KR20110063454A

KR20110063454A - 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성의 평가방법

Info

Publication number: KR20110063454A
Application number: KR1020117005865A
Authority: KR
Inventors: 치에 야스다; 고우스케 하야미즈
Original assignee: 가부시키가이샤환케루
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2011-06-10
Also published as: KR101045162B1; WO2010073986A1; JP4446010B1; CN102203620A; JP2010151482A

Abstract

본 발명은 비침습적 수단을 사용하여 채취한 피부 각질층 중의 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, 아르기나아제-1, SCCA2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질의 발현량을 지표로 하는 자외선에 의한 피부 선번(sunburn)에 대한 저항성의 평가방법에 관한 것이다.

Description

자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성의 평가방법{Method for evaluating resistance to skin sunburn by ultraviolet light}

본 발명은 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성의 평가방법에 관한 것이다.

햇볕에 그을림은 조사된 자외선이 멜라닌의 보호능력을 초과할 때에 일어난다. 햇볕에 그을림현상에는 2종류가 있어, 자외선을 쬔 직후에는 발증하지 않고, 2~6시간 후 피부가 빨갛게 되며, 통증은 6~48시간 후에 가장 심해지는 선번(홍반: sunburn)과, 24~72시간 사이에, 색소 침착이 진행되는 선탠(suntan)이 있다. 선번은 UVB가 표피를 투과하여, 진피 유두체(乳頭體)까지 도달한 결과, 유두체 내의 모세혈관이 염증반응으로서 충혈을 일으켜, 피부의 색이 빨갛게 된 상태(홍반)를 가리킨다. 자외선량이 멜라닌 색소의 방어반응을 초과하면, 세포조직이 손상을 받아, 발열과 수포, 통증이 발생한다. 이것을 일광 피부염이라고 한다. 또한, 선탠은 UVA가 멜라노사이트에 작용하여, 멜라닌 색소의 생성을 촉진한다. UVA는 발적과 염증을 수반하지는 않으나, 피부의 신진대사를 늦추기 때문에 기미를 발생시킨다.

이들 햇볕에 그을림의 원인이 되고 있는 자외선에는 피부에 대한 발암작용, 백내장 등의 안질환으로의 영향, 면역기능으로의 영향 등 많은 건강으로의 영향이 우려되고 있다. 피부에 있어서도 자외선에 노출되면, 다양한 자외선 장애를 일으킨다. 자외선은 피부에 염증을 일으키거나, 피부의 불포화지질을 산화하여 지질 라디칼을 발생시켜, 과산화지질을 생성한다. 이와 같은 자외선에 의한 염증과 산화는 조직, 세포, DNA의 장애를 일으킨다. 피부의 자외선 폭로에 의한 현상으로서는 일반적으로, 주름, 기미, 피부암 등을 들 수 있다.

최근 들어, 역학적인 데이터로서 자외선에 대한 감수성의 차이(피부 색, 피부타입 등)에 따라 피부암의 리스크가 높아진다는 보고도 있다(비특허문헌 1, 2, 3). 또한 피부암의 일종인 악성 흑색종(멜라노머)의 위험 리스크도는 melanocortin1 receptor의 1염기 치환의 유전자 변이에 의해 리스크가 수배 높아지는 것도 명확해져 있다(비특허문헌 4, 5). 자외선에 대한 감수성은 피부타입(그을렸을 때의 선번, 선탠의 상태의 차이에 따라 분류)에 따라 크게 상이하여, 6단계로 분류하는 타입별로 나누거나, 불그스름함(홍반)을 발생시키는 최소 자외선 에너지(최소 홍반량: MED)를 기준으로 행해지나, 전자는 주관적 관측, 또한 후자는 자외선을 쬐지 않고는 측정할 수 없다는 리스크가 수반된다. 오존층 파괴 등에 의해 이전에 비해 더욱 자외선 증가가 문제가 되고 있어, 개인에 대한 자외선으로의 감수성 리스크 평가도 적절히 행해질 필요가 있다.

