KR20110110738A

KR20110110738A - Ｔｒａｉｌ 센서타이저 타겟 유전자인 ｔｉｐ４１의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 ｔｒａｉｌ 감수성 증진용 조성물

Info

Publication number: KR20110110738A
Application number: KR1020110030415A
Authority: KR
Inventors: 김남순; 송인성; 김철희; 하가희; 김현택; 정소영; 김정민; 김주헌; 김진만
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2011-10-07
Also published as: CN102821778A; WO2011122916A9; CN102821778B; US8703732B2; WO2011122916A2; EP2556840A4; WO2011122916A3; US20120315284A1; EP2556840A2; EP2556840B1; JP5551793B2; KR101380840B1; JP2013515717A

Abstract

본 발명은 TIP41 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 TRAIL 감수성 증진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TRAIL 내성을 보이는 간암 세포주에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리하였을 때, 암세포주 특이적 세포사멸이 유도되며, 간암뿐만 아니라, TRAIL 내성이 있는 폐암 및 대장암에서도 세포사멸을 유도하고, 동물실험을 통해 종양의 크기 감소 및 암세포의 사멸을 유도하며, 이러한 사멸이 TIP41 발현억제로 인한 MKK7/JNK 전달경로 활성에 기인됨을 밝혔으므로, TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제의 조성물을 암의 예방 및 치료용 또는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＴＲＡＩＬ 센서타이저 타겟 유전자인 ＴＩＰ４１의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 ＴＲＡＩＬ 감수성 증진용 조성물{Composition for enhancing TRAIL sensitivity comprising inhibitors for expression or activity of TIP４１ as a target gene of TRAIL sensitizer}

본 발명은 TIP41 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 TRAIL 감수성 증진용 조성물에 관한 것이다.

암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서, 세포주가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고 비조절적인 방식으로 증식하고 불사화 되어 발생하는 질병이다. 암 발생의 원인으로는 화학물질, 바이러스, 세균, 전리방사선 등의 환경적 또는 외적 요인과 선천성 유전자 변이 등의 내적 요인을 들 수 있다(Klaunig & Kamendulis, Annu Rev Pharmacol Toxicol., 44:239-267, 2004).

초기에 발견된 암일 경우 수술, 방사선 치료, 화학적 요법 등의 치료법이 있으나 그 부작용 또한 큰 문제로 대두하고 있으며, 말기 암이나 전이된 암의 경우 특별한 치료법 없이 시한부 인생으로 삶을 마감하는 상황이다. 또한, 암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되고 그에 따른 치료제가 개발되어 오고 있으나, 아직까지 암에 대한 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있다.

트레일(TNF related apoptosis inducing ligand, TRAIL)은 종양괴사인자과(tumor necrosis factor, TNF)에 속하는 사이토카인으로써 사멸 수용체 경로(death receptor pathway)를 활성화시켜 세포사멸을 유도하는 리간드이다. TRAIL은 4개의 수용체를 갖고 있으며, 이 중 사멸 수용체4/5(death receptor 4/5, DR4/5)는 암세포주에서, 디코이 수용체(decoy receptor1/2, DcR 1/2)는 정상세포주에서 과발현된다고 알려져 있다. 디코이 수용체의 경우는 c-터미널 말단에 사멸도메인(death domain)을 가지고 있지 않아 세포사멸 신호전달이 세포 내로 전해지지 않는다. 따라서, TRAIL을 기반으로 하는 치료는 정상세포주에는 부작용이 없는 차세대 항암 치료제로 주목되고 있다.

현재까지 알려진 많은 항암제 및 암 저해제들은 비특이성으로 인한 정상조직에의 심한 부작용, 높은 돌연변이율로 인한 암세포주의 내성 획득 등의 문제점을 가지고 있다. 그러나 1997년 TRAIL이 정상세포주에는 작용하지 않고 암세포주에만 작용하여 세포사멸을 유도한다는 사실이 발견된 이후, TRAIL은 암세포주 특이적 항암제일 뿐만 아니라 기존 항암 치료제에 대해 저항성을 획득한 암세포주의 치료제로서의 가능성이 대두되었다. 그러나 유방암, 전립선암, 자궁암, 폐암, 간암, 뇌종양 등의 암에서는 TRAIL 내성이 나타나고 있으며, TRAIL을 암세포주에 지속적으로 처리하면 TRAIL에 감수성을 보이던 암세포주도 차차 TRAIL에 대해 내성을 가지는 것으로 밝혀졌다.

TRAIL 내성 기전은, 디코이 수용체 1과 2의 과발현 등으로 인한 사멸 수용체4/5의 작용저해, 세포 내 세포사멸 신호전달의 저해 등으로 예상되며, 그 중에서도 세포 내 신호전달체계의 변화로 인한 내성 획득이 보다 설득력있는 기전으로 인식되고 있다. 이러한 신호전달체계의 변화는 세포사멸 단백질(proapoptotic protein)의 작용을 저해하는 항세포사멸 단백질(antiapoptotic protein)의 과발현이 주요 원인으로 알려졌다. 이에 따라, 신규 TRAIL의 내성을 극복하는 치료제의 발굴에 의해 TRAIL 내성이 극복되어 암세포주특이적 세포사멸을 증진시키는 TRAIL 센서타이저(sensitizer)의 개발은 필수적으로 요구되는 연구 분야이다.

암 뿐만 아니라, TRAIL이 매개된 세포사멸 경로가 류마티스 관절염, 당뇨병성 신장질환, 퇴행성 뇌질환의 질병에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(대한류마티스 회지 Vol.12, No.2, June, 2005; J AM Sco Nephrol 19: 904-914(2008); Cell Death Differ. 2003 Jan;10(1):134-41). 자가면역 질환의 일종인 관절염 등에 있어서 과다 활성화된 면역세포의 사멸을 유도하여 병증의 완화 및 치료를 위하여 TRAIL을 이용한 다양한 접근이 시도되고 있다. 따라서 TRAIL은 위에서 언급한 다양한 암종의 치료뿐만 아니라 실험적 자가면역 뇌수막염 (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis(EAE)), 류마티스 관절염 및 제 1형 당뇨병 등의 T-세포 기인성 자가면역 질환의 치료 등에도 유용하게 이용될 수 있다.

TIP41 유전자는 TIPRL(TOR signalling pathway regulator-like)로도 불리며, 효모에서 처음 분리되었다. TIP41 단백질은 효모에서 TAP42 단백질과 상호작용함으로써 라파마이신(rapamycin)에 반응하는 TOR 신호전달체계를 음성적으로 조절한다고 알려져 있다(Jacinto E 등, Mol cell. 8(5): 1017-26, 2001). 인간의 TIP41 유전자는 효모의 TIP41 유전자와 37% 상동성을 가지며, NF-kappaB 신호전달 체계와 MAPK 신호전달 체계를 활성화한다고 알려져 있다(Matsuda A 등, Oncogene., 22(21): 3307-3318, 2003). 인간 TIP41 유전자의 기능은 효모에서 나타나는 TIP41 유전자의 기능과 달리 세포주의 증식을 활성화할 것으로 예상되나, 지금까지 인간 TIP41 유전자의 기능으로 알려진 것들 중 간암이나 위암 또는 암 발생 등과 관련해서는 어떠한 보고도 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 기존의 TRAIL 내성을 보이는 간암 세포주에서 TIP41 siRNA(small interfering RNA)를 처리하여 TIP41의 발현을 억제시킨 후, TRAIL을 처리하였을 때, 암세포주의 특이적 세포사멸이 유도되며, 이는 간암 뿐만 아니라, TRAIL에 대한 내성이 있는 폐암과 대장암에서도 세포사멸이 관찰되고, 종양을 이식한 마우스에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 주입하였을 때, 종양의 크기 감소 및 암세포의 사멸을 유도하는 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 TRAIL 감수성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 TRAIL 감수성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TIP41 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항암 보조제를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 TRAIL 내성을 보이는 간암 세포주에서 TIP41 siRNA를 처리하여 그 발현을 억제시킨 후, TRAIL을 처리하였을 때, 암세포주 특이적 세포사멸이 유도되며, 이는 간암뿐만 아니라, TRAIL에 대한 내성을 갖고 있는 폐암과 대장암에서도 효과가 관찰되며, 종양을 이식한 마우스에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 투여하였을 때, 종양의 크기 감소 및 암세포의 사멸을 유도하는 효과를 가지므로, TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 TRAIL 감수성 증진용 조성물 또는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 간암 조직에서 TIP41 발현증가 양상과 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 처리하여 TIP41 발현억제를 확인한 그림이다:
도 1의 A는 간암 조직에 발현되는 TIP41을 나타낸 그림이다;
도 1의 B는 간암 조직(HBV 감염 또는 비감염 간암조직)과 그와 인접한 정상조직에서의 TIP41 발현량을 웨스턴 블랏을 이용하여 나타낸 그림이다;
도 1의 C는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 처리하였을 때, TIP41 단백질의 발현억제를 나타낸 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA; 및
si-TIP41: TIP41 siRNA.
도 2는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 처리한 후 유도되는 세포사멸을 확인한 그림이다:
도 2의 A는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리한 후, 세포사멸을 핵염색법을 이용하여 확인한 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-1017: TIP41 siRNA;
도 2의 B는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리한 후, Annexin V-FITc/PI 염색법을 이용한 FACS로 분석한 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA;
도 2의 C는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 농도별로 처리한 후, Annexin V-FITc/PI 염색법을 이용한 FACS로 분석한 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA; 및
si-TIP41: TIP41 siRNA.
도 3은 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리한 후, 세포사멸에 관여하는 단백질의 발현을 확인한 그림이다:
도 3의 A는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리한 후, 케스페이즈(Casepase)-3, -8, -9 및 PARP의 활성을 확인한 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA;
도 3의 B는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리한 후, 사이토크롬 C(Cytochrome C)가 세포질(cytosol)로 방출되는 것을 확인한 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA; 및
si-TIP41: TIP41 siRNA.
도 4는 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리한 Huh7 간암 세포주의 세포사멸 경로에서 JNK 전달경로의 관련성을 확인한 그림이다:
도 4의 A는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리한 후, JNK의 활성을 확인한 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA;
도 4의 B는 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리한 Huh7 간암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 세포사멸의 감소를 나타낸 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA;
Vehicle: 0.3% 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO); 및
SP600125: JNK 억제제.
도 5는 Huh7 간암 세포주에서 TIP41 siRNA와 TRAIL로 유도되는 세포사멸이 p53 전달경로 비의존적인 신호경로인 것을 나타낸 그림이다:
도 5의 A는 Huh7 간암 세포주에서 TIP41 siRNA와 TRAIL로 유도되는 세포사멸이 p53 전달경로 비의존적인 신호경로인 것을 나타낸 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA; 및
도 5의 B는 p53 널 세포주(null cell)에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL 처리에 의한 세포사멸이 p53과 무관하게 유도되는 것을 확인한 그림이다.
도 6은 TIP41 단백질 발현억제와 TRAIL 수용체와의 관계를 나타낸 그림이다:
도 6의 A는 세포주별 TRAIL 수용체의 발현을 나타낸 그림이다;
도 6의 B는 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 처리한 후, TRAIL 수용체의 발현을 나타낸 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA; 및
도 6의 C는 간암 임상조직에서의 단계별 TRAIL 수용체의 발현을 나타낸 그림이다.
도 7은 정상세포주인 HAEC에 TIP41 siRNA와 TRAIL에 의해 세포사멸이 유도되지 않음을 나타내는 그림이다:
도 7의 A는 정상세포주인 HAEC에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리한 후 유도되는 세포사멸을 나타낸 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA;
Human Aortic Endothelial cells: 인간 대동맥 상피 세포주;
도 7의 B는 정상세포주인 HAEC에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리한 후, 세포사멸에 관여하는 전 세포사멸(pro-apoptotic) 단백질의 활성을 확인한 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA; 및
si-TIP41: TIP41 siRNA.
도 8은 TIP41 단백질 발현억제 후, TRAIL을 처리한 폐암과 대장암 세포에서 증가되는 것을 나타낸 그림이다:
도 8A의 A는 A549 폐암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킴으로써, TRAIL을 시간대별로 처리한 후, 케스페이즈(Casepase)-3, -8, -9 및 PARP의 활성을 확인한 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA;
도 8A의 B는 HCT116 대장암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 농도별로 처리한 후 유도되는 세포사멸이 대조군 siRNA에 비해서 증가됨을 나타낸 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA;
도 8B는 폐암 세포주에서 세포주 염색 분석(도 8B의 A)과 FACS 분석(도 8B의 B 및 C)을 통한, TIP41 siRNA의 TRAIL 감수성를 증가시켜 암 세포 사멸을 증가시키는 결과는 나타낸 그림이다; 및
도 8C는 다양한 간암 세포주에서 TIP41 siRNA의 TRAIL 감수성를 증가시켜 암 세포 사멸을 증가시키는 효과를 확인한 그림이다.
도 9는 동물실험을 통한 TIP41 siRNA의 기능을 검증한 그림이다:
도 9A는 누드 마우스(nude mouse)에 종양을 이식하고, TIP41 siRNA와 TRAIL을 주입한 후, 종양의 크기가 줄어드는 것을 나타낸 그림과 그래프이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA;
도 9B는 누드 마우스의 종양을 염색에 의한 세포사멸을 나타낸 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA;
si-TIP41: TIP41 siRNA; 및
도 9C는 누드 마우스의 종양 용해물로부터 세포사멸에 관여하는 케스페이즈-8(Caspase-8) 단백질의 활성을 웨스턴 블랏을 나타낸 그림이다.
도 10은 TIP41과 PP2Ac와의 상호작용을 확인한 그림이다:
도 10의 A는 PP2Ac를 과발현시킨 후, TIP41과 PP2Ac와의 상호작용을 확인한 웨스턴 블랏 결과 분석을 나타낸 그림이다; 및
도 10의 B는 TIP41과 PP2Ac 복합체 사이 및 TIP41과 MKK7 사이의 상호작용을 확인한 그림이다.
도 11은 TIP41과 PP2Ac 복합체 및 MKK7 사이의 상호작용을 확인한 그림이다:
도 11의 A는 MKK7을 과발현시킨 후, TIP41과 PP2Ac 복합체 및 MKK7 사이의 상호작용을 확인한 그림이다;
도 11의 B는 면역침전법을 이용한, TIP41과 PP2Ac 복합체 및 MKK7 사이의 상호작용을 확인한 그림이다; 및
도 11의 C는 시험관 내 GST 면역침전법을 이용한, TIP41과 PP2Ac 복합체 및 MKK7 사이의 상호작용을 확인한 그림이다.
도 12는 MKK7과 상호작용하는 TIP41의 결합부위를 확인하는 그림이다:
도 12의 A는 MKK7과 상호작용하는 TIP41의 결합부위를 확인하기 위해 제작한 TIP41 단편을 나타낸 그림이다; 및
도 12의 B는 MKK7과 상호작용하는 TIP41의 결합부위를 웨스턴 블랏을 통해서 나타낸 그림이다.
도 13은 TIP41과 상호작용하는 MKK7의 결합부위를 확인하는 그림이다:
도 13의 A는 TIP41과 상호작용하는 MKK7의 결합부위를 확인하기 위해 제작한 MKK7 단편을 나타낸 그림이다; 및
도 13의 B는 TIP41과 상호작용하는 MKK7의 결합부위를 웨스턴 블랏을 통해서 나타낸 그림이다.
도 14는 TIP41과 상호작용하는 MKK7에 의한 세포사멸 경로를 확인한 그림이다:
도 14의 A는 MKK7 발현억제 후 감소하는 세포사멸의 감소를 확인한 그림이다;
도 14의 B는 TIP41 발현억제 후, MKK7/JNK 경로의 활성화를 나타낸 그림이다;
si-cont: 대조군 siRNA; 및
si-MKK7: MKK7 siRNA.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 TRAIL 감수성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 TIP41 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제는 TRAIL 센서타이저(sensitizer)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 TIP41 단백질의 발현 억제제는 TIP41 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 TIP41 단백질의 활성 억제제는 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 조성물은 상기 조성물은 TRAIL을 이용한 암, 염증성 질환 또는 자가면역 질환 치료시 사용되는 것이 바람직하다.

