KR20110051508A - 단백질 상호작용 억제제 선별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 상호작용 억제제 선별방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 소량의 단백질만으로도 단백질간의 상호작용에 영향을 미치는 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있어 비용 및 시간을 현저하게 절감할 수 있다. 또한, 통상의 2D NMR이 아닌 FLOW NMR을 사용하는 경우 별도의 NMR 튜브에서 컬럼을 꺼내는 과정 없이도 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있어 더욱 효과적이다.

Description

단백질 상호작용 억제제 선별방법{Screening method of protein-protein interaction inhibitor}

본 발명은 단백질 상호작용 억제제 선별방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 소량의 단백질만으로도 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있는 단백질 상호작용 억제제 선별방법에 관한 것이다.

세포는 다양하고 복잡한 단백질-단백질 상호작용을 통하여 유전자 표현, 세포성장, 세포 주기, 대사, 신호전달 등의 여러 생물학적 기능을 수행함으로써 생명현상을 유지하고 있다. 따라서 세포내에서의 단백질-단백질 상호작용 및 상호작용의 기능을 이해하는 것은 생명현상들을 이해하는 초석이 되며 신약개발 및 질병 치료의 중요한 기반이 된다. 시험관내 또는 생체 내에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법으로는 친화성 크로마토그래피(affinity chromoatography), 공동면역침전(coimmunoprecipitation), 파아지 디스플레이(phage display), 투-하이브리드 어세이(two-hybrid assays), GST-융합 단백질 풀-다운(GST-fusion protein pulldown), 면역조직화학(immunohistochemistry)와 같은 기존의 방법들이 존재하지만, 이들 방법들은 여러 장점들도 있으나 빠르게 세포내 단백질-단백질 상호작용을 규명에 여러 단점들을 가지고 있다.

구체적으로, 단백질 친화성 크로마토그래피(Protein affinity chromatography)의 경우, 정제된 단백질이 준비되어야하는 어려움이 있다. 또한 단백질 간 상호작용 확인이 시험관 내에서 일어나므로, 세포내에서는 상호작용하지 않는 단백질들이 컬럼을 통과하는 동안 정전기적 상호작용에 의하여 상호작용하는 것처럼 보일 수 있는 false-positive 결과가 도출될 우려가 있다. 공동면역침전의 경우 정제된 민감성이 높은 항체가 필요하며 이 항체는 세포내에서 존재하는 단백질의 형태를 인식할 수 있는 것이어야 한다. 따라서 항체의 민감성과 특이성이 낮은 경우 단백질들 간 상호작용을 증명하기 힘들다. 파아지 디스플레이의 경우 단백질이 파아지의 캡시드나 외막 단백질과 융합된 형태로 발현되므로 발현할 수 있는 단백질의 크기가 제한되어있다. 포유류 세포의 많은 단백질들이 번역 과정 이후 여러 변형(modification)들을 거치게 되나 파아지에서는 진핵세포에서 만들어지는 단백질과 동일한 폴딩 및 번역 후 변형을 거치지 못하므로 단백질의 변형을 연구하기 어렵다. 한가지의 단백질도 여러 변형을 거침으로써 다양한 단백질들과 상호작용하여 세포 내 기능을 수행하기 때문에 어떠한 변형을 거치느냐 및 다양한 변형 이후

상호작용하는 짝들을 연구하는 것은 복잡한 세포의 기능조절을 이해하는 초석이 된다. 하지만 파아지 디스플레이를 이용하여 상호작용을 연구하는 경우 포유류 세포에서 일어나는 다양한 변형이 일어나지 못하므로 여러 변형을 거친 후 상호작용 하게 되는 단백질 간 상호작용 연구에 어려움이 있다.

