KR20110135694A

KR20110135694A - 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소, 및 이에 의해 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체

Info

Publication number: KR20110135694A
Application number: KR1020100055562A
Authority: KR
Inventors: 김천호; 김종일
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2011-12-19
Also published as: WO2011155800A2; CN103038339A; WO2011155800A3; EP2581444A2; EP2581444A4; WO2011155800A9; CN103038339B; EP2581444B1; US20130085187A1; KR101831918B1; US8697415B2

Abstract

본 발명은 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소, 및 이에 의해 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체는 생체에서의 초기 분해 속도가 지연되고, 분자량 및 점성도의 저하가 최소화되며, 겔화점은 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산의 겔화점보다 감소하여 겔화가 촉진되고, hMSC의 생존율이 배지 중의 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체의 농도 증가에 거의 영향을 받지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체는 세포, 유전자, 약물 등의 전달체 또는 조직공학용 지지체 등의 생체재료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소, 및 이에 의해 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체{Deacetylation hydrolase of hyaluronic acid, and hyaluronic acid and its derivative deacetylated by the same}

본 발명은 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소, 및 이에 의해 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체에 관한 것이다.

히알루론산은 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤라핀과 함께 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans; GAG)의 일종으로, N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 음이온성 천연고분자(polyanionic natural polymer)이다. 히알루론산은 동물의 안구, 태반, 관절의 윤활제, 능막액, 피부와 수닭의 벼슬 등으로부터 발견되며, 생체부분에 따라 10³~10⁷ 달톤의 분자량을 가지고 있다. 또한, 히알루론산은 피부의 표피와 진피 등 모든 층의 조직에서 작용하고 있는 세포외기질(extra-cellular matrix) 구조를 유지하는 구조 역할을 하고, 모든 고등 동물의 활액, 탯줄, 피 등에 존재하며 그 중 50% 이상의 히알루론산이 피부, 호흡기, 및 장관에 존재하는 유일한 비황산화 글리코스아미노글리칸(non-sulfated glycosaminoglycan)이다. 또한, 히알루론산은 음으로 대전되어 있기 때문에 양성의 이온들과 결합하여 물을 흡수하는 삼투의 불균형과 하이드로겔 형태를 쉽게 만들 수 있다. 따라서, 히알루론산은 다른 세포외기질 성분의 훌륭한 대안으로, 자체의 뛰어난 함수성 때문에 생체 내에서 조직과 관절 부위의 수분 항상성을 제공하여 물리적 힘에 대한 완충작용으로 압축을 지탱할 수 있으며, 조직과 조직 간의 투과성 조절에 관여하여 관절 표면에서 마찰에 대한 윤활효과를 유도하고, 관절의 혈관이 없는 부위에 영양을 공급하거나 노폐물을 제거하는 전달체 역할을 하기도 한다.

따라서, 천연고분자인 히알루론산의 고 흡수성 및 고 점성도를 활용하여 히알루론산 자체로서 또는 그 유도체 등을 제조하여(Glenn D. Prestwich, Jing-wen Kuo, Chemically-Modified HA for Therapy and Regenerative Medicine, Current Pharmaceutical Biotechnology, 9(4), 242-245 (2008).) 화장품, 안구 등에 적용하기도 하며(E. A. Balazs, M. I. Freeman, R. Kloti, G. Meyer-Schwickerath, F. Regnault, and D. B. Sweeney, "Hyaluronic acid and replacement of vitreous and aqueous humor", Mod. Probl. Ophthalmol., 10, 3~21 (1972).), 이외에도 연골 및 뼈의 재생(A. H. Isdale, L. D. Hordon, H. A. Bird, and V. Wright, "Intra-articular hyaluronate (Healon): A dose-ranging study in rheumatoid arthritis and osteoarthritis", J. Drug Dev., 4, 93~99 (1991). M. Kawabata, M. Igarashi, R. Mikami, S. Ninomiya, and H. Oda, "Clinical evaluations of SLM-10 (sodium hyaluronate injection) in patients with osteoarthritis of the knee", Yakuri to Chiryo, 21, 257~283 (1993).)과 피부 등 연조직 재생, 및 함몰조직 또는 성형 등에 히알루론산 겔을 생체에 직접 주입하는 등 조직재생과 조직공학의 다방면에서 그 용도가 활용되고 있다.

그러나, 히알루론산의 이러한 의료용 바이오 소재로의 적용 가능성에도 불구하고, 히알루론산 자체는 생체 내에서 너무 쉽게 분해되어 콜라겐보다 반감기가 짧기 때문에 사용상의 제약이 많다. 즉, 뼈와 연골 부위 등 밀집된 구조물에서는 림프액의 분비가 없어 콜라겐이나 프로테오글리칸 등과 동시에 분해되지만, 피부 혹은 관절부의 히알루론산은 국소적인 물질대사(local metabolism)에 의해서 20~30% 더 빨리 분해되고, 나머지는 림프계(lymphatic pathway)에 의해 제거되어, 조직의 부위에 따라 차이가 있지만 히알루론산의 반감기는 대체로 12시간에서 2~3일 정도로 보고되어 있다(J.R.E. Fraser, T.C. Laurent, and U.B.G. Laurent, Hyaluronan: its nature, distribution, functions, and turnover, J. Intern. Med., 242(1), 27-33 (1997)). 특히, 생체재료로서의 히알루론산은 정상관절에 이식하였을 때 그 반감기가 1일이 채 되질 못한 것으로 보고되어 있다(T.C. Laurent, and J.R.E. Fraser, Hyaluronan, FASEB J., 6, 2397-2404 (1992)). 이외의 다른 글리코스아미노글리칸과 특별히 혼합되어 있지 않은 부위인 안구 내에서는 반감기가 70일로 알려져 있다(U.B.G. Laurent, and R.K. Reed, Turnover of hyaluronan in the tissue, Adv. Drug Delivery Rev., 7, 237-56 (1991)).

이와 같이 히알루론산의 의료용 바이오 소재로의 적용 가능성에도 불구하고, 히알루론산 자체는 천연고분자 자체의 기계적 특성의 한계점 뿐만 아니라, 콜라겐보다 반감기가 짧고 생체 내에서 분해 속도가 너무 빠르기 때문에 아직까지 사용상의 제약이 많이 따른다. 따라서, 인체 내에서 오랜 기간 그 기계적 강도를 유지해야 하는 일부 성형 등에 생체 주입용 히알루론산 겔을 이용하는 경우 위와 같은 생체 내에서의 히알루론산의 짧은 반감기로 인해 분자량이 2,000~3,000 kDa 이상의 초고분자량의 히알루론산을 사용하여 적용하기도 한다.