상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 그레브스병, 하시모토씨 갑상선염, 애디슨병, 백반증, 경피증, 굿패스쳐 신드롬, 베제트병, 크론병, 강직성 척추염, 포도막염, 혈소판 감소성 자반증, 심상성 천포창, 소아 당뇨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 크라일로글로불린증, 부신백질이영양증 및 전신성 홍반성 낭창으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

안티센스 뉴클레오티드

안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포주흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

펩티드 미메틱스( Peptide Minetics )

상기 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)는 TIP41 활성을 이끄는 TIP41 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. J Med chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th AmeriCan Peptide Symposium) Pierce chemiCal co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al. in Peptides; chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al. Biochem Biophys Res commun 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al. in Peptides: chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., EScOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.

siRNA 분자

센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 TIP41 mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 siRNA 분자는 TIP41 유전자의 염기서열 내에서 선택되는 10개 내지 30개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, TIP41 유전자의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.

항체

TIP41 항체는 TIP41 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.

다클론 항체는 상기 TIP41을 동물에 주사하고, 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포주 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; cote RJ et al., Proc Natl ACad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 cole SP et al., Mol cell Biol 62:109-120, 1984).

또한, 상기 TIP41에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).

상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.

앱타머( Aptamer )

앱타머(Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 앱타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346:818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되었다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.

본 발명의 한가지 실험예에서 간암조직에서 TIP41 단백질이 정상조직에 비해서 과발현됨을 면역조직염색법 및 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다. 또한, 간암 세포주에서 TIP41 발현 억제는 TIP41 siRNA를 형질감염시킨 간암 세포주에서 확인할 수 있었다(도 1 참조).

본 발명의 한가지 실험예에서 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염하여 세포 내 TIP41 발현량을 감소시킨 후 TRAIL을 시간대별로 처리하였을 때, 세포사멸이 증가됨을 핵염색법과, FACS 분석방법을 이용하여 확인하였다. 또한 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염한 후, TRAIL 농도별로 처리하여 세포사멸을 유도한 후, FACS 방법을 이용하여 분석한 결과, TIP41 siRNA와 TRAIL을 함께 처리하였을 때, TRAIL만을 처리하였을 때보다 세포사멸이 더욱 증가됨을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

본 발명의 한가지 실험예에서 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염한 후, TRAIL을 시간대별로 처리하였을 때, 세포사멸에 관여하는 단백질의 발현을 살펴본 결과, 케스페이즈(Caspase)-3, -8, -9 및 폴리(ADP-리보오스)중합효소(Poly ADP ribose polymerase, PARP)가 활성화됨을 확인할 수 있었다. 또한, 사이토크롬 C(Cytochrome C)의 발현이 세포질(cytosol)에서 확인됨으로써, Huh7 간암 세포주에서 TIP41 단백질 발현 억제와 TRAIL 매개 세포사멸은 외인성 경로(extrinsic pathway)와 내인성 경로(intrinsic pathway)를 혼합한 형태로 일어남을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

본 발명의 한가지 실험예에서 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염한 후, TRAIL을 시간대별로 처리하였을 때, 씨-준-아미노말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase, JNK) 전달경로의 활성을 확인할 수 있었으며, JNK 억제제를 처리하였을 때, TIP41 단백질 발현 억제와 TRAIL 매개 세포사멸이 감소가 관찰되므로, 이러한 JNK 전달경로가 TIP41 단백질 발현 억제를 통하여 TRAIL 매개 세포사멸에 중요한 역할을 수행하고 있음을 알 수 있었다(도 4 참조).

본 발명의 한가지 실험예에서 TIP41 단백질 발현억제와 TRAIL 처리에 의해 유도되는 세포사멸이 정상세포주의 사멸을 유도하지 않으며, 암세포주 특이적으로 발생함을 확인하기 위하여, 자가세포사멸 경로에 관여하는 p53 단백질의 영향을 확인한 결과, p53 단백질의 15 과 392번 세린(serine)에 인산화가 일어남을 확인할 수 있었다. 그러나 p53 결핍 HCTC 동질유전자 세포주(p53-defecient HCT116 isogenic HCC cell)에 TIP41 단백질 발현을 억제한 후 TRAIL을 처리하여 세포사멸을 유도하였을 때, 세포사멸이 유도됨을 확인하였다. 이는 TIP41과 TRAIL 매개 세포사멸은 p53 비의존적 경로를 통해 일어남을 시사한다(도 5 참조).

본 발명의 한가지 실험예에서 세포주별로 TRAIL 수용체의 발현양상을 확인한 결과, 간암 및 폐암 세포주에서 TRAIL-R2(DR5)의 발현이 정상 세포주에 비해 간암 및 폐암 세포주에서 과발현됨이 확인되었다. 또한, 간암 세포주에서 TIP41 단백질 발현을 억제시킨 후, 간암 세포주에서 TRAIL 수용체의 발현을 확인한 결과, TRAIL 수용체 발현이 유사하다는 것이 확인되었다. 이는 TIP41 단백질 발현 억제를 통한 세포사멸의 증가가 TRAIL 수용체 발현 변화에 의한 것이 아님을 시사한다(도 6 참조).

본 발명의 한가지 실험예에서 정상세포주에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리한 후, 세포사멸을 관찰한 결과, TIP41 siRNA 처리와 관계없이 세포사멸의 차이가 없었으며, 세포사멸에 관여하는 단백질의 활성에 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 따라서, TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL 매개 세포사멸은 암세포주 특이적으로 발생함을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

본 발명의 한가지 실험예에서 간암이외의 TRAIL에 내성을 갖는 다른 폐암과 대장암 세포주에 siRNA를 이용항 TIP41 넉다운(knock down)과 TRAIL 처리에 의한, 세포사멸 유도가 확인되었다(도 8 참조).

본 발명의 한가지 실험예에서 동물실험을 통한 TIP41 기능 검증하기 위하여, 간암 세포주를 누드 마우스(nude mouse)의 등에 이식한 후, TIP41 siRNA와 TRAIL을 주입하여, 종양의 크기 감소 및 암세포주 사멸을 확인하였으며, 세포사멸에 관여하는 단백질의 활성이 TRAIL만을 주입하였을 때보다, TIP41 siRNA와 TRAIL을 함께 주입하였을 때 세포사멸 관련 단백질의 활성이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다(도 9 참조).

또한, TRAIL 센서타이저로써 TIP41 siRNA에 의해서 유도된 세포사멸 경로를 확인하기 위하여, TIP41과 결합하는 단백질로 알려진 MKK7과 PP2Ac 복합체 사이의 상호작용을 확인하였다(도 10, 및 도 11 참조).

또한, 보다 구체적으로 TIP41과 결합하는 MKK7의 결합부위를 확인하기 위하여, MKK7의 다양한 부위를 포함하는 단편을 제작하여 그 결합부위를 확인하였다(도 12, 및 도 13 참조).

아울러, TIP41 발현 억제와 TRAIL 처리에 의해서 유도되는 세포사멸의 경로가 상기 TIP41과 MKK7 사이의 상호작용에 의한 것인지 확인하기 위하여, Huh7 간암 세포주에서 MKK7의 발현을 억제한 후, 세포사멸을 분석을 수행하였다. 이 경우, 세포사멸이 감소하는 결과를 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 세포사멸이 MKK7 활성에 의해서 유도되는 JNK 활성화에 의하여 일어나는지 실험하였을 때, TIP41 억제에 의한 MKK7/JNK 신호기작 활성화가 확인되었다(도 14 참조).

따라서, TRAIL 내성을 보이는 간암 세포주에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리하였을 때, TRAIL에 대한 내성이 있는 간암, 폐암 및 대장암에서도 세포사멸이 유도되었다. 더욱이, 종양을 이식한 마우스에서 TIP41 siRNA와 TRAIL을 주입하였을 때, 종양의 크기 감소 및 암세포의 사멸을 유도가 관찰되었다. 따라서, TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제는 TRAIL 감수성 증진용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 조성물은 TIP41 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 TIP41 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 TIP41 단백질의 발현 억제제는 TIP41 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 TIP41 단백질의 활성 억제제는 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 및 천연물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 간암, 폐암 또는 대장암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, TRAIL에 대한 내성을 가진 암은 모두 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 항암 보조제에 있어서, TIP41 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TRAIL 감수성을 증진시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 실험예에서 TIP41 단백질이 간암조직에서 과발현되며(도 1 참조), Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 시간대별로 처리하였을 경우, 세포사멸이 TRAIL만 처리할 때보다 더욱 증가하였다(도 2 참조). 또한, TIP41 siRNA와 TRAIL 매개 세포사멸 경로를 알아보기 위하여 케스페이즈-3, -8, -9 및 폴리(ADP-리보오스)중합효소 활성과, JNK 전달경로 관련 단백질 및 p53 단백질을 관찰한 결과, 세포 사멸은 TIP41 siRNA와 TRAIL을 함께 처리하였을 때에 TRAIL을 단독 처리할 때보다 세포사멸이 더욱 증가하였으며, 이는 암세포주 특이적인 세포사멸임을 확인할 수 있었다(도 3, 도 4, 도 5, 및 도 7 참조). 또한, TIP41 단백질의 발현을 억제하였을 경우, TRAIL 수용체의 발현은 변화가 없음을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 간암 이외의 TRAIL에 내성을 갖는 다른 세포주에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리하여, 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(도 8 참조). 아울러, 누드 마우스의 등에 이식한 종양의 크기가 TIP41 siRNA와 TRAIL을 주입하였을 때에 TRAIL, TIP41 siRNA를 단독 주입하였을 때보다 더욱 감소되며, 종양조직에서 분리한 암세포주의 세포사멸과 세포사멸에 관여하는 단백질의 활성화가 TIP41 siRNA와 TRAIL을 주입하였을 때 가장 많이 관찰되었다.

