KR20120007193A

KR20120007193A - 고해상도 ＨＬＡ 대립유전자 ＳＰＲＥＸ-ＤＮＡｃｈｉｐ 키트

Info

Publication number: KR20120007193A
Application number: KR1020100067811A
Authority: KR
Inventors: 김태규; 최희백
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2012-01-20
Also published as: KR101296582B1

Abstract

본 발명은 고해상도 HLA 대립유전자 SPREX-DNA chip 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SPREX (sequence specific primer refractory extension) 방법에 의한 DNA 칩을 이용하여 사람의 주 조직적합성항원 복합체인 HLA 대립유전자를 고해상도로 선별할 수 있다.

Description

고해상도 ＨＬＡ 대립유전자 ＳＰＲＥＸ-ＤＮＡｃｈｉｐ 키트{SPREX(Sequence Specific Primer Refractory Extension)-DNA chip kit for high resolution typing of HLA allele}

본 발명은 고해상도 HLA 대립유전자 SPREX-DNA chip 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SPREX(sequence specific primer refractory extension) 방법에 의한 DNA 칩을 이용하여 사람의 주 조직적합성항원 복합체인 HLA 대립유전자를 고해상도로 선별하기 위한 키트에 관한 것이다.

사람의 주 조직적합성항원 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC)의 일종인 인간의 백혈구 항원(Human Leukocyte Antigen, HLA)은 기본적으로 이식거부반응에 관여하는 세포표면항원으로서, 현대의학의 발달과 함께 난치성질환의 치료법으로서 이식술이 발달함에 따라 그 중요성과 정확한 검사에 대한 수요가 계속적으로 증가되고 있는 실정이다. MHC 유전자는 클래스 I, II, III 부위로 구분되고, 이중 클래스 I 부위에는 HLA-A, B, C 등의 유전자가 존재하고 MHC 클래스 II 부위에는 HLA-DR, DQ, DP유전자들이 존재한다. 클래스 I 유전자의 구조는 α체인과 β₂ 마이크로글로불린이 결합한 형태를 이루고 클래스 II 유전자의 구조는 α,β 체인이 이형이합체(heterodimer)를 형성하는 형태로 이루어져 있다. HLA 대립유전자의 염기서열이 밝혀지고, 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA 대립유전자의 선별이 가능해지면서, HLA 대립유전자의 다양성에 관한 연구는 더욱 급속도로 진행되어, 대립유전자의 수가 현재 클래스 I 유전자인 HLA-A, -B, -C에서 각각 893, 1431, 569종류로 존재함이 알려지게 되었고 클래스 II 유전자인 HLA-DRA1, -DRB1, -DQA1, -DQB1, -DPA1, -DPB1에서 각각 3, 722, 35, 106, 28, 136 종류로 존재함이 알려져 있다(2009. 10월 기준).

HLA 유전자에 대해서는 최근 수년간 DNA 검사법으로 진단하는 방법이 개발되고 있다. 이식거부반응에 있어 중요한 역할을 하는 HLA 클래스 I 항원들은 유핵세포에서 모두 발현 되지만 HLA 클래스 I 항원에 대한 항체가 모두 밝혀지지 않아 혈청학적인 검사의 오차율이 높은 편이다. 이러한 높은 오차율을 감소시키기 위하여 DNA 검사가 유력한 대안으로 대두되고 있으며, HLA 클래스 II 항원은 대식세포, B 세포 등의 면역제공세포(APC) 등에서만 제한적으로 발현하므로 혈청학적 검사의 부정확성 때문에 정확성이 높은 DNA 타이핑(typing)으로 전환할 필요성이 대두되어 현재 DNA 검사법을 이용한 몇 가지 제품이 상업적으로 판매되고 있는 실정이다.

현재 제품화된 HLA 유전자형 검사 키트는 나일론 멤브레인 PCR-SSO(sequence specific oligonucleoTide), 리버스 블롯(reverse bloT) PCR-SSO, PCR-SSP(sequence specific primer), PCR-올리고캡쳐 샌드위치 어세이(PCR-oligocapTure sandwich assay) 및 PCR-SBT(sequence based Typing), leuminex bead를 이용한 방법을 이용하여 개발된 것인데, 사용자가 여러 프라이머를 사용하여 각각을 중합연쇄반응으로 증폭하여야 하고, HLA 대립유전자 선별 시 사용되는 유전자 수가 제한되며, 교잡반응 시 여러 탐침의 길이와 특성이 달라 동일 온도상에서 특이적으로 교잡반응을 수행할 수 없어 고해상도 검사를 하는데 어려운 단점을 가지고 있다.

따라서, 많은 유전자들을 대상으로 하여 손쉽게 고해상도 HLA 대립유전자를 선별할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

본 발명의 목적은 한국인에서 발견되는 고해상도 HLA 대립유전자를 선별하기 위한 HLA 대립유전자 선별키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 선별키트를 이용하여 HLA 대립유전자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HLA 대립유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열목록 서열번호 1 내지 219에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탐침을 포함하는 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩을 제공한다.

본 발명은 또한 HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치가 3' 말단 부위에서 1 내지 2개의 염기 부위에 위치하도록 하여 22 내지 30개의 올리고뉴클레오타이드 탐침을 작제하는 단계를 포함하는 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한

본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩;

HLA 대립유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 238 내지 240에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안티센스 프라이머 및 서열번호 241 내지 247에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 센스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트;

중합연쇄반응에 의한 증폭산물을 단일가닥으로 분리하기 위한 람다 엑소뉴클레아제(lambda exonuclease);

분리된 단일가닥을 적정 길이로 절단하기 위한 탈인산화효소와 우라실 DNA 글리코실라제(uracil DNA glycosylase, UNG); 및

상기 DNA 칩과 결합된 증폭산물을 탐지할 수 있는 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드를 포함하는 HLA 대립유전자 선별키트를 제공한다.

본 발명은 또한

서열번호 238 내지 240에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안티센스 프라이머 및 서열번호 241 내지 247에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 센스 프라이머를 이용하여 시료에서 추출한 DNA를 대상으로 HLA 대립유전자 DNA를 증폭시키는 단계;

상기 증폭된 DNA를 단일가닥으로 분리하고, 적당한 길이로 절단하는 단계;

상기 절단된 DNA, 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드 및 중합효소를 본 발명의 DNA 칩에 첨가하여 교잡 및 중합반응 시키는 단계; 및

중합된 탐침의 형광 시그널을 분석하는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 선별방법을 제공한다.

본 발명은 HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 부위를 포함하도록 작제된 탐침을 이용하여 사람의 주 조직적합성항원 복합체의 일종인 HLA 대립유전자를 고해상도로 선별할 수 있다.

본 발명은 주 조직적합성항원 복합체를 유전자수준에서 구별할 수 있으므로, 보다 정확한 조직적합성 판단에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩에 있어서 HLA-A 대립유전자 탐침의 배열도를 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩에 있어서 HLA-B 대립유전자 탐침의 배열도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩에 있어서 HLA-DRB1 대립유전자 탐침의 배열도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩을 이용하여 HLA-A 대립유전자형을 검사한 결과를 나타내는 사진도이다.
도 5는 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩을 이용하여 HLA-B 대립유전자형을 검사한 결과를 나타내는 사진도이다.
도 6는 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩을 이용하여 HLA-DRB1대립유전자형을 검사한 결과를 나타내는 사진도이다.
도 7는 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩을 이용하여 HLA-A 유전자형을 판독하기 위한 표를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩을 이용하여 HLA-B 유전자형을 판독하기 위한 표를 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩을 이용하여 HLA-DRB1 유전자형을 판독하기 위한 표를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 HLA 대립유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열목록 서열번호 1 내지 219에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탐침을 포함하는 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩에 관한 것이다.

본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩은 HLA 대립유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 포함하되, 상기 탐침은 HLA 대립유전자와 특이적으로 결합하고, 특히 HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치를 3' 말단 부위에 포함하는 22 내지 30 mer 길이의 올리고뉴클레오티드로서, HLA 대립유전자를 고해상도로 선별할 수 있는 특징이 있다.

본 명세서에서 "HLA 대립유전자를 고해상도로 선별할 수 있는"이란 HLA 대립유전자의 하위 분류군의 아형, 예를 들어, HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-B*0702, HLA-DRB1*0101 등으로 선별할 수 있다는 의미이고, "저해상도로 선별하는"는 HLA 대립유전자의 하위 분류군, 예를 들어, HLA-A*01, HLA-A*02, HLA-B*07, HLA-DRB1*01 등으로 선별할 수 있다는 의미로써, 고해상도 선별은 보다 구체화된 선별이라 할 것이다.

또한, 본 명세서에서 "SPREX (sequence specific primer refractory extension)"이란 피검 시료의 DNA로부터 증폭된 특정 유전자의 DNA를 단일사슬로 가공한 후 특정 유전자의 다양성을 나타내는 부위를 포함하는 탐침을 이용하여 보합 및 중합시켜 형광표지된 ddNTP로 중합된 탐침의 형광 시그널을 분석함으로써 특정 유전자를 타이핑(typing)하는 방법을 의미한다. 상기 SPREX가 특정 유전자의 다양성을 나타내는 부위(염기)를 포함하는 탐침을 이용하고, APEX(arrayed primer extension)가 특정 유전자의 다양성을 나타내는 부위를 포함하지 않는 탐침을 사용한다는 점에서 구별된다.

본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩을 이용하여 검출할 수 있는 HLA 대립유전자는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-DRB1일 수 있다.

상기 탐침은 구체적으로

서열번호 1 내지 55에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-A 선별용 탐침;

서열번호 56 내지 149에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-B 선별용 탐침; 및

서열번호 150 내지 219에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-DRB1 선별용 탐침으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩은 상기 탐침의 결합 여부를 비교하기 위한 양성 또는 음성 대조용 탐침을 더 포함할 수 있다.

