KR20110050541A - 항-ｃｄ５ 항체 - Google Patents

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죠세핀 엘. 케이. 클리트가드
찰스 피케
미켈 반달 페데르센
클라우스 코에포에드
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심포젠 에이/에스
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Abstract

본 발명은 항-CD5 항체를 포함하는 조성물의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 별개의 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 2개 이상의 항-CD5 항체를 포함하는 항체 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 항체 조성물의 결합 특이성을 갖는 이특이적 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약제 조성물, 항체 조성물의 용도, 및 항체 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 세포 은행 및 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

Description

항-ＣＤ５ 항체{ANTI-CD5 ANTIBODIES}
항-CD5 항체
상기 인용된 출원 또는 본 출원에 인용된 모든 특허 및 비특허 참고문헌은 또한 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항-CD5 항체를 포함하는 조성물의 분야에 관한 것이다.
본 발명의 배경
항체는 박테리아 및 바이러스와 같은 외래 침습성 병원체 공격시에 면역계에 의해 생성되는 분자이다. 항체 분자는 이황화결합에 의해 연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)로 구성되어, 각각의 암(arm)의 첨단에 존재하는 가변 결합 도메인을 갖는 V-형 분자를 형성한다. 상기 분자는 높은 변이성 및 외래 물질(통상적으로 단백질), 소위 항원에 대한 매우 강한 결합을 특징으로 한다. 항체는 항원 상의 특정 에피토프에 결합함으로써 이의 기능을 발휘한다. 결합 후, 다양한 효과기 기능이 항체의 불변 부분인 Fc 영역을 통해 매개될 수 있다. 항체 동형(isotype)에 따라, 보체 용해, 세포 사멸, 식작용 등과 같은 효과기 기능이 달성될 수 있다. 항체 구조와는 별개로, 다양한 양태의 항체 생물학이 자연 발생의 내인성 항체의 효과 및 항체 기반 약물의 치료에 영향을 미친다. 이러한 양태는 항체의 친화성 뿐만 아니라 반응 속도(즉, 얼마나 신속히 항체가 에피토프에 결합하는 지의 여부), 결합된 에피토프의 항원 상의 위치, 조성물에 존재하는 다양한 에피토프를 표적으로 하는 항체의 수, 및 이들이 면역원성 에피토프에 결합하는지 아닌지의 여부를 포함한다.
치료 약물로서의 항체의 용도
혈장으로부터 유래된 폴리클로날 항체 제조물, 소위 과다면역 면역글로불린 생성물은 전통적으로 높은 복합성의 표적을 특징으로 하는 질병, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 또는 B형 간염 바이러스 감염의 치료에 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 혈액 유래 생성물은 공급 부족, 높은 배치-투-배치(batch-to-batch) 변화 뿐만 아니라 혈액으로부터 환자로의 감염성 작용제의 잠재적 전달과 관련된 안전성 문제를 포함하는 다수의 선천적 불이익을 갖는다. 지난 10-15년 동안, 재조합 항체의 치료 잠재성을 연구하는데에 많은 초점이 맞춰져 왔고, 이러한 초점은 매우 가치가 있는 연구인 것으로 판명되어 왔다. 현재, 전세계적으로 임상 개발중인 약물 중 20% 이상이 항체 유래 약물이며, 이는 향후 전세계 시장에서 전체 약 400개의 잠재적 약물에 해당한다. 현재 시판 승인된 ~20개의 재조합 항체 치료제가 모두 모노클로날 항체이다. 재조합 폴리클로날 항체의 생성 기술 및 산업적 생산은 현재까지는 부족하다. 그러나, 하나 이상의 항원-에피토프를 표적으로 하는 폴리클로날 항체 치료제에 대한 장점 및 요구가 이미 인지되고 있다. 상기 목적은 향후 재조합 항체 기반 약물에서 과다면역 면역글로불린 생성물의 사용에 의해 기존에 문서화된 다클론성의 개념을 재도입시킴으로써 항체 기반 약물의 품질을 증가시키는 것이다.
만성 림프구성 백혈병 및 CD5
CLL은 서구에서 가장 흔한 형태의 백혈병이다. CLL 세포는 CD5 및 CD23과 함께 세포막에서 CD19 및 CD20을 발현한다. 따라서, 이러한 표현형은 CD23의 발현이 결핍되어 있으나, FMC7로 언급되는 또 다른 표면 분자를 발현하는 다른 CD5 양성 B-세포 질병인 외투층 세포 림프종(Mantle Cell Lymphoma, MCL)과 구별될 수 있다. 둘 모두의 질병은 통상적인 화학요법으로 치료가능하다. 현재, 플루다라빈 기반 요법이 CLL을 제어하는데 가장 효과적인 요법이다. 단일요법으로서 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 표준 용량 요법은 다른 무통성 B-세포 림프종/백혈병에서의 결과에 비해 CLL에서 매우 제한된 효과를 갖는다. CLL에서 단일 작용제 효능이 입증된 유일한 항체는 화학-난치성 CLL에 대해 등록된 항-CD52 항체 캄파쓰-1H( Campath-1H)이다. 그러나, 캄파쓰-1H와 관련된 심각한 면역결핍이 CLL에서의 일반적 적용을 제한한다. CLL에서의 결과를 개선시키기 위한 현재 방법은 항체 화학요법 조합물 및 CD20 및 CD52가 아닌 다른 항원, 예를 들어, CD23, CD40, CD40-리간드 및 HLA-DR을 표적으로 하는 항체의 개발에 초점을 둔다. 본 발명자는 CLL 세포에 대해 특징적인 연구되지 않은 CD5 항원이 CLL에서 항체 기반 수동 면역요법을 위한 매력적인 표적임을 암시한다.
CD5는 타입 Ⅰ 당단백질이며, 이는 스캐빈저(scavenger)-수용체 패밀리의 일원이다. CD5는 가슴샘세포, 성숙 T 세포, 및 성숙 B 세포의 서브셋에 의해 발현되고, 이는 림프구 활성화의 조절 및 분화 과정과 관련된 것으로 밝혀졌다. CD72, gp80-40 및 Ig 프레임워크 구조는 CD5에 대한 목적 리간드이며, 이의 CD5와의 상호작용이 마우스에서 밝혀졌고, 이러한 상호작용의 정확한 역할 및 구조적 특징은 해명되어야 한 채로 남아있다. CD5는 B-세포 수용체(BCR)의 근처의 표면 IgM의 CD79a 및 CD79b 형질도입 파트너와 관련이 있고, CD5 신호전달은 지질 라프트(lipid raft)로의 BCR 및 CD79a 및 CD79b와의 공동침전에 의해 매개된다. CD79a 및 CD79b는 Lyn 및 다른 티로신 키나아제, 예를 들어, Syk에 의해 인산화되고, Zap70 뿐만 아니라 티로신 포스파타아제 SHP-1이 또한 상기 신호전달의 매개체인 것으로 보고되었다. CD79b의 트렁케이션된 형태가 CLL 세포에서 관찰되었고, 따라서 손상된 세포내 신호전달이 CLL 세포의 생존에 중요한 것으로 암시되었다. CD5와 모노클로날 항-CD5 항체의 가교가 CLL 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있으나, 이러한 신호의 유도는 CD5가 BCR 및 BCR-관련 분자와 함께 지질 라프트로 전위되지 않는 경우에 발생하지 않는다. 에피토프의 위치가 수용체를 통해 신호가 전달되도록 하기 위한 항체의 능력에 중요함에 따라, 본 발명자는 CD5에 대한 많은 특이성을 갖는 광범위한 항체가 CLL 세포에서의 CD5의 신호전달 역할에 관한 지식을 밝혀내고, 이러한 지식이 CLL에 대한 효과적인 항체 요법의 개발에 기여할 것으로 생각한다.
CD5에 대한 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체 조성물이 여러 항체 특이성을 함유함으로써 여러 에피토프를 표적으로 함에 따라, 본 발명자는 CD72 및 CD5에 대한 다른 잠재적 리간드에 의해 활성화된 신호 경로의 mAb에 비해 보다 효과적인 차단이 폴리클로날 항체 조성물로 달성될 수 있는 것을 주장한다. 특정 에피토프의 표적화는 수용체를 통해 신호가 전달되도록 하는 mAb의 능력에 중요할 수 있다. 항-CD20 항체(리툭시맙)의 특이성이 생체내에서 유도된 효과기 기능의 유형에 직접 영향을 미치는 것으로 밝혀지고, 다양한 에피토프 특이성을 갖는 Her-2에 대한 항체가 다양한 항종양 활성을 유도하는 것으로 밝혀짐에 따라, 본 발명자는 다수의 특이성의 항체를 함유하는 폴리클로날 항체 조성물이 종양 세포의 사멸을 매개하는데 보다 효과적일 것으로 추측한다. 또한, 다수의 항원-에피토프를 표적으로 하는 폴리클로날 항체 조성물에 의한 표면 상에서 생성된 높은 밀도의 항체가 CLL의 치료에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀진 아폽토시스와 유사한 보체 매개 용해 및 ADCC와 같은 효과기 기능의 활성화를 증가시킬 가능성이 있다. 따라서, 종합적으로 보다 효과적인 요법이 폴리클로날 항체 조성물로 달성될 가능성이 매우 높다.
상기 언급된 바와 같이, 모노클로날 항-CD52 항체인 캄파쓰-1H는 기존에 중히 치료된 환자에서 CLL에 대해 효과적인 것으로 밝혀졌으나, 상기 치료는 유의한 면역억제 및 기회 감염의 발생을 동반한다. 이는 CD52가 혈장 세포를 제외한 모든 백혈구에서 발현되고, 따라서 캄파쓰-1H가 CLL 및 건강한 세포 둘 모두를 표적으로 하기 때문이다. 다른 한편, CD5는 NK 세포 및 건강한 B 세포에서 발현되지 않고, 따라서 CD5를 표적으로 하는 항-CLL 항체 치료제는 우선적으로 암 세포를 표적으로 할 것이고, 이는 환자에게 이로울 것인데, 이는 건강한 세포가 덜 빈번히 제거되고, 환자가 최소 면역억제를 경험할 것이기 때문이다.
T101은 피부 T-세포 림프종(CTCL) 및 류머티스 관절염에 걸린 환자의 치료를 위해 개발된, CD5에 대한 모노클로날 마우스 IgG2a이다. Ⅱ기 연구에서 치료 효과의 결핍으로 인해, T101 임상 개발이 중지되었다. T101이 임상 효과를 갖지 않는 원인은 공지되지 않았으며, 상기 T101이 불가피하게 HAMA(인간 항-마우스 항체) 반응을 중화시키는 완전한 뮤린 항체라는 사실과 관련이 있을 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고, 폴리클로날 항체 조성물을 이용한 여러 CD5 에피토프의 표적화가, 예를 들어, 수용체 내재화를 증가시켜 임상적 항-종양 효과를 발생시킴으로써 T101과 같은 모노클로날 항체에 비해 CD5의 억제에서 현저한 증가를 발생시킬 수 있는 것으로 생각될 수 있다. 또한, 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 함유하는 CD5 특이적 키메라 항체를 생성시키려고 함에 따라, 완전한 뮤린 T101 항체로 관찰된 HAMA 반응의 주요 부분이 관찰되지 않을 것이다. 키메라 항체의 가변 영역에 대한 항체가 발생하는 경우, 생체외에서 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 중화 항체를 이용한 본 발명자의 이전의 연구는 폴리클로날 항체 조성물이 모노클로날 항체보다 항체를 중화시키는데 덜 민감함을 나타내었다. 따라서, 폴리클로날 항-CD5 항체 조성물은 중화 항체의 유도가 발생하는 경우 약리학적으로 활성인 채로 유지될 가능성이 매우 높다.
효과기 메커니즘
세포의 표면 상의 항원에 결합하는 항체의 세포 수준에 대한 효과는 결합되는 특정 항체에 따라 상이하다. 중요한 효과기 메커니즘은 항체 의존성 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함한다. ADCC 효과기 메커니즘은 특정 항체에 의해 결합된 표적 세포를 활성적으로 용해시키는 면역계의 효과기 세포를 특징으로 한다. 이는 체액성 면역 반응의 일부로서 항체가 감염을 제한하고 함유하도록 작용할 수 있는 메커니즘 중 하나이다. 고전적 ADCC는 자연살세포(NK)에 의해 매개된다. 그러나, 단핵세포 및 다형핵과립 백혈구(PMN)가 또한 ADCC를 매개할 수 있다. ADCC는 이전의 항체 반응에 대한 의존성으로 인해 적응 면역 반응의 일부이다. 통상적 ADCC는 NK 세포의 활성화를 포함하고, 이는 NK 세포의 표면 상의 Fc 수용체에 의한 항체 코팅된 감염 세포의 인지에 의존된다. Fc 수용체는 병원체 감염 표적 세포의 표면에 결합하는 IgG와 같은 항체의 Fc (결정성) 부분을 인지한다. NK 세포의 표면에 존재하는 가장 흔한 Fc 수용체는 CD16 또는 FcγRⅢ로 언급된다. IgG의 Fc 수용체에 결합된 후, 자연살세포는 IFN-γ, 및 표적 세포로 진입하고, 아폽토시스를 촉발시킴으로써 세포 사멸을 촉진시키는 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)을 함유하는 세포독성 과립과 같은 사이토카인을 방출한다. 이는 세포독성 T 세포(CTL)에 의한 반응과 유사하나, 이에 의존하지는 않는다. ADCC의 수준은 IgG 서브타입(IgM>IgG1>IgG2), 표적 세포 상의 항체 밀도, 항체 당화 패턴 뿐만 아니라 표적 자체의 특성을 포함하는 여러 요인에 좌우된다.
CDC는 세포 항원으로의 항체 결합이 결합된 세포의 중화를 약시킬 수 있는 대안적 효과기 메커니즘이다. 항체는 소위 고전적 보체 경로를 활성화시킬 수 있다. 고전적 보체 경로에서, 결합된 항체는 보체 시스템의 단백질을 모집하고, 이를 통해 일련의 상호작용이 결합된 세포를 사멸시킨다. 보체 시스템은 일반적으로 비활성 효소원으로 순환하는 혈액에서 발견되는 다수의 작은 단백질로 구성된다. 여러 촉발인자 중 하나에 의해 자극되는 경우, 시스템 내의 프로테아제는 특정 단백질을 분해하여 사이토카인을 방출시키고, 추가 분해의 캐스캐이드 증폭을 개시시킨다. 상기 활성화 캐스케이드의 최종 결과는 상기 반응의 대량의 증폭, 및 세포 사멸 막 공격 복합체의 활성화이다. 20개를 초과하는 단백질 및 단백질 단편이 혈청 단백질, 장막 단백질, 및 세포막 수용체를 포함하는 보체 시스템을 구성한다.
암 항원에 대한 치료 항체를 포함하는 여러 연구는 항-종양 활성이 항체 Fc 영역으로의 결합을 통해 활성화되는 ADCC 및 CDC와 같은 효과기 메커니즘의 활성화를 필요로 하는 것을 나타낸다. 따라서, 항체 치료제의 효과에 관한 또 다른 문제는 항체 Fc 영역 및 모집된 효과기 분자의 상호작용이다. 대식세포, NK 세포 및 보체 단백질과 같은 효과기 분자 상의 Fc 수용체로의 IgG 항체의 Fc 영역의 결합이 항체 CH2 도메인의 당화에 영향을 받는다. 특히, 아스파라긴 297에서 N 결합된 올리고당류 상의 푸코오스의 정도는 NK 세포 상의 FcγⅢ 수용체(CD16)로의 IgG Fc 영역의 결합에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 보체 활성화에 관한 당화의 효과는 해명되어야 한 채로 남아있다. 항체 당화는 종 특이적이고, 이에 따라 생성 세포주의 특성이 효과기에 결합하고 효과기 기능을 매개하는 항체의 능력에 대한 주요한 영향을 준다. 항체 당화에서 상기 기재된 차이로 인해, 본 발명자는 CHO 세포 및 인간 Per.C6 세포에서 발현된 항체가 항체 기반의 약물의 치료 효과에 상이하게 영향을 미칠 것을 주장한다.
발명의 개요
한 양태에서, 본 발명은 별개의 CD5 에피토프에 결합하는 2개 이상의 항-CD5 항체를 포함하는 항체 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 상기 조성물은 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 어느 하나로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 어느 하나의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체를 포함한다. 각각의 항체의 VL 및 VH 서열(명칭에 의해 나열됨)은 표 2 및 3에 제공된다.
바람직하게는, 상기 조성물은 표 1에 나타낸 바와 같이 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 어느 하나의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 표 1에 나타낸 바와 같이 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 표 1에 나타낸 바와 같이 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37 중 어느 하나의 인간 CD5로의 결합을 억제할 수 있는 항체를 포함한다.
