KR20110045284A - 키토산 올리고당을 활성성분으로 포함하는 항비만용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산 올리고당을 활성성분으로 포함하는 항비만용 조성물을 제공한다. 본 발명에 의한 항비만용 조성물은 지방세포 형성과정에서의 주된 전사인자인 C/EBP α 및 PPAR γ 유전자의 전사를 억제하고, 또한 렙틴, 아디포넥틴, 및 리지스틴과 같은 지방세포 생성 마커 단백질을 현저히 하향조절하여 지방세포의 분화를 억제함으로써 항비만활성을 발휘한다.

키토산 올리고당, 항비만

Description

키토산 올리고당을 활성성분으로 포함하는 항비만용 조성물{ANTI OBESITY AGENT COMPRISING CHITOSAN OLIGOSACCHARIDES AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 항비만용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 키토산 올리고당을 활성성분으로 포함하는 항비만용 조성물에 관한 것이다.

비만은 단순히 비만자체의 심각성 보다 이로 인해 유발되는 당뇨병, 동맥경화, 심혈관계 질환과 고지혈증 등과 같은 대사성질환이 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 최근 보건복지가족부가 발표한 '2007 국민건강영양조사'에 따르면 최근 2년 사이 우리 국민의 신체활동량은 줄고 비만 관련 질환은 늘어난 것으로 나타났다. BMI 25 이상인 비만자의 경우 특히 남성에서 36.2%로 1.5% 증가했으며(10년간 11.1% 증가) BMI 30 이상의 고도비만율도 4.1%로 0.6% 증가하였다. 비만은 체내 잉여 에너지가 중성지방 및 기타 지방대사물의 형태로 지방조직에 저장됨으로서 일차적으로 나타나며, 이러한 에너지대사의 불균형에 따른 종합적인 대사이상에 의해 유발되는 질병으로서 식이조절뿐만 아니라 식욕조절 호르몬 대사, 지방세포분화, 지방합성 및 분해과정 그리고 열생성반응 등 다양한 측면에서의 접근이 요구되고 있다. 또한 소아 청소년 비만 유병률도 증가추세였으며 비만과 관련된 고지혈증도 지속적으로 늘어 10.8%로 2.7% 증가된 것으로 조사되었다. 따라서, 항비만 소재개발 연구는 식욕억제 물질인 렙틴(leptin)의 저항성을 유도하는 사이토카인 시그날링 3 서프레서(cytokine signaling 3 suppressor), 시상하부에 존재하는 음식 섭취 조절에 관여하는 카나비노이드 리셉터 1 길항제(cannabinoid receptor 1 antagonist), 식욕 촉진을 일으키는 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y) 길항제 등 식욕을 억제하여 체중을 감소시키는 것과 성장 호르몬 합성물 (AOD9604), 지방대사 촉진 및 대사율 증가 활성을 지닌 β3-adrenergic receptor agonist, UCP 과다발현을 통해 에너지 소비 촉진에 관여하는 PPARδ 등 에너지 소모를 증가시켜 체중을 감소시키는 방향으로 이뤄지고 있다.

그동안 비만 치료를 위해 개발된 약물들은 효과에 비해 부작용이 심각해 항비만 효과는 높고 부작용이 적은 새로운 작용기전을 가진 물질의 개발이 절실히 요구되고 있다.

3T3-L1 세포는 원래 마우스 엠브리오로부터 유래되었고, in vitro 모델에서 지방세포 분화와 기능을 위해 매우 유용하게 제공되어 왔다. 덱사메타손, 메틸이소부틸잔틴, FBS 및 인슐린의 혼합물인 지방세포형성 칵테일을 이용하여 분화를 모사하였을 때, 이들 배양물은 지방세포적 특성을 갖게 된다. 지방세포의 분화과정에서 많은 형태학적 및 생리학적 변화가 일어난다. 3T3-L1 세포는 방추사 형태의 섬유아세포에서 크고 구형세포로 변하며, 현미경으로 관찰할 수 있는 많은 양의 트 리글리세라이드 방울을 축적한다. 3T3-L1 세포는 지방세포 분화 조절기작의 연구를 용이하게 한다.

지방전구세포 의 지방세포로의 분화는 연쇄과정에 관여하는 전사인자를 활성화하는 다양한 작동체(effectors)에 대하여 포화되고 비활동성인 군집의 세포를 노출하는 과정을 포함한다. 이러한 연쇄과정은 최종적으로 C/EBPα와 퍼옥시좀 증식활성 수용체인 (PPAR)γ의 발현을 유도하는 CCAAT/인헨서 결합 단백질(C/EBP)β와 C/EBPδ로 시작된다. 이들 전사인자들은 지방세포 지방산 결합 단백질, 글로코스 트랜스포터4, 리포프로테인 리파아제 및 렙틴의 유전자를 포함하는 지방세포의 표현형을 형성하고 유지하는데 관여하는 유전자의 발현과 조화를 이룬다.

