KR20110083551A

KR20110083551A - 항생 펩타이드

Info

Publication number: KR20110083551A
Application number: KR1020110003489A
Authority: KR
Inventors: 원형식; 김서진; 이성희
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-14
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2011-07-20
Also published as: KR101276643B1

Abstract

본 발명은 3종 아미노산으로 설계 및 제조되어 간단한 조성과 짧은 길이를 가지는 항생 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 루신과 라이신을 이용하여 양친매성(amphipathic) 나선성을 부여하고, 2개의 트립토판 잔기가 친수성 말단부와 소수성 시작부 사이의 임계 양친매성 경계면에 위치하는 7에서 11 잔기를 가지는 항생 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드들은 천연 AMP들이나 기존에 보고된 다른 펩타이드인 omiganan(ILRWPWWPWRRK-NH₂)에 비해 항균성이 강력하고, 길이가 짧으며, 단순한 조성을 가지기 때문에, 새로운 항생제 개발에 유용한 후보물질로 이용될 수 있다.

Description

항생 펩타이드{ANTIMICROBAL PEPTIDE}

본 발명은 3종 아미노산으로 설계 및 제조된 항생 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 루신과 라이신을 이용하여 양친매성(amphipathic) 나선성을 부여하고, 2개의 트립토판 잔기가 친수성 말단부와 소수성 시작부 사이의 임계 양친매성 경계면에 위치하는 7에서 11 잔기를 가지는 아미노산 조성이 간단하고 길이가 짧은 새로운 항생 펩타이드에 관한 것이다.

모든 생명체로부터 유래한 막-용해성(lytic), 항생 펩타이드(이하, "AMP"라 함)들은 강력한 치료제 개발을 위한 후보물질로 주목받고 있다(Zaiou M., J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Zasloff M. Nature 415:389,2002; Hancock REW, et al., Proc. Nat. Acad. Soc. USA 97:8856, 2000; Yeaman MR, et al., Pharmacol. Rev. 55:27, 2003).

새로운 항생제 개발의 목적으로 AMP들의 구조-활성 관계에 대한 광범위한 연구들로부터 많은 유도체들이 생성되었다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Zasloff M. Nature 415:389, 2002; Won HS, et al., J. Biol. Chem. 279:14784, 2004).

이들을 이용하여 임상적 치료제를 개발하기 위한 산업적인 시도들도 널리 이루어지고 있다(Zaiou M.J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Zasloff M. Nature 415:389, 2002; Jenssen H, et al., Clin. Microbiol. Rev. 19:491,2006). 특히, 본 발명에서 대조군으로 사용된 펩타이드인 omiganan(MBI-226)은 항생 펩타이드 최초로 새로운 항생제 의약품으로 개발 완료 시점에 근접한 물질로서, 현재 임상 3상 시험이 진행 중이다(Gordon J, et al., Curr. Eye Res. 30:505, 2005).

그러나 이들의 상당하게 큰 분자 크기와 높은 제조원가 및 일부 물질에 나타난 약한 약제학적 및 약동학적 특성 등은 그들의 산업적 및 임상적인 적용에 있어서의 장애가 되고 있다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Won HS, et al., J. Biol. Chem. 279:14784, 2004).

따라서 약학적 최적화 및 제조원가를 낮추는 측면에서 더욱 바람직한 선도물질이 되기 위하여, 될 수 있는 한 단순한 아미노산 조성을 가지는 더 짧은 AMP들을 발명하는 것이 필요할 것이다. 이러한 측면에서, 항생 활성을 가지는 모델 양친매성 나선 펩타이드를 고안하기 위한 최소 드 노보(De novo) 시도들은 주목할 가치가 있다.

양이온성 양친매성 α-나선 펩타이드들은 특히 풍부하고 광범위하며 자연계에 존재하는 AMP들 중에서 가장 잘 규명된 군이다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Jenssen H, et al., Hancock REW. Clin. Microbiol. Rev. 19:491, 2006;).

따라서, 강력한 α-나선 형성력을 가지는 루신과 라이신과 같은 아미노산들의 단순한 조성을 가지는 새로운 양친매성 나선 모델 AMP들을 제조하기 위하여 많은 연구자가 노력하고 있다(Chou PY, et al., Biochemistry 13:211, 1974).