하기가 본 발명의 구체예이다:
항체 1, 항체 1의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 1의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 1과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 1의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 2, 항체 2의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 2의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 2와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 2의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 3, 항체 3의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 3의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 3과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 3의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 4, 항체 4의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 4의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 4와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 4의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 5, 항체 5의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 5의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 5와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 5의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 6, 항체 6의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 6의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 6과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 6의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 7, 항체 7의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 7의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 7과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 7의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 8, 항체 8의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 8의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 8과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 8의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 9, 항체 9의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 9의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 9와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 9의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 10, 항체 10의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 10의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 10과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 10의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 11, 항체 11의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 11의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 11과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 11의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 12, 항체 12의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 12의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 12와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 12의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 13, 항체 13의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 13의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 13과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 13의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 14, 항체 14의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 14의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 14와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 14의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 15, 항체 15의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 15의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 15와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 15의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 16, 항체 16의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 16의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 16과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 16의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 17, 항체 17의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 17의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 17과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 17의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 18, 항체 18의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 18의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 18과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 18의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 19, 항체 19의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 19의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 19와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 19의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 20, 항체 20의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 20의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 20과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 20의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 21, 항체 21의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 21의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 21과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 21의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 22, 항체 22의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 22의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 22와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 22의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 23, 항체 23의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 23의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 23과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 23의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 24, 항체 24의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 24의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 24와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 24의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 25, 항체 25의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 25의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 25와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 25의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 26, 항체 26의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 26의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 26과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 26의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 27, 항체 27의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 27의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 27과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 27의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 28, 항체 28의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 28의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 28과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 28의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 29, 항체 29의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 29의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 29와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 29의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 30, 항체 30의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 30의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 30과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 30의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 31, 항체 31의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 31의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 31과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 31의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 32, 항체 32의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 32의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 32와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 32의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 33, 항체 33의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 33의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 33과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 33의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 34, 항체 34의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 34의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 34와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 34의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 35, 항체 35의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 35의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 35와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 35의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 36, 항체 36의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 36의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 36과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 36의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
항체 37, 항체 37의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 37의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 서열을 포함하는 항체, 항체 37과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 CD5로의 항체 37의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항-CD5 항체 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 조성물.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 조성물 중 어느 하나의 결합 특성을 갖는 이특이적(bi-specific) 결합 분자에 관한 것이다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 조성물 또는 본 발명에 따른 이특이적 결합 분자를 활성 성분으로 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체 조성물 또는 본 발명에 따른 이특이적 결합 분자에 관한 것이다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 항체 조성물 또는 본 발명에 따른 이특이적 결합 분자의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 약제 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
한 추가 양태에서, 본 발명은,
- 진핵세포의 제 1 집단을 제 1의 별개의 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 제 1의 VH 및 VL 사슬의 동족쌍(cognate pair)을 포함하는 제 1의 항체를 코딩하는 제 1의 발현 작제물로 트랜스펙션시키는 단계;
- 진핵세포의 제 2 집단을 제 2의 별개의 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 제 2의 VH 및 VL 사슬의 동족쌍을 포함하는 제 2의 항체를 코딩하는 제 2의 발현 작제물로 트랜스펙션시키는 단계;
- 임의로, 제 3 또는 추가의 집단, 발현 작제물, 동족쌍 및 CD5 에피토프에 대해 상기 단계 b)를 반복하는 단계;
- 트랜스펙션된 제 1, 제 2 및 임의로 추가의 세포 집단을 선택하는 단계;
- 하나의 포트(pot)에 상기 트랜스펙션된 집단을 조합시켜 세포 은행을 수득하는 단계;
- 항체가 발현되도록 하는 조건 하에서 상기 세포 은행으로부터의 세포를 배양하는 단계; 및
- 상층액으로부터 항체 조성물을 회수하고 정제하는 단계를 포함하는, 항체 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 진핵 세포의 2개 이상의 하위집단(sub-population)을 포함하는 세포 은행에 관한 것으로, 상기 각각의 하위집단은 별개의 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 VH 및 VL 사슬의 동족쌍을 포함하는 항체를 코딩하는 하나의 발현 작제물로 트랜스펙션되거나 형질도입된다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 조성물 또는 본 발명에 따른 이특이적 결합 분자를 CD5 발현 세포에 투여함으로써 상기 CD5 발현 세포를 사멸시키는 것을 포함하여, CD5 발현 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 종속 청구항에 기재되어 있다.
정의
항체: 용어 "항체"는 혈청의 기능적 성분을 기재하며, 이는 분자의 집합물(항체 또는 면역글로불린) 또는 하나의 분자(항체 분자 또는 면역글로불린 분자)로 종종 언급된다. 항체 분자는 특정 항원성 결정인자(항원 또는 항원성 에피토프)에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 차례로 면역학적 효과기 메커니즘의 유도를 야기시킬 수 있다. 개별적 항체 분자는 보통 일특이적으로 간주되고, 항체 분자의 조성물은 모노클로날(즉, 동일한 항체 분자로 구성됨) 또는 폴리클로날(즉, 동일한 항원 또는 심지어 별개의 상이한 항원 상의 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 2개 이상의 상이한 항체 분자로 구성됨)일 수 있다. 각각의 항체 분자는 상응하는 항원에 특이적으로 결합하는 것을 가능하게 하는 독특한 구조를 갖고, 모든 자연 항체 분자는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄의 전체적으로 동일한 기본 구조를 갖는다. 항체는 또한 집합적으로 면역글로불린으로 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 항체 또는 항체들은 키메라 및 단일 사슬 항체, 뿐만 아니라 항체의 결합 단편, 예를 들어, Fab, Fv 단편 또는 scFv 단편, 뿐만 아니라 다합체 형태, 예를 들어, 이합체 IgA 분자 또는 5가 IgM을 포함한다. 항체는 인간, 뮤린, 키메라, 인간화, 또는 재형성(reshaped) 항체일 수 있다.
CDR: 용어 "상보성 결정 영역(CDR)"은 문헌[Lefranc et al (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol 27, 55-77]에 정의된 바와 같다. 용어 "재조합 폴리클로날 단백질의 별개의 일원"은 상이하나 동종성인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물의 한 단백질 분자를 나타내고, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자에 대해 동종성이나, 이는 또한 폴리클로날 단백질의 개별적 일원 사이에 아미노 서열의 차이를 특징으로 하는 가변 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유한다.
동족 VH 및 VL 코딩쌍: 용어 "동족 VH 및 VL 코딩쌍"은 동일한 항체 생성 세포 내에 함유되거나 이로부터 유래된 VH 및 VL 코딩 서열의 본래의 쌍을 기재한다. 따라서, 동족 VH 및 VL 쌍은 상기 세포가 유래되는 공여자에 본래 존재하는 VH 및 VL 쌍을 나타낸다. 용어 "VH 및 VL 코딩쌍으로부터 발현된 항체"는 항체 또는 항체 단편이 벡터, 플라스미드 또는 VH 및 VL 코딩 서열을 함유하는 유사물로부터 생성되는 것을 나타낸다. 완전한 항체 또는 이의 안정적인 단편으로 동족 VH 및 VL 코딩쌍이 발현되는 경우, 이들은 이들이 유래되는 세포로부터 본래 발현된 항체의 결합 친화성 및 특이성을 보존한다. 동족쌍의 라이브러리는 또한 동족쌍의 레퍼토리 또는 집합물로 언급되고, 이는 개별적으로 유지되거나 풀링(pooling)될 수 있다.
별개의 에피토프: 용어 "별개의 에피토프"는 에피토프를 구성하는 아미노산 서열이 상이한 것을 의미한다. 별개의 에피토프는 2개의 별개의 에피토프가 이의 아미노산 서열의 일부를 공유할 수 있는 중첩 에피토프일 수 있다.
에피토프: 용어 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 거대 분자 또는 거대 분자의 일부의 부분(예를 들어, 항원 또는 항원성 부위)을 기재하는데 사용된다. 면역원성 활성을 갖는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 유발하는 거대 분자의 일부이다. 항원성 활성을 갖는 에피토프는 당 분야에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 면역검정에 의해 결정시 항체가 면역특이적으로 결합하는 거대 분자의 일부이다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다. 항원은 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 독소, 바이러스, 박테리아, 단백질 또는 DNA이다. 항원 또는 항원성 부위는 종종 이들이 매우 작지 않는 한 하나 이상의 에피토프를 갖고, 이는 종종 면역 반응을 자극할 수 있다. 에피토프는 선형 또는 형태적일 수 있다. 선형 에피토프는 항체에 의해 인지되는 단백질 분자 상의 약 6 내지 10개의 인접한 아미노산으로 구성된다. 대조적으로, 형태 에피토프는 연속적으로 배열되지 않은 아미노산으로 구성된다. 본원에서, 항체는 3차원 구조만을 인지한다. 단백질 분자가 3차원 구조로 폴딩되는 경우, 에피토프를 형성하는 아미노산은 병렬되어 항체가 서열을 인지하는 것을 가능하게 한다. 변성된 단백질에서는, 선형 에피토프만이 인지될 수 있다. 자명한 일로서, 형태 에피토프는 폴딩된 단백질의 외부에 존재하여야 한다. 형태 에피토프를 인지하는 항체는 가벼운 비변성 절차하에서만 결합할 수 있다. 동일한 항원 상의 다양한 에피토프에 결합하는 항체는 에피토프의 위치에 따라 이들이 결합하는 항원의 활성에 대해 상이한 효과를 가질 수 있다. 항원의 활성 부위에서 에피토프에 결합하는 항체는 항원의 기능을 완전히 차단할 수 있는 반면, 상이한 에피토프에서 결합하는 또 다른 항체는 항원 단독의 활성에 영향이 없거나 거의 영향이 없을 수 있다. 그러나, 이러한 항체는 보체를 활성화시킴으로써 항원의 제거를 발생시킬 수 있고, 동일한 항원 상의 다양한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체와 조합되는 경우 상승작용적 효과를 발생시킬 수 있다. 본 발명에서, 에피토프는 바람직하게는 CD5의 세포외 도메인의 일부이다. 본 발명의 항원은 바람직하게는 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 세포외 도메인 CD5 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. CD5 결합 항원은 또한 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 CD5 폴리펩티드 또는 이의 단편의 세포외 도메인의 유사체 또는 유도체일 수 있다. 동일한 항원으로의 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있는 항체는 동일 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있거나, 서로 매우 근접한 결합 부위를 가질 수 있어, 경쟁은 입체 장애에 의해 주로 야기된다.
면역글로불린: 용어 "면역글로불린"은 보통 혈액 또는 혈청에서 발견된 항체의 혼합물의 집합적 명칭으로 사용되나, 이는 또한 다른 공급원으로부터 유래된 항체의 혼합물을 나타내는데 사용될 수 있다.
면역글로불린 분자: 용어 "면역글로불린 분자"는 개별적 항체 분자, 예를 들어, 면역글로불린의 일부, 또는 임의의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 조성물의 일부를 나타낸다.
중첩 에피토프: 본원에서 사용되는 용어 "중첩 에피토프"는 에피토프의 아미노산 서열이 중첩, 즉 에피토프가 둘 모두의 에피토프에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 공유하는 것을 의미한다. 항체 결합 중첩 에피토프는 서로 항원으로의 결합을 억제한다. 예를 들어, 제 2의 에피토프가 이미 제 2의 항체에 의해 결합된 경우 제 2의 에피토프와 중첩하는 제 1 에피토프로의 제 1 항체의 결합은 10% 이상, 예를 들어, 20% 이상, 예를 들어, 30% 이상, 예를 들어, 40% 이상, 예를 들어, 50% 이상, 예를 들어, 60% 이상, 예를 들어, 70% 이상, 예를 들어, 80% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 예를 들어, 100% 억제될 수 있다. 항체 쌍의 "중첩 에피토프"에 대한 분석은 통상적으로 CD5 및 개별적 형광 라벨링된 항체를 발현하는 세포에서의 FACS 분석, 또는 실시예에 기재된 바와 같이 플로우 셀 표면에 포획되거나 컨쥬게이션된 CD5 항원을 이용한 표면 플라즈몬 공명을 이용한 포화 항체 조건하에서의 결합 실험에 의해 결정된다.
폴리클로날 항체: 용어 "폴리클로날 항체"는 동일하거나 상이한 항원 상의 여러 상이한 특정 항원성 결정인자에 결합하거나 이와 반응할 수 있는 상이한 항체 분자의 조성물을 기재한다. 보통, 폴리클로날 항체의 가변성은 폴리클로날 항체의 소위 가변성 영역에 위치되는 것으로 생각된다. 그러나, 본 발명의 상황에서, 다클론성은 또한, 예를 들어, 인간 동형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 또는 뮤린 동형 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA과 같이 2개 이상의 항체 동형을 함유하는 항체의 혼합물의 경우에서와 같이 소위 불변 영역에 존재하는 개별적 항체 분자 사이의 차이를 기재하는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명의 목적상, 이러한 폴리클로날 항체는 또한 "항체 조성물"로 언급될 수 있다.
폴리클로날 단백질/다클론성: 본원에서 사용되는 용어 "폴리클로날 단백질" 또는 "다클론성"은 바람직하게는 면역글로불린 상과로부터 선택된 상이하나 상동성인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물을 의미한다. 따라서, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 상동성이나, 이는 또한 폴리클로날 단백질의 개별적 일원 사이의 아미노산 서열의 차이를 특징으로 하는 가변 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유한다. 이러한 폴리클로날 단백질의 공지된 예는 항체 또는 면역글로불린 분자, T-세포 수용체 및 B-세포 수용체를 포함한다. 폴리클로날 단백질은, 예를 들어, 요망되는 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체의 경우에서 요망되는 표적에 대한 공유된 결합 활성과 같은 공통의 특징에 의해 규정되는 단백질 분자의 규정된 서브셋으로 구성될 수 있다.
단백질/폴리펩티드: "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 길이 또는 전사후 변형에 관계 없이 아미노산의 임의의 사슬을 의미한다. 단백질은 2개 이상의 어셈블리된 폴리펩티드 사슬, 단백질의 단편, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 또는 펩티드를 포함하는 단량체 또는 다합체로 존재할 수 있다.
재조합 항체: 용어 "재조합 항체"는 세포와 자연적으로 관련되지 않은 항체의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포 또는 세포주로부터 발현되는 항체 분자 또는 여러 분자를 기재하는데 사용된다.
트랜스펙션: 용어 "트랜스펙션"은 본원에서 외래 DNA를 세포로 도입시키기 위한 광범위한 용어로 사용된다. 상기 용어는 또한 외래 DNA를 세포로 도입시키기 위한 다른 기능적으로 동등한 방법, 예를 들어, 형질전환, 감염, 형질유도 또는 공여 세포 및 수용체 세포의 융합을 포함하는 것을 의미한다.
가변 폴리펩티드 서열/가변 영역: 용어 "가변 폴리펩티드 서열" 및 "가변 영역"은 상호교환적으로 사용된다.
도면의 설명
도 1은 비장세포의 분류를 도시한다(상세히는 실시예 1 참조). 하기 게이트(gate)가 제조되었다(도시됨):
·게이트 1: 살아있는 세포(FSC/프로피디움 요오다이드 플롯).(하부 좌측 패널)
·게이트 2: 혈장 세포가 CD43 pos/CD138 pos로 게이팅된다.(하부 우측 패널)
·게이트 3: 이중 식별(상부 우측 패널)
도 2는 뮤린 - mSymplex™ PCR을 도시한다. 단일 세포로부터의 중쇄 및 경쇄 항체 유전자의 증폭 및 동족 결합을 위한 다중 중첩 신장 RT-PCR. 상세히는 실시예 1을 참조.
도 3은 뮤린 레퍼토리 클로닝을 도시한다. 단일 혈장세포로부터의 VH/VL 유전자쌍을 엔코딩하는 mSymplex™ PCR 생성물의 풀을 중첩 신장에 의한 스플라이싱에 의한 인간 카파 불변 경쇄를 엔코딩하는 유전자로 스플라이싱하였다. 완전한 인간-마우스 키메라 항체를 엔코딩하는 유전자의 풀을 발현 벡터에 삽입한 후, 양방향 프로모터 카세트(2xCMV)를 삽입하였다.
도 4는 포유동물 전장 항체 발현 벡터 00-VP-002의 개략적 설명을 도시한다. Amp 및 Amp pro, 앰피실린 내성 유전자 및 이의 프로모터; pUC 기점, 복제의 pUC 기점; CMV, 경쇄 및 중쇄의 발현을 구동시키는 포유동물 프로모터; IGHV 선도서열, 유전체 인간 중쇄 선도서열; H 스터퍼(stuffer), 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 서열과 교환되는 삽입물; IGHG1, 유전체 면역글로불린 동형 G1 중쇄 불변 영역을 엔코딩하는 서열(서열은 부록 2에 제시되어 있음); 토끼 B-글로빈 A, 토끼 베타-글로빈 폴리A 서열; IGKV 선도서열, 뮤린 카파 선도서열; L 스터퍼, 경쇄를 엔코딩하는 서열과 교환되는 삽입물; SV40 term, 원숭이 바이러스 40 종료자 서열; FRT, Flp 인지 표적 부위; Neo, 네오마이신 내성 유전자; SV40 폴리 A, 원숭이 바이러스 40 폴리 A 신호 서열.
도 5는 ELISA에서의 에피토프 맵핑(mapping)을 도시한다. 경쟁 ELISA로 결정시 CD5의 세포외 도메인에 특이적인 나열된 참조 항체를 이용한 항-CD5 항체의 억제의 정도. 억제 스코어링은 다음과 같다: 25 - 49%: 중간 경쟁 (+); 50 - 74%: 강한 경쟁 (++); 75 - 100%: 매우 강한 경쟁 (+++). *는 수행되지 않은 경쟁 실험을 나타낸다.
도 6은 비아코어(Biacore) 분석에 의해 결정시 CD5의 세포외 도메인에 특이적인 항-CD5 항체의 에피토프 맵을 도시한다. 생성된 항-CD5 항체 및 4개의 참조 항체에 대한 결합 부위의 평면도. 도에서의 수는 본 출원의 다른 곳에 나타낸 항체 수에 해당하는 항체 수이다.
도 7은 비아코어 분석에 의해 결정시 CD5의 세포외 도메인 상의 비중첩 에피토프에 특이적인 4개 항체의 동시 결합을 도시하는 센소그램(sensogram)을 도시한다. A) 전체 실험을 나타내는 센소그램. B) CD5의 세포외 도메인으로의 항-CD5 항체의 동시 결합에 초점을 둔 A로부터의 센소그램. 도에서의 수는 본 출원의 다른 곳에 나타낸 항체 수에 해당하는 항체수이다.
도 8은 유세포분석에 의해 결정된 CD5의 세포외 도메인 상의 비중첩 에피토프에 특이적인 4개 항체의 동시 결합을 나타내는 중첩 히스토그램을 도시한다. CEM 세포를 다음과 같이 염색하였다(항-CD5 항체, 선, 평균 형광 강도): 항체 없음, 실선, 7,29; 클론 12, 점선, 479,33; 클론 14, 점, 636,65; 클론 17, 점선 및 점(DashDot), 396,29; 클론 34, 점선 및 점 및 점(DashDotDot), 181,14; 클론 12,14,17 및 34의 혼합물, 회색으로 채워진 실선, 1292,72.
도 9는 4℃ 또는 37℃에서 밤새 나타낸 항체 혼합물로 처리된 세포의 평균 형광 강도(MFI)를 도시한다. 4℃에 비해 37℃에서의 MFI의 감소가 CD5 내재화를 나타낸다.