따라서, TRAIL 내성을 보이는 간암 세포주에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리하였을 때, 암세포주 특이적 세포사멸 TRAIL에 대한 내성을 갖고 있는 간암, 폐암, 대장암에서도 세포사멸을 유도되며, 종양을 이식한 마우스에서도 TIP41 siRNA와 TRAIL을 주입하였을 때, 종양의 크기 감소 및 암세포의 사멸을 유도하는 효과를 가지므로, TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 항암 보조제는 TIP41 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.

상기 항암 보조제는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 항암 보조제는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 항암 보조제의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 항암 보조제는 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 한가지 실시예에서, 본 발명에 따른 TIP41 발현 또는 활성 억제제를 TRAIL과 함께 처리하였을 때, TRAIL에 내성을 갖고 있는 다양한 간암, 폐암 및 대장암 세포주의 암 특이적인 세포사멸이 증가하였다. 또한, 본 발명에 따른 TIP41 발현 또는 활성 억제제의 암 특이적인 세포 사멸의 생체 내(in vivo) 효과가 종양을 이식한 누드모델에서 관찰되었다.

따라서, 본 발명에 따른 TIP41 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제는 암 치료 또는 예방용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 TIP41 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법은 하기의 단계들을 포함하는 방법인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) 실험군으로서 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 TIP41과 PP2Ac 단백질 사이의 결합수준 또는 TIP41과 MKK7 단백질 사이의 결합수준을 확인하는 단계; 및

3) 단계 2)의 TIP41과 PP2Ac 단백질 사이의 결합수준 또는 TIP41과 MKK7 단백질 사이의 결합수준을 대조군과 비교하여 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계.

상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 간암, 폐암 또는 대장암인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, TRAIL에 대한 내성을 가진 암은 모두 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 있어서, 제 16항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 결합수준은 면역침전법(immunoprecipitation), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏(Western Blotting), Glutathione-S-Transferase(GST) pull down 분석, 단백질 칩(Protein Chip), 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), 이분자 형광 상보(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 및 효모 2중 하이브리드(Yeast two-hybrid, Y2H)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

1) 실험군으로서 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 MKK7 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 MKK7 단백질 활성이 대조군과 비교하여 증가된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.

상기 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 있어서, MMK7 단백질의 활성 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

1) 실험군으로서 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 PP2Ac 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 PP2Ac 단백질 발현량이 대조군과 비교하여 감소된 피검물질을 선별하는 단계.

본 발명의 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2)의 PP2Ac 단백질의 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실험예 및 제조예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실험예 1> 간암 및 폐암 조직에서 TIP41 단백질 발현 확인

<1-1> 면역염색 방법을 이용한 TIP41 발현 확인

환자의 간암 조직(충남대학교 의과대학 김진만 교수팀)을 10% 중성 버퍼 포르말린 용액으로 고정시키고, 파라핀을 첨가한 뒤 5 ㎛ 두께로 절단하였다. 절단된 섹션(section)을 10 mM 구연산 버퍼(pH 6.0)에서 4분간 처리한 후, 3% 과산화수소(H2O2)가 포함된 0.1 M Tris-완충 식염수(TBS, pH 7.4)에서 30분 동안 두었다. 상기 섹션을 Protein Block Solution(DAKO)으로 상온에서 20분간 처리한 다음, 안티 TIP41 항체와 30분간 반응시켰다. 0.1 M TBST(0.01% Tween 20을 함유한 0.1 M TBS)로 세척한 다음, 섹션을 엔비전 안티-래빗 폴리머(nVision anti-rabbit polymer)(DAKO)와 30분간 반응시켰다. 퍼옥시다제(peroxidase)가 결합된 항체를 3,3'-다이나이트로벤지딘 색원체 기질 용액(3,3'-diaminobenzidine(DAB) chromogen substrate solution)(DAKO)과 반응시켜 가시화하였다. 현미경하에서 관찰하여 적절하게 염색되었을 때 0.1 M TBS로 세척하여 반응을 종료시킨 후, Olympus BX51 현미경(Olympus, 일본)을 이용하여 관찰하였고, Olympus DP 70 카메라(Olympus, 일본)로 이미지를 얻었다.

그 결과, 일반 간 조직에 비해서 간암조직에서 TIP41이 과발현됨을 관찰할 수 있었다(도 1의 A). 또한, 간암 및 폐암 환자의 주변 정상 조직에 비하여 TIP41 단백질이 이러한 환자의 암 조직에서 과발현되었다(표 1 및 2). TIP41 발현과 암 단계 사이의 관계 분석은 TIP41 양성 발현이 NSCLC, 폐암의 높은 단계와 현저하게 관련되어 있다는 것을 나타냈으며(P=0.045), 이것은 TIP41 발현과 NSCLC 진행 사이의 관계를 나타낸다(표 2). 이러한 데이터는 TIP41 발현이 HCC 및 NSCLC 세포에서 과발현된다는 것을 나타낸다.

간암(HCC) 임상조직에서 TIP41 발현량(IHC 방법)

HCC 단계	전체,n	TIP41		P
HCC 단계	전체,n	음성, n(%)	양성, n(%)	P
Ⅰ	4	1(25.0%)	3(75.0%)	0.490
Ⅱ	19	2(10.5%)	17(89.5%)
ⅢA	6	4(66.7%)	2(33.3%)
ⅢC	32	7(21.9%)	25(78.1%)
Ⅳ	6	1(16.7%)	6(83.3%)

폐암(비소세포성 폐암, NSCLC) 임상조직에서 TIP41 발현량(IHC 방법)

NSCLC 단계	전체	TIP41		P
NSCLC 단계	전체	음성, n(%)	양성, n(%)	P
Ⅰ	25	10(60.0%)	15(40.0%)	0.045
Ⅰ	47	16(34.0%)	31(66.0%)
Ⅱ	19	3(15.8%)	16(84.2%)
Ⅱ	31	6(19.4%)	25(80.6%)
ⅢA	47	4(8.5%)	43(91.5%)
ⅢB	5	1(16.7%)	5(83.3%)
Ⅳ	4	0(0%)	4(100%)

<1-2> 웨스턴 블랏을 이용한 TIP41 발현 확인

B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)에 의해 발병한 간암환자 7명과 그렇지 않은 간암환자 7명의 간암조직 및 인접 정상조직(충남대학교 의과대학)에서 추출된 단백질을 사용하여, TIP41 단백질 발현량을 웨스턴 블랏 방법을 이용해 확인하였다.

조직들을 용해 버퍼(lysis buffer)[20 mM 헤페스(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES)(pH7.5), 150 mM 염화나트륨(Nacl), 1 mM 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA), 2 mM 에틸렌글리콜테트라아세틱 산(ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA), 1% 트라이톤(Triton) X-100, 10% 글리세롤(glycerol), 프로테아즈 저해제 혼합물(Protease inhibitor cockatil), 포스파테이즈 저해제 혼합물(phosphatase inhibitor cocktail) I/II]로 조직을 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해(cell debris)를 제거하고 단백질을 얻었다. 단백질들은 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리한 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 트랜스퍼시킨 후 5% 스킴 밀크(skim milk)로 1시간 동안 비특이적 반응을 막기 위해서 블로킹하였다. 1시간 후, 니트로셀룰로오스 막은 1:2,000 TIP41(Betyl Laboratories, USA)과 1:5,000 GAPDH(Abforntier, 한국)로 4 ℃에서 12시간 이상 반응한 후 0.1% TBST(Tris-Buffered Saline Tween-20)로 10분씩 세 번 세척한 후 항 마우스(Pierce, USA) 및 항 래빗(Pierce, USA)의 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척하고 화학발광 시약(chemiluminescence reagent)을 이용해 발현을 확인하였다. 각 조직의 정량적 대조군으로 하우스 키핑 유전자(house keeping gene)인 GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다.

그 결과, B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)에 의해 발병한 간암환자 7명과 그렇지 않은 간암환자 7명의 간암조직에서 TIP41이 과발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 1의 B).

<1-3> 간암 세포주의 배양

한국세포주 은행으로부터 분양된 인간 Huh7 간암 세포주는 10% 우태아 혈청이 포함된 Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)으로 37℃ 5% CO₂에서 배양하였다. siRNA를 형질 감염 시키기 위해 Huh7 간암 세포주를 1×10⁶ cells/100 mm 디쉬에 심고 24시간 동안 배양하였으며, 그 다음 형질 감염을 수행하였다.

<1-4> siRNA 의 형질 감염

TIP41의 TRAIL 센서타이저(sensitizer)로써의 기능을 확인하기 위해 siRNA(Dharmacon RNAi Technologies, USA)를 선별하여 효과적으로 TIP41 단백질의 발현을 억제하는 서열을 구축하였다.

상기 <1-3>에서 배양된 2×10⁵ 간암 세포주를 60 mm 배양접시(culture dish)에 심고 lipofectamine RNAimax(invitrogen)를 사용하여 제조업체의 설명에 따라, siRNA(Small interfering RNA)를 형질 감염하였다. 72시간 후, 형질 감염한 세포들은 TRAIL(100 ng/㎖)을 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6시간 동안 처리한 후 세포주를 각각의 시간대에 용해 버퍼를 이용하여 세포주에서 단백질을 얻어 웨스턴 블랏을 하였다. 용해 버퍼([20 mM 헤페스(pH7.5), 150 mM 염화나트륨, 1 mM 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산, 2 mM 에틸렌글리콜테트라아세틱 산, 1% 트라이톤 X-100, 10% 글리세롤, 프로테아즈 저해제 혼합물, 포스파테이즈 저해제 혼합 I/II]로 세포를 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해(cell debris)를 제거하고 단백질을 얻었다. 단백질들은 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리한 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼시킨 후 5% 스킴 밀로 1시간 동안 비특이적 반응을 막기 위해서 블로킹하였다. 1시간 후, 니트로셀룰로오스 막은 1:2,000 TIP41(Bethyl Laboratories, USA) 및 1:5,000 tubulin(Sigma aldrich, USA)으로 4 ℃에서 12시간 이상 반응한 후 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척한 후 항 마우스(Pierce, USA) 및 항 래빗(Pierce, USA)의 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척하고 화학발광 시약을 이용해 발현을 확인하였다. 각 조직의 정량적 대조군으로 하우스 키핑 유전자인 GAPDH를 사용하였다.

사용된 TIP41 siRNA 서열은 5'- CCT AAT GAA ATA TCC CAG TAT -3'(서열번호 2)이었다.

그 결과, TRAIL을 처리의 유무와 관계 없이, TIP41 siRNA을 처리한 후, TIP41 단백질의 발현이 완전히 억제됨을 관찰할 수 있었다(도 1의 C).

< 실험예 2> TIP41 단백질 발현 억제 및 TRAL 처리에 의한 세포사멸 유도

<2-1> 핵염색법을 이용한 TIP41 단백질 발현 억제로 유도되는 세포사멸 분석

6웰 플레이트로 상기 실험예 <1-1>의 방법으로 배양된 TIP41 발현억제된 세포주들을 2×10⁵cells/웰 씩 분주하였다. 24시간 후, TRAIL을 100 ng/㎖로 각각 0, 2, 4, 6, 8 시간 동안 처리한 후 훽스트(Hoechst) 33342를 5 ㎍/㎖로 30분 동안 상온에서 염색하였다. 훽스트(Hoechst) 33342로 핵을 염색한 후, 형광현미경 하에서 사멸된 세포수를 계수하여 세포사멸을 측정하였다.

그 결과, Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 동시에 처리하였을 때, TRAIL만을 처리하였을 때보다 세포사멸이 증가하였다. TRAIL을 처리하는 시간이 길어질수록 세포사멸이 증가하며, TIP41 siRNA를 처리한 군에서 대조군 siRNA를 처리시보다 약 30% 정도 세포사멸 증가가 관찰되었다. 이를 통해 Huh7 간암 세포주에서 TIP41 siRNA의 처리는 TRAIL 저항을 감소시켜준다는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 A).

<2-2> FACS 를 이용한 TIP41 단백질 발현 억제로 유도되는 세포사멸 분석

상기 실험예 <1-1>의 방법으로 배양된 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염하여 세포 내 TIP41 발현량을 감소시킨 후 TRAIL을 100 ng/㎖ 로 처리한 후, 0, 2, 4, 6, 8 시간대에 세포사멸을 Annexin V-FITc/PI 염색법으로 사멸된 세포주와 정상세포주를 구별하여 염색한 후, FACS(Fluorescent activated cell sorter)를 사용하여 세포사멸을 측정하였다.

세포사멸을 측정하기 위해서, 세포주를 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 이용하여 세포주를 걷은 후 FITc 융합된 아넥신 V(annexin v)(50 ㎍/㎖)와 PI(propidium iodide)(50 ng/㎖)로 20분간 염색한 후 FACS Calibur(BD)를 사용하여 세포주를 분리하여, annexinV-FITc/PI 염색된 세포주의 비율을 분석하였다.

그 결과, TRAIL을 시간별로 처리한 후 세포사멸이 일어남을 FACS 분석을 통해서 확인할 수 있었으며(도 2의 B), 동일한 실험 방법으로 TRAIL을 0, 25, 50, 100, 200 ng/㎖ 농도별로 4시간 처리할 때, 처리 농도에 따라 세포사멸이 증가함을 확인할 수 있었다(도 2의 C).

