KR20120015294A - 벤다무스틴 환형다당류 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 벤다무스틴, (b) 하전된 환형다당류 및 (c) 상기 환형다당류와 반대의 전하를 갖는 안정화제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 예상치못한 바람직한 항암 활성을 가지며 혈장과 같은 반응성 환경에서 예상치못한 바람직한 안정도를 제공한다. 상기 조성물은 벤다무스틴을 치료를 필요로 하는 환자에 주사 또는 주입되기에 적합하다.

Description

벤다무스틴 환형다당류 조성물 {Bendamustine cyclopolysaccharide compositions}
본 발명은 (a) 벤다무스틴, (b) 하전된 환형다당류 및 (c) 안정화제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
벤다무스틴, 즉, 4-[5-[비스(2-클로로에틸)아미노]-1-메틸벤즈이미다졸-2-일]부탄산은 백혈병 및 일부 림프종의 치료에 사용된다. 그러나, 상기 화합물은 혈장에서 제한된 화학적 안정도를 갖고 있어, 치료적 효과를 얻기 위해서는 많은 투약량 또는 반복 투약을 필요로 한다. 따라서, 안정도를 증가시키는 상기 약물의 배합물이 필요하다.
벤다무스틴 분자를 중합체 물질과 착화시켜서 벤다무스틴의 안정도를 증가시키려는 시도가 있었다. 그러나, 상기 방법은 미미한 성공만을 이루었다. 따라서, 펜체바(Pencheva) 등의 문헌 "HPLC study on the stability of bendamustine hydrochloride immobilized onto polyphosphoesters; J. Pharma. Biomed. Anal; (2008)"은 벤다무스틴 화합물을 폴리포스포에스테르(polyphosphoester)와 착화시켜서 벤다무스틴의 안정도를 향상시키고자 하였다. 그러나, 상기 논문의 도 2에 따르면, 가장 안정한 착물도 pH 7에서 약 45분 후에 전체 로그 포인트(full log point) 만큼 감소한다.
유사하게, 에브젠(Evjen)의 문헌 "Development of Improved Bendamustin- Liposomes"; Masters Thesis; University of Tromso (2007)"은 벤다무스틴을 리포좀에 혼입시키기 위해서 이중의(dual) 비대칭 원심분리를 이용하였다. 표 18 (79면)에 따르면, 상기 배합물은 유리(free) 벤다무스틴에 비해 약간의 안정도를 증가시킬 뿐이었다 (세포 배양 배지에 분산될 때 유리 벤다무스틴의 14분 반감기 대비 20분 반감기).
따라서, 수용액, 특히 혈장에서 증가된 안정도를 제공하는 개선된 벤다무스틴 배합물이 필요하다.
본 발명은 (a) 벤다무스틴, (b) 하전된 환형다당류 및 (c) 안정화제를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 바람직하게 상기 안정화제는 상기 환형다당류와 반대 전하를 갖는다.
상기 조성물은 예상치못한 바람직한 항암 활성을 가지며 혈장과 같은 반응성 환경에서 예상치못한 바람직한 안정도를 제공한다. 상기 조성물은 벤다무스틴을 이용한 치료를 필요로 하는 환자에 주사 또는 주입되기에 적합하다.
본 발명은 (a) 벤다무스틴, (b) 하전된 환형다당류 및 (c) 상기 환형다당류와 반대 전하를 갖는 안정화제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 환형다당류에 대한 활성 성분의 비율은 중량 기준으로 약 1:12,500 내지 약 1:25이고, 보다 바람직하게는 약 1:5,000 내지 약 1:50이며, 더 더욱 바람직하게는 약 1:2,500 내지 약 1:75이고, 가장 바람직하게는 약 1:1,500 내지 1:100이다.
상기 안정화제는 전형적으로 환형다당류에 대하여 약 5:1 내지 약 1:1000, 바람직하게는 약 2:1 내지 약 1:200의 중량비로 존재한다.
환형다당류
본 발명의 실시에 사용될 수 있는 환형다당류는 사이클로덱스트린, 사이클로만닌(cyclomannins), 사이클로알트린(cycloaltrins), 사이클로프럭틴(cyclofructins) 등을 포함한다. 일반적으로, 6 내지 7개의 당 유닛(sugar unit)을 포함하는 환형다당류가 바람직하다.
사용가능한 바람직한 환형다당류 중에는 사이클로덱스트린이 있다.
사이클로덱스트린은 6개 이상의 당 유닛을 포함하는 환형 올리고-l-4-알파-D-글루코피라노오즈이다. 가장 널리 알려진 것은 6개, 7개 또는 8개 당 유닛을 함유하는 사이클로덱스트린이다. 6개 당 유닛을 함유하는 사이클로덱스트린은 알파-사이클로덱스트린으로 알려져 있고, 7개 당 유닛을 함유하는 것은 베타-사이클로덱스트린으로 알려져 있으며, 8개 당 유닛으로 이루어진 것은 감마-사이클로덱스트린으로 알려져 있다. 특히 바람직한 환형다당류는 베타-사이클로덱스트린이다.
사용되는 환형다당류는 하나 이상의 하전가능한 기(group)에 의해 변형된다. 이러한 하전가능한 기는 안정화제가 양이온일 때에는 음이온일 수 있거나, 또는 상기 하전된 기는 안정화제가 음이온일 때에는 양이온일 수 있다. 바람직한 음이온 기는 카복실, 설포닐 및 설페이트 기를 포함하는 반면, 바람직한 양이온 기는 4급 암모늄 기를 포함한다.
본원에서 사용되는 '하전된 환형다당류'란 용어는 하나 이상의 하이드록실 기가 하전가능한 잔기로 치환 또는 대체된 환형다당류를 지칭한다. 이러한 잔기는 그 자체가 하전가능한 기(예: 설포닐 기 등)일 수 있거나 또는 하나 이상의 하전가능한 잔기로 치환된 유기 잔기(예: C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알킬 에테르 잔기)를 포함할 수 있다. 바람직한 치환된 환형다당류는 설포부틸 에테르 베타-사이클로덱스트린, 2-하이드록시-N,N,N-트리메틸프로판암모늄으로 치환된 베타-사이클로덱스트린, 카복시메틸화-베타-사이클로덱스트린, O-포스페이트화-베타-사이클로덱스트린, 숙시닐-(2-하이드록시)프로필-베타-사이클로덱스트린, 설포프로필화-베타-사이클로덱스트린, 헵타키스(6-아미노-6-디옥시)베타-사이클로덱스트린, O-설페이트화-베타-사이클로덱스트린 및 6-모노디옥시-6-모노(3-하이드록시)-프로필아미노-b-사이클로덱스트린을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니며, 설포부틸 에테르 베타-사이클로덱스트린이 특히 바람직하다.
양이온성 안정화제
환형다당류가 음이온 기에 의해 변형된 양태에서, 상기 안정화제는 양이온성(cationinc agent) 제제 또는 다중양이온성(polycationic) 화합물로부터 선택된다. 사용될 수 있는 양이온성 제제는 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민 또는 4차 암모늄 화합물을 포함하며, 예컨대 N-알킬-N,N-다이메틸아민, N-알킬-N,N-다이에틸아민, N-알킬-N-N-다이에탄올로아민, N-알킬모폴린, N-알킬피페리딘, N-알킬피롤리딘, N- 알킬-N,N,N-트리메틸암모늄, N,N-다이알킬-N,N-다이메틸암모늄, N-알킬-N-벤질-N,N-다이메틸암모늄, N-알킬-피리디늄, N-알킬-피콜리늄, 알킬아미도메틸피리디늄, 카브알콕시피리디늄, N-알킬퀴놀리늄, N-알킬이소퀴놀리늄, N,N-알킬메틸피롤리디늄 및 l-알킬-2,3-다이메틸이미다졸륨을 포함한다. 특히 바람직한 양이온성 보조제(adjuvant)는 N-알킬-N-N-다이이소프로필아민, N-알킬모폴린, N-알킬피페리딘 및 N-알킬피롤리딘과 같은 입체 장애 3차 아민; 및 세틸피리디늄 클로라이드, 벤질다이메틸도데실암모늄 클로라이드, 도데실피리디늄 클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드, 벤질다이메틸테트라데실암모늄 클로라이드, 옥타데실다이메틸벤질암모늄 클로라이드 및 도미펜(domiphen) 브로마이드와 같은 4차 암모늄 화합물을 포함한다.