또한, 히알루론산을 다양한 임상적용 목적에 맞는 바이오 소재로 개발하기 위해서는, 생체 내에서의 분해 속도 문제를 극복하고 분자량 저하를 최소화시켜 고분자량의 히알루론산 구조를 유지하면서 화학적으로 변환한 히알루론산 유도체의 개발 연구가 필요하다. 이의 일 예로, 히알루론산을 가교시키거나 혹은 알킬 및 벤질에스터 유도체를 제조하기도 하며, 또는 커플링제를 이용하여 화학적으로 개질시키려는 시도가 많이 진행 중이다. 현재까지의 연구결과를 고찰해 보면, 화학적 개질을 통해 개발된 히알루론산 유도체들은 적용하려는 조직과 장기 및 약물전달체의 특정 기능에 맞는 기계적 및 화학적 특성을 가진 의료용 고분자로 적합하다는 것이 입증되고 있으며, 몇몇의 경우에는 약제학적 기능을 포함하는 히알루론산 고유의 생물학적 기능을 유지하는 결과를 보이기도 하였다. 그러나, 히알루론산 유도체의 합성에 있어서, 이론적으로는 1.5×10⁶달톤 이상의 분자량을 가진 고분자에서는 분자간 얽힘 현상이 발생하여 히알루론산 유도체로의 화학적 개질이 어려운 것으로 알려져 있다(Y.S. Soh, "Hyaluronic acid: properties and application", Polymer(Korea), 12, (1988).).

상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여, 저분자량의 히알루론산으로 전환하거나 혹은 히드라진 등을 이용하여 N-아세틸-D-글루코사민 잔기를 탈아세틸화하여 유기 아민기를 가진 히알루론산을 제조하고 얻어진 유기 아민기를 이용하여 화학적으로 개질하거나(V. Crescenzi, A. Francescangeli, D. Renier, D. Bellini, New cross-linked and sulfated derivatives of partially deacetylated hyaluronan: Synthesis and preliminary characterization, Biopolymers, Vol. 64, 86-94 (2002). S. Oerther, A-C Maurin, E. Payan, P. Hubert, F. Lapicque, N. Presle, J. Dexheimer, P. Netter, and F. Lapicque, High Interaction alginte-hyaluronate associations by hyaluronate deaetylation for the preparation of efficient biomaterials, Biopolymer, 54, 273-281(2000),), 혹은 히알루로니다제의 활성 위치로 알려져 있는 베타-글루쿠론산의 6번 위치에 있는 카복실기를 화학적으로 치환하여 물에 녹지 않는 히알루론산 유도체의 겔 형태를 제조하거나(Oh EJ, Kang SW, Kim BS, Jiang G, Cho IH, Hahn SK., Control of the molecular degradation of hyaluronic acid hydrogels for tissue augmentation. J Biomed Mater Res A., 86(3):685-93(2008) Hahn SK, Park JK, Tomimatsu T, Shimoboji T., Synthesis and degradation test of hyaluronic acid hydrogels.Int J Biol Macromol., 40(4), 374-80 (2007).), 히알루론산 반복 단위 내에 존재하는 알콜(-OH) 작용기 뿐만 아니라 당 고리구조 파괴를 이용한 화학적 개질 유도 및 카복실산의 음이온 하전을 이용한 물리적 개질 방법 등도 보고되어 있다(V. Crescenzi, A. Francescangeli, D. Renier, D. Bellini, New hyaluronan chemical derivatives. Ragioselectively C(6) oxidized products, Macromolecules, 34, 6367~6372 (2001).). 그러나, 화학적인 탈아세틸화 및 커플링제를 이용한 화학적 반응은 반응과 함께 히알루론산의 분자량이 현저히 감소되어 고유한 히알루론산의 기계적인 물성이 크게 저하될 수 밖에 없고(S. Oerther, A-C Maurin, E. Payan, P. Hubert, F. Lapicque, N. Presle, J. Dexheimer, P. Netter, and F. Lapicque, High Interaction alginte-hyaluronate associations by hyaluronate deaetylation for the preparation of efficient biomaterials, Biopolymer, 54, 273-281(2000)), 생체 내에서 히알루론산의 분해와 함께 이온 가교에 사용된 다가 금속의 탈리 및 도입된 화학적 작용기의 해리 등으로 세포 독성 가능성이 매우 높다. 또한, 히알루론산의 기계적 강도 저하는 다양한 물성을 요구하는 생체재료로서의 의학적 및 산업적 응용 가능성에서도 많은 제약이 있으며, 다양한 형태의 생체재료로 합성할 수 없다는 문제점이 있다. 특히, 하이드로겔, 시트형, 필름형, 스폰지형, 비드형, 나노섬유 등 조직공학적 지지체로서의 재생의학적 응용에서의 경우, 주위 세포의 유입을 통한 신속한 조직 재건을 위해서는 세포가 유입되는 기간 중에 그 강도 및 형태를 유지하여야 하며, 그렇지 않으면 형태가 쉽게 붕괴되어 효능 뿐 아니라 주변부 조직과의 생착율이 현저히 감소한다. 따라서, 세포, 단백질, 금속, 약물 등의 전달체 및 코팅제로서 뿐만 아니라 조직공학적 지지체로서 작용하기 위한 기본 요건인 골격 유지를 위해서는 히알루론산의 생체 분해속도 및 그 분자량을 조절할 수 있어야 한다.

한편, N-아세틸-D-글루코사민 잔기에 대한 탈아세틸화 가수분해효소로는 주로 키틴을 키토산으로 전환시키는 키틴 탈아세틸화 가수분해효소 (CDA:E,C,3.5.1.41)를 중심으로 연구되어 왔다. 키틴 탈아세틸화 가수분해효소의 경우, 1936년 일본 와타나베에 의해 동물 조직에서 N-아세틸-D-글루코사민 탈아세틸화제의 존재 가능성이 발표된 이후, 1957년 S. Roseman에 의해 E. coli strain K-12의 추출물에서 최초로 분리하였다. 이 후, Mucor rouxii의 추출물, Bacillus cereus의 추출물; Colletotrichum lindemuthianum, Colletotrichum lagenarium, Rhizopus stolonifer 등의 곰팡이; 곤충종; 갑각류; 및 원생동물인 Encephalitozoon cuniculi로부터 키틴 탈아세틸화 가수분해효소의 분리에 성공하였다. 이후, Mucor rouxii, Absidia coerulea, Aspergillus nidulans로부터 키틴 탈아세틸화 가수분해효소의 분리 및 정제에 대한 연구 논문이 발표되었고, Gongronella butleri 및 Saccharomyces cerevisiae에서 코발트 활성 키틴 탈아세틸화 가수분해효소(Cda2P), Encephalitozoon cuniculi, Metarhizium anisopliae, E. coli 배지 및 Rhizopus oryzae 배지 중에서 키틴 탈아세틸화 가수분해효소를 분리하였다. 최근에는, Scopulariopsis brevicaulis, Mortierella sp. DY-52, Rhizopus circinans, Vibrio cholerae로부터 키틴 탈아세틸화 가수분해효소의 분리를 보고하고 있지만 아직까지 순수분리를 확립한 결과는 역시 보고되지 않았다.