투-하이브리드 스템은 주로 효모와 포유류 세포에서 많이 사용되는데 효모의 경우 목적 단백질들이 진핵세포에서와 동일하게 만들어지고 폴딩(folding) 및 변형이 일어나야 한다. 포유류 세포를 이용한 투-하이브리드 시스템의 경우 단백질의 합성 후 폴딩이나 변형이 제대로 일어나지만 단백질의 상호작용을 DNA 결합 도메인을 이용하여 핵에서 전사활성화를 통하여 상호작용을 확인하므로, 세포질에서의 상호작용하는 단백질 간 상호작용의 경우 세포질에서 상호작용을 확인하기가 힘들다. 또한 단백질 간 상호작용이 리포터 유전자를 충분히 활성화시키지 못하는 경우, 상호작용하여 오히려 전사를 억제하는 경우 등에서 대조군과 활성화 정도의 차이가 크지 않아 상호작용을 증명하기 어려운 단점이 있다. 면역조직화학은 시료의 준비 과정 중 파라핀 및 포르말린으로 고정하는 과정을 거치게 되는데 이 과정 중 세포가 영향을 받을 수 있으며, 민감한 항체가 요구되고, 단지 목적 단백질들이 존재하는 세포 내 위치들을 염료들로 염색 후 이들 결과를 토대로 단백질들의 위치로 이들 간 상호작용을 추측하게 되므로 정확한 단백질-단백질 간 상호작용을 연구하기 힘들다. GST 풀-다운 어세이는 박테리아에서 목적 단백질들을 발현시키고 정제하는 과정을 거치게 되는데 단백질들을 수용성으로 발현시키는 과정이 쉽지 않으며 발현시킨 단백질이 포유류세포에서 발현되는 것과 다른 구조를 가질 수도 있다. 또한 정제과정 도중 및 정제 후 단백질의 분해가 일어날 수 있으므로 지속적인 단백질 상태가 모니터링 되어야 한다. 또한 단백질 간 결합이 사용하는 버퍼의 조성에 의하여 큰 영향을 받는다. 따라서 적절한 버퍼의 조성 연구가 수반되어야하며 시험관내 실험이므로 생체 내 상호작용과 다른 결과를 얻을 수 있다.

따라서,기존 방법의 단백질-단백질 상호작용을 분석하는 방법이 가지는 클로 닝 과정에서의 시간 소요, 정제된 항원 특이적 항체의 필요성, 실험 수행 과정에서 세포 파괴와 같은 과정 중의 오염 및 세포의 환경변화, 단백질 정제과정의 어려움, 고비용 등과 같 한계성을 극복하여 고속으로 간편하고 정확하게 단백질간 상호작용을 분석하기 위한 새로운 분석 시스템이 요구되고 있다.

이러한 요구에 부응하기 위하여 도입된 NMR을 통해 단백질의 상호작용을 규명하고 억제제를 선별하는 방법은 상술한 부작용을 최소화시키는데 효과적이다. 그러나, 상기 방법의 경우 단백질의 상호작용을 억제하는 하나의 억제제 후보물질을 시험한 후 다른 억제제 후보물질을 검증하기 위해서는 새로운 단백질이 필요하게 되어 필요로하는 단백질의 양이 많아지고 훨씬 많은 비용 및 노력이 필요한 문제가 있었다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명이 해결하고자 하는 첫번째 과제는 소량의 단백질만으로도 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있는 단백질 상호작용 억제제 선별방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하고자 하는 과제는 두번째 과제는 NMR 튜브에서 컬럼을 꺼내는 과정 없이도 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있는 단백질 상호작용 억제제 선별방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위해서,

1) 적어도 하나의 단백질에 친화성 태그(affinity tag)가 부착되고 링커로 연결된 상호작용하는 2개의 단백질을 준비하는 단계, 2) 상기 단백질을 동위원소로 표지하는 단계, 3) 상기 친화성 태그가 부착된 2개의 단백질을 컬럼에 흡착시키는 단계, 4) 상기 2개의 단백질이 흡착된 컬럼을 NMR 튜브에 넣은 후 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하는 단계, 5) 상기 NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 억제제 후보물질을 첨가하는 단계, 6) 상기 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함 단백질 상호작용 억제제 선별방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 상호작용하는 2개의 단백질이 효소 또는 수용체일 수 있으며, 보다 바람직하게는 mdm2와 p53일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 동위원소는 ¹³N, ¹⁵N일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 링커는 ~상기 링커의 아미노산 서열은 “GGGSGGGSGGGSGGGS” 로 16개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 친화성 태그는 GST 수지일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 컬럼의 길이는4-5㎝이고, 직경은 0.2 ~ 0.6㎝일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 2D 핵자기 공명 스펙트럼은 HSQC-NMR일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 6) 단계 이후, 7) 상기 NMR 튜브의 컬럼에서 억제제 후보물질을 제거하는 단계, 8) 억제제 후보물질이 제거된 컬럼을 상기 NMR 튜브에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 새로운 억제제 후보물질을 첨가하는 단계, 9) 상기 새로운 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함하되 상기 7) ~ 9) 단계는 반복수행되는 것될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 7) ~ 9) 단계는 1 ~ 20회 반복 수행될 수 있다.

