07 ± 33.52 3.40 ± 2.50
LPS + 물 분획물 10 21.83 ± 0.18 1276.63 ± 10.21 4.84 ± 0.76
LPS + 물 분획물 20 19.69 ± 1.42 1249.59 ± 97.69 6.86 ± 7.28
LPS + 물 분획물 40 21.80 ± 0.82 1312.19 ± 8.64 2.19 ± 0.64
표 2는 워크리아 인시그니스 추출물 및 이의 분획물의 질소산화물 생성 저해 효과와 사이토카인 생성 저해 효과를 나타내며, 상기와 같이 리포폴리사카이드를 처리한 군에 비해 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 처리한 군에서 농도의존적으로 질소산화물과 IL-6의 생산량이 감소하는 것을 확인하였고, 물 분획물을 제외하고는 모든 분획물에서 저해효과를 나타내었다(표 2). 따라서, 이후 실험은 시료를 획득하기 쉬운 메탄올 추출물로 실험을 실시하였다.
<2-2> iNOS 유전자의 발현 억제 실험 ( RT - PCR )
실험예 <2-1>의 방법으로 100 mm 페트리디쉬에 1× 106 개의 세포를 분주하고, 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 농도별로 처리하고, LPS로 염증을 유도시켜 24시간 배양 후, 배지를 제거한 다음에 세포를 배양용기로부터 떼어내어 리보핵산 추출 용액(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 세포를 균질화하였다. 5분 후에 세포를 모아서 원심분리관에 옮기고, 200 ㎕의 클로로포름을 넣고 15초간 완전히 섞어주고, 3분간 방치한 후, 14000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 리보핵산을 포함하는 상등액을 새로운 관에 옮겨 담고 아이소프로필알코올 500 ㎕와 혼합하였다. 10분 후 다시 원심분리를 하여 상등액은 버리고, 침천물에 75% 에탄올 1 ㎖을 넣고 10000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상등액은 버리고 침전된 리보핵산은 20분간 상온에서 건조시켰다. 건조된 리보핵산은 DEPC(Diethylpyrocarbonate, Sigma)가 처리된 증류수로 현탁하였다. 리보핵산은 정량 후, RT-PreMix (AccuPower RT PreMix, 바이오니아, 한국)를 이용하여 상보적 핵산(complementary DNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 템플릿(template)로 하고, iNOS 프라이머(primer)를 혼합하고, PCR Premix (AccuPower PCR PreMix, 바이오니아, 한국)를 사용하여 리보핵산의 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 2a에서 보는 바와 같이 음성대조군에 비해 리포폴리사카라이드를 처리한 양성대조군의 iNOS 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 처리한 군에서 처리농도에 따라 iNOS의 핵산 발현량이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다(도 2a).
<2-3> iNOS 단백질의 발현 억제 실험 ( Western blotting )
실험예 <2-1>의 방법으로 100 mm 페트리디쉬에 1× 106 개의 세포를 분주하고, 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 농도별로 처리하고, LPS로 염증을 유도시켜 24시간 배양 후, 배지를 제거한 다음에 세포를 배양용기로부터 떼어내어 단백질 분해효소 저해제(Protease inhibitor cocktail, Roche, USA)를 함유한 단백질 용출용액(CelLyticTM-MT Tissue Lysis Reagent, Sigma, USA)을 사용하여 균질화하였다. 추출액은 20분 동안 14000 rpm에서 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액을 5× SDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료에서 40 ㎍ 단백질을 SDS 4-12% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였고, 상기 단백질을 겔 한 장당 50 mA의 조건으로 1시간 동안 전기영동 하여 PVDF 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에서 단백질이 없는 부분을 탈지 분유로 차단(blocking)시킨 다음, 1차 항체[항-iNOS 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA)] 및 2차 항체(항토끼-IgG-HRP; Amersham Biosciences, UK)를 순차적으로 결합시킨 후, ECL 검출 키트(Amersham Biosciences, UK)로 발광반응을 유발하였고 X-ray 필름에 노출시켜 감광하였다. 단백질 밴드의 상대적인 밀도는 이미지 분석시스템을 이용하여 감광의 정도를 검출하고, Tina 2.0 소프트웨어 (//linux.softpedia.com/get/System/Operating-Systems/Linux-Distributions/ TINA-KNOPPIX-Live-CD-5172.sht㎖)를 이용하여 정량하였다.