또한, 균류 유래의 키틴 탈아세틸화 가수분해효소와 리조비알 노듈화 단백질 (rhizobial nodulation proteins, NodB proteins)과의 구조적 유사성이 밝혀진 이후, 키틴 탈아세틸화제 효소를 생성하는 Mucor rouxii, Colletotrichum lindemuthianum, Saccharomyces cerevisiae, Gongronella butleri 및 Rhizopus nigricans 등과 같은 균류로부터 일부 서열을 분석하고 있지만 정확한 서열이 보고된 바는 없다.

상기와 같이 다당류의 탈아세틸화 가수분해효소에 관한 보고는 키틴의 탈아세틸화 가수분해효소를 중심으로 보고되어 있지만, 단당류의 N-아세틸-D-글루코사민에 대해서는 반응성이 없으며, 연속되는 일련의 N-아세틸-D-글루코사민 배열이 필요한 것으로 보고되어 있다. 이들 키틴 탈아세틸화 가수분해효소의 경우, 펩티도글리칸인 N-아세틸화된 헤파린, N-아세틸-갈락토사민 등에는 활성이 없고(Araki, Y. & Ito, E. (1975). A pathway of chitosan formation in Mucor rouxii, Eur. J. Biochem., 55, 71-78 (1975)), 특히 히알루론산 중의 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 탈아세틸화는 일어나지 않는 것으로 보고되는(Martinou A, Kafetzopoulos D, Bouriotis V., Chitin deacetylation by enzymatic means: monitoring of deacetylation process, Carbohyd. Res., 273, 235-242 (1995)) 등 키틴 및 키토산의 N-아세틸-D-글루코사민류 이외에는 활성이 없다. 즉, 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에 존재하는 아세틸기를 선택적으로 탈아세틸화시킬 수 있는 탈아세틸화 가수분해효소는 아직까지 보고된 바가 없다.

따라서, 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에 존재하는 아세틸기를 선택적으로 탈아세틸화시킬 수 있는 탈아세틸화 가수분해효소에 대한 연구 및 개발의 필요성이 요구되고 있다.

본 발명자들은 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에 존재하는 아세틸기를 선택적으로 가수분해하는 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소에 대해 연구하던 중, 균주로부터 히알루론산 탈아세틸라제를 분리 및 정제한 후, 분리된 히알루론산 탈아세틸라제를 이용하여 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 제조하였으며, 상기 제조된 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체는 생체에서의 초기 분해 속도가 지연되고, 분자량 및 점성도의 저하가 최소화되며, 겔화점이 낮아 겔화가 촉진되며, hMSC의 생존율이 배지 중의 탈아세틸화된 히알루론산의 농도 증가에 거의 영향을 받지 않음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 균주로부터 분리 및 정제되며, 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에 존재하는 아세틸기를 선택적으로 가수분해하는 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소에 의해 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 제공하고자 한다.

도 1은 아스페리질루스 니둘란스로부터 분리 및 정제한 히알루론산 탈아세틸라제의 활성을 5탄당인 키틴 올리고머(penta-N-acetylchitohexadose)를 이용하여 분석한 도이다.
도 2는 아스페리질루스 니둘란스로부터 분리 및 정제한 히알루론산 탈아세틸라제 효소를 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 확인한 도이다[레인 1: 마커(표준 분자량), 레인 2: 30% 황산 암모늄 분획, 레인 3: Q-세파로오스 분획 (결합하지 않음), 레인 4: 페닐-세파로오스 분획, 레인 5: 세파크릴 분획].
도 3은 스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 탈아세틸라제를 수용성 크로마토그래피법(HPLC)을 통해 분리하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 탈아세틸라제를 SDS-PAGE를 통해 분리하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 탈아세틸라제의 pI 값을 2-D electrophoresis system을 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 히알루로니다제에 의한 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산과 탈아세틸화된 히알루론산의 분해속도를 비교한 도이다.
도 7은 탈아세틸라제 또는 화학적 방법에 의해 탈아세틸화된 히알루론산의 분자량을 겔 전기영동을 통해 비교한 도이다.
도 8은 탈아세틸라제 또는 화학적 방법에 의해 탈아세틸화된 히알루론산의 점성도를 확인한 도이다.
도 9는 탈아세틸라제에 의해 탈아세틸화된 히알루론산과 베타-글리시딜포스페이트의 상호작용에 의한 온도에 따른 점탄성도를 측정한 도이다.
도 10은 탈아세틸화된 히알루론산이 키토산/베타-글리시딜포스페이트의 혼합용액의 겔화에 미치는 영향을 나타낸 도이다[(a) 탈아세틸화된 히알루론산이 첨가되지 않은 경우, (b) 탈아세틸화된 히알루론산이 첨가된 경우].
도 11은 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산과 탈아세틸화된 히알루론산의 농도에 따른 hMSC의 형태 변화를 현미경으로 관찰한 도이다.
도 12는 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산과 탈아세틸화된 히알루론산의 농도 및 배양시간에 따른 hMSC의 증식정도를 나타낸 도이다.

본 발명은 균주로부터 분리 및 정제되며, 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에 존재하는 아세틸기를 선택적으로 가수분해하는 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소에 의해 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소는 균주로부터 분리 및 정제되며, 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에 존재하는 아세틸기를 선택적으로 가수분해하는 것을 특징으로 한다.

상기 균주는 아스페리질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 스코폴라리오프시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis), 무코르 룩시(Mucor rouxii), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 콜레토트리쿰 라게나리움(Colletotrichum lagenarium), 리조푸스 스톨로니페르(Rhizopus stolonifer), 압시디아 코에룰레아 (Absidia coerulea), 공그로넬라 부틀레리(Gongronella butleri), 사카로마이스즈 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 엔세팔리토준 쿠니쿨리(Encephalitozoon cuniculi), 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococus pneumoniae), 모티에렐라(Mortierella) sp. DY-52, 리조푸스 시르시난스(Rhizopus circinans), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholerae) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소를 아스페리질루스 니둘란스와 스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 분리 및 정제하였으며, 아스페리질루스 니둘란스로부터 분리한 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소의 유전자 염기서열을 분석하여 서열번호 1로 나타내었다.

또한, 본 발명에서는 상기 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소를 이용하여 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 제조할 수 있다. 구체적으로는, 히알루론산 및 이의 유도체를 pH 3.0~9.0의 완충용액 또는 증류수에 가하여 용해시키고, 여기에 상기에서 분리한 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소를 가하여 10~70℃, 바람직하게는 30~60℃에서 0.001~24시간, 바람직하게는 1~10시간, 더욱 바람직하게는 3~6시간 동안 반응시킨 후, 반응물에 에탄올을 가하여 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 석출한다. 이때, 에탄올은 반응물에 대해 2~10배의 중량비, 바람직하게는 약 4~7배의 중량비로 추가한다. 그 다음, 석출된 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 에탄올로 세척하고, 이를 다시 증류수에 용해시키고 증류수에 투석시킨 후, 동결건조하여 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소에 의해 탈아세틸화된 히알루론산은, 화학적인 방법으로 탈아세틸화된 히알루론산보다 탈아세틸화도가 우수하여 더 효율적으로 히알루론산의 아세틸기를 제거할 수 있다.