본 발명은 상기 두번째 과제를 달성하기 위해서, 1) 적어도 하나의 단백질에 친화성 태그(affinity tag)가 부착되고 링커로 연결된 상호작용하는 2개의 단백질을 준비하는 단계, 2) 상기 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질을 동위원소로 표지하는 단계, 3) 상기 친화성 태그가 부착된 2개의 단백질을 컬럼에 흡착시키는 단계, 4) 상기 2개의 단백질이 흡착된 컬럼을 NMR 튜브에 넣은 후 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하는 단계, 5) 상기 NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 억제제 후보물질을 첨가하는 단계, 6) 상기 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 6)단계 이후 7) 상기 FLOW NMR 튜브를 수세하여 상기 억제제 후보물질을 제거하는 단계, 8) 상기 FLOW NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 결합을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 새로운 억제제 후보물질을 첨가하는 단계 및 9) 상기 또 다른 억제제 후보물질이 첨가된 FLOW NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 5)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함하되 상기 7) ~ 9) 단계는 1 ~ 20회 반복 수행될 수 있다.

이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.

별도로 설명되어 있지 않다면, 단백질의 상호작용'이란 생체 내에서 단백질이 단독으로 작용하는 것이 아니라 다른 단백질과의 결합을 통해 그 기능을 나타내는 것을 의미한다.

'FLOW NMR'이란 NMR 튜브에서 시료를 꺼내지 않고 용액을 흐르게 하면서 용질을 바꾸어 측정할 수 있는 NMR 기법을 의미한다.

'펩티드'란 목적하는 단백질의 기질 펩티드 서열과 유사한 서열을 가지고 있어 단백질의 활성 부위에 결합할 수 있는 펩티드를 의미하고, '펩티드 유사체'는 이러한 펩티드 서열 중의 아미노산과 실질적으로 유사한 화합물 (아미노산 유사체)을 포함하는 펩티드 및 그의 단편으로서 단백질의 활성 부위에 결합하는 성질을 유지하는 것들을 포함한다.

본 발명에 따르면 소량의 단백질만으로도 단백질간의 상호작용에 영향을 미치는 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있어 비용 및 시간을 현저하게 절감할 수 있다. 또한, 통상의 2D NMR이 아닌 FLOW NMR을 사용하는 경우 별도의 NMR 튜브에서 컬럼을 꺼내는 과정 없이도 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있어 더욱 효과적이다.

나아가, 억제제와 결합된 단백질의 3차원구조를 분석하게 되면 억제제가 단 백질에 어떻게 결합이 되는지를 알 수 있을 뿐만 아니라 이러한 정보를 이용하여 단백질간의 상호작용에 영향을 미치는 억제제를 새롭게 디자인할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 상호작용하는 단백질의 활성부위의 3차원구조를 해석하게 되면 매우 빠른 속도로 신약의 설계가 가능하다. 예를 들어 억제제와 결합된 단백질의 3차원 구조를 분석하게 되면 억제제가 단백질에 어떻게 결합이 되는지를 알 수 있을 뿐만 아니라 이러한 정보를 이용하여 단백질간의 상호작용에 영향을 미치는 억제제를 새롭고 디자인할 수 있고 이를 NMR을 이용해 분석할 수 있다. 그러나 다수의 억제제 후보물질을 스크리닝하기 위해서는 각각의 억제제 후보물질별로 단백질이 필요하므로 결국 이들 각각을 NMR을 이용하여 분석하는 경우에는 동위원소로 치환된 많은 양의 단백질이 필요하게 되고, 이는 스크리닝 비용의 비약적인 상승을 초래하게 되는 것이다.

이에 본 발명의 일실시예에서는 1) 적어도 하나의 단백질에 친화성 태그(affinity tag)가 부착되고 링커로 연결된 상호작용하는 2개의 단백질을 준비하는 단계, 2) 상기 단백질을 동위원소로 표지하는 단계, 3) 상기 친화성 태그가 부착된 2개의 단백질을 컬럼에 흡착시키는 단계, 4) 상기 2개의 단백질이 흡착된 컬럼을 NMR 튜브에 넣은 후 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하는 단계, 5) 상기 NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 억제제 후보물질을 첨가하는 단계, 6) 상기 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜 브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함 단백질 상호작용 억제제 선별방을 제공하여 상술한 문제점의 극복을 모색하였다.