이에 본 발명자들은 아미노산 조성이 간단하면서 길이가 짧아 저분자량을 가지는 펩타이드 항생물질을 개발하기 위해 예의 노력을 기울인 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 목적은 항생 활성을 가지는 간단한 아미노산 조성의 저분자량 펩타이드와, 이를 이용한 약학적 조성물 및 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 12로 구성된 군으로부터 선택되고, 항생 활성이 있는 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 그램 양성균 또는 그램 음성균인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 그램 양성균은 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Micrococcus luteus, 및 MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MRSA 종은 베타 락탐 항생제 및 카나마이신을 포함한 다수의 항생제에 대한 다제내성균 MRSA-TK784인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 그램 음성균은 Escherichia coli ATCC 25922, Shigella dysentariae ATCC 9752, Salmonella typhomurium ATCC 14028, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 및 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 담체로는 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성아미노산, 및 아미노산 공중합체와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들 수 있다. 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같이 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체, 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌(Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991)에 기재되어 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 펩타이드 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효 용량은 1 일당 0.01 내지 20 ㎎/㎏체중이고, 바람직하기에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 체중이며, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus)형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다.

상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명은 항생 활성을 가지는 아미노산 조성이 간단하면서 길이가 짧은 저분자량 펩타이드와, 이를 이용한 약학적 조성물 및 항균용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

본 발명의 펩타이드들은 천연 AMP들이나 기존에 보고된 다른 펩타이드인 omiganan(ILRWPWWPWRRK-NH₂)에 비해 항균성이 강력하고, 내성균에 대하여도 활성을 가지며, 용혈독성이 약하고, 길이가 짧아 저분자량이며 단순한 아미노산 조성을 가지기 때문에, 새로운 항생제 개발에 유용한 후보물질로 이용될 수 있다.

도 1은 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 각 펩타이드 서열은 왼쪽에 일련번호로 표시했고, 그 펩타이드 이름은 오른편에 식으로 표시하였다. 트립토판(W) 잔기들은 굵은 글씨, 기울임꼴로 나타내었으며, 펩타이드의 앞선 번호로부터의 아미노산 변이는 밑줄로 표시하였다. 또한, 평균잔기 소수성(mean-residue hydrophobicity, H), 평균잔기 소수성 모멘트(mean-residue hydrophobic moment, μH), 및 도 2의 나선형 휠 다이어그램(helical wheel diagrams)에서의 극성 지역 각도(polar angle, θ) 값을 각 펩타이드에 따라 오른쪽에 표시하였다.
도 2는 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드에 대한 나선형 휠 다이어그램(helical wheel diagrams)으로, 각 다이어그램의 중앙에 해당 펩타이드의 모델 번호와 이름(화학식)을 나타내었다. 고안의 순서는 회색 화살표의 흐름으로 묘사하였다. 트립토판(W) 잔기들은 굵은 글씨, 기울임꼴로 나타내었으며, 펩타이드의 앞선 번호로부터의 아미노산 변이는 밑줄로 표시하였다.
도 3은 인간의 적혈구 세포에 대한 각 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드의 용혈 독성을 나타낸 것으로, 0.2% Triton X-100의 용혈 독성을 100%로 하여 상대적인 용혈독성을 %로 표시하였다.
도 4는 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드들의 Far-UV(원자외선) CD(circular dichroism, 원편광이색성) 스펙트럼으로서, 왼쪽 줄은 10 mM 인산완충액에서의 스펙트럼이고, 오른쪽 줄은 10 mM SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 미셀에서의 스펙트럼이다. 해당 모델 번호는 모든 패널에 있는 각 스펙트럼에 표지하였다.
도 5는 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드들의 SDS 미셀에서의 나선구조 정도를 나타낸 그림으로, 도 4에서 나타난 스펙트럼의 222 nm 파장에서의 신호 강도로부터 계산되었다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명자들은 천연 AMP를 이용하지 않더라도 임계 양친매성 경계면에 트립토판을 가지도록 새롭게 설계된 간단한 조성의 양친매성 나선 펩타이드가 짧은 길이로도 항생활성을 가질 것임을 예측하고, 이러한 발상을 증명하기 위하여 3종의 아미노산의 단순조성을 가지는 12 종의 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드들(두 개의 트립토판을 가지는 LK 펩타이드들)을 고안하고 그들의 항생 활성을 알아보았다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 펩타이드 준비

1-1: 펩타이드 서열 및 구조 설계

본 발명의 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드의 아미노산 서열 및 상기 서열로부터 예측 가능한 구조적 변수들(parameters)을 도 1에 요약하였다. 도 1의 각각의 서열은 서열번호 1에서 12로 지정하였다: 모델 1.1(서열번호 1) ~ 모델 4.4(서열번호 12).

