KR20110107981A - 신규한 뇌손상 질환 진단용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 뇌손상 질환 진단용 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 MDMA 약물의 투여를 통해 동정한 뇌손상 질환 진단용 마커, 이를 이용한 뇌손상 질환 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 뇌손상 질환의 진단 방법에 관한 것이고, 또한 상기 마커 유전자 또는 단백질의 발현을 증가 또는 감소시켜 뇌손상 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 물질을 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마커 유전자는 정상 조직 또는 세포에 비해 뇌손상 환자의 조직 또는 세포에서 발현양이 감소 또는 증가되는 것으로 확인됨에 따라, 뇌손상 질환 진단용 마커로 사용할 경우 뇌손상 질환을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 특히 MDMA 약물에 의해 후세대에 유발될 수 있는 뇌손상 질환을 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 뇌손상 질환 진단용 마커 및 이의 용도{Novel markers for diagnosing brain disease caused by brain injury and use thereof}
본 발명은 뇌손상 질환을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 뇌손상 질환 진단용 마커, 뇌손상 질환 진단용 키트, 마이크로어레이, 뇌손상 질환 진단용 조성물 및 상기 뇌손상 질환 진단용 마커를 이용한 뇌손상 질환의 진단 방법에 관한 것이다.
뇌 세포들의 파괴 또는 퇴화를 의미하는 뇌손상(brain injury)은 비교적 빈번하고 광범위하게 일어나므로 의학적으로는 매우 다양한 종류의 진단방법이 요구된다. 뇌손상은 광범위한 내적 및 외적 요인들에 의해 일어나는데, 가장 많은 수의 손상을 포함하는 흔한 유형은 외부 원인으로부터의 물리적인 외상 또는 두부 손상에 따른 외상성 뇌손상(TBI)이며, 생후에 발생하는 뇌손상을 선천성 장애로부터 기인한 손상과 구별하기 위하여 후천적 뇌손상(ABI)이라고 불린다.
뇌손상은 그 발명 원인이 아직까지 명확히 밝혀지지 않았으나, 장기적 저산소증, 알콜을 포함한 기형 발생물질들에 의한 중독, 감염 및 신경학적 질병 등이 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 화학요법(chemotherapy)은 신경줄기세포 및 미엘린(myelin)을 생성하는 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)에 손상을 입힐 수도 있다. 이 외에도 뇌손상의 흔한 원인으로는 외상적 뇌손상, 뇌졸중, 동맥류, 수술, 기타 신경학적 장애, 및 중금속 중독 등과 같은 생리적 외상이 있을 수 있다.
한편, MDMA(3, 4-methylenedioxymethamphetamine; ecstasy)는 고리-치환된 페닐-아이소프로필아민(phenyl-isopropylamine) 구조를 가지며, 구조면에서 암페타민(amphetamines) 및 할루시노겐(hallucinogens)과 유사한 것으로 알려져 있고, 각성제(psycho-stimulant)로 사용되기도 하며, 마우스의 경우 과잉행동(hyperactivity) 및 이상고열(hyperthermia)을 일으킨다(Salzmann, J., Canestrelli, C., Noble, F., Marie-Claire, C., 2006. Analysis of transcriptional responses in the mouse dorsal striatum following acute 3,4-methylenedioxymethamphetamine (ecstasy): identification of extracellular signal-regulated kinase-controlled genes. Neuroscience 137, 473-482).
또한, 지금까지 보고된 자료에 의하면, MDMA에 노출될 경우, 사람을 제외한 영장류를 포함하여 동물의 종과 투약조건에 따라 뇌의 세로토닌(5-hydroxytryptamine, 5-HT) 및 도파민(DA) 뉴런들을 손상을 받는 것으로 밝혀졌다(Green et al., 2003; Mithoefer et al., 2003). 또한, MDMA는 5-HT의 재흡수를 막고, 그것의 흐름을 차단하여 5-HT의 세포질내 방출(cytosolic release)을 유도하고(Banasr et al., 2004; O'Hearn et al., 1988; Ricaurte et al., 2000; Shankaran et al., 1999; Thiriet et al., 2002), 도파민으로 활성화되는 시스템에서 신경독성을 유발하는 것으로 알려져 있다(Camarero et al., 2002; Itzhak et al., 2003; Mithoefer et al., 2003; Ricaurte et al., 2002; Xie et al., 2004; Yuan et al., 2002).