또한, 본 발명의 탈아세틸화된 히알루론산은 히알루로니다제에 의한 생체에서의 초기 분해 속도가 지연되고, 분자량 및 점성도의 저하가 최소화되어 고분자량 및 고점성도를 가진 탈아세틸화된 히알루론산을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 탈아세틸화된 히알루론산의 겔화점은 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산의 겔화점보다 감소하여, 음이온성의 베타-글리시딜포스페이트와 양이온성의 유리 아민기를 가진 탈아세틸화된 히알루론산의 정전기적 상호작용에 의해 겔화가 촉진됨을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 탈아세틸화된 히알루론산의 농도에 따른 hMSC의 형태 변화는 현저한 차이가 관찰되지 않았으며, 탈아세틸화된 히알루론산의 경우 hMSC의 생존율이 배지 중의 탈아세틸화된 히알루론산의 농도 증가에 거의 영향을 받지 않는다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체는 생체에서의 초기 분해 속도가 지연되고, 분자량 및 점성도의 저하가 최소화되며, 겔화점은 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산의 겔화점보다 감소하여 겔화가 촉진되고, hMSC의 생존율이 배지 중의 탈아세틸화된 히알루론산의 농도 증가에 거의 영향을 받지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체는 세포, 유전자, 약물 등의 전달체 또는 조직공학용 지지체 등의 생체재료로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 아스페리질루스 니둘란스( Aspergillus nidulans )로부터 히알루론산 탈아세틸라제의 분리 및 정제

1. 아스페리질루스 니둘란스의 배양

아스페리질루스 니둘란스를 액체배지[총 1ℓ 기준, (글루코오스 5g, 효모추출물 2g, 펩톤 5g, NaCl 5g) 또는 (1% 글루코오스, 0.15% 효모추출물, 0.15% 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 1× 비타민 용액, 1× 최소염용액, 0.5% 키틴)] 또는 평판 배지[3% 수크로오스、0.2% NaNO₃, 1% K₂HPO₄, 0.05% KCl, 0.05% MgSO₄]에서 5~40℃에서 4~2,400시간 동안 초기 배양한 다음, 계속해서 액체배지[총 1ℓ 기준, (NaNO₃ 2g, K₂HPO₄ 1g, KCl 0.5g, MgSO₄ 0.5g, 펩톤 1g, 키틴 0~10g) 또는 (1% 글루코오스, 0.15% 효모추출물, 0.15% 카제인 가수분해물, 1× 비타민 용액, 1× 최소염용액, 0.5% 키틴)] 또는 평판 배지[3% 수크로오스, 0.2% NaNO₃, 1% K₂HPO₄, 0.05% KCl, 0.05% MgSO₄] 중에서 5~40℃, 4~200시간, 1~1,000rpm으로 쉐이킹하여 배양하였다. 상기 비타민 용액은 15.2% NaNO₃, 2.6% MgSO₄, 15.2% K₂HPO₄, 2.6% KCl, 0.04% ZnCl₂, 0.4% (NH₄)₂Mo₇O₂₄, 0.001% MnCl₂, 0.03% CuSO₄, 0.001% FeSO₄를 포함하고, 상기 최소염용액 500㎖ 중에는 리보플라빈 50㎎, p-아미노벤조산 250㎎, 피리독신-HCl 250㎎, 비오틴 2㎎, 아스코르브산 250㎎, 엽산 250㎎, 티아민 250㎎, 티코틴산 50㎎을 포함한다.

이때, 배양액이나 체내효소 단백질의 경우, 곰팡이 mycelia를 초음파분쇄기로 파쇄한 후, 1,000~100,000×g로 1~500분 동안 원심분리한 후, 상등액을 0~100% 황산암모늄(ammonium sulfate)에 0~48시간 처리하고, 1,000~100,000×g로 0~500분 동안 원심분리한 상등액을 다시 0~100% 황산암모늄에 0.1~48시간 처리 후 1,000~50,000×g로 1~500분 동안 원심분리하여 침전물을 얻었다. 또한, 체외 효소 단백질일 경우, 상기 배양액 6ℓ를 초음파분쇄기로 파쇄한 후 0~100% 황산암모늄 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)으로 포화시키고, 1,000~100,000×g으로 0~500분 동안 원심분리하여 상등액을 0~100% 황산암모늄에 포화시켜서 이전과 동일하게 1,000~100,000×g으로 0~500분 동안 원심분리하여 침전물을 얻었다.

상기에서 얻어진 아스페리질루스 니둘란스 침전물을 모아 Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에 현탁하고, 이를 0~100% 황산암모늄(50mM Tris-HCl, pH 7.5)에 하룻밤 동안 투석하였다.

2. 황산암모늄 농도에 따른 아스페리질루스 니둘란스 침전물 군의 탈아세틸화 효소 가수분해 활성

황산암모늄 농도에 따른 아스페리질루스 니둘란스 침전물 군의 탈아세틸화 효소 가수분해 활성은 키틴 5탄당(penta-N-acetylchitohexadose)을 기질로 하여 효소가수분해한 후 탈아세틸화 결과로 생성된 아세테이트 이온의 양을 정량하여 분석하였다. 즉, 탈아세틸화는 이중효소 활성 검색법(coupled enzyme assay)을 이용하여 당에서 분리된 유리 아세테이트 이온을 정량하는 방법으로 측정하였다.

구체적으로는, 하기에 나타난 바와 같이 아세트산 키트(ENZYTEC^TM)를 사용하여 탈아세틸라제의 작용에 의해 분해되어 유리된 아세테이트 이온을 ACS, CS와 MDH 효소반응과 결합시켜 NADH 생성과 1:1 정량적으로 전환시켜 NADH의 양을 측정하였다. 이를 위해 340㎚에서 흡광도를 측정하여 흡광도 계수 e₃₄₀ = 6.31 mM^-1cm^-1 를 사용하여 분석하였다.

대조군으로는, 1.5㎖ e-튜브에 아세트산 키트의 TEA(triethanolamine) 완충용액 330㎕, ATP/CoA/NAD 용액 67㎕, MDH/CS 용액 4㎕, 및 ACS 용액 7㎕를 순서대로 넣고, 각 튜브에 증류수를 채워 전체 부피를 1㎖로 맞춘 후, 25℃에서 30분동안 반응시킨 다음, 96웰로 옮겨 담고, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 340㎚에서 흡광도를 측정하였다(SpectraMax^® M2, Molecular Devices, USA).

키틴 5탄당을 기질로 한 황산암모늄의 농도에 따른 아스페리질루스 니둘란스 침전물 군의 탈아세틸화 효소 가수분해 활성은 표 1에 나타내었다.