본 발명의 선별방법을 보다 상세히 설명하면, 먼저, 1)단계로서 적어도 하나의 단백질에 친화성 태그(affinity tag)가 부착되고 링커로 연결된 상호작용하는 2개의 단백질을 준비한다. 본 발명에 사용될 수 있는 2개의 단백질은 단백질간에 상호작용이 발생하는 것이면 모두 적용될 수 있으나, 바람직하게는 3차원 구조가 알려진 기지의 단백질을 사용하는 것이 억제제 후보물질의 3차원 구조를 설계하는데 유리하다. 한편, 상기 상호작용하는 2개의 단백질이 효소 및/또는 수용체이거나 하나의 단백질의 활성부위에 결합할 수 있는 펩티드 또는 펩티드 유사체일 수 있다. 그 일례로서 mdm2와 p53일 수 있으나 이에 한정되지 않으며 본 발명의 기술적 원리가 적용되는 범위라면 얼마든지 적용이 가능하다.

한편 본 발명에 사용되는 2개의 단백질은 상호작용을 가지는데 이와는 별도로 상기 2개의 단백질을 링커로 연결한다. 이를 통해 후술하는 억제제 후보물질이 하나의 단백질과 결합하여 2개의 단백질의 상호작용이 억제되는 경우에도 상기 링커에 의해 2개의 단백질의 결합이 유지될 수 있는 것이며, 스크리닝 종료 후 컬럼에서 억제제 후보물질을 제거하기 위하여 이를 수세하는 경우에도 2개의 단백질은 컬럼에 흡착된 상태로 링커로 결합되어 있으므로 또 다른 억제제 후보물질의 스크리닝에 사용할 수 있게 되는 것이다.

본 발명에 사용가능한 링커는 2개의 단백질을 연결할 수 있는 것이면 종류의 제한이 없이 적절하게 선택하여 사용할 수 있으나, 바람직하게는 50개 미만의 아미노산의 개수를 가지는 링커를 사용할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 사용되는 링커는 상업적으로 판매되는 것이나 자체제작한 것을 사용할 수 있으며 구체적으로 구체적으로 “GGGSGGGSGGGSGGGS(서열번호 1)” 와 같은 아미노산으로 구성된 펩티드 일 수 있다.

본 발명에서는 단백질을 컬럼에 접착시키기 위하여 친화성 태그를 사용할 수 있다. 친화성 태그는 상기 2개의 단백질 중 적어도 하나의 단백질에 부착되며 본 발명에 사용가능한 친화성 태그는 컬럼에 접착될 수 있는 것이면 종류의 제한이 없지만 바람직하게는 GST, His-tag 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 한편, 상기 친화성 태그는 단백질과 함께 발현하거나 크로스 링킹과 같은 방법으로 부착시킬 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

한편 친화성 태그는 통상의 방법으로 단백질에 부착시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 친화성 태그를 포함하는 상용의 벡터에 클로닝하여 부착시킬 수 있다.

다음, 단계 2)에서 상기 2개의 단백질 중 적어도 하나의 단백질을 동위원소로 표지한다. 이 경우 사용가능한 단백질 동위원소로는 바람직하게는 ¹³C 또는 ¹⁵N을 사용할 수 있으며, 이 경우 2개의 단백질 모두를 표지하거나 그 중 하나의 단백질만을 표지할 수 있다. 나아가, 단백질을 구성하는 모든 아미노산을 표지할 수 있 으나 목적하는 단백질의 활성부위의 아미노산 서열에 대한 정보가 있을 경우에는 해당 아미노산만을 표지하는 것이 바람직하며, 단백질을 구성하는 아미노산 중 일부 아미노산(예를 들어 라이신)에만 표지하는 경우 모든 아미노산에 표지하는 경우에 비하여 NMR 스펙트럼의 검출 신호가 간소화되어 활성 부위의 판정이 용이하다

본 발명에 사용가능한 용매의 종류 및 농도는 통상의 NMR에 사용될 수 있는 것이면 종류의 제한이 없으나 바람직하게는 pH 6.8 ~ 8인 완충용액을 사용할 수 있으며, 0.1mM 단백질을 첨가할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

다음, 단계 3)에서 상기 친화성 태그가 부착된 2개의 단백질을 컬럼에 흡착시킨다. 상기 컬럼은 친화성 태그와 결합할 수 있는 재질이면서 NMR에 사용될 수 있는 것이면 종류의 제한이 없으며, 만일 친화성 태그로서 GST 수지를 사용하는 경우 컬럼은 GST 컬럼을 사용하는 것이 유리하다. 또한, 본 발명에 사용가능한 컬럼의 크기 및 형태는 NMR 튜브에 삽입될 수 있는 것이면 족하며, 바람직하게는 상기 컬럼의 길이는 4 - 5 ㎝이고, 직경은 0.2 ~ 0.6㎝일 수 있다.