상기 양성 또는 음성 대조용 탐침으로 서열번호 220 내지 237에 기재된 서열을 하나 이상 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 양성 또는 음성 대조용 탐침은

서열번호 220 내지 223에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-A 양성 대조용 탐침 및 서열번호 224의 음성 대조용 탐침;

서열번호 225 내지 228에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-B 양성 대조용 탐침 및 서열번호 229의 음성 대조용 탐침; 및

서열번호 230 내지 233에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-DRB1 양성 대조용 탐침 및 서열번호 234 내지 237에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음성 대조용 탐침으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치가 3' 말단 부위에서 1 내지 2개의 염기 부위에 위치하도록 하여 22 내지 30개의 올리고뉴클레오타이드 탐침을 작제하는 단계를 포함하는 본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩의 제조방법에 관한 것이다.

상기 탐침은 5' 말단에 18개의 티민(dTTP), 6개의 CH₂ 사슬 및 아민(amine)기를 더 포함하도록 작제될 수 있다.

본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩은 상기 작제된 DNA 탐침을 알데히드가 결합된 고체의 표면에 시프염기반응을 통해 결합시키며, 상기 DNA 탐침이 결합된 고체표면에 아민과 결합하지 않고 남아있는 알데히드를 환원시켜서 제조할 수 있다.

상기 고체는 유리일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 알데히드의 환원은 NaBH₄ 등의 환원제를 사용하여 실시할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한

본 발명의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩;

상기 DNA 칩과 결합된 증폭산물을 탐지할 수 있는 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드를 포함하는 HLA 대립유전자 선별키트에 관한 것이다.

상기 프라이머 세트는 HLA-A, -B, 또는 -DRB1의 엑손 부위를 증폭할 수 있도록 작제된 특이 서열로서, 보다 구체적으로, HLA-A, B의 엑손 2 및 3 부위, HLA-DRB1의 엑손 2 부위를 증폭할 수 있다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 238 내지 240에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안티센스 프라이머 및 서열번호 241 내지 247에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 센스 프라이머를 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, HLA-A에 대한 안티센스 프라이머는 서열번호 238, HLA-B는 서열번호 239, 또는 HLA-DRB1은 서열번호 240의 서열을 사용할 수 있다.

또한, HLA-A에 대한 센스 프라이머는 서열번호 241, HLA-B는 서열번호 242, 또는 HLA-DRB1은 서열번호 243 내지 247에 기재된 서열 중 하나 이상의 서열을 사용할 수 있다.

또한, 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드는 텍사스 레드(Texas Red) ddATP, 시아닌 3(Cyanine 3) ddCTP, 시아닌5(Cyanine 5) ddGTP 및 플루오레세인-12(fluorescein-12) ddUTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질로 표지될 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명은 또한

중합된 탐침의 형광 시그널을 분석하는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 선별방법에 관한 것이다.

본 발명의 HLA 대립유전자의 선별방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

제1단계는 시료 DNA의 증폭단계이다.

본 발명의 HLA-A 유전자 선별 키트의 프라이머를 이용하여 검사할 시료로부터 채취한 DNA를 증폭시킨다.

상기 프라이머는 각 HLA 유전자부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 프라이머는

HLA-A에 대한 서열번호 238에 기재된 안티센스 프라이머 및 서열번호 241에 기재된 센스 프라이머;

HLA-B에 대한 서열번호 239에 기재된 안티센스 프라이머 및 서열번호 242에 기재된 센스 프라이머; 또는

HLA-DRB1에 대한 서열번호 240에 기재된 안티센스 프라이머 및 서열번호 243 내지 247에 기재된 서열 중 하나 이상의 센스 프라이머 세트를 사용할 수 있다.

상기 프라이머를 사용하여 증폭할 수 있는 HLA 대립유전자 부위는 HLA-A, B의 엑손 2 및 3 부위, HLA-DRB1의 엑손 2 부위일 수 있다.

제2단계는 증폭된 DNA를 가공하는 단계이다.

증폭된 DNA를 단일가닥으로 분리하고, 분리된 단일가닥을 적당한 길이로 자르도록 가공시킨다.

이때, 단일가닥으로 분리하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 효소를 이용하는 방법을 사용하는 것이 좋다. 보다 구체적으로, 람다 엑소누클레아제(lamda exonuclease)를 처리하여 단일가닥으로 분리시키는 것이 좋다.

또한, 분리된 단일가닥이 너무 긴 경우에는 이후의 DNA 칩과의 보합 반응 시 오류를 발생시킬 확률이 증가하므로, 이를 방지하기 위하여, 분리된 단일가닥을 적당한 길이로 절단하는 것이 좋다.

단일가닥을 절단하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 효소를 이용하여 절단하는 것이 좋다. 보다 구체적으로, 분리된 단일사슬에 탈이산화효소(shrimp alkaline phosphatase)를 처리하여 잔여 dNTP를 탈인산화시키고, 우라실 DNA 글리코실라제(Uracil DNA Glycosylase, UNG)를 처리하여 300 내지 500bp 길이의 단일사슬로 절단할 수 있다.

제3단계는 가공된 DNA 단일사슬의 DNA 칩을 이용한 보합 및 중합반응 단계이다.

상기 가공된 DNA, 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드 및 중합효소를 HLA 대립유전자 특이 탐침이 함유된 DNA 칩에 첨가하여 보합 및 중합반응 시킨다.

상기 보합 및 중합반응은 60℃에서 30 분간 실시할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

또한, 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드로 중합된 탐침의 형광 시그널의 분석도를 높이기 위해 미반응 DNA를 상기 DNA 칩에서 제거하기 위한 세척 및 건조 단계를 추가로 실시할 수 있다.

상기 미반응 DNA는 NaOH 수용액, 3차 증류수를 DNA 칩에 순차적으로 가하여 제거할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

미반응 DNA가 제거된 DNA 칩은 건조시켜 분석에 사용할 수 있다.

제4단계는 중합된 탐침의 형광 시그널을 분석하는 단계이다.

반응 종료된 DNA 칩에 대해 스캐너를 이용하여 667nm 파장 범위에서 스캔하여 DNA 칩의 중합반응이 수행된 탐침 부위를 검사한다.

탐지된 시그널을 이용하여 HLA-A, -B, 또는 -DRB1 대립유전자 분석 프로그램인 "innofinder" 등을 이용하여 분석한다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> DNA 칩의 제조

(탐침의 작제)

HLA-A 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치를 3' 부위에서 1~2염기 부위에 위치하게 하여 22 내지 30mer의 염기서열을 가지는 단일 염기사슬을 작제하고, 작제된 단일 염기사슬의 5' 말단에 18개의 티민(dTTP), 6개의 CH₂ 사슬 및 아민(amine)기를 포함하도록 탐침을 작제하였다. 상기 탐침의 염기서열은 다음과 같다:

1) HLA-A 선별용 탐침: 탐침 1 내지 55

탐침 1 : 5'-TCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAAG (서열번호 1)

탐침 2 : 5'-GAGGGGCCGGAGTATTGGGACGGGG (서열번호 2)

탐침 3 : 5'-GGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCGG (서열번호 3)

탐침 4 : 5'-GCTCTCACTCCATGAGGTATTTCTT (서열번호 4)

탐침 5 : 5'-CAGA(C/T)CACC(A/C)AGC(A/G)CAAGTGGGAGA (서열번호 5)

탐침 6 : 5'-CCACTCCATGAGGTATTTCTACACC (서열번호 6)

탐침 7 : 5'-AGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTG (서열번호 7)

탐침 8 : 5'-GTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTG (서열번호 8)

탐침 9 : 5'-GTTCTCACACC(G/C)TCCAGA(G/T)GATGTT (서열번호 9)

탐침 10 : 5'-GTTCTCACACC(G/C)TCCAGA(G/T)GATGTA (서열번호 10)

탐침 11 : 5'-TATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGG (서열번호 11)

탐침 12 : 5'-GGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGAGT (서열번호 12)

탐침 13 : 5'-GGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGG (서열번호 13)

탐침 14 : 5'-AGCAGTTGAGAGCCTACCTGGATGG (서열번호 14)

탐침 15 : 5'-AGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGCAG (서열번호 15)

탐침 16 : 5'-GGAGACACGGAATGTGAAGGCCCAG (서열번호 16)

탐침 17 : 5'-TCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGA (서열번호 17)

탐침 18 : 5'-TCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGC (서열번호 18)

탐침 19 : 5'-CGAGAGAACCTGCGGATCGCGCTCCG (서열번호 19)

탐침 20 : 5'-CGAACCTGGGGACCCTGCGCGGCTA (서열번호 20)

탐침 21 : 5'-CCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCG (서열번호 21)

탐침 22 : 5'-ACCTGGAGGGCACGTGCGTGGACGGG (서열번호 22)

탐침 23 : 5'-GCCACTGCTCGCCCCCAGGCTCCCAA (서열번호 23)

탐침 24 : 5'-ACTGCTCGCCCCCAGGCTCCCAC (서열번호 24)

탐침 25 : 5'-CCGGAGTATTGGGACGAGGAGACAGGG (서열번호 25)

탐침 26 : 5'-AGCGGAGAGCCTACCTGGAGGGCCGG (서열번호 26)

탐침 27 : 5'-CCCACTCACAGACTGACCGAGAGAG (서열번호 27)

탐침 28 : 5'-GGCCCACTCACAGACTGACCGAGCG (서열번호 28)

탐침 29 : 5'-CGCTTCCTCCGCGGGTACC(A/G)GCAGG (서열번호 29)

탐침 30 : 5'-CGCTTCCTCCGCGGGTACCAGCAGA (서열번호 30)

탐침 31 : 5'-AATGTGAAGGCCCACTCACAGACTC (서열번호 31)

탐침 32 : 5'-AGGCCCACTCACAGACTGACCGAGAG (서열번호 32)

탐침 33 : 5'-GGCGCTTCCTCCGCGGGTACCAGCGGG (서열번호 33)

탐침 34 : 5'-CGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACG (서열번호 34)

탐침 35 : 5'-CGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAG (서열번호 35)

탐침 36 : 5'-GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCAC (서열번호 36)

탐침 37 : 5'-GAGGGGCCGGAGTATTGGGACCTGC (서열번호 37)

