KR20110087803A

KR20110087803A - 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 포함하는 피부상처치료제

Info

Publication number: KR20110087803A
Application number: KR1020100007405A
Authority: KR
Inventors: 강재선; 지용훈; 박윤정; 서주리; 이주희; 황성우; 문경호; 이상길; 김동희; 정성욱; 김원태; 정태성; 나동희
Original assignee: 대우제약 주식회사; 경성대학교 산학협력단; 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-27
Filing date: 2010-01-27
Publication date: 2011-08-03
Also published as: WO2011093600A3; WO2011093600A2

Abstract

본 발명은 한국산 당귀(참당귀 또는 세발당귀), 바디나물, 기름나물 및 기타 식물로부터 추출한 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 상처치료제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 포함하는 피부상처치료제{Use of Decursin and Decursinol angelate As Wound Healing ingredients}

본 발명은 한국산 당귀(참당귀 또는 세발당귀), 바디나물, 기름나물 및 기타 식물로부터 추출한 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 외용 피부상처치료제로서의 용도에 관한 것이다

데커신은 일본에서 바디나물(Angelica decursiva Fr. et Sav.)의 에테르 추출액으로부터 최초로 분리된 피라노쿠마린(pyranocoumarin) 계열의 천연물 성분으로 분자량 328.35 이며, 분자식이 C19H20O5이다.(TetrahedronLetters No. 14, 1461-1465(1966)). 특히 한국산 당귀(Angelica gigas Nakai)인 참당귀에 다량의 데커신이 함유되어 있고 (J. Pharm. Soc. Korea 11, 22-26(1967) 및 13, 47-50 (1969)), 기름나물(Peucedanum terebinthaceum Fischeret Turcz.)의 과실에서도 다량의 데커신이 분리된 바 있다(약학회지 제30권 제2호 73-78, 1986). 또한, 본 연구자등이 지리산 특산의 세발당귀(Angelica gigas Jiri)에도 다량의 데커신을 포함하고 있는 것을 조사한바 있다. (대한민국 특허출원번호 10-2008-0004122)

참당귀나 바디나물 그리고 기름나물의 성분인 데커신에 대한 약리작용이나 생물학적 성질에 대해서는 참당귀에서 분리한 데커신이 토끼의 적출장관 및 개구리의 적출심장의 운동을 마비시키며 혈압강하, 호흡억제 작용이 있으며, 토끼의 적출자궁에 대하여 비교적 흥분적으로 작용한다고 알려져 있다(생약학회지 제1권 제1호 25-32, 1970). 또한 참당귀 추출방법에 관한 국내특허도 본 발명자 등의 연구결과로 등록이 되었으며, 데커신과 데커시놀 안젤레이트는 구조 이성질체로서 현재까지 잘 알려져 있지 않았으나 본 발명자 등이 그 작용을 연구하여 왔으며, 그 분석법에 관한 것도 확립하여 밝힌바 있다 (한국등록10-0509843). 이외에도, 본 발명자 등은 데커신과 데커시놀 안젤레이트가 95% 이상 함유토록 하는 참당귀 추출물의 추출법과 이를 이용한 항산화 효과에 대한 특허를 등록한바 있으며, (대한민국 특허 등록번호 10-0893779) 지질 대사 개선효과를 가지는 참당귀 및 세발당귀 추출물과 그 추출방법에 대한 특허 또한 출원한 바 있다 (대한민국 특허출원번호 10-2008-4122). 최근에 잔틴 산화효소 억제효과를 통한 통풍 치료효과에 대한 연구결과를 특허출원 한 바 있다. (대한민국 특허출원번호 10-2008-132592) 참당귀는 한국이 원산지로서 그 사용 범위가 보혈제로서 한방약제로 이용되어져 왔으며 최근 연구결과로 한국산 당귀의 지표물질인 데커신과 주요 성분인 데커시놀이 혈류개선 작용과 항 헬리코박터 작용이 있다고 보고되어 있다.