올리고- 또는 폴리아민, 또는 페길화(pegylated) 올리고- 또는 폴리아민과 같은 다중양이온성 화합물이 안정화제로 또한 사용될 수 있다. 바람직한 다중양이온성 화합물은 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidin), 푸트레신(putrescine) 및 카다베린(cadaverine)과 같은 올리고아민; 폴리에틸렌이민, 폴르스페르민, 폴리푸트레신 및 폴리카다베린과 같은 폴리아민; 및 전술한 기의 페길화 올리고아민 및 폴리아민을 포함한다. PI2080, PEG 8000와 결합된 폴리에틸렌이민 2000이 특히 바람직하다.
양이온성 안정화제의 하나의 바람직한 종류는 아미노산 약 5 내지 약 50개, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 약 20개를 포함하는 폴리펩타이드이고, 여기에서 상기 아미노산의 약 50% 이상이 양전하를 함유한다. 가장 바람직하게,상기 하전된 아미노산은 아르기닌이다. 상기 펩타이드 종류의 특히 바람직한 구성원은 4개 아르기닌의 하나 이상의 블록 시퀀스(block sequence)를 포함하는 아르기닌-풍부한 펩타이드이다. 상기 펩타이드 종류의 또 다른 특히 바람직한 구성원은 서몰리신(thermolysin)에 의해 가수분해된 프로타민(protamine)이다(이하, 저분자량 프로타민 또는 'LMWP'로 지칭됨).
소수성으로 변형된 올리고- 또는 폴리아민이 또한 사용될 수 있다. 이러한 종류의 바람직한 안정화제는 아세틸 스페르민, 아세틸 폴리스페르민, 아세틸 폴리에틸렌이민, 부티릴 스페르민, 부티릴 폴리스페르민, 부티릴 폴리에틸렌이민, 라우로일 스페르민, 라우로일 폴리스페르민, 라우로일 폴리에틸렌이민, 스테아로일 스페르민, 스테아로일 폴리스페르민 및 스테아로일 폴리에틸렌이민을 포함한다.
또한, 양이온성 다당류 및 합성 다중양이온성 중합체가 사용될 수도 있다. 이러한 양이온성 다당류의 예는 키토산, 탈아세틸화 키토산, 4급화 셀룰로오즈, 4급화 아밀로오즈, 4급화 아밀로펙틴, 4급화 부분 가수분해된 셀룰로오즈, 4급화 부분 가수분해된 아밀로오즈 및 4급화 부분 가수분해된 아밀로펙틴이다. 이러한 합성 다중양이온성 중합체의 예는 폴리콰터늄(Polyquaternium) 2 (폴리[비스(2-클로로에틸] 에테르-알트-1,3-비스[3-다이메틸아미노)프로필]-우레아 4급화); 폴리콰터늄 11 (폴리(l-비닐피롤리돈-코-다이메틸암모니오에틸 메타크릴레이트) 4급화); 폴리콰터늄 16 및 44 (비닐피롤리돈 및 4급화 비닐이미다졸의 공중합체); 및 폴리콰터늄 46 (비닐카프로락탐, 비닐피롤리돈 및 4급화 비닐이미다졸의 공중합체)이다.
음이온성 안정화제
환형다당류가 양이온성 기에 의해 변형된 양태에서, 안정화제는 음이온성 제제 또는 다중음이온성 중합체로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 음이온성 제제는 카복시-, 설페이트-, 설포노-, 포스페이트- 또는 포스포노-기를 포함하는 화합물로부터 선택된다.
사용될 수 있는 음이온성 제제의 한 종류는 소듐 3-[(3-콜아미도프로필)다이메틸암모니오]-1-프로판설포네이트, 소듐 N-라우로일사르코시네이트, 소듐 도데실 설페이트, 소듐 도데실벤질설포네이트 등과 같은 음이온성 계면활성제이다.
양이온성 다당류가 또한 안정화제로 사용될 수도 있다. 이러한 화합물의 예는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 데르마탄 설페이트(dermatan sulphate), 캅파-카르기난(kappa-carrageenan), 이오타-카르기난(iota-carrageenan), 라므다-카르기난(lambda-carrageenan), 뮤-카르기난(mu-carrageenan), 자이-카르기난(xi-carrageenan), 프사이-카르기난(psi-carrageenan), 타우-카르기난(tau-carrageenan), 퍼셀라란(furcellaran), 헤파란 설페이트(heparan sulphate), 케라틴(keratin), 푸코이단(fucoidan), 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산(alginic acid), 폴리(설포닐부틸로)셀룰로오즈, 폴리(설포닐프로필로)셀룰로오즈, 폴리(설포닐프로필로)덱스트란, 폴리(설포닐부틸로)덱스트란, 폴리(설포닐부틸로)아밀라아제 및 폴리(설포닐프로필로)아밀라아제이다.
안정화제는 또한 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 및 이들의 공중합체로부터 선택된 다중음이온성 중합체일 수 있다.
부형제( Excipients )
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 당, 폴리알코올, 가용성 중합체, 염 및 지질을 추가로 포함할 수 있다.
사용될 수 있는 당 및 폴리알코올은 락토오즈, 수크로오즈, 만니톨 및 솔비톨을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
사용가능한 가용성 중합체의 예는 폴리옥시에틸렌, 폴록사머, 폴리비닐피롤리돈 및 덱스트란이다.
유용한 염은 염화나트륨, 염화마그네슘 및 염화칼슘을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
사용가능한 지질은 지방산, 글리세롤 지방산 에스테르, 당지질 및 인지질을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
제조
본 발명의 조성물은 고형 벤다무스틴을 환형다당류 수용액에 용해시킴으로써 또는 환형다당류 수용액을 벤다무스틴 수성 원액과 혼합시킴으로써 제조될 수 있다. 그 결과 수득되는 혼합물을 격렬하게 혼합하고, 선택적으로는, 초음파를 가하여서 균질한 평형 수용액을 수득한다. 환형다당류가 사이클로덱스트린일 때, 조성물 제조에 사용되는 사이클로덱스트린 수용액은 사이클로덱스트린 4% 이상을 함유하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게 상기 용액은 사이클로덱스트린 10% 이상을 함유한다.
안정화제 및 부형제(존재하는 경우)는 바람직하게는 환형다당류와 벤다무스틴의 예비-제조된 균질한 평형 수용액에 첨가함으로써 조성물에 도입된다. 이러한 제제는 순수 물질로 또는 수용액으로 첨가될 수 있으며, 바람직하게 적당한 교반 하에 혼합된다.
바람직하게, 최종 조성물은 주사용으로 사용하기 전에 여과된다.
상기 조성물은 선택적으로는 동결 건조되어서, 사용 전에 주사 매질(injection media)에서 용해되기에 적합한 고형 물질로 생산될 수 있다. 안정화제로서 아민을 포함하는 조성물은 안정화제 첨가 이전에 동결 건조되고, 안정화제는 복원(reconstitution)된 후에 사용 직전에 상기 조성물에 도입되는 것이 바람직하다.
한 양태에서, 본 발명의 조성물은 구성성분을 혼합 및 배양하여서 제조된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 구성성분을 혼합하고 그 혼합물에 초음파 처리하여서 제조된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 구성성분을 혼합, 배양하고 생성물을 동결건조하여서 제조된다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 구성성분을 혼합하고 그 혼합물에 초음파 처리하고 생성물을 동결건조하여서 제조된다.
본 발명의 조성물은 시험관내 및 생체내 조건 둘다에서 혈장 내에 도입될 때에 수용액 중에서 증가된 안정도를 나타낸다. 따라서, 상기 배합물은 비-배합된 벤다무스틴보다 훨씬 큰 혈장내 반감기를 나타내며, 그 반감기는 50% 넘게, 바람직하게는 100% 넘게 커질 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 벤다무스틴 단독에 대비해서 뿐만 아니라 벤다무스틴과 환형다당류를 포함하는 조성물에 대비해서도 종양에 대해 예상치못한 향상된 안정도를 나타낸다.
실시예 1: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 콘드로이틴을 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 20 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 15분동안 초음파 세척기에서 20℃로 배양하고, 콘드로이틴 설페이트 25% 용액 1 mL와 혼합하였다.
실시예 2: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 폴리(설포닐부틸로)셀룰 로오즈를 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 30 % w/w 용액 1 ml에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 10℃로 예비 배양하였다. 그 후에, 상기 용액을 폴리(설포닐부틸로)셀룰로오즈 소듐 염 2% 용액 1 mL와 혼합하였다. 상기 샘플을 10℃에서 30분동안 초음파 세척기에서 배양하였다.