< 실험예 3> TIP41 단백질 발현 억제 및 TRAIL 처리에 의해 유도된 세포사멸 경로 확인

<3-1> 케스페이즈(Caspase)의 활성화

TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리한 후 유도되는 세포사멸의 경로를 확인하기 위하여, TIP41 siRNA를 형질 감염한 72시간 후, TRAIL을 100ng/ml로 0, 0.5, 1, 2, 4, 6시간 동안 처리 후, 케스페이즈(Caspase)-3, -9, -9 및 폴리(ADP-리보오스)중합효소(Poly ADP ribose polymerase, PARP)의 발현을 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다.

상기 실험예 <1-1>의 배양한 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염한 72 시간 후, TRAIL을 100 ng/㎖로 시간대별로 처리하였다. 용해 버퍼[20 mM 헤페스(pH7.5), 150 mM 염화나트륨, 1 mM 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산, 2 mM 에틸렌글리콜테트라아세틱 산, 1% 트라이톤 X-100, 10% 글리세롤, 프로테아즈 저해제 혼합물, 포스파테이즈 저해제 혼합물 I/II]로 세포를 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해(cell debris)를 제거하고 단백질을 얻었다. 단백질들은 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리한 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼시킨 후 5% 스킴 밀크로 1시간 동안 비특이적 반응을 막기 위해서 블로킹하였다. 1시간 후, 니트로셀룰로오스 막은 1:1,000 Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 및 1:2,000 PARP(cell signaling technology, USA)로 4 ℃에서 12시간 이상 반응한 후 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척한 후, 항 마우스(Pierce, USA) 및 항 래빗(Pierce, USA)의 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척하고 화학발광 시약을 이용해 발현을 확인하였다.

그 결과, TIP41 단백질 발현이 억제된 후 TRAIL의 시간별 처리에 의해 Caspase-9, -8, -3과 PARP가 활성화됨을 확인할 수 있었다(도 3의 A). 이것은 TIP41 단백질 발현 억제에 의한 세포사멸이 TRAIL의 농도 및 시간 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

<3-2> 미토콘드리아의 사이토크롬 C의 세포질로의 방출

세포사멸 경로를 확인하기 위하여, 미코콘드리아(mitochondria)의 사이토크롬 C(Cytochrome C)가 세포질로 방출되는지 확인하기 위해 세포 분획(subcellular fractionation) 및 웨스턴 블랏을 이용하였다. 상기 실험예 <1-1>의 방법으로 배양된 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염하여 세포 내 TIP41 발현량을 감소시킨 후, 60mm 디쉬에 TIP41의 발현이 억제된 세포주들을 2×10⁶ cells/디쉬씩 분주하였다. 24시간 후, TRAIL을 100 ng/㎖로 각각 0, 1, 2, 4시간 동안 처리한 후 세포질 분획을 수행하였다. 세포질 분획은 Subcellular Proteome Extraction kit(Calbiochem사)를 사용하여 수행하였으며, 키트(kit)는 4가지 버퍼로 구성되며, 각 버퍼의 사용에 따라 세포질, 미토콘드리아, 핵 및 세포골격 단백질의 순서로 세포 분획이 분리되었다. 용출 버퍼 1(extraction buffer 1) 500 ㎕를 각각의 세포주에 첨가하여 4℃에서 10분간 교반한 후 원심분리하여 세포질 분획을 얻고, 용출 버퍼 2 500 ㎕를 4℃에서 30분간 교반한 후 원심분리하여 미토콘드리아 분획을 얻었다. 분획된 세포질과 미토콘드리아를 웨스턴 블랏 방법을 이용하였다.

상기 실험예 <1-1>의 배양한 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염한 72 시간 후, TRAIL을 0, 2, 4 및 6시간 동안 처리하였다. 용해 버퍼(lysis 버퍼)[20 mM 헤페스(pH7.5), 150 mM 염화나트륨, 1 mM 디에틸렌트리아민, 2 mM 에틸렌글리콜테트라아세틱 산, 1% 트라이톤 X-100, 10% 글리세롤, 프로테아즈 혼합물, 포스페이즈 혼합물 I/II]로 세포를 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고 단백질을 얻었다. 단백질들은 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리한 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼시킨 후 5% 스킴 밀크로 1시간 동안 비특이적 반응을 막기 위해서 블로킹하였다. 세포질 분획 마커로 튜불린(tubulin)을 이용하였으며, 미토콘드리아는 Peroxiredoxin III 을 사용하였다. 1시간 후, 니트로셀룰로오스 막은 1:1,000 Cytochrome C(BD, USA), 1:5,000 Tubulin(Sigma aldrich, USA) 및 1:2,000 퍼록시레독신 3(peroxiredoxin Ⅲ)(Abfrontier, 한국)으로 4 ℃에서 12시간 이상 반응한 후 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척한 후 항 마우스(Pierce, USA) 및 항 래빗(Pierce, USA)의 2차 항체를 1: 2,000의 비율로 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척하고 화학발광 시약을 이용해 발현을 확인하였다.

그 결과, TIP41 siRNA를 처리한 후 사이토크롬 C가 세포질로 방출됨을 확인할 수 있었다(도 3의 B). 즉, 케스페이즈 -8과 -9가 활성화되었으며, 미토콘드리온(mitochondrion)으로부터 세포질로 사이토크롬 C가 방출됨을 확인하였다. 이러한 결과는 Huh7 간암 세포주에서 TIP41 단백질 발현 억제와 TRAIL 처리로 유도되는 세포사멸이 Caspase/미토콘드리아 의존적 세포사멸 경로와 밀접하게 연관되어 있음을 나타내는 것이다.

< 실험예 4> TIP41 단백질 발현 억제 및 TRAIL 처리로 유도되는 JNK 전달경로의 활성

<4-1> TIP41 단백질 발현 억제 및 TRAIL 처리로 유도되는 JNK 전달경로의 단백질 활성

자가 세포사멸(apoptosis)의 경우 JNK의 인산화(phosphorylation)에 의한 경우가 많은 논문들에서 보고되었으며, p38의 활성화 역시 세포사멸을 유도할 수 있다는 보고가 있었다.

JNK 및 p38의 활성이 세포사멸을 유도한다고 보고되어져 있다. 이에 따라, 상기 <실험예>에서 확인된 TIP41 단백질 발현 억제와 TRAIL 처리로 유도되는 세포사멸과 미토겐-활성 단백질 키나아제(Mitogen-Activated Protein, MAP) 전달경로, 특히 JNK와 p38과의 관련성을 확인하기 위해서 Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염한 후, TRAIL(100 ng/㎖)을 0, 1, 2, 4시간으로 처리하였다. 그 후, 웨스턴 블랏을 이용하여 TIP41 단백질 발현 억제와 TRAIL 처리로 유도되는 세포사멸과 JNK와 p38과의 관련성을 확인하였다.

상기 실험예 <1-1>의 배양한 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염한 72 시간 후, TRAIL을 상기 기재된 시간대별로 처리하였다. 용해 버퍼[20 mM 헤페스(pH7.5), 150 mM 염화나트륨, 1 mM 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산, 2 mM 에틸렌글리콜테트라아세틱 산, 1% 트라이톤 X-100, 10% 글리세롤, 프로테아즈 저해제 혼합물, 포스파테이즈 저해제 혼합물 I/II]로 세포를 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고 단백질을 얻었다. 단백질들은 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리한 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼시킨 후 5% 스킴 밀크로 1시간 동안 비특이적 반응을 막기 위해서 블로킹하였다. 1시간 후, 니트로셀룰로오스 막은 1:1,000의 비율로 p-MKK7(cST Inc., USA)과 p-p38(cST Inc., USA)를 사용하였으며, 1:1,000의 비율로 p-JNK(cST Inc., USA)를 사용하였으며, 1:5,000의 비율로 Tubulin(Sigma aldrich, USA)을 사용하여 4℃에서 12시간 이상 반응한 후, 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척한 후 항 마우스(Pierce, USA) 및 항 래빗(Pierce, USA)의 2차 항체를 1: 2,000의 비율로 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척하고 화학발광 시약을 이용해 발현을 확인하였다.

그 결과, 도4의 A에서 보는 바와 같이 RNAi에 의한 TIP1의 하향 조절은 TRAIL에 의해 유도되는 MKK7/JNK 활성을 연장시키기에 충분함을 알 수 있었다(도 4의 A).

<4-2> JNK 억제제의 처리에 의한 세포사멸의 감소

JNK 전달경로와 TIP41 억제와 TRAIL 처리로 유도되는 세포사멸간의 관련성을 확인하기 위해서, 실험예 <4-1>과 동일한 방법으로 세포주를 배양하고, TIP41 siRNA를 처리한 후, JNK 억제제인 SP600125(10 ㎍/㎖)를 1시간 동안 처리하여 JNK 전달경로를 차단하였다. TRAIL 자극으로 유도되는 세포사멸을 Annexin-FITc/PI 염색법을 이용한 FACS 분석법을 사용하여 측정하였다.

그 결과, JNK 억제제를 처리하여 JNK 전달경로를 차단시킨 후, TRAIL 을 처리한 실험에서 세포사멸이 감소되었다. 이를 통해, JNK 전달경로가 TIP41 단백질 발현억제와 TRAIL 처리로 유도되는 세포사멸에 중요한 역할을 수행하고 있음을 알 수 있었다(도 4의 B).

<실험예 5> TIP41 단백질 발현 억제 후 p53 비의존적 세포사멸 경로 확인

<5-1> 간암 세포주에서 p53 비의존적 세포사멸 경로 확인

현재 사용되는 항암제의 가장 큰 문제점은 정상세포주와 암세포주를 구분하지 못하고 정상세포주를 죽이는 부작용을 가지고 있으며, 이러한 정상세포주의 사멸 기작은 p53경로의 활성화를 통해서 일어난다고 알려졌다. p53의존적 세포사멸을 유도하는 항암제는 암세포주뿐만 아니라 정상 세포주에도 영향을 미치게 되므로, TIP41 siRNA 처리 후, TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸이 p53을 통해서 일어나는 것인지 확인하였다.

TIP41 siRNA를 Huh7 간암 세포주에 형질 감염한 72시간 후 100 ng/㎖의 TRAIL을 0, 2, 4 및 6시간 처리하였다. 포스포-p53(phospho-p53) 항체를 사용한 웨스턴 블랏 방법을 수행하여 세포사멸이 p53 전달경로를 경유하여 일어나는지를 확인하기 위하여, p53의 인산화(phosphorylation)를 확인하는 항체를 이용하였다. p-p53(Ser 6), p-p53(Ser 9), p-p53(Ser 15), p-p53(Ser 20), p-p53(Ser 37), p-p53(Ser 46) 및 p-p53(Ser 392)을 이용하여, p53의 세린(serine) 6, 9, 15, 20, 37, 46, 392번의 인산화를 확인하였다.

용해 버퍼[20 mM 헤페스(pH7.5), 150 mM 염화나트륨, 1 mM 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산, 2 mM 에틸렌글리콜테트라아세틱 산, 1% 트라이톤 X-100, 10% 글리세롤, 프로테아즈 저해제 혼합물, 포스파테이즈 저해제 혼합물 I/II ]로 세포를 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고 단백질을 얻었다. 단백질들은 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리한 후, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼시킨 후 5% 스킴 밀크로 1시간 동안 비특이적 반응을 막기 위해서 블로킹하였다. 1시간 후, 니트로셀룰로오스 막은 모두 1:1,000의 비율로 p-p53(Ser 6), p-p53(Ser 9), p-p53(Ser 15), p-p53(Ser 20), p-p53(Ser 37), p-p53(Ser 46) 및 p-p53(Ser 392)(cST Inc, USA)로 4 ℃에서 12시간 이상 반응한 후 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척한 후 항 마우스(Pierce, USA) 및 항 래빗(Pierce, USA)의 2차 항체를 1: 2,000의 비율로 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 0.1% TBST로 10분씩 세 번 세척하고 화학발광 시약을 이용해 발현을 확인하였다.

그 결과, 세포에 TIP41 siRNA와 TRAIL 처리하였을 때 p53 단백질의 15번과 392번 세린(serine)에 인산화가 일어남을 확인 할 수 있었다(도 5의 A). 세린 15번의 인산화는 DNA 손상 등에 의한 세포사멸에 관여하는 ATM(Ataxia telangiectasia mutated)/ATR(ATM and RAD3-related) 경로의 활성화 또는 DNA-의존적 단백질 키나아제(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK)에 의해 일어나게 되며 세포사멸과 관련이 알려져 있으며, Ser 392번의 인산화는 핵 내에서 p53 단백질이 DNA 서열에 결합하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, TIP41 단백질 발현억제를 통한 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸이 p53 의존적인 가능성이 있으나, JNK 전달경로로 활성화되는 세린이 발현되는 않은 결과를 고려하였을 때에 p53 비의존적인 가능성도 배제될 수 없었다.