한편, 2개의 단백질을 컬럼에 흡착시키는 방법은 제한이 없으나, 바람직하게는 단백질을 정제한 후 이를 완충액으로 평형화시킨 후 컬럼에 흡착시킬 수 있다.

다음, 단계 4)에서는 상기 2개의 단백질이 흡착된 컬럼을 NMR 튜브에 넣은 후 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정한다. 구체적으로 NMR을 이용한 단백질들 간의 상호작용 연구는 상술한 X-ray 등 이용한 방법과 비교하여 다양한 장점이 있다. X-ray는 단백질의 co-complex 단일결정을 먼저 얻어야만 하는데, 이러한 과정은 쉽지 않다. 특히 단백질들 간의 상호작용이 충분히 강해서, 단백질 결정화 과정 동안 complex가 유지되어야만 하는 기본 조건이 충족되어야만 한다. 하지만, NMR을 이용한 단백질 상호작용 연구는 모든 과정이 용액 상태에서 이루어지므로, 결합 단백질의 농도를 증가시킴으로써 비교적 쉽게 약한 단백질들 간의 상호작용도 측정할 수 있다. NMR을 이용해 구조를 규명하기 위해서는 먼저 각 아미노산들의 화학적 이동을 결정해야 하는데, 이렇게 얻어진 chemical shift 정보만 가지고도 매우 상세히 단백질들 간의 3차구조적인 상호작용 부위를 알 수 있다. 단백질들 간의 상호작용을 측정하기 위해 많이 사용되는 NMR 기법은 화학적 이동 섭동(chemical shift perturbation)방법과 크로스 세츄레이션(cross-saturation) 방법 등이 이용될 수 있다. 한편, 활성신호의 대비를 용이하게 하기 위하여 각각의 단백질에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정할 수도 있으며 단백질간의 상호작용이 발생하는 경우 개개의 단백질의 피크와는 다른 양상의 피크가 나타나게 된다.

다음, 단계 5)에서는 상기 NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 결합을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 억제제 후보물질을 첨가한다. 이 때, 첨가될 수 있는 억제제 후보물질은 2개의 단백질의 상호작용을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 종류에 관계없이 첨가할 수 있으며, 단백질, 펩티드, 화합물 및 천연물 등의 종류를 불문하고 첨가할 수 있다. 이 때 첨가되는 억제제 후보물질의 종류는 한종류 또는 여러종류일 수 있으며, 한종류만 첨가되는 경우에는 당해 억제제 후보물질이 타겟 억제제인지 여부를 파악할 수 있으므로 억제제 후보물질의 종류가 소수일 때 사용한다. 억제제 후보물질의 종류가 많을 경우에는 여러 종류의 억제제 후보물질을 혼합하여 첨가하여 첨가된 혼합물에서 타겟 억제제가 있는지 여부를 판별할 수 있다. 만일 혼합물에서 타겟 억제제가 있는 것으로 판명된 경우에는 이를 하나씩 분석하여 타겟 억제제를 찾을 수 있다. 한편 바람직하게는 상기 억제제 후보물질이 10종류 이내로 단독 또는 혼합되어 첨가되는 것이 타겟 억제제를 검출하는데 유리하다.

다음, 단계 6)에서는 상기 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 5)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별한다. 구체적으로 상호작용하는 2개의 단백질에 억제제 후보물질을 첨가하는 경우 첨가된 후보물질이 상호작용을 저해하는 억제제라면 상호작용을 방해하여 2D 핵자기 공명 스펙트럼의 활성부위신호가 달라지게 된다. 다시 말해, 단백질간의 상호작용이 중단되므로 결합단백질의 NMR 피크가 아닌 각각의 단백질의 NMR 피크로 환원되는 것이다. 그러나 첨가된 후보물질이 실제 억제제가 아니라면 단백질간의 상호작용을 방해하지 못하므로 활성부위신호가 거의 달라지지 않게 된다. 이를 통해 당해 억제제 후보물질이 실제 단백질간의 상호작용을 억제할 수 있는지 여부를 판별할 수 있다.

한편, 상기 6) 단계 이후 또 다른 억제제 후보물질을 시험하기 위하여 7) 상기 NMR 튜브의 컬럼에서 억제제 후보물질을 제거하는 단계, 8) 억제제 후보물질이 제거된 컬럼을 상기 NMR 튜브에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종 류 이상의 새로운 억제제 후보물질을 첨가하는 단계, 9) 상기 새로운 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함하되 상기 7) ~ 9) 단계는 반복수행될 수 있다.