한편, 일반적으로 기미로 불리고 있는 색소 침착이 생기는 초기단계에 있어서는 피부 표면에 현재화(顯在化)되기 전에 다양한 자극에 의해 표피 각화세포가 α-MSH, bFGF, CGRP, 엔도텔린(endothelin) 등의 정보전달물질을 생성하여, 멜라노사이트에 전달한다. 멜라노사이트에 전달된 후, 세포 내에 있어서 멜라닌 색소가 대량으로 만들어진다. 또한 자외선에 의해 턴오버가 이상해져 대량으로 만들어진 멜라닌 색소를 배출할 수 없기 때문에 색소성 병변으로도 변화한다. 인 비트로(in vitro)계를 사용한 실험에 있어서도 멜라노사이트에 UV를 조사한 경우, 세포의 증식인자 마커인, p73, Nup88, p27, Id1, PCNA가, 또한 아포토시스 관련 단백질인 bcl-2의 발현이 증감한다는 보고가 있다(비특허문헌 5).

지금까지, 생검(biopsy)에 의한 피부조직을 사용하여 침습적으로 기미부와 정상부를 비교하여, 기미부에 있어서 NT-3, ADAM9, HB-EGF 등의 단백질의 발현이 현저히 증가하고 있다는 보고가 있다(특허문헌 1). 또한, 피부의 기미 형성을 예지하는 검사방법으로서 생검에 의해 MLSTD1, MOGAT1, Mcp9, Krt2-6b 등의 mRNA량을 측정하여, 기미 형성의 리스크를 판단한다는 보고가 있다(특허문헌 2, 3, 4).

또한, 비침습적 방법으로서 테이프 스트리핑 또는 찰과를 매개로 채취한 피부에 유래하는 각질층을 시료로 하여, 인터류킨 1(IL-1)과 인터류킨 1 리셉터 안타고니스트(IL-1ra)의 존재량을 분석해, 피질을 평가하는 방법이 특허문헌 5에 개시되어 있다.

특허문헌 1: 일본국 특허공개 제2004-205246호 공보

특허문헌 2: 일본국 특허공개 제2005-106745호 공보

특허문헌 3: 일본국 특허공개 제2005-110505호 공보

특허문헌 4: 일본국 특허공개 제2007-289063호 공보

특허문헌 5: 일본국 특허 제3590708호 공보

비특허문헌 1: Arch Dermatol.2004;140:819-824

비특허문헌 2: Cancer Causes Control. 1997;8(2):246-252

비특허문헌 3: Ann Epidemiol.2008;18(8):614-627

비특허문헌 4: Invest Dermatol.117:294-300,2001

비특허문헌 5: Am.J.Hum.Genet.66:176-186,2000

비특허문헌 6: Carcinogenesis 24(12):1929-1934,2003

본 발명은 비침습적 수단을 사용하여 채취한 피부 각질층을 사용해서, 피부 선번에 대한 저항성의 지표를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명에서 말하는 피부 선번에 대한 저항성이란, 자외선 폭로에 의한 조사 후 24시간 이내에 발생하는 염증이 조기에 회복되어, 발적의 정도가 감소되는 것이다.

(1) 피부 각질층 중의 블레오마이신 히드롤라아제(bleomycin hydrolase), 카텝신 D(cathepsin D), 아르기나아제-1(arginase-1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질의 발현량을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 선번(sunburn)에 대한 저항성의 평가방법.

(2) (1)의 평가방법을 토대로 피부 선번 방지 화장료를 선택하는 방법.

본원 발명은 비침습적 수법을 사용하여 얻어진 피부 각질층에 있어서, 아넥신 II(annexin II), 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, 아르기나아제-1, 편평상피암 관련 항원 squamous cell carcinoma-related antigen2(SCCA2)의 존재량이 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성의 지표가 되는 것을 명확하게 하였다.

본 발명에 의해, 자외선을 실제로 조사하지 않고, 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성을 평가할 수 있다.

본 발명은 비침습적 테이프 스트리핑수단을 사용하여 채취한 피부 각질층을 사용해서 평가할 수 있기 때문에, 안전하고 또한 간편하다.

또한, 본 발명의 평가방법을 이용하여, 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항을 높이는 것에 유용한 성분을 스크리닝할 수 있다.

본 발명에 의해, 자외선에 의한 염증(홍반)의 회복력을 평가하는 것이 가능하다. 자외선에 의한 염증의 회복력이 낮으면, 자외선 폭로에 의한 피부 노화, 주름, 기미, 더 나아가서는 피부암의 리스크가 높다고 추측되기 때문에, 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성이 약한 사람에게는, 사전에 강력한 선스크린제의 사용을 추천하는 등의 미용 카운셀링을 적확하게 행할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세히 설명한다.