<5-2> p53 결핍 세포주 배양

HCT116 세포주는 정상적으로 p53 단백질을 만드는 대장암 세포주이며, TRAIL 내성세포주로 TRAIL 단일처리에 의해 세포사멸이 자주 일어나지 않는다고 알려져 있다. HCT116 p53-결핍 세포주는 Dr. B. Vogelstein에 의해 1998년 확립된 세포주로, p53 유전자가 결손 되어있다(Vogelstein, B., Science, 1998). 상기 세포주를 분양받아 실험에 사용하였으며, 세포주들은 10% 우태아 혈청, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신, 그리고 100 IU/㎖ 암피실린(ampicillin)이 포함된 DMEM(Hyclone, USA) 배지에 100 ㎍/㎖ 안정한 항생제 마커 G418을 첨가하여 3일 주기로 계대 배양되었다.

<5-3> p53 결핍 세포주에서 p53 비의존적 세포사멸 경로 확인

p53 비의존적인 가능성을 확인하기 위하여, 상기 실험예 <5-2>에서 제작한 HCT116 p53 결핍 세포주에 TIP41 siRNA를 Huh7 간암 세포주에서와 같은 실험 방법으로 형질 감염 한 후, 동일한 조건으로 TRAIL을 처리하여 세포사멸을 유도한 후, Annexin-FITc/PI 염색법을 이용한 FACS 분석법을 수행하였다.

그 결과, TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후 TRAIL을 처리하였을 때, Huh7 간암 세포주와 같이 HCT116 p53 결핍 세포주에서도 세포사멸이 잘 유도되었으며, 이는 TIP41 단백질 발현억제에 의한 세포사멸은 p53 비의존적 경로를 통해 세포사멸이 유도됨을 의미한다. 따라서, 도 5의 A에 나타난 p53 세린 15번의 활성화는 TIP41 단백질 발현 억제에 의한 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸에 미치는 영향이 미미하며, p53이 핵으로 이동하여 전사활성을 높이는 것으로 추정할 수 있었다(도 5의 B).

< 실험예 6> TRAIL 수용체의 발현양상 측정

<6-1> 세포주별 TRAIL 수용체의 발현확인

TRAIL 저항성을 극복시켜 암세포주 특이적 치료제로서의 효능을 높이기 위해서, 암세포주의 세포사멸을 증가시키기는 방법으로 TRAIL 수용체의 발현을 증가시키는 연구결과가 보고되었다. 이러한 연구와 관련하여 TIP41유전자의 발현 억제를 통한 세포사멸과 TRAIL 수용체와의 상관관계를 확인하기 위하여 정상세포주와 간암 및 폐암 세포주에서 TRAIL 수용체의 발현양상을 확인하였다. TRAIL 수용체는 4종류로 구분되며, 이는 TRAIL-R1(DR4), TRAIL-R2(DR5), TRAIL-R3(DcR1) 그리고 TRAIL-R4(DcR2)로써, R1과 R2는 사멸 수용체로 작용하여 TRAIL이 결합하면 세포주를 자가세포사멸이 일어나도록 유도하나, R3와 R4는 디코이(decoy) 수용체로써 TRAIL이 R1과 R2에 결합을 저해하여 TRAIL에 의한 세포사멸을 저해시킨다고 알려져 있다.

정량적 실시간 PCR(qPCR)은 Huh7 간암 세포주, HAEC 정상세포주(Human aortic endothelial cell, clonetics사), A549 폐암 세포주(한국 세포주 은행)를 트라이졸(Trizol)을 이용하여 RNA를 추출한 후, 추출한 RNA 1㎍을 역전사효소 superscript II(invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 TIP41, TRAIL-R1(Death receptor(DR)4), TRAIL-R2(DR5), TRAIL-R3(DcR1) 및 TRAIL-R4(DcR2) 유전자의 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 실시하였다. PCR결과는 2-DDct comparative method를 통해 각 유전자의 상대적인 발현량을 확인하였다. TIP41 정방향 프라이머(서열번호 3: 5'-att gaa agc cag aga aca ga-3')와 TIP41 역방향 프라이머(서열번호 4: 5'-tct cgt gtc att cat tct ga-3'), DR4 정방향 프라이머(서열번호 5: 5'-ctc agc gga atc aat cag ctg tg-3'), DR4 역방향 프라이머(서열번호 6: 5'-aga gga aca cga caa tca gcc tta g-3'), DR5 정방향 프라이머(서열번호 7: 5'-atc aag cgg ccc cct ttt ttt cac-3'), DR5 역방향 프라이머(서열번호 8: 5'-ctc att gtc aca ctc ctc gac agc-3'), DcR1 정방향 프라이머(서열번호 9: 5'-tcc cca aga ccc taa agt tc-3'), DcR1 역방향 프라이머(서열번호 10: 5'-ggc acc aaa ttc ttc aac ac-3'), DcR2 정방향 프라이머(서열번호 11: 5'-gca cag agg gtg tgg att ac-3') 및 DcR2 역방향 프라이머(서열번호 12: 5'-gag cag atg cct ttg agg ta-3')를 이용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 이때, 정량적 대조군으로서 베타-2-마이크로불린(beta-2-microglobulin, B2M)의 정방향 프라이머(서열번호 13: 5'-ctc gct ccg tgg cct tag -3') 및 역방향 프라이머(서열번호 14: 5'-caa atg cgg cat ctt caa-3')로 기재된 프라이머 쌍을 사용하여 함께 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 조건으로 40 싸이클을 반복한 후, 72℃에서 8분 동안 신장시켜준 뒤, 상온까지 식혀주었다. 정량적 실시간 PCR 결과를 각 시료별 TRAIL 수용체 발현량을 B2M 발현량으로 보정해주는 2-DDct 비교 방법으로 분석한 후, 정상 간 조직에서의 TRAIL 수용체 발현량에 대한 간암 조직에서의 발현량의 배수를 그래프로 도 6에 나타내었다.

그 결과, TRAIL 내성 암세포주인 간암 및 폐암 세포주에서 TRAIL-R3(DcR1)은 정상세포주보다 낮게 발현되었으며, TRAIL-R4(DcR2)는 정상세포주와 비슷한 수준으로 발현되었다. TRAIL-R1(DR4)의 경우는 정상세포주에 비해 간암 및 폐암 세포주에서 발현량이 조금 높으나 전체 발현량이 낮았으며, TRAIL-R2(DR5)는 정상세포주에 비해 간암 및 폐암 세포주에서 과량으로 발현됨을 확인하였다. 따라서, 일반적으로 알려진 것과 같이, 사멸 수용체가 간암 및 폐암 세포주에서 많이 발현되며 이는 TRAIL 내성이 수용체의 발현과는 관계가 없음을 확인할 수 있었다(도 6의 A).

<6-2> TIP41 단백질 발현 억제와 TRAIL 처리 후, TRAIL 수용체의 발현확인

TIP41 단백질의 녹다운(knockdown)으로 유도된 세포사멸과 TRAIL 수용체와의 상관관계를 확인하기 위하여, TRAIL 및 TIP41 siRNA로 처리된 Huh7 간암 세포주에의 TRAIL 수용체의 발현 수준을 측정하였다. TIP41 siRNA를 Huh7 간암 세포주에 형질 감염 72시간 후 100 ng/㎖의 TRAIL을 4시간 및 6시간 동안 처리하였다. TRAIL을 처리한 후, 정량적 실시간 PCR을 수행하기 위하여 Huh7 간암 세포주를 트라이졸을 이용하여 RNA를 추출한 후, 추출한 RNA 1 ㎍을 역전사효소 superscript II(invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 TIP41, TRAIL-R1(Death receptor(DR)4), TRAIL-R2(DR5), TRAIL-R3(DcR1) 및 TRAIL-R4(DcR2) 유전자의 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 실시하였다. PCR결과는 2-DDct comparative method를 통해 각 유전자의 상대적인 발현량을 측정하였다.

그 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 군과 대조군을 비교하여 볼 때 TIP41 단백질 발현 억제 후, TRAIL 수용체(TRAIL-R1, -R2, -R3 및 -R4)의 발현의 차이는 거의 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(도 6의 B).

<6-3> 간암 세포 조직별 TRAIL 수용체의 발현확인

간암 조직과 그 인접한 조직에서 TRAIL 수용체의 발현 양상을 실시간 역전사 중합반응(Reverse Transcriptase-PCR)법으로 측정하였다. 실험에 사용된 조직들은, 에드몬슨(Edmondson)과 스테이너(Steiner) 분류법에 의하여 Ⅰ(n=5), Ⅱ(n=5), Ⅲ(n=5) 및 Ⅳ(n=4)로 분류된 각 간암 단계에 있는 환자에서 간암 조직(hepatocellular Carcinoma, HCC) 및 근처의 정상 조직을 포함하는 19개 조직을 카톨릭 의대(Catholic University of Medicine in Seoul, Korea)에서 외과 수술 전 환자의 동의하에 채취하였다.

실시간 역전사 PCR은 트라이졸을 이용하여 간암조직에서 RNA를 추출한 후, 추출한 RNA 1㎍을 역전사효소 superscript II(invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 TRAIL-R1(Death receptor(DR)4), TRAIL-R2(DR5), TRAIL-R3(DcR1) 및 TRAIL-R4(DcR2) 유전자의 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 실시하였다. PCR결과는 2-DDct comparative method를 통해 각 유전자의 상대적인 발현량을 확인하였다.

그 결과, TRAIL-R1(DR4)의 발현량이 정상조직에 비해서 간암조직에서 유의한 증가가 간암 1단계에서 가장 많이 관찰되었으며, 그 뒤로, 간암 3단계의 조직, 간암 2단계 및 4단계에서 발현량의 차이가 유의하게 관찰되었다. TRAIL-R2(DR5)의 경우에는 간암 1단계와 간암 5단계에서 정상조직에 비하여, 간암조직에서 발현이 유의하게 증가되는 것이 관찰되었으나, TRAIL-R3(DcR1)은 거의 모든 단계에서 발현량이 낮았으며, 정상조직과 간암조직 사이의 차이가 관찰되지 않았다. 또한, TRAIL-R4(DcR2)는 간암 2단계에서만 정상조직에 비해서 간암조직에서 유의하게 증가하는 것이 관찰되었으며, 그 외에서는 정상조직과 비슷하거나, 오히려 정상조직에서 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 6의 C).

< 실험예 7> 정상 세포주에서 세포사멸 확인

<7-1> FACS 분석을 사용한 TIP41 발현 억제와 TRAIL 처리에 의한 정상 세포주에서의 세포사멸 분석

TIP41은 암세포주에 특이적으로 과발현되나 정상세포주에서도 발현되므로, TIP41의 발현을 억제하였을 때, 암세포주와 같이 정상세포주의 세포사멸이 유도될 수도 있기 때문에 TIP41 단백질 발현 억제와 TRAIL 처리로 유도되는 세포사멸이 암세포주 특이적인 반응임을 확인하기 위해서 정상세포주인 HAEC에 TIP41 단백질 발현 억제와 TRAIL 처리로 세포사멸을 유도하였다.

정상세포주인 HAEC에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후 72시간이 지난 후, TRAIL을 100 ng/㎖으로 0, 2, 4시간 동안 처리하여, 세포사멸을 유도하였다. 사멸된 세포를 상기 기재된 방법과 동일하게 Annexin-FITc/PI 염색으로 분석하였다.

그 결과, TRAIL을 처리한 후, TIP41 siRNA를 처리 유무와 관계없이 세포사멸되는 정도가 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 따라서, 암세포주 특이적으로 과발현되는 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TRAIL을 처리하여 유도되는 세포사멸이 암세포주 특이적으로 발생함을 확인할 수 있었다(도 7의 A).

<7-2> TIP41 발현 억제와 TRAIL 처리에 의한 정상세포주의 세포사멸 단백질 분석

TIP41 siRNA를 상기와 동일한 실험 방법으로 정상 세포주에 형질감염시킨 후, Caspase-8, -3, JNK, PARP 단백질의 활성화를 확인하였다. 정상 세포주에 100 ng/TRAIL을 0, 2, 4시간 동안 처리하였고, 그런 다음 전-세포사멸(pro-apoptotic) 단백질의 발현 및 활성을 상기 기재된 웨스턴 블랏 방법을 사용하여 확인하였다.

그 결과, TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, TIP41 단백질의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었으나, 그 외의 세포사멸 전달경로에 관여하는 Caspas-8, Caspase-3, JNK, pJNK(인산화된 JNK, phosphorylation JNK)의 변화가 관찰되지 않았다. 또한 이러한 단백질이 활성화되지 않음을 확인함으로써, TIP41 siRNA와 TRAIL에 의한 세포사멸이 암세포주 특이적인 반응임을 확인할 수 있었다(도 7의 B).

< 실험예 8> 암세포주에서 TRAIL 발현 억제를 통한 TIP41 - 매개된 세포사멸

<8-1> 폐암 세포주에서 TIP41 단백질 발현 억제를 통한 TIP41 - 매개된 세포사멸

<8-1-1> 웨스턴 블랏 방법을 통한 TIP41 단백질 발현 억제로 유도되는 폐암 세포주의 세포사멸의 확인

상기 <실험예>에서 사용한 간암 세포주 이외의 TRAIL 내성 암세포주에서 TIP41 단백질 발현억제로 인한 TRAIL의 내성을 극복하는 센서타이저로서의 기능을 검증하기 위하여, 폐암 세포주인 A549 세포주에서 간암 세포주에서와 같은 방법으로 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, 72시간이 지난 후 100 ng/㎖의 TRAIL 0, 1, 2, 3, 4시간 동안 처리한 후, 세포사멸과 관련된 단백질의 활성화를 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 간암에서와 같이, JNK 및 Caspase-8, PARP 등이 활성화되어 세포사멸이 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 8A의 A).

