KR20120004939A - 핵산의 존재비 측정 장치, 핵산의 존재비 측정 방법, 핵산의 존재비 측정 프로그램, 판정 방법, 및 핵산의 존재비 측정 키트 - Google Patents

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Abstract

[과제]간이하게 핵산의 존재비를 측정할 수 있는 핵산의 존재비 측정 장치, 핵산의 존재비 측정 방법, 핵산의 존재비 측정 프로그램, 판정 방법, 및 핵산의 존재비 측정 키트를 제공한다.
[해결 수단] 2 종류의 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각의 온도와 형광 강도의 미분값과의 관계를 나타내는 미분 융해 곡선에 의거하여, 각각 다른 크기의 융해 온도(TmW 및 TmM)를 포함하는 2개의 온도 범위(ΔTW 및 ΔTM) 내에 있어서의 미분 융해 곡선과 베이스값을 나타내는 직선으로 둘러싸인 부분의 면적비(SM/SW)와 2 종류의 핵산의 존재비와의 관계를 나타내는 검량선을 메모리(26)에 기억해 둔다. 측정 대상의 핵산 혼합물의 미분 융해 곡선의 2개의 온도 범위(ΔT’W 및 ΔT’M) 내에 있어서의 미분 융해 곡선과 베이스값을 나타내는 직선으로 둘러싸인 부분의 면적비(S’M/S’W)를 연산하고, 연산된 면적비와 검량선에 의거하여 핵산의 존재비를 연산함으로써, 검체의 핵산의 존재비를 측정한다.

Description

핵산의 존재비 측정 장치, 핵산의 존재비 측정 방법, 핵산의 존재비 측정 프로그램, 판정 방법, 및 핵산의 존재비 측정 키트 {NUCLEIC ACID ABUNDANCE RATIO MEASUREMENT DEVICE, METHOD AND PROGRAM STORAGE MEDIUM, DETERMINATION METHOD, AND NECLEIC ACID ABUNDANCE RATIO MEASUREMENT KIT}
본 발명은, 핵산의 존재비 측정 장치, 핵산의 존재비 측정 방법, 핵산의 존재비 측정 프로그램, 판정 방법, 및 핵산의 존재비 측정 키트에 관한 것이다.
종래, 각 온도에 있어서의 샘플의 시그널 값을 나타내는 융해 곡선의 시그널 값을 미분한 시그널 미분값과, 온도와의 관계로 나타내어진, 미분 융해 곡선으로 나타내어진 곡선으로부터, 다른 2개의 피크의 유무 및 그 온도 범위를 판정함으로써, 유전자의 다형(多型)의 형(型)을 판별하는 융해 곡선 해석 방법 및 융해 곡선 해석 장치가 제안되어 있다(예를 들면 특허문헌 1 참조).
국제공개 제2009/081965호 팜플릿
그러나, 특허문헌 1의 기술에서는, 유전자의 다형의 형을 자동적으로 판별하는 것은 가능해도, 그 유전자의 변이의 비율을 얻을 수는 없다는 문제가 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 간이하게 핵산의 존재비를 연산함으로써 핵산의 존재비를 측정할 수 있는 핵산의 존재비 측정 장치, 핵산의 존재비 측정 방법, 핵산의 존재비 측정 프로그램, 판정 방법, 및 핵산의 존재비 측정 키트를 제공함을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치는, 1 이상의 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호를, 다른 온도 범위 내에 있어서 검출하는 검출 수단과, 상기 검출 수단에 의해 검출된 검출 신호로부터 얻어지는 특징량(特徵量)의 비와 검량(檢量) 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 수단을 포함하여 구성되어 있다. 검량 정보란, 특징량의 비와 핵산의 존재비와의 관계를 나타내는 정보이며, 예를 들면 특징량의 비와 핵산의 존재비와의 관계를 나타내는 검량선, 표, 계산식 등이다.
본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치에 의하면, 검출 수단이, 1 이상의 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호를, 다른 온도 범위 내에 있어서 검출한다. 그리고, 존재비 연산 수단이, 검출 수단에 의해 검출된 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산함으로써 검체(측정 대상의 핵산 혼합물) 중의 핵산의 존재비를 측정한다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 각각 다른 융해 온도를 갖는 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각으로부터 얻어진 온도와 검출 신호와의 관계를 나타내는 융해 곡선에 의거하여, 상기 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내에 있어서의 상기 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 상기 존재비와의 관계를 나타내는 검량 정보를 기억한 기억 수단, 또는 상기 검량 정보를 입력하기 위한 입력 수단을 포함하여 구성할 수 있다.
이러한 형태에 의하면, 기억 수단에, 각각 다른 융해 온도를 갖는 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각으로부터 얻어진 온도와 검출 신호와의 관계를 나타내는 융해 곡선에 의거하여, 각각 다른 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내에 있어서의 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 존재비와의 관계를 나타내는 검량 정보가 기억되어 있다. 또는, 이 검량 정보가 입력 수단에 의해 입력된다. 그리고, 측정 대상의 핵산 혼합물의 융해 곡선의 복수의 온도 범위의 각각에 대응하는 온도 범위 내에 있어서의, 융해 곡선의 검출 신호에 의거하여 특징량의 비를 연산하고, 연산된 특징량의 비와 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산함으로써 검체 중의 핵산의 존재비를 측정한다.
이와 같이, 복수의 핵산의 존재비와, 각 핵산의 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내의 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와의 관계를 나타내는 검량 정보와, 측정 대상의 핵산 혼합물의 복수의 온도 범위의 각각에 대응하는 온도 범위 내의 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비에 의거하여 간이하게 핵산의 존재비를 연산함으로써 검체 중의 핵산의 존재비를 측정할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 특징량의 비를, 하나의 융해 온도 부근(융해 온도에 대략 상당한다)에 있어서의 검출 신호의 레벨로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값과, 다른 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호의 레벨로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값과의 비, 하나의 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호의 미분값으로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값과, 다른 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호의 미분값으로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값과의 비, 하나의 온도 범위 내의 검출 신호의 미분값의 합과 다른 온도 범위 내의 검출 신호의 미분값의 합과의 비, 또는 하나의 온도 범위 내의 검출 신호의 미분값의 합으로부터 백그라운드 레벨의 합을 감산한 값과, 다른 온도 범위 내의 검출 신호의 미분값의 합으로부터 백그라운드 레벨의 합을 감산한 값과의 비로 할 수 있다.
