KR20110115886A - 관상동맥질환에 관련된 단일염기다형성 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 관상동맥질환에 관련된 단일염기다형성(SNP) 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 MMP3 유전자의 SNP를 포함하는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이 및 키트, 이들을 이용한 관상동맥질환의 진단 방법, 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝 방법 및 관상동맥질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 MMP3 유전자의 rs679620 다형성 유전자형은 특이적으로 관상동맥질환의 유전적 감수성을 진단하는 마커로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

관상동맥질환에 관련된 단일염기다형성 및 그의 용도{Single Nucleotide Polymorphisms Associated with Coronary Heart Disease and Uses Thereof}

본 발명은 관상동맥질환에 관련된 단일염기다형성(SNP) 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 MMP3 유전자의 SNP를 포함하는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이 및 키트, 이들을 이용한 관상동맥질환의 진단 방법, 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝 방법 및 관상동맥질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

대사증후군(metabolic syndrome)은 심혈관질환의 주된 위험인자인 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 복부비만 등이 동시에 발생하는 일련의 질환군으로 인슐린 저항성이 주된 원인이다. 이들 환자의 가장 중요한 사망원인은 동맥경화증(arteriosclerosis)으로 인한 심혈관질환이다(Mensah et al., Cardiol. Clin., 22: 485-504, 2004; Schernthaner G., Diabetes Res. Clin. Pract. 31 Suppl., 1996).

동맥경화증은 만성 염증성 질환이며, 혈관평활근세포의 과도한 증식이 중요한 원인으로 알려져 있다. 혈관세포의 과도한 증식은 비만, 당뇨병, 고혈압 및 고지혈증 등의 질환에서 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 발생에 중요한 병태생리이다(Ross R., Nature, 362: 801-809, 1993).

대사증후군의 유병률은 나라와 인종, 성별, 지역마다 차이를 보인다. 대사증후군의 발병에는 식습관, 생활습관, 흡연 등의 환경적 요소도 포함되지만 유전적 요인이 더욱 중요하게 작용한다고 보고되어 있다(Goldbourt et al., Arteriosclerosis, 6: 357-77, 1986; Groop et al., Diabetes, 45: 1585-1593, 1996). 그러므로 유전적 위험 요인의 규명으로 유전적 고위험군을 선별하고 이들에서 환경적 요인 등을 조절함으로써 이러한 대사성 질환을 예방하는 것이 중요하다. 따라서 대사증후군을 유발하는 유전자를 알아보고 이러한 질병을 유도하는 유전자의 다형성 (polymorphism)을 알아내는 연구는 필수적이라 할 수 있다.

단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)은 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이를 말한다. SNP는 DNA 염기서열 중 개인간 약 0.1%의 차이를 보이는데, 생김새, 질병감수성, 약물감수성 등을 다르게 나타내는 요인이 된다. 따라서 이를 잘 활용하면 환자마다의 특성에 맞는 맞춤 약물의 개발과 처방이 가능할 수도 있을 것으로 본다.

일반적으로 SNP가 표현형에 영향을 미쳐 표현형의 차이에 따라 질병의 발현 여부가 달라지는 경우에는 상기 SNP는 질환에 대한 감수성을 나타내는 마커로서 사용될 수 있다. 인간 게놈 지도의 완성에 따라 SNP의 존재에 대한 연구 결과 또한 GenBank와 같은 데이터베이스에 공개되어 있으나, SNP의 존재가 표현형에 미치는 영향에 대해서는 아직까지 대부분 미연구된 상태이다.

Matrix metalloproteinase (MMP)는 기질 금속단백효소로 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 선택적으로 분해하는 효소로 알려져 있으며 약 19종 이상이 보고되어 있다. MMP는 세포간의 해리, 세포사멸(apoptosis)의 회피, 세포분열, 혈관형성 및 수많은 성장인자와 사이토카인(cytokine)의 생체이용률에 영향을 주어 배발생, 조직형성, 염증반응, 상처치유 등을 조절한다. 특히 종양에 있어서는 종양세포의 이주뿐만이 아니라 종양의 발생과 성장 등 모든 단계에 관련되어 있다(Egeblad and Werb, Nature Reviews Cancer, 2:161-174, 2002; Hojilla et al., British J. Cancer, 89: 1817-1821, 2003). 혈관평활근세포의 증식과 이동을 촉진하는 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관신생에 중요한 역할을 한다. 혈관평활근세포의 내막내로의 이동과정 중에는 내탄력층의 통과가 필수적인데 이때 MMP1, MMP3, MMP9의 발현이 촉진되는 것으로 관찰되어 VEGF가 MMP의 발현을 증가시키는 것으로 사료되고 있다(Wang et al., Circ. Res., 83: 832-840, 1998; Newby et al., Physiol. Rev., 85: 1-31, 2005).