나아가 최근에는 MDMA가 청소년 및 대학생들 간에 사용되고 있는 사례가 증가되고 있고, 특히 대부분의 MDMA 사용자들이 임신 가능한 연령의 젊은 성인들이기 때문에 MDMA의 장기간 사용에 따른 신경상의 변화에 대한 연구들이 진행되고 있는데, 특히 태아의 경우 MDMA에 노출된 경우에는 매우 치명적인 뇌손상이 유발될 수 있다는 내용이 보고된 바 있다(Schuster et al., 1998).
그러나 MDMA 반응의 태아기 조절을 매개하는 기작들을 설명하는 것은 여전히 어려운 일이며, 특히 태아기 및 성장 기간 동안 MDMA에 대한 노출의 여부를 측정할 수 있는 방법에 대해서는 아직까지 연구된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 사람에서 뇌에 대한 독성 위험을 예측 또는 진단할 수 있는 방법으로 기작-기반 측정(mechanism-based assays)을 제공할 수 있는 기능 유전체학 방법(functional genomics method)을 사용하여 뇌손상 질환을 예측 또는 진단할 수 있는 신규한 마커들을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 뇌손상 질환을 예측 또는 진단할 수 있는 신규한 뇌손상 질환 진단용 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 뇌손상 질환 진단용 마커로 사용할 수 있는 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 조성물 및 뇌손상 질환 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 (a) 뇌손상 질환 의심환자의 생물학적 시료로부터 하기 표에 기재된 90개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환의 예측 및 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 뇌손상 질환을 진단할 수 있는 90개의 유전자들 중 선택된 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 발현 단백질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌손상 질환은 MDMA(3,4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloride) 에 의해 유발되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 뇌손상 질환은 세로토닌(serotonin) 또는 도파민(dopamine) 뉴런의 손상과 관련된 질환일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마커는 차세대에서 MDMA(3,4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloride)에 의해 유발되는 뇌손상 질환을 예측 또는 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에서 동정한 90개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 상기 90개의 유전자들 중 어느 하나의 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 뇌손상 질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 키트 및 본 발명에 따른 상기 마커를 포함하는 뇌손상 질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은, (a) 뇌손상 질환 의심환자의 생물학적 시료로부터 하기 표에 기재된 90개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환의 예측 및 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 대뇌피질 조직 또는 세포일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 90개의 유전자들 중에서 1번 내지 36번의 유전자들 중 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 감소되었을 경우, 뇌손상 질환이 유발된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 90개의 유전자들 중에서 37번 내지 90번의 유전자들 중 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 뇌손상 질환이 유발된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에 따른 마커 유전자는 정상 조직 또는 세포에 비해 뇌손상 환자의 조직 또는 세포에서 발현양이 감소 또는 증가되는 것으로 확인됨에 따라, 뇌손상 질환 진단용 마커로 사용할 경우 뇌손상 질환을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 특히 MDMA 약물에 의해 후세대에 유발될 수 있는 뇌손상 질환을 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 실험설계를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 MDMA(20mg/kg/day)를 태아기에 노출(prenatal exposure)시킨 후, 마우스 대뇌 피질의 차별적 발현 프로파일(differential expression profiles)을 나타낸 것이며, (A)는 단일 투여량(single dose) 섭취에 따른 MDMA의 태아기 노출은 수컷 및 암컷 새끼 모두의 대뇌 피질에서 상당한 전사체적 변화(transcriptional changes)를 나타낸 것이고, 이를 암컷(B) 및 수컷(C) 자손을 대상으로 한 대뇌 피질에서의 전사체적 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 태아기에 MDMA 노출에 따른 수컷 및 암컷 자손에서 변화된 유전적 요소들의 대규모 동정을 나타낸 것으로서, (A)는 암컷, (B)는 수컷의 대뇌 피질 상에서 전사체적 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 MDMA 노출에 따른 차별 발현되는 유전자들의 기능적 분류를 KEGG 경로 데이터베이스를 사용하여 나타낸 것으로서, (A)는 암컷에서의 변화를 나타낸 것이고, (B)는 수컷에서의 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 뇌손상에 의해 유발되는 질환을 진단 및 예측할 수 있는 뇌손상 질환 진단용 마커를 제공함에 특징이 있으며, 보다 구체적으로 MDMA의 약물 노출에 의해 유발되는 뇌손상 질환을 진단할 수 있는 마커를 제공함에 그 특징이 있다.