도 10은 지정된 기간 동안 지정된 항체 및 항체 혼합물로 처리된 CLL 세포(환자 31)에서의 CD5 수준의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 알파-튜불린을 로딩 대조군으로 포함시켰다.
발명의 상세한 설명
항체 혼합물
한 구체예에서, 본 발명은 2개 이상의 별개의 CD5 에피토프, 바람직하게는 비중첩 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 항체 분자를 포함하는 항체 조성물에 관한 것이다. 항체의 비중첩 특성은 CD5 발현 세포를 이용한 FACS 분석에서 차별적으로 라벨링된 항체를 이용하거나, 플로우 셀 표면에 포획되거나 컨쥬게이션된 CD5 항원을 이용한 표면 플라즈마 공명을 이용함으로써 결정될 수 있다. ELISA 기반의 방법이 또한 사용될 수 있다. 2개의 비중첩 CD5 에피토프에 결합하는 조성물이 광범위한 CD5 발현 세포에 대해 사용될 수 있는데, 이들이 CD5 형태에서의 차이에 덜 취약하고, 모노클로날 항체에 비해 돌연변이에 덜 취약할 수 있기 때문이다. 더욱이, 2개의 비중첩 CD5 에피토프에 결합하는 항체 조성물이 단일 에피토프를 표적으로 하는 조성물이 비해 우수한 효능을 제공할 수 있다.
모노클로날 항-CD5 항체 요법에 대해, 특정 비율의 환자는 항체 치료에 효과적으로 반응하지 않을 것이다. 상기 환자 일부에 대해, 이는 항체의 신속한 청소로 인한 것일 수 있거나, 항체가 환자에서 상기 항체에 대한 면역 반응을 발생시키기 때문이다. 일부 환자에 대해, 반응의 결핍이 있을 수 있는데, 이는 이들의 특정 CD5 발현 세포가 모노클로날 항체가 이의 에피토프에 결합할 수 없는 형태의 CD5를 발현하기 때문이다. 이는 당화에서의 차이, 도메인 결실, 또는 돌연변이 및/또는 SNP(들)로 인한 것일 수 있다.
항체가 CD5 상의 2개 이상의 별개의 에피토프에 결합할 수 있는 항체 조성물이 보다 광범위하게 적용될 수 있는데, 이는 둘 모두의 에피토프가 항체에 의해 인지되는 에피토프에 비해 변경될 가능성이 감소되기 때문이다. 더욱이, 모든 항체가 환자에 의해 청소될 가능성이 훨씩 적다.
광범위한 CD5 발현 세포 유형에 대한 개선된 임상 효능 및 광범위한 유용성을 위해, 조성물 내의 별개의 CD5 에피토프에 각각 결합하는 항체의 수가 증가될 수 있다. 따라서, 조성물은 3개의 비중첩 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 조성물은 4개의 비중첩 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 본 출원의 실시예는 4개 이상의 별개의 항체가 동시에 CD5에 결합할 수 있는 것을 나타낸다. 이는 항체를 신중하게 선택함으로써 4개 이상, 예를 들어, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 비중첩 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 조성물을 설계하는 것이 가능하거나 이러한 것이 유리한 것을 배제하지는 않는다.
또 다른 구체예에서, 조성물은 하나의 에피토프에 결합하는 1개 이상의 항체, 예를 들어, 상이하나 중첩인 에피토프에 결합하는 2개의 항체를 포함한다. 중첩 에피토프를 갖는 항체를 포함시키는 것이 유리할 수 있는데, 이는 이러한 것이 에피토프가 결합될 가능성을 증가시키기 때문이다. 이에 대한 하나의 이론적 설명은 일부 환자 및/또는 일부 암세포 내의 에피토프가 형태 변화 또는 돌연변이 또는 SNP로 인해 변경될 수 있기 때문이다. 이는 하나의 항체의 결합에 영향을 미칠 수 있으나, 이는 중첩 에피토프에 결합하는 또 다른 항체의 결합에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 더욱이, 항체 중 하나가 환자에 의해 청소될 위험이 있는데, 이는 항원으로 보여지기 때문이다. 상이하나 중첩인 에피토프에 결합하는 항체를 포함시킴으로써, 2개 항체 중 하나의 청소의 결과 및 에피토프에서의 돌연변이의 결과가 감소된다.
따라서, 한 구체예에서, 조성물은 상이하나 중첩인 에피토프에 결합하는 2개의 항체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 동일한 에피토프에 결합하는 2개의 별개의 항체 분자를 포함한다. 동일 또는 중첩 에피토프에 결합하는 항체는 동일하거나 상이한 동형일 수 있다.
따라서, 2개의 비중첩 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 항체 조성물은 3개, 4개, 5개 또는 6개의 별개의 항체 분자를 포함할 수 있어, 2개의 항체가 2개의 중첩 에피토프 또는 동일한 제 1 에피토프에 결합하고, 또 다른 항체는 제 2의 에피토프에 결합한다. 물론, 조성물은 중첩 에피토프에 결합할 수 있거나 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 2개 이상, 예를 들어, 3개 또는 4개의 항체 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 조성물에 포함된 항체의 전체 수는 각각의 에피토프에 대해 1개 이상의 항체를 가지거나, 중첩 에피토프를 갖는 여러 항체를 가짐으로써 6개를 초과할 수 있다. 조성물에 포함되는 각각의 추가 항체에 대해 항체의 전체 투여량을 일정하게 유지시킴으로써, 각각의 항체의 농도가 감소된다. 따라서, 허용되는 효능을 유지하면서 조성물 내에 포함될 수 있는 항체의 수를 제한하는 것이 예상된다. 표면 플라즈몬 공명 결합 연구로부터의 관찰 및 증식 검정으로부터의 관찰을 기초로 하고, 공격(challenge)을 제조하는 것으로 고려하여, 6, 7, 8, 9, 10개 이상으로 항체의 수를 증가시킴으로써 한정된(존재시) 추가 장점이 수득될 수 있다. 물론, 이는 조성물이 10개 이상, 예를 들어, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 항체, 예를 들어, 25개 이상의 항체, 예를 들어, 30개 이상의 항체, 예를 들어, 40개 이상의 항체, 예를 들어, 50개 이상의 항체를 포함하는 것을 배제하지 않는다.
바람직하게는, 조성물은 도메인 Ⅰ 에피토프에 결합하는 1개 이상의 항체를 포함하고, 이는 도메인 Ⅰ 에피토프에 결합하는 2개 이상의 항체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 도메인 Ⅱ 에피토프에 결합하는 1개 이상의 항체를 포함하고, 이는 도메인 Ⅱ 에피토프에 결합하는 2개 이상의 항체를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 조성물 내의 1개 이상의 항체는 도메인 Ⅲ 에피토프에 결합하고, 보다 바람직하게는 조성물은 도메인 Ⅲ 에피토프에 결합하는 2개 이상의 항체를 포함하고, 조성물은 또한 도메인 Ⅲ 에피토프에 결합하는 3개의 항체를 포함할 수 있다.
수용체 결합 연구는 일부 항체가 실제로 추가 항체의 결합을 자극할 수 있어, 1개 또는 여러개의 항체의 수용체 포화 후에 특정 항체가 수용체에 보다 많은 양으로 수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다. CD5에 대한 항체 조성물의 조성을 설계하는 경우, 비중첩 에피토프를 갖는 항체를 사용하는 것이 바람직한데, 이는 이들이 높은 상승작용적 효과를 제공하기 때문이다.
조성물의 항체는 비인간 가변 사슬 및 인간 불변 사슬을 갖는 키메라 항체일 수 있다. 비인간 가변 사슬은 마우스, 래트, 양, 돼지, 닭, 비인간 영장류 또는 다른 적합한 동물로부터 유래될 수 있다. 완전한 인간 항체를 수득하기 위해, 항체는 인간 항체 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물에서 생성될 수 있다. 항체는 또한 소위 인간화된 항체일 수 있고, 여기서 비인간 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된다.
바람직하게는, 인간 불변 사슬은 IgG1 또는 IgG2 동형이다. 더욱 바람직하게는, 조성물 내의 모든 항체는 제조의 용이성을 위해 동일한 동형을 갖는다. 그러나, 조성물 내에 상이한 동형의 항체를 포함시키는 것이 유리할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 조성물은 인간 CD5, 돌연변이된 인간 CD5, 및 인간 CD5의 결실 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 CD5에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 인간 및 비인간 영장류 CD5 둘 모두에 결합할 수 있어, 이들은 임상 실험 전에 관련 독물학 연구에서 시험될 수 있다. 바람직하게는, 비인간 영장류는 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스)이다. 시노몰구스 원숭이는 비교적 작은 동물이고, 독물학 연구에 매우 적합하다. 따라서, 추가의 영장류 CD5는 바람직하게는 시노몰구스 CD5이다. 바람직하게는, 항체는 인간 및 비인간 영장류 CD5에 대략 동일한 친화성으로 결합한다.
본 발명은 한 조성물에서 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8개의 항체를 조합시키는 경우에 하나 이상의 기능적 검정에서 보다 우수한 결과를 나타내었다. 이러한 데이터는 조성물 내의 항체의 수의 선택에 대한 지침을 제공하나, 이들은 한정된 방식으로 해석될 방법이 없다. 실험 데이터가 단지 4개 항체의 동시 결합을 나타내더라도, 조성물은 8개 이상의 항체를 포함할 수 있다. 조성물 내에 6개 이상의 항체를 포함시키는 다른 이유, 예를 들어, 항체 일원의 청소율에서의 차이가 존재할 수 있다.
조성물의 항체의 추가의 바람직한 특징은 단백질 균질성이어서, 항체는 용이하게 정제될 수 있다. 개별적 항체 일원에 대해, 1개의 명백한 피크를 갖는 이온 교환 크로마토그래피 프로파일이 특성규명의 용이성을 위해 바람직하다. 명료한 이온 교환 크로마토그래피 프로파일이 또한 최종 항체 조성물의 특성규명의 용이성에 바람직하다. 또한, 항체를 조합시키는 경우 이들을 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 식별될 수 있는 것이 바람직하여, 모든 항체를 갖는 조성물이 1회의 작업(run)으로 특성규명될 수 있다.
항체는 인간, 뮤린, 토끼, 닭, 돼지, 라마, 양 항체이거나, 이들 기원일 수 있다. 항체는 또한 실시예에 기재된 바와 같이 키메라일 수 있거나, 당 분야에 기재된 널리 공지된 방법을 이용하여 인간화된 항체, 초(super) 인간화된 항체 또는 이의 재형성된 형태일 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체 분자로부터 선택될 수 있다. 이러한 항체 분자의 CDR은 아미노산 서열 및 누클레오티드 서열 둘 모두로서 표 1에 제시되어 있다.
더욱이, 본 발명의 항체 조성물은 바람직하게는 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체 분자로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 2 내지 5개의 항체를 포함할 수 있다.
표 1: 항체 1-37의 CDR 영역의 아미노산 및 DNA 서열.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
표 2: 각각의 항체의 VL 사슬 아미노산 서열(">[항체 번호], SEQ ID NO:[NO]"의 포맷 내에 항체 명칭이 나열되고, 서열이 후속됨).
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
표 3: 각각의 항체의 VH 사슬 아미노산 서열(">[항체 번호], SEQ ID NO:[NO]"의 포맷 내에 항체 명칭이 나열되고, 서열이 후속됨).
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
표 4: 각각의 항체의 VL 사슬 누클레오티드 서열(">[항체 번호], SEQ ID NO:[NO]"의 포맷 내에 항체 명칭이 나열되고, 서열이 후속됨).
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
표 5: 각각의 항체의 VH 사슬 누클레오티드 서열(">[항체 명칭], SEQ ID NO:[NO]"의 포맷 내에 항체 명칭이 나열되고, 서열이 후속됨).
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
표 6: 불변 카파(경쇄) 및 중쇄 도메인의 누클레오티드 및 아미노산 서열.
Figure pct00026
표 7: 인간 CD5의 아미노산 서열.
Figure pct00027
표 8: 인간 CD5의 누클레오티드 서열.
Figure pct00028
Figure pct00029
표 13: 항-CD5 항체의 친화성.
Figure pct00030
에피토프 맵핑
CD5 분자는 세포질(세포내) 도메인, 막횡단 도메인 및 3개의 세포외 도메인(Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ)으로 구성된 막횡단 당단백질이다. 가장 아미노산 말단 도메인이고 세포막으로부터 멀리 떨어진 세포외 도메인 Ⅰ은 보통 CD5의 가장 면역원성인 도메인인 것으로 간주된다. 다수의 모노클로날 항체가 CD5의 도메인 Ⅰ에 대해 발생되었다. 그러나, CD5의 도메인 Ⅱ 및 Ⅲ은 도메인 Ⅰ보다 포유동물 종에서 보존되어 있다. 따라서, 도메인 Ⅱ 또는 Ⅲ 상의 보다 보존된 에피토프에 결합하는 항체는 일반적으로 돌연변이된 에피토프로 인한 결합 결핍을 회피하는데 바람직하다. 또한, 상이한 도메인 상의 별개의 에피토프를 인지하는 항체를 포함하는 조성물이 바람직하다. 이는 2개 이상의 이유가 적용된다. 첫째로, 상이한 도메인 상의 별개의 에피토프를 인지하는 항체를 포함하는 조성물이 에피토프의 돌연변이에 덜 민감하다. 둘째로, CD5 분자로의 다수의 항체의 동시 결합을 달성하는 것이 요망될 수 있다. 이는 상이한 도메인 상의 에피토프를 인지하는 항체가 발생할 가능성이 더 높다.
본 발명의 항체 조성물의 용도
본 발명의 조성물은 생체내 치료 및 CD5를 발현하는 세포와 관련된 질병의 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들어, 주사 및 항체 기반 임상 생성물에 대해 당 분야에 공지된 다른 투여 경로를 이용하여 치료적 유효량(예를 들어, 성장 억제, 식작용, 이동성의 감소, 말단 분화 및/또는 CD5를 발현하는 세포의 사멸을 발생시키는 투여량)으로 환자(예를 들어, 인간 피검체)에 투여된다.
CD5를 발현하는 세포를 포함하고, 본 발명의 항체를 이용하여 치료되고/되거나, 개선되고/되거나, 예방될 수 있는 질병은 암, 이식, 자가면역 질병 및 염증성 질병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의해 치료되는 질병은 CLL이다. 본 발명의 조성물은 또한 류머티스 관절염의 치료, 개선 또는 예방과 관련하여 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 급성 T 세포 백혈병, 피부 T 세포 림프종, 및 확산 거대 B 세포 림프종의 치료, 개선 또는 예방과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체의 생성
본 발명의 항체 조성물은 1개 또는 소수의 생물반응기 또는 이의 동등물에서 폴리클로날 발현 세포주로부터 생성될 수 있다. 상기 방법 후, 항-CD5 항체는 상기 과정 동안 항-CD5 항체 조성물을 구성하는 개별적 일원을 분리시킴이 없이 단일한 제조물로서 반응기로부터 정제될 수 있다. 항체 조성물이 1개 이상의 생물반응기에서 생성되는 경우, 정제된 항-CD5 항체 조성물은 각각의 생물반응기로부터의 개별적으로 정제된 상층액으로부터 수득된 항체를 풀링시킴으로써 수득될 수 있다.
재조합 항체 조성물을 생성시키는 한 방법은 WO2004/061104호 및 WO2006/007850호(이들 참조문헌은 참조로서 본원에 포함됨)에 기재되어 있다. 본원에 기재된 방법은 개별적 숙주 세포의 유전체로의 항체 코딩 서열의 부위 특이적 통합을 기초로 하여, VH 및 VL 단백질 사슬이 생성 동안 본래의 쌍으로 유지되는 것을 보장한다. 더욱이, 부위 특이적 통합은 위치 효과를 최소화시키고, 따라서 폴리클로날 세포주에서의 개별적 세포의 성장 및 발현 특성은 매우 유사한 것으로 예상된다. 일반적으로, 상기 방법은, ⅰ) 하나 이상의 재조합효소 인지 부위를 갖는 숙주 세포; ⅱ) 숙주 세포의 재조합효소 인지 부위와 양립가능한 하나 이상의 재조합효소 인지 부위를 갖는 발현 벡터; ⅲ) 스크리닝 벡터로부터 발현 벡터로 선택 VH 및 VL 코딩쌍을 전달하여, 전장 항체 또는 항체 단편이 벡터로부터 발현될 수 있는 발현 벡터의 집합물의 생성(상기 전달은 스크리닝 벡터가 발현 벡터와 동일한 경우에 필요하지 않을 수 있음); ⅳ) 발현 벡터 및 숙주 세포의 유전체 내의 재조합효소 인지 부위와 벡터 내의 재조합효소 인지 부위를 조합시킬 수 있는 재조합효소를 코딩하는 벡터의 집합물을 이용한 숙주 세포의 트랜스펙션; ⅴ) 트랜스펙션된 숙주 세포로부터의 폴리클로날 세포주의 수득/생성, 및 ⅵ) 폴리클로날 세포주로부터의 항체 조성물의 발현 및 수집을 포함한다.
한 조성물에 대해 적은 수(2-3개 이상)의 항체가 사용되는 경우, 이들은 모노클로날 항체의 제조와 유사한 방식, 예를 들어, WO 2004/085474호에 기재된 바와 같이 발현되고 정제될 수 있다. 정제된 항체는 정제 후에 혼합될 수 있거나, 투여 전의 혼합 또는 별개의 투여를 위해 별개의 바이얼로 패키징될 수 있다.
바람직하게는, 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포(예를 들어, Sp2/0 또는 NSO 세포), 섬유모세포, 예를 들어, NIH 3T3, 및 무한증식 인간 세포, 예를 들어, HeLa 세포, HEK 293 세포, 또는 PER.C6이 사용된다. 그러나, 비포유동물 진핵세포 또는 원핵세포, 예를들어, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 진균, E. 콜리(E. coli) 등이 또한 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 이의 유전체 내에 하나 이상의 적합한 재조합효소 인지 부위를 포함한다. 숙주 세포는 또한 통합체에 대해 선택될 수 있도록 하기 위해 통합 부위에 작동가능하게 연결되는 선택 방식을 함유하여야 한다(즉, 통합 부위 내에 항-CD5 Ab 발현 벡터 또는 발현 벡터 단편의 통합된 카피를 갖는 세포). 유전체의 소정의 위치에 FRT 부위를 갖는 세포의 제조가, 예를 들어, US 5,677,177호에 기재되어 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 통합체의 높은 발현을 허용하는 부위(소위, 핫-스팟(hot-spot))에 위치되는 단일한 통합 부위만을 갖는다.