<8-1-2> 핵염색법을 통한 TIP41 단백질 발현 억제로 유도되는 폐암 세포주의 세포사멸의 확인

폐암 세포주인 A549 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염하여 세포 내 TIP41 발현량을 감소시킨 후, TRAIL을 100 ng/㎖ 로 처리한 후, 0, 1, 2, 4, 6 시간대에 세포사멸을 핵염색법을 이용하여 측정하였다.

세포사멸의 측정은 훽스트(Hoechst) 33342로 핵을 염색한 후 형광현미경으로 관찰하여 사멸된 세포주를 계수하였다. 6웰 플레이트로 TIP41 발현 억제된 세포주들을 2×10⁵ cells/웰 씩 분주하였다. 24시간 후, 상기 세포에 100 ng/㎖ TRAIL을 각각 0, 1, 2, 4, 6 시간 동안 처리한 후 훽스트 33342를 5 ㎍/㎖로 30분 동안 상온에서 염색하였다. 핵이 염색된 세포주들을 형광현미경하에서 사멸된 세포주를 계수하여 세포사멸을 측정하였다.

그 결과, 도 8B의 A에 나타난 바와 같이, A549 폐암 세포주에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리하였을 때, TRAIL만을 처리하였을 때보다 세포사멸이 증가하였다. TRAIL을 처리하는 시간이 길어질수록 세포사멸이 증가하며, TIP41 siRNA를 처리한 군에서 대조군 siRNA를 처리시보다 약 30% 정도 세포사멸 증가가 관찰되었다. 따라서, A549 폐암 세포주에서 TIP41 siRNA가 TRAIL 저항을 감소시켜주는 것을 확인할 수 있었다(도 8B의 A).

<8-1-3> FACS 분석 방법을 사용하여 폐암 세포에서 TIP41 단백질 발현 억제를 통한 TRAIL - 매개된 세포사멸의 확인

세포 내 TIP41 발현량을 감소시키기 위하여 A549 세포주에 TIP41 siRNA를 형질 감염하고, TRAIL을 100 ng/㎖ 로 처리한 후, 0, 1, 2, 4, 6 시간대에 세포사멸을 Annexin V-FITc/PI 염색법으로 사멸된 세포주와 정상세포주를 구별하여 염색한 후, FACS(Fluorescent activated cell sorter)를 사용하여 세포사멸을 측정하였다.

세포사멸을 측정하기 위해서, 세포주를 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 이용하여 세포주를 걷은 후 FITc 융합된 아넥신 V(annexin v)(50 ㎍/㎖)와 PI(propidium iodide)(50 ng/㎖)로 20분간 염색한 후 annexinV-FITc/PI 염색된 세포주의 비율을 분석하기 위하여 FACS Calibur(BD)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 대조군 siRNA를 폐암 세포주인 A549 세포주에 처리한 것에 비하여, 본 발명에 따른 TIP41 siRNA를 처리하였을 때, A549 세포주의 세포 사멸이 현저하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 8B의 B). 또한, 도 8B의 C에 나타난 바와 같이, TRAIL 농도를 0, 25, 50, 100, 및 200 ng/ml로 처리하고, 4시간 동안 처리하고 세포 사멸을 관찰한 결과, TRAIL 처리 농도가 높아질수록, TRAIL과 TIP41 siRNA를 함께 처리하였을 때, 세포사멸이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 8B의 C).

이러한 결과를 통하여, 본 발명에 따른 TIP41 siRNA는 TRAIL의 내성을 갖는 폐암 세포주의 TRAIL 내성을 감소시키고, 암 특이적인 세포사멸을 유발하는 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

<8-2> TIP41 발현 억제를 통한 대장암 세포주에서 TRAIL - 매개된 세포사멸

HCT116 대장암 세포주에서 동일한 방법으로 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 후, 72시간이 지난 후, TRAIL을 0, 50, 100 ng/㎖로 처리하였으며, 비히클(vehicle)로는 0.3% DMSO를 처리한 후, 세포사멸을 유도하는 실험을 수행하였다. 사멸된 세포주를 상기 기재된 방법과 동일하게 Annexin-FITc/PI 염색한 후, 세포 사멸을 측정하기 위하여 FACS 분석법을 사용하였다.

그 결과, TRAIL의 처리농도가 높아질수록 세포사멸이 증가함을 확인할 수 있으며, TIP41 siRNA를 형질 감염시킨 군에서 대조군에 비해서 세포사멸이 증가함을 확인할 수 있었다. 즉 대장암 세포주에서도 간암 세포주에서와 마찬가지로 세포사멸이 유도됨을 확인함으로써, TIP41 유전자는 TRAIL 내성을 갖는 암에 대한 TRAIL 센서타이저로 사용이 가능함을 확인하였다(도 8A의 B).

<8-3> TIP41 발현 억제를 통한 간암 세포주에서 TRAIL - 매개된 세포사멸

상기 <실험예>에서 사용한 Huh 간암 세포주 이외의 TRAIL 내성 암세포주에서 TIP41 단백질 발현억제로 인한 TRAIL의 내성을 극복하는 센서타이저로서의 기능을 검증하기 위하여, HepG2(liver hepatocellular cells) 세포와 SK-Hep1 세포에 TIP41 siRNA를 형질 감염시킨후, 72시간이 지난 후 100 ng/㎖의 TRAIL 0, 1, 2, 4, 6시간 동안 처리한 후, 세포사멸과 관련된 단백질의 활성화를 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 8C의 A 및 B에 나타난 바와 같이, HepG2 및 SK-Hep1 세포에서 TIP41 siRNA에 의해서 Caspase-8과 PARP이 활성화되어 세포사멸이 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 8C의 A 및 B).

< 실험예 9> 동물실험을 통한 TIP41 기능 검증

<9-1> Huh7 간암 세포주를 누드 마우스에 이식

누드 마우스(nude mouse)의 오른쪽 등부분에 간암 세포주인 Huh7 간암 세포주를 2×10⁶ 정도를 이식한 후, 종양이 일정한 크기(50 ~ 100 mm3)로 성장시켰다. 실험은 개체군 당 7마리씩(n=7), 총 28마리 누드마우스를 Japan SLc Inc.에서 구입하여 수행하였다.

<9-2> TIP41 발현 억제와 TRAIL 처리에 의한 종양크기 변화 측정

실험예 <9-1>에 기재된 방법으로 Huh7 간암 세포주를 누드마우스의 등에 이식하여 종양을 형성한 후, 12일 동안 0, 4, 6, 8일에 control siRNA와 TIP41 siRNA를 누드마우스의 등에 형성된 종양에 주입하였으며, 2, 5, 7, 9, 10, 11일에 TRAIL을 주입한 후, 12일에 마우스를 희생시켰다. 50 nM의 농도로 Lipofectamine RNAiMax 시약을 사용하여 혼합물을 만들어 형성된 종양에 각각 주입하였으며, 2, 5, 7, 9, 10, 11일에 TRAIL을 2.5 ㎍/㎏씩 주입한 후, 4개의 그룹(control siRNA+vehicle, control siRNA+TRAIL, TIP41 siRNA+vehicle, TIP41 siRNA+TRAIL)으로 나누어, TIP41 siRNA와 TRAIL 처리에 따른 종양의 크기를 관찰하고자 하였다.

그 결과, TIP41 siRNA를 주입한 군에서 control siRNA를 주입한 군과 비교하여 종양의 크기가 감소되는 것을 관찰할 수 있었으며, TRAIL을 주입하였을 때, control siRNA에 비해서 TIP41 siRNA를 처리한 후, 더욱 감소하는 종양의 크기를 관찰할 수 있었다(도 9A).

<9-3> 암조직에서 세포사멸의 관찰

siRNA를 처리하지 않은 누드 마우스와, control siRNA, TIP41 siRNA를 처리한 누드마우스에 TRAIL을 처리한 군과, 처리하지 않은 군으로 나누어 6군에서 생성된 종양을 떼어 포르말린(formalin)에 고정한 뒤, 파라핀에 포매하였다. 이를 5 ㎛ 두께로 절편을 만들어, 자일렌(xylene)을 사용하여 파라핀을 제거한 후 에탄올 농도에 따른 다시 수화(rehydration)시켰다. 4% 파라포름알데하이드 용액(paraformaldehyde solution)을 처리하여 조직 절편을 고정하고, Proteinase K 용액을 처리하여 조직을 투과 가능하게 한 후, 4% 파라포름알데하이드 용액에 다시 고정한 뒤, TUNEL staining kit(promega, USA)를 사용하여 실험을 수행하였다. 평형(equilibration) 버퍼를 사용하여 조직 절편을 평형화(equilibrating)시키며, 그동안 rTdT 반응용액을 준비하여 평형화된(equilibrated) 부위에 이를 처리하였다. 마지막에, 스트렙타비딘(streptavidin) HRP 용액을 처리하고 DAB 혼합물를 사용하여 발색반응을 시킨 후, 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다.

그 결과, siTIP RNA를 형질 감염시킨 군에서 세포사멸이 확연히 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 6의 B).

<9-4> 종양의 세포사멸 측정

4 그룹(control siRNA+vehicle, control siRNA+TRAIL, TIP41 siRNA+ vehicle. TIP41 siRNA+TRAIL)에서 채취한 종양들을 용해시켜 단백질을 추출한 후 세포사멸의 표지자인 Caspase-8 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 방법으로 세포사멸을 확인하였다.

그 결과, TIP41 단백질의 발현량 감소로 TIP41 siRNA의 효과를 확인할 수 있었으며, TRAIL 처리에 의해서 증가되지 않았던 Caspase-8의 활성이 TIP41 siRNA 형질 감염시킨 후, 발현이 확연하게 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 이를 통해서, TIP41 siRNA가 생체 내에서도 작용될 수 있으며, TRAIL에 내성을 가진 암에 대해서 효과적으로 세포사멸을 유도함으로써, TRAIL 내성 극복의 효과를 갖는 항암제로서 사용될 수 있음을 확인하였다(도 9C).

< 실험예 10> TIP41 과 PP2Ac 와의 상호결합 측정

<10-1> 발현벡터의 구성

TIP41, PP2Ac, MKK7, alpha4 및 PR65 유전자들을 발현하는 벡터를 제조하기 위하여, 상기 간암 세포주에서 RNA를 분리하여 발현 벡터에 클로닝하였다. 역향 RNA(reserved RNA)를 주형으로서 사용하여, 각각의 유전자에 해당하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. TIP41 정방향 프라이머(서열번호 15: 5'- cg ggt acc aa atg atg atc cac ggc ttc'-3')와 TIP41 역방향 프라이머(서열번호 16: 5'-ccc gga tcc tta ttc Cac ttg tgt act -3'), PP2Ac 정방향 프라이머(서열번호 17: 5'-cg gga tcc atg gac gag aag gtg ttc -3'), PP2Ac 역방향 프라이머(서열번호 18: 5'-a tag ttt agc ggc cgc tta cag gaa gta gtc tgg -3'), MKK7 정방향 프라이머(서열번호 19: 5'-ccg ctc gag atg gcg gcg tcc tcc ctg-3'), MKK7 역방향 프라이머(서열번호 20: 5'-gg ggt acc cct gaa gaa ggg cag gtg-3'), alpha4 정방향 프라이머(서열번호 21: 5'-cg gga tcc atg gct gct gag gac gag-3'), alpha4 역방향 프라이머(서열번호 22: 5'-a tag ttt agc ggc cgc tca gcc cat gtt ctg tcg-3'), PR65 정방향 프라이머(서열번호 23: 5'-cg gga tcc atg gcg gcg gcc gac ggc-3') 및 PR65 역방향 프라이머(서열번호 24: 5'-a tag ttt agc ggc cgc tca ggc gag aga cag aac-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 95℃에서 3분간 변성시킨 후, 95℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분 30초의 조건으로 30 싸이클을 반복한 후, 72에서 10분 동안 신장시켜준 뒤, 4℃에서 식혀주었다.

TIP41에 대한 벡터의 경우, 추출된 PCR 산물을 KpnI과 BamHI 제한 효소로 절단하였고, 그런 다음 pHA 벡터(pcDNA3.1; Invitrogen사 벡터에 HA tag를 삽입 제조한 벡터)에 삽입하였다. 사용한 프라이머에는 KpnI과 BamHI 제한 부위가 포함되었다. PP2Ac, PR65, MKK7, alpha4의 경우, BamHI과 Not I 제한 효소 인지부위를 포함한 프라이머를 이용하여, 증폭시킨 후, 생성된 PCR 산물을 정제한 후, BamHI과 Not I 제한효소로 자른 다음 pGST 벡터(pEBG 벡터)(Mayer et al. 1995 Current Biology 5(3):296-305. 또한, 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 상기 언급된 동일한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. MKK7 및 PP2Ac에 대한 PCR 산물을 E. coli 발현 벡터인 pET21a(Novagen사) 벡터에 각각 삽입하였고, TIP41에 대한 PCR 산물은 pGEX4T-1(GE helthcare사) 벡터에 삽입하였다. 상기 과정에 의하여, pET21-MKK7, pET21-PP2Ac, 및 pGEX4T-TIP41을 제조하였다.