MMP3 유전자에서도 다양한 polymorphism이 보고되어 있다. MMP3 구조유전자에서 catalytic domain의 exon 2에는 rs679620 SNP가 존재한다(도 1). 그러나 rs679620 SNP에 대해 한국인에서의 유전자 통계학적인 데이터나 분석 결과는 아직 보고되어 있지 않으며, 이를 확인하기 위한 분석방법 또한 명확하게 확립되어 있지 않아, MMP3의 단일염기다형성을 분석을 수행하는데는 어려움이 있었다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, MMP3 유전자의 단일염기다형성(NCBI refSNP ID: rs679620)이 관상동맥질환과 밀접한 관련성이 있다는 사실을 확이하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 관상동맥질환의 진단을 위한 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, （ｂ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, （ｃ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 특이적으로 코딩되는 폴리펩티드 또는 (d) 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 cDNA와 이들을 포함하는 관상동맥질환 진단용 조성물, 관상동맥질환 진단용 마이크로어레이 또는 관상동맥질환 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 MMP3 유전자의 단일염기다형성을 이용한 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝 조성물, 스크리닝 방법 또는 관상동맥질환 치료용 의약 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, （ｂ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, （ｃ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 특이적으로 코딩되는 폴리펩티드 또는 (d) 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 관상동맥질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, （ｂ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, （ｃ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 특이적으로 코딩되는 폴리펩티드 또는 (d) 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 관상동맥질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 마이크로어레이를 포함하는 관상동맥질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 시험대상물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험대상물질이 상기 폴리펩티드의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 확인하는 단계를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기가 AA 유전자형을 갖는 MMP3 유전자를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 MMP3 유전자의 rs679620 다형성 유전자형은 특이적으로 관상동맥질환의 유전적 감수성을 진단하는 마커로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 MMP3 유전자에서의 Lys45Glu 폴리모피즘(polymorphism)의 위치를 나타낸 도면이다(A: chromosome 11q22.3; B: MMP3 유전자 지도, 네모로 표시된 영역이 대표적인 엑손임).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 MMP3 유전자 rs679620 단일염기다형성과 관련된 정상군과 환자군의 동종접합체(homozygote), SNP homozygote 및 이종접합체(heterozygote) 유전자형의 비율을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 MMP3 유전자 Lys45Glu (A198G) 단일염기다형성 확인을 위한 시퀀싱 결과를 나타낸 그래프이다(A: wild type (A), B: SNP type (G)).

본 발명자들은 MMP3(Matrix metalloproteinase 3) 유전자의 유전자 다형성이 관상동맥질환에 영향을 미칠 것으로 예측하고, 관상동맥질환 환자를 대상으로 MMP3 유전자에서의 유전자 다형성(polymorphism)을 연구한 결과, MMP3 유전자의 rs679620 다형성 유전자형은 특이적으로 관상동맥질환의 유전적 감수성을 진단하는 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서 정상인과 관상동맥질환 환자들을 대상으로 MMP3 유전자에 존재하는 유전자 다형성을 연구한 결과, MMP3 유전자의 198번째 염기에 A/G 대립유전자와 관련된 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP가 존재하며, 상기 SNP 위치에서 AG 유전자형 또는 GG 유전자형을 갖는 경우가 정상 대조군(AA 유전자형)에 비해 관상동맥질환 환자군에서 유의하게 높으므로, MMP3 유전자의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP는 관상동맥질환에 대한 감수성 진단용 마커로 이용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치는 198번째 염기인 것을 특징으로 한다.

상기 SNP에 대한 NCBI의 refSNP ID는 상기 SNP의 서열 및 그 위치를 나타내는 것이다. 당업자라면 상기 번호를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. NCBI에 등록되어 있는 SNP의 refSNP ID에 해당하는 구체적인 서열은 계속되는 유전자에 대한 연구 결과에 따라 약간씩 변경될 수 있으며, 이러한 변경된 서열 또한 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당업자에게 자명할 것이다.