융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호로는, 본래는 융해 온도에 있어서의 검출 신호를 사용하는 것이 바람직하지만, 시약 조건(검체의 상태)이나 사이클 수에 따라 생기는 융해 온도의 변동이나, 측정 장치의 검출 감도(예를 들면 1℃ 단위로 측정)에 의해 생기는 오차를 고려하여, 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호를 사용하는 것을 의미하는 것이다. 또, 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호에는, 융해 온도에 있어서의 검출 신호가 포함된다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 특징량의 비를, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서, 하나의 온도 범위의 하한값에 대응하는 점과 상기 하나의 온도 범위의 상한값에 대응하는 점을 지나는 직선과 융해 곡선으로 둘러싸인 부분의 면적과, 다른 온도 범위의 하한값에 대응하는 점과 상기 다른 온도 범위의 상한값에 대응하는 점을 지나는 직선과 융해 곡선으로 둘러싸인 부분의 면적과의 비로 할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 온도 범위의 상한값 또는 하한값을, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 2개의 피크 사이에서 검출 신호의 미분값이 최소가 되는 온도, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 피크의 발치(foot of peak)에 대응하는 온도, 또는 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 피크로부터 ±15℃ 이내의 온도로 할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 온도 범위의 상한값 또는 하한값을, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 피크로부터 ±10℃ 이내의 온도로 할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 온도 범위의 상한값 또는 하한값을, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 피크로부터 ±7℃ 이내의 온도로 할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 하나의 온도 범위의 상한값과, 상기 하나의 온도 범위보다 높은 온도 범위를 함유하는 온도 범위의 하한값을, 다른 값으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 하나의 온도 범위의 하한값으로부터 상한값까지의 폭과, 상기 다른 온도 범위의 하한값으로부터 상한값까지의 폭을, 동일한 폭으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 하나의 온도 범위의 하한값으로부터 상한값까지의 폭과, 상기 다른 온도 범위의 하한값으로부터 상한값까지의 폭을, 다른 폭으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 다른 형태는, 상기 핵산 혼합물의 온도 변화를 제어하는 온도 제어 수단과, 상기 검출 신호로서 흡광도, 형광 강도, 또는 상대 형광 강도를 계측하는 계측 수단을 더 포함하여 구성할 수 있다. 이 구성에 의해, 검체로부터 계측한 검출 신호를 사용하여, 검체 중의 핵산의 존재비를 측정할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 방법은, 1 이상의 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호를, 다른 온도 범위 내에 있어서 검출하는 검출 공정과, 상기 검출 공정에 있어서 검출된 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 공정을 포함하는 방법이다.
본 발명의 핵산의 존재비 측정 방법에 의하면, 검출 공정에서, 1 이상의 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호를, 다른 온도 범위 내에 있어서 검출한다. 그리고, 존재비 연산 공정에서, 검출 공정에 있어서 검출된 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산함으로써 검체 중의 핵산의 존재비를 측정한다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 방법의 다른 형태는, 각각 다른 융해 온도를 갖는 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각으로부터 얻어진 온도와 검출 신호와의 관계를 나타내는 융해 곡선에 의거하여, 상기 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내에 있어서의 상기 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 상기 존재비와의 관계를 나타내는 검량 정보를 작성하는 검량 정보 작성 공정과, 측정 대상의 핵산 혼합물의 융해 곡선의 상기 복수의 온도 범위의 각각에 대응하는 온도 범위 내에 있어서의 융해 곡선의 검출 신호에 의거하여 특징량의 비를 연산하는 특징량비 연산 공정과, 상기 특징량비 연산 공정에 있어서 연산된 특징량의 비와 상기 검량 정보 작성 공정에 있어서 작성된 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 공정을 포함하는 방법이어도 된다. 이들 공정을 거쳐 핵산의 존재비를 연산함으로써 핵산의 존재비를 측정할 수 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 프로그램은, 컴퓨터를, 1 이상의 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호로서, 다른 온도 범위 내에 있어서 검출된 검출 신호를 취입(取入)하고, 취입한 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 수단으로서 기능시킴으로써, 컴퓨터에 검체 중의 핵산의 존재비를 측정시키기 위한 프로그램이다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 프로그램의 다른 형태는, 컴퓨터를, 각각 다른 융해 온도를 갖는 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각으로부터 얻어진 온도와 검출 신호와의 관계를 나타내는 융해 곡선에 의거하여, 상기 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내에 있어서의 상기 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 상기 존재비와의 관계를 나타내는 검량 정보가 기억된 기억 수단으로부터 상기 검량 정보를 취득하거나, 또는 입력 수단에 의해 입력되는 상기 검량 정보를 취득하는 취득 수단, 측정 대상의 핵산 혼합물의 융해 곡선의 상기 복수의 온도 범위의 각각에 대응하는 온도 범위 내에 있어서의 융해 곡선의 검출 신호에 의거하여, 특징량의 비를 연산하는 특징량비 연산 수단, 및 상기 특징량비 연산 수단에 의해 연산된 특징량의 비와 상기 취득 수단에 의해 취득된 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 수단으로서 기능시킬 수도 있다. 이에 따라, 컴퓨터에 검체 중의 핵산의 존재비를 측정시킬 수 있다. 또한 본 발명의 핵산 존재비 측정 프로그램의 다른 형태로서, 상기 컴퓨터를, 상기 검출 신호나 일부의 연산을 다른 컴퓨터에서 실행시키기 위한 제어 수단으로서 기능시킬 수 있다.
또한 본 발명의 판정 방법은, 상기의 핵산의 존재비 측정 장치, 상기의 핵산의 존재비 측정 방법, 또는 상기의 핵산의 존재비 측정 프로그램을 사용하여 얻어지는 핵산의 존재비와, 미리 정한 핵산의 존재비와 환자의 상태와의 관계에 의거하여, 환자의 상태를 판정하는 방법이다.
또한 본 발명의 판정 방법은, 상기의 핵산의 존재비 측정 장치, 상기의 핵산의 존재비 측정 방법, 또는 상기의 핵산의 존재비 측정 프로그램을 사용하여 얻어지는 핵산의 존재비와, 미리 정한 핵산의 존재비와 체질 및 체질에 적합한 약제 처방량 중 적어도 일방과의 관계에 의거하여, 체질 및 체질에 적합한 약제 처방량 중 적어도 일방을 판정하는 방법이다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 키트는, 상기의 핵산의 존재비 측정 장치, 상기의 핵산의 존재비 측정 방법, 또는 상기의 핵산의 존재비 측정 프로그램에 있어서, 상기 핵산의 존재비를 측정할 때에 사용되고, 상기 핵산 혼합물 중의 핵산에 존재할 수 있는 표적으로 하는 변이를 포함하는 핵산 서열의 영역에 하이브리다이즈 가능한 프로브와, 상기 핵산 혼합물 중의 핵산에 존재할 수 있는 표적으로 하는 변이를 포함하는 핵산 서열을 증폭 가능한 프라이머 세트를 포함하는, 핵산의 존재비 측정 키트이다. 또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 키트를, 미리 정한 핵산의 존재비와, 체질 및 체질에 적합한 약제 처방량 중 적어도 일방과의 관계에 의거하여, 체질 및 체질에 적합한 약제 처방량 중 적어도 일방을 판정하기 위하여 사용할 수도 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치는, 복수의 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각의 온도와 검출 신호와의 관계를 나타내는 융해 곡선에 의거하여, 각각 다른 크기의 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내에 있어서의 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 상기 존재비와의 관계를 나타내는 검량 정보를 기억한 기억 수단과, 측정 대상의 핵산 혼합물의 융해 곡선의 상기 복수의 온도 범위의 각각에 대응하는 온도 범위 내에 있어서의 융해 곡선의 검출 신호에 의거하여, 특징량의 비를 연산하는 특징량비 연산 수단과, 상기 특징량비 연산 수단에 의해 연산된 특징량의 비와 상기 기억 수단에 기억된 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 수단을 포함하여 구성해도 된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치, 핵산의 존재비 측정 방법, 및 핵산의 존재비 측정 프로그램에 의하면, 다른 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 검량 정보에 의거하여, 간이하게 핵산의 존재비를 연산함으로써 검체 중의 핵산의 존재비를 측정할 수 있다는 효과를 얻을 수 있다.