적합한 발현 벡터는 숙주 세포의 재조합효소 인지 부위(들)과 매칭되는 재조합 인지 부위를 포함한다. 바람직하게는, 재조합효소 인지 부위는 숙주 세포의 작제에 사용된 선택 유전자와 상이한 적합한 선택 유전자에 연결된다. 선택 유전자는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 글루타민 합성효소 유전자(GS), 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR), 및 네오마이신을 포함하고, 여기서 GS 또는 DHFR이 삽입된 VH 및 VL 서열의 유전자 증폭에 사용될 수 있다. 벡터는 또한 벡터의 완전한 통합 대신 항체 코딩 서열의 재조합효소 매개 카세트 교환(recombinase-mediated cassette exchange, RMCE)을 가능케 하는 2개의 상이한 재조합효소 인지 부위를 함유할 수 있다. RMCE는 문헌[Langer et al 2002; Schlake and Bode 1994]에 기재되어 있다. 적합한 재조합효소 인지 부위는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 FRT, lox 및 attP/attB 부위를 포함한다. 바람직하게는, 통합 벡터는 스크리닝 벡터로부터의 VH 및 VL 코딩쌍의 전달 전에 벡터에 불변 영역(바람직하게는, 인트론을 포함함)이 존재하는 동형 엔코딩 벡터이다(또는 불변 영역은 스크리닝이 전장 항체에서 수행되는 경우 스크리닝 벡터에 이미 존재한다). 벡터에 존재하는 불변 영역은 전체 중쇄 불변 영역(CH1 내지 CH3 또는 CH4) 또는 항체의 Fc 부분을 엔코딩하는 불변 영역(CH2 내지 CH3 또는 CH4)일 수 있다. 경쇄 카파 또는 람다 불변 영역이 또한 전달 전에 존재할 수 있다. 존재시, 존재하는 불변 영역의 수의 선택은 사용되는 스크리닝 및 전달 시스템에 좌우된다. 중쇄 불변 영역은 동형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로부터 선택될 수 있다. 바람직한 동형은 IgG1, IgG2 및/또는 IgG3이다. 추가로, 항-CD5 항체를 엔코딩하는 핵산의 부위 특이적 통합을 위한 발현 벡터는 VH 및 VL 사슬 각각의 높은 수준의 발현을 유도하는 적합한 프로모터 또는 동등한 서열을 함유한다.
스크리닝 벡터로부터의 선택 VH 및 VL 코딩쌍의 전달은 통상적인 제한 효소 절단 및 라이게이션에 의해 수행될 수 있고, 각각의 발현 벡터 분자는 하나의 VH 및 VL 코딩쌍을 함유한다. 바람직하게는, VH 및 VL 코딩쌍은 개별적으로 전달되나, 이들은 또한 요망시 한 덩어리(in-mass)로 전달될 수 있다. 모든 선택된 VH 및 VL 코딩쌍이 발현 벡터로 전달되는 경우, 발현 벡터의 집합물 또는 라이브러리가 수득된다. 전달의 대안적 방식이 또한 요망시 사용될 수 있다. 스크리닝 벡터가 발현 벡터와 동일한 경우, 발현 벡터의 라이브러리는 스크리닝 동안 선택된 VH 및 VL 서열쌍으로 구성되며, 이는 스크리닝/발현 벡터에 위치된다.
숙주 세포로 핵산 서열을 트랜스펙션시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 부위 특이적 통합을 보장하기 위해, 적합한 재조합효소가 또한 숙주 세포에 제공되어야 한다. 이는 바람직하게는 재조합효소를 엔코딩하는 플라스미드의 공동 트랜스펙션에 의해 달성된다. 적합한 재조합효소는, 예를 들어, 상응하는 재조합효소 인지 부위를 갖는 숙주 세포/벡터 시스템과 함께 사용되는 Flp, Cre 또는 파아지 ΦC31 인테그라아제이다. 숙주 세포는 대량(bulk)으로 트랜스펙션될 수 있고, 이는 발현 벡터의 라이브러리가 하나의 단일 반응으로 세포주로 트랜스펙션됨으로써, 폴리클로날 세포주가 수득되는 것을 의미한다. 대안적으로, 발현 벡터의 수집물은 숙주 세포로 개별적으로 트랜스펙션될 수 있음으로써, 개별적 세포주의 수집물이 생성될 수 있다(각각의 세포주는 특정한 특이성을 갖는 항체를 생성함). 트랜스펙션 후에 생성된 세포주(개별적 또는 폴리클로날)는 이후 부위 특이적 통합체에 대해 선택되고, 이들이 트랜스펙션 전에 이미 상기 특성을 갖지 않는 경우에 현탁액 및 혈청 비함유 배지에서 성장하도록 적합된다. 트랜스펙션이 개별적으로 수행된 경우, 개별적 세포주는 이의 성장 특성 및 항체 생성과 관련하여 추가로 분석된다. 바람직하게는, 유사한 증식 속도 및 항체 발현 수준을 갖는 세포주가 폴리클로날 세포주의 생성을 위해 선택된다. 이후, 폴리클로날 세포주는 소정의 비로 개별적 세포주를 혼합시킴으로써 생성된다. 일반적으로, 폴리클로날 마스터 세포 은행(polyclonal master cell bank, pMCB), 폴리클로날 연구 세포 은행(polyclonal research cell bank, pRCB) 및/또는 폴리클로날 작업 세포 은행(polyclonal working cell bank, pWCB)이 폴리클로날 세포주로부터 제작된다. 폴리클로날 세포주는 개별적 세포주를 소정의 비로 혼합시킴으로써 생성된다. 폴리클로날 세포주는 앰풀로 분배됨으로써, 폴리클로날 연구 세포 은행(pRCB) 또는 마스터 세포 은행(pMCB)이 생성되고, 폴리클로날 작업 세포 은행(pWCB)이 연구 또는 마스터 세포 은행으로부터 세포를 확장시킴으로써 생성될 수 있다. 연구 세포 은행은 주로 개념 연구의 증명용이고, 여기서 폴리클로날 세포주는 마스터 세포 은행에서의 폴리클로날 세포주만큼 많은 개별적 항체를 포함하지 않을 수 있다. 일반적으로, pMCB는 생성 목적을 위해 pWCB를 제작하기 위해 추가로 확장된다. pWCB가 소모된 후, pMCB로부터의 신규한 앰풀이 확장되어 신규한 pWCB를 제작할 수 있다.
본 발명의 한 구체예는 본 발명의 재조합 항-CD5 항체 조성물을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주이다.
본 발명의 한 추가 구체예는 폴리클로날 세포주이며, 여기서 각각의 개별적 세포는 단일한 VH 및 VL 코딩쌍을 발현할 수 있고, 전체로서 폴리클로날 세포주는 VH 및 VL을 엔코딩하는 쌍의 집합물을 발현할 수 있고, 여기서 각각의 VH 및 VL 쌍은 항-CD5 항체를 엔코딩한다. 바람직하게는, VH 및 VL 코딩쌍의 집합물은 본 발명의 방법에 따라 생성된 동족쌍이다.
본 발명의 재조합 항체 조성물은 항체의 충분한 발현을 가능케 하고, 폴리클로날 세포주가 안정적인 채로 유지되는 기간(범위는 대략 15일 내지 50일임) 동안 적절한 배지 중에서 pWCB로부터의 한 앰풀을 배양함으로써 제조될 수 있다. 유가 배양(fed batch) 또는 관류와 같은 배양 방법이 이용될 수 있다. 재조합 항체 조성물이 배지로부터 수득되고, 통상적인 정제 기술에 의해 정제된다. 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 및 겔 여과와 같은 이후의 정제 단계와 조합된 친화성 크로마토그래피가 종종 IgG의 정제에 사용되었다. 정제 후, 폴리클로날 항체 조성물 중의 모든 개별적 일원의 존재가, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가된다. 이러한 항체 조성물의 특징은 WO 2006/007853호(본원에 참조로서 포함됨)에 상세히 기재되어 있다.
재조합 숙주에서 항체의 혼합물을 발현시키는 대안적 방법이 WO 2004/009618호에 기재되어 있다. 이러한 방법은 단일한 세포주로부터의 동일한 경쇄와 관련된 상이한 중쇄를 갖는 항체를 생성한다. 항-CD5 항체 조성물이 조합 라이브러리로부터 생성되는 경우에 상기 방법이 적용가능할 수 있다.
치료 조성물
본 발명의 또 다른 양태는 활성 성분으로서 본 발명의 항-CD5 항체 조성물 또는 항-CD5 재조합 Fab 또는 또 다른 항-CD5 재조합 항체 단편 조성물, 또는 이특이적 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물이다. 바람직하게는, 이러한 조성물의 활성 성분은 본 발명에 기재된 바와 같은 항-CD5 재조합 항체 조성물이다. 이러한 조성물은 암, 예를 들어, CLL의 개선 및/또는 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 또한, 이러한 조성물은 류머티스 관절염의 개선 및/또는 예방 및/또는 치료를 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 약제 조성물은 인간, 가축, 또는 애완동물에 투여된다.
약제 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
항-CD5 항체 조성물 또는 이의 항체 단편은 단위 투여 형태로 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제 내에서 투여될 수 있다. 환자에 투여하기에 적합한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 약학적 실시가 이용될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 투여는 치료용 투여이고, 이는 질환이 진단된 후에 투여되는 것을 의미한다. 임의의 적합한 투여 경로가 이용될 수 있고, 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 근내, 복막내, 비내, 에어로졸, 좌약, 또는 경구 투여일 수 있다. 예를 들어, 약제 제형은 액체 용액 또는 좌약의 형태일 수 있다. 비내 제형을 위해, 항체는 분말, 비내 점적, 또는 에어로졸의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 그 자체로 공지된 방식, 예를 들어, 통상적인 용해, 동결건조, 혼합, 과립화 또는 당제화(confectioning) 방법에 의해 제조된다. 약제 조성물은 통상적인 약학적 실시에 따라 제형화될 수 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NY 참조).
바람직하게는, 활성 성분의 용액 또는 현탁액, 특히 등장성 수용액 또는 현탁액이 본 발명의 약제 조성물을 제조하는데 사용된다. 활성 성분을 단독으로 또는 담체, 예를 들어, 만니톨과 함께 포함하는 동결건조된 조성물의 경우, 이러한 용액 또는 현탁액은 가능하다면 사용 전에 생성될 수 있다. 약학적 조성물은 멸균되고/되거나, 부형제, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 및/또는 에멀젼화제, 용해화제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있고, 이는, 예를 들어, 통상적인 용해 또는 동결건조 방법에 의해 그 자체로 공지된 방식으로 제조된다. 상기 용액 또는 현탁액이 점성도 증가 물질, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 포함할 수 있다.
주사 조성물은 멸균 조건하에서 통상적인 방식으로 제조되고; 이는 또한 앰풀 또는 바이얼로 조성물을 도입시키고, 용기를 밀봉시키기 위해 적용된다.
약제 조성물은 약 1% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 90%의 활성 성분을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 예를 들어, 단위 투여 형태, 예를 들어, 앰풀, 바이얼, 좌약, 정제, 환약 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 제형은 질병 또는 질환에 대한 요법을 제공하기 위한 치료적 또는 예방적 유효량(예를 들어, 병리 질환을 예방하거나, 제거하거나, 감소시키는 양)으로 인간 개체에 투여될 수 있다. 투여되는 치료제의 바람직한 투여량은 질병의 중증도, 특정 환자의 전체 건강 상태, 화합물 부형제의 제형, 및 투여 경로와 같은 요인에 좌우될 가능성이 있다.
진단적 용도
본 발명의 또 다른 구체예는 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따라 제조된 항-CD5 항체 조성물을 포함하며, 여기서 단백질은 검출가능한 라벨로 라벨링될 수 있거나, 비-라벨 검출을 위해 라벨링되지 않을 수 있다. 키트는 CD5의 과다발현과 관련된 암에 걸린 개체를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 조성물
한 양태에서, 본 발명은 별개의 도메인 Ⅰ 에피토프에 결합할 수 있는 3개 이상, 예를 들어, 3개 또는 4개 이상, 예를 들어, 4개 또는 5개 이상, 예를 들어, 5개 또는 6개 이상, 예를 들어, 6개의 항-CD5 항체를 포함하는 항체에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 별개의 에피토프는 도메인 Ⅰ의 비중첩 에피토프이다.
한 양태에서, 본 발명은 별개의 에피토프에 결합할 수 있는 3개 이상, 예를 들어, 3개 또는 4개 이상, 예를 들어, 4개 또는 5개 이상, 예를 들어, 5개 또는 6개 이상, 예를 들어, 6개의 항-CD5 항체를 포함하는 항체 조성물에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 별개의 에피토프는 비중첩 에피토프이다.
한 양태에서, 본 발명은 별개의 에피토프에 결합하는 항-CD5 항체의 하기 조성물로부터 선택된 항체 조성물에 관한 것이다:
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높은 CD5 친화성 항체를 포함하는 본 발명의 조성물
한 양태에서, 본 발명의 항체 조성물의 항-CD5 항체는 본원의 표 13에 따른 CD5 친화성에 대해 선택된다. 한 양태에서, 항체 조성물은 CD5에 대해 비교적 높은 친화성을 갖는 항체를 포함한다.
본 발명의 항체 조성물 및 CD5 내재화
한 양태에서, 본 발명의 항체 조성물은 CD5를 내재화시킬 수 있다. CD5의 내지화는 CD5의 분해를 발생시킬 수 있다. CD5의 내재화는 CD5로부터의 신호전달 다운스트림을 효과적으로 차단함으로써, CD5 신호전달을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 조성물로 CD5를 표적화함으로써 CD5 기능이 효과적으로 차단될 수 있고, 상기 항체 조성물은 CD5를 내재화시킬 수 있고, 임의로 이후에 CD5의 세포내 분해를 야기시킬 수 있다.
CLL에서, 이러한 병상은 현저히 느리게 분열하는 CD5 양성 B 림프구의 축적을 특징으로 한다. 상기 축적은 대개 과도한 증식이 아닌 세포의 증가된 (병리학적) 생존에 의한 것이다. 세포의 증가된 생존은 적어도 부분적으로는 프로그램화된 세포 사멸(아폽토시스)를 겪는데 실패함에 의한 것이다. 이러한 아폽토시스의 동일한 실패는 화학요법에 대한 CLL의 선천적 내성의 원인이 된다. CLL의 병상을 극복하기 위한 한 방법은 축적된 세포의 청소를 야기시키는 것이다. 현재의 요법은 환자 자신의 혈액의 일부를 분리시켜, 축적된 세포의 일부를 제거하고, 축적 세포가 없는 공여자 혈액을 복귀시키는 것을 포함할 수 있다. 축적된 세포와 관련하여, CD5의 내재화 및 분해는 세포의 현저한 청소를 발생시키지 않을 가능성이 높을 것이다. 따라서, CD5의 내재화를 야기시킬 수 있는 본 발명의 조성물은 이러한 양태에 바람직하지 않다. 그러나, CD5의 내재화 및 분해와 관련된 다른 긍정적인 효과가 있을 수 있다. 이러한 경우, 내재화를 야기시키는 조성물이 이로울 수 있다.
CD5를 내재화시킬 수 있는 항체 조성물은 항체 조합물 9+14+15+17+18+31, 9+14+15+17+18, 9+15+18+31, 9+15+18을 포함하는 항-CD5 항체 조성물로부터 선택될 수 있다.
CD5를 분해시킬 수 있는 항체 조성물은 항체 조합물 9+14+15+17+18+31 및 9+15+18을 포함하는 항-CD5 항체 조성물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 및 CD5 양성 세포의 청소
한 양태에서, 본 발명의 조성물의 항체의 CD5로의 결합은 CD5를 내재화시키지 않는다. 이러한 방식에서, 상기 항체에 의해 결합된 CD5는 CD5 양성 세포의 표면에 남아 있어, 이에 따라, 예를 들어, 효과기 메커니즘 ADCC 및 CDC에 의한 세포의 청소를 가능케 한다. 청소되는 CD5 양성 세포를 수득하기 위해 상기 효과기 메커니즘이 효력을 발생하도록 하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 항체 조성물을 사용하는 것이 이로울 수 있고, 상기 조성물의 항체는 상기 항체가 CD5에 결합된 후에 CD5 양성 세포의 표면에 남아있다.
상기 본원에 논의된 바와 같이, CLL은 세포의 병리적 축적을 특징으로 한다. 이러한 축적은 CD5의 내재화를 야기시킬 수 없어, 예를 들어, 효과기 메커니즘 ADCC 및 CDC에 의한 세포의 청소를 발생시킴으로써 치료될 수 있다. 따라서, CD5 내지화를 발생시키지 않는 본 발명의 조성물을 사용함으로써, CD5 양성 세포는 ADCC 및 CDC와 같은 효과기 메커니즘에 의해 특이적으로 표적화되어, 이에 따라 신체로부터 청소될 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 아폽토시스를 겪는 CD5 양성 림프구의 실패에 의해 야기된 축적을 역작용(counter)시킬 수 있다. 따라서, CD5 양성 B 림프구의 청소를 야기시킬 수 있는 본 발명의 조성물, 예를 들어, CD5를 내재화시키지 않는 조성물이 바람직하다.
조성물의 항체의 CD5로의 결합이 CD5의 내재화를 발생시키지 않는 항체 조성물이 항체 조합물 14+17, 및 17+18을 포함하는 항-CD5 항체 조성물로부터 선택될 수 있다.