실시예 3: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 히알루론산을 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 30 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 10 ℃로 예비배양하였다. 그 후에, 상기 용액을 히알루론산 소듐 염 0.1% 용액 1 mL와 혼합하였다. 상기 샘플을 10 ℃에서 30분동안 초음파 세척기에서 배양하였다.
실시예 4: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 덱스트란을 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 20 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 20 ℃로 배양한 다음, 덱스트란 40 (MW 40000) 50% 용액 1 mL와 혼합하고, 15분 더 초음파 처리하였다.
실시예 5: 2- 하이드록시프로필 -β- 사이클로덱스트린 및 덱스트란을 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 20 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 20 ℃로 배양한 다음, 덱스트란 40 (MW 40000) 50% 용액 1 mL와 혼합하고, 15분 더 초음파 처리하였다.
실시예 6: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 4급화 셀룰로오즈를 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
4급화 셀룰로오즈 (하이드로클로라이드 염) 2 mg을 물 1 mL에 용해시켰다. (실온에서) 초음파 세척기에서 4시간 예비배양한 후에, 상기 용액을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 20 % w/w 용액 1 mL 중 벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg의 용액과 혼합하였다. 상기 용액을 잘 혼합하고 초음파 세척기에서 15분동안 배양하였다.
실시예 7: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 30 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 20℃로 배양한 후에 PVP (MW=IOOOO) 20% 용액 1 mL와 혼합하고, 20분동안 초음파 처리하였다.
실시예 8: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 세틸피리디늄 클로라이드를 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg 및 만니톨 8.5 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 50 % w/w 용액 0.8 g에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 20 ℃로 배양한 후에 세틸피리디늄 클로라이드 2.5% 용액 0.2 mL와 혼합하였다.
실시예 9: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 PI2080 을 포함한 벤다무 스틴 조성물의 제조
PI2080 의 제조
폴리에틸렌이민 (PEI, MW 2000)을 알드리츠(Aldrich)에서 구입하였다. 폴리(에틸렌 글리콜) 모노메틸 에테르(PEG, MW 8500)를 폴리머 소스이즈 잉크.(Polymer Sources Inc.)에서 구입하였다.
PEG와 PEI의 컨쥬게이트(conjugate)인 PI2080는 비노그라도프 에스.브이.(Vinogradov S. V.)의 문헌 'Bioconjugate Chem. 1998, 9, 805-812'에 기재된 절차에 따라 제조하였다. PEG 4g을 무수 아세토니트릴 20 mL 중 1,1'-카보닐다이이미다졸과 반응시켰다. 반응 생성물을 스펙트라포(SpectraPor) 3 멤브레인, MWCO 3500을 이용하여 물에 대해 2회 투석하고, 동결 건조하였다. 동결 건조된 물질을 메탄올 32 mL에 용해시키고, PEI 2.9 g과 혼합하고, 25 ℃에서 24시간동안 배양하였다. 생성물을 스펙트라포 3 멤브레인 MWCO 3500을 이용하여 물에 대해 2회 투석하고, 생성물 PI2080을 동결건조하였다.
소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 PI2080 을 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 2.5 mg 및 만니톨 4.3 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 50 % w/w 용액 0.8 g에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 20℃로 배양한 후에 PI2080 5% 용액 0.2 mL와 함께 혼합하였다.
실시예 10: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 프로타민 설페이트를 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 2.5 mg 및 만니톨 4.3 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 50 % w/w 용액 0.800 g에 용해시켰다. 상기 용액을 90분동안 20℃에서 진탕시킨 후에 초음파 세척기에서 30분동안 배양하였다. 이어서, 상기 혼합물을 물 0.163 g 중 프로타민 설페이트 30 mg의 현탁액으로 옮기고, 15분동안 격렬하게 혼합하였다.
실시예 11: 래트에 투약된 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 세틸피리 디늄 클로라이드를 포함한 조성물 중 벤다무스틴의 약동학
시험 조성물:
대조군: 6 mg/mL 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중 10.2 mg/mL 만니톨; 20 mg/kg 투약
본 발명의 조성물: 5 mg/g 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 40% w/w 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린, 0.5% 세틸피리디늄 클로라이드, 8.5 mg/g 만니톨 수용액 (실시예 8의 절차에 따라 생산); 20 mg/kg 투약
동물:
암컷 스프라그-둘리 래트(Sprague-Dawley rats) (250 - 350 g). 상기 동물을 조명 하에(12시간 명/암 사이클, 06h00에 조명을 켬) 22℃ ± 1℃의 제어 온도에서 공기 필터 커버가 있는 케이지에 3마리씩 놓았다. 동물과 관련된 모든 조작은 멸균 청정공기후드(sterilized laminar hood)에서 실시하였다. 동물이 자유롭게 퓨리나(Purina) 마우스 사료 및 물을 섭취하도록 하였다. 동물을 하룻밤동안 단식시키고, 마취시킨 후에 투약하였다.
투약 및 샘플링:
본 발명의 벤다무스틴 조성물 및 대조군을 래트 꼬리정맥에 정맥내 투여하였다. 주사한지 5, 15, 30, 45분, 1, 1.5, 2 및 3시간 후에 혈액 샘플을 채혈하였다. 아이소플루레인(isoflurane)을 전신 흡입시켜서 래트를 마취시켰다. 헤파린처리된 시험관으로 경정맥에서 혈액 샘플을 채혈하고, 얼음 위에 보관하였다. 즉시, 혈액을 원심분리하고, 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플을 즉시 추출하였다.
샘플 추출 및 분석:
혈장 샘플 0.100 mL을 플라스틱 시험관으로 옮겼다. 30초동안 격렬하게 진탕하면서 아세토니트릴 중 100 mM HCl 0.400 mL로 샘플을 추출하였다. 상기 샘플을 5분동안 10000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 분리하였다. 샘플을 드라이아이스에서 동결시키고, HPLC 분석때까지 -80 ℃에서 보관하였다. 20 ㎕ 분액을 분석용 HPLC에 주입하였다.
HPLC 조건:
C18 역상 컬럼 50 x 4.6 mm, 대칭/쉴드(Shield) 3.5 ㎛
컬럼 온도 30 ℃
유속 1.5 mL/분
주입 부피 20 ㎕
형광 검출 파장: 여기 327 nm, 방출 420 nm
이동상: 완충액 A: 5% 아세토니트릴 0.1% TFA
완충액 B: 90% 아세토니트릴 0.1% TFA
수행 시간: 10 분
대조군 대비 시험 조성물의 벤다무스틴 약동학 향상이 하기 표 1에 나타나 있다:
주사후 시간 대비 래트 혈장중 벤다무스틴의 농도
시간(hr) 대조군 (ng/mL) 본 발명의 조성물 (ng/mL)
평균값(SEM) 평균값(SEM)
0.08 12304 (2498) 16721 (1981)
0.25 7625 (536) 10713 (1458)
0.5 3046 (260) 4855 (874)
0.75 966 (192) 2165 (101)
1 414 (143) 1108 (104)
1.5 133 (80) 418 (57)
2 54 (34) 197 (25)
3 9 (6) 57 (24)
SEM - 평균값의 표준오차
상기 데이터는 혈장중 벤다무스틴의 안정도가 본 발명의 조성물에서 크게 증가하였음을 보여준다.
실시예 12: 래트에 투약된 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 PI2080 을 포함한 조성물 중 벤다무스틴의 약동학
시험 조성물:
대조군: 2.5 mg/mL 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중 4.25 mg/mL 만니톨; 10 mg/kg 투약
본 발명의 조성물: 2.5 mg/g 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 40% w/w 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린, 1% PI2080, 4.3 mg/g 만니톨 수용액(실시예 8의 절차에 따라 생산); 20 mg/kg 투약
동물:
암컷 스프라그-둘리 래트 (250 - 350 g). 상기 동물을 조명 하에(12시간 명/암 사이클, 06h00에 조명을 켬) 22℃ ± 1℃의 제어 온도에서 공기 필터 커버가 있는 케이지에 3마리씩 놓았다. 동물과 관련된 모든 조작은 멸균 청정공기후드에서 실시하였다. 동물이 자유롭게 퓨리나 마우스 사료 및 물을 섭취하도록 하였다. 동물을 하룻밤동안 단식시키고, 마취시킨 후에 투약하였다.
투약 및 샘플링:
본 발명의 벤다무스틴 조성물 및 대조군을 래트 꼬리정맥에 정맥내 투여하였다. 주사한지 5, 15, 30, 45분, 1, 1.5, 2 및 3시간 후에 혈액 샘플을 채혈하였다. 아이소플루레인을 전신 흡입시켜서 래트를 마취시켰다. 헤파린처리된 시험관으로 경정맥에서 혈액 샘플을 채혈하고, 얼음 위에 보관하였다. 즉시, 혈액을 원심분리하고, 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플을 즉시 추출하였다.