<10-2> HEK293T 세포주의 배양

한국 세포주 은행으로부터 분양받은 HEK293T 세포주는 10% 우태아 혈청이 포함된 Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)으로 37℃ 5% CO2에서 배양하였다. siRNA를 형질 감염하기 위해 HEK293T 세포주를 1×10⁶ cells/100 mm 디쉬에 심고 24시간 동안 배양하였으며, 그 다음 형질 감염을 수행하였다.

<10-3> TIP41 과 PP2Ac 와의 상호결합 확인

본 발명자들은 상기 실험을 통해서, TIP41 발현 억제 및 TRAIL 처리에 의한 세포사멸의 원인이 JNK의 지속적인 활성화에 의한 결과임을 밝혔으며, 이는 TIP41 발현 억제가 JNK 활성화 작용기전을 유도한다는 것을 의미하였다. TIP41과 결합한다고 알려진 단백질에 의해서 JNK 활성이 조절되는지 확인하기 위하여, 최근 보고에서 TIP41과 결합한다고 알려진 단백질 포스파타아제 2Ac(Protein phosphatase 2Ac, PP2Ac)를 발현시키는 발현벡터를 상기 실험예 <10-1>에서 제조하였다.

PP2Ac 단백질은 세린(Serine)/트레오닌(Threonine) 포스파타아제로써, 여러 단백질의 Ser/Thr 아미노산에 인산화(phosphorylation)되어 있는 인산염을 없애는 기능을 수행한다. PP2Ac 단백질의 기질로 Foxo1, NF-kappaB(p65), AMPK, MKK4 등이 알려져 있다.

먼저 TIP41과 결합하는 것으로 알려진 PP2Ac와의 결합을 확인하기 위해, HEK293T 세포주를 2×10⁵ 수로 100 ㎜ 배양 접시에 분주한 후, 상기 세포주에 Lipofectamine LTX 시약을 사용하여 실험예 <10-1>에서 제조된 PP2Ac 발현벡터를 세포에 형질 감염시켜 PP2Ac를 과발현시켰다. 형질 감염된 세포로부터 세포 용해물을 추출하여 GST-Pull down 분석을 수행하였다. GST-pull down 분석은 세포 용해물 1 ㎎/㎖에 GSH-bead 40 ㎕를 첨가한 후, 4℃에서 12시간 동안 조심히 교반한 후, PBST[0.1% Tween20 포함된 PBS] 버퍼를 1 ㎖씩 넣고 세척해주며 이를 6번 반복하였다. 그 후 세척된 비드에 1×샘플 버퍼(웨스턴 블랏용)를 100 ㎕씩 첨가한 후, 95℃ 히팅 블록(heating block)에서 5분간 끊인 후, 얼음에서 2분간 냉각시켰다. 그 후 각각의 항체를 사용하여 상기 기재된 것과 동일한 조건에서 웨스턴 블랏을 수행하였다.

그 결과, 도 10의 A에 나타난 바와 같이, TIP41은 양성 대조군으로써 제공된 alpha 4와 마찬가지로 PP2Ac와 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, GST pull down 전 전체 세포 용해물(whole cell lysate, WcL)을 통해 각 발현 벡터의 발현량도 확인하였다(도 10의 A).

<10-4> TIP41 과 PP2Ac 복합체의 상호작용 확인

TIP41과 JNK 키나아제로 알려진 PP2Ac와의 결합을 확인하기 위하여, 실험예 <10-1>에 제조된 발현벡터를 HEK293T 세포주에 상기와 동일한 방법으로 형질 감염시킨 후, GST-Pull down하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

그 결과, 도 10의 B에 나타난 바와 같이, TIP41과 PP2Ac 복합체의 결합 즉, PP2Ac, PR65와 alpha4의 결합을 확인할 수 있었다(도 10의 B).

< 실험예 11> TIP41 과 MKK7 사이의 상호작용 확인

<11-1> MKK7 과발현 후, TIP41 과 MKK7 사이의 상호작용 확인

TIP41과 JNK 키나아제로 알려진 MKK7 사이의 결합을 확인하기 위해서 상기 <실험예 10>에서 제조된 MKK7 발현벡터를 HEK293T 세포에 형질 감염시켜 과발현시킨 후, <실험예 10>과 동일한 방법으로 GST-Pull down 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 11의 A에 나타난 바와 같이, TIP41과 MKK7의 결합을 확인할 수 있었다(도 11의 A).

<11-2> 면역침전법을 이용한 TIP41 과 MKK7 의 상호작용 확인

TIP41과 MKK7 사이의 상호작용을 확인하기 위해서 각각의 항체를 이용하여 면역침전법(immunoprecipitation)을 수행한 후, 웨스턴 블랏을 수행하여 TIP41과 MKK7 사이의 결합을 확인하였다. 면역침전법은 침전시키고자 하는 단백질의 항체를 세포 용해물 1 ㎎에 2 ㎍씩 넣고 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, Protein G 세파로즈 비드(sepharose bead)를 30 ㎕씩 넣고 4℃에서 12시간 동안 반응시킨다. 그 뒤, PBST[0.1% Tween20 포함된 PBS] 버퍼를 1 ㎖씩 넣고 세척해주며 이를 4번 반복하였다. 그 후, 세척된 비드에 1×샘플 버퍼(웨스턴 블랏용)를 100 ㎕씩 첨가한 후 95℃ 히팅 블록에서 5분간 끊인 후, 얼음에서 2분간 냉각시켰다. 그 후 MKK7, TIP41 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

그 결과, 도 11의 B에 나타난 바와 같이, TIP41이 MKK7과 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 11의 B).

< 실험예 12> TIP41 과 PP2Ac 또는 TIP41 과 MKK7 사이의 상호작용 확인

TIP41과 PP2Ac 및 MKK7 사이의 상호작용을 더욱 정확하게 확인하기 위해서, 세포 내에서 TIP41과 MKK7의 상호작용이 아닌, E. coli에서 재조합 단백질을 합성하여 합성된 단백질들을 1:1 반응율로 반응시키는 GST-pull down 분석을 수행하였다. 재조합 단백질은 상기 실험예 <10-1>에서 제조된 E. coli용 발현벡터를 BL21 E. coli 균주에 형질전환시켜 제조하였다. 유도는 형질 전환된 E. coli를 LB 배지에 접종하여, O.D값이 0.4 ~ 0.6 사이가 되도록 배양한 후, 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가한 후, 2시간 동안 넣고 30℃에서 배양하였다. 그 후, 초음파 분해(sonication)를 사용하여 용해물을 얻어 GST pull down을 하는데 사용하였다.

그 결과, 도 11의 C에 나타난 바와 같이, TIP41과 MKK7이 직접적으로 상호 결합함을 확인할 수 있었으며, 또한, TIP41과 PP2Ac가 직접적으로 상호 결합함을 확인하였다(도 11의 C).

또한 TIP41과 PP2Ac 및 MKK7 사이의 상호작용은 실험예 <10-4>에서와 같이 수행된 결과에서도 확인되었다(도 10의 B).

< 실험예 13> MKK7 과 결합하는 TIP41 의 결합 부위의 확인

MKK7과 결합하는 TIP41의 결합부위를 확인하기 위해서, TIP41 단편 발현 벡터를 상기 <실험예 10>에 기재된 방법으로 클로닝 하였다.

도 12의 A에 나타낸 바와 같이, 전장 TIP41을 D1 ~ D6의 6개의 단편으로 나누어, 이를 각각에 해당하는 하기 프라이머를 이용하여, 증폭시킨 뒤, pHA 발현벡터에 삽입하였다. TIP41-D1 정방향 프라이머(서열번호 15)와 TIP41-D1 역방향 프라이머(서열번호 25: 5'-cg gga tcc cag gct tga aac tcc atg-3'), TIP41-D2 정방향 프라이머(서열번호 15), TIP41-D2 역방향 프라이머(서열번호 26: 5'-cg gga tcc g gaa ggt gga aca tgc atc-3'), TIP41-D3 정방향 프라이머(서열번호 27: 5'-gg ggt acc atg ctt aaa gtg gcc tgt g -3'), TIP41-D3 역방향 프라이머(서열번호 16), TIP41-D4 정방향 프라이머(서열번호 28: 5'-cg gga tcc atg ctt aaa gtg gcc tgt-3'), TIP41-D4 역방향 프라이머(서열번호 29: 5'-ccg ctc gag cag gct tga aac tcc atg-3'), TIP41-D5 정방향 프라이머(서열번호 15) 및 TIP41-D5 역방향 프라이머(서열번호 30: 5'-cg gga tcc gtg ttc acc ctc cgt cct-3'), TIP41-D6 정방향 프라이머(서열번호 31: 5'-cg gga tcc aaa ttg aaa gcc aga gaa c-3') 및 TIP41-D6 역방향 프라이머(서열번호 16)를 이용하여 PCR을 수행하였다.

D1 ~ D6의 TIP41 단편을 발현하는 벡터들을 과발현시키기 위해서 HEK293T 3×10⁶ 세포주를 100 ㎜ 배양 접시에 심은 후, Lipofectamine LTX 시약을 사용하여 클로닝된 TIP41 D1 ~ D6 단편 발현벡터들을 세포주에 각각 형질 감염하였다. 형질 감염된 세포로부터 세포 용해물를 추출하여, GST-Pull down 분석을 수행하였다. GST-pull down 분석은 상기와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 12의 B에 나타난 바와 같이, MKK7과 결합하는 단편은 전장 TIP41 단백질과 단편 D3와 D6이었다. 따라서, MKK7은 기재된 TIP41 단백질(서열번호 1)의 N 말단으로부터, 230번 ~ 272번 부위에 결합함을 확인할 수 있었다(도 12).

< 실험예 14> TIP41 과 결합하는 MKK7 의 결합 부위 확인

TIP41과 결합하는 MKK7의 결합부위를 확인하기 위해서, MKK7 단편 발현 벡터를 상기 <실험예 10>에 기재된 방법으로 클로닝 하였다. MKK7-D1 정방향 프라이머(서열번호 32: 5'-cg gga tcc cgc agc atg gag agc att -3')와 MKK7-D1역방향 프라이머(서열번호 20), MKK7-D5 정방향 프라이머(서열번호 33: 5'-cg gga tcc gcc ggc tgt gcc gcc tac-3'), MKK7-D5 역방향 프라이머(서열번호 20), MKK7-D6 정방향 프라이머(서열번호 19), MKK7-D6 역방향 프라이머(서열번호 34: 5'-at agt tta gcg gc cg cta aat gcg ctc ggg gat ggg-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 도 13의 A에 나타낸 바와 같이, 전장 MKK7을 D1, D5 및 D6의 3개의 단편으로 나누어, 이를 각각에 해당하는 상기 프라이머를 이용하여, 증폭시킨 뒤, pGST 발현벡터에 삽입하였다.

D1, D5 및 D6의 MKK7 단편을 발현하는 벡터들을 과발현시키기 위해서 HEK293T 3×10⁶ 세포주를 100 ㎜ 배양 접시에 심은 후, Lipofectamine LTX 시약을 사용하여 클로닝된 MKK7 D1, D5 및 D6 단편 발현벡터들을 세포주에 각각 형질 감염하였다. 형질 감염된 세포로부터 세포 용해물를 추출하여, GST-Pull down 분석을 수행하였다. GST-pull down 분석은 상기와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 13의 B에 나타낸 바와 같이, TIP41에 대한 MKK7의 결합 단편은 전장 MKK7 단백질과 단편 D6이었다. 따라서, TIP41은 MKK7(서열번호 35)의 아미노산 서열에서 N 말단 1번 ~ 85번 부위에 결합함을 알 수 있었다(도 13의 B).

< 실험예 15> MKK7 / JNK 경로에 의해 매개된 세포사멸

<15-1> MKK7 발현 억제에 의한 세포사멸 감소

세포사멸 내성이 MKK7과 TIP41 사이의 상호작용에 의해 매개된다는 것을 확인하기 위하여, MKK7에 대한 siRNA에 의해 세포사멸 내성의 감소를 알아보았다.

Huh7 간암 세포주에 TIP41 siRNA, MKK7 siRNA 각각 및 혼합하여 도입한 후, TRAIL을 100 ng/㎖의 농도로 0, 3, 6시간 동안 자극을 준 뒤에, 세포사멸을 Annexin-FITc/PI 염색법을 이용한 FACS 분석법을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 14의 A에 나타난 바와 같이, MKK7 발현 억제에 의해 세포사멸이 감소함을 확인할 수 있었다. 이를 통해, TIP41 단백질 발현억제와 TRAIL 처리로 유도되는 세포사멸은 MKK7의 역할이 중요함을 확인할 수 있었다(도 14의 A).