CD5 분해를 야기시킬 수 없는 항체 조성물은 항체 14+17을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 항- CD5 항체의 클로닝
면역화
CD5-인간 성장 호르몬(hGH) 융합 단백질을 이용한 주사에 의한 면역화를 위해 암컷 BALB/c, 계통 A(8-10주령)를 사용하였다. 모든 면역화를 위해 사내 제조된 재조합 CD5 세포외 도메인(ECD)을 사용하였다. 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus, TEV) 절단 부위에 의해 분리된 CD5의 ECD 및 인간 성장 호르몬(hGH)으로 구성된 융합 단백질로서 CD5-ECD를 생성시켰다.
CD5-hGH를 PBS에 희석시킨 후, 프로인트(Freund) 애쥬번트와 1:1로 혼합시켰다. 면역 반응을 향상시키고 조절하기 위해 애쥬번트를 사용하였다. 첫번째 면역화를 위해, 완전 프로인트 애쥬번트(CFA)를 사용한 반면, 이후의 면역화에 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA)를 사용하였다. IFA는 광유로 구성된 수중유 에멀젼이고, CFA는 가열 사멸된 건조 미코박테리움 종이 첨가된 IFA이다. 둘 모두의 애쥬번트는 데포(depot) 효과를 갖는다. CFA는 면역 반응의 장기 지속을 발생시키고, 면역 반응을 부스팅시키기 위해 첫번째 면역화에 사용되며, IFA는 이후의 면역화에 사용된다. 물을 가진 유리의 표면 상에 점적을 첨가함으로써 에멀젼을 시험하였다. 점적이 하나의 점적으로 유지되는 경우, 에멀젼은 안정적이며 주사가 수행될 수 있다. 안정적인 에멀젼만을 마우스에 투여하였다. 각각의 주사에 50 μg CD5-hGH를 사용하였다. 전부, 마우스에 4회 주사하였다. 모든 마우스를 100 μl 에멀젼으로 주사하였다. 주사를 피하(s.c) 주사하였다.
종료시, 마우스를 힙노름-도미쿰(Hypnorm-Dormicum)의 주사에 의해 6일에서 희생시키고, 비장을 분리시키고, 74 μm 세포 여과기(cell strainer)(Corning#136350-3479)로 옮겼다. 세포를 필터를 통해 잘게 부수고, 10% FBS를 갖는 저온 RPMI 1640에 재현탁시키고, 5분 동안 300Xg에서 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 1% FBS를 갖는 RPMI 1640에 재현탁시키고, 50 μm 주사기 필터(BD# 340603)를 통해 여과시키고, 원심분리에 의해 수집하였다. 세포 펠렛을 10% DMSO를 갖는 FCS 중의 재현탁 후에 동결건조시키고, 동결된 세포를 FACS 분류때까지 -80℃에 저장하였다.
뮤린 혈장 세포의 FACS 분류
동결된 비장세포를 갖는 바이얼을 37℃에서 해동시키고, 얼음이 여전히 존재하는 15 ml 튜브로 옮겼다. 10 ml 얼음 냉각 RPMI, 10% FBS(우태아 혈청)를 스월링(swirling)과 함께 튜브에 적가하였다. 10 ml FACS PBS에서의 1회 세척 후, 5 ml FCS PBS를 첨가하고, 세포를 50 μm Filcon을 통해 여과시켰다. 이후, 세포를 펠렛화시키고, 2% FBS(최종 부피)를 갖는 1 ml PBS에 재현탁시키고, 특정 희석(약 5 μg/ml)에 따른 항-CD43-FITC 및 항-CD138-PE로 염색하였다. 세포를 어두운 곳에서 20분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 2 ml FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 15 ml 이하의 FACS PBS를 첨가하였다. 프로피디움 요오다이드(PI)를 1:100으로 첨가하고, 세포를 이후 PCR 반응 완충액(하기 참조)을 함유하는 96 웰 PCR-플레이트로 분류시키고, 400Xg로 2분 스핀 다운시키고, 플레이트를 -80℃에서 동결시켰다. 혈장 세포를 도 1에 도시된 바와 같이 CD43-양성/CD-138 양성으로 게이팅(gating)시켰다.
동족 VH 및 VL 쌍의 연결
VH 및 VL 코딩 서열의 연결을 혈장 세포로 게이팅된 단일 세포 상에서 수행하여, VH 및 VL 코딩 서열의 동족 페어링(pairing)을 촉진시켰다. 상기 절차는 1단계의 다중 중첩 신장 RT-PCR 후의 네스티드 PCR을 기초로 한 2단계의 PCR 절차를 사용하였다. 본 실시예에 사용된 프라이머 혼합물은 카파 경쇄만 증폭시킨다. 그러나, 요망시 람다 경쇄를 증폭시킬 수 있는 프라이머가 다중 프라이머 혼합물 및 네스티드 PCR 혼합물에 첨가될 수 있다. 람다 프라이머가 첨가되는 경우, 분류 절차는 람다 양성 세포가 배제되지 않도록 적합되어야 한다. 동족 VH 및 VL 서열의 연결을 위한 원리는 도 2에 예시되어 있다.
생성된 96-웰 PCR 플레이트를 해동시키고, 분류된 세포를 다중 중첩 신장 RT-PCR을 위한 주형으로 제공하였다. 단일 세포 분류 전에 각각의 웰에 첨가된 분류 완충액은 반응 완충액(OneStep RT-PCR 완충액; Qiagen), RT-PCR용 프라이머(표 10 참조) 및 RNase 억제제(RNasin, Promega)를 함유하였다. 20-μl 반응 부피에서 제공된 최종 농도를 수득하기 위해 OneStep RT-PCR 효소 혼합물(25x 희석; Qiagen) 및 dNTP 혼합물(각각 200 μM)을 보충하였다. 플레이트를 55℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 각각의 웰로부터 RNA를 역전사시켰다. RT 후, 플레이트를 다음과 같은 PCR 주기에 적용시켰다: 94℃에서 10분, 35x(94℃에서 40초, 60℃에서 40초, 72℃에서 5분), 72℃에서 10분.
고처리량을 촉진시키기 위해 PCR 반응을 24개의 96-웰 플레이트(ABgene)에 대해 필 실 배스킷(Peel Seal Basket)을 갖춘 H20BIT 써멀 사이클러(Thermal cycler)에서 수행하였다. PCR 플레이트를 주기 후에 -20℃에 저장하였다.
네스티드 PCR 단계를 위해, 제공된 최종 농도를 수득하기 위해 각각의 웰(20-μl 반응)에 다음과 같은 혼합물을 갖는 96-웰 PCR 플레이트를 제조하였다: 1x 패스트스타트(FastStart) 완충액(Roche), dNTP 혼합물(각각 200 μM), 네스티드 프라이머 혼합물(표 11 참조), 퓨젼(Phusion) DNA 중합효소(0.08 U; Finnzymes) 및 패스트스타트 고 정확도 효소 블렌드(0.8 U; Roche). 네스티드 PCR을 위한 주형으로서, 1 μl를 다중 중첩 신장 PCR 반응물로부터 옮겼다. 네스티드 PCR 플레이트를 다음과 같은 열주기에 적용시켰다: 35x(95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 90초), 72℃에서 10분.
무작위로 선택된 반응물을 약 890 염기쌍(bp)의 중첩-신장 단편의 존재를 확인하기 위해 1% 아가로오스 겔 상에서 분석하였다. 플레이트를 PCR 단편의 추가 가공때까지 -20℃에서 저장하였다. 상이한 공여자로부터의 쌍을 혼합시키지 않으면서 네스티드 PCR로부터의 연결된 VH 및 VL 코딩쌍의 레퍼토리를 풀링시키고, 이를 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 인간 카파 불변 경쇄를 엔코딩하는 서열을 중첩 신장에 의해 연결된 VH 및 VL 코딩쌍의 풀링된 PCR 생성물의 VL 코딩 영역으로 스플라이싱시켰다(도 3). 인간 카파 불변 경쇄를 엔코딩하는 서열을 50 μl의 전체 부피 중에 퓨젼(Phusion) 효소(2 U; Finnzymes), 1x 퓨젼 완충액, dNTP 혼합물(각각 200 μM), hKCforw-v2 프라이머 및 카파3' 프라이머(표 12), 및 플라스미드 주형 pLL138(10 ng/μl)을 함유하는 반응물 중에서 카파 경쇄를 갖는 인간 항체의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드로부터 증폭시켰다. 반응물을 다음과 같은 열주기에 적용시켰다: 25x(95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초), 72℃에서 10분. 생성된 PCR 단편을 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하였다.
각각의 레퍼토리의 정제된 풀링된 PCR 단편을 인간 카파 불변 엔코딩 영역 단편(1.4 ng/μl), 정제된 풀링된 PCR 단편(1.4 ng/μl), 퓨젼(Phusion) DNA 중합효소(0.5 U; Finnzymes) 및 패스트스타트 고 정확도 효소 블렌드(0.2 U; Roche), 1x 패스트스타트 완충액(Roche), dNTP 혼합물(각각 200 μM), mhKCrev 프라이머 및 mJH 세트 프라이머를 함유하는 중첩 신장 PCR(50 μl 전체 부피)에 의한 스플라이싱에 의해 인간 카파 불변 엔코딩 영역(부록 2)의 증폭되고 정제된 PCR 단편으로 스플라이싱시켰다(표 12 참조). 반응물을 다음과 같은 열주기에 적용시켰다: 95℃에서 2분, 25x(95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분), 72℃에서 10분. 생성된 PCR 단편을 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제시켰다.
스크리닝 벡터로의 동족 VH 및 VL 코딩쌍의 삽입
CD5에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 확인하기 위해, 수득된 VH 및 VL 코딩 서열을 전장 항체로 발현시켰다. 이는 발현 벡터로의 VH 및 VL 코딩쌍의 레퍼토리의 삽입 및 숙주 세포로의 형질전환을 포함하였다.
결합된 VH 및 VL 코딩쌍을 함유하는 발현 벡터의 레퍼토리의 생성을 위해 2단계의 클로닝 절차를 사용하였다. 통계적으로, 발현 벡터의 레퍼토리가 스크리닝 레퍼토리의 생성에 사용되는 동족의 쌍을 이룬 VH 및 VL PCR 생성물의 수보다 10배 많은 재조합 플라스미드를 함유하는 경우, 모든 독특한 유전자쌍이 제시될 가능성이 99%이다. 따라서, 400개의 중첩 신장 V-유전자 단편이 수득된 경우, 4000개 이상의 클론의 레퍼토리가 스크리닝을 위해 생성되었다.
간단히, 인간 카파 불변 코딩 영역에 스플라이싱된, 연결된 VH 및 VL 코딩쌍의 레퍼토리의 정제된 PCR 생성물을 PCR 생성물의 말단으로 도입된 인지 부위에서 XhoⅠ 및 NotⅠ DNA 엔도누클레아제로 절단시켰다. 절단되고 정제된 단편을 표준 라이게이션 절차에 의해 XhoⅠ/NotⅠ 절단된 포유동물 IgG 발현 벡터, OO-VP-002(도 4)에 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 E. 콜리로 전기영동시키고, 적절한 항생제를 함유하는 2xYT 플레이트에 첨가하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 벡터의 증폭된 레퍼토리를 표준 DNA 정제 방법(Qiagen)을 이용하여 플레이트로부터 회수된 세포로부터 정제하였다. AscⅠ 및 NheⅠ 엔도누클레아제를 이용한 절단에 의한 프로모터-선도서열 단편의 삽입을 위한 플라스미드를 제조하였다. 상기 효소에 대한 제한 부위는 VH 및 VL 코딩 유전자쌍 사이에 위치되어 있다. 벡터의 정제 후, AscⅠ-NheⅠ 절단된 양방향성 포유동물 프로모터-선도서열 단편을 표준 라이게이션 절차에 의해 AscⅠ 및 NheⅠ 제한 부위로 삽입하였다. 라이게이션된 벡터를 E. 콜리에서 증폭시키고, 플라스미드를 표준 방법을 이용하여 정제하였다. 생성된 스크리닝 벡터의 레퍼토리로 E. 콜리를 통상적인 절차에 의해 형질전환시켰다. 수득된 콜로니를 384-웰 마스터 플레이트로 통합시키고, 저장하였다. 어레이된 콜리니의 수는 투입 PCR 생성물의 수를 3배 이상 초과하였고, 이에 따라 수득된 모든 독특한 V-유전자쌍의 존재 가능성은 95%였다.
CD5 세포외 도메인으로의 결합에 대한 스크리닝
일반적으로, 스크리닝을 2단계 절차로 수행하였다. 세포 표면 발현된 CD5로의 항-CD5 항체 결합의 검출을 위해 CD5-트랜스펙션된 DG05.2 세포주를 이용한 유세포분석을 세포 기반 방법으로서 사용한 후 ELISA에서 재조합 CD5-ECD 단백질에 대한 반응성에 대해 항체-라이브러리를 스크리닝하였다. 간단히, ELISA를 위해, Nunc maxisorb 플레이트(cat no 464718)를 20μl의 5 μg/ml CD5-ECD 단백질(CD5-ECD는 TEV-프로테아제 분해 및 니켈(Nickel) 컬럼 상에서의 이후의 정제에 의해 분리되었음)로 코팅시키고, 밤새 4℃에서 PBS 중에 희석시켰다. 다음날, 웰을 RT에서 1시간 동안 5Oul 1%-BSA-PBS-T에서 블로킹시킨 후, PBS + 0.05% 트윈 20(PBS-T)로 4회 세척하고, 13 μl의 1%-BSA-PBS-T 및 CHO-flp-019 트랜스펙션체(transfectant)로부터의 2 μl 상층액(하기 참조)을 첨가하고, RT에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 PBS-T로 1회 세척하고, 1% BSA-PBS-T 중에 1:5000 희석된 웰당 20 μl의 이차 항체(HRP-염소-항-인간 IgG, Jackson, cat no 109-035-097)를 첨가하여 상층액에 존재하는 항체를 검출하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고, 5분 동안 인큐베이션된 25 μl의 기질(Kem-en-tec Diagnostics, cat no 4390)을 첨가하였다. 인큐베이션 후에 25 μl의 1M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 ELISA 판독기에서 특정 신호를 검출하였다.
항-CD5 항체의 세포 기반 유세포분석 검출을 위해, CD5-전장으로 트랜스펙션된 DG05.2 세포를 사용하였다. 세포를 10% FBS(우태아 혈청) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 MEM-알파 배지에서 배양하였다. 스크리닝에 사용 전에, 세포를 PBS에서 세척하고, TrypLE로 트립신 처리하고, 성장 배지에 재현탁하였다. 이후, 세포 현탁액을 5분 동안 250Xg에서의 원심분리에 의해 PBS에서 2회 세척하고, PBS를 제거하고, 5 ml 1% FBS-PBS에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 500000 세포/ml로 희석시키고, 25μl의 상기 용액을 1% FBS-PBS에 희석된 25μl의 40μg/ml 항-CD5 항체와 혼합시키고, 어두운 곳에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포-항체 현탁액을 5분 동안 250Xg에서의 원심분리에 의해 PBS 중에서 2회 세척하고, PBS를 제거하고, 50μl의 APC-컨쥬게이션된 마우스 항-인간 IgG 항체(BD Pharmingen cat. No. 550931)를 첨가하고, 어두운 곳에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포-항체 현탁액을 5분 동안 250Xg에서의 원심분리에 의해 PBS 중에서 2회 세척하고, PBS를 제거하고, 100μl의 1%-BSA-PBS에 재현탁시키고, HTS 유닛이 장비된 FACS Calibur의 사용에 의해 분석하였다.
스크리닝으로부터의 데이터는 전체 클론 중 68개(11.7%)가 ELISA에서 양성인 것을 나타내었다. 37개의 독특한 클론형(clonotype)이 확인되었다. 37개의 클론형 중 15개가 또한 FACS에서 양성이었다. 추가 분석을 위해 모든 독특한 클론형을 선택하였다.
서열 분석 및 클론 선택
ELISA에서 CD5-특이적인 것으로 확인된 클론을 본래의 마스터 플레이트(384-웰 포맷)로부터 회수하고, 신규한 플레이트로 통합시켰다. 클론으로부터 DNA를 분리시키고, V-유전자의 DNA 서열분석을 위해 제공하였다. 서열을 정렬시키고, 모든 독특한 클론을 선택하였다. 수득된 서열의 다중 정렬은 각각의 특정 클론의 독특함을 나타내었고, 독특한 항체의 확인을 가능케 하였다. 68개 클론의 서열 분석 후, 37개의 유전적으로 별개의 항체 서열 클러스터가 확인되었다. 이러한 관련 서열의 클러스터는 필시 통상적인 전구체 클론의 체세포 초돌연변이(hypermutation)를 통해 유래된 것으로 보였다. 종합적으로, 각각의 클러스터로부터 1개의 클론을 서열 및 특이성의 확인을 위해 선택하였다. 선택된 항체 가변 서열의 서열은 부록 1에 제시되어 있다.
서열 및 특이성 확인
항체를 엔코딩하는 클론을 확인하기 위해, DNA 플라스미드를 제조하고, 2-ml 규모의 프리스타일(FreeStyle) CHO-S 세포(Invitrogen)의 트랜스펙션을 발현을 위해 수행하였다. 상층액을 트랜스펙션 96시간 후에 수거하였다. CD5-특이적 ELISA에 의해 특이성을 결정하였다.
표 9: 항-CD5 항체 클로닝을 위한 시작 물질을 생성시키기 위해 사용된 면역화 스케줄.
Figure pct00032
표 10: RT-PCR 다중 중첩 신장 프라이머 혼합물.
Figure pct00033
표 11: 네스티드(Nested) 프라이머 세트.
Figure pct00034
표 12: 카파 불변 스플라이싱 프라이머 세트.
Figure pct00035
실시예 2: 항- CD5 항체의 포유동물 생성
항-EGFR 항체의 일시적 발현을 위해 프리스타일(Freestyle) MAX CHO 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하였다. 항체를 200-2000 ml 부피로 발현시켰다.
트랜스펙션 약 24시간 전에 CHO-S 세포를 계대배양시켜 0.5 x 106 세포/ml의 세포 농도에 도달시켰다. 플라스미드(세포 배양 배지 ml 당 1.25 μg)를 OptiPro 혈청 비함유 배지로 희석시키고, 공급자에 의해 권고된 바와 같이 프리스타일 MAX 트랜스펙션 시약 용액과 혼합시켰다. 트랜스펙션 시약을 세포 배양액으로 옮기고, 8일 후에 상층액을 수거하였다.