본원 발명은, 비침습적 수법에 의해 채취한 피부 각질층 중에 존재하는 5종류의 단백질을 계측한 존재량을 토대로, 당해 피험자의 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성을 알 수 있는 것이다. 자외선에 폭로한 후의 회복 정도와 그 5종류의 단백질의 존재량이 상관하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다. 이 5종류의 단백질은, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, 아르기나아제-1, SCCA2이다. 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D는, 단백질의 발현량이 적은 사람은, 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성이 강한 경향이 있다. 아르기나아제-1, SCCA2는, 단백질의 발현량이 많은 사람은, 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성이 강한 경향이 있다.

따라서, 이들 5종류에 대해, 사전에 발현량을 몇 개의 단계로 설정하여, 자외선에 의한 피부 선번 저항 정도를 지표화할 수 있다. 피험자로부터 채취한 피부 각질층의 발현량을 측정하여, 이들 지표와 비교함으로써, 당해 피험자의 피부 선번 저항성을 용이하게 알 수 있다.

이 결과를 토대로, 햇볕에 그을림에 주의가 필요한 사람에게 옥외활동을 주의하도록 지도할 수 있다. 또는, 자외선에 약한 것이 판명된 경우에는, 자외선 차폐효과가 강한 화장료를 선택하는 것 등의 대처를 각자가 취할 수 있다. 또는, 화장료 선택의 카운셀링을 과학적인 근거를 가지고 행할 수 있다.

또한, 자외선에 의한 선번이 발생하기 쉬운 배양 피부 모델을 이용하여, 이 5종류의 단백질의 발현량에 영향을 미치는 피검사물질을 탐색함으로써, 자외선에 의한 선번 저항성을 개선할 수 있는 약제를 스크리닝하는 것이 가능해진다.

본원 발명은, 테이프 스트리핑 등의 비침습적 방법에 의해 안전하고 용이하게 피부 각질층을 채취하여, 그 피부 각질층을 사용해서 단시간에 주목하는 단백질의 발현량을 특정할 수 있다. 이 때문에, 화장품 매장 등에서 간단하게 측정하여, 그 자리에서 화장료 선택의 정보로서 활용할 수 있다. 이 단백질의 발현량을 측정하는 기기는 검출한 결과와 상기 단계화한 지표와 비교하여 제시할 수 있다. 또한, 이 결과를 토대로, 적합한 화장료를 표시하는 것도 가능하다.

또한 본 발명은, 의료목적 이외의 목적으로, 피부 노화 등의 노화 리스크를 평가할 수 있어, 그것을 토대로 하여 의료 이외의 목적으로 대처조치를 실시할 수 있는 것이다.

아르기나아제-1은 분자질량 34,735 Da의 세포 내 단백질로, 아르기닌을 오르니틴과 요소로 변환하는 효소. 포유류 《아르기나아제》의 2개 이상의 《아이소폼(isoform)》(I형과 II형)이 존재하고, 그들은 조직 분포, 세포 내 국재성, 면역학적 교차반응성, 생리학적 기능에 있어서 상이하다. 이 유전자가 지령하는 아이소폼 I형은 사이토졸(cytosol) 효소로, 요소 순환의 구성인자로서 간장에서 우선적으로 발현된다. 이 효소의 유전적 《결손》은, 《고암모니아혈증》을 특징으로 하는 《상염색체 열성 유전질환》인 《아르기닌 혈증》을 초래한다. 유전자 염기서열정보(ARG1, Nucleic Acids Res.:16:8789-8802(1988), X12662). 아미노산 서열정보(Arginase-1, Cell Death Differ. 2000 Feb;7(2):137-44, P05089).

아넥신 II는, 분자질량 38,473 Da의 세포 내 단백질로, 칼슘으로 제어되는 막 결합 단백질이며, 이 단백질에 2개의 칼슘 이온이 결합한다. 2조(組) 있는 아넥신 리피트 중, 하나는 칼슘이 결합하고, 하나는 인지질이 결합한다. 이 단백질은 세포막에 있는 인지질에 결합하고 있는 액틴이나 세포 골격계의 단백질과 가교하거나, t-PA(tissue plasminogen activator)를 매개로 플라스미노겐을 활성화한다. 유전자 염기서열정보(Annexin A2, Gene 95:243-251(1990), BC015834). 아미노산 서열정보(Annexin A2, J.Biol. Chem. 266:5169-5176(1991), P07355).