또한 본 발명의 판정 방법 및 판정 키트에 의하면, 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치, 핵산의 존재비 측정 방법, 또는 핵산의 존재비 측정 프로그램에 의해 얻어진 핵산의 존재비를 사용하여, 환자의 상태를 판정할 수 있다는 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 실시 형태의 핵산의 존재비 측정 장치의 구성을 나타내는 블럭도.
도 2는 (A) 핵산 혼합물의 융해 곡선, 및 (B) 미분 융해 곡선의 일례를 나타내는 도면.
도 3은 미분 융해 곡선의 다른 예를 나타내는 도면.
도 4는 검량선의 일례를 나타내는 도면.
도 5는 본 실시 형태의 핵산의 존재비 측정 장치에 있어서의 핵산의 존재비 측정 처리 루틴의 내용을 나타내는 플로우차트.
도 6은 실시예에 있어서의 핵산 혼합물의 각 샘플의 미분 융해 곡선을 나타내는 도면.
도 7은 실시예에 있어서의 측정 대상의 핵산 혼합물의 융해 곡선을 나타내는 도면.
도 8은 실시예에 있어서의 측정 대상의 핵산 혼합물의 미분 융해 곡선을 나타내는 도면.
도 9는 핵산 혼합물의 (A) 융해 곡선 및 (B) 미분 융해 곡선의 다른 예를 나타내는 도면.
도 10은 특징량(特徵量)의 비의 다른 예에 관하여 설명하기 위한 도면.
도 11은 미분 융해 곡선에 있어서 2개의 온도 범위가 분리되어 있는 예를 나타내는 도면.
도 12는 미분 융해 곡선에 있어서 베이스값이 일탈하여 있는 예를 나타내는 도면.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 핵산의 존재비 측정 장치의 실시 형태를 상세하게 설명한다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 본 실시 형태의 핵산의 존재비 측정 장치(10)는, 키보드, 마우스, 터치 패널, 바코드 리더 등의 독취(讀取) 장치로 구성되며, 또한 조작함으로써 각종 정보를 입력하기 위한 조작부(12), 핵산의 존재비의 측정 결과를 표시하기 위한 표시부(14), 및 핵산의 존재비의 측정 처리를 실행하는 컴퓨터(16)를 구비하고 있다.
컴퓨터(16)는, 핵산의 존재비 측정 장치(10) 전체의 제어를 담당하는 CPU(20), 후술하는 핵산의 존재비 측정 처리 등의 각종 프로그램을 기억한 기억 매체로서의 ROM(22), 작업 영역(work area)으로서 데이터를 일시적으로 격납(格納)하는 RAM(24), 각종 정보가 기억된 기억 수단으로서의 메모리(26), 입출력 포트(I/O 포트)(28), 네트워크 인터페이스(네트워크 I/F)(30), 및 이들을 접속하는 버스를 포함하여 구성되어 있다. I/O 포트(28)에는, 조작부(12) 및 표시부(14)가 접속되어 있다. 또, HDD를 더 설치해도 된다.
또한 메모리(26)에는, 2 종류의 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각의 융해 곡선에 의거하여, 각각 다른 크기의 융해 온도를 포함하는 2개의 온도 범위 내에 있어서의, 융해 곡선의 검출 신호의 미분값의 합으로부터 백그라운드 레벨의 합을 감산한 값의 비와, 2 종류의 핵산의 존재비와의 관계를 나타내는 검량선이 기억되어 있다. 또, 검량선은, ROM(22) 또는 HDD에 기억해 두어도 된다. 또한 본 실시 형태에서는, 기억해 둔 검량선을 연산 전에 사전에 읽어내는 경우에 관하여 설명하지만, 바코드 리더로 검량선의 정보를 포함한 바코드를 읽어내거나, 각종 독취 장치로 IC칩이나 RFID에 기록된 검량선의 정보를 읽어내거나 하는 등, 검량선의 정보를 조작부(12)로부터 입력해도 되고, 검량선의 정보를 I/O 포트(28)나 네트워크 I/F(30)를 통해 접속된 외부 장치로부터 수신하도록 해도 된다.
여기에서, 검량선의 작성 방법에 관하여 설명한다.
우선, 예를 들면 와일드형의 핵산 Wt와 뮤탄트형의 핵산 Mt와의 2 종류의 핵산의 존재비를 각각 달리 한 복수의 핵산 혼합물을 제작하고, 복수의 핵산 혼합물의 각각에 대하여, 융해 곡선 해석 장치를 사용하여 융해 곡선을 얻는다.
도 2(A)에, 어느 하나의 핵산 혼합물의 온도와, 흡광도 또는 형광 강도 등의 검출 신호와의 관계로 나타내어진 융해 곡선, 및 동도 (B)에 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계로 나타내어진 융해 곡선(미분 융해 곡선이라고도 한다)을 나타낸다. 이 미분 융해 곡선으로부터 피크를 검출함으로써, 핵산 Wt의 융해 온도 TmW 및 핵산 Mt의 융해 온도 TmM을 검출하고, TmW 및 TmM을 포함하는 온도 범위의 각각을 설정한다. TmW를 포함하는 온도 범위 ΔTW로서는, 예를 들면 TmW와 TmM과의 사이에서 검출 신호의 미분값이 최소가 되는 온도를 하한, 검출 신호의 피크의 발치에 대응하는 온도를 상한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다. 또한 TmM을 포함하는 온도 범위 ΔTM으로서는, 예를 들면 TmW와 TmM과의 사이에서 검출 신호의 미분값이 최소가 되는 온도를 상한, 검출 신호의 피크의 발치에 대응하는 온도를 하한으로 하는 온도 범위를 설정할 수 있다. 또, 온도 범위 ΔTW 및 온도 범위 ΔTM은, 도 2(B)에 나타내는 바와 같이 동일한 폭(예를 들면 10℃)이 되도록, 또는, 도 3에 나타내는 바와 같이 다른 폭(예를 들면 온도 범위 ΔTW가 7℃, 온도 범위 ΔTM이 16℃)이 되도록 설정할 수 있다. 또한 온도 범위 ΔTW 및 온도 범위 ΔTM은, 각각의 융해 온도 Tm으로부터 플러스 X℃、마이너스 X℃의 폭(X℃는 예를 들면 15℃ 이내, 바람직하게는 10℃ 이내, 보다 바람직하게는 7℃ 이내)으로 하도록 설정할 수 있다. 이러한 온도 범위의 설정을 자동적으로 행하는 것은 용이하다.
다음으로, 온도 범위 ΔTW 및 온도 범위 ΔTM의 각각에 대하여, 미분 융해 곡선의 온도 범위의 하한에 대응하는 점과 상한에 대응하는 점을 지나는 직선과, 미분 융해 곡선으로 둘러싸인 면적(도 2(B)의 사선 부분)을 구한다. 면적을 구하는 방법의 일례로서, 구체적으로 이하와 같이 구할 수 있다. 온도 T에 있어서의 검출 신호의 미분값을 f(T)라고 하고, 온도 T에 있어서의 베이스값을 B(T)라고 하여, 하기 (1)식에 의해 구한다.