탐침 38 : 5'-ATCCGTGTCCCGGCCCGGCAGTGGAG (서열번호 38)

탐침 39 : 5'-AGCACAAGTGGGAGGCGGCCCGTTGGG (서열번호 39)

탐침 40 : 5'-AGCACAAGTGGGAGGCGGCCCGTCGGG (서열번호 40)

탐침 41 : 5'-AGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTGG (서열번호 41)

탐침 42 : 5'-GGAATGTGAAGGCCCACTCACAGAT (서열번호 42)

탐침 43 : 5'-CTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAG (서열번호 43)

탐침 44 : 5'-CCTGGAGGGCACGTGCGTGGACGGG (서열번호 44)

탐침 45 : 5'-GGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTTG (서열번호 45)

탐침 46 : 5'-GGGGCCGGAGTATTGGGACCGGAAC (서열번호 46)

탐침 47 : 5'-CCTCCGCGGGTACCAGC(A/G)G(G/A)ACGCT (서열번호 47)

탐침 48 : 5'-AGCGGAGAGTCTACCTGGAGGGCACG (서열번호 48)

탐침 49 : 5'-ACATGGCAGCTCAGACCACCAAGCA (서열번호 49)

탐침 50 : 5'-CGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGT (서열번호 50)

탐침 51 : 5'-CGGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCGG (서열번호 51)

탐침 52 : 5'-A(G/T)GATGTATGGCTGC(G/C)ACGTGGGGT (서열번호 52)

탐침 53 : 5'-GCCCACTCACAGACT(G/C)ACCGAGTGG (서열번호 53)

탐침 54 : 5'-AGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCGAG (서열번호 54)

탐침 55 : 5'-CCGTGGATAGAGCAGGAGAGGCCTG (서열번호 55)

2) HLA-B 선별용 탐침: 탐침 56 내지 149

탐침 56 : 5'-TTGGGACCGGGAGACACGGAACAT (서열번호 56)

탐침 57 : 5'-ACACAGATCT(A/C/T/G)CAAGACCAACA (서열번호 57)

탐침 58 : 5'-GAGAACCTGCGGA(T/C)CGCGCTCCG (서열번호 58)

탐침 59 : 5'-AGACTTACCGAGAGAACCTGCGC (서열번호 59)

탐침 60 : 5'-AGACTTACCGAGAGAACCTGCGGAT (서열번호 60)

탐침 61 : 5'-GCCGGGGCCAGGGTCTCACACTTGG (서열번호 61)

탐침 62 : 5'-CCTCCTCCGCGGGCATAACCAGTTAG (서열번호 62)

탐침 63 : 5'-GGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGT (서열번호 63)

탐침 64 : 5'-GGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCG (서열번호 64)

탐침 65 : 5'-ATCTCCAAGACCAACACACAGACTT (서열번호 65)

탐침 66 : 5'-GTCTCACACCCTCCAGAGGATGTTT (서열번호 66)

탐침 67 : 5'-GTCTCACACCCTCCAGAGGATGTT (서열번호 67)

탐침 68 : 5'-GTCTCACACCCTCCAGAGGATGTCT (서열번호 68)

탐침 69 : 5'-GTCTCACACC(C/A)TCCAGAGGATGTC (서열번호 69)

탐침 70 : 5'-CAGAGGATGTATGGCTGCGACC (서열번호 70)

탐침 71 : 5'-ACCTGGAGGGCCTGTGCGTGGAGTCG (서열번호 71)

탐침 72 : 5'-GTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGT (서열번호 72)

탐침 73 : 5'-ACGCCGCGAGTCCGAGAGGGGAGC (서열번호 73)

탐침 74 : 5'-GACGGAGCCCCGGGCGCCGTGGGTGG (서열번호 74)

탐침 75 : 5'-AGACTTACCGAGAGAACCTGCGCAC (서열번호 75)

탐침 76 : 5'-AGACTTACCGAGAGAACCTGCGGAT (서열번호 76)

탐침 77 : 5'-TCCTGGACCGCCGCG GACACGGCGA (서열번호 77)

탐침 78 : 5'-GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCC (서열번호 78)

탐침 79 : 5'-GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCT (서열번호 79)

탐침 80 : 5'-GCCTCCTCCGCGGG(C/T)ATGACCAGTC (서열번호 80)

탐침 81 : 5'-CTCAGTGGGCTACGTGGACGACACG (서열번호 81)

탐침 82 : 5'-CTCAGTGGGCTACGTGGACGACACC (서열번호 82)

탐침 83 : 5'-CCGGGGCCAGGGTCTCACATCA (서열번호 83)

탐침 84 : 5'-GGCCGGGGCCAGGGTCTCACACCC (서열번호 84)

탐침 85 : 5'-CCGGGGCCAGGGTCTCACACTTGG (서열번호 85)

탐침 86 : 5'-GAGGCGGCCCGTGAGGCGGAGCAGTGG (서열번호 86)

탐침 87 : 5'-AGGCGGCCCGTGTGGCGGAGCAGCTG (서열번호 87)

탐침 88 : 5'-AGGCGGCCCGTGAGGCGGAGCAGCGG (서열번호 88)

탐침 89 : 5'-GTATTGGGACCGGGAGACACAGAAGT (서열번호 89)

탐침 90 : 5'-GAGGGGCCGGAGTATTGGGAC(C/G)GGGAGA (서열번호 90)

탐침 91 : 5'-GGGGCCGGAGTATTGGGACCGGAAC (서열번호 91)

탐침 92 : 5'-ATTGGGACCGG(G/A)A(G/C)ACACAGATCTC (서열번호 92)

탐침 93 : 5'-GGGACCGGAACACACAGATCTA (서열번호 93)

탐침 94 : 5'-ATCT(A/C/G/T)CAAGACCAACACACAGACTT (서열번호 94)

탐침 95 : 5'-T(A/C/G/T)CAAGACCAACACACAGACTGA (서열번호 95)

탐침 96 : 5'-TGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAA (서열번호 96)

탐침 97 : 5'-TGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAG (서열번호 97)

탐침 98 : 5'-GAACACACAGATCTACAAGGCCCAGG (서열번호 98)

탐침 99 : 5'-GACACCGCGGCTCAGATCACCCGG (서열번호 99)

탐침 100 : 5'-CGAGAGAGCCTGCGGAACCTGCGCGGC (서열번호 100)

탐침 101 : 5'-CGGCCCGTGTGGCGGAGCAGGAC (서열번호 101)

탐침 102 : 5'-GCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACG (서열번호 102)

탐침 103 : 5'-AGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCCTG (서열번호 103)

탐침 104 : 5'-CGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGTGG (서열번호 104)

탐침 105 : 5'-CGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGAGG (서열번호 105)

탐침 106 : 5'-GAGAGCCTACCTGGAGGGCGAG (서열번호 106)

탐침 107 : 5'-CACTCCATGAGGTATTTC(T/G/C)ACACCG (서열번호 107)

탐침 108 : 5'-CACTCCATGAGGTATTTC(T/G/C)ACACCT (서열번호 108)

탐침 109 : 5'-CCTACCTGGAGGGCCTGTGCGTGGAGTC (서열번호 109)

탐침 110 : 5'-ACCTGGAGGGCCTGTGCGTGGAGTGG (서열번호 110)

탐침 111 : 5'-CAGCGACGCCGCGAGTCCGAGAGGGG (서열번호 111)

탐침 112 : 5'-ACGCCGCGAGTCCGAGAGAGGAGC (서열번호 112)

탐침 113 : 5'-TTTTTTCGCCGCGAGTCCGAGAGAGG (서열번호 113)

탐침 114 : 5'-CAAGGCACAGACTGACCGAGAGGAC (서열번호 114)

탐침 115 : 5'-TGCGAC(C/G)TGGGGCC(C/G)GACGGGCGCT (서열번호 115)

탐침 116 : 5'-TGCGAC(C/G)TGGGGCC(C/G)GACGGGCGCC (서열번호 116)

탐침 117 : 5'-CAGACTTACCGAGAGGACCTGCGGAA (서열번호 117)

탐침 118 : 5'-GGTCTCACACCCTCCAGAGGATGTT (서열번호 118)

탐침 119 : 5'-CTCACACCCTCCAGAGGATGTA (서열번호 119)

탐침 120 : 5'-TTTTTTCACCCTCCAGAGGATGTA (서열번호 120)

탐침 121 : 5'-GGCCAGGGTCTCACACCCTCCAGACG (서열번호 121)

탐침 122 : 5'-ACGCCGCGAGTCCGAGGACGGAG (서열번호 122)

탐침 123 : 5'-AGCGACGCCGCGAGTCCGAGGATGG (서열번호 123)

탐침 124 : 5'-CGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGCG (서열번호 124)

탐침 125 : 5'-GTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGAC (서열번호 125)

탐침 126 : 5'-GTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGAT (서열번호 126)

탐침 127 : 5'-GATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACG (서열번호 127)

탐침 128 : 5'-GATACCTGGAGAACGGGAAGGACAAG (서열번호 128)

탐침 129 : 5'-GCCTCCTCCGCGGG(C/T)ATGACCAGTC (서열번호 129)

탐침 130 : 5'-GACGGGCGCCTCCTCCGCGGGCATA (서열번호 130)

탐침 131 : 5'-GCCTCCTCCGCGGGCAT(G/A)ACCAGTA (서열번호 131)

탐침 132 : 5'-ATTGGGACCGG(A/G)A(C/G)ACACAGATCTG (서열번호 132)

탐침 133 : 5'-ACGCAGTTCGTGAGGTTCGACAGCA (서열번호 133)

탐침 134 : 5'-AC(G/C)C(A/T)GTTCGTGAGGTTCGACAGCG (서열번호 134)

탐침 135 : 5'-ATTGGGACCGG(G/A)A(C/G)ACACAGATCTT (서열번호 135)

탐침 136 : 5'-GGCCGGAGTATTGGGACCGGGAGAT (서열번호 136)