일반적으로 MDMA가 성인에 노출되었을 경우, 급성 또는 만성 신경독성을 야기시키는 것으로 알려져 있다(Green et al., 2003). 하지만, MDMA에 대한 세포내 전사적 반응에 대한 정보는 아직까지 그 연구가 미비한 실정이며, 대부분의 선행연구들은 MDMA가 성년기의 동물들에 미치는 영향에 대해서만 집중하여 왔다. 하지만, 임신 연령대의 젊은 여성들 사이에서 MDMA의 사용이 증가함에 따라, MDMA가 성장하는 태아 및 태아기 노출 후의 다음 세대에 해로운 영향을 미치는지 여부를 조사할 필요성이 증가하고 있다.
이에 본 발명자들은 청소년기 또는 태아기에 MDMA가 미치는 영향을 조사하기 위해 어린 마우스를 실험동물로 사용하여 MDMA의 노출에 따른 유전자의 발현양상에 차별이 보이는 유전자들을 스크리닝 하였다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, MDMA에 노출된 부모의 자손(F1 세대)도 간접적으로 MDMA에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 가정하고, 초기 태아 발달 기간 동안의 F1(자손 1대)의 MDMA에의 간접적인 접촉이 F1 세대에서 대뇌 피질 영역의 전사체적 구성(transcriptomic configuration)에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 생후 11주차의 F1을 대상으로 차별적 유전자 발현(differential gene expression)을 분석하고, 이를 MDMA에 노출되지 않은 대조군과 비교하였다.
그 결과, 태아기에 노출된 F1 세대의 유전체적 구성이 대조군 그룹과 비교하여 구별되는 분자적 표지(molecular signature)를 갖고 있는 것으로 나타났으며, 이러한 구별되는 분자적 변화의 표지들을 계통수(dendrogram)로 나타내었다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 태아기 때 MDMA에 의한 노출은 F1 세대의 마우스 대뇌 피질에서 전사체적 구성(transcriptomic configuration) 변화를 일으킨다는 사실을 알 수 있었고, 암컷의 경우 1,784개의 유전자들의 발현에 변화가 있었으며, 수컷의 경우에는804개의 유전자들의 발현에 변화가 있는 것으로 나타났으며, MDMA의 지속적인 노출 후에 상기 변화된 후성학적(epigenetic) 조절은 성장기 동안 지속되는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명자들은 상기 발현에 변화를 보인 유전자들을 뇌손상 질환을 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 상기 본 발명의 일실시예를 통해 확인된 암컷의 1,784개 유전자와 수컷의 804개의 유전자들 중에서 공통적인 유전자들 90개를 선별하였으며, 이들의 유전자 목록을 하기 표에 나타내었다. 또한, 하기 표에서 1번~36번의 유전자들은 MDMA 노출시 그 발현이 감소되는 유전자들이며, 37번~90번의 유전자들은 MDMA 노출시 그 발현이 증가되는 유전자들이다. 또한, 상기 표의 유전자들 중에서 유전자 명이 확정되지 않은 12개의 유전자들에 대해서는 상기 유전자들의 염기서열을 본 명세서와 함께 첨부된 서열목록에 기재하였다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
또한, MDMA에 대한 정신적 및 생리학적 반응에 있어 성별에 따른 차이를 나타내는 자료들이 보고된 바 있는데, 예를 들어, MDMA에 노출된 암컷 쥐(rat)들은 수컷보다 훨씬 더 강한 운동능력을 가지며, 사람에 대한 연구에서는 여성들이 남성보다 더 심한 우울증 스코어(depression scores), 지각변화(perceptual changes), 사고장애 및 신체 조절능력 상실에 대한 공포를 보이는 것으로 나타났다(Liechti et al., 2001; Verheyden et al., 2002; Walker et al., 2007). 하지만 성별차이에 관한 상기 데이터는 각성(psycho-stimulant) 효과, 5-HT 기능 및 주관적 효과(subjective effects)에 관한 것으로 제한되어 있을 뿐이다.