그 결과, 도 2b에서 나타내는 바와 같이 대식세포에 LPS와 본 발명의 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 동시에 처리한 경우 농도의존적으로 iNOS의 단백질 발현이 감소하였다(도 2b).
<2-4> iNOS 단백질의 면역형광염색 실험 ( Immunofluoresence )
약 2×105/㎖ 세포를 퍼머녹스 챔버 플라스틱 슬라이드(Permanox chambered plastic slides; Nunc, USA)에서 배양한 후 상등액을 제거하였다. 이후 4℃에서 30분간 에탄올로 고정하였고, 인산 완충액(PBS)으로 세척한 후, 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 실온에서 30분간 차단하였다. 차단 후 1차 항체[항-iNOS 항체(1:100)]를 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 인산 완충액으로 3번 세척한 이후에 텍사스레드(Texas red; Santa Cruz Biotechnology, USA))가 연결된 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 실온의 암조건에서 2시간 동안 반응하였다. 인산완충액으로 프로롱 골드 안티페드 용액(ProLong Gold Antifade reagent, Invitrogen, USA)으로 3번 마운팅한 후 공초점 현미경(LSM510m Carl Zeiss, Germany)으로 촬영하였다.
그 결과, 도 2c에서 보는 바와 같이 LPS만 처리한 세포에 비해 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 함께 처리한 세포에서 iNOS의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 2c).
< 실험예 3> 프로스타글란딘 생성에 관한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 억제 효과
<3-1> Raw264 . 7세포에서의 프로스타글란딘 생성 저해 실험
워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2) 생성 저해 효과를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 실험예 <2-1>의 방법으로 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물과 리포폴리사카라이드를 처리한 Raw264.7 세포의 배양 상층액을 취하여 프로스타글란딘 측정 키트(PGE2 assay kit; R&D systems, Minneapolis, USA)를 사용하여 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2)의 생성 저해 효과를 측정하였다.
워크리아 인시그니스 시료 (㎍/㎖) PGE 2 생성량 ( pg /㎖)
음성대조군 13.70 ± 0.26
LPS 522.80 ± 25.24
LPS + 메탄올 추출물 5 405.15 ± 58.51
LPS + 메탄올 추출물 10 268.91 ± 38.83
LPS + 메탄올 추출물 20 145.69 ± 5.63
LPS + 메탄올 추출물 40 75.12 ± 3.63
표 3은 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 프로스타글란딘 E2 생성 저해 효과에 대한 것으로, 하기와 같이 처리한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 농도의존적으로 프로스타글란딘 E2의 생성량이 감소하였고, 40 ㎍/㎖에서는 85.63 ± 0.69 % 의 프로스타글란딘 E2 생성 저해율을 나타내었다(표 3).
<3-2> COX -2 유전자의 발현 억제 실험 ( RT - PCR )
워크리아 인시그니스 메탄올 추출물이 프로스타글란딘의 생성에 관여하는 사이크로옥시게네이즈(COX-2)의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다. 실험예 <2-2>와 동일한 방법으로 얻은 cDNA를 템플릿(template)으로 하고, COX-2 프라이머(primer)를 혼합하고, PCR Premix를 사용하여 리보핵산의 발현정도를 확인하였다.
그 결과, 도 3a에서 보는 바와 같이, LPS 처리군에서는 COX-2의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 처리한 군에서 처리농도에 따라 COX-2의 핵산 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 3a).
<3-3> COX -2 단백질의 발현 억제 실험 ( Western blotting )
실험예 <2-3>과 동일한 방법으로 얻은 단백질을 부착시킨 PVDF 막에 1차 항체로 항-COX-2 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 결합시킨후 실험예 <2-3>과 동일한 방법으로 감광하여 분석하였다.
그 결과, 도 3b에서 나타내는 바와 같이 대식세포에 LPS와 본 발병의 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 동시에 처리한 경우 농도의존적으로 COX-2의 단백질 발현이 감소하였다(도 3b).
<3-4> COX -2 단백질의 면역형광염색 ( Immunofluoresence )
실험예 <2-4>와 같은 방법으로 세포를 고정하고, 차단한 후, 1차 항체[항-Cox-2 항체(1;100)]를 결합시키고, 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 3c에서 보는 바와 같이 LPS만 처리한 세포에 비해 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 함께 처리한 세포에서 COX-2의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 3c).