탐침 137 : 5'-TACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCG (서열번호 137)

탐침 138 : 5'-GCCAGGGTCTCACACCCTCCAGAGC (서열번호 138)

탐침 139 : 5'-GCCTCCTCCGCGGG(C/T)AT(G/A)ACCAGTT (서열번호 139)

탐침 140 : 5'-ATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGAG (서열번호 140)

탐침 141 : 5'-GCCCGTG(T/A)GGCGGAGCAGCGG (서열번호 141)

탐침 142 : 5'-TTTTTAACACACAGATCTACAAGA (서열번호 142)

탐침 143 : 5'-GACGGGCGCCTCCTCCGCGGGCATG (서열번호 143)

탐침 144 : 5'-GGCCAGGGTCTCACATCATCCAGG (서열번호 144)

탐침 145 : 5'-CTCACACCCTCCAGAGGATGTCTGGC (서열번호 145)

탐침 146 : 5'-CTCACACCCTCCAGAGGATGTTTGGC (서열번호 146)

탐침 147 : 5'-CTCACACCCTCCAGAG(G/c)ATGTACGGC (서열번호 147)

탐침 148 : 5'-CAGGGTCTCACA(C/T)C(C/A)TCCAGAGGA (서열번호 148)

탐침 149 : 5'-AGACTGACCGAGAG(G/A)(A/G)CCTGCGGAC (서열번호 149)

3) HLA-DRB1 선별용 탐침: 탐침 150 내지 219

탐침 150 : 5'-GAGGCGGGCCGCGGTGGACACCTAT (서열번호 150)

탐침 151 : 5'-CACGTTTCTTGGAGTACTCTACGTC (서열번호 151)

탐침 152 : 5'-AGATACTTCCATAACCAGGAGGAGA (서열번호 152)

탐침 153 : 5'-CGGTTCCTGGACAGATACTTCTATC (서열번호 153)

탐침 154 : 5'-CAGCCAGAAGGACCTCCTGGAGCAGAAG (서열번호 154)

탐침 155 : 5'-ACCTCCTGGAGC(A/G)GAGGCGGGCCGAGG (서열번호 155)

탐침 156 : 5'-GGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTAGCG (서열번호 156)

탐침 157 : 5'-GATACTTCTATCACCAAGAGGAGTC (서열번호 157)

탐침 158 : 5'-CTGCAGACACAACTACGGGGTTGGTG (서열번호 158)

탐침 159 : 5'-CTGCAGACACAACTACGGGGTTGTGG (서열번호 159)

탐침 160 : 5'-ACGGGGTTGGTGAGAGCTTCACGG (서열번호 160)

탐침 161 : 5'-AGGACATCCTGGAGGACAGGCGGGG (서열번호 161)

탐침 162 : 5'-CATTTCTTCAACGGGACGGAGCCGG (서열번호 162)

탐침 163 : 5'-CGTTTCCTGTGGCAGGGTAAGTATA (서열번호 163)

탐침 164 : 5'-GTACCGGGCGGTGACGGAGCTAGGG (서열번호 164)

탐침 165 : 5'-TTGGAGTACTCTACGGGTGAGTGTT (서열번호 165)

탐침 166 : 5'-GAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACT (서열번호 166)

탐침 167 : 5'-GAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACA (서열번호 167)

탐침 168 : 5'-GTGCGCTTCGACAGCGACGTGAGGG (서열번호 168)

탐침 169 : 5'-CAACGGGACGGAGCGGGTGCGGTAT (서열번호 169)

탐침 170 : 5'-GGTGCGGTTGCTGGAAAGACGCGTCC (서열번호 170)

탐침 171 : 5'-GACGGAGCTGGGGCGGCCTGATGAGGAG (서열번호 171)

탐침 172 : 5'-CACGTTTCTTGGAGTACTCTACGGG (서열번호 172)

탐침 173 : 5'-GCAGAAGCGGGGCCGGGTGGACAAC (서열번호 173)

탐침 174 : 5'-CCTACTGCAGACACAACTACGGGGC (서열번호 174)

탐침 175 : 5'-GGAACAGCCAGAAGGACATCCTGGG (서열번호 175)

탐침 176 : 5'-TCTTCAATGGGACGGAGCGGGTGCTG (서열번호 176)

탐침 177 : 5'-CAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTA (서열번호 177)

탐침 178 : 5'-GCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTT (서열번호 178)

탐침 179 : 5'-GATGCATCTATAACCAAGAGGAGTC (서열번호 179)

탐침 180 : 5'-GAGCTGGGGCGGCCTGCTGCGGAGC (서열번호 180)

탐침 181 : 5'-GGAGTACTCTACGTCTGAGTGTCAA (서열번호 181)

탐침 182 : 5'-ACGTTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGGG (서열번호 182)

탐침 183 : 5'-AGACACTTCCATAACCAGGAGGAGC (서열번호 183)

탐침 184 : 5'-CTTCCTGGAAGACAGGCGGGCCCTGG (서열번호 184)

탐침 185 : 5'-CCAGAAGGACATCCTGGAGCAGGCG (서열번호 185)

탐침 186 : 5'-AAGGACCTCCTGGAGCGGAGGCGGT (서열번호 186)

탐침 187 : 5'-GCGGGTGCGGTTCCTGGA(C/A)AGAC (서열번호 187)

탐침 188 : 5'-ACCTCCTGGAGCAGAGGCGGGCCGCGG (서열번호 188)

탐침 189 : 5'-CCAGAAGGACATCCTGGAAGACAAG (서열번호 189)

탐침 190 : 5'-AGAAGGACCTCCTGGAGCAGAGG (서열번호 190)

탐침 191 : 5'-AGCTGGGGCGGCCTG(A/T)(T/C)GCCGAGTC (서열번호 191)

탐침 192 : 5'-CCAGAAGGAC(A/T)TCCTGGAAGACGAG (서열번호 192)

탐침 193 : 5'-GATACTTCCTATAACCAGGAGGAGAA (서열번호 193)

탐침 194 : 5'-TGCAGACACAACTACGGGGTTGTGG (서열번호 194)

탐침 195 : 5'-GAACAGCCAGAAGGACATCCTGGAG (서열번호 195)

탐침 196 : 5'-GAACAGCCAGAAGGACTTCCTGGAG (서열번호 196)

탐침 197 : 5'-GTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGTCG (서열번호 197)

탐침 198 : 5'-GAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACC (서열번호 198)

탐침 199 : 5'-ACGGAGCTGGGGCGGCCTGATGCCG (서열번호 199)

탐침 200 : 5'-TCAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTA (서열번호 200)

탐침 201 : 5'-CACGTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA (서열번호 201)

탐침 202 : 5'-GATACTTC(C/T)ATAACCA(G/A)GAGGAGTC (서열번호 202)

탐침 203 : 5'-GAGCGGGTGCGGTT(C/A)CTGGA(G/C)AGACA (서열번호 203)

탐침 204 : 5'-TCCTGGA(A/G)(G/C)(A/G)(C/G)AGGCGGGCCGAGG (서열번호 204)

탐침 205 : 5'-AGACACTTC(C/T)ATAACCAGGAGGAGTT (서열번호 205)

탐침 206 : 5'-TACTTCTAT(A/C)ACCAAGAGGAGTA (서열번호 206)

탐침 207 : 5'-CCAGAAGGACATCCTGGAAGACAGG (서열번호 207)

탐침 208 : 5'-CGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGA (서열번호 208)

탐침 209 : 5'-CAA(T/C)GGGACGGAGCGGGTGCGGTTC (서열번호 209)

탐침 210 : 5'-AAGGACCTCCTGGAGCGGAGGCGGG (서열번호 210)

탐침 211 : 5'-TCTTCAA(T/C)GGGACGGAGCGGGTGCGGT (서열번호 211)

탐침 212 : 5'-GAACAGCCAGAAGGAC(A/T/C)TCCTGGAAGA (서열번호 212)

탐침 213 : 5'-GATACTTCTAT(C/A)ACCAAGAGGAGTA (서열번호 213)

탐침 214 : 5'-GTCATTTCTTCAA(C/T)GGGACGGAGCGGG (서열번호 214)

탐침 215 : 5'-GTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGG (서열번호 215)

탐침 216 : 5'-GCCGAGGTGGACACCTACTGCAGAT (서열번호 216)

탐침 217 : 5'-TGACGGAGCTGGGGCGGCCTGATGC (서열번호 217)

탐침 218 : 5'-CGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGC (서열번호 218)

탐침 219 : 5'-CAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTC (서열번호 219)

4) HLA-A 양성/음성용 탐침: 탐침 220 내지 224

탐침 220 : 5'-CCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGAC (서열번호 220)

탐침 221 : 5'-ACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGA (서열번호 221)

탐침 222 : 5'-TGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACAT (서열번호 222)

탐침 223 : 5'-GACCTGCGCTCTTGGACCGCAGCGG (서열번호 223)

탐침 224 : 5'-GACCTGCGCTCTTGGACCGCGGAGG (서열번호 224)

5) HLA-B 양성/음성용 탐침: 탐침 225 내지 229

탐침 225 : 5'-GCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTC (서열번호 225)

탐침 226 : 5'-GGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTT (서열번호 226)

탐침 227 : 5'-CCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGC (서열번호 227)

탐침 228 : 5'-GCCCGGCCGCGGGGAGCCCCACTTC (서열번호 228)

탐침 229 : 5'-GCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGATTC (서열번호 229)

6) HLA-DRB1 양성/음성용 탐침: 탐침 230 내지 234

탐침 230 : 5'-CGACGTGGGGGAGT(A/T)CCGGGCGGTG (서열번호 230)

탐침 231 : 5'-GACGTGGGGGAGT(A/T)CCGGGCGGTGA (서열번호 231)

탐침 232 : 5'-GGGGAGT(A/T)CCGGGCGGTGACGGAGC (서열번호 232)

탐침 233 : 5'-GACGTGGGGGAGT(A/T)CCGGGCAGTGA (서열번호 233)

탐침 234 : 5'-GACGTGGGGGAGT(A/T)CCGGGCGATGA (서열번호 234)

7) HLA-DRB 3,4,5 음성용 탐침: 탐침 235 내지 237

탐침 235 : 5'-GCAGAAGCGGGGCC(G/A)GGTGGACAAT (서열번호 235)

탐침 236 : 5'-AACAGTGACCTGGGGGAGTACCAGG (서열번호 236)

탐침 237 : 5'-GGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGC (서열번호 237)

(DNA 칩의 제조)

상기에서 작제된 탐침들을 완충용액(350mM sodium bicarbonate, pH 9.0)에 각각 50μM로 용해시키고, 알데히드가 도포된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, TX, USA) 표면에 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 크기 150㎛, 간격 300㎛으로 점적을 수행한 후, 시프염기 반응을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)용액과 3차 증류수를 이용하여 순차적으로 세척한 다음, NaBH₄ 용액(0.1g NaBH₄, 30㎖phosphate buffered saline (PBS), 10㎖ ethanol)에 15분 동안 침지하여, 아민이 결합되지 않은 알데히드 잔기를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다.