상기 서열번호 1의 염기서열은 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드는 상기 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 한 염기서열에 크게 제한받지 않으며, 하기 표 1의 서열번호 5~서열번호 14의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 예시할 수 있다.

서열번호	염기서열 (n= a or g)
서열번호 5	c tca naa aag
서열번호 6	acc tca naa a
서열번호 7	naa aag atg t
서열번호 8	acc tca naa aag
서열번호 9	acg acc tca naa
서열번호 10	acc tca naa aag atg
서열번호 11	acg acc tca naa aag atg
서열번호 12	act acg acc tca naa aag atg
서열번호 13	act act acg acc tca naa aag atg tga
서열번호 14	act act acg acc tca naa aag atg tga aac

본 발명은 다른관점에서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드이다.

대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드라 함은 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행된다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 대립 유전자 특이적 프로브일 수 있다. 본 발명에 있어서 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 관상동맥질환에 대한 감수성을 진단하기 위한 마이크로어레이 등의 진단 키트나 진단 방법 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 대립 유전자 특이적 프라이머일 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이여야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 예컨대 서열번호 2 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머셋 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머셋 일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다.

상기 폴리펩티드는 관상동맥질환 진단용 조성물, 마이크로어레이 또는 키트, 또는 관상동맥질환의 진단 방법 또는 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝 방법 등에서 사용될 수 있다. 다르게는 상기 폴리펩티드를 대신하여 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 사용할 수도 있다. 상기 항체로는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, （ｂ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, （ｃ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 특이적으로 코딩되는 폴리펩티드 또는 (d) 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 관상동맥질환 진단용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물을 이용하여 NCBI GenBank 등록 번호 rs679620의 SNP 위치의 유전자형을 조사하면 관상동맥질환에 대한 감수성을 진단할 수 있게 된다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, （ｂ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, （ｃ）상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 특이적으로 코딩되는 폴리펩티드 또는 (d) 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 관상동맥질환 진단용 마이크로어레이 및 상기 마이크로어레이를 포함하는 관상동맥질환 진단용 키트에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이 및 진단 키트는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제작될 수 있으며, 제작된 마이크로어레이 또는 진단 키트를 이용하여 관상동맥질환을 진단할 수 있다.

본 발명에 따른 관상동맥질환의 진단 방법은 대상자로부터 핵산 시료를 분리하는 단계; 및 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI GenBank 등록 번호 rs679620의 SNP 위치의 염기의 대립 유전자형을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 핵산 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함할 수 있다.

예를 들어 대상자의 조직, 체액 또는 세포로부터 DNA를 분리해 낸 후 PCR을 통해 DNA를 증폭시킨 후 SNP 분석을 실시한다. SNP 분석은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 실시예에서와 같이 Real Time PCR System을 이용하여 SNP 분석을 수행하거나, 디데옥시법에 의해 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 수행할 수 있으며, 또는 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe ybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism) 등을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 시험대상물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 시험대상물질이 상기 폴리펩티드의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 확인하는 단계를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 폴리펩티드와 시험대상물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질과 시험대상물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 상기 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 폴리펩티드 외에도, 폴리펩티드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내 (in vivo) 실험을 위해, 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 관상동맥질환 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기가 AA 유전자형을 갖는 MMP3 유전자를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 NCBI GenBank 등록 번호 rs679620의 SNP 위치의 염기가 AG 또는 GG 유전자형을 갖는 경우 관상동맥질환에 대한 발병 가능성이 높다. 따라서 AG 또는 GG 유전자형을 갖는 관상동맥질환 환자의 경우 NCBI GenBank 등록 번호 rs679620의 SNP의 유전자형을 AA 유전자형으로 수정하여 관상동맥질환을 치료할 수 있다. 따라서 관상동맥질환 환자의 세포 내로 NCBI GenBank 등록 번호 rs679620의 SNP 위치의 염기가 AA 유전자형을 갖는 MMP3 유전자를 도입하여 관상동맥질환을 치료할 수 있다. AA 유전자형을 갖는 MMP3의 도입은 당업자에게 공지되어 있는 통상적인 핵산 치료법에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, AA 유전자형을 갖는 MMP3 유전자를 바이러스성 전달체 또는 비바이러스성 전달체를 통해 세포 내로 도입하여 NCBI GenBank 등록 번호 rs679620의 SNP의 유전자형을 AA 유전자형으로 수정하여 관상동맥질환을 치료할 수 있다. 본 발명의 MMP3 유전자를 유효 성분으로 하는 조성물의 치료상 유효량은 관상동맥질환을 치료하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.