<실험예 4> Raw264.7 세포에서 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 신호전달 단백질의 인산화 억제 효과
실험예 <2-3>의 방법으로 세포를 분주하고, 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 농도별로 처리하고, LPS로 염증을 유도시켜 15분 혹은 30분간 배양 후, 배지를 제거한 다음에 세포를 배양용기로부터 떼어내어 단백질 분해효소 저해제 및 인산화분해저해효소(phosphatase inhibitor, Roche, 독일)를 함유한 단백질 용출용액을 사용하여 균질화하였다. 추출액은 20분 동안 14000 rpm에서 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액의 단백질을 정량하여 시료당 20 ㎍의 단백질을 SDS 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동한 후, PVDF 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에서 단백질이 없는 부분을 탈지분유로 차단(blocking)시킨 다음, 1차 항체로 항-ERK, 항-p38 MAPK, 항-JNK, 항-IkBa(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA)의 전체형태의 항체를 부착하거나, 항-p38 MAPK과 항-JNK(1:1000, Enzo, Rarmingdale, NY) 또는 항-ERK, 항-IkBa(1:1000, Cell Signaling Technology, 미국)의 인산화형태의 항체를 부착한 후, 2차 항체를 순차적으로 결합시켰다.
그 결과, 도 4에서 나타내는 바와 같이 대식세포에 LPS와 본 발명의 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 동시에 처리한 경우 전체형태의 신호전달 단백질들의 발현은 동일한 반면, 인산화 형태의 단백질들은 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 농도의존적으로 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 4).
<실험예 5> 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 NF -κB 단백질 이동 저해 효과
실험예 <2-4>와 같은 방법으로 세포를 고정하고, 차단한 후, 1차 항체[항-p65 항체(1;100)]를 결합시키고, 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 LPS만 처리한 세포에 비해 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 함께 처리한 세포에서 p65가 핵 내에서 적게 관찰됨을 확인하였다(도 5).
< 실험예 6> Raw264 .7 세포에서 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 사이토카인 생성 저해 효과
리포폴리사카라이드를 처리한 Raw264.7 세포에서의 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 사이토카인 생성 저해 효과를 확인하기 위하여, 리포폴리사카라이드로 유도된 IL-6와 IL-1beta의 생성량을 효소면역학적 분석키트(mouse IL-6 Enzyme Immunometric Assay Kit와 mouse IL-1beta Enzyme Immunometric Assay Kit; Assay designs, USA)를 이용하여 측정하였다. 실험예 <2-1>과 같은 방법으로 처리된 세포배양액을 50 ㎕를 회수하여 마우스 면역글로불린이 코팅된 96 웰플레이트에 분주하여 2시간 동안 교반하며 반응시켰다. 그런 다음, 세척용액으로 4회 세척하고, 제 1차 항체인 항-IL-6 혹은 항-IL-1beta 항체를 50 ㎕씩 분주한 후 2시간 반응시켰다. 반응 후에 세척을 하고 제 2차 항체를 분주하고 30분간 반응시켰다. 다시 세척한 후 기질을 넣어 30분간 반응시킨 다음, 발색 정도를 마이크로플레이트 측정기로 450 ㎚에서 측정하였다.
그 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이 LPS를 처리한 군에서 IL-6와 IL-1beta의 양이 증가하였고, LPS에 의해 증가된 사이토카인의 양이 처리된 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 농도에 따라 감소함을 확인하였다(도 6).
< 실험예 7> Raw264 .7 세포에서 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 TNF -α 생성 저해 효과
리포폴리사카라이드를 처리한 Raw264.7 세포에서의 워크리아 인시그니스 추출물의 염증 저해 효과를 확인하기 위하여, 리포폴리사카라이드로 유도된 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α)의 생성량을 마우스 종양괴사인자를 효소면역학적 분석키트(mouse TNF-α Enzymen Immunometric Assay Kit; Assay designs, USA)를 이용하여 측정하였다. 실험예 <1-1>의 방법으로 Raw264.7세포를 배양한 후, 상층액 50 ㎕를 회수하여 마우스 면역글로불린이 코팅된 96 웰플레이트에 분주하여 2시간 동안 교반하며 반응시켰다. 그런 다음, 세척용액으로 4회 세척한 후, 제 1차 항체인 항-TNF-α 항체를 50 ㎕씩 분주한 후 2시간 반응시켰다. 반응 후에 세척을 하고 제 2차 항체를 분주하고 30분간 반응시켰다. 다시 세척한 후 기질을 넣어 30분간 반응시킨 다음, 발색 정도를 마이크로플레이트 측정기로 450 ㎚에서 측정하였다.