구체적으로, 6) 단계 이후 7) 단계로서 상기 NMR 튜브에서 컬럼을 꺼낸 후 이를 수세하여 억제제 후보물질을 제거할 수 있다. 이 경우 억제제 후보물질은 제거되나 단백질의 경우 친화성 태그가 부착되어 있으므로 여전히 컬럼에 흡착되어 있게 되며 친화성 태그가 부착되지 않은 다른 단백질은 친화성 태그가 부착된 단백질과 링커로 연결되어 있으므로 억제제 후보물질과 같이 제거되지 않는다. 한편, 억제제 후보물질이 제거되는 경우 다시 단백질간의 상호작용이 발생하게 된며 단백질간에 링커가 연결되어 있지 않은 경우 억제제에 의해서 단백질간의 결합이 깨지게 되므로 수세과정에서 친화성 태그가 부착되지 않은 단백질은 억제제 후보물질과 함께 제거된다.

그 뒤, 8) 단계로서 억제제 후보물질이 제거된 컬럼을 상기 NMR 튜브에 다시 삽입하고 상기 6) 단계와 마찬가지로 상기 NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 결합을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 새로운 억제제 후보물질을 첨가한 후, 9) 단계로서 상기 또 다른 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별할 수 있다. 이를 통해 상기 단백질들을 새롭게 준비하지 않고도 이미 억제제 스크리닝에 사용했던 단백질을 재사 용할 수 있는 것이다. 상기 7) ~ 9) 단계는 반복수행될 수 있으며 바람직하게는 상기 7) ~ 9) 단계는 1 ~ 20회 반복수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상술한 본 발명의 원리를 도 1을 참고하여 설명한다. 친화성 태그로서 GST 수지가 부착된 GST_Mdm2 혼성단백질을 p53 단백질과 반응시키면 단백질간의 상호작용에 의해 두 단백질이 결합하게 된다. 그 뒤 두 개의 단백질에 아미노산 서열(GGGSGGGSGGGSGGGS)인 링커를 첨가하여 2개의 단백질을 연결하게 된다. 그 뒤 이를 컬럼에 첨가하면 상기 GST 수지가 컬럼에 흡착하게 되어 결과적으로 2개의 단백질이 모두 컬럼에 흡착하게 된다. 그 뒤 억제제로서 Nutlin-3을 첨가하면 컬럼에 흡착은 유지되나 2개의 단백질간에 상호작용이 저해되어 양 단백질이 분리되며 링커로만 연결된다. 이후, 컬럼을 수세하여 Nutlin-3를 제거하면 컬럼에 흡착된 단백질 및 이와 링커로 연결된 다른 단백질은 여전히 컬럼에 흡착되어 남아있게 된다. 그 뒤 새로운 억제제 후보물질을 컬럼에 첨가하여 동일한 실험을 반복하여 수행할 수 있게 되는 것이다.

본 발명의 2실시예에 따른 단백질 상호작용 억제제 선별방법은 1) 적어도 하나의 단백질에 친화성 태그(affinity tag)가 부착되고 링커로 연결된 상호작용하는 2개의 단백질을 준비하는 단계, 2) 상기 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질을 동위원소로 표지하는 단계, 3) 상기 친화성 태그가 부착된 2개의 단백질을 컬럼에 흡착시키는 단계, 4) 상기 2개의 단백질이 흡착된 컬럼을 NMR 튜브에 넣은 후 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하는 단계, 5) 상기 NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 억제제 후보물질을 첨가하는 단계, 6) 상기 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함한다.

이하에서는 1실시예와 중복되는 내용은 배제하고 2실시예의 특징적인 내용만 서술하기로 한다. 구체적으로 2실시예는 2D NMR로서 통상의 NMR이 아닌 FLOW NMR을 사용하는데 차이가 있다. FLOW NMR은 새로운 억제제 후보물질을 첨가하기 위하여 NMR 튜브에서 컬럼을 꺼낸 뒤 사용한 억제제를 제거하는 것이 아니라 컬럼을 꺼내지 않은 채 NMR 튜브 내부에서 사용한 억제제를 제거할 수 있게 된다. 이를 통해 별도로 사용한 컬럼을 꺼내는 불편함이 없이 또 다른 억제제 후보물질을 연속적으로 스크리닝할 수 있게 된다.