반면, 본 발명의 결과에 따르면, F1 암컷에서 1,784 개의 유전자들이, 수컷에서 804개의 유전자들이 MDMA의 태아기 노출에 따른 분자적 표지와 관련된 것으로 확인되었다. 따라서 MDMA에 대한 태아기 노출 후, 수컷 및 암컷 F1 뇌의 전사체적 구성(transcriptomic configurations)은 자극제에 대응하는 성별 차이에 관한 추가적인 정보를 제공할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 표에 기재된 90개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 마커를 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기진단이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 뇌손상 질환 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 뇌손상 질환의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 뇌손상 질환 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 뇌손상 질환의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
또한, 상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 뇌손상 질환의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 뇌손상 질환의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 뇌손상 질환 진단용 마커는 정상 세포에 비해 뇌손상 질환의 세포에서 발현양이 감소하거나 증가하는 상기 90개의 유전자 또는 상기 유전자들이 발현된 단백질일 수 있다.
본 발명에서, 상기 "뇌손상 질환"은 뇌 세포들의 파괴 또는 퇴화를 일으키는 모든 종류의 뇌손상에 의해 단기 또는 장기적으로 나타나는 모든 종류의 질환을 포함하며, 특정 종류의 질환에만 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게 상기 뇌손상 질환은 MDMA(3, 4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloride)에 의해 유발되는 질환일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 뇌손상 질환은 세로토닌(serotonin) 또는 도파민(dopamine) 뉴런의 손상과 관련된 질환일 수도 있다.
또한, 본 발명에서 상기 마커는 차세대에서 MDMA (3,4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloride)에 의해 유발되는 뇌손상 질환을 예측 또는 진단할 수 있는 특징이 있다.
본 발명은 상기 본 발명에 따른 마커 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현되 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 90개의 각각의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 90개의 마커 유전자들로부터 발현된 단백질들에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.
상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 뇌손상 질환 진단용 마커 또는 상기 뇌손상 질환 진단용 조성물을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 뇌손상 질환 진단용 키트는 상기 마커 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 뇌손상 질환 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 뇌손상 질환 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 뇌손상 질환 진단용 마커를 포함하는 뇌손상 질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 마커 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 뇌손상 질환의 예측 및 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은, (a) 뇌손상 질환 의심환자의 생물학적 시료로부터 하기 표에 기재된 90개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 뇌손상 질환 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 뇌손상 질환 환자 또는 뇌손상 질환 의심환자에서의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 뇌손상 질환의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 뇌손상 질환의 예측 및 진단방법은 본 발명에 따른 뇌손상 마커 유전자들인 상기 90개의 유전자들 중에서 1번 내지 36번의 유전자들 중 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 감소되었을 경우, 뇌손상 질환이 유발된 것으로 판단할 수 있으며, 반면, 상기 90개의 유전자들 중에서 37번 내지 90번의 유전자들 중 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 뇌손상 질환이 유발된 것으로 판단할 수 있다.
나아가 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 상기 90개의 뇌손상 질환 진단용 마커 유전자들 중 1번 내지 36번으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 발현 단백질을 포함하는 뇌손상 환자의 대뇌 피질 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 선택된 유전자의 발현양 또는 그 발현 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, 상기 선택된 유전자의 발현양 또는 그 발현 단백질의 양 또는 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, (a) 본 발명에 따른 상기 90개의 뇌손상 질환 진단용 마커 유전자들 중 37번 내지 90번으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 발현 단백질을 포함하는 뇌손상 환자의 대뇌 피질 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 선택된 유전자의 발현양 또는 그 발현 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, 상기 선택된 유전자의 발현양 또는 그 발현 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 뇌손상 질환 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 뇌손상 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.