<실시예 2> DNA 칩을 이용한 HLA 대립유전자 선별

혈액에서 분리한 DNA를 2mM dATP, dGTP, dCTP, 0.8mM dTTP, 0.2mM dUTP와 HLA-A,B 유전자의 엑손 2 및 3부위를 증폭할 수 있는 특이적 프라이머들, HLA-DRB1 유전자의 엑손 2 부위를 증폭할 수 있는 특이적 프라이머들과 중합반응 완충용액 및 중합반응 효소를 이용하여 HLA-A,B는 엑손 2 및 3 부위를 DRB1은 엑손 2 부위를 증폭하였다. 이때, 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

1) 안티센스 프라이머: HLA-A-R, HLA-B-R, HLA-DR-R

HLA-A-R: 5'-TGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC-3' (서열번호 238)

HLA-B-R: 5'-GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT-3'(서열번호 239)

HLA-DR-R: 5'-ACCCMCCTCCCWYGTCACCTCC-3' (서열번호 240)

2) 센스 프라이머: HLA-A-F, HLA-B-F, HLA-DR-F1~F5

HLA-A-F: 5'-GAAACSGCCTCTGYGGGGAGAAGCAA-3' (서열번호 241)

HLA-B-F: 5'-GGGAGGAGCGAGGGGACC(G/C)CAG-3' (서열번호 242)

HLA-DR-F1: 5'-CACGTTTCTTGGAGTACTCTAC-3' (서열번호 243)

HLA-DR-F2: 5'-ACCACGTTTCYTGTGGCAG-3' (서열번호 244)

HLA-DR-F3: 5'-GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA-3' (서열번호 245)

HLA-DR-F4: 5'-CACGTTTCTTGAAGCAGGATAAGTT-3' (서열번호 246)

HLA-DR-F5: 5'-CACGTTTCTTGGAGGAGGTTAAGTT-3' (서열번호 247)

증폭된 DNA에 람다 엑소누클레아제(lamda exonuclease, 10units/㎕)를 처리하여 단일사슬로 분리하였다. 분리된 단일사슬에 탈이산화효소(shrimp alkaline phosphotase)를 처리하여, 잔여 dNTP를 탈인산화시키고, 우라실 DNA 글리코실라제(Uracil DNA Glycosylase, UNG)를 처리하여 300 내지 500bp길이의 단일가닥 DNA를 수득하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 DNA 칩에 상기에서 가공된 시료유전자를 가하고, 시아닌 5(Cyanine 5) 형광물질에 의해 표지된 ddNTP (NEN Life Science) 및 중합효소(Thermo Sequenase, AP Biotech., USA)를 첨가한 후, 60℃에서 30분간 반응시켰다. 이어, DNA 칩을 50mM NaOH 수용액으로 10분간, 3차증류수로 10분간 순차적으로 세척한 다음 건조시키고, 건조된 DNA 칩을 스캐너(Biochip Scanner, Nanostorage, Korea)를 이용하여 100mm의 픽셀크기로 667nm 파장범위에서 스캔하였다.

도 1내지 3은 각각 HLA-A, -B, -DRB1 대립유전자의 탐침 위치를 표시한 도면이다.

도 4는 HLA-A 대립유전자형을 검사한 결과를 나타내는 사진으로, 20개의 샘플 각각은 2개의 HLA 대립유전자를 갖고 있어 1개 샘플은 2개의 HLA 대립유전자의 하위 분류군으로 선별된다. 따라서, 도 4는 HLA-A*0206/A*3303, A*0201/*3101, A*2602/A*3001, A*0207/*3001, A*0201/A*2402, A*0101/A*0301, A*0301/A*3201, A*1101/A*2603, A*0207/A*3101, A*0207/A*0301, A*2602/A*3001, A*2402/A*6801, A*0205/A*2402, A*2420/2601, A*2420/A*2603, A*0201/A*2901, A*1102/A*3303, A*0201/A*3201, A*1102/A*2402, A*2402/A*2901 대립유전자에 대한 검사 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 HLA-B 대립유전자형을 검사한 결과를 나타내는 사진으로 HLA-B*3701/B*5101, B*1301/B*5401, B*4601/B*5401, B*4403/B*5101, B*1511/B*5801, B*1302/B*3901, B*4002/B*4801, B*1501/B*2705, B*2705/B*3701, B*4006/B*4403, B*4402/B*5701, B*1501/B*4601, B*2705/B*5101, B*4403/B*5201, B*1302/B*1527, B*4402/B*4601, B*1401/B*5102, B*0702/B*1535, B*4701/B*5101, B*1501/B*1511 대립유전자에 대한 검사 결과이다.

도 6은 본 발명의 DNA 칩을 사용하여 HLA-DRB1대립유전자형을 검사한 결과를 나타내는 사진으로 HLA-DRB1*0406/DRB1*1101, DRB1*0403/DRB1*1001, DRB1*0701/DRB1*0901, DRB1*1201/DRB1*1202, DRB1*0403/DRB1*1405, DRB1*0301/DRB1*0405, DRB1*0406/DRB1*0901, DRB1*0701/DRB1*1405, DRB1*0101/DRB1*0701, DRB1*0901/DRB1*1602, DRB1*1201/DRB1*1301, DRB1*0406/DRB1*1202, DRB1*0901/DRB1*1302, DRB1*0701/DRB1*1301, DRB1*0401/DRB1*0803, DRB1*0701/DRB1*1401, DRB1*0901/DRB1*1301, DRB1*0802/DRB1*0803, DRB1*0101/DRB1*1101, DRB1*0410/DRB1*0701 대립유전자에 대한 검사 결과이다.