샘플 추출 및 분석:
혈장 샘플 0.100 mL을 플라스틱 시험관으로 옮겼다. 30초동안 격렬하게 진탕하면서 샘플을 아세토니트릴 중 100 mM HCl 0.400 mL로 추출하였다. 상기 샘플을 5분동안 10000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 분리하였다. 샘플을 드라이아이스에서 동결시키고, HPLC 분석때까지 -80 ℃에서 보관하였다. 20 ㎕ 분액을 분석용 HPLC에 주입하였다.
HPLC 조건:
C18 역상 컬럼 50 x 4.6 mm, 대칭/쉴드 3.5 ㎛
컬럼 온도 30 ℃
유속 1.5 mL/분
주입 부피 20 ㎕
형광 검출 파장: 여기 327 nm, 방출 420 nm
이동상: 완충액 A: 5% 아세토니트릴 0.1% TFA
완충액 B: 90% 아세토니트릴 0.1% TFA
수행 시간: 10 분
대조군 대비 본 발명 시험 조성물의 벤다무스틴 약동학 향상이 하기 표 2에 나타나 있다:
주사후 시간 대비 래트 혈장중 벤다무스틴의 농도
시간(hr) 대조군 (ng/mL) 본 발명의 조성물 (ng/mL)
평균값(SEM) 평균값(SEM)
0.08 6045 (388) 6124 (508)
0.25 2428 (250) 2814 (392)
0.5 520 (105) 1234 (92)
0.75 145 (35) 549 (95)
1 48 (11) 314 (118)
1.5 8 (1) 188 (97)
2 2 (1) 118 (60)
3 0 (1) 48 (23)
SEM - 평균값의 표준오차
상기 데이터는 혈장중 벤다무스틴의 안정도가 본 발명의 조성물에서 크게 증가하였음을 보여준다.
실시예 13: 래트에 투약된 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 프로타민 설페이트를 이용한 조성물 중 벤다무스틴의 약동학
시험 조성물:
대조군: 2.5 mg/mL 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 0.9% NaCl 중 4.25 mg/mL 만니톨; 10 mg/kg 투약
본 발명의 조성물: 2.5 mg/mL 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 40% w/w 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린, 3% 프로타민 설페이트, 4.3 mg/g 만니톨 수용액 (실시예 10의 절차에 따라 생산됨); 10 mg/kg 투약.
동물:
암컷 스프라그-둘리 래트 (250 - 350 g). 상기 동물을 조명 하에(12시간 명/암 사이클, 06h00에 조명을 켬) 22℃ ± 1℃의 제어 온도에서 공기 필터 커버가 있는 케이지에 3마리씩 놓았다. 동물과 관련된 모든 조작은 멸균 청정공기후드에서 실시하였다. 동물이 자유롭게 퓨리나 마우스 사료 및 물을 섭취하도록 하였다. 동물을 하룻밤동안 단식시키고, 마취시킨 후에 투약하였다.
투약 및 샘플링:
벤다무스틴 조성물 및 대조군을 래트 꼬리정맥에 정맥내 투여하였다. 주사한지 5, 15, 30, 45분, 1, 1.5, 2 및 3시간 후에 혈액 샘플을 채혈하였다. 아이소플루레인을 전신 흡입시켜서 래트를 마취시켰다. 헤파린처리된 시험관으로 경정맥에서 혈액 샘플을 채혈하고, 얼음 위에 보관하였다. 즉시, 혈액을 원심분리하고, 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플을 즉시 추출하였다.
샘플 추출 및 분석:
혈장 샘플 0.100 mL을 플라스틱 시험관으로 옮겼다. 30초동안 격렬하게 진탕하면서 샘플을 아세토니트릴 중 100 mM HCl 0.400 mL로 추출하였다. 상기 샘플을 5분동안 10000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 분리하였다. 샘플을 드라이아이스에서 동결시키고, HPLC 분석때까지 -80 ℃에서 보관하였다. 20 ㎕ 분액을 분석용 HPLC에 주입하였다.
HPLC 조건:
C18 역상 컬럼 50 x 4.6 mm, 대칭/쉴드 3.5 ㎛
컬럼 온도 30 ℃
유속 1.5 mL/분
주입 부피 20 ㎕
형광 검출 파장: 여기 327 nm, 방출 420 nm
이동상: 완충액 A: 5% 아세토니트릴 0.1% TFA
완충액 B: 90% 아세토니트릴 0.1% TFA
수행 시간: 10 분
대조군 대비 시험 조성물의 벤다무스틴 약동학의 향상은 하기 표 3에 나타난 바와 같다:
주사후 시간 대비 래트 혈장중 벤다무스틴의 농도
시간(hr) 대조군 (ng/mL) 본 발명의 조성물 (ng/mL)
평균값(SEM) 평균값(SEM)
0.08 6045 (388) 3853 (787)
0.25 2428 (250) 2416 (716)
0.5 520 (105) 1100 (313)
0.75 145 (35) 595 (154)
1 48 (11) 415 (140)
1.5 8 (1) 139 (20)
2 2 (1) 126 (36)
3 0 (1) 47 (18)
4 19(9)
SEM - 평균값의 표준오차
상기 데이터는 벤다무스틴 단독과 비교할 때 환형다당류 조성물의 안정도가 크게 증가하였음을 보여준다.
실시예 14: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 루비콰트 ( Luviquat ) FC370을 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린의 30 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 10℃로 예비 배양한 다음, 루비콰트 FC370 0.1% 용액 1 mL와 혼합하였다.
루비콰트 FC370 (폴리콰터늄-16)은 비닐피롤리돈 및 4급화 비닐이미다졸(CAS No. 95144-24-4 (BASF))의 공중합체이다. 상기 샘플을 10 ℃에서 30분동안 초음파 세척기에서 배양하였다.
실시예 15: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 루비콰트 HOLD 를 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 30 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 20분동안 10℃로 예비 배양하고, 이어서 루비콰트 HOLD 0.15% 용액 1 mL와 혼합하였다. 루비콰트 HOLD (폴리콰터늄-46)은 1H-이미다졸륨, 1-에테닐헥사하이드로-2하제핀-2-온과의 1-에테닐-3-메틸-메틸 설페이트 중합체 및 1-에테닐-2-피롤리디논, CAS No. 174761-16-1(BASF)이다. 상기 샘플을 10℃에서 30분동안 초음파 세척기에서 배양하였다.
실시예 16: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 4급화 폴리( 비닐피롤리 돈-코-2- 다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트 )를 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린의 30 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 10℃로 예비 배양하였다. 그 후에, 상기 용액을 4급화 폴리(비닐피롤리돈-코-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트) 0.1% 용액 1 mL와 혼합하였다. 상기 샘플을 10℃로 30분동안 초음파 세척기에서 배양하였다.
실시예 17: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 4급화 폴리( 비닐피롤리 돈-코-2- 다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트 )를 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg를 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 30 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 10℃로 예비 배양하였다. 그 후에, 상기 용액을 4급화 폴리(비닐피롤리돈-코-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트) 0.1% 용액 1 mL와 혼합하였다. 상기 샘플을 10℃로 30분동안 초음파 세척기에서 배양하였다.
실시예 18: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 키토산을 포함한 벤다무스틴의 제조
저분자량 키토산 5 mg을 0.2M 염산 5 mL에 현탁시키고, 밤새 혼합하였다. 바이알 내용물을 0.45 um 유리섬유 필터를 통해 여과시키고 동결건조하였다. 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 30 % w/w 용액 2 mL을 상기 동결건조된 물질에 부가하였다. 혼합물을 24시간동안 24℃로 배양하고, 0.45 um 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 상기 용액 1 mL을 사용하여 벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 20분동안 10℃로 배양하였다.
실시예 19: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 4급화 폴리(비스(2- 클로 로에틸)에테르- 알트 -1,3- 비스 [3- 다이메틸아미노 )프로필]- 우레아를 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
벤다무스틴 하이드로클로라이드 6 mg을 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 30 % w/w 용액 1 mL에 용해시켰다. 상기 용액을 초음파 세척기에서 15분동안 10℃로 예비배양하였다. 그 후에, 상기 용액을 4급화 폴리(비스(2-클로로에틸)에테르-알트-1,3-비스[3-다이메틸아미노)프로필]-우레아 0.05% 용액 1 mL와 혼합하였다. 상기 샘플을 10℃에서 30분동안 초음파 세척기에서 배양하였다.