각 서열을 고안하기 위하여 본 발명자들은 도 2에서 나타난 나선 휠 도식을 이용하였다. 모든 펩타이드들은 α-나선 구조로 형성될 때, 나선 축의 한쪽으로 소수성 루신 잔기가 다른 한쪽으로는 양이온성 라이신 잔기가 모여서 완전하게 양친매성이 되도록 고안하였으며, 2개의 트립토판 잔기는 나선 휠 사영에서 친수성(lysyl) 말단부와 소수성(leucyl) 시작부 사이의 임계 양친매성 경계면에 위치시켰다(도 2 참조).

따라서, 모든 모델 펩타이드들은 -WLLKW- 또는 -WLKKW- 모티브를 소유하게 된다. 상기 모티브를 항상 상기 서열의 중앙에 위치시키기 위하여, 고안된 서열은 홀수의 아미노산을 갖게 되는데, 이러한 규칙에 따라 L_lK_mW₂로 표시되는, 12개의 모델 펩타이드들을 생성하였고, 이들은 5개 잔기에서 11개 잔기까지의 다양한 길이를 갖는다: 모델 1.#은 5개의 잔기, 2.#은 7개의 잔기, 3.#은 9개의 잔기 및 4.#은 11개의 잔기.

동일한 수의 잔기를 갖는 그룹에서, 최소의 루신을 가지고 있는 것을 #.1로 표시하였다. 다른 단백질들은 K(라이신)에서 L(루신)로 대체하여, 펩타이드의 앞선 번호로부터, 순차적으로 생성하였다. 결국, 상기 모델 펩타이드의 L:K 비율은 1:0.4에서 1:2.5로 분포하였다.

설계된 각 펩타이드의 서열로부터 평균잔기 소수성(mean-residue hydrophobicity, H) 값은 아미노산의 Eisenberg 소수성 지수(Nielsen, S.L. et al., Protein Sci. 16:1969, 2007; Dathe, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1558:171, 2002; Eisenberg, D., Annu. Rev. Biochem. 53:595, 1984)를 합하여 계산하였고, 평균잔기 소수성 모멘트는 도 2의 아미노산 배치를 고려하여 각 아미노산 소수성 값은 벡터 합으로서 계산하였다. 이들 구조 변수들은 HydroMCalc () 프로그램을 사용하여 계산하였고 각 수치들을 도 1에 도시하였다. 또한, 도 2의 나선형 휠 다이어그램(helical wheel diagrams)에서의 극성 지역 각도 (polar angle, θ) 값을 구하여 도 1에 나타내었다.

AMP(Bessalle, R., et al., J. Med. Chem. 36:1203, 1993; Dathe, M., et al., FEBS Lett. 403:208, 1997; Deslouches, B., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 49:316, 2005)의 드 노보 설계(de novo)에서 트립토판 잔기가 종종 나타나며, LKW 서열 역시 나타난다: K₆L₆W(KWKKLLKKLLKLL-NH₂), K₄L₇W(KLLLKWLLKLLK- NH₂) 및 이들의 유사체는 항생제로 평가되고 있다(Avrahami, D., Z. et al., Biochemistry 40:12591, 2001; . Shin, S. Y., et al., Biotechnol. Lett. 26:735, 2004; Oren, Z., J. et al., Eur. J. Biochem. 269:3869, 2002). 그러나 이들은 본 발명에서 제시하는 펩타이드들에 비해 길고, 트립토판 배치법이 다르며, 서열을 고안할 수 있는 아무런 규칙도 제시되지 않았다.

1-2: 펩타이드 준비

모델 펩타이드 및 대조 펩타이드(omiganan)(서열번호 13: ILRWPWWPWRRK-NH₂)은 화학적으로 합성된 건조 분말 형태로 구입하였다(ANYZEN, 한국 광주). 모든 펩타이드들이 중성 pH에서 음전하를 갖지 않게 하기 위하여, C-terminal amidation으로 합성되었다.

또한, 본 발명의 펩타이드 분말을 각각의 용매에 녹인 후, 용액에서의 상기 펩타이드 농도는 분광광도계를 이용하여 280 ㎚에서의 흡광량으로부터 결정하였다.모델 펩타이드들은 모두 2개의 트립토판 잔기를 가지고 있기 때문에 280 ㎚에서의 몰흡광계수(molar extinction coefficient)를 11,000 M^-1㎝^-1로 사용하였고, omiganan은 4개의 트립토판을 가지고 있기 때문에 22,000 M^-1㎝^-1의 몰흡광계수를 사용하여 농도를 계산하였다.