본 발명의 데커신과 데커시놀 안젤레이트는 한국산 당귀, 바디나물, 기름나물 및 기타 다른 식물로부터 추출하여 분리하거나 조직배양기술과 유기합성 기술을 활용하여 생산 할 수 있다. 하기의 구조는 데커신과 데커시놀 안젤레이트의 구조를 나타낸 것으로서 동일한 분자량과 동일한 화학식을 가지고 있는 구조이성질체이다.

본 발명은 천연식물로부터 추출한 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 이용하여 피부상처치료를 위한 새로운 용도를 제공한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 이미 개발된 정제법으로 데커신 및/또는 데커시놀 안젤레이트를 얻었다. (대한민국 특허 등록번호 10-0893779호)

본 발명의 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 피부 상처치료효과에 탁월한 효과가 있으며 상처에는 겔제제, 연고제제, 크림제제 등의 형태로 피부에 적용 할 수 있고 산제의 형태로도 피부에 도포할 수 있다. 본 화합물을 0.1% 농도에서 5% 농도까지를 적용하여 피부재생효과에 대해 사전실험을 실시하였고, 0.1% 농도에서 1% 농도 까지 실험을 재실시하였다. 최종적으로 0.5%농도와 1%농도를 사용하여 최종 결과를 도출하였을 때 본 화합물 0.5% 농도에서 피부 상처 재생 능력이 가장 우수하였다. 이러한 결과는, 랫드의 상처 회복 능력, 조직검사 그리고 콜라겐 생성 간접 정량 시험 방법을 통하여 확인할 수 있었다.

약학제제에 적용할 경우 본 화합물에 바셀린, 알로에 추출물, 젤라틴 등의 연고기제를 첨가하여 제조 할 수 있다. 제조시 뭉치는 현상을 방지하기 위해 다가알콜류로서 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 락티톨, 리비톨 등과 폴리소르비탄, 트리톤 X-100 등 계면활성제와 점증제로서 아카시아 고무, 펙틴, 잔탄껌, 한천 등을 사용할 수 있으며 안정제, 보존제, 방향제 등을 추가로 첨가할 수 있다. 또한, 분해방지를 위해 산도조절제인 구연산, 숙신산, 주석산, 호박산, 사과산, 붕산, 초산, 염산, 아스코르브산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 피부상처치료제조성물은 유효성분으로 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 조성물 전체중량의 0.1 내지 5.0 중량% 함유할 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 1.0 중량% 함유한다.

본 발명의 피부상처치료제는 외용으로 사용되며, 1일 수회, 연고, 크림제, 겔제 및 산제로서 피부에 도포할 수 있다.

본 발명의 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 피부 상처치료작용이 매우 우수하여 안전한 천연성분의 외용 피부상처치료제를 제공할 수 있다.