발현된 항체를 IgG1 분자의 정제를 위해 단백질 A-세파로오스 컬럼(MabSelect Sure, GE Health Care)을 이용하는 친화성 크로마토그래피 단계를 이용하여 배양 상층액으로부터 정제시켰다. 항체를 0.1 M 글리신, 2.7을 이용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 280 nm에서의 흡광도 측정에 의해 결정된 항체 함유 분획을 풀링시키고, 1X PBS에 대해 투석시켰다.
실시예 3: 에피토프 특이성의 결정
참조 항체를 이용한 경쟁 ELISA
CD5에 결합하는 참조 항체를 이용함으로써, 항-CD5 항체의 인간 Fc 영역에 특이적인 이차 시약과의 인큐베이션에 의해 항-CD5 항체의 결합 에피토프 사이를 구별할 수 있고, 뮤린 IgG Fc와 교차 반응성을 나타내지 않는 경쟁 ELISA를 개발하였다. ELISA를 문헌[Ditzel et al, 1995, The Journal of Immunology, VoI 154, Issue 2 893-906]에 공개된 기재로부터 적합시켰다.
CD5-ECD 항원을 PBS 중에서 1 μg/ml로 희석시키고, 4℃에서 밤새 50 μl/ELISA 웰 코팅시킴으로써 에피토프 차단 ELISA를 수행하였다. 다음날 아침, 웰을 PBS-T로 2회 세척하고, 실온에서 PBS-T-1% BSA로 1시간 동안 차단시킨 다음, PBS-T에서 4회 세척하였다. 다음으로, 25 μl 뮤린 참조 mAb를 상기 농도에서 CD5 상의 모든 에피토프를 포화시키기 위해 이전 실험으로부터 공지된 희석으로 독립 ELISA 웰에 첨가하였다. 15분 후, 항-CD5 항체를 함유하는 25 μl 상층액을 참조 항체로 미리 인큐베이션된 웰 또는 25 μl PBS를 함유하는 웰에 첨가하였다. 항체를 실온에서 45분 동안 인큐베이션시킨 후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하였다. 이차 염소-항-인간 IgG HRP 컨쥬게이트를 1:3000 희석시키고, 50 μl를 각각의 웰에 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고, 50 μl/웰의 TMB를 첨가하여 플레이트를 발달시키고, 5-15-30분마다 620 nm에서 판독하고, 50 μl/웰의 1M H2SO4로 반응을 중지시키고, 450nm에서 판독하였다. 억제 정도를 다음과 같은 식으로부터 계산하였다: 억제% = (1-(OD 경쟁/OD 경쟁 없음(PBS))) x 100.
ELISA 시약:
1) 코팅 완충액: 1 x PBS; Gibco cat:20012-019
2) 항원: CD5-ECD
3) ELISA 플레이트: NUNC Maxisorp; cat:442404
4) 블로킹/희석 완충액: PBS-T 중 1% BSA(PBS-T-1% BSA)
5) 세척 완충액: 1x PBS/0.05% 트윈20 (PBS-T)
6) 참조 항체:
·UCHT-2(뮤린), BD Pharmingen, 555350
·BL1 a(뮤린), Beckman Coulter, IM116
·1804(뮤린), AbD Serotech, MCA1804
·L17F12(뮤린), BD Pharmingen, 3463000
·H65(뮤린), Abcam, ab20132
·MEM-32(뮤린), Abcam, ab9189
·CRIS-1(뮤린), Abcam, ab36466
7) 염소-항-인간 IgG HRP 컨쥬게이트; Serotec, Star 106P
8) TMB 플러스(Plus); KemEnTec, cat # 4390L
9) 1M H2SO4
CD5 ECD에 대해 발생된 사용된 참조 항체의 특이성에 따른 항-CD5 항체 상층액을 등급화시키기 위해 ELISA 경쟁 검정을 이용하였다. 50-100%로부터의 억제 값을 항원 상에서 근접한 중첩 에피토프 또는 에피토프에 결합하는 항체쌍 사이의 유의한 경쟁의 지표로 취하였고, 50% 미만의 억제 값은 항체쌍에 의해 인지된 에피토프가 근접하여 있지 않아 감소된 입체 장애를 발생시키는 것을 나타낸다. 항-CD5 항체가 CD5 상의 다양한 에피토프에 결합하는 것을 발견하였다(도 5). 일부 항체에 대해, 본 발명자는 참조 항체와 경쟁이 없는 것을 관찰하였는데, 이는 참조 항체가 추정상 도메인 1상의 에피토프에 결합하고, 상기 항체가 도메인 Ⅱ 또는 도메인 Ⅲ에 결합할 가능성이 크기 때문이다.
표면 플라즈몬 공명 기술을 이용한 별개의 에피토프와 참조 또는 동일종 항체에 대한 경쟁 분석
4개의 플로우 셀(flow cell)을 함유하는 비아코어(Biacore) 2000 기계에서 SPR 분석을 수행하였다. 제조업체의 설명서에 따라 8.000 공명 단위(Ru)의 폴리클로날 항-인간 IgG Fc 특이적 항체를 갖는 CM5 비아코어 칩을 플로우 셀 1-4에 컨쥬게이션시켰다. 5 μl/분의 유속을 이용하여, 40 μg/ml 농도의 5μl의 하나의 항-CD5 항체 클론 및 5 μl의 에르비툭스(Erbitux)를 주입하였고, 이는 플로우 셀 1 및 항-인간 IgG Fc 특이적 항체가 컨쥬게이션된 플로우 셀 2-4에 각각 포획되었다. 이후, 10 mg/ml 농도의 15μl 시나기스(Synagis)를 2회 주입하여 항-인간 IgG Fc 특이적 항체의 잔여 부위를 차단시켰다. 과적(overload) 시나기스를 세척한 후, 15 μl의 200nM CD5-ECD를 5 μl/분 유속으로 4개 모두의 플로우 셀에 주입하였고, 이는 플로우 셀 2-4 내의 항-CD5 항체 클론에 의해 포획되었다. 이후, CD5를 포획하는 항-CD5 항체 클론이 중첩 에피토프에 결합하지 않는 경우 CD5에 결합하는 다양한 항-CD 항체 클론을 주입하였다, 도 6. 이후, 항체/항원 복합체를 낮은 pH의 산 세척(100 mM H3PO4로 접촉 시간 30초)으로 떼어낸 후, 모든 항-CD5 항체 클론이 CD5로의 결합에 대해 동시에 시험될때까지 전체 주기를 반복하였다. 일차 항체 클론에 의해 포획된 후 CD5에 결합하는 이차 항체 클론의 결합을 다음과 같이 계산하였다: 첫째로, 플로우 셀 1의 참조 센소그램을 플로우 셀 2-4의 센소그램으로부터 회수하였다. 둘째로, 결합된 CD5 당 결합된 이차 항체의 양을 계산하였다: (이차 항-CD5 항체 결합 전 RU / 이차 항-CD5 항체 결합 후의 RU) / (CD5 결합 전의 RU / CD5 결합 후의 RU).
시약:
1. CM5 칩; 비아코어(Biacore), Cat. No. BR-1000-14
2. NHS; 비아코어 BR-1000-50
3. EDC; 비아코어 BR-1000-50
4. 10mM 아세테이트 완충액 pH 4,5; 비아코어, Cat. No. BR-1003-50
5. 염소 항-인간 IgG Fc 항체; Caltag, Cat. No. H10500
6. 에탄올아민, 1.0M pH 8.5; 비아코어 BR-1000-50
7. 10 x HBS-EP 런닝(running) 완충액: 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20
8. 항원: 사내 제조된 재조합 인간 CD5 세포외 도메인
9. 100 mM H3PO4
10. 참조 항체:
·UCHT-2(뮤린), BD Pharmingen, 555350
·L17F12(뮤린), BD Pharmingen, 346300
·H65(뮤린), Abcam, ab20132
·LT-1(뮤린), Abcam, ab19717
11. 비-CD5 특이적 대조군: 에르비툭스(Erbitux)(Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany, Catalogue #: 018964
표면 플라즈몬 공명 기술을 이용한 항- CD5 항체의 친화성.
4개의 플로우 셀을 함유하는 비아코어 2000 기계에서 SPR 분석을 수행하였다. 제조업체의 설명서에 따라 8.000 공명 단위(Ru)의 폴리클로날 항-인간 IgG Fc 특이적 항체를 갖는 CM5 비아코어 칩을 플로우 셀 1-4에 컨쥬게이션시켰다. 각각의 항-CD5 항체를 4개의 상이한 농도의 CD5-ECD(4개 주기에 대한 농도는 하기 제시되어 있음)로의 결합에 대해 결정하고, 친화성을 계산하였다. 비-CD5 결합 항체, 에르비툭스를 음성 대조군으로 제공하였고, 항-CD5 특이적 항체로 수득된 값으로부터 공제시켰다. 25 μl/분의 유속을 이용하여, 25μl의 에르비툭스 및 25μl의 3개의 항-CD5 항체 클론(모두 동일 농도)을 주입하고, 이는 항-인간 IgG Fc 특이적 항체가 컨쥬게이션된 플로우 셀 1, 2, 3 및 4에서 각각 포획되었다. 이후, 모든 플로우 셀을 세척하고, 500초 동안 기다린 후, 250μl의 CD5-ECD 100nM 또는 20OnM(주기 1)을 플로우 셀 1-4에 주입하였다. 1000초 동안 기다린 후, 30μl의 H3PO4를 60μl/분의 유속을 이용하여 주입하였다. 이후, 항체/항원 복합체를 낮은 pH의 산 세척(100 mM H3PO4로 접촉 시간 30초)으로 떼어내었다. 이후, 50nM 또는 100nM CD5-ECD로 주기 2를 실행하고, 25nM 또는 50nM CD5-ECD로 주기 3을 수행하고, 최종적으로 12.5nM 또는 25nM CD5-ECD로 주기 4를 수행하였다. 이후, 모든 항-CD5 항체 클론이 4개의 상이한 농도로 CD5로의 결합에 대해 시험될때까지 4개의 신규한 주기를 반복하였다. 4개의 결합 곡선을 BIAevaluation 4.1 소프트웨어(Biacore)를 이용하여 소정의 1:1(Langmuir) 결합 및 해리 모델에 적합시켜 결합 속도 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 전체적으로 평가하였다, 표 13.
시약:
1. CM5 칩; 비아코어, Cat. No. BR-1000-14
2. NHS; 비아코어 BR-1000-50
3. EDC; 비아코어 BR-1000-50
4. 10mM 아세테이트 완충액 pH 4.5; 비아코어, Cat. No. BR-1003-50
5. 염소 항-인간 IgG Fc 항체; Caltag, Cat. No. H10500
6. 에탄올아민, 1.0M pH 8.5; 비아코어 BR-1000-50
7. 10 x HBS-EP 런닝 완충액: 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20
8. 항원: 사내 생성된 재조합 인간 CD5 세포외 도메인
9. 100 mM H3PO4
10. 항체: 항-CD5 항체
11. 비-CD5 특이적 대조군:
에르비툭스(Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany, Catalogue #:018964
비아코어에서의 CD5 로의 항- CD5 항체 클론의 동시 결합
4개의 플로우 셀을 함유하는 비아코어 2000 기계에서 SPR 분석을 수행하였다. 제조업체의 설명서에 따라 8.000 공명 단위(Ru)의 폴리클로날 항-인간 IgG Fc 특이적 항체를 갖는 CM5 비아코어 칩을 플로우 셀 1-4에 컨쥬게이션시켰다. 5 μl/분의 유속을 이용하여, 15μl의 항-CD5 항체 클론 12(클론 12)를 주입하였고, 이는 항-인간 IgG Fc 특이적 항체가 컨쥬게이션된 플로우 셀 1에서 포획되었다. 이후, 10 mg/ml 농도의 15μl 시나기스(Synagis)를 2회 주입하여 항-인간 IgG Fc 특이적 항체의 잔여 부위를 차단시켰다. 과적(overload) 시나기스를 세척한 후, 15 μl의 200nM CD5-ECD를 5 μl/분의 유속으로 플로우 셀 1에 주입하였고, 이는 플로우 셀 1 내의 클론 12에 의해 포획되었다. 이후, 클론 12에 의해 포획된 CD5에 결합하는 15 μl의 클론 14를 주입하였다. CD5가 클론 14에 의해 포화된 후, 15 μl의 클론 17을 주입하고, 클론 17로 CD5를 포화시킨 후, 5 μl/분의 유속으로 모든 플로우 셀 1에 15 μl의 클론 34를 주입하였다, 도 7. 이후, 항체/항원 복합체를 낮은 pH의 산 세척(100 mM H3PO4로 접촉 시간 30초)으로 떼어내었다.
CEM 세포 상의 CD5 로의 항- CD5 항체 클론의 동시 결합
CEM(ATCC-CCL-119)의 표면 상의 CD5로의 항-CD5 항체 클론의 동시 결합을 FACS Calibur에서 플로우 사이토메트리(Flow Cytometri)에 의해 수행하였다. 500000 CEM 세포를 30분 동안 어두운 곳에서 4℃에서 50 μl의 항-CD5 항체 클론 12, 14, 17, 34, 또는 1% FBS-PBS 중에 40 μg/ ml로 희석된 클론 12, 14, 17 및 34의 혼합물과 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 세포 현탁액을 3분 동안 250Xg에서의 원심분리에 의해 PBS 중에서 2회 세척하고, PBS를 제거하고, 30분 동안 어두운 곳에서 4℃에서 20 μl의 PE-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG-특이적 항체(Beckman Coulter cat. No. IM1626) 및 30 μl의 1% FBS-PBS와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포 현탁액을 3분 동안 250Xg에서의 원심분리에 의해 PBS 중에서 2회 세척하고, PBS를 제거하고, 100 μl 1% FBS-PBS에 재현탁시키고, HTS 유닛이 장비된 FACS-Calibur에서 분석하였다, 도 8.
실시예 4: CD5 내재화
CD5 내재화를 유도하는 항-CD5 항체의 능력을 유세포분석에 의해 연구하였다. B-CLL 세포를 피콜-하이패크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배를 이용하여 환자 말초 혈액 샘플로부터 정제하였다. 3명의 CLL 환자로부터의 샘플을 매 실험에 포함시켰다. 말초 혈액을 1xPBS와 1:1 혼합시키고, 5 ml의 이러한 혼합물을 4 ml의 피콜-하이패크 용액의 상부에 첨가하고, 이후 튜브를 800 x g에서 20분 동안 원심분리시켰다. CLL 세포를 함유하는 PBMC 층을 분리시키고, 50ml 1xPBS와 혼합시키고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 이를 2회 반복하였다. 이후, 세포를 CD5 및 CD19 발현 및 PBMC 집단에서의 CLL 세포의 백분율에 대해 유세포분석에 의해 분석하였고, 95% 이상의 CLL 세포를 갖는 샘플만 사용하였다. 이후, 세포를 계수하고, 1xPBS 중에 5x106 세포/ml로 희석시키고, 150μl를 둥근 바닥 96-웰 플레이트 내의 각각의 웰로 옮겼다. 1000 rpm에서 3분 동안 각각의 웰 내의 상층액의 분산액을 플레이트에서 원심분리시킨 후, 펠렛화된 세포를 25 μl PBS에 재현탁시켰다. 이후, 세포를 37℃ 또는 4℃에서 18시간 동안 3.3 μg/ml의 항-CD5 항체와 함께 인큐베이션시킨 후, 이들을 얼음 냉각된 FACS 완충액(1xPBS+2%FBS+0.1% 아지드)에서 2회 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 얼음 냉각된 FACS 완충액에 1:20 희석된 이차 항체(FITC-컨쥬게이션된 염소 F(ab')2 항-인간 Fc 특이적 IgG, Caltag H10101)로 염색시켰다. 4℃ 미만의 인큐베이션은 내재화를 완전히 억제하였다. 최종적으로, 세포를 2회 세척하고, FACS Calibur에서 분석하였다.
결과
비중첩 에피토프를 갖는 항체를 함유하는 다양한 항체 혼합물을 유세포분석에 의해 CD5 내재화를 유도하는 능력에 대해 시험하였다(도 9). 도 9A 및 9B에 제시된 결과로부터 명백한 바와 같이, 비중첩 에피토프를 갖는 일부 항체 혼합물이 내재화를 유도(도 9B)한 반면, 나머지는 유도하지 않았다(도 9A). 모노클로날 항체 Ab9, Ab14, Ab15, Ab17, Ab18 및 Ab31은 내재화를 유도하는데 실패하였다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, 내재화의 유도는 에피토프 의존성이고, 이는 CD5 양성 세포의 표면 상에서 높은 항체 밀도를 발생시키거나 CD5 내재화를 유도하는 항체 혼합물을 설계하기 위한 결합 에피토프의 지식을 기초로 할 수 있다.
실시예 5: CD5 분해
CD5 분해를 유도하는 항-CD5 항체의 능력을 웨스턴 블롯 분석에 의해 연구하였다. 환자로부터의 CLL 세포를 정제하고, 세척하고, 실시예 X에 기재된 바와 같이 분석하고, 30분, 1시간, 2시간 또는 4시간 동안 3.3 μg/ml의 항 CD5 항체로 처리하였다. 이후, 세포를 다시 세척하고, RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 5 μg/ml 아프로티닌(aprotinin), 5 μg/ml 류펩틴(Leupeptin), 1% 트리톤 x-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트 및 0.1% SDS)에서 용해시켰다. 8 μg의 단백질을 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로오스 막에 전기블로팅(electroblot)시켰다. 5% 비-지방 밀크에서의 블로킹 후, 막을 4℃에서 밤새 1:500 희석된 일차 항체(AbD Serotec으로부터의 마우스 항-CD5 Ab, 클론 4C7)와 함께 인큐베이션시킨 후, 세척하고, 실온에서 1시간 동안 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP) 컨쥬게이션된 이차 항체(R&D systems로부터의 염소 항-마우스 IgG, HAF007)와 함께 인큐베이션하였다. 향상된 화학발광 + 웨스턴 블로팅 검출 시스템(Amersham Biosciences)을 이용하여 HRP 신호를 검출하였다.