<15-2> TIP41 발현 억제에 의한 MKK7 / JNK 경로 활성화

실제로 TIP41 발현 억제가 직접적으로 MKK7의 활성화에 관여하고, 이로 인해 MKK7 하부 신호전달에 미치는 영향을 확인하기 위해 시험관 내(in vitro) immuno-co-kinase 분석을 수행하였다. immuno-co-kinase 분석은 면역침전법의 일종으로, MKK7을 침전시킨 뒤, 이를 분리해서 시험관 내(in vitro) 상태에서 인위적으로 MKK7의 기질 및 MKK7의 하부 신호전달에 관여하는 기질을 동시에 정량적으로 첨가하여 인산화되는 정도를 확인하는 실험방법이다. 상기와 같은 방법으로 MKK7 항체를 사용하여 면역 침전을 시켜, MKK7 단백질이 결합되어 있는 Protein G 비드를 얻은 후, 키나아제 버퍼에 MKK7의 기질인 재조합 GST-JNK1과 JNK1의 기질인 GST-c-Jun 및 표지자로 동위원소(-32P)를 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 1×단백질 로딩 다이(protein loading dye)를 첨가한 후, 95℃에서 5분간 끊여 주었다. 10% SDS-PAGE 젤에 전기 영동한 후 젤 드라이어기에서 젤을 건조시킨 후, BAS 리더기(방사선 측정기기, 후지쯔, 일본)로 감광하였다.

그 결과, 도 14의 B에 나타난 바와 같이, TIP41 발현 억제에 의해 MKK7이 활성화되어, MKK7의 기질인 GST-JNK1을 인산화시켰으며, 또한 활성화된 JNK1은 JNK의 하부경로의 기질 GST-c-jun 단백질을 인산화시켰다. 따라서, TIP41 단백질 발현억제와 TRAIL 처리로 MKK7이 활성화되고, 이를 통해 JNK 전달경로가 활성화됨을 증명하였다(도 14의 B).

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서, 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서, 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

상기에서 보는 바와 같이, TRAIL 내성을 보이는 간암 세포주에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 처리하였을 때, 암세포주 특이적 세포사멸이 유도되며, 이는 간암 뿐만 아니라, TRAIL 내성 폐암 및 대장암에서도 세포사멸을 유도하고, 종양을 이식한 마우스에 TIP41 siRNA와 TRAIL을 주입하였을 때, 종양의 크기 감소 및 암세포의 사멸을 유도하는 효과를 가지므로, TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 TRAIL 감수성 증진용 조성물 또는 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Composition for enhancing TRAIL sensitivity comprising inhibitors for expression or activity of TIP41 as a target gene of TRAIL sensitizer <130> 11p-03-43 <150> KR10-2010-0030004 <151> 2010-04-01 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Ile His Gly Phe Gln Ser Ser His Arg Asp Phe Cys Phe Gly 1 5 10 15 Pro Trp Lys Leu Thr Ala Ser Lys Thr His Ile Met Lys Ser Ala Asp 20 25 30 Val Glu Lys Leu Ala Asp Glu Leu His Met Pro Ser Leu Pro Glu Met 35 40 45 Met Phe Gly Asp Asn Val Leu Arg Ile Gln His Gly Ser Gly Phe Gly 50 55 60 Ile Glu Phe Asn Ala Thr Asp Ala Leu Arg Cys Val Asn Asn Tyr Gln 65 70 75 80 Gly Met Leu Lys Val Ala Cys Ala Glu Glu Trp Gln Glu Ser Arg Thr 85 90 95 Glu Gly Glu His Ser Lys Glu Val Ile Lys Pro Tyr Asp Trp Thr Tyr 100 105 110 Thr Thr Asp Tyr Lys Gly Thr Leu Leu Gly Glu Ser Leu Lys Leu Lys 115 120 125 Val Val Pro Thr Thr Asp His Ile Asp Thr Glu Lys Leu Lys Ala Arg 130 135 140 Glu Gln Ile Lys Phe Phe Glu Glu Val Leu Leu Phe Glu Asp Glu Leu 145 150 155 160 His Asp His Gly Val Ser Ser Leu Ser Val Lys Ile Arg Val Met Pro 165 170 175 Ser Ser Phe Phe Leu Leu Leu Arg Phe Phe Leu Arg Ile Asp Gly Val 180 185 190 Leu Ile Arg Met Asn Asp Thr Arg Leu Tyr His Glu Ala Asp Lys Thr 195 200 205 Tyr Met Leu Arg Glu Tyr Thr Ser Arg Glu Ser Lys Ile Ser Ser Leu 210 215 220 Met His Val Pro Pro Ser Leu Phe Thr Glu Pro Asn Glu Ile Ser Gln 225 230 235 240 Tyr Leu Pro Ile Lys Glu Ala Val Cys Glu Lys Leu Ile Phe Pro Glu 245 250 255 Arg Ile Asp Pro Asn Pro Ala Asp Ser Gln Lys Ser Thr Gln Val Glu 260 265 270 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41 siRNA <400> 2 cctaatgaaa tatcccagta t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41 forward primer <400> 3 attgaaagcc agagaacaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41 reward primer <400> 4 tctcgtgtca ttcattctga 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR4 forward primer <400> 5 ctcagcggaa tcaatcagct gtg 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR4 reward primer <400> 6 agaggaacac gacaatcagc cttag 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 forward primer <400> 7 atcaagcggc cccctttttt tcac 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 reward primer <400> 8 ctcattgtca cactcctcga cagc 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DcR1 forward primer <400> 9 tccccaagac cctaaagttc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DcR1 reward primer <400> 10 ggcaccaaat tcttcaacac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DcR2 forward primer <400> 11 gcacagaggg tgtggattac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DcR2 reward primer <400> 12 gagcagatgc ctttgaggta 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-2-microglobulin forward primer <400> 13 ctcgctccgt ggccttag 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-2-microglobulin reward primer <400> 14 caaatgcggc atcttcaa 18 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41 forward primer for cloning <400> 15 cgggtaccaa atgatgatcc acggcttc 28 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41 reward primer for cloning <400> 16 cccggatcct tattccactt gtgtact 27 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2Ac forward primer for cloning <400> 17 cgggatccat ggacgagaag gtgttc 26 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2Ac reward primer for cloning <400> 18 atagtttagc ggccgcttac aggaagtagt ctgg 34 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MKK7 forward primer for cloning <400> 19 ccgctcgaga tggcggcgtc ctccctg 27 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MKK7 reward primer for cloning <400> 20 ggggtacccc tgaagaaggg caggtg 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha4 forward primer for cloning <400> 21 cgggatccat ggctgctgag gacgag 26 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha4 reward primer for cloning <400> 22 atagtttagc ggccgctcag cccatgttct gtcg 34 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR65 forward primer <400> 23 cgggatccat ggcggcggcc gacggc 26 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR65 reward primer <400> 24 atagtttagc ggccgctcag gcgagagaca gaac 34 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP-DI reward primer for cloning <400> 25 cgggatccca ggcttgaaac tccatg 26 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41-D2 reward primer for cloning <400> 26 cgggatccgg aaggtggaac atgcatc 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41-D3 forward primer for cloning <400> 27 ggggtaccat gcttaaagtg gcctgtg 27 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41-D4 forward primer for cloning <400> 28 cgggatccat gcttaaagtg gcctgt 26 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41-D4 reward primer for cloning <400> 29 ccgctcgagc aggcttgaaa ctccatg 27 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41-D5 reward primer for cloning <400> 30 cgggatccgt gttcaccctc cgtcct 26 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41-D6 forward primer for cloning <400> 31 cgggatccaa attgaaagcc agagaac 27 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MKK7-D1 forward primer for cloning <400> 32 cgggatcccg cagcatggag agcatt 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MKK7-D5 forward primer for cloning <400> 33 cgggatccgc cggctgtgcc gcctac 26 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MKK7-D6 reward primer for cloning <400> 34 atagtttagc ggccgctaaa tgcgctcggg gatggg 36 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIP41 forward primer <400> 35 cggaattcat gatgatccac ggcttc 26 <210> 36 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Ala Ala Ser Ser Leu Glu Gln Lys Leu Ser Arg Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 Leu Lys Gln Glu Asn Arg Glu Ala Arg Arg Arg Ile Asp Leu Asn Leu 20 25 30 Asp Ile Ser Pro Gln Arg Pro Arg Pro Thr Leu Gln Leu Pro Leu Ala 35 40 45 Asn Asp Gly Gly Ser Arg Ser Pro Ser Ser Glu Ser Ser Pro Gln His 50 55 60 Pro Thr Pro Pro Ala Arg Pro Arg His Met Leu Gly Leu Pro Ser Thr 65 70 75 80 Leu Phe Thr Pro Arg Ser Met Glu Ser Ile Glu Ile Asp Gln Lys Leu 85 90 95 Gln Glu Ile Met Lys Gln Thr Gly Tyr Leu Thr Ile Gly Gly Gln Arg 100 105 110 Tyr Gln Ala Glu Ile Asn Asp Leu Glu Asn Leu Gly Glu Met Gly Ser 115 120 125 Gly Thr Cys Gly Gln Val Trp Lys Met Arg Phe Arg Lys Thr Gly His 130 135 140 Val Ile Ala Val Lys Gln Met Arg Arg Ser Gly Asn Lys Glu Glu Asn 145 150 155 160 Lys Arg Ile Leu Met Asp Leu Asp Val Val Leu Lys Ser His Asp Cys 165 170 175 Pro Tyr Ile Val Gln Cys Phe Gly Thr Phe Ile Thr Asn Thr Asp Val 180 185 190 Phe Ile Ala Met Glu Leu Met Gly Thr Cys Ala Glu Lys Leu Lys Lys 195 200 205 Arg Met Gln Gly Pro Ile Pro Glu Arg Ile Leu Gly Lys Met Thr Val 210 215 220 Ala Ile Val Lys Ala Leu Tyr Tyr Leu Lys Glu Lys His Gly Val Ile 225 230 235 240 His Arg Asp Val Lys Pro Ser Asn Ile Leu Leu Asp Glu Arg Gly Gln 245 250 255 Ile Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ile Ser Gly Arg Leu Val Asp Ser Lys 260 265 270 Ala Lys Thr Arg Ser Ala Gly Cys Ala Ala Tyr Met Ala Pro Glu Arg 275 280 285 Ile Asp Pro Pro Asp Pro Thr Lys Pro Asp Tyr Asp Ile Arg Ala Asp 290 295 300 Val Trp Ser Leu Gly Ile Ser Leu Val Glu Leu Ala Thr Gly Gln Phe 305 310 315 320 Pro Tyr Lys Asn Cys Lys Thr Asp Phe Glu Val Leu Thr Lys Val Leu 325 330 335 Gln Glu Glu Pro Pro Leu Leu Pro Gly His Met Gly Phe Ser Gly Asp 340 345 350 Phe Gln Ser Phe Val Lys Asp Cys Leu Thr Lys Asp His Arg Lys Arg 355 360 365 Pro Lys Tyr Asn Lys Leu Leu Glu His Ser Phe Ile Lys Arg Tyr Glu 370 375 380 Thr Leu Glu Val Asp Val Ala Ser Trp Phe Lys Asp Val Met Ala Lys 385 390 395 400 Thr Glu Ser Pro Arg Thr Ser Gly Val Leu Ser Gln Pro His Leu Pro 405 410 415 Phe Phe Arg

Claims

TIP41 단백질 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 TRAIL 감수성 증진용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 TIP41 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 TIP41 단백질의 발현 억제제는 TIP41 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 TIP41 단백질의 활성 억제제는 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 TRAIL을 이용한 암, 염증성 질환 또는 자가면역 질환 치료시 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
TIP41 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제.
제 7항에 있어서, 상기 TIP41 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
제 7항에 있어서, 상기 TIP41 단백질의 발현 억제제는 TIP41 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
제 7항에 있어서, 상기 TIP41 단백질의 활성 억제제는 TIP41 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
제 7항에 있어서, 상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암 보조제.
제 7항에 있어서, 상기 TIP41 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TRAIL 감수성을 증진시킴을 특징으로 하는 항암 보조제.
제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 항암 보조제를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
1) 실험군으로서 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 TIP41과 PP2Ac 또는 MKK7 단백질의 결합수준을 확인하는 단계; 및
3) 단계 2)의 TIP41과 PP2Ac 또는 MKK7 단백질의 결합수준을 대조군과 비교하여 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
제 14항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 결합수준은 면역침전법(immunoprecipitation), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏(Western Blotting), Glutathione-S-Transferase(GST) pull down 분석, 단백질 칩(Protein Chip), 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), 이분자 형광 상보(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 및 효모 2중 하이브리드(Yeast two-hybrid, Y2H)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
1) 실험군으로서 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 MKK7 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 MKK7 단백질 활성이 대조군과 비교하여 증가된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
제 16항에 있어서, MKK7 단백질의 활성 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
1) 실험군으로서 암 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 PP2Ac 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PP2Ac 단백질 발현량이 대조군과 비교하여 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
제 18항에 있어서, 단계 2)의 PP2Ac 단백질의 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
제 14항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포주는 TRAIL 내성 암 세포주인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.