도1은 실험동물에서 상처치료효과를 시간별로 관찰한 결과로서 CON(Model control) ; 상처를 내고 치료약을 바르지 않은 그룹, Vaseline(바셀린 처리군); 상처 후 연고기제인 바셀린만으로 치료한 그룹, Madecassol(마데카솔,Madecassolⓡ처리군 ) ; 상처 후 현재 상처치료제로 널리 사용되고 있는 동국제약의 제품인 마데카솔로 치료한 그룹, 0.5% AGNEX( 0.5% 아그넥스겔 제제); 상처 후 실시예2에 따라 제조한 0.5% 아그넥스겔 제제로 치료한 그룹, 1% AGNEX( 1% 아그넥스겔 제제); 상처 후 실시예2에 따라 제조한 1% 아그넥스겔 제제로 치료한 그룹으로 10일 동안 각 상처의 치료 효율을 상처의 크기로 비교하였다.
도2는 실험동물에서 CON(Model control), Vaseline(바셀린 처리군) Madecassol(마데카솔,Madecassolⓡ처리군 ), 0.5% AGNEX( 0.5% 아그넥스겔 제제) 1% AGNEX( 1% 아그넥스겔 제제)처리군에서 상처의 크기가 50%로 줄어드는 시간을 표기한 것으로 날짜가 짧을수록 치료효과가 높으므로 0.5% AGNEX군이 가장 우수함을 알 수 있다.
도3은 실험동물의 조직을 검사한 결과로 Normal control(정상대조군), Model control, Vaseline(바셀린 처리군) Madecassol(마데카솔,Madecassolⓡ처리군 ), 0.5% AGNEX( 0.5% 아그넥스겔 제제) 1% AGNEX( 1% 아그넥스겔 제제)처리군의 실험동물 조직을 염색하여 현미경으로 관찰한 것으로써 각각 배율 160배 검체 1개와 640배 배율로 관찰한 2개의 검체를 나타낸 것으로 Normal control(정상대조군)은 표피와 진피의 경계가 뚜렷하고 붉은색 부분인 진피 내의 콜라겐 양이 풍부하였다. 반면 model control 군은 표피가 생성되지 않았고 보라색 점들로 나타난 fibroblast가 약간의 콜라겐과 형성되었다. Madecassol 군은 표피가 완전히 생성되었고 진피 내 콜라겐 양 또한 풍부하지만 모낭과 피지선이 생성중으로 보인다. 0.5% AGNEX군 및 1% AGNEX군은 normal control군 만큼 진피와 표피의 경계가 뚜렷하지는 않으나 다른 군과 비교하였을 때 가장 뚜렷하였고 모낭과 피지선 또한 완벽하게 재생되었다.
도4 실험동물의 조직내의 Hydroxyproline의 함량을 검사한 결과로 Normal control(정상대조군), Model control, Vaseline(바셀린 처리군) Madecassol(마데카솔,Madecassolⓡ처리군), 0.5% AGNEX(0.5% 아그넥스겔 제제) 1% AGNEX(1% 아그넥스겔 제제)처리군에서 Hydroxyproline의 조직내 함량을 표시함 결과이다. 0.5% 및 1% AGNEX가 함량이 높은 것을 볼 수 있으며 이것은 상처치유가 빠른것을 의미한다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실험 및 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 참당귀로부터의 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 분리

식품용 및 의약용으로 사용하기 위해 추출 용매는 약전 에탄올 및 주정 알콜을 사용하였고 물을 사용할 때는 정제수를 사용하였다. 원료인 참당귀를 40메시 (40 mesh)이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조한다. 건조분말 약 2배에서 4배의 약전용 알콜 또는 주정알콜 (이하 ‘에탄올’로 표기)을 첨가하여 12시간이상 충분히 추출한다. 추출물을 여과하고 감압농축한다. 생성된 농축물을 섭씨 80도 열풍으로 건조함으로써 점성이 높은 물질을 얻을 수 있었다. 참고로, 상기 농축물에 함유된 데커신과 데커시놀 안젤레이트의 함량이 33% 이었다. 고점성의 농축물 1 킬로그람당 에탄올 1리터를 넣어 주성분을 용해하고 영하 20도에서 10시간 동안 방치한다. 생성된 침전물은 원심분리하여 제거되고 상등액은 감압농축 후 섭씨 80도 열풍으로 건조하여 농축된다. 농축물에 60% 에탄올(희석 에탄올) 50 리터를 넣어 용해한 후 원심분리하여 용액을 회수한다. 회수된 용액은 감압농축한 후 80도 열풍으로 건조하여 약 330그람의 농축물을 얻었다.

최종 농축물을 액체크로마토그램 (HPLC)으로 분석한 결과 데커신 54.52%, 데커시놀 안젤레이트 41.26%, 데커시놀 0.299%, 이외 데커신 유사체가 2.5%로 구성되어 있다. 구조 결정은 질량분석을 통하여 분자량을 확인하여 결정하였다.