도 7내지 9는 본 발명의 DNA 칩을 사용하여 각각 HLA-A, -B, -DRB1의 유전자형을 판독하기 위한 표이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> SPREX(Sequence Specific Primer Refractory Extension)-DNA chip kit for high resolution typing of HLA allele <160> 247 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 1 for typing HLA-A allele <400> 1 tcgacagcga cgccgcgagc cagaag 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 2 for typing HLA-A allele <400> 2 gaggggccgg agtattggga cgggg 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 3 for typing HLA-A allele <400> 3 ggttcgacag cgacgccgcg agccgg 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 4 for typing HLA-A allele <400> 4 gctctcactc catgaggtat ttctt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 5 for typing HLA-A allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> B letter can be C or T. D letter can be A or G. H letter can be A or C. <400> 5 cagabcacch agcdcaagtg ggaga 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 6 for typing HLA-A allele <400> 6 ccactccatg aggtatttct acacc 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 7 for typing HLA-A allele <400> 7 aggcggccca tgtggcggag cagttg 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 8 for typing HLA-A allele <400> 8 gttctcacac cgtccagagg atgtg 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 9 for typing HLA-A allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> K letter can be G or C. M letter can be G or T. <400> 9 gttctcacac cktccagamg atgtt 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 10 for typing HLA-A allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> K letter can be G or C. M letter can be G or T. <400> 10 gttctcacac cktccagamg atgta 25 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 11 for typing HLA-A allele <400> 11 tatggctgcg acgtggggtc ggactgg 27 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 12 for typing HLA-A allele <400> 12 ggcgccgtgg atagagcagg agagt 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 13 for typing HLA-A allele <400> 13 ggcgccgtgg atagagcagg agggg 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 14 for typing HLA-A allele <400> 14 agcagttgag agcctacctg gatgg 25 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 15 for typing HLA-A allele <400> 15 aggcggccca tgtggcggag cagcag 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 16 for typing HLA-A allele <400> 16 ggagacacgg aatgtgaagg cccag 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 17 for typing HLA-A allele <400> 17 tccgtgtccc ggcccggccg cggga 25 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 18 for typing HLA-A allele <400> 18 tccgtgtccc ggcccggccg cggggagc 28 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 19 for typing HLA-A allele <400> 19 cgagagaacc tgcggatcgc gctccg 26 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 2 for typing HLA-A allele <400> 20 cgaacctggg gaccctgcgc ggcta 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 21 for typing HLA-A allele <400> 21 ccaagcacaa gtgggaggcg gcccg 25 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 22 for typing HLA-A allele <400> 22 acctggaggg cacgtgcgtg gacggg 26 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 23 for typing HLA-A allele <400> 23 gccactgctc gcccccaggc tcccaa 26 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 24 for typing HLA-A allele <400> 24 actgctcgcc cccaggctcc cac 23 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 25 for typing HLA-A allele <400> 25 ccggagtatt gggacgagga gacaggg 27 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 26 for typing HLA-A allele <400> 26 agcggagagc ctacctggag ggccgg 26 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 27 for typing HLA-A allele <400> 27 cccactcaca gactgaccga gagag 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 28 for typing HLA-A allele <400> 28 ggcccactca cagactgacc gagcg 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 29 for typing HLA-A allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> D letter can be A or G. <400> 29 cgcttcctcc gcgggtaccd gcagg 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 30 for typing HLA-A allele <400> 30 cgcttcctcc gcgggtacca gcaga 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 31 for typing HLA-A allele <400> 31 aatgtgaagg cccactcaca gactc 25 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 32 for typing HLA-A allele <400> 32 aggcccactc acagactgac cgagag 26 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 33 for typing HLA-A allele <400> 33 ggcgcttcct ccgcgggtac cagcggg 27 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 34 for typing HLA-A allele <400> 34 cggcaaggat tacatcgccc tgaacg 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 35 for typing HLA-A allele <400> 35 cggcaaggat tacatcgccc tgaaag 26 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 36 for typing HLA-A allele <400> 36 gctcccactc catgaggtat ttcac 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 37 for typing HLA-A allele <400> 37 gaggggccgg agtattggga cctgc 25 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 38 for typing HLA-A allele <400> 38 atccgtgtcc cggcccggca gtggag 26 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 39 for typing HLA-A allele <400> 39 agcacaagtg ggaggcggcc cgttggg 27 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 40 for typing HLA-A allele <400> 40 agcacaagtg ggaggcggcc cgtcggg 27 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 41 for typing HLA-A allele <400> 41 aggcggccca tgtggcggag cagtgg 26 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 42 for typing HLA-A allele <400> 42 ggaatgtgaa ggcccactca cagat 25 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 43 for typing HLA-A allele <400> 43 ctacctggag ggcacgtgcg tggag 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 44 for typing HLA-A allele <400> 44 cctggagggc acgtgcgtgg acggg 25 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 45 for typing HLA-A allele <400> 45 ggacgacacg cagttcgtgc ggtttg 26 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 46 for typing HLA-A allele <400> 46 ggggccggag tattgggacc ggaac 25 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 47 for typing HLA-A allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> D letter can be G or A. <400> 47 cctccgcggg taccagcdgd acgct 25 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 48 for typing HLA-A allele <400> 48 agcggagagt ctacctggag ggcacg 26 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 49 for typing HLA-A allele <400> 49 acatggcagc tcagaccacc aagca 25 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 50 for typing HLA-A allele <400> 50 cgcttcctcc gcgggtacca ccagt 25 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 51 for typing HLA-A allele <400> 51 cgggcgcttc ctccgcgggt accgg 25 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 52 for typing HLA-A allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> M letter can be G or T. K letter can be G or C. <400> 52 amgatgtatg gctgckacgt ggggt 25 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 53 for typing HLA-A allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> K letter can be G or C. <400> 53 gcccactcac agactkaccg agtgg 25 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 54 for typing HLA-A allele <400> 54 agctgagagc ctacctggag ggcgag 26 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 55 for typing HLA-A allele <400> 55 ccgtggatag agcaggagag gcctg 25 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 56 for typing HLA-B allele <400> 56 ttgggaccgg gagacacgga acat 24 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 57 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(22) <223> R letter can be A, C, T, or G. <400> 57 acacagatct rcaagaccaa ca 22 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 58 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(23) <223> B letter can be T or C. <400> 58 gagaacctgc ggabcgcgct ccg 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 59 for typing HLA-B allele <400> 59 agacttaccg agagaacctg cgc 23 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 60 for typing HLA-B allele <400> 60 agacttaccg agagaacctg cggat 25 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 61 for typing HLA-B allele <400> 61 gccggggcca gggtctcaca cttgg 25 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 62 for typing HLA-B allele <400> 62 cctcctccgc gggcataacc agttag 26 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 63 for typing HLA-B allele <400> 63 ggacgggcgc ctcctccgcg ggt 23 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 64 for typing HLA-B allele <400> 64 ggccgcgggg agccccgctt catcg 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 65 for typing HLA-B allele <400> 65 atctccaaga ccaacacaca gactt 25 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 66 for typing HLA-B allele <400> 66 gtctcacacc ctccagagga tgttt 25 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 67 for typing HLA-B allele <400> 67 gtctcacacc ctccagagga tgtt 24 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 68 for typing HLA-B allele <400> 68 gtctcacacc ctccagagga tgtct 25 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 69 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(24) <223> H letter can be C or A. <400> 69 gtctcacacc htccagagga tgtc 24 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 70 for typing HLA-B allele <400> 70 cagaggatgt atggctgcga cc 22 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 71 for typing HLA-B allele <400> 71 acctggaggg cctgtgcgtg gagtcg 26 <210> 72 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 72 for typing HLA-B allele <400> 72 gtggacgaca cgcagttcgt gcggt 25 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 73 for typing HLA-B allele <400> 73 acgccgcgag tccgagaggg gagc 24 <210> 74 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 74 for typing HLA-B allele <400> 74 gacggagccc cgggcgccgt gggtgg 26 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 75 for typing HLA-B allele <400> 75 agacttaccg agagaacctg cgcac 25 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 76 for typing HLA-B allele <400> 76 agacttaccg agagaacctg cggat 25 <210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 77 for typing HLA-B allele <400> 77 tcctggaccg ccgcggacac ggcga 25 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 78 for typing HLA-B allele <400> 78 gctcccactc catgaggtat ttcc 24 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 79 for typing HLA-B allele <400> 79 gctcccactc catgaggtat ttct 24 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 80 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> B letter can be C or T. <400> 80 gcctcctccg cgggbatgac cagtc 25 <210> 81 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 81 for typing HLA-B allele <400> 81 ctcagtgggc tacgtggacg acacg 25 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 82 for typing HLA-B allele <400> 82 ctcagtgggc tacgtggacg acacc 25 <210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 83 for typing HLA-B allele <400> 83 ccggggccag ggtctcacat ca 22 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 84 for typing HLA-B allele <400> 84 ggccggggcc agggtctcac accc 24 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 85 for typing HLA-B allele <400> 85 ccggggccag ggtctcacac ttgg 24 <210> 86 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 86 for typing HLA-B allele <400> 86 gaggcggccc gtgaggcgga gcagtgg 27 <210> 87 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 87 for typing HLA-B allele <400> 87 aggcggcccg tgtggcggag cagctg 26 <210> 88 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 88 for typing HLA-B allele <400> 88 aggcggcccg tgaggcggag cagcgg 26 <210> 89 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 89 for typing HLA-B allele <400> 89 gtattgggac cgggagacac agaagt 26 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 90 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(28) <223> K letter can be C or G. <400> 90 gaggggccgg agtattggga ckgggaga 28 <210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 91for typing HLA-B allele <400> 91 ggggccggag tattgggacc ggaac 25 <210> 92 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 92 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> D letter can be G or A. K letter can be G or C. <400> 92 attgggaccg gdakacacag atctc 25 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 93 for typing HLA-B allele <400> 93 gggaccggaa cacacagatc ta 22 <210> 94 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 94 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> R letter can be A, C, T, or G. <400> 94 atctrcaaga ccaacacaca gactt 25 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 95 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(23) <223> R letter can be A, C, T, or G. <400> 95 trcaagacca acacacagac tga 23 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 96 for typing HLA-B allele <400> 96 tggatagagc aggaggggcc ggaa 24 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 97 for typing HLA-B allele <400> 97 tggatagagc aggaggggcc ggag 24 <210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 98 for typing HLA-B allele <400> 98 gaacacacag atctacaagg cccagg 26 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 99 for typing HLA-B allele <400> 99 gacaccgcgg ctcagatcac ccgg 24 <210> 100 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 100 for typing HLA-B allele <400> 100 cgagagagcc tgcggaacct gcgcggc 27 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 101 for typing HLA-B allele <400> 101 cggcccgtgt ggcggagcag gac 23 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 102 for typing HLA-B allele <400> 102 gctgagagcc tacctggagg gcacg 25 <210> 103 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 103 for typing HLA-B allele <400> 103 agttgagagc ctacctggag ggcctg 26 <210> 104 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 104 for typing HLA-B allele <400> 104 cgcaagtggg aggcggcccg tgtgg 25 <210> 105 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 105 for typing HLA-B allele <400> 105 cgcaagtggg aggcggcccg tgagg 25 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 106 for typing HLA-B allele <400> 106 gagagcctac ctggagggcg ag 22 <210> 107 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 107 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> Y letter can be T, G, or C. <400> 107 cactccatga ggtatttcya caccg 25 <210> 108 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 108 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> Y letter can be T, G, or C. <400> 108 cactccatga ggtatttcya cacct 25 <210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 109 for typing HLA-B allele <400> 109 cctacctgga gggcctgtgc gtggagtc 28 <210> 110 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 110 for typing HLA-B allele <400> 110 acctggaggg cctgtgcgtg gagtgg 26 <210> 111 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 111 for typing HLA-B allele <400> 111 cagcgacgcc gcgagtccga gagggg 26 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 112 for typing HLA-B allele <400> 112 acgccgcgag tccgagagag gagc 24 <210> 113 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 113 for typing HLA-B allele <400> 113 ttttttcgcc gcgagtccga gagagg 26 <210> 114 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 114 for typing HLA-B allele <400> 114 caaggcacag actgaccgag aggac 25 <210> 115 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 115 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> K letter can be C or G. <400> 115 tgcgacktgg ggcckgacgg gcgct 25 <210> 116 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 116 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> K letter can be C or G. <400> 116 tgcgacktgg ggcckgacgg gcgcc 25 <210> 117 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 117 for typing HLA-B allele <400> 117 cagacttacc gagaggacct gcggaa 26 <210> 118 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 118 for typing HLA-B allele <400> 118 ggtctcacac cctccagagg atgtt 25 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 119 for typing HLA-B allele <400> 119 ctcacaccct ccagaggatg ta 22 <210> 120 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 120 for typing HLA-B allele <400> 120 ttttttcacc ctccagagga tgta 24 <210> 121 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 121 for typing HLA-B allele <400> 121 ggccagggtc tcacaccctc cagacg 26 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 122 for typing HLA-B allele <400> 122 acgccgcgag tccgaggacg gag 23 <210> 123 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 123 for typing HLA-B allele <400> 123 agcgacgccg cgagtccgag gatgg 25 <210> 124 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 124 for typing HLA-B allele <400> 124 cgacgccgcg agtccgagga tggcg 25 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 125 for typing HLA-B allele <400> 125 gtgcgtggag tggctccgca gac 23 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 126 for typing HLA-B allele <400> 126 gtgcgtggag tggctccgca gat 23 <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 127 for typing HLA-B allele <400> 127 gatacctgga gaacgggaag gagacg 26 <210> 128 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 128 for typing HLA-B allele <400> 128 gatacctgga gaacgggaag gacaag 26 <210> 129 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 129 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> B letter can be C or T. <400> 129 gcctcctccg cgggbatgac cagtc 25 <210> 130 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 130 for typing HLA-B allele <400> 130 gacgggcgcc tcctccgcgg gcata 25 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 131 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> D