면적 S = {f(Ts +1)-B(Ts +1)} + {f(Ts +2)-B(Ts +2)}
+…+ {f(Te -1)-B(Te -1)} …(1)
단, Ts는 각 온도 범위에 있어서의 하한값, Te는 상한값이다. 또한 각 온도 T에 있어서의 베이스값 B(T)는, 하기 (2)식에 의해 구하는 값이며, 검출 신호에 포함되는 백그라운드 레벨을 나타내는 것이다. 이 베이스값을 검출 신호의 미분값으로부터 감산함으로써, 검출 신호에 포함되는 백그라운드의 영향을, 보다 적절히 제거할 수 있다.
B(T) = a × (T-Ts) + f(Ts) …(2)
단, a = {f(Te)-f(Ts)} / (Te-Ts) 이다.
상기 (1)식 및 (2)식에 따라, 각 핵산 혼합물에 대하여, 온도 범위 ΔTW에 있어서의 면적 SW 및 온도 범위 ΔTM에 있어서의 면적 SM을 구하고, 면적비와 각 핵산 혼합물의 존재비와의 관계를 나타내는 검량선을 작성한다. 도 4에, 횡축에 존재비(핵산 혼합물의 총량에 대한 핵산 Mt의 비율)를 잡고, 종축에 면적비(SM/SW)를 잡은 검량선의 일례를 나타낸다. 이와 같이 작성된 검량선을 메모리(26)에 기억해 둔다. 또, 면적비는 SW/SM으로 정해도 된다.
다음으로, 도 5를 참조하여, 본 실시 형태의 핵산의 존재비 측정 장치(10)에 있어서 실행되는, 측정 대상의 핵산 혼합물에 대한 핵산의 존재비 측정 처리 루틴에 관하여 설명한다.
스텝(100)에서, 메모리(26)에 기억된 검량선을 읽어들인다.
다음으로, 스텝(102)에서, 2 종류의 핵산의 존재비가 미지인 검체(측정 대상의 핵산 혼합물)의 융해 곡선의 데이터를 취득한다. 융해 곡선의 데이터는, 네트워크 I/F(30)를 통해 접속된 융해 곡선 해석 장치 등의 외부 장치로부터 취득하거나, 기록 매체에 기록된 데이터를 읽어들이거나 함으로써 취득할 수 있다.
다음으로, 스텝(104)에서, 상기 스텝(102)에서 취득한 융해 곡선의 검출 신호를 온도에 관하여 미분하여, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 미분 융해 곡선을 연산한다.
다음으로, 스텝(106)에서, 상기 스텝(104)에서 연산한 미분 융해 곡선에 대하여, 상기 스텝(100)에서 읽어들인 검량선을 작성한 때에 설정한 온도 범위 ΔTW 및 ΔTM의 각각에 대응한 온도 범위 ΔT’W 및 ΔT’M을 설정한다. 또, 온도 범위 ΔT’W 및 ΔT’M은, 검량선을 작성한 때에 설정한 온도 범위 ΔTW 및 ΔTM과 동일한 온도 범위를 설정해도 되고, 온도 범위 ΔTW 및 ΔTM에 근사한 온도 범위를 설정해도 된다.
그리고, 온도 범위 ΔT’W 및 온도 범위 ΔT’M의 각각에 대하여, 미분 융해 곡선의 온도 범위의 하한에 대응하는 점과 상한에 대응하는 점을 지나는 직선과, 미분 융해 곡선으로 둘러싸인 면적을 구한다. 구체적으로는, (1)식 및 (2)식에 따라, 검량선을 작성할 때에 각 온도 범위에 있어서의 면적을 연산한 것과 같은 수법에 의해, 온도 범위 ΔT’W에 있어서의 면적 S’W 및 온도 범위 ΔT’M에 있어서의 면적 S’M을 연산한다.
다음으로, 스텝(108)에서, 상기 스텝(106)에서 연산한 면적 S’W 및 S’M을 사용하여, 면적비 S’M/S’W를 연산한다.
다음으로, 스텝(110)에서, 상기 스텝(108)에서 연산한 면적비 S’M/S’W와 상기 스텝(100)에서 읽어들인 검량선에 의거하여, 면적비 S’M/S’W에 대응하는 핵산의 존재비를 연산함으로써 검체의 핵산의 존재비를 측정한다. 즉, 검체의 변이의 비율을 측정한다.
다음으로, 스텝(112)에서, 상기 스텝(110)에서의 측정 결과가 표시부(14)에 표시되도록, 측정 결과를 출력하여 처리를 종료한다.
또, 상기 루틴에서는, 스텝(102)에 있어서, 융해 곡선을 취득하기 전에 검량선의 사전의 읽어들임을 행하고 있지만(스텝(100)), 검량선의 읽어들임은, 스텝(110)에 있어서, 면적비 및 검량선에 의거하여 핵산의 존재비(변이의 비율)를 측정하기 전이면, 어느 단계에서 행해도 된다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 실시 형태의 핵산의 존재비 측정 장치에 의하면, 2 종류의 핵산의 존재비와 각 핵산의 융해 온도를 포함하는 2개의 온도 범위 내의 미분 융해 곡선으로부터 얻어지는 면적비와의 관계를 나타내는 검량선과, 존재비가 미지인 측정 대상의 핵산 혼합물의 미분 융해 곡선의 2개의 온도 범위의 각각에 대응하는 온도 범위 내의 미분 융해 곡선으로부터 얻어지는 면적비에 의거하여, 간이하게 검체의 핵산의 존재비를 연산함으로써 간이하게 검체의 핵산의 존재비를 측정할 수 있다. 즉, 간이하게 검체의 변이의 비율을 측정할 수 있다.
[실시예 1]
c-kit 유전자의 부분 서열을 측정 대상의 핵산으로서 사용하여, 본 발명의 일 실시예를 이하에 설명한다.
샘플로서 표 3에 나타내는 핵산 혼합물의 샘플(103 카피/반응액)을 사용하고, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm 분석을 행했다. PCR 반응액 조성은 표 1과 같고, PCR 및 Tm 분석의 조건은 표 4와 같다.
[표 1]
Figure pat00001
[표 2]
Figure pat00002
[표 3]
Figure pat00003
플라스미드로는, pT7Blue T-vector(다카라바이오사)에 하기에 나타내는 서열(Wt 서열: 서열 번호 4, Mt 서열: 서열 번호 5)을 삽입하여, EcoRI로 리니어라이즈한 것을 사용했다. Wt 서열과 Mt 서열은, 대문자로 나타낸 염기가 다르다. Wt 서열을 삽입한 플라스미드를 Wt 플라스미드, Mt 서열을 삽입한 플라스미드를 Mt 플라스미드라고 한다.
Wt 서열:
cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtcggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagAcatcaagaatgattctaattatgtggttaaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttcgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat
Mt 서열:
cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttctcctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtcggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagTcatcaagaatgattctaattatgtggttaaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttcgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat
[표 4]
Figure pat00004
도 6에, 상기 조건에 의해 측정한 각 샘플의 미분 융해 곡선을 나타낸다. 본 실시예에서는, 검출 신호로서 형광 강도가 얻어진다. 도 6의 미분 융해 곡선으로부터 피크를 검출하여 각 핵산의 융해 온도 TmW 및 TmM을 구하고, 구한 융해 온도를 포함하는 온도 범위 ΔTW(58℃∼66℃), 온도 범위 ΔTM(50℃∼58℃)을 설정했다. 그리고, 각 샘플에 대하여, 상기 (1)식 및 (2)식에 따라, 온도 범위 ΔTW에 있어서의 면적 SW 및 온도 범위 ΔTW에 있어서의 면적 SM을 구하여, 면적비 SM/SW를 구했다. 표 5에, 각 샘플의 면적 SM 및 SW, 및 면적비 SM/SW를 나타낸다.