[실시예 2] 겔제제의 제조

데커신 및 데커시놀안젤레이트를 주성분으로 포함하는 실시예1의 농축액 0.05 g과 0.1 g에 에탄올 500 ㎕ 각각을 첨가하여 완전히 용해하였다. 각 용해물에 10 g vaseline(Duksan, Korea)을 각각 첨가하여 섭씨 70℃로 조정된 건조기에서 충분히 섞일 때까지 혼합하여 최종 0.5%와 1% 겔제제(이하 아그넥스: AGNEX로 표기)가 되도록 제조하였다.

[실험예 1] 상처치료 효능확인

2-1. 실험동물

실험동물은 9주령의 수컷 스프라그-돌리 백서 (Sprague-Dawley rat, male, 250-280 g, 샘타코, 이하 SD-rat)을 사용하였고, 습도 50 ± 5%, 온도 24～26℃로 유지되는 사육장(SPF chamber)에서 사육하였으며, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일 동안 실험실 환경에서 적응시킨 후 THE GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS(Natioanl Research Council, NRC)에 의거하여 실험하였다.

2-2. 상처치료모델 제조 및 시험물질 처리

SD-rat을 30% urethane (sigma)으로 복강마취 시킨 후, 등에 일정한 크기 (1.5 ㎝ x 1.5 ㎝)로 피부를 제거한 후 Table 1에 따라 각 그룹에 해당하는 약물을 10일간 1일 1회 국소도포하고 멸균된 거즈로 상처부위를 보호해 주었다. (a) 정상대조군(Normal control) ; 상처를 내지 않은 그룹, (b) 모델대조군(Model control) ; 상처를 내고 치료약을 바르지 않은 그룹, (c) 바셀린 처리군(Vaseline); 상처 후 연고기제인 바셀린만으로 치료한 그룹, (d) 마데카솔 처리군(Madecassolⓡ, 제조판매사 ㈜동국제약) ; 상처 후 현재 상처치료제로 널리 사용되고 있는 동국제약의 제품인 마데카솔로 치료한 그룹, (e) 0.5% 아그넥스겔 제제 ; 상처 후 실시예2에 따라 제조한 0.5% 겔제제(0.5% AGNEX)로 치료한 그룹, (f) 1% 아그넥스겔 제제 ; 상처 후 실시예2에 따라 제조한 1% 겔제제(1% AGNEX)로 치료한 그룹.

Table 1. An in-vivo experimental design for studying wound healing of AGNEX.

2-3. 결과 분석 방법

* 상처크기 측정 분석

1일 1회 상처부위에 연고를 국소도포 할 때마다 caliper를 이용하여 가로, 세로 상처의 크기를 매일 측정하였다. 평가는 초기 상처의 크기에 대한 관찰시 상처크기의 백분율로 평가하였다.

* 조직병리학적 평가 분석

실험 종료 후 상처가 회복된 부위의 피부를 절개하여 조직병리학적 평가를 수행하였다. 피부조직은 4% neutral buffered paraformaldehyde에 6시간동안 고정시킨 후 12, 16, 20% sucrose로 infusion 시켰다. OCT compound (Tissue-Tekⓡ)에 고정된 조직을 포매하고 액체질소로 완전히 얼려 cryosection시 까지 -80℃에 보관하였다. Microtome (GmbH, 69190 Walldorf)을 이용하여 5 ㎛ 두께로 절단한 조직은 gelatin-coated slide에 붙여 1시간동안 실온에서 건조한 뒤 Hematoxylin & Eosin staining하여 광학현미경으로 확인하였다.(도3 참조)