한편 키틴과 키토산은 고유한 구조와 특이한 성질을 가지는 다양이온성 폴리머이다. 키틴은 몇몇 곰팡이나 미생물의 세포벽에 뿐만 아니라 갑각류와 곤충의 보호 큐티클에 널리 분포하고, 통상적으로 게나 새우의 껍질로부터 얻어진다. 키틴은 100℃에서 45% NaOH로 2시간 탈아세틸처리하여 키토산으로 변환된다. 키토산 올리고당은 키토산의 효소에 의한 가수분해로 제조될 수 있다. 키토산과 키토산올리고당은 상업적으로 대량생산, 시판되고 있다. 하지만 지방세포 분화에 관한 세포적 내지 분자적 기작에 대한 키토산 올리고당의 연구는 거의 이루어지지 않고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같이 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로,

그 목적은 식품소재로부터 유래되어 부작용이 없으면서 항비만활성이 우수한 항비만용 조성물을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 키토산 올리고당을 활성성분으로 포함하는 항비만용 조성물.

(2) 제 1항에 있어서,

지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물.

(3) 제 1항에 있어서,

C/EBP α 및 PPAR γ 유전자의 전사를 억제하는 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물.

(4) 제 1항에 있어서,

1 내지 5 KDa의 키토산 올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물

본 발명에 의하면, 식품소재로부터 유래되어 부작용이 없으면서 항비만활성이 우수한 항비만용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 식품소재로부터 유래되어 부작용이 없으면서 항비만활성이 우수한 키토산 올리고당을 활성성분으로 함유하는 항비만용 조성물을 포함한다.

본 발명에 사용가능한 키토산 올리고당에는 특별한 제한이 없으며, 시판되는 것을 구입하여 사용하여도 좋고, 키토산을 효소를 이용하여 가수분해한 것을 이용하여도 좋다. 바람직하게는 상기 키토산 올리고당은 1 내지 5 KDa, 보다 바람직하게는 1 내지 3KDa의 저 사슬길이를 가지는 키토산 올리고당을 사용하는 것이 항비만 활성이 우수하다.

상기 본 발명에 따른 항비만용 조성물에 활성성분으로 포함되는 키토산 올리 고당은 지방세포 형성과정에서의 주된 전사인자인 C/EBP α 및 PPAR γ 유전자의 전사를 억제하고, 또한 렙틴, 아디포넥틴, 및 리지스틴과 같은 지방세포 생성 마커 단백질을 현저히 하향조절하는 것으로 밝혀져 키토산 올리고당을 함유하는 상기 본 발명의 항비만용 조성물은 지방세포의 분화를 억제하는 특성이 우수한 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 항비만용 조성물은 조성물의 총 중량에 대하여 상기 키토산 올리고당을 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 항비만용 조성물은 홍화씨 추출물을 더 함유할 수 있으며, 홍화씨 추출물은 항산화 활성이 우수할 뿐만 아니라, 키토산 올리고당의 처리시 보조조제로서 처리함으로써 항비만 활성을 보다 증진시킬 수 있다. 상기 홍화씨 추출물의 첨가량은 0.1 내지 10 중량%의 범위가 바람직하다.

본 발명에 따른 항비만용 조성물은 정제, 레커칠된 정제, 당 코팅된 정제, 경질 및 연질 캡슐, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태로서 경구적으로 투여될 수 있다. 이러한 형태의 제제는 비경구적으로도 투여될 수 있다. 또한 예를 들어, 좌약의 형태로 직장으로 투여되거나, 주사액의 형태로 비경구적으로도 투여될 수 있다. 활성성분은 위와 같은 경구 또는 비경구 투여제의 제형으로 각 활성 성분 모두를 함유하는 형태로 제형화되거나, 함께 또는 순차적으로 투여될 수 있는 단일 물질의 특별한 조합으로 개별적으로 투여될 수도 있다. 정제, 래커칠된 정제, 당 코팅된 정제 및 캡슐을 제조하기 위하여, 약제학적으로 불활성인 무기 또는 유기 부형제가 본 발명의 제형을 위해 첨가될 수 있다. 이러한 부형제로는 락토스, 옥수수전분 또는 이들의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 이들의 염을 들 수 있다. 상기 캡슐에 적합한 부형제로는 식물성유, 왁스, 지방, 반고체 또는 액체 폴리올을 들 수 있다. 용액 및 시럽을 제조하는데 적절한 부형제는 예를 들어, 물, 폴리올, 수크로스, 전화당글루코스 등이다. 주사액에 적합한 부형제로는 물, 알코올, 글리세롤, 식물성유를 들 수 있다. 좌약에 적합한 부형제로는 천연유 또는 경화유, 왁스, 지방, 반액체 또는 액체의 폴리올을 들 수 있다.