실시예 20
a. 저분자량 프로타민(LMWP)의 제조
프로타민 설페이트 2 g을 0.1 M 암모늄 아세테이트 완충액(pH 7) 70 mL에 용해시켜서 프로타민 설페이트 용액을 형성시켰다. 서몰리신 20 mg을 50 mM 트리스 완충액(pH 7.4) 10 mL에 용해시켜서 서몰리신 용액을 형성시켰다. 상기 서몰리신 용액을 프로타민 설페이트 용액에 부가한 후에, 1M 수성 염화칼슘 70 ㎕을 부가하였다. 상기 혼합물을 30분동안 실온에서 배양하였다. 0.7 M EDTA 용액 0.7 mL을 상기 혼합물에 부가하였다. 상기 혼합물을 동결건조하였다. 건조 물질을 0.2% 수성 아세트산에 1 mL당 100 mg로 재용해시키고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 상기 용액 5 mL을 RP-HPLC 컬럼 베이닥(Vaydac) 218TP152050, 5x25 cm에 주입하였다. 상기 샘플을 0.2% 아세트산을 포함하는 물중 에탄올 구배로 용출시켰다. 상기 생성물을 함유하는 분획물을 수거하고 동결 건조하였다.
b. 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트 (" SBECD ") 및 저분자량 프로타민( "LMWP")을 포함한 벤다무스틴 조성물의 제조
소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 400 mg을 물 0.600 mL와 혼합하고, 완전히 용해될 때까지 진탕시켰다. 벤다무스틴 하이드로클로라이드 16 mg 및 만니톨 27.3 mg을 상기 용액에 부가하고, 90분동안 진탕시켰다. LMWP 20 mg을 물 936.8 mg에 용해시키고, 벤다무스틴 용액과 혼합하였다. 생성물을 4 ℃로 보관하였다. 하기와 같이 분석용 RP-HPLC 크로마토그래피를 사용하여 생성물의 벤다무스틴 함량을 측정하였다. 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴-물 구배를 1.5 mL/분 유속으로 와터즈 시메트리쉴드(Waters SymmetryShield) RP-18 3.5㎛ 컬럼 (4.6 x 50 mm)을 이용하여 샘플 10㎕을 분리하였다. 260 nm에서 UV 흡수 검출에 의해 피크 검출을 실시하였다. 벤다무스틴의 피크 아래 면적을 이용하여 약물 안정도 속도를 3회 반복실험(in triplicate)으로 평가하였다. 24시간 후의 벤다무스틴 피크 아래 면적은 초기의 101.8% 이었다(표준 편차 2%).
실시예 21: 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 저분자량 프로타민을 포함한 동결건조된 벤다무스틴 조성물의 제조
실시예 20의 조성물을 동결건조하였다. 생성물은 무정형 백색 고형물이고 수용성이었다. 사용하기 전에 물 1.536 mL로 복원시켰다.
실시예 22: 벤다무스틴 조성물의 세포 독성
H460, RPMI8226 및 MDA-MB-231 세포를, 10% 소태아 혈청(FBS) 및 항생제를 함유한 적절한 배지에 보관하였다. 도말 24시간 후에, 벤다무스틴(BM), 0.1% 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린 (SBECD) 존재하의 BM 및 0.1% SBECD와 0.002-0.005% 저분자량 프로타민(LMWP) 존재하의 BM을 세포 배양물에 상이한 농도로 첨가하고, 세포를 3일동안 증식시켰다. WST-1 절차를 이용하여 약물 세포독성을 평가하였다.
벤다무스틴, SBECD에 배합된 벤다무스틴 및 SBECD/LMWP에 배합된 벤다무스틴의 IC50 값을 측정하였다. 표 4는 SBECD 또는 SBECD/LMWP에 약물을 배합하여 생성된 BM 역가(potency)가 증가하였음을 나타낸다. BM 세포독성 활성 변화의 척도로서, SBECD 또는 SBECD/LMWP 배합물중 BM의 IC50에 대한 BM IC50의 비를 계산하였다. 각 세포주에 대하여, 상기 비는 3 내지 12회의 독립적 실험에 대한 평균치를 나타낸다.
BM 역가의 증가 (BM IC50/배합물 IC50, 괄호 안은 표준 오차)
세포주
조성 H460 RPMI8226 MDA-MB-231
BM 1.0 1.0 1.0
BM + SBECD 1.2 (0.2) 1.6 (0.1) 1.6 (0.5)
BM + SBECD + LMWP 1.9 (0.3) 2.5 (0.4) 2.2 (0.1)
SBECD 배합물은 BM 역가를 증가시키는 한편, IC50을 감소시킨다. LMWP를 SBECD 배합물에 부가하면 BM IC50이 실질적으로 더욱 감소된다. 2개 세포주인 H460 및 RPMI8226에서, LMWP의 효과는 통계적으로 유의하여서 각각 p=0.036 및 0.018이었다. MDA-MB-231 세포에서 2개 배합물의 효과는 유의하게 다르지는 않았다. 이들 3개 세포주의 경우에, BM의 IC50의 평균 감소치는 SBECD 및 SBECD/LMWP 각각에 대하여 1.5배 및 2.2배이었다.
실시예 23: 배지에 의해 예비배양된 벤다무스틴 조성물의 세포독성
BM 및 SBECD/LMWP 배합물 (20% SBECD, 1% LMWP중 40 mg/ml BM)을 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 0, 1 또는 4시간동안 배양한 후에, RPMI8226 세포에 다양한 농도로 부가하였다. BM 처리 동안에, SBECD 및 LMWP의 농도를 배양 배지에서 각각 0.1% 및 0.05%로 일정하게 유지시켰다. 이어서, 세포를 72시간동안 증식시켰다. WST-1 절차를 이용하여 약물 세포독성을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 5 및 6에 제시하였다.
0, 1 또는 4시간동안 세포 배양 배지에서 예비 배양된, 벤다무스틴 처리된 RPMI8226 세포의 세포 증식
벤다무스틴(uM) BM 0 h BM 1 h BM 4 h
세포 증식율(%)
1 100 100 100
15 83 100 100
31 70 100 100
62 46 106 104
125 11 20 105
250 -23 -45 75
500 -87 -85 8
1000 -98 -102 -99
0, 1 또는 4시간동안 세포 배양 배지에서 예비 배양된, 벤다무스틴의 SBECD/LMWP 배합물로 처리된 RPMI8226 세포의 세포 증식
벤다무스틴(uM) BM/SBECD/LMWP
0 h		 BM/SBECD/LMWP
1 h		 BM/SBECD/LMWP
4 h
세포 증식율(%)
1 100 100 100
15 71 71 114
31 35 37 51
62 21 39 29
125 -14 -25 8
250 -99 -98 -104
500 -99 -98 -101
1000 -96 -98 -108
RPMI8226 세포에서 0, 1 또는 4시간동안 세포 배양 배지에서 예비배양된 벤다무스틴 및 BM/SBECD/LMWP 배합물의 IC50
예비 배양 시간(h) 벤다무스틴의 IC50 (uM)
BM BM/SBECD/LMWP
0 62 32
1 106 38
4 390 53
IC50, TGI 및 LC50 파라미터는 예비배양 각 시간에 대해 계산하였다.
Figure pct00001
상기에서, IC50 - 세포의 50% 증식 억제를 야기시키는 약물 농도, TGI - 세포의 전체 증식 억제를 야기시키는 약물 농도, LC50 - 세포의 50% 사멸을 야기시키는 약물 농도이다.
상기 결과는 BM, SBECD 및 LMWP가 BM 단독보다 더 큰 역가를 가짐을 나타낸다.
실시예 24: SBECD 및 LMWP 를 포함하는 벤다무스틴 조성물의 세포독성
RPMI8226, H69, MDA-MB-231 및 H460 세포를, 10% FBS 및 항생제를 함유한 적절한 배지에 보관하였다. 도말 24시간 후에, 벤다무스틴(BM), SBECD/LMWP에 배합된 벤다무스틴(20% SBECD, 1% LMWP중 40 mg/mL BM)을 세포 배양물에 상이한 농도로 첨가하고, 세포를 3일동안 증식시켰다. WST-1 절차를 이용하여 약물 세포독성을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
세포주 BM SBECD/LMWP
RPMI8226 117 61
H69 254 119
H460 601 228
MDA-MB-231 600 321
상기 데이터는 본 발명의 조성물이 보강된 세포독성을 가짐을 나타낸다.