[표 5]
Figure pat00005
표 5에 나타낸 각 값에 의거하여, 횡축에 샘플의 총량에 대한 Mt의 비율을 잡고, 종축에 면적비 SM/SW를 잡은 검량선을 작성했다. 여기에서 작성한 검량선은, 도 4에 일례로 나타낸 검량선과 동일하다.
다음으로, 이 검량선을 사용하여, Wt와 Mt와의 존재비가 미지인 측정 대상의 핵산 혼합물의 핵산의 존재비를 측정했다.
우선, 도 7에 나타내는 측정 대상의 핵산 혼합물의 온도와 형광 강도와의 관계를 나타내는 융해 곡선의 데이터를 취득하고(스텝(102)), 도 8에 나타내는 바와 같이 융해 곡선의 형광 강도를 미분하여, 온도와 형광 강도의 미분값과의 관계를 나타내는 미분 융해 곡선을 연산했다(스텝(104)).
다음으로, 연산한 미분 융해 곡선에 대하여, 도 4의 검량선을 작성한 때에 설정한 온도 범위 ΔTW(58℃∼66℃), 온도 범위 ΔTM(50℃∼58℃)과 같은 온도 범위 ΔT’W 및 온도 범위 ΔT’M을 설정하여, (1)식 및 (2)식에 따라, 온도 범위 ΔT’W에 있어서의 면적 S’W, 및 온도 범위 ΔT’M에 있어서의 면적 S’M을 연산했다(스텝(106)). 여기에서는, S’W=730, 면적 S’M=241.5가 얻어졌다.
다음으로, 연산한 면적 S’W 및 S’M을 사용하여, 면적비 S’M/S’W를 연산했다(스텝(108)). 여기에서는, S’M/S’W=0.331(33.1%)이 얻어졌다.
다음으로, 도 4의 검량선에 있어서, 면적비 S’M/S’W(= 33.1%)에 대응하는 Mt의 비율, 즉 변이의 비율을 연산함으로써 변이의 비율을 측정했다(스텝(110)). 여기에서는, Mt의 비율이 40∼50%의 사이가 되었다.
또, 상기 실시예에서는, 융해 상태를 나타내는 검출 신호로서, 형광을 발하는 프로브를 사용하여, 형광 물질에 따른 여기광에 의해 방사되는 형광의 강도를 사용하는 경우에 관하여 설명했지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면 이중 가닥 핵산의 융해에 의해 증가하는, 260nm에 있어서의 흡광도를 사용해도 된다. 또한 상기 실시예에서는, 이중 가닥의 형성(비융해)시에 소광하는 프로브를 사용하는 경우에 관하여 설명했지만, 이중 가닥의 형성시에 형광을 발하는 프로브를 사용해도 된다. 그 경우, 도 9(A)에 나타내는 바와 같은 온도와 형광 강도와의 관계를 나타내는 융해 곡선이 얻어지고, 이로부터 동도 (B)에 나타내는 바와 같은 미분 융해 곡선이 얻어진다.
형광 물질의 구체예로서는, 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide)나 SYBR(등록상표) Green과 같은 인터컬레이터를 들 수 있다. 이들은, 일반적으로, 이중 가닥의 형성에 의해 형광을 발하고, 이중 가닥의 융해에 의해 형광의 발생이 억제된다. 또한 형광 물질은, 예를 들면 이중 가닥 핵산을 구성하는 적어도 일방의 단일 가닥 핵산에 결합해도 된다. 형광 물질이 결합한 단일 가닥 핵산으로서는, 예를 들면 본 실시예에서 사용한, 구아닌 소광 프로브로서 알려져 있는 Q Probe(등록상표)와 같은 소위 형광 소광 프로브를 들 수 있다. 형광 소광 프로브는, 일반적으로, 이중 가닥의 형성에 의해 형광이 소광하고, 이중 가닥의 융해에 의해 형광을 발생한다.
또한 본 발명에 있어서의 핵산 혼합물의 융해 상태를 나타내는 검출 신호는, 상술한 바와 같이, 예를 들면 샘플의 비융해에 의해 발생하고, 샘플의 융해에 의해 발생이 억제되는 것이어도 되고, 반대로, 샘플의 비융해에 의해 발생이 억제되고, 샘플의 융해에 의해 발생하는 것이어도 된다. 또한 검출 신호의 미분값은, 예를 들면 온도에 관하여 검출 신호를 미분하여 「dF/dT」로 나타내도 되고, 「-dF/dT」로 나타내도 된다. dF는 검출 신호의 변화량, dT는 온도의 변화량이다. 샘플의 융해에 의해 검출 신호의 발생이 억제되는 경우, 검출 신호의 미분값을 「dF/dT」로 나타낸 미분 융해 곡선에 있어서, 피크는 곡형(谷型)이 되고, 검출 신호의 미분값을 「-dF/dT」로 나타낸 미분 융해 곡선에 있어서, 피크는 산형(山型)이 된다. 또한 샘플의 융해에 의해 검출 신호를 발생하는 경우, 검출 신호의 미분값을 「dF/dT」로 나타낸 미분 융해 곡선에 있어서, 피크는 산형이 되고, 검출 신호의 미분값을 「-dF/dT」로 나타낸 미분 융해 곡선에 있어서, 피크는 곡형이 된다. 어느 경우도, 소정의 온도 범위에 있어서의 미분 융해 곡선과 베이스값을 나타내는 직선으로 둘러싸인 부분의 면적을 구할 수 있다. 또한 검출 신호의 미분값은, 온도에 관하여 검출 신호를 미분한 미분값에 한하지 않고, 시간에 관하여 검출 신호를 미분한 미분값을 사용해도 된다.
또한 상기 실시 형태 및 실시예에서는, 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비로서, 상기의 면적비를 사용하는 경우에 관하여 설명했지만, 이에 한정되지 않는다. 특징량의 비로서, 도 10(A)에 나타내는 바와 같이 융해 온도 TmW에 있어서의 검출 신호의 레벨 FW와, 융해 온도 TmM에 있어서의 검출 신호의 레벨 FM과의 비(FM/FW)를 사용해도 된다. 또한 온도 범위 ΔTW의 하한값에 있어서의 검출 신호의 레벨과, 상한값에 있어서의 검출 신호의 레벨과의 차이 ΔFW와, 온도 범위 ΔTM의 하한값에 있어서의 검출 신호의 레벨과, 상한값에 있어서의 검출 신호의 레벨과의 차이 ΔFM과의 비(ΔFM/ΔFW)를 사용해도 된다. 또한 융해 온도 TmW에 있어서의 검출 신호의 레벨로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값 (F-B)W와, 융해 온도 TmM에 있어서의 검출 신호의 레벨로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값 (F-B)M과의 비 ((F-B)M/(F-B)W)를 사용해도 된다.