따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 유전자 다형성 판독을 통한 관상동맥질환 환자에서의 MMP3 유전자 다형성 분석

1-1. 실험대상의 선정

경북대학교 병원에 외래를 방문한 관상동맥질환 환자 200명를 실험군으로, 정상인 100명을 대조군으로 선정하였다. 정상인의 선택기준은 60세 이상, 관상동맥질환과 고혈압의 병력이 없고, 공복혈당 100mg/dL 이하, 당화혈색소 6.0% 이하였다. 모든 참여자들은 나이, 성별, 키, 몸무게를 기록하였고, 설문지 조사를 통해 흡연력, 고콜레스테롤혈증 및 고혈압 유무를 조사하였다. 혈액학적 검사는 고밀도 지단백 콜레스테롤, 저밀도 지단백 콜레스테롤, 중성지방, 총콜레스테롤, 공복혈당, 당화혈색소, C-reactive protein 및 혈청 크레아티닌을 측정하였다. 모든 검사들은 임상시험 심사위원회(IRB)의 기준에 맞게 참여자들의 자발적인 동의하에 시행되었다.

1-2. 프라이머 제작

dbSNP#	Allele
rs679620	Lys45Glu	A/G

상기 표 2에 나타난 바와 같이, MMP3(rs679620)의 45번째 아미노산은 lysine (AAA)에서 glutamic acid (GAA)로 A→G 단일 염기변이가 있는 지점이다. MMP3의 198번째 염기이며 45번째 아미노산에서 첫 번째 염기 A 또는 G를 3'말단에 갖는 1F1 프라이머(서열번호 2): AGA AAA CTA CTA CGA CCT A A (wild type) 및 1F2 프라이머(서열번호 3): AGA AAA CTA CTA CGA CCT A G (SNP type)을 각각 sense primer로 제작하였고, R1 프라이머(서열번호 4): AAG ATG CTG TTG ATT CTG CT는 antisense primer로 제작하여 공통으로 사용하였다(표 3). 이때, 상기 Sense primer의 대립유전자(allele) 특이성을 높이기 위하여 3'말단으로부터 두 번째 염기 C를 A로 치환하였다.

Primer	Orientation	Type	Sequence (5'to 3')	GC%	Size (bp)
서열번호 2	Sense	Wild	AGA AAA CTA CTA CGA CCT AA	35.0	20
서열번호 3	Sense	SNP	AGA AAA CTA CTA CGA CCT AG	40.0	20
서열번호 4	Antisense		AAG ATG CTG TTG ATT CTG CT	40.0	20

1-3. PCR을 이용한 MMP3 유전자의 단일염기다형성 분석

1-1의 실험대상으로부터 추출한 genomic DNA 0.5 ㎕, 1-2에서 제작한 프라이머 0.5 ㎕, Taq DNA polymerase 0.1 ㎕, dNTPs 0.5 ㎕, MgCl₂(2.5mM) 및 reaction buffers 1 ㎕을 혼합한 후, 하기 표 4의 조건으로 wild type과 SNP type에 대하여 각각 2개의 tube에서 PCR을 별도로 수행하였다.

SNP	Denaturation	Annealing	Extension	cycle
Lys45Glu (A198G)	30 sec	30 sec	30 sec	35
	94℃	55℃	72℃

PCR이 완료된 후, 증폭된 유전자를 확인하기 위해 1.2% agarose gel에서 100 volts로 15분간 전기영동을 수행하였다.

임상적으로 정상군과 환자군 남ㅇ녀 총 300명을 조사한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, MMP3 유전자 rs679620 단일염기다형성과 관련하여 wild type 동종접합체(homozygote), SNP homozygote 그리고 이종접합체(heterozygote)가 확인되었다.

유전자 다형성 판독의 결과는 다음 표 5 및 6과 같다.