실시예 25: 래트에 투약된 소듐 설포부틸 에테르 β- 사이클로덱스트린 및 저분자량 프로타민( LMWP)을 포함한 조성물 중 벤다무스틴의 약동학
하기 조성물을 시험을 위해 제조하였다.
대조군: 5 mg/mL 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 0.9% NaCl중 10.2 mg/mL 만니톨; 10 mg/kg 투약
조성물 25A
- 5 mg/mL 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 20% w/w 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린, 10.2 mg/g 만니톨 수용액; 10 mg/kg 투약.
조성물 25 B
- 5 mg/mL 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 20% w/w 소듐 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린, 1% LMWP, 10.2 mg/g 만니톨 수용액; 10 mg/kg 투약
동물:
암컷 스프라그-둘리 래트 (250 - 350 g). 상기 동물을 조명 하에(12시간 명/암 사이클, 06h00에 조명을 켬) 22℃ ± 1℃의 제어 온도에서 공기 필터 커버가 있는 케이지에 3마리씩 놓았다. 동물과 관련된 모든 조작은 멸균 청정공기후드에서 실시하였다. 동물이 자유롭게 퓨리나 마우스 사료 및 물을 섭취하도록 하였다. 동물을 하룻밤동안 단식시키고, 마취시킨 후에 투약하였다.
투약 및 샘플링:
벤다무스틴 조성물 및 대조군을 래트 꼬리정맥에 정맥내 투여하였다. 주사한지 5, 15, 30, 45분, 1, 1.5, 2 및 3시간 후에 혈액 샘플을 채혈하였다. 아이소플루레인을 전신 흡입시켜서 래트를 마취시켰다. 헤파린처리된 시험관으로 경정맥에서 혈액 샘플을 채혈하고, 얼음 위에 보관하였다. 즉시, 혈액을 원심분리하고, 혈장을 분리하였다. 혈장 샘플을 즉시 추출하였다.
샘플 추출 및 분석:
혈장 샘플 0.100 mL을 플라스틱 시험관으로 옮겼다. 30초동안 격렬하게 진탕하면서 샘플을 아세토니트릴 중 100 mM HCl 0.400 mL로 추출하였다. 상기 샘플을 5분동안 10000 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 분리하였다. 샘플을 드라이아이스에서 동결시키고, HPLC 분석때까지 -80 ℃에서 보관하였다. 20 ㎕ 분액을 분석용 HPLC에 주입하였다.
HPLC 조건:
C18 역상 컬럼 50 x 4.6 mm, 대칭/쉴드 3.5 ㎛
컬럼 온도 30 ℃
유속 1.5 mL/분
주입 부피 20 ㎕
형광 검출 파장: 여기 327 nm, 방출 420 nm
이동상: 완충액 A: 5% 아세토니트릴 0.1% TFA
완충액 B: 90% 아세토니트릴 0.1% TFA
수행 시간: 10 분
대조군 대비 시험 조성물의 벤다무스틴 약동학의 향상은 하기 표 9에 나타난 바와 같다:
주사후 시간 대비 래트 혈장중 벤다무스틴의 농도
시간 [hr] 대조군 [ng/mL] 조성물 25A [ng/mL] 조성물 25B [ng/mL]
평균값(SEM) 평균값(SEM) 평균값(SEM)
0.08 6045 (388) 5233 (143) 3629 (1286)
0.25 2428 (250) 1702 (217) 1915 (708)
0.5 520 (105) 307 (73) 852 (251)
0.75 145 (35) 72 (25) 468 (80)
1 47 (11) 36 (17) 317 (53)
1.5 8 (1) 16 (10) 160 (32)
2 2 (1) 5 (4) 93 (27)
3 0 (0) 0 (0) 47 (20)
4 12 (5)
SEM - 평균값의 표준오차
상기 실시예는 SBECD를 포함한 벤다무스틴 조성물중 LMWP 존재가 혈장중 BM의 반감기를 크게 증가시킴을 나타낸다.
실시예 26: 설치류( murine ) 실험 폐전이 모델에 대한 벤다무스틴 조성물의 효능
동물:
5 내지 6주령의 암컷 찰스 리버스(Charles Rivers) C57Bl/6 마우스를 찰스 리버 캐나다 잉크(Charles River Canada Inc.)에서 구입하였다. 상기 동물을 조명 하에(12시간 명/암 사이클, 06h00에 조명을 켬) 22℃ ± 1℃의 온도 제어 환경에서 공기 필터 커버가 있는 케이지에 5마리씩 놓았다. 동물과 관련된 모든 조작은 멸균 청정공기후드에서 실시하였다. 동물이 자유롭게 퓨리나 마우스 사료(Pro Lab PMH 4018, Agway 상표명, 미국 뉴욕 시라쿠스 소재) 및 물을 섭취하도록 하였다. 상기 동물 연구는 "실험 동물의 관리 및 이용 지침서(Guidelines for Care and Use of Experimental Animals)"에 따라 실시하였다.
종양 세포 배양:
루이스 폐암종(Lewis Lung carcinoma) 3LL 세포를 적절한 배양 배지에서 배양하였다. 상기 세포는 종양 주입 준비를 위해 로그함수적 증식 상에서 수거하였다.
종양 주입(Tumor Implantation):
루이스 폐암종 3LL 세포 (PBS 200ul 중 2.0 내지 5.0 x 105 세포)를 꼬리 정맥에 정맥내 주입하여서 실험 폐전이 종양 모델을 확립하였다.
처치:
종양 주입후 당일에 처치를 실시하였다. 상기 동물에 하기 투약 용액을 투약하였다.
대조군: (0.9%, NaCl)
조성물:
- 배합되지 않은 벤다무스틴 (BM), (50 mg/kg)
- 20% SBECD, 1% LMWP중 벤다무스틴 (50 mg/kg)
효능 평가:
폐 표면에 있는 전이 반점의 갯수를 세어서 전이 형성을 평가하였다. 통상적인 전이 검사는 연구 마지막에 모든 기관에 대해 실시하였다.
효능 평가의 결과를 하기 표 10에 제시하였다.
처치 폐 전이 갯수
(동물 마릿수)		 대조군 대비
전이 형성 억제율(%)		 비배합 BM 대비
전이 형성 억제율(%)
대조군 65.5±7.8 (8) 0 -
BM (50 mg/kg) 56.1±9.5 (9) 14.4 0
BM (50 mg/kg), 20% SBECD, 1% LMWP 37.0±8.1 (9) 43.5** 34.0*
** 통계적 유의, p<0.01
* 통계적 유의, p<0.05
상기 결과는 비배합 약물 대비 SBECD 및 LMWP를 포함하는 조성물의 효능이 통계적으로 유의하게 향상되었음을 나타낸다.
실시예 27: 누드 마우스( nude mouse )에서 인간 유방 암종 ( MDA - MB 231) 피하(s.c.) 고형 종양에 대한 벤다무스틴 조성물의 효능
동물:
5 내지 6주령의 balb /c 마우스를 찰스 리버 캐나다 잉크에서 구입하였다. 상기 동물을 조명 하에(12시간 명/암 사이클, 06h00에 조명을 켬) 22℃ ± 1℃의 온도 제어 환경에서 공기 필터 커버가 있는 케이지에 5마리씩 놓았다. 동물과 관련된 모든 조작은 멸균 청정공기후드에서 실시하였다. 동물이 자유롭게 퓨리나 마우스 사료(Pro Lab PMH 4018, Agway 상표명, 미국 뉴욕 시라쿠스 소재) 및 물을 섭취하도록 하였다. 상기 동물 연구는 "실험 동물의 관리 및 이용 지침서"에 따라 실시하였다.
종양 세포 배양:
인간 유방암 세포 MDA-MB 231을 적절한 배양 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 종양 주입 준비를 위해 로그함수적 증식 상에서 수거하였다.
종양 주입:
인간 종양 또는 골수종 세포(2.5 내지 5.0 x 106 세포)는 1 내지 2 cm 길이의 20-게이지 바늘을 사용하여 30% 매트리겔(Matrigel)을 함유하는 배지 0.200 mL로 balb /c nu/nu 마우스 옆구리 양쪽에 주입하였다.
처치:
종양 세포 주입 2 내지 3주 후에, 피하 고형 종양이 발현된 동물을 선별하여 종양 크기를 기준으로(직경 0.5 내지 0.8 cm) 여러 등질 그룹(homogeneous groups)(그룹 또는 투약량 당 n = 5 동물수)으로 나누었다. 처치는 다음날 실시하였다. 동물에게 하기 투약 용액을 투약하였다.