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 LPS를 처리한 군에서 TNF-α의 양이 증가하였고, LPS에 의해 증가된 TNF-α의 양이 처리된 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 농도에 따라 감소함을 확인하였다(도 7).
< 실험예 8> 카라기난 ( carrageenan ) 유도 마우스 족부종에 대한 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 억제효과
워크리아 인시그니스 추출물이 동물세포에 대해 염증저해효과가 우수하였기에 동물실험을 통해 염증저해 효과를 확인하였다.
구체적으로, 무게가 20-25g인 BALB/c 암컷 마우스(코아텍, 대한민국)를 3-4마리씩 무작위적으로 선정하여 각 그룹으로 나누었다. 워크리아 추출물은 인산완충액(PBS)에 초음파로 녹여서 40 혹은 80mg/kg의 농도로 투여하였으며, 음성대조군으로는 PBS를 투여하였으며, 양성대조군으로는 인도메타신(Indomethacin, Sigma, USA)을 5 mg/kg의 농도로 투여하였다. 30분 후에, 염증을 유도하기 위하여 PBS에 녹인 카라기난(1% v/v) 용액을 마우스의 왼발에 25 ul씩 주사하였다. 발의 두께는 카라기난을 주사하기 전에 캘리퍼(Digital caliper, Niigata Seiki, 일본)로 측정하였으며, 카라기난 주사하고 2시간 후에 다시 측정하여 염증유도정도를 계산하였다.
그 결과 도 8에서 나타낸바와 같이 음성대조군은 카라기난에 의해 염증이 유도되어 발의 두께가 0.66±0.05mm까지 증가하였으나, 워크리아 인시그니스 추출물을 전처리한 군에서는 농도의존적으로(40mg/kg; 0.43 ± 0.04, 80mg/kg; 0.32±0.06) 발의 두께가 감소함을 확인하였다(도 8).
< 실험예 9> 비장 세포에서 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물의 사이토카인 생성 저해효과
BALB/c 마우스(오리엔트, 대한민국)에서 비장을 무균적으로 떼어내어 10% 우태아혈청(FBS), 25mM HEPES, 2mM 글루타민(glutamine), 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍㎍/㎖)을 포함하고 있는 RPMI 1640 배지(GibcoBRL, USA)에서 갈아서 단일세포현탁액(single cell suspension)으로 만들었다. 준비된 비장 세포 현탁액은 실온에서 1500 rpm으로 10분간 원심 분리한 뒤 상층액을 버리고 적혈구 분해용액(Red blood cell lysis buffer) 1 ㎖을 넣고 37℃ 에서 10분간 분해시켰다. 이 용액에 10 ㎖ PBS를 더하여 섞은 후, 실온에서 1500 rpm으로 5분간 원심 분리한 뒤 상층액을 버리는 과정을 2회 반복하였다. 마지막에 PBS 대신 10% 우태아혈청(GIBCO BRL, USA)을 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하여 부유시켰다. 세포수를 1 × 106 세포/㎖로 맞춘 후, 세포부유액 200 ㎕를 96웰 플레이트에 각각 분주하였고, 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 농도별 (0, 5, 10, 20, 40 ㎍/㎖)로 첨가한 후, 습윤배양기에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 1시간 배양한 후, 세포에서 인터루킨-4(IL-4)와 인터루킨-13(IL-13)을 유도하기 위해 콘카나발린 A(Concanavalin A, Sigma, USA)를 1㎍/㎖농도로 첨가하였고, 습윤배양기에서 5% CO2, 37℃에서 3일간 배양하였다. 인터루킨-4와 13의 함량을 측정하기 위하여 각각의 사이토카인에 특정 반응하는 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, USA)를 사용하였으며, 제조사의 방법에 따라 각 사이토카인의 함량을 측정하였다. 대조군은 Con A를 처리하지 않았다.
그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이 ConA에 의해 유도되는 사이토카인 IL-4와 IL-13의 양이 워크리아 인시그니스 메탄올 추출물을 함께 처리한 군에서는 농도의존적으로 감소되었다(도 9).