상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 90개의 유전자들에서 1번 내지 36번의 유전자들 중 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현 또는 그 발현 단백질의 양을 증가시키거나 활성을 증가시키는 물질 또는 상기 37번 내지 90번으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 발현 단백질의 발현을 감소시키거나 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 뇌손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 마커 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.
또한, 상기 마커 단백질의 발현 및 활성을 증가시키거나 감소시키는 물질로서 상기 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
실험동물의 준비 및 약물처리
국립독성연구소 독성부 생식독성과에서 MDMA ((±)-3, 4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloride, CAS # 92279-84-0, purity =99.9%) 를 입수하였다. 상기 MDMA를 3ml/kg에 대응하는 부피로 isotonic salineat 에 20 mg/kg 의 양만큼 녹이고, 경구투여하였다(p.o.). 오리엔트사(Orient Co. Ltd.)에서 구입한 수컷 및 암컷 C57BL/6N 마우스 (6 주)를 SPF-조건하에 유지시켰다. 모든 마우스들은 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침('Guide for the Care and Use of Laboratory Animals', US NIH publication No. 86-23, 1985 Ed.)에 따라 실험실에 적응시켰다. 본 발명자들은 MDMA가 후세대(F1 세대)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 설계하였다(도 1). 본 실험에서, 임신일(gestation day (GD)) 0 은 교배의 증거(질 내 교배플러그(copulatory plug))가 처음으로 발견된 날로 정의하였으며, 생후일(postnatal day (PND)) 0 은 출생일로 정의하였다. 또한, 상기 마우스들은 분리된 우리(cage)에서 교배시켰고, 교배플러그(vaginal plug)가 발견된 날(GD 0)에 임신한 것으로 간주하였다. GD 6 부터 PND 21(출산 후 3주)에 거쳐 상기 암컷들에게 일일 경구투여량 (20mg/kg) 만큼의 MDMA 또는 부형제(vehicle)를 투여하였다. 대조군인 동물들에는 같은 부피량(3 ml/kg)으로 부형제(vehicle)를 투여하였다. 출산 후, 어미(F0 세대) 및 그들의 자손(F1 세대)은 PND 21에 젖을 뗄 때까지 함께 두었다. F1 수컷 및 암컷 마우스들을 11주차에 죽이고, 그 뇌를 제거하여 얼음 위에 두었다. 그 후 뇌 영역들을 해부하고, 드라이아이스에 얼려서 다음 분석 시까지 LN2 탱크에 보관하였다. 상기 본 발명에 따른 실험의 전반적인 과정은 도 1에 나타내었다.
< 실시예 2>
뇌 조직으로부터의 RNA 추출
사용 설명(Life Technology, Rockville, MD, USA)에 따라 TRI 시약 (Molecular Research Center, Cincinnati, OH.,USA)을 사용하여 상기 뇌 조직으로부터 총(total) RNA를 추출하였다. 즉, 상기 조직들을 액체질소에서 얼리고 분쇄한 후, 1 ml 의 TRI 시약에서 균질화시키고, 클로로포름이 첨가되었을 경우에는 200 ml를 사용하여 실온에서 5분간 배양시킨 후, 잘 섞고 실온에서 3분간 배양시켰다. 상기 샘플들을 14000 rpm에서 20분간 원심분리시킨 후, 수용액 층을 새로운 튜브에 옮기고 같은 양의 아이소프로판올을 넣어준 후, 얼음에서 30분간 배양시켰다. 14000 rpm에서 15분간 원심분리시킨 후, RNA 침전물(pellets)을 75% 에탄올로 씻고, RNase가 없는 물에 녹였다. RNA의 순도는 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 측정하였고, 농도는 ND-1000 분광광도계(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하였다. 추가 연구를 위해 최소 > 1.6 의 28S/18S 비율을 갖는 샘플들을 선별하였다.