대조군: (0.9%, NaCl)
조성물:
- 비배합 벤다무스틴, (35 mg/kg)
- 40% SBECD, 1% 프로타민 설페이트 중 벤다무스틴 (35 mg/kg) (배합된 BM)
효능 평가:
피하 고형 종양 측정은 주사 첫째날 및 그 후 3 내지 4일 간격으로 실시하였다. 각 종양의 가장 큰 2개 수직 직경을 캘리퍼스(calipers)로 측정하고, 종양 크기는 하기 식을 이용하여 추정하였다:
TV = L x W /2
여기에서, TV: 종양 체적; L: 길이; W: 폭
동물의 체중도 또한 기록하였다. 그 결과를 하기 표 11에 제공하였다.
그룹
(동물 마릿수)		 제14일 체중(g) 제14일 종양 체적
(g)(종양 갯수)		 대조군 대비 억제율(%) (제14일) 비고
대조군
(0.9%, NaCl)
(5)		 19.9±0.35 (4) 1.80±0.19 (8) - 종양 전이로 인해 제11일에 5마리중 1마리 죽음, 종양 크기에 의한 프로토콜 한계 포인트로 인해 모든 동물을 제14일에 죽임
BM (35mg/kg)
(5)		 18.1±0.39 (5) 0.54±0.06 (10) 70.2%
BM (35mg/kg), 40% SBECD, 1% PS
(5)		 18.6±0.30 (2) 0.32±0.09 (4) 82.0% 처치 제4일에 5마리중 3마리 마우스 죽음
표 12는 종양 증식에 대한 BM 및 그 조성물의 효능을 나타낸다.
누드 마우스에서 인간 유방암종 MDA-MB 231 s.c. 고형 종양에서 처치후 종양 중량
시간[일] 비처리 대조군 [g] BM (35mg/kg) [g] BM (35mg/kg), 40% SBECD, 1% PS [g]
평균 (SEM) 평균 (SEM) 평균 (SEM)
0 0.277(0.031) 0.237(0.008) 0.247(0.012)
2 0.329(0.034) 0.250(0.028) 0.242(0.039)
4 0.436(0.052) 0.294(0.027) 0.151(0.045)
7 0.615(0.065) 0.313(0.030) 0.182(0.046)
9 0.838(0.095) 0.349(0.038) 0.216(0.046)
11 1.164(0.149) 0.417(0.046) 0.232(0.065)
14 1.803(0.185) 0.537(0.055) 0.324(0.092)
SEM - 평균값의 표준 오차
상기 결과는 SBECD 및 프로타민 설페이트를 포함하는 조성물의 예상치못한 독성결과 및 우수한 효능을 나타낸다.
실시예 28: 누드 마우스에서 인간 유방암종 MDA - MB 231 s.c. 고형 종양에 대한 벤 다무스틴 조성물의 효능
처치를 위해 하기 조성물을 이용하여 실시예 27에 기재된 바와 같이 실험을 실시하였다.
대조군: (0.9%, NaCl)
조성물:
- 비배합 벤다무스틴, (30 mg/kg)
- 40% SBECD 중 벤다무스틴 (30 mg/kg) (배합된 BM)
상기 처치는 제1, 2, 9 및 10일에 실시하였다.
그 결과를 하기 표 13에 제시하였다.
그룹
(동물 마릿수)		 처치 스케줄 종양 크기 측정으로 추정된 제19일 종양 중량(g)(종양 갯수) 제19일 부검에서 실제 종양 중량(g)(종양 갯수)
G1.대조군
(0.9%, NaCl)(5)		 제1,2,9,10일 1.70±0.15 (10) 0.855±0.105 (10)
G2.
BM (30mg/kg)(5)		 제1,2,9,10일 0.684±0.10 (10) 0.275±0.052 (10)
G3.
BM (30mg/kg), 40% SBECD (5)		 제1,2,9,10일 1.05±0.18 (10) 0.413±0.067 (10)
표 14는 종양 증식에 대한 BM 및 그 조성물의 효능을 나타낸다.
누드 마우스에서 인간 유방암종 MDA-MB 231 s.c. 고형 종양에서 처치후 종양 중량
시간[일] 비처리 대조군 [g] BM (30mg/kg) [g] BM (30mg/kg), 40% SBECD [g]
평균 (SEM) 평균 (SEM) 평균 (SEM)
0 0.252(0.020) 0.203(0.028) 0.200(0.024)
2 0.288(0.019) 0.238(0.023) 0.245(0.022)
5 0.384(0.029) 0.267(0.022) 0.300(0.027)
7 0.536(0.028) 0.313(0.028) 0.392(0.038)
9 0.693(0.044) 0.388(0.045) 0.522(0.060)
12 1.034(0.049) 0.497(0.060) 0.641(0.071)
14 1.174(0.065) 0.550(0.075) 0.756(0.090)
16 1.456(0.104) 0.594(0.084) 0.853(0.125)
19 1.704(0.145) 0.684(0.098) 1.051(0.176)
SEM - 평균값의 표준 오차
상기 데이터는 벤다무스틴과 하전된 사이클로덱스트린을 포함하는 2개 구성성분 시스템(반대로 하전된 안정화제를 포함하지 않음)이 벤다무스틴 단독에 비해 더 적음을 나타낸다.
실시예 29: 누드 마우스에서 인간 유방암종 MDA - MB 231 s.c. 고형 종양에 대한 벤 다무스틴 조성물의 효능
상기 실험은 처치를 위해 하기 조성물을 이용하여 실시예 28에 기재된 절차를 이용하여 실시하였다.
대조군: (0.9%, NaCl)
조성물:
- 비배합된 벤다무스틴, (30 mg/kg)
- 20% SBECD, 1% LMWP 중 벤다무스틴 (30 mg/kg) (배합된 BM)
처치는 제1, 2, 9 및 10일에 실시하였다.
그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.
그룹
(동물 마릿수)		 처치 스케줄 제16일에 종양 중량(g)
(종양 갯수)		 대조군 대비 억제율(%)
(제16일)
G1.대조군
(0.9%, NaCl)(6)		 제1,2,9,10일 0.789±0.056 (6) -
G2.
BM (30mg/kg)(6)		 제1,2,9,10일 0.487±0.067 (6) 38.3
G3.
BM (30mg/kg), 20% SBECD,1%LMWP (6)		 제1,2,9,10일 0.364±0.028 (6) 53.9
비고: 왼쪽 옆구리에 주입된 종양은 접종된 종양 세포 갯수가 보다 적기 때문에 우측 옆구리의 종양보다 훨씬 적었다. 이들 종양 체적은 상기 제시된 데이터에 포함되지 않았다.
상기 결과는 20% SBECD 및 1% LMWP를 함유한 벤다무스틴 조성물이 비배합된 약물보다 더 활성임을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 실시예 28에서 얻어진 결과를 감안할 때 예상되지 않은 것이다.
누드 마우스에서 인간 유방암종 MDA-MB 231 s. c.고형 종양의 처치 후의 종양 중량
시간[일] 비처리 대조군 [g] BM (30mg/kg) [g] BM (30mg/kg), 20% SBECD, 1% LMWP [g]
평균 (SEM) 평균 (SEM) 평균 (SEM)
0 0.161(0.007) 0.139(0.013) 0.140(0.018)
2 0.187(0.011) 0.178(0.027) 0.163(0.016)
4 0.233(0.024) 0.202(0.039) 0.167(0.016)
6 0.288(0.036) 0.259(0.049) 0.188(0.010)
8 0.344(0.027) 0.295(0.054) 0.216(0.014)
10 0.422(0.031) 0.319(0.044) 0.234(0.013)
12 0.508(0.041) 0.361(0.050) 0.258(0.012)
14 0.589(0.057) 0.417(0.054) 0.319(0.022)
16 0.789(0.056) 0.487(0.067) 0.364(0.028)
SEM - 평균값의 표준 오차
실시예 30: 인산염 완충액 중 설포부틸 베타 사이클로덱스트린 ( SBECD ) 및 저분자량 프로타민( LMWP)을 포함한 조성물에서 벤다무스틴 화학적 안정도
인산염 완충액 중 4% SBECD (w/w) (SBECD/PB)는 5 mM 인산염 완충액 중에 SBECD를 용해시키고 pH를 7.2로 조정하여서 제조하였다.
하기 조성물을 제조하고 시험하였다.
대조군: 벤다무스틴 하이드로클로라이드(BM)를 5 mM 인산염 완충액에 용해시켜서 제조된 0.6 mg/mL BM 수용액, pH 7.2.