결국, 본 발명에 따르면 소량의 단백질만으로도 단백질간의 상호작용에 영향을 미치는 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있어 비용 및 시간을 현저하게 절감할 수 있다. 또한, 통상의 2D NMR이 아닌 FLOW NMR을 사용하는 경우 별도의 R 튜브에서 컬럼을 꺼내는 과정 없이도 다수의 억제제 후보물질을 선별할 수 있어 더욱 효과적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위 한 것으로 해석되어야 할 것이다.

<실시예 1> 단백질의 준비 및 정제

Mdm2 단백질(NCBI ABT17086)의 잔기 중 3번에서 109번에 해당하는 부분과 p53 단백질(NCBI BAC16799)의 잔기 중 1번에서 73번에 해당하는 부분을 PCR을 이용하여 각각 증폭하였다. 그 뒤 pGEX4T-1 발현벡터에 Mdm2 (잔기 3-109)를 클로닝한 후 링커(GGGSGGGSGGGSGGGS)를 Mdm2 (잔기 3-109)뒤에 연결하고 그 뒷부분에 p53 (잔기 1-73)을 클로닝 하였다. 상기 방법으로 친화성 태그가 부착된 mdm2-linker-p53 단백질이 발현되었다.

상기 제작된 플라즈미드를 E. coli BL21(DE3) 에 형질전환하여 ¹⁵N으로 표지된 M9 minimal media (1L)에 접종하였다. 그 뒤 흡광도가 OD 0.6이 되었을 때 온도를 25℃로 낮추고 1 mM IPTG를 넣은 후 25℃에서 6시간 동안 배양하였다. 그 뒤 배양액을 5000 rpm으로 4 ℃에서 20분간 원심분리 하여 형질전환된 균주를 회수한 후, PBS 완충액 (pH=7.3, 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8mM KH₂PO₄)으로 현탁 하여 냉온 상태 (4℃)를 유지하면서 초음파 분쇄기로 형질전환된 균주를 파쇄하였다. 이 시료를 15000 rpm으로 4℃에서 30분간 원심 분리하여 세포내재성 단백질을 포함하는 상층액과 세포벽-막 성분 등의 고체성분을 포함하는 균체 잔해(cell debris)를 분리한 후 상층액을 취하여 단백질 (Mdm2_링커_p53)을 정제하였다.

<실시예 2> 2D NMR의 측정

평형화된 GST 수지와 상기 정제된 단백질을 혼합하여 NMR 튜브에 넣은 후 2D NMR을 측정하였다. 상기 NMR 튜브에서 컬럼을 수세하여 억제제 후보물질을 제거하였다. 억제제 후보물질이 제거된 상기 NMR 튜브에 2개의 단백질의 결합을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 새로운 억제제 후보물질을 첨가한 후, 또 다른 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하였다.

<실험결과>

도 2는 GST 수지_p53의 HSQC NMR 스펙트럼이다. 상기에서 GST 수지는 컬럼의 재질을 의미한다. 도 3은 GST 수지_GST_mdm2_linker_p53에 대한 HSQC NMR 스펙트럼이다. 구체적으로 mdm2의 경우 거대 분자인 GST가 부착되므로 부피가 너무 커지게 되어 p53과의 결합부분 등을 제외하고는 NMR 피크가 거의 발생하지 않는다. 또한 p53의 경우 mdm2와의 상호작용으로 인해 p53의 단독일 때와 비교하여 NMR 활성신호가 약해지는 것을 확인할 수 있다.

도 4는 억제제로서 0.5mM의 Nutlin-3을 첨가한 후 HSQC NMR을 측정한 스펙트럼이다. 도 4에서 동그라미로 표시된 부분이 도 3에 없었던 새로운 피크를 의미하는 것으로서 이는 Nutlin-3의 첨가로 인해 mdm2와 p53의 상호작용이 방해되었기 때문으로 해석되며 결국 Nutlin-3는 mdm2와 p53의 상호작용을 억제하는 화합물에 해 당함을 알 수 있다.

한편, 도 5 컬럼을 수세하여 억제제를 제거한 후 HSQC NMR 스펙트럼을 분석한 것으로 GST 수지_GST_mdm2_linker_p53에 대한 HSQC NMR 스펙트럼인 도 3과 활성신호부위가 실질적으로 일치하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 억제제를 제거하는 경우 p53이 억제제와 같이 제거되지 않고 mdm2과 상호작용을 유발하면서 컬럼에 흡착되는 것을 의미하는 것으로 이는 p53을 컬럼에 흡착된 mdm2과 링커로 연결시켜 수세에 의해 p53이 유실되는 것을 최소화하였기 때문으로 해석된다.