Genotype	Controls (%)	Cases (%)	P
AA	78(78)	108(54)	0.000
AG	19(19)	72(36)
GG	3(3)	20(10)

표 5로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 관상동맥질환 환자와 대조군에서 MMP3 (rs679620) 다형성에 대해 유전자형 빈도와 위험도를 비교해 보면, 대조군과 비교하여 관상동맥질환 환자에서 AG 와 GG genotype이 AA genotype 보다 의미있게 빈도가 높게 나왔다 (p value 0.000).

Genotype	Male		Female
	Control (%)	Case (%)	Control (%)	Case (%)
AA	22(61.1)	63(58.3)	56(87.5)	45(48.9)
AG	13(36.1)	37(34.3)	6(9.4)	35(38.0)
GG	1(2.8)	8(7.4)	2(3.1)	12(13.1)

표 6으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 관상동맥질환 환자와 대조군에서 MMP3 (rs679620) 다형성에 대해 남녀별로 유전자형 빈도를 비교해 보면, 특히 여성에 있어서 대조군과 비교하여 관상동맥질환 환자에서 AG 와 GG genotype이 AA genotype 보다 빈도가 높게 나왔다.

1-4. MMP3 유전자의 시퀀싱 분석

1-3의 PCR로 증폭된 wild type과 SNP type 유전자를 정제한 후 (주)Macrogen (Korea)에 의뢰하여 자동염기서열반응으로 염기서열을 결정하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 MMP3 유전자 rs679620의 단일염기다형성 확인을 위한 시퀀싱 결과를 각각 나타낸 그래프이다.

도 3에 나타난 바와 같이, wild type과 SNP type에서 단일염기다형성이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

인간염색체에 SNP가 존재한다고 해서 반드시 질병에 걸리는 것은 아닐지라도 일부 환자에서는 SNP 유전자형 차이가 질병과의 연관성이 있다는 연구 결과가 많이 이루어져 있다(Ozaki et al., Nat Genet.,38: 921-925, 2006; Rissanen et al., Diabetes Care., 23: 1533-1538, 2000; Sajurai et al., Hor. Metab. Res., 32: 31-32, 2000). 인종별 또는 국가별로 유전형에 차이가 있으면 질병감수성 차이를 나타낸다는 것도 잘 알려진 사실이다. 관상동맥질병 발생률이 낮은 국민(멕시코, 코스타리카)의 경우 당뇨병환자에서 관동맥 병변의 빈도 및 범위가 적다. 반면 관상동맥질병의 빈도가 높은 국민(노르웨이, 미국)에서는 당뇨병환자에서 관상동맥질병의 빈도 및 범위도 크다는 보고가 있다(Robertson and Strong, Lab. lnvest., 18: 538-551, 1968).