< 실시예 3>
마우스 유전체 조사 마이크로어레이
마이크로어레이 상의 모든 특징(feature)에서 60-mer의 유전자 발현 프로브와 함께 찍히는(co-spotted) 24-mer 올리고(oligo)의 내부 대조 프로브(internal control probe (ICP))를 사용하였다. Digoxigenin-UTP 표지된 cRNA를 제조하고, Applied Biosystems Chemiluminescent RT-IVT Labeling Kit, v2.0을 사용하여 1 ㎍ 의 총 RNA로부터 이를 증폭시켰다. 어레이 교잡(array hybridization), 화학발광(chemiluminescence) 검출, 이미지 포착(image acquisition) 및 분석은 Applied Biosystems Chemiluminescence Detection Kits 및 Applied Biosystems 1700 Chemiluminescent Microarray Analyzer를 사용설명에 따라 사용하여 수행하였고, 이미지들은 자동 그리드(auto-gridded)되었으며, 화학발광 신호들은 정량화하였고, 수정을 거쳐 공간적으로 표준화시켰다.
< 실시예 4>
DNA 마이크로어레이 데이터의 발현 프로파일링 분석
어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) 마우스 게놈 조사 마이크로어레이(Mouse Genome Survey Microarray) 발현 데이터를 GenPlex 소프트웨어(Istech Inc., Korea)를 사용하여 분석하였다. 1차 데이터 필터링을 위해, SNR (Signal to Noise Ratio) <1.5을 가진 스팟(spot)들을 제외시키고, 남아있는 필터링 된 데이터를 추가분석에 사용하였다. 데이터를 표준화시키기 위해 변위치 표준화(quantile normalization)를 사용하였다. 로그 비율(log ratio)들의 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)은 Cluster 및 TreeView 2.3을 사용하여 수행하였다. 모든 클러스터링 적용을 위해 유클리드 상관(Euclidean correlation), 메디안 센터링(median centering) 및 완전연관(complete linkage)을 사용하였다.
또한, 태아의 MDMA에의 노출을 최대화시키기 위해 F1 세대를 임신기간(GD6) 동안과 생후 3주(PND21)까지 간접적으로 노출시켰고, 그 후, 대뇌 피질의 발현 프로파일을 분석하기 위해 11주차에 암컷 및 수컷 자손들을 죽이고, 그것들의 뇌 분획(section)들을 준비하여 분석하였다.
분석 결과, 기억 및 학습과 관련된 쥐의 대뇌 피질은 MDMA에 의해 상당히 영향을 받았으며, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 13,848개의 유전적 요소들의 유전자 발현이 두 개의 주요한 클러스터들로 나타났다. 이것은 수컷 및 암컷 대뇌 피질의 뚜렷한 전사체적 구성(transcriptomic configuration)이 존재함을 보여준다. 또한, 처음 두 개의 주요 클러스터들 사이에 뚜렷한 두 개의 서브-클러스터들이 더 존재하는 것으로 나타났으며, 각각의 서브-클러스터는 수컷 및 암컷 새끼들의 구별되는 분자적 표지(molecular signature), 즉 태아기 노출 그룹(MDMA, 20mg/kg daily single dose ingested) 및 부형제(vehicle) 그룹에 의해 구분되었다.
또한, MDMA를 처리한 어미의 수컷 및 암컷 자손 모두는 각각의 성별을 분리하여 재분석한 결과, F1 대뇌 피질에서 전사체적 변화들을 분명하게 나타내었다(도 2b 및 2c 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 어미의 약물섭취 후의 임신 및 수유 기간 동안의 태아기의 MDMA에의 노출은 자손들 사이에서 대뇌 피질의 전사체적 구성(transcriptomic configuration)에 영향을 미쳤고, 이러한 변화는 F1 세대의 성장 동안에 영구적이라는 사실을 알 수 있었다.
나아가, 본 발명자들은 마우스 대뇌 피질에서 MDMA에의 태아기 노출과 관련된 분자적 표지를 찾기 위하여, Welch's T-test 와 fold-change 분석을 사용하여 MDMA에 노출된 그룹과 부형제(vehicle) 그룹 간의 차별적 유전자 발현(differential gene expression)을 분석하였다. 아웃라이어(outlier) 유전자들을 찾기 위해 Welch's T-test (P<0.05) 및 1.5-fold change 컷-오프(cut-off)를 사용하였다.