또한 동도 (B)에 나타내는 바와 같이, 융해 온도 TmW에 있어서의 검출 신호의 미분값 fW와 융해 온도 TmM에 있어서의 검출 신호의 미분값 fM과의 비(fM/fW)를 사용해도 된다. 또한 온도 범위 ΔTW의 검출 신호의 미분값의 합 ΣfW(동도 중 우하향 사선부의 면적에 상당)와, 온도 범위 ΔTM의 검출 신호의 미분값의 합 ΣfM(동도 중 우상향 사선부의 면적에 상당)과의 비(ΣfM/ΣfW)를 사용해도 된다. 또한 융해 온도 TmW에 있어서의 검출 신호의 미분값으로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값 (f-B)W와, 융해 온도 TmM에 있어서의 검출 신호의 미분값으로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값 (f-B)M과의 비 ((f-B)M/(f-B)W)를 사용해도 된다. (f-B)W는, 온도 범위 ΔTW의 하한값에 대응하는 점과 상한값에 대응하는 점을 지나는 직선상의 융해 온도 TmW에 대응하는 값을, fW로부터 빼서 구할 수 있다. (f-B)M에 관해서도 마찬가지로, 온도 범위 ΔTM의 하한값에 대응하는 점과 상한값에 대응하는 점을 지나는 직선상의 융해 온도 TmM에 대응하는 값을, fM으로부터 빼서 구할 수 있다.
또한 상기 실시예에서는, 1 염기만이 다른 핵산의 존재비를 측정하고 있지만, 목적으로 하는 각각의 핵산의 융해 온도가 다른 것이면, 상동성은 특별하게 한정되는 것은 아니며, 상동성이 전혀 없어도 된다. 예를 들면 융해 온도가 다르고, 또한 상동성이 없는 유전자 A와 유전자 B와의 핵산 혼합물에 대하여, 유전자 A와 유전자 B와의 존재비를 측정할 수 있다.
또한 상기 실시예에서는, 각각의 핵산에 대하여 같은 프로브를 사용하여 검출하고 있지만, 다른 프로브를 사용해도 된다.
또한 상기 실시 형태 및 실시예에서는, 핵산의 각각의 융해 온도를 포함하는 온도 범위(ΔTW 및 ΔTM)가 연속하고 있는 경우에 관하여 설명했지만, 도 11에 나타내는 바와 같이 융해 온도가 분리되어 있는 경우 등에는, 온도 범위도 비연속인 범위로 설정할 수 있다.
또한 상기 실시 형태 및 실시예에서는, 백그라운드 레벨을 감산하기 위한 베이스값을, 미분 융해 곡선에 있어서의 온도 범위의 하한값에 대응하는 점과 상한값에 대응하는 점을 지나는 직선상의 값으로 하는 경우에 관하여 설명했지만, 예를 들면 베이스값을, 온도 범위의 상한값 또는 하한값에 대응하는 검출 신호의 미분값으로 일정하게 해도 된다. 단, 도 12에 나타내는 바와 같이, 온도 범위의 하한값에 대응하는 검출 신호의 미분값과, 상한값에 대응하는 검출 신호의 미분값과의 차이가 큰 경우(베이스값에 소정량 이상의 일탈이 생기고 있는 경우)에는, 상기 실시 형태 및 실시예와 같이, 온도 범위의 하한값에 대응하는 점과 상한값에 대응하는 점을 지나는 직선상의 값을 베이스값으로 한 쪽이, 정도(精度) 좋게 백그라운드의 영향을 제거할 수 있다. 또한, 베이스값을 직선이 아니라 곡선으로 정하도록 해도 된다.
또한 상기 실시 형태 및 실시예에서는, 2 종류의 핵산의 존재비가 다른 핵산 혼합물에 대하여, 핵산의 존재비를 연산하는 경우에 관하여 설명했지만, 3 종류 이상의 핵산의 존재비가 다른 핵산 혼합물에 관해서도, 마찬가지로 본 발명을 적용할 수 있다.
또한 상기 실시 형태 및 실시예에서는, 검량 정보로서, 도 4에 나타내는 바와 같은 검량선을 사용하는 경우에 관하여 설명했지만, 특징량의 비와 핵산의 존재비와의 관계를 표 형식으로 나타낸 검량 정보나, 특징량의 비와 핵산의 존재비와의 관계를 계산식으로 나타낸 검량 정보를 사용해도 된다.
또한 상기 실시 형태에서는, 측정 결과를 표시부(14)에 표시하는 경우에 관하여 설명했지만, 인자(印字) 장치를 마련하여, 측정 결과를 종이 등의 매체에 인자 출력하도록 해도 되고, 가반성(可搬性) 기록 매체에 기록하도록 해도 되며, I/O 포트(28)나 네트워크 I/F(30)를 통해 접속된 외부 장치에, 측정 결과를 출력하도록 해도 된다.
또한 본 실시 형태의 핵산의 존재비 측정 장치에, 미리 정한 핵산의 존재비와 병의 진행 상황과의 관계와, 연산된 핵산의 존재비에 의거하여, 병의 진행 상황을 판정하는 판정부를 더 마련하여 구성해도 된다. 변이 유전자와 정상 유전자와의 존재비를 측정하여, 그 존재비를 환자의 상태를 보기 위한 파라미터로서 사용할 수 있다. 예를 들면 혈중 유리(遊離) 핵산에 있어서의 변이 유전자(예를 들면 암 질환에 관련하는 유전자)와 정상 유전자와의 비율과, 병의 진행 상황과의 관계를 정한 테이블을 미리 작성해 둔다. 그리고, 변이 유전자와 정상 유전자와의 존재비를 측정하여 미리 작성해 둔 테이블과 비교함으로써, 병의 진행 상태를 판정할 수 있다. 이와 같이, 측정한 핵산의 존재비를 사용하여, 환자의 상태, 예를 들면 병의 진행 상황 등을 모니터링 할 수 있다.
또한 본 실시 형태의 핵산의 존재비 측정 장치에, 미리 정한 핵산의 존재비와 체질 및 체질에 적합한 약제 처방량 중 적어도 일방과의 관계와, 연산된 핵산의 존재비에 의거하여, 체질 및 체질에 적합한 약제 처방량 중 적어도 일방을 판정하는 판정부를 더 마련하여 구성해도 된다. 체질로는, 피측정자의 특정한 질환에 대한 이환(罹患)하기 쉬움이나, 특정한 약제 투여에 대한 약효이다. 예를 들면, 어느 유전자(카피 수 다형(copy number variant)이 있는 유전자)와 카피 수가 기지(旣知)의 대상이 되는 유전자와의 비율과, 특정한 질환에 대한 이환하기 쉬움, 특정한 질환의 감염의 유무, 병상(病狀), 약효, 약제 처방량 등과의 관계를 정한 테이블을 미리 작성해 둔다. 그리고 상기 카피 수 다형이 알려져 있는 유전자와 대상이 되는 유전자의 존재비를 측정하여, 미리 작성해 둔 테이블과 비교함으로써, 특정한 질환에 대한 이환하기 쉬움, 약효 등의 체질이나, 감염의 유무나 병상, 약제 처방량 등을 판정할 수 있다. 이와 같이, 측정한 핵산의 존재비를 사용하여, 피측정자의 체질이나 약제 처방량 등을 판정할 수 있다. 예를 들면 CCL3L의 카피 수가 많은 경우에는, HIV에 이환하기 어려운 체질인 것으로 알려져 있고, FCGR3B의 카피 수가 적은 경우에는, 전신성 에리테마토데스(Erythematodes) 등과 같은 자기 면역 질환에 이환하기 쉬운 체질인 것으로 알려져 있다. 또한 자폐증이나 통합 실조증(失調症)이나 돌발성 학습 장해 등에 관련하는 유전자에 있어서도, 이러한 유전자의 카피 수 다형이 나타나는 것으로 알려져 있다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 키트는, 표적으로 하는 변이를 포함하는 핵산 서열의 영역에 하이브리다이즈 가능한 프로브와, 표적으로 하는 변이를 포함하는 핵산 서열을 증폭 가능한 프라이머 세트를 포함한다. 이들 시약을 포함하는 측정 키트를 사용함으로써, 보다 간편하게 목적으로 하는 유전자의 변이를 검출하고, 존재비를 측정할 수 있는 등의 이점을 갖는다.