블레오마이신 히드롤라아제는 분자질량 52,562 Da의 세포 내 단백질로, 파파인 패밀리의 중성 시스테인 프로테아제의 하나. 유일하게 알려져 있는 활성은 당펩티드 블레오마이신(BLM)(암의 복합화학요법의 중요 요소)의 대사 불활성화이다. 유전자 염기서열정보(BLMH, 1230091253543_0, X92106). 아미노산 서열정보(bleomycin hydrolase, Biochemistry 35:6706-6714(1996), Q13867).

카텝신 D는 분자질량 44,542 Da의 리소좀성 아스파라긴산 프로테아제로, 세포 내 단백질의 분해를 촉진한다. 염증, 아테롬성 동맥경화증, 혈전증, 알츠하이머병 등의 발증에 관여하고 있고, 아포토시스나, 유방암 등의 종양세포의 증식에도 관여하는 것이 시사되어 있다. 유전자 염기서열정보(CTSD, 1230091253543_1, M63138). 아미노산 서열정보(Cathepsin D, Nat. Biotechnol. 21:660-666(2003), P07339).

편평상피암 관련 항원 squamous cell carcinoma-related antigen2(SCCA2)는 분자질량 44,854 Da의 세포 내 단백질로, 카르복실 말단측에 세르핀구조를 갖는 세린 프로테아제 저해제. 정상 편평상피에서는 발현이 근소하나, 편평상피암에서는 고발현이 보인다. 또한, 카텝신 G, 키마아제(chymase)의 세린 프로테아제를 강하게 저해하는 것 외에 시스테인 프로테아제, 파파인, 카텝신 L을 억제한다. 유전자 염기서열정보(SERPINB4, 1230091253543_2, X89015). 아미노산 서열정보(Serpin B4, Int. J. Cancer 89:368-377(2000), P07355).

상기의 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2는, 전구체 단백질이어도, 성숙 단백질이어도 되고, 또한, 절단형이어도, 비절단형이어도 된다. 전구체 단백질로서는, 프로단백질, 프레프로단백질 등을 들 수 있다. 프로단백질, 프레프로단백질 등에는, 시그널 펩티드를 갖는 것도 있다.

피부 각질층으로부터 각질층 단백질을 채취하는 방법

(1) 테이프 스트리핑법에 의한 각질층의 채취

테이프 스트리핑법이란 피부에 점착 테이프를 첩부(貼付)하고, 점착 테이프를 떼어냄으로써, 점착면에 점착된 각질층을 채취하는 방법이다.

시판의 점착 테이프를 사용하여, 예를 들면 사람 협부(頰部)에 점착 테이프를 눌러붙임으로써, 각질층을 점착 테이프에 점착시켜서 채취할 수 있다. 시판의 점착 테이프로서는 아사히 바이오메드사제 각질 체커, 모리텍스사제 각질층 실, PROMOTOOL사제 각질 체커(디스크타입 W, 디스크타입 G, PRO타입), Integral사제 Corneofix, 3M사제 투명 테이프, 3M사제 투명 양면 테이프 등을 들 수 있다.

(2) 추출 버퍼

점착 테이프에 점착된 각질층으로부터 각질층 단백질을 추출하기 위해 추출 버퍼를 사용한다. 추출 버퍼로서 예를 들면 이하의 조성을 들 수 있다. 조성: PBS(-), 0.1% SDS.

점착 테이프로 채취되어 오는 피부의 각질층은 각화세포가 분화된 것으로, 세포골격계의 단백질을 다수 포함한다. 그 때문에 각질층 단백질의 추출 효율을 높이기 위해서는, 이 추출 버퍼에 적당한 계면활성제를 함유시키는 것이 바람직하다. 계면활성제로서는 SDS(라우릴황산나트륨, CH₃(CH₂)₁₁OSO₃Na)를 사용하는 것이 바람직하다.