실시예 2: 항생성 분석

2-1: 펩타이드의 항생 활성 분석

상기 실시예 1-2의 펩타이드들의 활성은 4개의 그램 양성균(Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p, Staphylococcus epidermis ATCC 12228, Micrococcus luteus ATCC 10240) 및 5개의 그램 음성균(Escherichia coli ATCC 25922, Shigella dysentariae ATCC 9752, Salmonella typhomurium ATCC 14028, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)에 대하여 측정하였다. 또한, 메티실린 내성(methicillin-resistant) Staphylococcus aureus 종인 MRSA-TK784(Ubukata, K., et al., Antimicrob. Agents Chemother, 5:851, 1985)은 다제내성균(multi-drug resistant bacterium)으로 사용하였다.

상기 균주들을 이용하여, 본 발명의 모델 펩타이드에 대한 항생 감수성 평가는 액상(broth)배지에서의 미량희석법(microdilution method)으로 최소저해 농도(MIC) 값들을 측정하여 수행하였다.

즉, 다양한 농도(1.3~80 ㎍/㎖, 2배씩 순차적으로 희석)로 각각의 펩타이드가 첨가된 세포 배양액(10⁶~10⁸ cells/㎖, LB 액상 배지)으로부터, 세포 성장을 완전하게 저해하는 가장 낮은 펩타이드 농도를 그 MIC로 결정하였다.

2-2: 펩타이드의 항생 활성 분석 결과

MRSA-TK784 종의 항생제 저항성은 이미 문헌상에 발표된 바 있으며(Ubukata, K., et al., Antimicrob. Agents Chemother, 5:851, 1985), 즉, 상기 MRSA-TK784 종은 메티실린을 포함한 다양한 베타-락탐(β-lactam) 항생제에 저항력이 있음이 보고된 바 있다(MIC=100 ㎍/㎖ 이상). 이에 본 발명자들은 MRSA-TK784의 항생제 내성을 확대 검토 해 본 결과(표 1), 또 다른 β-lactam 항생제인 옥사실린(oxacillin)에도 매우 큰 저항력이 있었다(MIC=80 ㎍/㎖ 이상). 게다가, 상기 종은 단백질 합성 저해 항생제인 카나마이신(kanamycin)에도 강한 저항력이 있었으며(MIC=80 ㎍/㎖ 이상), 반코마이신(vancomycin)에도 약간의 저항력을 보였다(MIC=2.5 ㎍/㎖).

하기 표 2는 본 발명의 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드 및 대조 펩타이드(omiganan)의, 9개의 서로 다른 박테리아 종 및 MRSA-TK784에 대한 MIC 값을 정리한 것이다.

하기(실시예 4)한 바와 같이, 모델 펩타이드 1.1 및 1.2의 비활성은 그들이 비나선형 구조를 갖는데 기여한다. 반면, 나선형 성질을 갖는 다른 펩타이드들은 특정 박테리아 종들에 대한 항생성을 나타낸다. 이들 중, 모델 2.1, 2.2, 3.1 및 3.2 펩타이드들은 약한 나선형 구조 성질을 나타내는 CD 스펙트럼을 보였고(실시예 4 참조), 따라서 활성도 상대적으로 강하지 않아 MIC 값이 거의 40 또는 80 ㎍/㎖으로 컸고, 활성을 나타내는 균주의 종류도 적었다. 그러나, 강한 항생성은 모델 3.3~4.4에서 관찰되었다. 이들 중, 가장 강력한 항생성은 9-잔기의 L₅K₂W₂ 펩타이드(모델 3.4)에서 관찰되었다. 상기 펩타이드(모델 3.4)의 MIC 값은 3개의 그램 양성 박테리아에서 1.3 ㎍/㎖보다 낮았으며, MRSA-TK784를 포함하는 다른 6개의 종에서는 2.5~10 ㎍/㎖ 값을 가졌다. 이는 표 1에 나타낸 MIC(최소저해농도)의 기하평균값(GM = 3.1)을 기준으로 하였을 때, omiganan(GM = 31.7)에 비해 10배 이상 강한 활성에 해당된다. 모델 3.4 뿐만 아니라, 모델 3.3, 4.2 및 4.3 펩타이드에서도, omiganan 보다 더 강한 활성을 보였다.

또한, 모델 4.4 펩타이드는 그램 음성 박테리아에 항생성이 없었지만, 그램 양성 박테리아에 대하여는, 표 1에 나타낸 MIC(최소저해농도)의 기하평균값(GM)을 기준으로 하였을 때, omiganan에 비해 4배 이상 강한 활성을 나타냈었다. 그 밖에, 모델 4.1의 활성은 omiganan에 비해 그램양성균에 대해서는 낮지만 그램음성균에 대하여는 더 높은 활성을 나타내어, 전체적으로는 omiganan과 유사한 정도의 활성을 나타내었다. 여기서 주목할 만한 것은, 본 발명의 모델 펩타이드 중 일부가, 다제내성균인 MRSA-TK784를 효과적으로 저해하는 것이다. 즉, 상기 MRSA 종은 omiganan에는 저항성이 있으나, omiganan에 비해 더 적은 수의 아미노산으로 구성되고 길이도 더 짧은 본 발명의 모델 펩타이드 3.3, 3.4, 4.2, 4.3 및 4.4가 MRSA에 활성이 있는 것이다. 따라서, MRSA-활성 모델 펩타이드는 새로운 항생제 개발을 위해, omiganan보다 더 훌륭한 후보 물질이 될 수 있을 것이다.