황산암모늄의 농도(%)	0%	1~30%	31~50%	51~70%	71~100%
생성된 아세테이트 농도(A₃₄₀)	0.285	0.852	0.711	0.321	0.314

표 1에 나타난 바와 같이, 황산암모늄의 농도가 1~50%인 분획에서 아스페리질루스 니둘란스 침전물의 탈아세틸화 효소 가수분해 활성이 우수하게 나타났다. 따라서, 히알루론산 탈아세틸라제는 1~50%의 황산암모늄 포화용액에 침전된 아스페리질루스 니둘란스 침전물로부터 분리하였다.

3. 배양된 아스페리질루스 니둘란스로부터 히알루론산 탈아세틸라제의 분리 및 정제

1~50%의 황산암모늄 포화용액에 침전된 아스페리질루스 니둘란스 침전물을 4℃로 유지된 냉장실에 장착된 세파덱스 G-100 컬럼(sigma) 또는 페닐-세파로오스 CL-4B 및 Q-세파로오스 컬럼 중에서 분획시켰다. 소수성 상호작용을 위한 컬럼인 페닐-세파로오스 CL-4B(2.5×6㎝, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 시료를 주입한 후 0~1.0M 황산암모늄으로 용출하여 먼저 분획하고, 이를 음이온 교환 수지인 Q-세파로오스(2.5×4㎝, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로 옮겨 용출하여 분획하였다. 활성이 높은 0.01~5M 분획을 (NH₄)₂SO₄가 80% 포화되도록 녹여서 농축하여 50mM Tris-HCl, pH 7.5에 하룻밤 동안 투석하여 히알루론산 탈아세틸라제를 분리 조제하였다. 또는, 황산암모늄 1~50% 포화용액에 침전시킨 단백질 침전물을 Tris-HCl 50mM, pH 7.5에 녹인 후 세파덱스 G-100 컬럼(sigma) (16㎜ diam × 60㎝)에 로딩하였다. 용출 완충액을 Tris-HCl 50mM, pH 7.5로 하고 분획하였다. 수집된 분획 중 히알루론산 탈아세틸라제 부분을 0~100% 황산암모늄으로 0.1~48시간 처리하여 1,000~100,000×g로 1~500분 동안 원심분리한 후 농축하여 히알루론산 탈아세틸라제를 분리 및 정제하였다. 분리 및 정제된 히알루론산 탈아세틸라제의 활성을 5탄당인 키틴 올리고머(penta-N-acetylchitohexadose)를 이용하여 분석하였다.

결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 0.5M NaCl이 포함된 25mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액에서 히알루론산 탈아세틸라제 효소 활성이 용출됨을 확인하였다.

4. 히알루론산 탈아세틸라제의 동정 (SDS-PAGE)

상기 아스페리질루스 니둘란스로부터 분리 및 정제한 히알루론산 탈아세틸라제 효소를 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 동정하였다. 구체적으로는, 10% 변성 폴리아크릴아미드겔을 만든 후, 정제한 히알루론산 탈아세틸라제와 마커(SeeBlue Plus2 Prestained Standard, invitrogen, Carlsbad, CA)를 로딩하여 120V로 수행하였다. 그 다음 겔을 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 20분 동안 염색하고, 탈염 용액(50% 메탄올, 10% 아세트산)에 반응시켰다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 아스페리질루스 니둘란스로부터 분리 및 정제한 히알루론산 탈아세틸라제는 약 28 kDa의 분자량을 가짐을 확인하였다.

5. 히알루론산 탈아세틸라제의 유전자 염기서열 분석

히알루론산 탈아세틸라제 효소 단백질의 분석을 위해, 효소 단백질의 아미노산 서열을 Edman 분석법으로 효소 단백질을 가수분해한 단편의 서열을 일부 분석한 다음 데이터베이스로부터 효소 단백질의 아미노산 서열을 구하였다. 이로부터 아스페리질루스 니둘란스에서 추측되는 히알루론산 탈아세틸라제의 유전자 염기서열을 분석하였다. 상기 히알루론산 탈아세틸라제의 유전자 염기서열을 서열번호 1로 표시하였다.

실시예 2 : 스코폴라리오프시스 브레비카울리스( Scopulariopsis brevicaulis )로부터 히알루론산 탈아세틸라제의 분리 및 정제

상기 실시예 1에서 아스페리질루스 니둘란스 대신 스코폴라리오프시스 브레비카울리스(ATCC 36009)를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 하여 스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 히알루론산 탈아세틸라제를 분리 및 정제하였다.

스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 분리된 히알루론산 탈아세틸라제의 평균분자량을 확인하기 위하여, 수용성 크로마토그래피법으로 HPLC waters M515와 waters 486 detector에 Annexin V와 biobasic SEC-120(3007.8㎜)을 사용하였으며, shodex standard P-82를 표준시료로 하여 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.4)을 1㎖/min 속도로 100㎕ 주입하여 280nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 분리된 히알루론산 탈아세틸라제를 10% SDS-PAGE를 수행하여 동정하였다. 또한, 히알루론산 탈아세틸라제의 pI 값은 2-D electrophoresis system으로 18㎝의 broad range IPG strip(pH 3-10)을 사용하여 등전기 초점화 (isoelectrofocusing)를 수행하였다.

스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 탈아세틸라제를 수용성 크로마토그래피법(HPLC) 및 SDS-PAGE를 통해 분리하여 분석한 결과는 각각 도 3 및 도 4에 나타내었으며, 2-D electrophoresis system에 의한 pI 값은 도 5에 나타내었다.

도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 수용성 크로마토그래피법(HPLC)에 의해 스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 분리된 탈아세틸라제의 평균분자량은 약 55kDa임을 확인하였으며, 10% SDS-PAGE에서도 약 58 kDa의 분자량을 나타냄을 확인하였다.

또한 도 5에 나타난 바와 같이, 스코폴라리오프시스 브레비카울리스로부터 분리된 탈아세틸라제의 pI 값이 pH 3.0~3.5 사이를 가지는 히알루론산 탈아세틸라제임을 확인하였다.

실험예 1 : 히알루론산 탈아세틸라제의 반응성 비교

1.5㎖ e-튜브에 10mM 히알루론산(Fluka, #53747, Mw 1,400kDa) 20㎕에, 상기 실시예 2에서 분리 및 정제한 히알루론산 탈아세틸라제 50㎕를 넣고 pH가 각각 다른 완충용액((pH 5.5, pH 7, pH 8.5)으로 전체 부피를 200㎕로 맞춘 다음, 4시간 경과 후 pH와 반응온도(실온, 40℃, 60℃)에 따른 탈아세틸화도를 비교하였다.

대조군으로는, 1.5㎖ e-튜브에 아세트산 키트의 TEA 완충용액 330㎕, ATP/CoA/NAD 용액 67㎕, MDH/CS 용액 4㎕, 및 ACS 용액 7㎕를 순서대로 넣고, 각 튜브에 증류수를 채워 전체 부피를 1㎖로 맞춘 후, 25℃에서 30분동안 반응시킨 다음, 96웰로 옮겨 담고, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 340㎚에서 흡광도를 측정하였다(SpectraMax^® M2, Molecular Devices, USA). 아세트산나트륨(sodium acetate)을 표준시료로 하여 검량선을 구하고 유리된 아세테이트 농도를 구하였다.