(3) 각질층 단백질의 추출

각질층을 채취한 점착 테이프를 원통 용기에 넣고, 고속회전하는 호모지나이제이션용 페슬(pestle)(이하, 「페슬」이라 부른다)을 사용해서 점착면을 문지름으로써 신속하게 각질층 단백질의 추출이 가능하다. 점착 테이프는 점착면을 원통 용기 내측으로 향하게 하고, 점착면의 반대면을 원통 용기의 내측을 따르듯이 하여, 원통 용기에 넣는다. 점착 테이프를 점착면의 반대면을 원통 용기의 내측을 따르게 하여 넣음으로써, 페슬에 의해 용이하게 점착면을 문지를 수 있다. 그 외의 방법으로서, 각질층을 채취한 점착 테이프를 추출 버퍼에 담그고 스크레이퍼(scraper)로 문질러 각질층 단백질을 추출해도 되고, 진탕법이나 초음파 조사법을 사용해도 된다.

(4) 각질층 단백질 추출액의 회수

각질층 단백질 추출액을 약 1분간 정치(靜置)하여, 거품을 침정화(沈靜化)하고, 그 후, 원통 용기로부터 각질층 단백질 추출액을 흡인하여 회수하는 것이 바람직하다.

(5) 각질층 단백질 중의 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2의 존재량의 분석

얻어진 각질층 단백질 추출액 중의 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2의 존재량은, 면역 블로팅법, ELISA법, 항체칩법, FRET법에 의해 정량 분석할 수 있다.

자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성의 평가

1 MED의 자외선 조사 1주 후에 피부 홍반이 소실되는 군의 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D의 존재량은, 피부 선번이 소실되지 않는 군과 비교하여 적은 것이 명확해졌다.

또한, 1 MED의 자외선 조사 1주 후에 피부 선번이 소실되는 군의 아르기나아제-1, SCCA2의 존재량은, 피부 선번이 소실되지 않는 군과 비교하여 많은 것이 명확해졌다.

따라서, 피부 각질층 중의 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D의 존재량이 평균값보다도 적은 경우, 또는, 아르기나아제-1, SCCA2의 존재량이 평균값보다도 많은 경우에는, 자외선에 의한 피부 선번에 대한 저항성이 강하다고 평가할 수 있다.

반대로, 피부 각질층 중의 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D의 존재량이 평균값보다도 많은 사람, 또는, 아르기나아제-1, SCCA2의 존재량이 평균값보다도 적은 사람은, 자외선 피폭에 의해 피부 노화, 기미, 주름이 항진되기 쉬워, 기미 등의 자외선 장애가 발생하기 쉽다고 평가할 수 있다.

자외선에 의한 피부 선번의 소실 촉진제의 스크리닝

마우스 등의 피부 각질층 중의 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D의 존재량을 감소시키거나, 또는, 아르기나아제-1, SCCA2의 존재량을 증대시키는 성분을 탐색함으로써, 자외선에 의한 피부 선번의 소실 촉진제를 스크리닝할 수 있다.

실시예

1. 피험자

20대와 30대의 남성 10명을 피험자로 하였다. 각 피험자의 연령, 피부타입, 최소 홍반량, 자외선 조사 전의 a＊값을 표 1에 나타낸다. 또한, 피부타입의 II는 「간단히 선번을 일으키고, 약간 선탠을 일으키는」 타입, 피부타입의 III는 「보통으로 선번을 일으키고, 보통으로 선탠을 일으키는(담갈색의 햇볕에 그을림)」 타입, 피부타입의 IV는 「약간 선번을 일으키고, 항상 선탠을 일으키는(갈색의 햇볕에 그을림)」 타입이다. 표 1에 나타낸 피부타입은 피험자의 자기 신고이다. 따라서, 이번 객관적으로 측정한 최소 홍반량과 피부타입은 반드시 대응하지는 않는다.

또한, a＊값은 자외선에 의한 염증에 수반하여 발생하는 발적 레벨의 지표로서 측정하였다.

2. 피부 각질층 중의 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2의 존재량의 측정

2.1 테이프 스트리핑에 의한 각질층의 채취

점착 테이프로서 아사히 바이오메드사제 각질 체커(2.5 ㎝×2.5 ㎝)를 사용하였다. 피험자의 배부(背部)에 각질 체커를 붙이고, 손가락 끝으로 가볍게 문질러 붙여서 피부 각질층을 각질 체커의 점착면에 점착시켜, 합계 5장의 테이프 스트리핑을 배부로부터 채취하였다. 또한, 테이프 스트리핑에 의한 채취 개소는 자외선 비조사부위로부터 채취하였다.