또한 본 발명에 따른 제형은 필요에 따라 방부제, 용해제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 향미제, 삼투압 조절제, 완충제, 코팅제 및/또는 산화방지제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 화합물은 1일 10 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 15 내지 70mg/kg으로 투여하는 것이 좋으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 키토산 올리고당을 포함하는 식품조성물을 포함한다. 상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강기능성 식품 조성물의 경우는 1일 10 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 15 내지 70mg/kg로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물에는 100 ㎖를 기준으로 1 내지 10 g, 바람직하게는 2 내지 5 g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물들을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0 내지 약 30 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

[실험과정]

3T3-L1 섬유아세포는 ATCC로부터 구입하고, 키토산 올리고당은 주식회사 키토라이프(경기, 한국)로부터 구입하였다.

세포배양 및 지방세포의 분화

마우스 3T3-L1 지방전구세포를 습한 5% 이산화탄소 분위기에서 10% FBS를 함유하는 DMEM를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 3T3-L1 세포가 포화되었을 때 세포를 0.25 μM DEX, 0.5 mM IBMX, 및 10 μg/ml 인슐린(10% FBS를 함유하는 DMEM)을 함유하는 분화배지에 48시간동안 배양하였다. 세포배양배지를 5 μg/ml 인슐 린(10% FBS를 함유하는 DMEM)을 함유하는 포스트 DM 배지로 바꾸고, 포스트 DM은 매 48시간마다 새로운 걸로 교체하였다. 분화된 세포들은 적어도 95%의 세포들이 지질액적의 축적에 의해 지방세포적 표현형을 보였을 때만 사용되었다. 지방세포 분화에서 키토산 올리고당의 기능을 결정하기 위해 조 키토산 올리고당(다양한 분자량으로 구성) 및 분획 키토산올리고당(3개 다른 분자량으로 구성)을 각각 소정 농도로 배지에 첨가하였다. 세포는 RNA와 트리글리세라이드 분석, 또는 세포지질함량 지시약인 오일 레드 O 염색을 위해 분화개시 후 8일 에 획득하였다.

오일 레드 O 염색

PBS로 세포를 2회 세척하고, 10% 포름알데히드로 실온에서 10분간 고정하고, 60℃에서 10분간 오일 레드 O로 염색하였다. 지방세포에서 지방액적은 빨간색으로 염색되었다.

RT-PCR 분석

총 RNA는 RNAiso 시약(TAKARA, 일본)을 이용하여 분리하였다. 유전자 특이적인 프라이머를 가지고 원스텝 RT-PCR 키트를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다.

PPAR-γ: 포워드 5'-GGTGAAACTCTGGGAGATTC-3'

리버스 5'-CAACCATTGGGTCAGCTCTT-3'

C/EBPα: 포워드 5'-AGGTGCTGGAGTTGACCAGT-3'

리버스 5'-CAGCCTAGAGATCCAGCGAC-3'

β-액틴: 포워드 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'

리버스 5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'

PCR 반응은 하기 조건으로 써멀 사이클러(Techne, 프린스톤, 미국)를 이용하여 수행하였다.

PCR 조건: 50℃ 30분, 95℃ 15분(1사이클); 94℃ 30초, 50℃ 30초, 및 72℃ 1분(30 사이클).

PCR 산물은 EtBr을 함유하는 1% 아가로오즈겔상에서 전기영동하고, UV광에서 단일 콤팩트한 밴드의 예측된 사이즈로서 가시화하였다.

트리글리세라이드 분석

처리된 3T3-L1 지방세포를 PBS로 가볍게 씻고, 0.1% NP40으로 보충된 PBS로 분해하였다. 트리글리세라이드 함량은 트리글리세라이드 GPO 트린더 키트(시그마)를 이용하여 측정하였다. 흡광도는 540nm에서 측정하고 트리글리세라이드를 브래드포드 분석에 의해 결정된 단백질 함량으로 정규화하였다.