반응조건(pH, 온도)에 따른 히알루론산 탈아세틸화제의 활성은 표 2에 나타내었다.

온도(℃)	pH
온도(℃)	5.5	7	8.5
실온	3.8%	5.8%	6.5%
40℃	7.5%	10.6%	10.8%
60℃	12.6%	11.8%	20.1%

표 2에 나타난 바와 같이, 균주로부터 분리된 히알루론산 탈아세틸화제의 활성이 약알칼리성에서 온도가 증가할수록 우수함을 확인하였다.

실시예 3 : 탈아세틸화된 히알루론산의 제조

히알루론산(0.363%) 27.5㎖(0.1g)을 0.1M Tris-HCl 완충용액(pH 8.5) 55㎖에 가하여 녹이고, 상기 실시예 1에서 제조한 히알루론산 탈아세틸라제 68.75㎖를 가한 다음, 증류수 96.25㎖와 1M KCl 27.5㎖를 넣어 총 부피를 275㎖로 맞추었다. 그 다음 40℃에서 4시간 동안 반응시키고, 반응물에 99% 에탄올(Merck, #1.00983.1011)을 1:5의 중량비로 추가하여 탈아세틸화된 히알루론산을 석출시킨 다음, 99% 에탄올로 세척하고, 이를 다시 증류수에 용해시키고 증류수에 투석시켰다. 24시간 후, 동결건조하여 탈아세틸화된 히알루론산을 얻었다.

실시예 4 : 탈아세틸화된 히알루론산의 제조

히알루론산(Fluka, #53747, Mw 1,400kDa)을 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 0.3%로 용해하고, 상기 실시예 2에서 제조한 히알루론산 탈아세틸라제를 100㎕/㎖의 농도로 추가한 다음, 55℃ 항온수조에서 3시간 동안 반응시키고, 가열판을 이용하여 100℃에서 2분 동안 반응시켰다. 반응물에 99% 에탄올(Merck, #1.00983.1011)을 1:5의 중량비로 추가하여 탈아세틸화된 히알루론산을 석출시킨 다음, 99% 에탄올로 세척하고, 이를 다시 증류수에 용해시키고 증류수에 투석시켰다. 24시간 후, 동결건조하여 탈아세틸화된 히알루론산을 얻었다.

비교예 1 : 화학적 방법으로 탈아세틸화된 히알루론산의 제조

히드라진 일수화물 6㎖에 히알루론산 0.12g을 가하여 2%(w/v) 혼합물을 제조한 후, 황산 히드라진(hydrazine sulfate) 0.06g을 첨가하였다. 상기 혼합물을 55℃에서 72시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 혼합물에 차가운 에탄올 10㎖를 가하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 에탄올로 여러 차례 세척하고 진공상태에서 24시간 동안 건조시켰다. 건조된 시료를 5% 아세트산 수용액 2㎖에 용해시킨 후, 수용성 0.5M 요오드산(HIO₃) 1.2㎖를 가하고 4℃에서 1시간 이상 방치하였다. 그 다음 수용성 57% HI 0.35㎖를 가하고 15분 동안 교반하여 짙은 보라색의 용액을 얻었다. 이 용액을 분별깔때기에 넣고 에틸에테르 3㎖를 가하고 격렬하게 몇 분 동안 흔든 후, 수용액 층을 회수하고 수용액의 색이 완전히 없어질 때까지 반복한 후에 0.2M NaOH를 이용하여 얻어진 수용액의 pH가 7.0~7.5 범위가 되도록 맞추고 수용액에 다시 에탄올을 가하여 침전물을 얻었다. 침전물을 증류수에 용해시키고 증류수에 투석시켰다. 그 다음 동결건조하여 화학적으로 탈아세틸화된 히알루론산을 얻었다.

실험예 2 : 탈아세틸화된 히알루론산의 탈아세틸화도 측정

탈아세틸화된 히알루론산의 탈아세틸화도는 TNBS에 의한 유리 아민기 정량법을 이용하여 N-아세틸-D-글루코사민을 표준시료로 하여 검량선을 구하고 유리 아민의 함량을 측정하는 비색법으로 구하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 3 및 4, 비교예 1에서 제조한 탈아세틸화된 히알루론산 2~4㎎을 4% NaHCO₃ 수용액(pH 9.0) 1.0㎖에 녹였다. 상기 용액에 0.05% TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid)를 1.0㎖ 첨가한 다음, 40℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 6M HCl을 3.0㎖ 첨가하고, 60℃에서 90분 동안 반응을 더 진행시킨 다음 실온에 방치하여 충분히 식힌 후, 증류수 5㎖를 가하고 345㎚에서 흡광도를 측정하여 유리 아민의 함량을 측정하였다.

결과는 표 3에 나타내었다.

탈아세틸화된 히알루론산	탈아세틸화도
실시예 3	4.22
실시예 4	10.6
비교예 1	1.43

표 3에 나타난 바와 같이, 탈아세틸라제에 의해 탈아세틸화된 히알루론산의 탈아세틸화도는 화학적인 탈아세틸화 반응에 의해 탈아세틸화된 히알루론산의 탈아세틸화에 비해 우수하였다. 따라서, 탈아세틸라제에 의한 효소 가수분해법이 화학적인 방법보다 더 효율적으로 히알루론산의 아세틸기를 제거함을 알 수 있다.

실험예 3 : 탈아세틸화에 따른 히알루론산의 생분해성 비교 실험

탈아세틸화에 따른 히알루론산의 생분해성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 4에서 제조한 탈아세틸화된 히알루론산을 시트르산염 완충용액(pH 4.5)에 녹인 후, 0.5% 히알루론산과 2unit/㎖ 히알루로니다제를 되도록 빠르게 섞은 후 레오미터의 플레이트 위로 옮긴 다음, 1분 후 부터 30분 동안 점도를 측정하였다. 이때, 조건은 전단응력(shear stess) 1 Pa.s, 37℃, 30분으로 실시하였다.

히알루로니다제에 의한 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산과 탈아세틸화된 히알루론산의 분해속도를 비교한 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 히알루로니다제에 의한 탈아세틸화된 히알루론산의 점도는 초기 1~5분 값에서 히알루로니다제에 의한 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산의 점도와 비교하였을 때 기울기에서 차이를 보여 생체에서의 초기 분해 속도가 지연됨을 확인할 수 있었다.