본 발명의 핵산의 존재비 측정 키트를 구성하는 프로브 및 프라이머의 서열은, 목적으로 하는 유전자의 서열, 나아가서는 목적으로 하는 유전자 변이의 서열이 기지이면, 이들 서열에 의거하여 당업자에 의해 적당하게 설계 가능하다. 검사를 효과적으로 실시하기 위하여, 필요한 프로브의 길이, 프라이머 세트의 아닐(anneal) 위치 등도, 당업자에 의해 적의 조정할 수 있다.
또한 상기의 프로브는, 표지가 붙여 있는 표지화 프로브인 것이 검출의 효율성의 관점에서 바람직하다. 표지화 프로브에 있어서의 표지 물질의 구체예로서는, 예를 들면 형광 색소 및 형광단을 들 수 있다. 표지화 프로브의 구체예로서는, 예를 들면 형광 색소로 표지되어 단독으로 형광을 나타내며 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예를 들면 소광)하는 프로브가 바람직하다.
이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로 형광 소광 프로브라고 불린다. 그 중에서도, 상기 프로브로서는, 올리고뉴클레오티드의 3’영역(예를 들면 3’말단) 혹은 5’영역(예를 들면 5’말단)의 염기가 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직하고, 표지화되는 염기는, 시토신(C)인 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 표지화 프로브가 하이브리다이즈 하는 검출 목적 서열에 있어서, 상기 표지화 프로브의 말단 염기 C와 쌍을 이루는 염기, 혹은 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1∼3 염기 떨어진 염기가 구아닌(G)이 되도록, 상기 표지화 프로브의 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라고 불리며, 소위 Q Probe로서 알려져 있다. 이러한 구아닌 소광 프로브가 검출 목적 서열에 하이브리다이즈 하면, 형광 색소로 표지화된 말단의 C가, 상기 검출 목적 서열에 있어서의 G에 접근함에 따라, 상기 형광 색소의 발광이 약해진다(형광 강도가 감소한다)는 현상을 나타낸다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 또한 상기 표지 물질은, 예를 들면 통상, 뉴클레오티드의 인산기에 결합할 수 있다.
본 발명의 핵산의 존재비 측정 키트에 포함되는 각 시약은, 다른 용기에 포함되어 있어도 되고, 동일한 용기에 포함되어 있어도 된다. 또, 본 명세서에 있어서의 「다른 용기」로는, 각 시약이 비접촉 상태를 유지할 수 있도록 구분된 것이면 되고, 반드시 독립하여 취급 가능한 개별의 용기가 아니어도 된다.
또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 키트에는, 상기의 외에, 증폭에 필요한 폴리머라제 등의 시약 또는 완충액, 하이브리다이즈를 위해 필요한 시약 또는 완충액, 검체 시료를 희석하기 위한 희석제 등을 포함해도 된다. 또한 본 발명의 핵산의 존재비 측정 키트에는, 본 발명의 핵산의 존재비 측정 방법을 기재한 설명서, 키트에 포함되는 혹은 추가적으로 포함하는 것이 가능한 각종의 시약에 관한 사용 설명서 등을 포함하는 것이 바람직하다.
또한 상기 실시 형태에서는, 융해 곡선의 데이터를, 융해 곡선 해석 장치 등의 외부 장치로부터 취득하거나, 기록 매체에 기록된 데이터를 읽어들이거나 함으로써 취득하는 경우에 관하여 설명했지만, 융해 곡선 해석 장치와 본 실시 형태의 핵산의 존재비 측정 장치를 일체로 구성해도 된다. 구체적으로는, 상기 실시 형태의 구성에 부가하여, 핵산 혼합물의 온도 변화를 제어하는 온도 제어부와, 흡광도, 형광 강도, 상대 형광 강도 등의 검출 신호를 계측하는 계측부를 마련한다. 그리고, 온도 제어부에 의해 검체인 핵산 혼합물을 온도 변화시킨 때의 검출 신호를, 계측부에 의해 계측함으로써 융해 곡선의 데이터를 얻는다. 이후는, 상기 실시 형태와 같이, 융해 곡선을 사용하여 검체의 핵산의 존재비를 측정할 수 있다.
또, 상기의 핵산의 존재비 측정 처리 루틴을 규정한 프로그램을 기록 매체에 기록하여 제공하도록 해도 된다.
10 핵산의 존재비 측정 장치
12 조작부
14 표시부
16 컴퓨터
20 CPU
22 ROM
24 RAM
26 메모리
SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, INC. <120> Nucleic Acid Abundance Ratio Measurement Device, Method and Program Storage Medium, Determination Method, and Nucleic Acid Abundance Ratio Measurement Kit <130> CO-F03565-03 <150> JP2010-155032 <151> 2010-07-07 <150> JP2011-148520 <151> 2011-07-04 <160> 5 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer_F <400> 1 tgtattcaca gagacttggc a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer_R <400> 2 gagaatgggt actcacgttt c 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> prove <400> 3 gatgtctctg gctagacc 18 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Wt <400> 4 cactatagta ttaaaaagtt agttttcact ctttacaagt taaaatgaat ttaaatggtt 60 ttcttttctc ctccaaccta atagtgtatt cacagagact tggcagccag aaatatcctc 120 cttactcatg gtcggatcac aaagatttgt gattttggtc tagccagaga catcaagaat 180 gattctaatt atgtggttaa aggaaacgtg agtacccatt ctctgcttga cagtcctgca 240 aaggattttt agtttcaact ttcgataaaa attgtttcct gtgactttca taatgtaaat 300 <210> 5 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mt <400> 5 cactatagta ttaaaaagtt agttttcact ctttacaagt taaaatgaat ttaaatggtt 60 ttcttttctc ctccaaccta atagtgtatt cacagagact tggcagccag aaatatcctc 120 cttactcatg gtcggatcac aaagatttgt gattttggtc tagccagagt catcaagaat 180 gattctaatt atgtggttaa aggaaacgtg agtacccatt ctctgcttga cagtcctgca 240 aaggattttt agtttcaact ttcgataaaa attgtttcct gtgactttca taatgtaaat 300

Claims (19)

1 이상의 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호를, 다른 온도 범위 내에 있어서 검출하는 검출 수단과,
상기 검출 수단에 의해 검출된 검출 신호로부터 얻어지는 특징량(特徵量)의 비와 검량(檢量) 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 수단
을 포함하는 핵산의 존재비 측정 장치.