실시예 3: 용혈 독성(Hemolytic activity) 및 치료지수(Therapeutic index) 분석

3-1: 펩타이드의 용혈 활성 및 유사치료지수 분석

본 발명의 모델 펩타이드들에 대한 독성 평가의 일환으로, 용혈 활성을 측정하기 위하여, 다양한 농도의 펩타이드들(1.3~80 ㎍/㎖, 2-배씩 순차적으로 희석)이 있는 조건에서, 인간 적혈구 세포 현탁액(10% v/v)을 37℃ 조건에서, 30분간 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리한 다음, 상층액의 흡광도를 550 ㎚에서 측정하여 용혈 정도를 평가하였다. 펩타이드 대신 0.2% Triton X-100을 처리한 결과를 100% 용혈활성의 대조군으로 하여, 각 펩타이드의 용혈 능력을 %로 나타내었다.

상기 실험은 3개의 샘플로 수행되어졌으며, 3회의 독립적인 측정의 평균값을 기록하려 도 3에 도시하였다. 최소 용혈 농도(Minimal hemolytic concentration, MHC)는 5% 이상의 용혈 활성을 나타내는 최소 농도 값으로 결정하여 표 3에 나타내었다. 본 실험이 2배 연속 희석(2-fold serial dilution)의 방법으로 수행된 점을 고려하여, 측정된 최고 농도인 320 ㎍/㎖에서도 용혈활성이 나타나지 않았을 경우에는, 640 ㎍/㎖을 MHC로 하여 하기의 유사치료지수(pseudo-therapeutic index, TI') 계산에 사용하였다.

일반적으로 독성 용량 대비 유효 용량의 비로서 파악하는 안전성 평가의 지표로서, 유사 치료지수(pseudo-therapeutic index, TI')를 결정하여 표 3에 나타내었다. 이때, 독성 용량으로서는 적혈구에 대한 최소 용혈 농도인 MHC를 사용하고, 유효 용량으로서는 세균에 대한 최소 저해농도인 MIC의 기하평균값(GM)을 사용하였다: TI'= MHC/GM. 유사치료지수는, 전통적으로 50% 독성용량(TD₅₀) 대비 50% 유효용량 (ED₅₀) 비로서 정의되는 치료지수(therapeutic index, TI=TD₅₀/ED₅₀)와 마찬가지로, 각 펩타이드들의 상대적인 안전성을 비교하는 지표로서 사용될 수 있다(Chen, Y. et al., J. Biol. Chem. 280:12316, 2005; Zhu, W.L. et al., J. Biochem. Mol. Biol. 40:1090, 2007).

3-2: 펩타이드의 용혈 활성 및 치료지수 분석 결과

하기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 중 항생활성이 약한 모델 1.1~3.2는 농도를 높게 처리해도(320 ㎍/㎖) 용혈 활성이 거의 없거나 미약했다. 반면, 강력한 항생 활성을 나타내는 펩타이드일수록 용혈독성도 커지는 경향을 보였다. 그러나, 항생 활성이 omiganan과 비슷하거나 더 큰 모델 4.1 및 4.2 펩타이드의 경우, 높은 농도에서도 용혈 작용이 크지 않았다.

전술한 바와 같이 모델 4.2는 omiganan보다 더 좋은 항생활성을 가지면서도(표 2 참조), 유사치료지수도 약 1.4배 향상되어 나타났고, omiganan과 유사한 정도의 항생활성을 가지는 모델 4.1 펩타이드의 유사치료지수는 omiganan보다 약 3배 크게 나타났다(표 3).

따라서, 간단한 조성과 짧은 길이를 가지는 상기 두개의 펩타이드가, 더 길고 조성이 복잡한 omiganan 보다도 활성 및 안전성의 측면에서 더 개선된 성질을 가지므로, 새로운 항생제 개발 측면에서 더 좋은 후보군으로 제안될 수 있다.