결과
비중첩 에피토프를 갖는 항체를 함유하는 다양한 항체 혼합물을 웨스턴 블롯 분석에 의해 CD5 분해를 유도하는 능력에 대해 시험하였다(도 10). 도 10에 제시된 결과로부터 명백한 바와 같이, 비중첩 에피토프를 갖는 일부 항체 혼합물은 CD5 분해를 유도(도 10B 및 C)한 반면, 나머지는 유도하지 않았다(도 10A). 모노클로날 항체 Ab9, Ab14, Ab15, Ab17, Ab18 및 Ab31은 CD5 분해를 유도하는데 실패하였다(Ab9만 도 10A에 도시되어 있음). 따라서, CD5 분해의 유도는 CD5 내재화 에피토프 의존성이다. 대조군 mAb 또는 PBS는 CD5 분해를 유도하지 않았다. CD5 내재화는 CD5 내재화에 따라 발생활 가능성이 높다.
SEQUENCE LISTING <110> Symphogen A/S <120> Anti-CD5 antibodies <130> P119PC00 <150> PA 2008 001191 <151> 2008-08-29 <160> 508 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gacsgatggg cccttggtgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gctgtaggtg ctgtctttgc 20 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tattcccatg gcgcgccsag gtccarctgc arcagyctg 39 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tattcccatg gcgcgccgar gtgmagctkg tkgagtc 37 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tattcccatg gcgcgccsag gtgcagctkm aggagtc 37 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tattcccatg gcgcgcccag gttactctga aagagtc 37 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tattcccatg gcgcgcccag atccagttgg tgcagtctg 39 <210> 8 <211> 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PRT <213> Mus musculus <400> 88 Cys Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Gly Thr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Cys Ala Arg Arg Arg Asp Gly Asn Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90 Cys Val Arg His Gly Tyr Phe Asp Val Trp 1 5 10 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Cys Ala Phe Tyr Asp Gly Ala Tyr Trp 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 92 Cys Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Tyr Trp 1 5 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Cys Ala Arg Asp Thr Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 94 Cys Ala Arg Arg Val Ala Thr Tyr Phe Asp Val Trp 1 5 10 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 95 Cys Thr Arg Arg Ser His Ile Thr Leu Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 96 Cys Ala Arg Arg Arg Thr Thr Ala Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Cys Asn Asn Gly Asn Tyr Val Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 98 Cys Thr Arg Arg Arg Glu Ile Thr Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 99 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Cys Ala Arg Ser Gly Ile Ser Pro Phe Thr Tyr Trp 1 5 10 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 Cys Ala Lys Tyr Asp Arg Gly Phe Ala Ser Trp 1 5 10 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Ser Gln Gly Ile Ser Asn His Leu 1 5 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 102 Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu 1 5 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 104 Ser Gln Ser Val Asp His Asp Gly Asp Ser Tyr Met 1 5 10 <210> 105 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met 1 5 10 <210> 106 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 106 Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu 1 5 <210> 107 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 107 Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr Leu 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 108 Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Leu 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 109 Asn Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu 1 5 <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 110 Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Tyr Phe 1 5 <210> 111 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 111 Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Ile 1 5 <210> 112 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 112 Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile 1 5 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu 1 5 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 114 Ser Gln Asp Val Arg Thr Asp Val 1 5 <210> 115 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 115 Ser Gln Asp Val Ile Thr Ala Val 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 116 Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile 1 5 <210> 117 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 118 Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu 1 5 <210> 119 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 119 Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asp Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 Asn Ser Ser Val Ser Tyr Met 1 5 <210> 121 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121 Ser Ser Ser Leu Ser Tyr Met 1 5 <210> 122 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 122 Ser Gln Arg Ile Gly Thr Ser Met 1 5 <210> 123 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 123 Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 124 Ile Ser Ser Val Ser Tyr Met 1 5 <210> 125 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 125 Ser Gln Thr Ile Ala Thr Ser Ile 1 5 <210> 126 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 126 Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 1 5 10 <210> 127 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 127 Asn Glu Ser Val Glu Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Met 1 5 10 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 128 Tyr Phe Thr Ser Ser 1 5 <210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 129 Tyr Tyr Thr Ser Ser 1 5 <210> 130 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 130 Tyr Ala Ala Ser Asn 1 5 <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 131 Tyr Tyr Thr Ser Arg 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 132 Phe Tyr Thr Ser Arg 1 5 <210> 133 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 133 Tyr Gly Thr Ser Asn 1 5 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 134 Tyr Gly Thr Ser Asn 1 5 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 135 Tyr Asn Ala Asn Ser 1 5 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 136 Tyr Asn Ala Lys Thr 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 137 His Tyr Thr Ser Thr 1 5 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 138 Tyr His Thr Ser Thr 1 5 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 139 Tyr Ser Ala Ser Phe 1 5 <210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 140 Tyr Ser Ala Ser Tyr 1 5 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 141 Lys Ser Ala Ser Glu 1 5 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 142 Tyr Trp Ala Ser Thr 1 5 <210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 143 Tyr Ser Thr Ser Asn 1 5 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 144 Lys Asn Ala Ser Glu 1 5 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 145 Tyr Asp Thr Ser Lys 1 5 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 146 Tyr Asp Thr Ser Asn 1 5 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 147 Lys Asp Ala Ser Glu 1 5 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 148 Tyr Ala Thr Ser Asn 1 5 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 149 Tyr Lys Val Ser Asn 1 5 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 150 Ser Ala Ala Ser Asn 1 5 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 151 Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Leu Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 152 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 152 Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Ile Pro Tyr Thr Cys 1 5 10 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 153 Cys Gln Gln Asn Tyr Glu Asp Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 154 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 154 Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 155 Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 156 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 156 Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 157 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 157 Cys Gln Gln Trp Ser Ser Arg Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 158 Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 159 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 159 Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Tyr Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 160 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 160 Cys Gln Gln Arg Ser Tyr Phe Pro Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 161 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 161 Cys Lys Gln Val Tyr Asp Val Pro Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 162 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 162 Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 163 Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 164 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 164 Cys Gln His His Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 165 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 165 Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Leu Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 166 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 166 Cys Gln Gln His Tyr Thr Ser Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 167 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 167 Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 168 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 168 Cys Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 169 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 169 Cys Gln Asn Asp Tyr Asp Tyr Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 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Mus musculus <400> 189 tctggctaca cattcactaa ttttgctatt 30 <210> 190 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 190 tctggcttca acattaaaga cacctatatg 30 <210> 191 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 191 tctggctact ccttcaccag ttactggatg 30 <210> 192 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 192 tctggtttct cattaactaa ctatgatgta 30 <210> 193 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 193 tctggattca ctttcagtaa ctatggcatg 30 <210> 194 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 194 tctgggtata ttttcgcaaa ctatggcatg 30 <210> 195 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 195 tctgggtata acttcacaaa ctatggaatg 30 <210> 196 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 196 tctggttata ccttcacaaa ctatggaatg 30 <210> 197 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 197 tctggctaca ccttcactga ctactatata 30 <210> 198 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 198 tctggcaaca ccttcacaaa cttctattta 30 <210> 199 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 199 tctgggtata ccttcacaaa ctatggaatg 30 <210> 200 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 200 tctgaattca ctttcagtaa ctatgccatg 30 <210> 201 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 201 tctggctaca cgttcaccag ctacaggatg 30 <210> 202 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 202 tctggttact cattcactga ctacaccatg 30 <210> 203 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 203 tctgggtata tgttcacaaa ccatggaatg 30 <210> 204 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 204 tctgggtata tgttcacaaa ctatggaatg 30 <210> 205 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 205 tctgggtata tcttcacaaa ctatggaatg 30 <210> 206 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 206 tctggcttca acattaaaga ctactatata 30 <210> 207 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 207 tctgggtata ccttcataaa ttatggaatg 30 <210> 208 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 208 tctggctaca ccttcactga ctactttata 30 <210> 209 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 209 tctggctaca tttttaccgg ttacaatata 30 <210> 210 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 210 cttattaatc cttacaatgg tggtactacc 30 <210> 211 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 211 cttattaatc cttacaatgg tggtactatg 30 <210> 212 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 212 tccattagta gtggtggtaa caccttt 27 <210> 213 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 213 tccattagta gtggtggtag cacc 24 <210> 214 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 214 agtattgatc cttactatgg tgatactaaa 30 <210> 215 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 215 agtattgatc cttattatgg tgatactaag 30 <210> 216 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 216 cttattagtt ctaactctgg tgatgttagc 30 <210> 217 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 217 cttattagta cttcctctgg tgatgttagc 30 <210> 218 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 218 aggattgatc ctgcgaatgg taatactaaa 30 <210> 219 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 219 atgattcatc cttccgatag tgaaactagg 30 <210> 220 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 220 gtgatttgga gtggtggaaa cacagac 27 <210> 221 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 221 gtgatatgga attatggaaa cacagac 27 <210> 222 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 222 gccattaata gtaatggtga tattacc 27 <210> 223 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 223 cttattaatc cttacaatgg tggtactaga 30 <210> 224 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 224 tggataaaca cctacactgg agagccaaca 30 <210> 225 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 225 tggattaaca cctacactgg agagccaaca 30 <210> 226 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 226 tggataaaca cttacactgg agagccaaca 30 <210> 227 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 227 tggatttatc ctggaggcgg taatactagg 30 <210> 228 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 228 tgtatttatc ctggaaacgt taagactaaa 30 <210> 229 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 229 tggataaaca cctacactgg agagcctaca 30 <210> 230 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 230 accattagta gtggtggtag ttacacc 27 <210> 231 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 231 aggattgatc cttacgatag tggaactcac 30 <210> 232 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 232 cttattaatc cttacaatgg tggtactagg 30 <210> 233 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 233 tggattgatc ctgagaatgg tcgtactgaa 30 <210> 234 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 234 gagatttatc ctggaagtag taatacttac 30 <210> 235 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 235 gctgtttatc caggaaatgg tgatacttcc 30 <210> 236 <211> 45 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 236 tgtgcaagag attactacgg tagtagtcca gactttgact actgg 45 <210> 237 <211> 45 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 237 tgtgcaagag ataactacgg tagtagtcca gactttgact actgg 45 <210> 238 <211> 45 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 238 tgtgcaagag ataactacgg tagtagccca tactttgact actgg 45 <210> 239 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 239 tgtgtccgtt attactacgg tgttacctac tggtacttcg atgtctgg 48 <210> 240 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 240 tgtgtccgtt attactacgg tattaggtac tggtacttcg atgtctgg 48 <210> 241 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 241 tgtgcaagaa ggatgattac gatgggagac tggtatttcg atgtctgg 48 <210> 242 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 242 tgtgcaagaa ggatgattac gacgggagac tggtacttcg atgtctgg 48 <210> 243 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 243 tgtgcaagac actatggtgc ccacaactat tttgactatt gg 42 <210> 244 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 244 tgtgcaagac actatggtgc caacaactat tttgactatt gg 42 <210> 245 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 245 tgtgctagag aggagaatta ctacggtacc tactactttg actactgg 48 <210> 246 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 246 tgtgcaagat ggggggatca cgacgatgct atggacttct gg 42 <210> 247 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 247 tgtgccagaa atcatggtga tggttacttc aactggtact tcgatgtctg g 51 <210> 248 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 248 tgtgccagaa atcatggtga tggttactat aactggtact tcgatgtctg g 51 <210> 249 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 249 tgtgcaagag gaactgcctg gtttacttac tgg 33 <210> 250 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 250 tgtgcaagag atggggatga tggttgggac atcgatgtct gg 42 <210> 251 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 251 tgtgcaagaa gggggactta ctggcacttc gatgtctgg 39 <210> 252 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 252 tgtgcaagaa gggggtctta ctggcacttc gatgtctgg 39 <210> 253 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 253 tgtgcaagac gctctacgct cgtctttgac tactgg 36 <210> 254 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 254 tgtgcaagaa acggctactg gtacttcgat gtctgg 36 <210> 255 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 255 tgtgcaaagg agggagatta cgacgggacg gcctactttg attactgg 48 <210> 256 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 256 tgtgcaagaa ggcgggacgg aaactttgac tactgg 36 <210> 257 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 257 tgtgtaagac atggatactt cgatgtctgg 30 <210> 258 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 258 tgtgccttct atgatggggc ttactgg 27 <210> 259 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 259 tgtgctagtt atgatcctga ctactgg 27 <210> 260 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 260 tgtgcaagag atactacggc gacgtactac tttgactact gg 42 <210> 261 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 261 tgtgcaagac gtgttgcgac gtacttcgat gtctgg 36 <210> 262 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 262 tgtacacgaa ggagtcatat taccttggac tactgg 36 <210> 263 <211> 45 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 263 tgtaataatg gtaactacgt cagacactac tactttgact actgg 45 <210> 264 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 264 tgtacaagaa gaagagaaat aacctttgac tactgg 36 <210> 265 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 265 tgtgcaagat cggggatttc gccctttact tactgg 36 <210> 266 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 266 tgtgcaaaat atgaccgggg gtttgcttcc tgg 33 <210> 267 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 267 agtcagggca ttagcaatca ttta 24 <210> 268 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 268 agtcagggca ttagaaatta ttta 24 <210> 269 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 269 agtcagggca ttaacaatta ttta 24 <210> 270 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 270 agccaaagtg ttgatcatga tggtgatagt tatatg 36 <210> 271 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 271 agccaaagtg ttgattatga tggtgatagt tatatg 36 <210> 272 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 272 agtcaggaca ttagcaatta ttta 24 <210> 273 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 273 agtcaggaca ttagtactta ttta 24 <210> 274 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 274 acctcaagta taagttccag ttacttg 27 <210> 275 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 275 aactcaagtg taagttccag ttacttg 27 <210> 276 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 276 agtgagaaca tttactacaa ttta 24 <210> 277 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 277 agtgaaaata tttacggtta tttc 24 <210> 278 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 278 agtcaagaca ttaacaacta tata 24 <210> 279 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 279 agtcaagaca ttaacaagta tata 24 <210> 280 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 280 agtgagaata tttacagtta ttta 24 <210> 281 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 281 agtcaggatg tgaggactga tgta 24 <210> 282 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 282 agtcaggatg tgattactgc tgta 24 <210> 283 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 283 agtcagagca ttggtacaag cata 24 <210> 284 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 284 tccagtcaga gtctcttaaa tcaaaagaac tacttg 36 <210> 285 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 285 agctcaagtg taagttccag ttacttg 27 <210> 286 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 286 agtgagaaca tttactacaa ttta 24 <210> 287 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 287 agtcagagcc ttttatatag tagcgatcaa aagaactact tg 42 <210> 288 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 288 aactcaagtg taagttacat g 21 <210> 289 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 289 agctcaagtt taagttacat g 21 <210> 290 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 290 agtcagcgca ttggcacaag catg 24 <210> 291 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 