그 결과, 1,784개의 유전자(암컷 그룹) 및 804개의 유전자(수컷 그룹)를 태아기때 MDMA의 노출에 따른 차별적 발현 유전자(differentially expressed gene)들로 동정하였다. 또한, 상기 MDMA 특이적 표지들 중에서, 암컷 대뇌 피질의 경우에는 1,385 개의 유전자들이 상향조절(up-regulated), 즉 발현이 증가된 것으로 나타났고, 399개의 유전자들은 발현이 감소된 것으로 나타났다(도 3a 참조). 또한, 유사하게 수컷 대뇌 피질에서는 335개의 유전자들이 상향조절 되었고, 469개의 유전자들은 낮게 발현되었다(도 3b 참조). 이러한 상대적인 발현 차이는 도 3의 히트-맵(heat-map)에 나타내었다.
또한, 본 발명자들은 MDMA의 노출에 의해 차별발현을 나타낸 상기 1,784개의 유전자(암컷 그룹) 및 804개의 유전자(수컷 그룹)들 중에서 공통적인 유전자들을 선별하였고, 이를 하기 표에 기재하였으며, 하기 표에 기재된 유전자들이 정상 샘플들에 비해 발현이상을 나타냄에 따라 이들 유전자를 뇌손상 질환을 예측 또는 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
< 실시예 5>
KEGG 경로 분석
본 발명자들은 상기 암컷의 1,784 개의 유전자들 및 수컷의 804 개의 유전자들이 관여하는 생물학적 프로세스의 주요 경로들을 찾기 위해, KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and the Genomes) 경로(pathway) 데이터베이스 (http://www.genome.jp/kegg/)에서 경로 마이닝 툴(pathway mining tool)을 사용하여, MDMA에 노출된 구분(differentially) 발현되는 유전자들과 관련된 분자적 경로들을 분석하였다.
그 결과, 1,784개의 F1 암컷 MDMA 특이적 분자 표지 및 804개의 F1 수컷 MDMA 특이적 분자 표지들로부터 대표적인 15개의 경로들을 확인할 수 있었고(도 4 참조), 다수의 유전자들이 4개의 주요한 경로들에 배치되었다. F1 MDMA 관련 유전자들과 관련된 상기 15개의 생물학적 프로세싱 경로들 사이에서, 9개는 F1 수컷 및 암컷 모두에서 공통된 경로로 확인되었고, 여기에는 MAPK 신호전달 경로, focal adhesion, 인슐린 신호전달 경로, 칼슘 신호전달 경로, 액틴 세포골격의 조절, Wnt 경로, 신경자극성 리간드-수용체 상호작용(neuroactive ligand-receptor interaction) 경로, axon guidance 및 대장암(colorectal cancer) 신호전달 경로가 포함되는 것으로 나타났다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Novel markers for diagnosing brain disease caused by brain injury and use thereof <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe ID 299424 gene sequence <400> 1 gcatgctctc ccagacttgg tctaggcttg ctggtgggtt tgggggcctg atgacctact 60 gtgcagaaat ctcataagct ccaaattgga cctactatct gccaatagat taagcccttc 120 aatccttttc ctaagcaatc tgcttgagga ccttctccag acatatatct aaaatgttcc 180 180 <210> 2 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 305559 gene sequence <400> 2 aagaggagac agctgagcag agccatccag gagcccgatg tcccaactca ccttccagcc 60 agtctcctgg aatccaacca catgagtgga cctacgagga acagttcaag cagctgtatg 120 aactcgatgc ggaccccaag aggaaggagt ttctggatga cctatttagc ttcatgcaga 180 180 <210> 3 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 355052 gene sequence <400> 3 gcaaccactg ccctccgttt ggagcttaaa aggaggctcc cagtattctg aagtttaagt 60 gatgccgcag agcataaccc tgtgcctatg tattccacat tactaaggta tatcttcaga 120 gtacatttct agttcttttg ggtagagtgc tgttgatgtc tgtctccact ccccaaattc 180 180 <210> 4 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 424366 gene sequence <400> 4 gtgccctgga ctgggcgaag tgggagtgct gggttctgat gatgatatat acaaaacctg 60 atgcctgcag gtgggtcaca ccatgcctct gtctgactac gaaga 105 <210> 5 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 515525 gene sequence <400> 5 ggctacacaa taagatcttg tctcaaaaca acaagaacaa gaatgacagt tccatgattc 60 ataagagtct tttctgaggc ttgctttata gtcatttcct ctaacataaa gcagaccata 120 ttggaaggaa gctgcttaag ctaagaacct aaacaactca aaagctttag gaaattcctg 180 180 <210> 6 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 520252 gene sequence <400> 6 aaatccattc tatgaacaac tgaaattaca gaacaagcag gtcatgtcct ctgtgtacaa 60 atcattgaag aagttaattg aggcccaaga gaacatccac aagctcaatc aggagataag 120 tctctattca aacctacata gccggctcat ggtggagaag aatcttacta agatgtccgt 180 180 <210> 7 