실험예 4 : 탈아세틸화에 따른 히알루론산의 겔 전기영동에 의한 분자량 비교 실험

탈아세틸라제 또는 화학적인 방법에 의해 탈아세틸화된 히알루론산의 분자량을 비교하기 위하여, 겔 전기영동을 수행하였다. 구체적으로는, 단백질 전기영동 장치를 이용하여 12% 아크릴아미드 겔[30% 아크릴아미드 3.85㎖, 증류수 6.15㎖, 3% 과황산암모늄(ammonium persulfate) 0.5㎖, TEMED 0.01㎖]을 겔판에 2㎝ 정도 높이로 겔을 형성한 다음, 1.2% 아크릴아미드 용액(40mM Tris-아세테이트 2.425㎖, 아크릴아미드 0.114g, 비스-아크릴아미드 0.006g, 6.4% β-디메틸아미노프로피오니트릴)을 60℃로 예열한 다음, 3% 과황산암모늄 0.75㎖를 첨가하고 바로 2% 아가로오스 용액을 첨가하여 혼합한 후, 겔 플레이트에서 n-부탄올을 제거시킨 아가로오스-아크릴아미드 혼합물을 상기 아크릴아미드 겔에 신속히 주입하고 well former를 삽입하여 약 4~8℃에서 겔을 완전히 굳혔다. 40mM Tris-아세테이트 완충용액(pH 6.8)에 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산과 상기 실시예 4 및 비교예 1에서 제조한 탈아세틸화된 히알루론산을 각각 1㎎/㎖의 농도로 녹인 다음, 염색용액(20% 수크로오스 수용액, 0.001% 브로모페놀 수용액)과 1:4(v/v)의 부피비율로 혼합한 다음, 해밀톤 주사기(Hamilton syringe)를 이용하여 20㎕씩 로딩하였다. 60V로 전기영동하면서, 염색용액이 겔 안으로 들어가면 120V로 승압하였다. 전기영동이 끝난 겔 플레이트에서 겔을 조심히 분리한 후, 0.1M 아세트산 100㎖에 200㎎ 톨루이딘 블루를 녹인 염색 시약으로 염색하였다. 20분 후 3% 아세트산(v/v)에 90분간 탈염한 다음, 물로 세척하였다.

결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 탈아세틸라제에 의해 탈아세틸화된 히알루론산(실시예 4)의 경우 화학적인 방법으로 탈아세틸화된 히알루론산(비교예 1)에 비해 분자량 저하가 최소화되어 고분자량의 탈아세틸화된 히알루론산을 제조할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 5 : 탈아세틸화에 따른 히알루론산의 점성도 변화

탈아세틸라제 또는 화학적인 방법에 의해 탈아세틸화된 히알루론산의 점성도 변화를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 4에서 제조한 탈아세틸화된 히알루론산(EnHyA), 비교예 1에서 제조한 화학적으로 탈아세틸화시킨 히알루론산(Chem-HyA), 및 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산 (HyA)을 증류수에 각각 0.3%씩 녹인 후 레오미터의 플레이트 위로 옮긴 다음, 전단응력 1 Pa.s, 37℃의 조건으로 점성도를 측정하여 반응에 따른 영향을 비교하였다.

결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 탈아세틸라제에 의해 탈아세틸화된 히알루론산(실시예 4)의 경우 화학적인 방법으로 탈아세틸화된 히알루론산(비교예 1)에 비해 점성도 저하가 최소화되어 고점성도를 가진 탈아세틸화된 히알루론산을 제조할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 6 : 탈아세틸화된 히알루론산과 베타-글리시딜포스페이트의 상호작용에 의한 온도에 따른 점탄성도 측정

양이온성의 유리 아민기를 가진 탈아세틸화된 히알루론산과 음이온성의 베타-글리시딜포스페이트를 혼합하여 온도에 따른 혼합 용액의 점탄성도를 측정하여 탈아세틸화에 따른 겔화 정도를 비교하여 하이드로겔로의 가능성을 조사하였다. 구체적으로는, 베타-글리시딜포스페이트 45% 수용액에, 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산 또는 상기 실시예 4에서 제조한 탈아세틸화된 히알루론산을 증류수 중에 각각 0.7%가 되도록 제조한 수용액을 1:1(v/v)의 비율로 잘 섞었다. 이때, 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산 또는 탈아세틸화된 히알루론산이 용액 제조 중 분해를 막고, 또한 베타-글리시딜포스페이트 수용액과의 혼합 과정 중 생길 수 있는 겔화를 최소화하기 위해 4℃ 상태를 유지하여 실험하였다. 혼합된 용액을 레오미터의 플레이트 위로 옮긴 다음, 오실레이션 모드에서 1 헤르쯔의 주파수, 전단응력 10 Pa.s의 조건으로 온도를 분당 1℃씩 서서히 올리면서 혼합 용액의 점탄성도를 측정하여 탈아세틸화에 따른 겔화 정도를 비교하였다. 탄성 모듈러스가 점성 모듈러스를 초과할 때의 온도를 겔화온도라고 한다.

결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 탈아세틸화된 히알루론산의 겔화점은 약 52.8℃이고 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산의 겔화점은 약 49.7℃로, 탈아세틸화된 히알루론산의 겔화점이 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산의 겔화점보다 약 3.1℃ 감소함을 확인하였다. 상기 결과에 의해, 음이온성의 베타-글리시딜포스페이트와 양이온성의 유리 아민기를 가진 탈아세틸화된 히알루론산의 정전기적 상호작용에 의해 겔화가 촉진됨을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 탈아세틸화된 히알루론산은 세포, 유전자, 약물 등의 전달체 또는 조직공학용 지지체로서 제조가 가능함을 알 수 있다.

실험예 7 : 탈아세틸화된 히알루론산이 키토산/베타-글리시딜포스페이트의 혼합용액의 겔화에 미치는 영향

상기 실험예 6에 의해 탈아세틸화된 히알루론산이 베타-글리시딜포스페이트와 정전기적 상호작용에 의해 겔화가 촉진됨을 확인하였다. 따라서, 탈아세틸화된 히알루론산이 베타-글리시딜포스페이트 수용액과 상호작용에 의해 겔화가 되는 것으로 알려져 있는 키토산 혼합용액의 겔화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로는, 베타-글리시딜포스페이트 45% 수용액에, 키토산(탈아세틸화도 80%, 분자량 700kD, Fluka) 또는 상기 실시예 4에서 제조한 탈아세틸화된 히알루론산을 증류수 중에 각각 2.0%가 되도록 제조한 수용액을 1:0.4(v/v)의 비율로 잘 섞은 다음 온도에 따른 이들 혼합용액의 점탄성 거동을 레오미터를 이용하여 조사하였다. 이때, 베타-글리시딜포스페이트 수용액과의 혼합 과정 중 생길 수 있는 겔화를 최소화하기 위해 4℃ 상태를 유지하여 실험하였다. 혼합된 용액을 레오미터의 플레이트 위로 옮긴 다음, 오실레이션 모드에서 1 헤르쯔의 주파수, 전단응력 10 Pa.s의 조건으로 온도를 분당 1℃씩 서서히 올리면서 혼합 용액의 점탄성도를 측정하여 탈아세틸화에 따른 겔화 정도를 비교하였다.

결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 탈아세틸화된 히알루론산이 첨가되지 않은 경우는 42.2℃ 부근에서 겔화가 일어났으나(a), 본 발명의 탈아세틸화된 히알루론산이 첨가된 경우는 33.1℃ 부근에서 겔화가 일어났다(b). 따라서, 본 발명의 탈아세틸화된 히알루론산이 겔화를 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.