제1항에 있어서,
각각 다른 융해 온도를 갖는 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각으로부터 얻어진 온도와 검출 신호와의 관계를 나타내는 융해 곡선에 의거하여, 상기 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내에 있어서의 상기 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 상기 존재비와의 관계를 나타내는 검량 정보를 기억한 기억 수단, 또는 상기 검량 정보를 입력하기 위한 입력 수단
을 포함하는 핵산의 존재비 측정 장치.
제1항에 있어서,
상기 특징량의 비를,
하나의 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호의 레벨로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값과, 다른 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호의 레벨로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값과의 비,
하나의 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호의 미분값으로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값과, 다른 융해 온도 부근에 있어서의 검출 신호의 미분값으로부터 백그라운드 레벨을 감산한 값과의 비,
하나의 온도 범위 내의 검출 신호의 미분값의 합과 다른 온도 범위 내의 검출 신호의 미분값의 합과의 비, 또는
하나의 온도 범위 내의 검출 신호의 미분값의 합으로부터 백그라운드 레벨의 합을 감산한 값과, 다른 온도 범위 내의 검출 신호의 미분값의 합으로부터 백그라운드 레벨의 합을 감산한 값과의 비
로 한 핵산의 존재비 측정 장치.
제1항에 있어서,
상기 특징량의 비를, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서, 하나의 온도 범위의 하한값에 대응하는 점과 상기 하나의 온도 범위의 상한값에 대응하는 점을 지나는 직선과 융해 곡선으로 둘러싸인 부분의 면적과, 다른 온도 범위의 하한값에 대응하는 점과 상기 다른 온도 범위의 상한값에 대응하는 점을 지나는 직선과 융해 곡선으로 둘러싸인 부분의 면적과의 비로 한 핵산의 존재비 측정 장치.
제4항에 있어서,
상기 온도 범위의 상한값 또는 하한값을,
온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 2개의 피크 사이에서 검출 신호의 미분값이 최소가 되는 온도,
온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 피크의 발치(foot of peak)에 대응하는 온도, 또는
온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 피크로부터 ±15℃ 이내의 온도
로 한 핵산의 존재비 측정 장치.
제4항에 있어서,
상기 온도 범위의 상한값 또는 하한값을, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 피크로부터 ±10℃ 이내의 온도로 한 핵산의 존재비 측정 장치.
제4항에 있어서,
상기 온도 범위의 상한값 또는 하한값을, 온도와 검출 신호의 미분값과의 관계를 나타내는 융해 곡선에 있어서의 피크로부터 ±7℃ 이내의 온도로 한 핵산의 존재비 측정 장치.
제4항에 있어서,
상기 하나의 온도 범위의 상한값과, 상기 하나의 온도 범위보다 높은 온도 범위를 함유하는 온도 범위의 하한값을, 다른 값으로 한 핵산의 존재비 측정 장치.
제4항에 있어서,
상기 하나의 온도 범위의 하한값으로부터 상한값까지의 폭과, 상기 다른 온도 범위의 하한값으로부터 상한값까지의 폭을, 동일한 폭으로 한 핵산의 존재비 측정 장치.
제4항에 있어서,
상기 하나의 온도 범위의 하한값으로부터 상한값까지의 폭과, 상기 다른 온도 범위의 하한값으로부터 상한값까지의 폭을, 다른 폭으로 한 핵산의 존재비 측정 장치.
제1항에 있어서,
상기 핵산 혼합물의 온도 변화를 제어하는 온도 제어 수단과,
상기 검출 신호로서 흡광도, 형광 강도, 또는 상대 형광 강도를 계측하는 계측 수단
을 포함하는 핵산의 존재비 측정 장치.
1 이상의 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호를, 다른 온도 범위 내에 있어서 검출하는 검출 공정과,
상기 검출 공정에 있어서 검출된 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 공정
을 포함하는 핵산의 존재비 측정 방법.
각각 다른 융해 온도를 갖는 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각으로부터 얻어진 온도와 검출 신호와의 관계를 나타내는 융해 곡선에 의거하여, 상기 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내에 있어서의 상기 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 상기 존재비와의 관계를 나타내는 검량 정보를 작성하는 검량 정보 작성 공정과,
측정 대상의 핵산 혼합물의 융해 곡선의 상기 복수의 온도 범위의 각각에 대응하는 온도 범위 내에 있어서의 융해 곡선의 검출 신호에 의거하여, 특징량의 비를 연산하는 특징량비 연산 공정과,
상기 특징량비 연산 공정에 있어서 연산된 특징량의 비와 상기 검량 정보 작성 공정에 있어서 작성된 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 공정
을 포함하는 핵산의 존재비 측정 방법.
컴퓨터를,
1 이상의 융해 온도를 갖는 핵산 혼합물의 융해 곡선의 검출 신호로서, 다른 온도 범위 내에 있어서 검출된 검출 신호를 취입(取入)하고, 취입한 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 검량 정보에 의거하여, 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 수단
으로서 기능시키기 위한 핵산의 존재비 측정 프로그램.
컴퓨터를,
각각 다른 융해 온도를 갖는 핵산의 존재비가 각각 다른 복수의 핵산 혼합물의 각각으로부터 얻어진 온도와 검출 신호와의 관계를 나타내는 융해 곡선에 의거하여, 상기 융해 온도를 포함하는 복수의 온도 범위 내에 있어서의 상기 융해 곡선의 검출 신호로부터 얻어지는 특징량의 비와 상기 존재비와의 관계를 나타내는 검량 정보가 기억된 기억 수단으로부터 당해 검량 정보를 취득하거나, 또는 입력 수단에 의해 입력되는 상기 검량 정보를 취득하는 취득 수단,
측정 대상의 핵산 혼합물의 융해 곡선의 상기 복수의 온도 범위의 각각에 대응하는 온도 범위 내에 있어서의 융해 곡선의 검출 신호에 의거하여 특징량의 비를 연산하는 특징량비 연산 수단, 및
상기 특징량비 연산 수단에 의해 연산된 특징량의 비와 상기 취득 수단에 의해 취득된 검량 정보에 의거하여 핵산의 존재비를 연산하는 존재비 연산 수단
으로서 기능시키기 위한 핵산의 존재비 측정 프로그램.
제1항에 기재된 핵산의 존재비 측정 장치를 사용하여 얻어지는 핵산의 존재비와, 미리 정한 핵산의 존재비와 환자의 상태와의 관계에 의거하여, 환자의 상태를 판정하는 판정 방법.
제1항에 기재된 핵산의 존재비 측정 장치를 사용하여 얻어지는 핵산의 존재비와, 미리 정한 핵산의 존재비와 체질 및 체질에 적합한 약제 처방량 중 적어도 일방과의 관계에 의거하여, 체질 및 체질에 적합한 약제 처방량 중 적어도 일방을 판정하는 판정 방법.
제1항에 기재된 핵산의 존재비 측정 장치에 있어서, 상기 핵산의 존재비를 측정할 때에 사용되고,
상기 핵산 혼합물 중의 핵산에 존재할 수 있는 표적으로 하는 변이를 포함하는 핵산 서열의 영역에 하이브리다이즈 가능한 프로브와,
상기 핵산 혼합물 중의 핵산에 존재할 수 있는 표적으로 하는 변이를 포함하는 핵산 서열을 증폭 가능한 프라이머 세트
를 포함하는 핵산의 존재비 측정 키트.
제18항에 있어서,
상기 프로브가 표지화 프로브인 핵산의 존재비 측정 키트.
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