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
< 제조예 1> : 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis)의 메탄올 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 메탄올 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 메탄올 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 메탄올 추출물 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 메탄올 추출물 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
< 제제예 2> : 식품의 제조
<2-1> 밀가루 식품의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis)의 열수 추출물을 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
<2-2> 스프 및 육즙( gravies )의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물을 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물을 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
<2-4> 유제품( dairy products )의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물을 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<2-5> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 워크리아 인시그니스의 물 추출물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 워크리아 인시그니스의 열수 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
실시예 <1-2>의 추출물(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
< 제제예 3> : 음료의 제조
<3-1> 건강음료의 제조
액상과당(0.5 %), 올리고당(2 %), 설탕(2 %), 식염(0.5 %), 물(75 %)과 같은 부재료와 본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
<3-2> 야채쥬스의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
<3-3> 과일쥬스의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖ 에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
< 제조예 4> 화장료 조성물의 제조
<4-1> 크림의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물 0.1 중량부
세토스테아릴알코올 2.8 중량부
밀난 2.6 중량부
스테아린산 1.4 중량부
친유형모노스테아린산글리세린 2 중량부
피이지-100 스테아레이트 1 중량부
세스퀴올레인산소르비탈 1.4 중량부
호호바오일 4 중량부
스쿠알란 3.8 중량부
폴리소르베이트 60 1.1 중량부
마카다이아오일 2 중량부
초산토코페롤 0.2 중량부
메칠폴리실록산 0.4 중량부
에칠파라벤 0.1 중량부
프로필파라벤 0.1 중량부
Euxyl K-400 0.1 중량부
1,3-부칠렌글리콜 7 중량부
메칠파라벤 0.05 중량부
글리세린 6 중량부
d-판데놀 0.2 중량부
트리에탄올아민 0.2 중량부
pt 41891 0.2 중량부
정제수 50.55 중량부
<4-2> 로션의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물 0.1 중량부
세토스테아릴알코올 1.6 중량부
스테아린산 1.4 중량부
친유형모노스테아린산글리세린 1.8 중량부
피이지-100 스테아레이트 2.6 중량부
세스퀴올레인산소르비탈 0.6 중량부
스쿠알렌 4.8 중량부
마카다이아오일 2 중량부
호호바오일 2 중량부
초산토코페롤 0.4 중량부
메칠폴리실록산 0.2 중량부
에칠파라벤 0.1 중량부
프로필파라벤 0.1 중량부
1,3-부칠렌글리콜 4 중량부
메칠파라벤 0.1 중량부
산탄검 0.1 중량부
글리세린 4 중량부
d-판데놀 0.15 중량부
알란토인 0.1 중량부
카르보내(2% aq. Sol) 4 중량부
트리에탄올아민 0.15 중량부
에탄올 3 중량부
pt 41891 0.1 중량부
정제수 51.7 중량부
< 제조예 5> 화장료 조성물 중 세정제의 제조
<5-1> 비누의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물 4.0 중량부
비누베이스 94.25 중량부
토코페롤 아세테이트 0.3 중량부
글리세린 0.2 중량부
PEG 4000(폴리에틸렌글리콜 4000) 0.8 중량부
호호바유 0.3 중량부
세탄올 0.15 중량부
상기 성분들을 혼합기에서 잘 혼합한 후 비누제조 기계에서 압출하고 일정한 크기로 절단 및 성형하여 비누 조성물을 제조하였다. 상기 비누 베이스는 당 업계에서 통상적으로 사용되고 있는 천연 유지인 팜유(palm oil)의 나트륨염이 사용될 수 있다.
<5-2> 바디 클렌저의 제조
본 발명의 워크리아 인시그니스의 열수 추출물 4.0 중량부
암모늄 라우릴 설페이트 42 중량부
코카미도프로필 베타인 12 중량부
글리콜 디스테어레이트 0.5 중량부
프로필렌 글리콜 1.0 중량부
색소 적당량
향료 적당량
구연산 적당량
드레인(50% 농축액) 1.0 중량부
정제수를 가하여 100 중량부로 한다.
암모늄 라우릴 설페이트, 코카미도프로필 베타인, 글리콜 디스테어레이트 및 프로필렌 글리콜를 70℃까지 가열하고 가열된 정제수를 넣어 유화시키면서 상기 나머지 성분들을 첨가하고 실온으로 냉각하여 바디 클렌저를 제조하였다.

Claims (12)

  1. 워크리아 인시그니스(Wercklea insignis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 알코올은 C1 내지 C2 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 워크리아 인시그니스 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 계통분획하여 얻은, 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 워크리아 인시그니스 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
  10. 워크리아 인시그니스 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 계통분획하여 얻은, 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 천식의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
  11. 워크리아 인시그니스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 개선용 화장료 조성물.




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