조성물 30-1: BM을 SBECD/PB에 용해시켜서 제조된 4% SBECD중 0.6 mg/mL BM
조성물 30-2: BM을 SBECD/PB에 용해시키고 LMWP을 부가하여서 제조된 4% SBECD 및 0.2% LMWP중 0.6 mg/mL BM
조성물 30-3: BM을 SBECD/PB에 용해시키고 LMWP을 부가하여서 제조된 4% SBECD 및 1% LMWP중 0.6 mg/mL BM
조성물 30-4: LMWP을 SBECD/PB에 용해시키고 BM을 부가하여서 제조된 4% SBECD 및 0.2% LMWP중 0.6 mg/mL BM
조성물 30-5: LMWP을 SBECD/PB에 용해시키고 BM을 부가하여서 제조된 4% SBECD 및 0.2% LMWP중 0.6 mg/mL BM.
상기 조성물을 25℃에서 배양하고, 하기와 같이 HPLC에 의해 주기적으로 분석하였다. 샘플 10㎕을 와터즈 시메트리쉴드 RP-18 3.5㎛ 컬럼(4.6 x 50 mm)을 이용하여 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴-물 구배로 1.5 mL/min 유속으로 HPLC 상에서 분리하였다. UV 흡수 검출에 의해 260 nm에서 피크 검출을 실시하였다. 벤다무스틴 피크 면적을 이용하여 제1차 동태 모델(kinetics model)로 약물 분해 속도를 평가하였다. 분해 반감기(T1/2)로 표시된 결과를 하기 표 17에 제시하였다.
조성물 T1/2
대조군: 0.6 mg/mL BM 44분
조성물 30-1: 4% SBECD, 0.6 mg/mL BM 642분
조성물 30-2: 4% SBECD, 0.6 mg/mL BM, 0.2% LMWP 707분
조성물 30-3: 4% SBECD, 0.6 mg/mL BM, 1% LMWP 789분
조성물 30-4: 4% SBECD, 0.2% LMWP, 0.6 mg/mL BM 673분
조성물 30-5: 4% SBECD, 1% LMWP, 0.6 mg/mL BM 729분
상기 결과는 LMWP가 BM과 SBEC의 용액중에서 BM의 안정도를 증가시킴을 나타낸다. 상기 결과는 또한 LMWP 화합물이 BM 및 SBECD의 예비제조된 혼합물에 부가되는 경우에 LMWP의 안정화 효과가 더 커짐을 나타낸다 (각각, 조성물 30-3 vs. 30-5, 조성물 30-2 vs. 30-4).
실시예 31: 혈장중 벤다무스틴 화학적 안정도
헤파린처리된 인간 혈장 20㎕을 하기 벤다무스틴(BM) 조성물과 함께 혈장 780㎕에 스파이크(spike)하였다.
대조군: 벤다무스틴 하이드로클로라이드(BM)를 물에 용해시켜서 제조된 0.6 mg/mL 벤다무스틴 하이드로클로라이드 수용액.
조성물 31-A: 4%(w/w) SBECD 수용액에 BM을 용해시켜서 제조된 4% SBECD중 0.6 mg/mL BM
조성물 31-B: 8%(w/w) SBECD 수용액에 BM을 용해시켜서 제조된 8% SBECD중 0.6 mg/mL BM
조성물 31-C: 20%(w/w) SBECD 수용액에 BM을 용해시켜서 제조된 20% SBECD중 0.6 mg/mL BM
조성물 31-D: 40%(w/w) SBECD 수용액에 BM을 용해시켜서 제조된 40% SBECD중 0.6 mg/mL BM
조성물 31-1: 4%(w/w) SBECD 수용액에 BM을 용해시키고 PI2080을 부가하여서 제조된 4% SBECD 및 3% PI2080중 0.6 mg/mL BM
조성물 31-2: 8%(w/w) SBECD 수용액에 BM을 용해시키고 PI2080을 부가하여서 제조된 8% SBECD 및 3% PI2080중 0.6 mg/mL BM
조성물 31-3: 20%(w/w) SBECD 수용액에 BM을 용해시키고 PI2080을 부가하여서 제조된 20% SBECD 및 3% PI2080중 0.6 mg/mL BM
조성물 31-4: 40%(w/w) SBECD 수용액에 BM을 용해시키고 PI2080을 부가하여서 제조된 40% SBECD 및 3% PI2080중 0.6 mg/mL BM
스파이크 후에 혈장중 벤다무스틴 농도는 처음에는 0.015 mg/mL이었다. 스파이크된 혈장 샘플을 37℃에서 배양하였다. 샘플 50 ㎕을 스파이크된 혈장으로부터 주기적으로 수거하고, 아세토니트릴중 100 mM HCl 용액 200 ㎕로 옮기고, 혼합하고, 원심분리하였다. 상청액 50㎕을 95% 아세토니트릴로 20배 희석한 후에, 희석된 샘플 20 ㎕을 물(0.1% TFA)중 아세토니트릴(0.1% TFA) 구배를 이용하여 1.5 mL/분 유속으로 와터즈 시메트리쉴드 RP18 3.5 ㎛ 컬럼 (4.6 x 50 mm) 상에서 분리하였다. 327 nm 여기 및 420 nm 방출에서 형광 검출에 의해 피크 검출을 실시하였다. 벤다무스틴 피크 면적을 이용하여 제1차 동태 모델에서 약물 분해 속도를 평가하였다. 분해 반감기(T 1/2)로 표기된 결과를 하기 표 18에 제시하였다.
배합물 혈장중 T1/2
대조군: 0.6 mg/mL BM 123분
조성물 31-A: 0.6 mg/mL BM, 4% SBECD 134분
조성물 31-B: 0.6 mg/mL BM, 8% SBECD 137분
조성물 31-C: 0.6 mg/mL BM, 20% SBECD 174분
조성물 31-D: 0.6 mg/mL BM, 40% SBECD 242분
조성물 31-1: 0.6 mg/mL BM, 4% SBECD, 3% PI2080 182분
조성물 31-2: 0.6 mg/mL BM, 8% SBECD, 3% PI2080 251분
조성물 31-3: 0.6 mg/mL BM, 20% SBECD, 3% PI2080 297분
조성물 31-4: 0.6 mg/mL BM, 40% SBECD, 3% PI2080 302분
상기 결과는 PI2080이 혈장중 BM의 안정도를 증가시킴을 나타낸다.
본원에 기재된 실시예 및 대표적인 화합물은 예시를 목적으로 한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 전술한 발명의 상세한 설명으로부터, 본원에 기재된 발명에 다양한 변화 및 변형이 이루어져서 다양한 용도 및 상태로 채택될 수 있음이 명백하다. 이러한 실시양태는 하기 특허청구범위의 범주내에 있다.

Claims (15)

  1. (a) 벤다무스틴(bendamustine), (b) 하전된 환형다당류(charged cyclopolysaccharide) 및 (c) 상기 환형다당류와 반대 전하를 갖는 안정화제(stabilizing agent)를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 환형다당류가 베타-사이클로덱스트린인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하전된 환형다당류가 음이온성 기의 하전된 기(charged group)를 갖는 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 음이온성 기가 설페이트, 설포닐 및 카보닐 기로부터 선택되는 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 환형다당류가 설포부틸 에테르 베타-사이클로덱스트린인 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 안정화제가 약 5 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드이고, 상기 아미노산의 약 50% 이상이 양전하를 갖는 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 안정화제가 약 6 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드이고, 상기 아미노산의 약 50% 이상이 양전하를 갖는 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 4개 아르기닌으로 이루어진 하나 이상의 블록 시퀀스(block sequence)를 포함하는 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 안정화제가 폴리아르기닌인 조성물.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 안정화제가 저분자량 프로타민인 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 환형다당류 상의 하전된 기가 양이온성 기인 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 하전된 기가 4급 암모늄 기(quaternary ammonium group)인 조성물.
  13. (a) 벤다무스틴, (b) 하전된 환형다당류 및 (c) 상기 환형다당류와 반대 전하를 갖는 안정화제를 포함하고,
    상기 (b) 하전된 환형다당류 및 (c) 상기 환형다당류와 반대 전하를 갖는 안정화제의 조합물을 포함하지 않는 (a) 벤다무스틴보다 혈장중 반감기가 더 큰 것을 특징으로 하는
    벤다무스틴 배합물(bendamustine formulation).
  14. 제13항에 있어서,
    상기 배합물이 비배합된 벤다무스틴보다 혈장중 반감기가 50% 이상 큰 것을 특징으로 하는 배합물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 배합물이 비배합된 벤다무스틴보다 혈장중 반감기가 100% 이상 큰 것을 특징으로 하는 배합물.

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