291 agtcagagca ttggcacaag cata 24 <210> 292 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 292 agtcagaaca ttggcacaag cata 24 <210> 293 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 293 atctcaagtg taagttacat g 21 <210> 294 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 294 agtcagacca ttgccacaag cata 24 <210> 295 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 295 agtcagagcc ttgtacacag taatggaaac acctattta 39 <210> 296 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 296 aatgaaagtg ttgaatattc tggcacaagt ttaatg 36 <210> 297 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 297 tatttcacat caagt 15 <210> 298 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 298 tattacacat caagt 15 <210> 299 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 299 tatgctgcat ccaat 15 <210> 300 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 300 tactacacat caaga 15 <210> 301 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 301 ttctacacat cacga 15 <210> 302 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 302 tatggcacat ccaac 15 <210> 303 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 303 tataatgcaa acagc 15 <210> 304 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 304 tataatgcaa aaacc 15 <210> 305 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 305 cattacacat ctaca 15 <210> 306 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 306 tatcacacat caact 15 <210> 307 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 307 tactcggcat ccttc 15 <210> 308 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 308 tactcggcat cctac 15 <210> 309 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 309 aagagtgctt ctgag 15 <210> 310 <211> 14 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 310 actgggcatc cact 14 <210> 311 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 311 tatagcacat ccaac 15 <210> 312 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 312 tataatgcaa acagt 15 <210> 313 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 313 aagaatgctt ctgag 15 <210> 314 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 314 tatgacacat ccaaa 15 <210> 315 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 315 tatgacacat ccaac 15 <210> 316 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 316 aagtctgctt ctgag 15 <210> 317 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 317 aaggatgctt ctgag 15 <210> 318 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 318 tatgccactt ccaac 15 <210> 319 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 319 tacaaagttt ccaat 15 <210> 320 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 320 tctgctgcat ccaac 15 <210> 321 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 321 tgtcagcagt atagtaacct tccgtacacg ttc 33 <210> 322 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 322 tgtcagcagt atagtaagat tccgtacacg tgc 33 <210> 323 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 323 tgtcagcaaa attatgagga tccgacgttc 30 <210> 324 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 324 tgtcagcaaa gtaatgagga tccgacgttc 30 <210> 325 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 325 tgtcaacagg gtgatgcgct tccgtggacg ttc 33 <210> 326 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 326 tgccaacagg gtaattcgct tccgttcacg ttc 33 <210> 327 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 327 tgccagcagt ggagtagtag accacccacg ttc 33 <210> 328 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus 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Mus musculus <400> 420 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Tyr Leu His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Lys Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Phe 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Asp Tyr Asp Gly Thr Ala Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 <210> 421 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 421 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala His 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp 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<213> Mus musculus <400> 429 aacattgtgc tgacccagtc tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattaga aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctatcac acatcaactt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaacc ttccgctcac g 291 <210> 430 <211> 294 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 430 gacattgtgc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gcaggtcacc 60 atgacctgca gggccacctc aagtataagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120 tccggtgcct cccccaaact ctggatttat ggcacatcca acttggcttc tggagtccct 180 actcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagtgtggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtacagtg attacccact cacg 294 <210> 431 <211> 291 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 431 gacattgtgc tgacccaatc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga atctgtcacc 60 atcacatgtc ggccaagtga aaatatttac ggttatttcg catggtatca gcagagacag 120 ggaaaatctc ctcagctcct 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DNA <213> Mus musculus <400> 434 gaaattgttc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gcaggtcacc 60 atgacctgca gggccacctc aagtataagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120 tccggtgcct cccccaaact ctggatttat ggcacatcca acttggcttc tggagtccct 180 actcgcttca gtggcggtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag ccgaatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag caaaggagtt atttcccgtt cacg 294 <210> 435 <211> 309 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 435 aacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagcg atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc tgaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataactat 300 ccgctcacg 309 <210> 436 <211> 291 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 436 aacattgtgc tgactcagtc tccagcctcc ctggctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtga gaacatttac tacaatttag catggtatca gcagaagcaa 120 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<210> 439 <211> 288 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 439 gatattgtga tgacacagtc tccatcctca ctgtctgaat ctctgggagg caaagtcacc 60 atcacatgca aggcaagtca agacattaac aactatatag cttggtacca acacaagcct 120 ggaaaaggtc ctaggctgct catacattac acatctacat tgctgccagg catcccatca 180 aggttcagtg gaagtgggtc tgggacagat tattccttca gcatcagcaa cctggagcct 240 gaagatattg caacttatta ttgtctacag tatgataatc tgtggacg 288 <210> 440 <211> 288 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 440 gatgttgtgc tgacccaatc tccagcaatc ctgtctgcat cgccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccatctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcatccccca aaccctggat ttatgccact tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacggacg 288 <210> 441 <211> 291 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 441 aacattgtgc tgacacagtc tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcaattgca gtgcaagtca gggcattagc aatcatttaa actggtttca gcagaaatca 120 gatggaactg 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<211> 291 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 444 cacattgtgc tcacccaatc tccagccatc ctatctgtga gtccaggaga gagagtcagt 60 ttctcctgca gggccagtca gaccattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120 aatggttctc caaggcttct cataaagaat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180 aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240 gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtaatagct ggccactcac g 291 <210> 445 <211> 300 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 445 caaattgttc tcacccagtc tccagcttct ttgcctgcgt ctccaggaca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 catcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctcgaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgacg 300 <210> 446 <211> 291 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 446 aacattgtgc tgactcagtc tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcaattgca gtgcaagtca gggcattagc aatcatttaa actggtttca gcagaaatca 120 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caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaaacagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180 gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagaggag 300 aattactacg gtacctacta ctttgactac 330 <210> 492 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 492 caggtgcagc tgaaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggagcctc aatgaagata 60 tcctgcaagg cttcaggtta ttcattcacc ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga accttgagtg gattggactt attaatcctt acaatggtgg tactatgtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccaa tacagcctac 240 atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagataac 300 tacggtagta gcccatactt tgactac 327 <210> 493 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 493 aaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gcctacatat 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caggtccagc tgcaacagcc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta taccttcata aattatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180 gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcga acatgaggac atggctgtat atttctgtac aagaagaaga 300 gaaataacct ttgactac 318 <210> 499 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 499 caggtccagc tgcaacagtc tggggctgaa ctggtgaggc caggggtctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg gttctggcta cacattcact aattttgcta ttcactgggt gaaacagagt 120 catgcaaaga gtctagagtg gattggactt attagttcta actctggtga tgttagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccag cacagcctat 240 atggaacttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attattgtgc aagacactat 300 ggtgcccaca actattttga ctat 324 <210> 500 <211> 330 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 500 caggtgcagc tgaaggagtc tggacctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gcctacagca tgaactgggt 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ctgacctgct tagaacccca gaagacaaca cctccaacga caaggccccc 540 gcccaccaca actccagagc ccacagctcc tcccaggctg cagctggtgg cacagtctgg 600 cggccagcac tgtgccggcg tggtggagtt ctacagcggc agcctggggg gtaccatcag 660 ctatgaggcc caggacaaga cccaggacct ggagaacttc ctctgcaaca acctccagtg 720 tggctccttc ttgaagcatc tgccagagac tgaggcaggc agagcccaag acccagggga 780 gccacgggaa caccagccct tgccaatcca atggaagatc cagaactcaa gctgtacctc 840 cctggagcat tgcttcagga aaatcaagcc ccagaaaagt ggccgagttc ttgccctcct 900 ttgctcaggt ttccagccca aggtgcagag ccgtctggtg gggggcagca gcatctgtga 960 aggcaccgtg gaggtgcgcc agggggctca gtgggcagcc ctgtgtgaca gctcttcagc 1020 caggagctcg ctgcggtggg aggaggtgtg ccgggagcag cagtgtggca gcgtcaactc 1080 ctatcgagtg ctggacgctg gtgacccaac atcccggggg ctcttctgtc cccatcagaa 1140 gctgtcccag tgccacgaac tttgggagag aaattcctac tgcaagaagg tgtttgtcac 1200 atgccaggat ccaaaccccg caggcctggc cgcaggcacg gtggcaagca tcatcctggc 1260 cctggtgctc ctggtggtgc tgctggtcgt gtgcggcccc cttgcctaca agaagctagt 1320 gaagaaattc cgccagaaga 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aggggtctgg gtgggcacca ccctgaccca cagcgtcacc 2220 ccactccctc tgtcttatga ctcccctccc caaccccctc atctaaagac accttccttt 2280 ccactggctg tcaagcccac agggcaccag tgccacccag ggcccggcac aaaggggcgc 2340 ctagtaaacc ttaaccaact tggttttttg cttcacccag caattaaaag tcccaagctg 2400 aggtagtttc agtccatcac agttcatctt ctaacccaag agtcagagat ggggctggtc 2460 atgttccttt ggtttgaata actcccttga cgaaaacaga ctcctctagt acttggagat 2520 cttggacgta cacctaatcc catggggcct cggcttcctt aactgcaagt gagaagagga 2580 ggtctaccca ggagcctcgg gtctgatcaa gggagaggcc aggcgcagct cactgcggcg 2640 gctccctaag aaggtgaagc aacatgggaa cacatcctaa gacaggtcct ttctccacgc 2700 catttgatgc tgtatctcct gggagcacag gcatcaatgg tccaagccgc ataataagtc 2760 tggaagagca aaagggagtt actaggatat ggggtgggct gctcccagaa tctgctcagc 2820 tttctgcccc caccaacacc ctccaaccag gccttgcctt ctgagagccc ccgtggccaa 2880 gcccaggtca cagatcttcc cccgaccatg ctgggaatcc agaaacaggg accccatttg 2940 tcttcccata tctggtggag gtgagggggc tcctcaaaag ggaactgaga ggctgctctt 3000 agggagggca aaggttcggg ggcagccagt gtctcccatc agtgcctttt ttaataaaag 3060 ctctttcatc tatagtttgg ccaccataca gtggcctcaa agcaaccatg gcctacttaa 3120 aaaccaaacc aaaaataaag agtttagttg aggagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180

Claims (64)

  1. 별개의 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 2개 이상의 항-CD5 항체를 포함하는 항체 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 에피토프가 비중첩(non-overlapping) 에피토프인 항체 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체가 도메인 Ⅰ, 도메인 Ⅱ 및 도메인 Ⅲ로 구성된 군으로부터 선택된 CD5의 하나 이상의 세포외 도메인에 결합하는 항체 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 별개의 CD5 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체가 상이한 별개의 CD5 에피토프로의 하나 이상의 다른 항체의 결합을 향상시킬 수 있는 항체 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 별개의 CD5 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체가 CD5와 관련하여 하나 이상의 다른 항체의 최대 결합 능력을 증가시킬 수 있는 항체 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 재조합 항체인 항체 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 갖는 키메라 항체인 항체 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 인간 불변 영역이 IgG1 또는 IgG2인 항체 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간화된 항체인 항체 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체인 항체 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD5 항체 중 하나 이상이 10-8 M 이하의 Kd 값을 갖는 항체 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD5 항체 중 하나 이상이 10-9 M 이하의 Kd 값을 갖는 항체 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD5 항체 중 하나 이상이 10-10 M 이하의 Kd 값을 갖는 항체 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD5가 인간 CD5인 항체 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 인간 CD5가 표 7에 표시된 서열을 갖는 항체 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 비-인간 포유동물 CD5에 결합할 수 있는 항체 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 항체가 인간 CD5에 대한 상기 항체의 결합 친화성과 실질적으로 동일한 친화성으로 상기 비-인간 포유동물 CD5에 결합할 수 있는 항체 조성물.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 포유동물이 영장류인 항체 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 영장류가 시노몰구스(cynomolgous) 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis))인 항체 조성물.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항체 분자가 표 6에 나타낸 바와 같은 불변 도메인 카파 경쇄 서열을 포함하는 항체 조성물.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 모든 항체 분자가 표 6에 나타낸 바와 같은 불변 도메인 카파 경쇄 서열을 포함하는 항체 조성물.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항체 분자가 표 6에 나타낸 바와 같은 불변 도메인 중쇄 서열을 포함하는 항체 조성물.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 모든 항체 분자가 표 6에 나타낸 바와 같은 불변 도메인 중쇄 서열을 포함하는 항체 조성물.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 항체 조성물의 결합 특이성을 갖는 이특이적 결합 분자.
  25. 제 24항에 있어서, 이중 가변 도메인(dual-variable-domain) 항체인 이특이적 결합 분자.
  26. 제 24항에 있어서, 이특이적 Fab 단편 또는 이특이적 scFV인 이특이적 결합 분자.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 항-CD5 항체 분자를 포함하는 항체 조성물.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 항-CD5 항체 분자를 포함하는 항체 조성물.
  29. 제 1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 3개 이상의 항-CD5 항체 분자를 포함하는 항체 조성물.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 4개 이상의 항-CD5 항체 분자를 포함하는 항체 조성물.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 5개 이상의 항-CD5 항체 분자를 포함하는 항체 조성물.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택된 6개 이상의 항-CD5 항체 분자를 포함하는 항체 조성물.
  33. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 모든 항-CD5 항체 분자가 표 1에 나타낸 바와 같은 항체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 및 37의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 조성물.
  34. 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 추가의 별개의 항-CD5 항체 분자를 포함하고, 상기 추가의 항체 분자가 제 3의 별개의 에피토프에 결합하는 항체 조성물.
  35. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 추가의 별개의 항-CD5 항체 분자를 포함하고, 상기 추가의 항체 분자가 제 4의 별개의 에피토프에 결합하는 항체 조성물.
  36. 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 추가의 별개의 항-CD5 항체 분자를 포함하고, 상기 추가의 항체 분자가 제 5의 별개의 에피토프에 결합하는 항체 조성물.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 추가의 별개의 항-CD5 항체 분자를 포함하고, 상기 추가의 항체 분자가 제 6의 별개의 에피토프에 결합하는 항체 조성물.
  38. 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 포함된 항-CD5 항체 분자 중 3개 이상이 서로 CD5에 대한 결합을 억제하지 않는 항체 조성물.
  39. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 포함된 항-CD5 항체 분자 중 4개 이상이 서로 CD5에 대한 결합을 억제하지 않는 항체 조성물.
  40. 제 36항 또는 제 37항에 있어서, 상기 조성물에 포함된 항-CD5 항체 분자 중 5개 이상이 서로 CD5에 대한 결합을 억제하지 않는 항체 조성물.
  41. 제 37항에 있어서, 상기 조성물에 포함된 항-CD5 항체 분자 중 6개 이상이 서로 CD5에 대한 결합을 억제하지 않는 항체 조성물.
  42. 제 1항에 있어서, 2개의 항체의 조합물을 포함하는 상기 조성물이 Ab9+Ab18, Ab9+Ab15, Ab9+Ab31, Ab9+Ab14, Ab9+Ab17, Ab18+Ab15, Ab18+Ab31, Ab18+Ab14, Ab18+Ab17, Ab15+Ab31, Ab15+Ab14, Ab15+Ab17, Ab31+Ab14, Ab31+Ab17 및 Ab14+Ab17로 구성되는 2개의 항체의 조합물의 군으로부터 선택되는 항체 조성물.
  43. 제 1항에 있어서, 3개의 항체의 조합물을 포함하는 상기 조성물이 Ab9+Ab18+Ab15, Ab9+Ab18+Ab31, Ab9+Ab18+Ab14, Ab9+Ab18+Ab17, Ab9+Ab15+Ab31, Ab9+Ab15+Ab14, Ab9+Ab15+Ab17, Ab9+Ab31+Ab14, Ab9+Ab31+Ab17, Ab9+Ab14+Ab17, Ab18+Ab15+Ab31, Ab18+Ab15+Ab14, Ab18+Ab15+Ab17, Ab18+Ab31+Ab14, Ab18+Ab31+Ab17, Ab18+Ab14+Ab17, Ab15+Ab31+Ab14, Ab15+Ab31+Ab17, Ab15+Ab14+Ab17 및 Ab31+Ab14+Ab17로 구성되는 3개의 항체의 조합물의 군으로부터 선택되는 항체 조성물.
  44. 제 1항에 있어서, 4개의 항체의 조합물을 포함하는 상기 조성물이 Ab9+Ab18+Ab15+Ab31, Ab9+Ab18+Ab15+Ab14, Ab9+Ab18+Ab15+Ab17, Ab9+Ab18+Ab31+Ab14, Ab9+Ab18+Ab31+Ab17, Ab9+Ab18+Ab14+Ab17, Ab9+Ab15+Ab31+Ab14, Ab9+Ab15+Ab31+Ab17, Ab9+Ab15+Ab14+Ab17, Ab9+Ab31+Ab14+Ab17, Ab18+Ab15+Ab31+Ab14, Ab18+Ab15+Ab31+Ab17, Ab18+Ab15+Ab14+Ab17, Ab18+Ab31+Ab14+Ab17 및 Ab15+Ab31+Ab14+Ab17로 구성되는 4개의 항체의 조합물의 군으로부터 선택되는 항체 조성물.
  45. 제 1항에 있어서, 5개의 항체의 조합물을 포함하는 상기 조성물이 Ab9+Ab18+Ab15+Ab31+Ab14, Ab9+Ab18+Ab15+Ab31+Ab17, Ab9+Ab18+Ab15+Ab14+Ab17, Ab9+Ab18+Ab31+Ab14+Ab17, Ab9+Ab15+Ab31+Ab14+Ab17 및 Ab18+Ab15+Ab31+Ab14+Ab17로 구성되는 5개의 항체의 조합물의 군으로부터 선택되는 항체 조성물.
  46. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 항체 Ab9+Ab18+Ab15+Ab31+Ab14+Ab17을 포함하는 항체 조성물.
  47. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 9+14+15+17+18+31, 9+14+15+17+18, 9+15+18+31 및 9+15+18로 구성된 항체의 조합물의 군으로부터 선택된 항체의 조합물을 포함하고; 상기 조성물이 CD5를 내재화(internalization)시킬 수 있는 항체 조성물.
  48. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 14+17, 17+18로 구성된 항체의 조합물의 군으로부터 선택된 항체의 조합물을 포함하고; 상기 조성물이 CD5를 내재화시킬 수 없는 항체 조성물.
  49. 제 1항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 따른 항체 조성물 또는 제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 이특이적 결합 분자를 활성 성분으로 포함하는 약제 조성물.
  50. 약제로서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 따른 항체 조성물 또는 제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 이특이적 결합 분자.
  51. 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 50항에 따른 조성물 또는 이특이적 결합 분자.
  52. 만성 림프구성 백혈병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 50항에 따른 조성물 또는 이특이적 결합 분자.
  53. 류머티스 관절염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 50항에 따른 조성물 또는 이특이적 결합 분자.
  54. 약제의 제조에서의 제 1항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 따른 항체 조성물 또는 제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 이특이적 결합 분자의 용도.
  55. 제 49항에 따른 약제 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  56. a) 진핵세포의 제 1 집단을 제 1의 별개의 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 제 1의 VH 및 VL 사슬의 동족쌍(cognate pair)을 포함하는 제 1의 항체를 코딩하는 제 1의 발현 작제물로 트랜스펙션시키는 단계;
    b) 진핵세포의 제 2 집단을 제 2의 별개의 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 제 2의 VH 및 VL 사슬의 동족쌍을 포함하는 제 2의 항체를 코딩하는 제 2의 발현 작제물로 트랜스펙션시키는 단계;
    c) 임의로, 제 3 또는 추가의 집단, 발현 작제물, 동족쌍 및 CD5 에피토프에 대해 상기 단계 b)를 반복하는 단계;
    d) 트랜스펙션된 제 1, 제 2 및 임의로 추가의 세포 집단을 선택하는 단계;
    e) 하나의 포트(pot)에 상기 트랜스펙션된 집단을 조합시켜 세포 은행(cell bank)을 수득하는 단계;
    f) 항체가 발현되도록 하는 조건 하에서 상기 세포 은행으로부터의 세포를 배양하는 단계; 및
    g) 상층액으로부터 항체 조성물을 회수하고 정제하는 단계를 포함하는, 항체 조성물을 제조하는 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 상기 항체 조성물이 제 1항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 항체 조성물인 방법.
  58. 제 56항에 있어서, 상기 세포가 부위 특이적 통합으로 트랜스펙션된 방법.
  59. 제 56항에 있어서, 상기 VH 및 VL 영역이 뮤린 영역이고, 상기 항체의 불변 영역이 인간 영역인 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 모든 항체가 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하는 방법.
  61. 진핵 세포의 2개 이상의 하위집단(sub-population)을 포함하는 세포 은행으로서, 각각의 하위집단이 별개의 CD5 에피토프에 결합할 수 있는 VH 및 VL 사슬의 동족쌍을 포함하는 항체를 코딩하는 하나의 발현 작제물로 트랜스펙션되거나 형질도입되는 세포 은행.
  62. 제 61항에 있어서, 상기 세포 은행이 제 1항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 항체 조성물을 엔코딩하는 세포 은행.
  63. 제 61항에 있어서, 상기 세포가 이특이적 통합을 이용하여 트랜스펙션되는 세포 은행.
  64. 제 1항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 항체 조성물 또는 제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 이특이적 결합 분자를 CD5를 발현하는 세포에 투여함으로써 상기 CD5를 발현하는 세포를 사멸시키는 것을 포함하는, CD5를 발현하는 세포를 사멸시키는 방법.
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