웨스턴 블롯 분석

관심있는 단백질의 조절수준이 아래 웨스턴블롯 분석에 의해 확인되었다. 세포를 균질화하고 10㎍의 단백질을 2X 샘플버퍼(50mM Tris(pH 6.8), 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.1% 브로모페놀블루, 5% 베타-머캡토에탄올)로 희석하여 SDS PAGE(7.5와 12%)를 하기 전에 95℃로 5분간 가열하였다. 그리고 세포를 PVDF 막으로 옮기고, 4℃에서 0.1% TWEEN 20을 함유하는 Tris 완충염(TBS)에 5% 블로킹제로 밤샘 배양하였다. 막을 TWEEN-20(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 8.0)으로 TBS를 4밤샘교체하여 세s-HCl새 세s완충액으로 5분간 밤, 10분간 밤 배양한 후 1:200으로 희석된 1차 항체(레빗 안티렙틴Cl마우스 안티 PPARγCl마우스 안티 리지스틴Cl및 마우스 안티 아디포넥틴)를 함유하는 블로킹 용액으로 2시간 동안 배양하였다. 4밤샘씻은 후 막을 2시간 동안 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합 안티고우트 IgG와 안티 레빗 IgG 2차 항체(1:1000)로 배양하HClECL(아머샴 바이오사이언스)로 현상하였다. 웨스턴 블롯은 UMAX 파워룩 1120으로 스캐닝하여 분석하고 이미지 분석 소프트웨어(KODAK ID, 미국)를 사용하여 디지털화하였다.

[실험결과]

3T3-L1 지방세포 분화에 대한 키토산 올리고당의 억제효과

키토산 올리고당이 지방세포 분화를 억제하는지 알아보기 위해 인슐린, 덱사메타손, 및 이소부틸메틸잔틴(분화배지, DM)을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포 분화를 유도하였다. DM 유도동안에 키토산 올리고당을 0일차에 배지에 첨가하고, 3T3-L1 지방세포 분화에 대한 이들의 효과를 관찰하고, 지방세포를 오일레드 o로 염색하였다. 염색결과에서 분화기간동안 조 키토산 올리고당의 5일 배양시 유의적으로 3T3-L1 지방세포형성을 억제한 것을 확인하였다(도 1). 조 키토산 올리고당으로 3T3-L1 세포를 처리한 결과 현저하게 세포분화(도 1A) 및 트리글리세라이드 축적(도 1B)를 대조군에 비하여 투여량에 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 키토산 올리고당 중에서도 1 내지 3 KDa의 작은 길이의 사슬이 트리글리세라이드 함량을 줄이는데 효과적이었다(도 2).

지방세포 전사인자의 발현에 대한 키토산 올리고당의 영향

지방세포 분화기간동안 키토산 올리고당의 억제 기작을 조사하기 위하여 지방세포 분화에 주요 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 조사하였다. 3T3-L1 지방세포 분화의 DM 유도 기간에 PPARγ와 C/EBPα이 DM에 의해 활성화된다는 보고가 있다. 5일에 분화된 3T3-L1 세포로부터 총 RNA를 정제하고 RT-PCR을 수행한 결과 전사단계에서 키토산 올리고당의 처리에 의해 PPARγ와 C/EBPα가 강하게 억제(약 40%)되는 것을 확인하였으며, 이는 키토산 올리고당이 3T3-L1에서 지방세포 분화를 위한 시그날링에 영향을 주는 것을 암시한다.

지방세포형성 마커 단백질의 발현에 대한 키토산 올리고당의 영향

PPARs mRNA와 단백질 수준이 키토산 올리고당에 의해 저해되므로 PPARs의 목적 유전자가 키토산 올리고당의 처리로 인해 3T3-L1 지방세포에서 억제되는 지를 조사하였다. 웨스턴 블롯 실험에 의하면 PPARsγ, 아디포넥틴, 렙틴, 및 리지스틴은 단백질 수준에서 현저하게 하향조절되는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 뿐만 아니라, 지방세포형성과정에서 중요한 생물적표지인 지방산결합단백질(FABP)과 글 루코스 트랜스포터4(GLUT4)가 키토산 올리고당 처리에 의해 현저하게 하향조절되어졌다(도 4). 이들 결과는 키토산 올리고당이 지질생성과 지방세포형성을 이들 마커 단백질의 하향조절에 의해 저해하는 것이 명백하다는 것을 알려준다.

도 1은 대조군과 본 발명 실시예에서의 지방세포에서의 지방 액적 사진.

도 2는 3T3-L1에서 트리글리세라이드 함량에 대한 서로 다른 분자량을 가지는 키토산 올리고당의 영향을 측정한 결과.

도 3은 RT-PCR로 분석한 PPARγ와 C/EBPα의 mRNA 발현에 대한 키토산 올리고당의 영향을 측정한 결과.

도 4는 3T3-L1 세포에 대한 PPARγ, 아디포넥틴, 렙틴, 리지스틴, FABP, 및 GLUT4의 단백질 발현에서의 키토산 올리고당의 영향을 측정한 결과.

Claims (4)

1. 키토산 올리고당을 활성성분으로 포함하는 항비만용 조성물.
2. 제 1항에 있어서,

   지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물.
3. 제 1항에 있어서,

   C/EBP α 및 PPAR γ 유전자의 전사를 억제하는 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물.
4. 제 1항에 있어서,

   1 내지 5 KDa의 키토산 올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만용 조성물

Images