실험예 8 : 탈아세틸화된 히알루론산의 세포적합성 실험

본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론사의 세포적합성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로는, 사람 중간엽세포(human mesenchymal stromal cell; hMSC; bone marrow derived, Lonza Walkersville, Inc., P=5)를 96-웰 플레이트 내의 MSCGM Bullet Kit(Catalog No: PT-3001, Lonza, Walkersville, MD USA) 배지 50㎕ 중에 3×10³ cells/100㎕/well의 농도로 95% 습도와, 세포가 지지체에 충분히 부착할 수 있도록 37℃, 5% CO₂ 배양기 중에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 각 웰에 0.3%, 0.6%, 0.9%의 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산 용액 또는 0.3%, 0.6%, 0.9%의 상기 실시예 4에서 제조한 탈아세틸화된 히알루론산 용액을 첨가한 다음, 2일에 1번씩 동일 농도의 히알루론산을 함유한 배지를 교환하면서 배양 후 3일 및 6일 후 배지를 제거하고 웰당 셀카운팅 키트-8 염료 [(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt), DOJINDO, JAPAN]와 배지 혼합액(1:9 v/v)을 500㎕ 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 셀카운팅 키트-8 염료에 의해 오렌지색으로 발색된 배지 혼합액을 96-웰 플레이트에 각각 100㎕씩 취하여 마이크로플레이트 ELISA 리더 (Molecular Devices, USA)를 사용하여 405㎚ 파장에서의 흡광도 값을 측정하여 히알루론산 농도 및 배양 시간에 따른 hMSC의 증식정도를 확인하였다(n=4). 세포의 생존율은 CCK-8 kit를 이용하여 하기 수학식 1로 구하였다. 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산과 탈아세틸화된 히알루론산의 농도에 따른 hMSC의 형태 변화는 현미경으로 관찰하였다.

[수학식 1]

세포 생존율(%) = [시료의 흡광도/대조군의 흡광도]×100

탈아세틸화 되지 않은 히알루론산과 탈아세틸화된 히알루론산의 농도에 따른 hMSC의 형태 변화를 현미경으로 관찰한 결과는 도 11에 나타내었으며, 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산과 탈아세틸화된 히알루론산의 농도 및 배양시간에 따른 hMSC의 증식정도는 도 12에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 탈아세틸화된 히알루론산의 세포 친화성은 hMSC의 형태(24-웰 플레이트, P=5, 1.8×10⁴ cells/㎖/well)에서 현저한 차이가 관찰되지 않았다.

또한, 도 12에 나타난 바와 같이, 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산의 경우 농도가 증가할수록 hMSC의 세포생존율이 감소함을 확인하였는데, 이는 Taichi Ito 등이 발표한 히알루론산 및 화학적 치환물의 경우 배지 중에 이들 농도가 증가함에 따라 중피(mesothelial) 세포에 대해서 세포 생존율이 감소하는 실험 결과와 일치함을 확인하였다(Ito T, Fraser IP, Yeo Y, Highley CB, Bellas E, Kohane DS., Anti-inflammatory function of an in situ cross-linkable conjugate hydrogel of hyaluronic acid and dexamethasone. Biomaterials. 2007 Apr;28(10):1778-86.). 그러나, 본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론산의 경우 hMSC의 생존율은 배지 중의 탈아세틸화된 히알루론산의 농도 증가에 거의 영향을 받지않음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론산은 생체재료로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체는 생체에서의 초기 분해 속도가 지연되고, 분자량 및 점성도의 저하가 현저히 낮으며, 겔화점은 탈아세틸화 되지 않은 히알루론산의 겔화점보다 감소하여 겔화가 촉진되고, hMSC의 생존율이 배지 중의 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체의 농도 증가에 거의 영향을 받지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체는 세포, 유전자, 약물 등의 전달체 또는 조직공학용 지지체 등의 생체재료로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Deacetylation hydrolase of hyaluronic acid, and hyaluronic acid and its derivative deacetylated by the same <130> P10-08316 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene sequence of deacetylation hydrolase of hyaluronic acid isolated from Aspergillus nidulans <400> 1 atgctgtttc ctaatgtgcc gggtgtggca tctcttctct cactcttcgc cgcaaccctc 60 atcctaaaca ctcaagccct agccatcaat acaatagcaa acctcacaga ccgacaaccg 120 cgtgtttcct acggtctata cattcaccat tgctacgttc ctggagtggt agccctaacc 180 ttcgatgacg gaccctacat ttacacagaa gaactcctcg acatactcgc gcagtacggc 240 gccaaagcga ccttctttgt gaatggccac aatctagctg gcaacgaatg gctcatccag 300 cgtgttgtaa atgaaggcca ccagctagca tcgcacacat ggggccatac cgatcttact 360 gttctcagct atgatcaaat cgtcgaccaa atgacccgac tcgagtctgc ctttgtagca 420 tccgtcgggg tagtccctac ctacatgagg ccaccgtacc tcgccgccaa tgactatgtt 480 ctgggcgtca tggctgaact cggctaccat gtcattggtg ctagtgtcga taccaaggac 540 tatgagaacg atcatcctga tctgattgga cgtagtgtgg ccaagtttaa ccaggagcta 600 gatcagggag gaacgatcgt cttgtcgcat gacattcacg aacagactgt gcgaactctg 660 acacacatca tgctggagga agtgtacgaa cgagggttgc agcctacaac tgtcggaggt 720 tgtcttggtg acgacgcatg gtaccgttag 750

Claims

균주로부터 분리 및 정제되며, 히알루론산의 N-아세틸-D-글루코사민에 존재하는 아세틸기를 선택적으로 가수분해하는 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 아스페리질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 스코폴라리오프시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis), 무코르 룩시(Mucor rouxii), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 콜레토트리쿰 라게나리움(Colletotrichum lagenarium), 리조푸스 스톨로니페르(Rhizopus stolonifer), 압시디아 코에룰레아 (Absidia coerulea), 공그로넬라 부틀레리 (Gongronella butleri), 사카로마이스즈 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 엔세팔리토준 쿠니쿨리(Encephalitozoon cuniculi), 메타리지움 아니소플리애 (Metarhizium anisopliae), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococus pneumoniae), 모티에렐라(Mortierella) sp. DY-52, 리조푸스 시르시난스(Rhizopus circinans), 및 비브리오 콜레라이(Vibrio cholerae)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소.
제 1항에 있어서, 상기 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소는 서열번호 1의 아스페리질루스 니둘란스로부터 분리한 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소의 유전자 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소.
제 1항의 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소를 이용하여 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체.
히알루론산 및 이의 유도체를 pH 3.0~9.0의 완충용액 또는 증류수에 가하여 용해시키고, 여기에 제 1항의 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소를 가하여 10~70℃에서 0.001~24시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는, 제 4항의 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체의 제조방법.
제 4항의 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 포함하는 세포, 유전자 또는 약물의 전달체.
제 4항의 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체를 포함하는 조직공학용 지지체.