모델 3.2의 경우, omiganan보다 낮은 항생활성을 가지지만, 유사치료지수에 근거하여 더욱 안전성이 크므로 투여 용량을 높을 수 있고, 따라서 omiganan보다 더 좋은 항생제 후보 물질로 거론될 수 있다. 또한, 모델 2.2 및 3.1도 omiganan과 유사한 유사치료지수를 나타내었으므로, 짧은 길이와 간단한 아미노산 조성의 측면에서 더 유리한 항생제 개발 후보 물질로 고려될 수 있다.

이 외에, 본 발명의 모델 3.3, 3.4, 4.3 및 4.4는 높은 농도에서 용혈활성이 크지만, 특정 박테리아 종에 대한 MIC가 매우 작기 때문에, 항생활성이 유효한 농도에서의 용혈 활성은 유의하지 않은 정도이다. 따라서, 이들의 MRSA에 대한 강력한 항생성을 고려하면, 모델 3.3, 3.4, 4.3 및 4.4는 아미노산 서열의 최적화 또는 유효용량과 독성량의 세밀한 조절을 통해 치료제로 개발할 수 있는 후보물질이 될 수 있다.

실시예 4: 구조-활성 관계(Structure-activity relationship) 분석

4-1: 원편광 이색성 분광 측정(Circular dichroism spectroscopy)

원편광 이색성(CD) 측정은 pH 6.7의 10 mM 인산나트륨(sodium phosphate) 완충액 및 15 mM SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 미셀에 녹아있는 50 μM 펩타이드에 대하여 20℃에서 Jasco J-720 분광편광계에서 수행하였고, 250~190 ㎚ 범위에서 스캔 속도 50 ㎚/분 및 0.2 ㎚ 단계 해상도로 스캔하였다. 3번의 스캔을 하고, 용매의 CD 신호를 빼어 평균 내었다. 최종적으로 상기 CD 강도는 평균 잔기의 몰 타원률(MRME, mean-residue molar ellipticity)로 변환하여(Won, H. S., et al., Eur. J. Biochem. 269:4367, 2002) 도 4에 도시하였다. 222 nm에서의 MRME 값으로부터 각 펩타이드의 나선구조 정도(helicity) %를 계산하여 도 5에 나타내었다. 계산은 다음의 식을 이용하였다(Zhu, W.L. et al., J. Biochem. Mol. Biol. 40:1090, 2007): %helicity = (MRME222 + 2,000)×100÷(-30,000).

4-2: 원편광 이색성 분석 결과

본 발명자들은 설계 및 합성된 펩타이드가 실제로 나선 구조로 접힐 수 있는지 확인하였다. 일반적으로, 양친매성 나선 AMP은 세포막과 상호작용을 통해 나선 구조를 형성하는 것이 알려져 있다(Oren, Z., et al ., Biopolymers 47:451, 1998; Shai, Y. Biochim . Biophys . Acta 1462:55, 1999; Zelezetsky, I., et al ., Biochim. Biophys. Acta 1758:1436, 2006). 따라서, Far-UV CD 분광기(JASCO-J720, JASCO, 일본)를 이용하여, 간단한 세포막 유사 환경으로 흔히 사용되는 SDS 미셀에서 및 완충 수용액에서 각각, 모델 펩타이드의 구조를 조사하였다(도 4 참조).

알려진 양친매성 나선 AMP들처럼, 본 발명의 펩타이드들 역시 일반 수용액 상태에서는 200 ㎚에서 강한 CD 음성 밴드를 보임으로써, 특정 2차구조를 가지지 않는 풀린 구조로 존재함을 나타내었다. 모델 1.1, 1.2, 2.1 및 3.1 펩타이드들은 SDS 미셀 환경에서도 유사한 CD 스펙트럼을 보여, 나선 구조를 취하지 못하는 것으로 파악되었다. 본 발명의 설계 단계에서 나선 구조는 활성을 유도하기 위한 중요한 조건 중 하나로 고려되었으므로, 나선성을 가지지 못하는 모델 1.1, 1.2, 2.1 및 3.1의 항생활성(표 2 참조)이 없거나 약한 이유는 나선 구조를 취하지 못하기 때문인 것으로 파악할 수 있다.

그러나, 유효한 항생 활성이 나타났던 다른 펩타이드들에서는 SDS 미셀 환경에서 나선구조 성질이 관찰되었다. 즉, 208 및 222 ㎚ 쪽으로 CD 신호가 이동하여 200 ㎚가 넘는 곳에서 넓은 범위의 음성 밴드 스펙트럼을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 CD 데이터는, 본 발명의 고안된 모델 펩타이드의 대부분이 나선구조 경향을 지니고 있어서, 도 2에 나타난 바와 같은 양친성 나선구조를 통해 항생활성을 나타낼 수 있음을 명확하게 뒷받침하였다.