2.2 피부 각질층 단백질의 추출

추출 버퍼: PBS(-), 0.1%(w/v) SDS.

추출 버퍼량: 200 μL.

추출용기: 직경 11 ㎜의 원통 용기.

원통 용기에 점착 테이프를 점착면의 반대면이 용기의 내벽을 따르듯이 하여 넣고, 추출 버퍼를 넣어, 미니·코드리스 그라인더(후나코시사 code13753E)에 페슬로서 Handy pestle(TOYOBO사, code HMX-301)을 접속하고, 페슬을 9000 rpm으로 회전시켜서, 원통 용기 내벽을 따르게 한 점착 테이프의 점착면을 문질렀다. 교반시간은 90초로 하였다.

피부 각질층 단백질 추출액을 약 1분간 정치하여, 거품을 침정화하고, 그 후, 원통 용기로부터 피부 각질층 단백질 추출액을 흡인하여 회수하였다.

3. 피부 각질층 단백질량의 측정

피부 각질층 단백질 추출액에 포함되는 전체 단백질량을 DC protein Assay Kit(BIO-RAD사)를 사용해서 측정하였다.

4. 피부 각질층 단백질 중의 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2의 존재량의 측정

피부 각질층 단백질량 1 ㎍ 분량을 사용하여 면역 블로팅에 의한 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2의 발현량을 측정하였다. 각 피험자의 피부 각질층 단백질 1 ㎍ 분량을 사용하여 5-15% 그래디언트 겔을 사용해서 SDS-PAGE에 의해 분리 후, 단백질을 PVDF막으로 전사하여, 5% 탈지유로 블로킹을 행하였다. 1차항체(아르기나아제-1 단일클론항체: Santa Cruz Biotechnology, 아넥신 II 다중클론항체: Santa Cruz Biotechnology, 블레오마이신 히드롤라아제 다중클론항체: Abnova, 카텝신 D 단일클론항체: R&D Systems, SCCA2 단일클론항체: Santa Cruz Biotechnology)를 1000배 희석, 2차항체(HRP-마우스 anti-Goat IgG: ZYMED Laboratories, HRP-토끼 anti-Goat IgG: ZYMED Laboratories)를 10000배 희석으로 반응시킨 후, ECLplus(BD Bioscience)로 검출을 행하였다. 얻어진 밴드의 강도는 NIH-Image로 수치화를 행하였다. 이 수치를 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2의 존재량으로 하였다.

5. 자외선 조사

피험자의 배부에 직경 약 8 ㎜의 원 내에 1 MED의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사장치는 solar light company제 Multiple Solar Ultraviolet Simulator Model 601을 사용하였다. 자외선 강도는 solar light company제 Erythema UV & UVA Intensity Meter Model 3D-600 v2.0을 사용해서 설정하였다.

6. 피부 a＊값의 측정

피부 선번의 홍반의 정도를 평가하기 위해, 분광측색계(CM-500, 코니카미놀타사제)를 사용하여 자외선 조사부위 및 비조사부위의 a＊값을 측정하였다. 자외선 조사 전, 조사 후 2, 4, 7, 10, 14일째의 자외선 조사부위 및 비조사부위의 a＊값을 측정하여, 같은 날 내에서 조사부위와 비조사부위의 a＊의 차를 측정일의 a＊ 변화량(△a＊)으로서 해석에 사용하였다.

7. 피부 a＊값의 측정결과

자외선 조사 후의 a＊값의 변화량(△a＊)을 도 1에, 7일째의 △a＊값을 표 2에 나타낸다.

△a＊를 지표로 하는 피부 홍반은 조사 후 24시간에서 최대에 도달하고, 이것이, 그 후 경시적으로 감소해 간다. 그리고 7일째에는 최대값의 약 1/4에 도달한다.

피험자 1~5는 자외선 조사 7일째에 홍반이 거의 소실되었으나(△a＊＜1), 피험자 6~10은 자외선 조사 7일째에서도 홍반이 소실되지 않았다(△a＊＞1). △a＊＞1이면, 육안평가에 의해 홍반의 확인이 가능하여, 피험자 6~10은 모두, 육안평가에 의해 홍반이 확인되었다. 한편, 육안평가에 의해 피험자 1~5의 홍반은 확인되지 않았다.