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 566320 gene sequence <400> 7 aggaatccaa atgcgttaga cccagccaga gttctacaca gccgccctcg cctttcaagc 60 cgctcaggtg acaaccggtt tgctccatga aaactacctg acttcagctt gctgtctata 120 ccctgaagat ccccagagta acagcttgtc cttcctcaag gctctttgct taggaagaaa 180 180 <210> 8 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 783471 gene sequence <400> 8 taagcattgg ttacaatgaa acttaaatgt gcctaatact aagatctttc catctctgac 60 tcatggggta atgcaaaatt gtttttaaaa tagtaacttt tcatttgaaa ggtactttat 120 atcaggctca aatttagtac ctatttatat gctgagcaat aggggtgggc acatacatca 180 180 <210> 9 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 824655 gene sequence <400> 9 ccccatgtct tcaaatcctg cctctttaaa catgtgaacc attatcacta gggtacactc 60 aagtgctagc cactccatac tacatccctg ttctggagat acccacaagt ttttacagat 120 cgggaaactg aggctctgag aggtggggtg agaggtatag agcttatggc acagtcagga 180 180 <210> 10 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 444821 gene sequence <400> 10 gaagtctact ggcatcttca ccaccatgga gaaggctggg gcccacttca tgggtggggc 60 caagaggatc atcatccccc caccttctgt tgatgccccc atgtttgtga tgggtgtgaa 120 ccacaagaaa tatgtcagca atgcatcctg caccaccaac tgcttagctc ccctggccaa 180 180 <210> 11 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 531607 gene sequence <400> 11 attgttgcca tcaacaaccc cttcattgac ctcaactaca tggtctacgt gttccagtat 60 gactccaccc atggcaaatc caatggcaca gtcaaggttg agaatgggaa acttgtcatc 120 aatgggaagc ccatcaccgt cttccaggag cgagatcccg ctaacatcaa atggggtgat 180 180 <210> 12 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe ID 563270 gene sequence <400> 12 ttctaatctc tcatttatgt gctgttgtgg caagagggct aacagtttga gaaaccactg 60 taagcacagg tggactttct aaataggaga aaaaaatttg cagactgt 108

Claims (9)

  1. 하기 표에 기재된 90개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 마커.
    Figure pat00007

    Figure pat00008

    Figure pat00009
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뇌손상 질환은 MDMA(3,4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloride) 에 의해 유발된 것을 특징으로 하는 뇌손상 질환 진단용 마커.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 마커는 차세대에서 MDMA(3,4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloride)에 의해 유발되는 뇌손상 질환을 예측 또는 진단할 수 있는 것을 특징으로 하는 뇌손상 질환 진단용 마커.
  4. 제1항의 표에 기재된 90개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질을 포함하는 뇌손상 질환 진단용 조성물.
  5. (a) 뇌손상 질환 의심환자의 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 90개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
    (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함하는 뇌손상 질환의 예측 및 진단 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 대뇌피질 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 뇌손상 질환의 예측 및 진단 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌손상 질환의 예측 및 진단 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 90개의 유전자들 중에서 1번 내지 36번의 유전자들 중 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 감소되었을 경우, 뇌손상 질환이 유발된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 뇌손상 질환의 예측 및 진단 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 90개의 유전자들 중에서 37번 내지 90번의 유전자들 중 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 뇌손상 질환이 유발된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 뇌손상 질환의 예측 및 진단 방법.
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