4-3: 항생활성을 결정하는 구조인자 분석결과

상기 나선성의 정도는 생물학적 활성과 연관이 있어서, 더 안정화된 나선형 구조의 상기 펩타이드는 활성이 더 큰 경향을 보인다(표 2 및 도 5 참조). 그러나, 상기 나선성 정도는 항생활성에 선형적으로 비례하지는 않고, 다양한 균주에 대한 항생 활성의 상세한 변화는 나선성 정도만으로는 명확하게 설명되지 않았다.

이러한 관찰은 본 발명자들이 자연의 AMP 서열에서 트립토판을 치환한 선행 조사와 일치하며, 이는 많은 다른 물리-화학적 변수가 활성에 기여한다는 것을 나타낸다(Won, H. S., et al., J. Biol. Chem. 279:14784, 2004; Won, H. S., et al., Eur. J. Biochem. 269:4367, 2002; Won, H. S., et al., J. Med. Chem. 49:4886, 2006). 또한, 문헌에 알려진 바와 같이(Yeman, M.R. and Yount, N.Y., Pharmacol. Rev. 55:27, 2003; Chou, H.T. et al., Int. J. Antimicrob. Agents 32: 130, 2008) 다양한 구조 인자들, 즉, 도 1에 나타낸 평균잔기 소수성, 평균잔기 소수성 모멘트 및 극성 각도 등의 구조 인자들이 나선 구조 정도와 복합적으로 작용하여 항생 활성 정도를 결정한다는 사실을 뒷받침한다.

4-4: 용혈독성을 결정하는 구조인자 분석결과

상기 나선성의 정도는 용혈독성과도 관련되어 있어서, 상기 펩타이드 중 더 안정화된 나선형 구조의 펩타이드 군이 더 큰 용혈독성을 나타내는 경향을 보였다(도 3, 표 5 및 도 5 참조). 그러나, 용혈독성은 소수성 정도에 더욱 결정적인 영향을 받음을 파악할 수 있다. 예를 들어, 평균잔기 소수성(H)이 음의 값인 다른 펩타이드들과 달리, 양수의 H 값을 가지는 3.4와 4.4 펩타이드가 공통적으로 가장 두드러진 용혈독성을 나타내었다(도 1 및 도 3 참조). 또한, 모델 4.1과 3.3은 유사한 정도의 나선구조를 가지는데, 전체 모델들 중 가장 작은 소수성 값을 가지는 모델 4.1은 용혈활성이 거의 없는 반면, 소수성 값이 큰 모델 3.3은 용혈독성이 매우 크게 나타났다.

펩타이드와 생체막의 상호작용에 있어서, 일반적으로 세균의 세포막은 음전하가 많기 때문에, 세포막 표면에서의 정전기적 상호작용과 세포막 내부와의 소수성 상호작용이 모두 중요하게 관여하므로, 항생활성에는 다양한 구조 인자가 복합적으로 관여한다. 반면, 인체의 세포막은 음전하와 양전하가 유사한 수로 존재하여 전체적인 전하가 0에 가깝기 때문에, 세포막 내부와의 소수성 상호작용이 더욱 중요한 결정 인자로 작용하게 된다. 이러한 이유로, 본 발명의 상기 펩타이드에서 소수성이 큰 물질일수록 더 큰 용혈 독성을 나타내는 것으로 파악할 수 있다. 따라서, 구조적 성질을 유지하면서 소수성을 조절할 경우, 용혈독성이 컸던 모델 3.4 등의 펩타이드들도 더 우수한 약제로 개발될 수 있고, 이러한 개발을 위한 선도물질로서도 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 S. aureus 종의 3가지 항생제에 대한 MIC 값

Strain	Minimal Inhibitory Concentration(㎍/㎖)
Strain	Oxacillin	Kananycin	Vancomycin
ATCC 6538p	<1.3	1.3	<1.3
MRSA-TK784	>80	>80	2.5

단, 상기 표에서 ^a 아미노산 서열은 해당 모델 번호로 나타내었으며(도 1 참조), ^b시험한 4종의 그램 양성균에 대한, ^c시험한 5종의 그램 음성균에 대한, ^c시험한 모든 9종 균주에 대한 최소저해농도의 기하평균값이다.

단, 상기 표에서 ^a 시험한 4종의 그램 양성균에 대한, ^b시험한 5종의 그램 음성균에 대한, ^c시험한 모든 9종 균주에 대한 유사치료지수 평균값이며, ^d생리활성이 너무 낮아 측정되지 못한 값을 n.a.(not available)로 표시하였다.