따라서, 피험자 1~5는 피험자 6~10과 비교하여 발적의 회복이 빨라, 피부 선번에 대한 저항성이 높다고 평가할 수 있다.

본 발명의 피부 선번에 대한 저항성이란, 피부 선번의 정도를 최소 홍반으로 통일했을 때, 최소 홍반이 소실되고, 염증이 회복되는 기능의 우열을 나타내는 것이다. 따라서, 자외선의 최소 홍반량과, 피부 선번에 대한 저항성은 반드시 상관하지는 않는다.

표 2에 나타낸 피부타입은 어디까지나 피험자 본인의 햇볕에 그을림에 대한 감수성을 앙케이트 조사에 의해 분류한 것으로, 표 2의 최소 홍반량과 정합되지 않는 부분이 있으나, 이것은, 일반적으로 자기 자신이 분류하고 있는 피부타입은 애매한 점이 많은 것을 나타내고, 최소 홍반량이나 이번 측정한 단백 발현량은 보다 객관적인 지표를 나타낼 수 있는 것을 나타내고 있다.

8. 자외선에 의한 피부 선번 소실군과 피부 선번 비소실군의 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2의 존재량에 대해

상기 7.을 표 2에 나타낸 자외선 조사 7일 후에 피부 선번이 소실된 군(피험자 1~5)과 피부 선번이 소실되지 않은 군(피험자 6~10)의 2군으로 나누어, 각각의 군의 피험자의 피부 각질층 중의 아르기나아제-1, 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, SCCA2의 존재량의 평균값을 비교하였다. 결과를 도 2~6에 나타낸다.

도 2, 도 6에 나타낸 바와 같이, 홍반 비소실군의 아르기나아제-1 존재량 평균값이 2.166인데 대해, 홍반 소실군의 아르기나아제-1 존재량 평균값은 8.081로, 3.73배이다. 아르기나아제-1 존재량 평균값은 홍반 비소실군, 홍반 소실군에서 유의한 차가 있었다(p=0.038). 또한, 홍반 비소실군의 SCCA2 존재량 평균값이 4.220인데 대해, 홍반 소실군의 SCCA2 존재량 평균값은 12.377로, 2.93배의 차가 확인되었다.

피부 각질층 중의 아르기나아제-1, SCCA2의 존재량이 많은 사람은 피부 선번에 대한 저항성이 높다고 평가하였다.

도 3~5에 나타낸 바와 같이, 홍반 비소실군의 아넥신 II 존재량 평균값이 2.598인데 대해, 홍반 소실군의 아넥신 II 존재량 평균값은 1.286으로, 0.49배이다. 아넥신 II 존재량 평균값은 홍반 비소실군, 홍반 소실군에서 유의한 차가 있었다(p=0.011). 또한, 홍반 비소실군의 블레오마이신 히드롤라아제 존재량 평균값이 13.756인데 대해, 홍반 소실군의 블레오마이신 히드롤라아제 존재량 평균값은 4.961로, 0.36배의 차가 확인되었다. 홍반 비소실군의 카텝신 D 존재량 평균값은 27.757인데 대해, 홍반 소실군의 카텝신 D 존재량 평균값은 8.705로, 0.31배의 차가 확인되었다.

피부 각질층 중의 아넥신 II, 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D의 존재량이 많은 사람은 피부 선번에 대한 저항성이 낮다고 평가하였다.

도면의 간단한 설명

도 1은 자외선 조사 후의 a＊값의 변화량을 나타내는 도면이다.

도 2는 피험자의 피부 각질층 중의 아르기나아제-1의 존재량의 평균값을 비교한 그래프이다.

도 3은 피험자의 피부 각질층 중의 아넥신 II의 존재량의 평균값을 비교한 그래프이다.

도 4는 피험자의 피부 각질층 중의 블레오마이신 히드롤라아제의 존재량의 평균값을 비교한 그래프이다.

도 5는 피험자의 피부 각질층 중의 카텝신 D의 존재량의 평균값을 비교한 그래프이다.

도 6은 피험자의 피부 각질층 중의 SCCA2의 존재량의 평균값을 비교한 그래프이다.

Claims

피부 각질층 중의 블레오마이신 히드롤라아제, 카텝신 D, 아르기나아제-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질의 발현량을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 선번(sunburn)에 대한 저항성의 평가방법.
제1항의 평가방법을 토대로 피부 선번 방지 화장료를 선택하는 방법.