letter can be G or A. <400> 131 gcctcctccg cgggcatdac cagta 25 <210> 132 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 132 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> D letter can be A or G. K letter can be C or G. <400> 132 attgggaccg gdakacacag atctg 25 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 133 for typing HLA-B allele <400> 133 acgcagttcg tgaggttcga cagca 25 <210> 134 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 134 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> K letter can be G or C. S letter can be A or T. <400> 134 ackcsgttcg tgaggttcga cagcg 25 <210> 135 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 135 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> D letter can be A or G. K letter can be G or C. <400> 135 attgggaccg gdakacacag atctt 25 <210> 136 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 136 for typing HLA-B allele <400> 136 ggccggagta ttgggaccgg gagat 25 <210> 137 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 137 for typing HLA-B allele <400> 137 tacatcgccc tgaacgagga cctgcg 26 <210> 138 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 138 for typing HLA-B allele <400> 138 gccagggtct cacaccctcc agagc 25 <210> 139 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 139 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> B letter can be C or T. D letter can be A or G. <400> 139 gcctcctccg cgggbatdac cagtt 25 <210> 140 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 140 for typing HLA-B allele <400> 140 attacatcgc cctgaacgag gacctgag 28 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 141 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(21) <223> S letter can be T or A. <400> 141 gcccgtgsgg cggagcagcg g 21 <210> 142 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 142 for typing HLA-B allele <400> 142 tttttaacac acagatctac aaga 24 <210> 143 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 143 for typing HLA-B allele <400> 143 gacgggcgcc tcctccgcgg gcatg 25 <210> 144 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 144 for typing HLA-B allele <400> 144 ggccagggtc tcacatcatc cagg 24 <210> 145 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 145 for typing HLA-B allele <400> 145 ctcacaccct ccagaggatg tctggc 26 <210> 146 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 146 for typing HLA-B allele <400> 146 ctcacaccct ccagaggatg tttggc 26 <210> 147 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 147 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(26) <223> K letter can be G or C. <400> 147 ctcacaccct ccagagkatg tacggc 26 <210> 148 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 148 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(24) <223> B letter can be C or T. H letter can be C or A. <400> 148 cagggtctca cabchtccag agga 24 <210> 149 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 149 for typing HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> D letter can be A or G. <400> 149 agactgaccg agagddcctg cggac 25 <210> 150 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 150 for typing HLA-DRB1 allele <400> 150 gaggcgggcc gcggtggaca cctat 25 <210> 151 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 151 for typing HLA-DRB1 allele <400> 151 cacgtttctt ggagtactct acgtc 25 <210> 152 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 152 for typing HLA-DRB1 allele <400> 152 agatacttcc ataaccagga ggaga 25 <210> 153 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 153 for typing HLA-DRB1 allele <400> 153 cggttcctgg acagatactt ctatc 25 <210> 154 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 154 for typing HLA-DRB1 allele <400> 154 cagccagaag gacctcctgg agcagaag 28 <210> 155 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 155 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(27) <223> D letter can be A or G. <400> 155 acctcctgga gcdgaggcgg gccgagg 27 <210> 156 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 156 for typing HLA-DRB1 allele <400> 156 ggtgacggag ctggggcggc ctagcg 26 <210> 157 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 157 for typing HLA-DRB1 allele <400> 157 gatacttcta tcaccaagag gagtc 25 <210> 158 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 158 for typing HLA-DRB1 allele <400> 158 ctgcagacac aactacgggg ttggtg 26 <210> 159 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 159 for typing HLA-DRB1 allele <400> 159 ctgcagacac aactacgggg ttgtgg 26 <210> 160 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 160 for typing HLA-DRB1 allele <400> 160 acggggttgg tgagagcttc acgg 24 <210> 161 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 161 for typing HLA-DRB1 allele <400> 161 aggacatcct ggaggacagg cgggg 25 <210> 162 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 162 for typing HLA-DRB1 allele <400> 162 catttcttca acgggacgga gccgg 25 <210> 163 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 163 for typing HLA-DRB1 allele <400> 163 cgtttcctgt ggcagggtaa gtata 25 <210> 164 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 164 for typing HLA-DRB1 allele <400> 164 gtaccgggcg gtgacggagc taggg 25 <210> 165 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 165 for typing HLA-DRB1 allele <400> 165 ttggagtact ctacgggtga gtgtt 25 <210> 166 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 167 for typing HLA-DRB1 allele <400> 166 gagtactgga acagccagaa ggact 25 <210> 167 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 167 for typing HLA-DRB1 allele <400> 167 gagtactgga acagccagaa ggaca 25 <210> 168 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 168 for typing HLA-DRB1 allele <400> 168 gtgcgcttcg acagcgacgt gaggg 25 <210> 169 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 169 for typing HLA-DRB1 allele <400> 169 caacgggacg gagcgggtgc ggtat 25 <210> 170 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 170 for typing HLA-DRB1 allele <400> 170 ggtgcggttg ctggaaagac gcgtcc 26 <210> 171 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 171 for typing HLA-DRB1 allele <400> 171 gacggagctg gggcggcctg atgaggag 28 <210> 172 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 172 for typing HLA-DRB1 allele <400> 172 cacgtttctt ggagtactct acggg 25 <210> 173 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 173 for typing HLA-DRB1 allele <400> 173 gcagaagcgg ggccgggtgg acaac 25 <210> 174 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 174 for typing HLA-DRB1 allele <400> 174 cctactgcag acacaactac ggggc 25 <210> 175 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 175 for typing HLA-DRB1 allele <400> 175 ggaacagcca gaaggacatc ctggg 25 <210> 176 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 176 for typing HLA-DRB1 allele <400> 176 tcttcaatgg gacggagcgg gtgctg 26 <210> 177 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 177 for typing HLA-DRB1 allele <400> 177 caatgggacg gagcgggtgc ggtta 25 <210> 178 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 178 for typing HLA-DRB1 allele <400> 178 gcttcgacag cgacgtgggg gagtt 25 <210> 179 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 179 for typing HLA-DRB1 allele <400> 179 gatgcatcta taaccaagag gagtc 25 <210> 180 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 180 for typing HLA-DRB1 allele <400> 180 gagctggggc ggcctgctgc ggagc 25 <210> 181 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 181 for typing HLA-DRB1 allele <400> 181 ggagtactct acgtctgagt gtcaa 25 <210> 182 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 182 for typing HLA-DRB1 allele <400> 182 acgtttcctg tggcagccta agaggg 26 <210> 183 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 183 for typing HLA-DRB1 allele <400> 183 agacacttcc ataaccagga ggagc 25 <210> 184 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 184 for typing HLA-DRB1 allele <400> 184 cttcctggaa gacaggcggg ccctgg 26 <210> 185 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 185 for typing HLA-DRB1 allele <400> 185 ccagaaggac atcctggagc aggcg 25 <210> 186 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 186 for typing HLA-DRB1 allele <400> 186 aaggacctcc tggagcggag gcggt 25 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 187 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(23) <223> H letter can be C or A. <400> 187 gcgggtgcgg ttcctggaha gac 23 <210> 188 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 188 for typing HLA-DRB1 allele <400> 188 acctcctgga gcagaggcgg gccgcgg 27 <210> 189 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 189 for typing HLA-DRB1 allele <400> 189 ccagaaggac atcctggaag acaag 25 <210> 190 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 190 for typing HLA-DRB1 allele <400> 190 agaaggacct cctggagcag agg 23 <210> 191 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 191 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> S letter can be A or T. B letter can be T or C. <400> 191 agctggggcg gcctgsbgcc gagtc 25 <210> 192 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 192 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> S letter can be A or T. <400> 192 ccagaaggac stcctggaag acgag 25 <210> 193 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 193 for typing HLA-DRB1 allele <400> 193 gatacttcct ataaccagga ggagaa 26 <210> 194 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 194 for typing HLA-DRB1 allele <400> 194 tgcagacaca actacggggt tgtgg 25 <210> 195 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 195 for typing HLA-DRB1 allele <400> 195 gaacagccag aaggacatcc tggag 25 <210> 196 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 196 for typing HLA-DRB1 allele <400> 196 gaacagccag aaggacttcc tggag 25 <210> 197 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 197 for typing HLA-DRB1 allele <400> 197 gtgacggagc tggggcggcc tgtcg 25 <210> 198 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 198 for typing HLA-DRB1 allele <400> 198 gagtactgga acagccagaa ggacc 25 <210> 199 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 199 for typing HLA-DRB1 allele <400> 199 acggagctgg ggcggcctga tgccg 25 <210> 200 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 200 for typing HLA-DRB1 allele <400> 200 tcaatgggac ggagcgggtg cggta 25 <210> 201 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 201 for typing HLA-DRB1 allele <400> 201 cacgtttctt ggagcaggtt aaaca 25 <210> 202 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 202 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> B letter can be C or T. D letter can be G or A. <400> 202 gatacttcba taaccadgag gagtc 25 <210> 203 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 203 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(26) <223> H letter can be A or C. K letter can be C or G. <400> 203 gagcgggtgc ggtthctgga kagaca 26 <210> 204 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 204 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(24) <223> D letter can be A or G. K letter can be G or C. <400> 204 tcctggadkd kaggcgggcc gagg 24 <210> 205 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 205 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(26) <223> B letter can be C or T. <400> 205 agacacttcb ataaccagga ggagtt 26 <210> 206 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 206 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(23) <223> H letter can be A or C. <400> 206 tacttctath accaagagga gta 23 <210> 207 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 207 for typing HLA-DRB1 allele <400> 207 ccagaaggac atcctggaag acagg 25 <210> 208 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 208 for typing HLA-DRB1 allele <400> 208 cggtgacgga gctggggcgg cctga 25 <210> 209 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 209 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> B letter can be T or C. <400> 209 caabgggacg gagcgggtgc ggttc 25 <210> 210 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 210 for typing HLA-DRB1 allele <400> 210 aaggacctcc tggagcggag gcggg 25 <210> 211 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 211 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(27) <223> B letter can be T or C. <400> 211 tcttcaabgg gacggagcgg gtgcggt 27 <210> 212 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 212 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(27) <223> V letter can be A, T, or C. <400> 212 gaacagccag aaggacvtcc tggaaga 27 <210> 213 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 213 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> H letter can be C or A. <400> 213 gatacttcta thaccaagag gagta 25 <210> 214 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 214 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(27) <223> B letter can be C or T. <400> 214 gtcatttctt caabgggacg gagcggg 27 <210> 215 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 215 for typing HLA-DRB1 allele <400> 215 gtgcgcttcg acagcgacgt ggggg 25 <210> 216 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 216 for typing HLA-DRB1 allele <400> 216 gccgaggtgg acacctactg cagat 25 <210> 217 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 217 for typing HLA-DRB1 allele <400> 217 tgacggagct ggggcggcct gatgc 25 <210> 218 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 218 for typing HLA-DRB1 allele <400> 218 cggtgacgga gctggggcgg cctgc 25 <210> 219 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 219 for typing HLA-DRB1 allele <400> 219 caatgggacg gagcgggtgc ggttc 25 <210> 220 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 220 for typing HLA-A allele <400> 220 cctgcgctct tggaccgcgg cggac 25 <210> 221 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 221 for typing HLA-A allele <400> 221 acctgcgctc ttggaccgcg gcgga 25 <210> 222 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 222 for typing HLA-A allele <400> 222 tgcgctcttg gaccgcggcg gacat 25 <210> 223 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 223 for typing HLA-A allele <400> 223 gacctgcgct cttggaccgc agcgg 25 <210> 224 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative control probe 224 for typing HLA-A allele <400> 224 gacctgcgct cttggaccgc ggagg 25 <210> 225 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 225 for typing HLA-B allele <400> 225 gcccggccgc ggggagcccc gcttc 25 <210> 226 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 226 for typing HLA-B allele <400> 226 ggcccggccg cggggagccc cgctt 25 <210> 227 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 227 for typing HLA-B allele <400> 227 ccggcccggc cgcggggagc cccgc 25 <210> 228 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 228 for typing HLA-B allele <400> 228 gcccggccgc ggggagcccc acttc 25 <210> 229 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative control probe 229 for typing HLA-B allele <400> 229 gcccggccgc ggggagcccc gattc 25 <210> 230 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 230 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> S letter can be A or T. <400> 230 cgacgtgggg gagtsccggg cggtg 25 <210> 231 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 231 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> S letter can be A or T. <400> 231 gacgtggggg agtsccgggc ggtga 25 <210> 232 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 232 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> S letter can be A or T. <400> 232 ggggagtscc gggcggtgac ggagc 25 <210> 233 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe 233 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> S letter can be A or T. <400> 233 gacgtggggg agtsccgggc agtga 25 <210> 234 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative control probe 234 for typing HLA-DRB1 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> S letter can be A or T. <400> 234 gacgtggggg agtsccgggc gatga 25 <210> 235 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 235 for typing HLA-DRB3 allele <220> <221> variation <222> (1)..(25) <223> D letter can be A or G. <400> 235 gcagaagcgg ggccdggtgg acaat 25 <210> 236 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 236 for typing HLA-DRB4 allele <400> 236 aacagtgacc tgggggagta ccagg 25 <210> 237 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe 237 for typing HLA-DRB5 allele <400> 237 gggacggagc gggtgcggtt cctgc 25 <210> 238 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer HLA-A-R for amplifying HLA-A allele <400> 238 tgttggtccc aattgtctcc cctc 24 <210> 239 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer HLA-B-R for amplifying HLA-B allele <400> 239 ggaggccatc cccggcgacc tat 23 <210> 240 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer HLA-DR-R for amplifying HLA-DRB1 allele <400> 240 acccmcctcc cwygtcacct cc 22 <210> 241 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer HLA-A-F for amplifying HLA-A allele <400> 241 gaaacsgcct ctgyggggag aagcaa 26 <210> 242 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer HLA-B-F for amplifying HLA-B allele <220> <221> variation <222> (1)..(22) <223> K letter can be G or C. <400> 242 gggaggagcg aggggacckc ag 22 <210> 243 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer HLA-DR-F1 for amplifying HLA-DRB1 allele <400> 243 cacgtttctt ggagtactct ac 22 <210> 244 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer HLA-DR-F2 for amplifying HLA-DRB1 allele <400> 244 accacgtttc ytgtggcag 19 <210> 245 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer HLA-DR-F3 for amplifying HLA-DRB1 allele <400> 245 gtttcttgga gcaggttaaa ca 22 <210> 246 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer HLA-DR-F4 for amplifying HLA-DRB1 allele <400> 246 cacgtttctt gaagcaggat aagtt 25 <210> 247 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer HLA-DR-F5 for amplifying HLA-DRB1 allele <400> 247 cacgtttctt ggaggaggtt aagtt 25