실시예 5. 고찰

본 발명에서는 단순한 아미노산 조성을 가지고 길이가 짧은 항생 펩타이드를 개발하는 방법을 고안하였다. 즉, 본 발명에서 설계, 합성된 L_lK_mW₂ 모델 펩타이드 들은 3종의 아미노산만을 이용하여 설계, 합성되었고, 나선 휠 사영 상에서 친수성 말단부과 소수성 시작부 사이 임계 양친매성 경계면에 두개의 트립토판이 위치하였다. 이러한 Trp의 규칙에 따라 제조된, 7~11 잔기의 짧은 펩타이드들이 강하고 넓은 범위의 항생성을 보였고, CD 분석을 통해 생체막 유사 환경에서 나선형 성질을 가짐을 규명하였다.

본 발명에서 대조군으로 사용된 펩타이드인 omiganan(MBI-226)은 항생 펩타이드 최초로 새로운 항생제 의약품으로 개발 완료 시점에 근접한 물질로서, 현재 임상 3상 시험이 진행 중이다(Gordon J, et al., Curr. Eye Res. 30:505-515, 2005). 본 발명의 LKW 모델 펩타이드들은 상용 발전 중인 omiganan 보다 짧으며, 더 단순한 아미노산 조성을 지닌다. 따라서, 강력한 항생성, 특히 MRSA에 대해 항생성이 있는 이들 중 몇은, omiganan 보다 더 훌륭한 치료 및 상용 발전용 후보물질이 될 수 있다. 이들 중, L₄K₅W₂(모델 4.2) 펩타이드는 omiganan 보다 항생 활성이 강력하고, 반면 용혈 독성이 작으므로, 가장 좋은 신약 후보물질로 사용될 수 있다. 또한, MRSA 에는 비활성을 나타내지만, omiganan 보다 용혈 작용이 적게 일어나고, 항생성은 필적할 만한 L₃K₆W₂(모델 4.1)도 후보물질로 사용할 수 있다.

또한, 모델 2.2, 3.1, 3.2의 경우, omiganan보다 낮은 항생활성을 가지지만, 용혈독성이 적어, omiganan과 비슷하거나 더 큰 유사치료지수를 가지는 안전성을 나타내므로, 짧은 길이와 간단한 아미노산 조성의 측면에서 더 유리한 항생제 개발 후보 물질로 고려될 수 있다.

이 외에, 다소 용혈독성이 있지만 MRSA에 대해서도 항생활성이 강력한 L₅K₄W₂(모델 4.3), L₆K₃W₂(모델 4.4), L₄K₃W₂(모델 3.3), 및 L₅K₂W₂(모델 3.4) 펩타이드들은 세밀한 용량조절을 통해 특정 박테리아 감염의 치료 용도로 사용하거나 또는, 항생성은 유지하면서 독성을 줄일 수 있는 아미노산 서열의 최적화를 통해 주요한 후보물질로 개발할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> ANTIMICROBIAL PEPTIDE <130> P11-E010 <150> KR10-2010-0003291 <151> 2010-01-14 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 1.1) <400> 1 Trp Leu Lys Lys Trp 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 1.2) <400> 2 Trp Leu Leu Lys Trp 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 2.1) <400> 3 Lys Trp Leu Lys Lys Trp Leu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 2.2) <400> 4 Lys Trp Leu Leu Lys Trp Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 3.1) <400> 5 Lys Lys Trp Leu Lys Lys Trp Leu Lys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 3.2) <400> 6 Leu Lys Trp Leu Lys Lys Trp Leu Lys 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 3.3) <400> 7 Leu Lys Trp Leu Leu Lys Trp Leu Lys 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 3.4) <400> 8 Leu Lys Trp Leu Leu Lys Trp Leu Leu 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 4.1) <400> 9 Leu Lys Lys Trp Leu Lys Lys Trp Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 4.2) <400> 10 Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Trp Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 4.3) <400> 11 Leu Leu Lys Trp Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antimicrobial peptide(No: 4.4) <400> 12 Leu Leu Lys Trp Leu Leu Lys Trp Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> omiganan(MBI-226) <400> 13 Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys 1 5 10

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 12로 구성된 군으로부터 선택되고, 항생 활성이 있는 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미생물에 대한 항균용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 펩타이드는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10인 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균용 조성물.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물은 그램 양성균 또는 그램 음성균인 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 그램 양성균은 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Micrococcus luteus, 및 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 종은 베타 락탐 항생제 및 카나마이신을 포함한 다수의 항생제에 대한 다제내성균 MRSA-TK784인 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 그램 음성균은 Escherichia coli, Shigella dysentariae, Salmonella typhomurium, Klebsiella pneumoniae 및 Pseudomonas aeruginosa 으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미생물에 대한 항균용 조성물.