* Hydroxyproline assay를 이용한 조직 내 collagen 양 측정 분석

재생된 피부조직 내 collagen 양을 측정하기위해 collagen의 가수분해 산물인 hydroxyproline의 양을 측정하였다. 피부조직 0.2 g에 6N-HCl 4 ㎖을 넣어 균질기(homogenizer)로 균질화시켜 110℃에서 24시간동안 가수분해 시킨 후 Pore size 0.4 ㎛ syringe filter (Sartorius)로 여과시켰다. 상층액 100 ㎕를 취하여 완전히 건조시켜 염산을 제거한 후 50% isopropanol 1.2 ㎖을 첨가하여 침전물을 용해하였다. 여기에 Chloramine-T solution을 200 ㎕를 가하여 20분 동안 실온에서 반응시켰다. Ehrilich 시약을 1.2 ㎖ 첨가하여 100℃에서 5-10분 동안 발색하여 효소면역측정기(ELISA reader)를 이용하여 558 nm에서 흡광도를 측정하였다. Trans-hydroxyproline (Sigma)로 표준곡선을 그려 정량하여 피부조직 g당 함유한 hydroxyproline양으로 표현하였다. (도4 참조)

2-4 결과

* 상처동물 모델의 상처크기 측정

실험동물인 SD rat의 등에 털을 제거하고 일정한 크기로(1.5 x 1.5 cm) 피부를 제거하였다. 각 그룹에 해당하는 약물을 매일 국소도포 하였다. 상처의 크기 측정은 매일 10일 동안 약물 처리전에 측정하였다. 상처크기는 면적(가로 × 세로)으로 계산하였으며 첫 날의 상처크기를 100 %로 설정하여 줄어드는 비율을 비교하였다. (도 1참조.) 10일 째 되는 날, 회복률이 높은 순대로 나열해보면 0.5% AGNEX / Madecassol / 1% AGNEX / Vaseline / Control 이다. 상처의 크기가 50 % 감소한 날짜를 비교해보면, control은 6.8일, caseline은 6.3일, madecassol은 5.3일, 0.5% AGNEX는 4.7일, 1% AGNEX는 5.6 일로 0.5% AGNEX의 효과가 가장 뛰어남을 확인하였다. (도 2 참조.)

* 조직병리학적 검사

상처가 회복된 조직을 Hematoxylin & Eosin staining 염색을 통해 관찰하였다. Normal control 군은 표피와 진피의 경계가 뚜렷하고 붉은색 부분인 진피 내의 콜라겐 양이 풍부하였다. 반면 model control 군은 표피가 생성되지 않았고 보라색 점들로 나타난 fibroblast가 약간의 콜라겐이 형성되었다. Madecassol 군은 표피가 완전히 생성되었고 진피 내 콜라겐 양 또한 풍부하지만 모낭과 피지선이 생성중으로 보였다. AGNEX 군은 normal control 군 만큼 진피와 표피의 경계가 뚜렷하지는 않으나 다른 군과 비교하였을 때 가장 뚜렷하였고 모낭과 피지선 또한 완벽하게 재생되었다.(도 3참조)

* Hydroxyproline assay

상처가 회복된 조직의 콜라겐 양을 측정하기 위해 collagen의 가수분해 산물인 hydroxyproline의 양을 측정하였다. Normal control 군은 9.6 mg, model control 군은 7.5 mg, Vaseline 군은 7.2 mg, Madecassol 군은 8.3 mg, 0.5% AGNEX군은 8.9 mg, 1% AGNEX 군은 9.0 mg 이었다.(도 4참조) Model control이나 Vaseline 군에 비해 약물 처리 군의 조직내 콜라겐 양이 증가하였다.

본 발명이 제공하는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 피부 상처치료작용이 매우 우수하여 안전한 천연성분의 피부상처치료제를 제공할 수 있다.

Claims

하기 구조를 가지는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 유효성분으로 포함하는 외용 피부상처치료제
제 1항에 있어서, 상기 데커신 및 데커시놀 안젤레이트가 한국산 참당귀(Angelica gigas Nakai), 세발당귀(Angelica gigas Jiri), 바디나물(Angelica decursiva Fr et Sav.), 또는 기름나물( Pseucedanum terebinthaceum Ficscher et Turcz)로부터 추출한 성분인 것을 특징으로 하는 외용 피부상처치료제
제1항 또는 제2항에 있어서, 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 조성물 전체중량의 0.1 내지 5.0 중량% 포함하는 외용 피부상처치료제