결국, 컬럼에는 이미 사용한 억제제만 제거되었을 뿐 GST 수지_GST_mdm2_linker_p53는 여전히 남아 있으므로, 새로운 억제제 후보물질을 첨가하여 다시 스크리닝 과정을 수행할 수 있다.

본 발명은 저비용 고효율로 신약 선도물질을 발굴하고, 구조기반 약물 설계 등의 새로운 신약 연구개발에 유용하다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 억제제 후보물질의 선별방법을 도시한 개략도이다.

도 2는 GST 수지_p53에 대한 HSQC NMR 스펙트럼이다.

도 3은 GST 수지_GST_mdm2_linker_p53에 대한 HSQC NMR 스펙트럼이다.

도 4는 GST 수지_GST_mdm2_linker_p53에 Nutlin3을 첨가한 후 HSQC NMR 스펙트럼이다.

도 5는 컬럼을 수세한 후 GST 수지_GST_mdm2_linker_p53에 대한 HSQC NMR 스펙트럼이다.

<110> KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Screening method of protein-protein interaction inhibitor <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial linker <400> 1 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (14)

1) 적어도 하나의 단백질에 친화성 태그(affinity tag)가 부착되고 링커로 연결된 상호작용하는 2개의 단백질을 준비하는 단계;

2) 상기 단백질을 동위원소로 표지하는 단계,

3) 상기 친화성 태그가 부착된 2개의 단백질을 컬럼에 흡착시키는 단계, ;

4) 상기 2개의 단백질이 흡착된 컬럼을 NMR 튜브에 넣은 후 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하는 단계;

5) 상기 NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 억제제 후보물질을 첨가하는 단계;

6) 상기 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항에 있어서,

상기 상호작용하는 2개의 단백질이 효소 또는 수용체인 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제2항에 있어서,

상기 상호작용하는 2개의 단백질은 mdm2와 p53인 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항에 있어서,

상기 동위원소는 ¹³C 또는 ¹⁵N인 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항에 있어서,

상기 링커는 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항에 있어서,

상기 친화성 태그는 GST, His-tag로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항에 있어서,

상기 컬럼의 길이는 4 ~ 5 ㎝이고, 직경은 0.2 ~ 0.6㎝인 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항에 있어서,

상기 2D 핵자기 공명 스펙트럼은 HSQC-NMR인 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항에 있어서,

상기 6) 단계에서 억제제 후보물질은 1 ~ 10 종류를 첨가하는 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항에 있어서,

상기 6) 단계 이후,

7) 상기 NMR 튜브의 컬럼에서 억제제 후보물질을 제거하는 단계;

8) 억제제 후보물질이 제거된 컬럼을 상기 NMR 튜브에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 새로운 억제제 후보물질을 첨가하는 단계;

9) 상기 새로운 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함하되;

상기 7) ~ 9) 단계는 반복수행되는 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제10항에 있어서,

상기 7) ~ 9) 단계는 1 ~ 20회 반복수행되는 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

1) 적어도 하나의 단백질에 친화성 태그(affinity tag)가 부착되고 링커로 연결된 상호작용하는 2개의 단백질을 준비하는 단계;

2) 상기 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질을 동위원소로 표지하는 단계,

3) 상기 친화성 태그가 부착된 2개의 단백질을 컬럼에 흡착시키는 단계, ;

4) 상기 2개의 단백질이 흡착된 컬럼을 NMR 튜브에 넣은 후 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하는 단계;

5) 상기 NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하는 적어도 한 종류 이상의 억제제 후보물질을 첨가하는 단계;

6) 상기 억제제 후보물질이 첨가된 NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 4)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제12항에 있어서,

상기 6)단계 이후,

7) 상기 FLOW NMR 튜브를 수세하여 상기 억제제 후보물질을 제거하는 단계;

8) 상기 FLOW NMR 튜브에 삽입된 컬럼에 2개의 단백질의 상호작용을 억제하 는 적어도 한 종류 이상의 새로운 억제제 후보물질을 첨가하는 단계; 및

9) 상기 또 다른 억제제 후보물질이 첨가된 FLOW NMR 튜브에 대한 2D 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고 상기 5)단계에서 측정한 2D 핵자기 공명 스펙트럼과 비교하여 활성부위 신호변화를 통해 후보물질을 선별하는 단계를 포함하되;

상기 7) ~ 9) 단계는 1 ~ 20회 반복수행되는 것을 특징으로 하는 단백질 상호작용 억제제 선별방법.

제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법으로 선별된 단백질 상호작용 억제제.

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