따라서, 본 발명에서는 MMP3 유전자의 rs679620 단일염기다형성을 신속하고 정확하게 분석하는 방법을 제시함으로써, 한국인 특이적인 변이를 확인할 수 있었으며, 관상동맥질환 진단용 SNP의 용도를 제공하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Keimyung University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Single Nucleotide Polymorphisms Associated with Coronary Heart Disease and Uses Thereof <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1828 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(1828) <223> matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase) (MMP3), which has single nucleotide polymorphism at 198th base(A/G)(NCBI refSNPvID: rs679620), wherein the 198th base is described as A. <400> 1 ctacaaggag gcaggcaaga cagcaaggca tagagacaac atagagctaa gtaaagccag 60 tggaaatgaa gagtcttcca atcctactgt tgctgtgcgt ggcagtttgc tcagcctatc 120 cattggatgg agctgcaagg ggtgaggaca ccagcatgaa ccttgttcag aaatatctag 180 aaaactacta cgacctcaaa aaagatgtga aacagtttgt taggagaaag gacagtggtc 240 ctgttgttaa aaaaatccga gaaatgcaga agttccttgg attggaggtg acggggaagc 300 tggactccga cactctggag gtgatgcgca agcccaggtg tggagttcct gatgttggtc 360 acttcagaac ctttcctggc atcccgaagt ggaggaaaac ccaccttaca tacaggattg 420 tgaattatac accagatttg ccaaaagatg ctgttgattc tgctgttgag aaagctctga 480 aagtctggga agaggtgact ccactcacat tctccaggct gtatgaagga gaggctgata 540 taatgatctc ttttgcagtt agagaacatg gagactttta cccttttgat ggacctggaa 600 atgttttggc ccatgcctat gcccctgggc cagggattaa tggagatgcc cactttgatg 660 atgatgaaca atggacaaag gatacaacag ggaccaattt atttctcgtt gctgctcatg 720 aaattggcca ctccctgggt ctctttcact cagccaacac tgaagctttg atgtacccac 780 tctatcactc actcacagac ctgactcggt tccgcctgtc tcaagatgat ataaatggca 840 ttcagtccct ctatggacct ccccctgact cccctgagac ccccctggta cccacggaac 900 ctgtccctcc agaacctggg acgccagcca actgtgatcc tgctttgtcc tttgatgctg 960 tcagcactct gaggggagaa atcctgatct ttaaagacag gcacttttgg cgcaaatccc 1020 tcaggaagct tgaacctgaa ttgcatttga tctcttcatt ttggccatct cttccttcag 1080 gcgtggatgc cgcatatgaa gttactagca aggacctcgt tttcattttt aaaggaaatc 1140 aattctgggc tatcagagga aatgaggtac gagctggata cccaagaggc atccacaccc 1200 taggtttccc tccaaccgtg aggaaaatcg atgcagccat ttctgataag gaaaagaaca 1260 aaacatattt ctttgtagag gacaaatact ggagatttga tgagaagaga aattccatgg 1320 agccaggctt tcccaagcaa atagctgaag actttccagg gattgactca aagattgatg 1380 ctgtttttga agaatttggg ttcttttatt tctttactgg atcttcacag ttggagtttg 1440 acccaaatgc aaagaaagtg acacacactt tgaagagtaa cagctggctt aattgttgaa 1500 agagatatgt agaaggcaca atatgggcac tttaaatgaa gctaataatt cttcacctaa 1560 gtctctgtga attgaaatgt tcgttttctc ctgcctgtgc tgtgactcga gtcacactca 1620 agggaacttg agcgtgaatc tgtatcttgc cggtcatttt tatgttatta cagggcattc 1680 aaatgggctg ctgcttagct tgcaccttgt cacatagagt gatctttccc aagagaaggg 1740 gaagcactcg tgtgcaacag acaagtgact gtatctgtgt agactatttg cttatttaat 1800 aaagacgatt tgtcagttat tttatctt 1828 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F1 primer <400> 2 agaaaactac tacgacctaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F2 primer <400> 3 agaaaactac tacgacctag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 primer <400> 4 aagatgctgt tgattctgct 20 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 5 ctcanaaaag 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 6 acctcanaaa 10 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 7 naaaagatgt 10 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 8 acctcanaaa ag 12 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 9 acgacctcan aa 12 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 10 acctcanaaa agatg 15 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 11 acgacctcan aaaagatg 18 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 12 actacgacct canaaaagat g 21 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 13 actactacga cctcanaaaa gatgtga 27 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide containing NCBI refSNI ID: rs679620(n=a or g) <400> 14 actactacga cctcanaaaa gatgtgaaac 30

Claims (12)

1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
   
2. 상기 폴리뉴클레오티드의 NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치는 198번째 염기인 것을 특징으로 하는 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드.
   
3. 제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 대립 유전자 특이적 프로브 또는 대립 유전자 특이적 프라이머인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머셋 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머셋인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
   
6. 제1항의 관상동맥질환 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
   
7. (a)　제1항의 폴리뉴클레오티드, （ｂ）제3항의 폴리뉴클레오티드, （ｃ）제6항의 폴리펩티드 또는 (d) 제1항의 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 관상동맥질환 진단용 조성물.
   
8. (a)　제1항의 폴리뉴클레오티드, （ｂ）제3항의 폴리뉴클레오티드, （ｃ）제6항의 폴리펩티드 또는 (d) 제1항의 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 관상동맥질환 진단용 마이크로어레이.
   
9. 제8항의 마이크로어레이를 포함하는 관상동맥질환 진단용 키트.
   
10. 제6항의 폴리펩티드를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝용 조성물.
    
11. 제6항의 폴리펩티드를 시험대상물질과 접촉시키는 단계; 및
    상기 시험대상물질이 상기 폴리펩티드의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 확인하는 단계를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약의 스크리닝 방법.
    
12. NCBI refSNP ID: rs679620의 SNP 위치의 염기가 AA 유전자형을 갖는 MMP3 유전자를 포함하는 관상동맥질환 치료용 의약 조성물.

Images