Claims

HLA 대립유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열목록 서열번호 1 내지 219에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탐침을 포함하는 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩.
제1항에 있어서,
HLA 대립유전자는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-DRB1인 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩.
제1항에 있어서, 탐침은
서열번호 1 내지 55에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-A 선별용 탐침;
서열번호 56 내지 149에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-B 선별용 탐침; 및
서열번호 150 내지 219에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-DRB1 선별용 탐침으로 이루어진 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩.
제1항에 있어서,
서열번호 220 내지 237에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA 대립유전자 양성 또는 음성 대조용 탐침을 더 포함하는 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩.
제4항에 있어서, 탐침은
서열번호 220 내지 223에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-A 양성 대조용 탐침 및 서열번호 224의 음성 대조용 탐침;
서열번호 225 내지 228에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-B 양성 대조용 탐침 및 서열번호 229의 음성 대조용 탐침; 및
서열번호 230 내지 233에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HLA-DRB1 양성 대조용 탐침 및 서열번호 234 내지 237에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 음성 대조용 탐침으로 이루어진 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩.
HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치가 3' 말단 부위에서 1 내지 2개의 염기 부위에 위치하도록 하여 22 내지 30개의 올리고뉴클레오타이드 탐침을 작제하는 단계를 포함하는 제1항의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 탐침은 5' 말단에 18개의 티민(dTTP), 6개의 CH₂ 사슬 및 아민(amine)기를 더 포함하는 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩의 제조방법.
제1항의 HLA 대립유전자 검출용 DNA 칩;
HLA 대립유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 238 내지 240에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안티센스 프라이머 및 서열번호 241 내지 247에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 센스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트;
중합연쇄반응에 의한 증폭산물을 단일가닥으로 분리하기 위한 람다 엑소뉴클레아제(lambda exonuclease);
분리된 단일가닥을 적정 길이로 절단하기 위한 탈인산화효소와 우라실 DNA 글리코실라제(uracil DNA glycosylase, UNG); 및
상기 DNA 칩과 결합된 증폭산물을 탐지할 수 있는 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드를 포함하는 HLA 대립유전자 선별키트.
제8항에 있어서, 프라이머 세트는
서열번호 238에 기재된 HLA-A, 서열번호 239에 기재된 HLA-B, 또는 서열번호 240에 기재된 HLA-DRB1에 대한 안티센스 프라이머; 및
서열번호 241에 기재된 HLA-A, 서열번호 242에 기재된 HLA-B, 또는 서열번호 243 내지 247에 기재된 서열 중 하나 이상의 HLA-DRB1에 대한 센스 프라이머로 이루어진 HLA 대립유전자 선별키트.
제8항에 있어서,
형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드는 텍사스 레드(Texas Red) ddATP, 시아닌 3(Cyanine 3) ddCTP, 시아닌5(Cyanine 5) ddGTP 및 플루오레세인-12(fluorescein-12) ddUTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질로 표지되는 HLA 대립유전자 선별키트.
서열번호 238 내지 240에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 안티센스 프라이머 및 서열번호 241 내지 247에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 센스 프라이머를 이용하여 시료에서 추출한 DNA를 대상으로 HLA 대립유전자 DNA를 증폭시키는 단계;
상기 증폭된 DNA를 단일가닥으로 분리하고, 적당한 길이로 절단하는 단계;
상기 절단된 DNA, 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드 및 중합효소를 제1항의 DNA 칩에 첨가하여 교잡 및 중합반응 시키는 단계; 및
중합된 탐침의 형광 시그널을 분석하는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 선별방법.
제11항에 있어서, 프라이머는
HLA-A에 대한 서열번호 238에 기재된 안티센스 프라이머 및 서열번호 241에 기재된 센스 프라이머;
HLA-B에 대한 서열번호 239에 기재된 안티센스 프라이머 및 서열번호 242에 기재된 센스 프라이머; 또는
HLA-DRB1에 대한 서열번호 240에 기재된 안티센스 프라이머 및 서열번호 243 내지 247에 기재된 서열 중 하나 이상의 센스 프라이머인 HLA 대립유전자의 선별방법.
제11항에 있어서,
증폭된 DNA는 람다 엑소뉴클레아제(lambda exonuclease)를 처리하여 단일가닥으로 분리하는 HLA 대립유전자의 선별방법.
제11항에 있어서,
분리된 단일가닥은 탈인산화효소(shrimp alkaline phosphatase)와 우라실 DNA 글리코실라제(uracil DNA glycosylase, UNG)를 순차적으로 처리하여 300 내지 500bp의 길이로 절단하는 HLA1 대립유전자의 선별방법.