KR20110038181A - Ｉｂ-ｑｘ-유사 균주로부터 유래된 감염성 기관지염 백신 - Google Patents

Ｉｂ-ｑｘ-유사 균주로부터 유래된 감염성 기관지염 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IB-QX로 공지된, 최근에 확인된 유전자형의 IB 바이러스로부터, 또는 IB-QX-유사 바이러스로 본원에서 지칭되는, IB-QX와 유전학적으로 관련되는 바이러스로부터 유래된 감염성 기관지염 (IB) 바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 IB 바이러스는 약독화 생 바이러스 또는 불활성화 바이러스일 수 있다. IB-QX-유사 바이러스의 연속 계대에 의해 본 발명의 약독화 생 IB 바이러스가 생산될 수 있다. 본 발명의 IB 바이러스는, 특히, IB-QX 및 IB-QX-유사 바이러스에 대한 백신에 유용하다. 지금까지, IB 바이러스의 공지된 백신 균주는 IB-QX 및 IB-QX-유사 바이러스에 의해 야기되는 감염성 기관지염에 대해 보호하는데 불충분한 것으로 판명되었다.

Description

ＩＢ-ＱＸ-유사 균주로부터 유래된 감염성 기관지염 백신 {INFECTIOUS BRONCHITIS VACCINES DERIVED FROM IB-QX-LIKE STRAINS}
관련 출원에 관한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2008년 8월 8일 출원된 가출원 61/087,228을 우선권으로 청구하고, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 조류 전염병에 대한 백신 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 감염성 기관지염 (IB) 바이러스에 대한 신규 백신에 관한 것이다.
배경기술
감염성 기관지염 (IB) 바이러스는 가금류 (예를 들어, 닭)에서 호흡기 질환을 야기하는 코로나바이러스이다. IB 질환 증상에는, 예를 들어, 호흡 곤란, 체중 감소, 산란 감소, 이상란(abnormal egg)의 빈도 증가, 및 사망률 증가가 포함된다.
IB 바이러스의 여러 상이한 유전자형 및 혈청형이 확인되었다. IB 바이러스의 유전자형 결정은 바이러스의 S1 (스파이크) 단백질을 코딩하는 유전자 전체 또는 이의 일부분의 서열을 결정함으로써 일반적으로 달성된다. S1 단백질은 IB 바이러스의 게놈에 의해 코딩되는 더 큰 S 당단백질의 N-말단 절단 생성물이다. S 당단백질의 C-말단 절단 생성물은 S2 단백질로 지칭된다. S1 단백질은 세포 부착을 담당하고, IB 바이러스에 대한 주요 항원 결정인자이다. IB 바이러스의 예시적인 유전자형 (또는 "균주")에는 793B, 매사추세츠(Massachusetts), 이태리(Italy)02, D274, 아칸소(Arkansas), B1648 및 D1466이 포함된다. (예를 들어, [Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257] 참조).
"QX" ("QXIBV"로 또한 지칭됨)로 지정된, IB 바이러스의 신규 유전자형이 1990년대 후반 중국에서 최초로 확인되었다. ([Liu et al. (2006), Archives of Virology 151:1133-1148] 참조). 최초의 QX 유전자형의 확인 이래로, S1 뉴클레오티드 서열 수준에서 QX에 대한 유사성/동일성 정도가 높은 수많은 IB 바이러스 유전자형이 세계적으로 확인되었다. 이러한 "IB-QX-유사" 바이러스들 (본원에서 추가로 정의됨)이, 예를 들어, 프랑스, 독일, 네덜란드, 벨기에, 영국, 이태리 및 폴란드에서 확인되었다.
명확하게, IB-QX-유사 바이러스들은 가금류 산업을 심각하게 위협한다. 이러한 유형의 IB 바이러스의 중요성이 급속하게 드러나고 있음에도 불구하고, 지금까지, IB-QX-유사 바이러스에 대해 특이적인 백신이 이용가능하거나 당업계에 기술되어 있지 않았다. 시판되는 IB 백신 (약독화된 생(live) 균주)은 IB-QX-유사 바이러스에 대해 닭을 보호하는데 효과적이지 않은 것으로 발견되었다. 따라서, IB-QX 및 IB-QX-유사 바이러스에 대한 특이적 보호를 제공하는 새로운 백신 조성물 및 백신접종 방법이 당업계에서 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 IB-QX 및 IB-QX-유사 바이러스에 의한 감염에 대해 보호하는 백신 조성물 내의 항원성 성분으로서 특히 유용한 IB 바이러스를 제공함으로써 상기 언급된 당업계에서의 요구를 충족시킨다. 본 발명은 약독화된 생 버전(version)의 IB-QX-유사 바이러스를 포함한다. 이같은 약독화된 생 균주는, 예를 들어, 적합한 약독화가 수득될 때까지 IB-QX-유사 바이러스를 연속적으로 계대시킴으로써 생산될 수 있다. 본 발명은 불활성화 버전의 IB-QX-유사 바이러스를 또한 포함한다. 본 발명의 정황에서 사용하기 위한 IB-QX-유사 바이러스는, 예를 들어, IB-QX-유사 바이러스의 기탁 균주로부터, IB-QX-유사 바이러스 감염의 야생 사례로부터, 또는 특정 S1 유전자 서열과 같은 규정된 미리 정해진 유전자 절편을 발현하는 재조합 IB 바이러스의 구축에 의해 수득될 수 있다.
본 발명은 IB-QX-유사 바이러스의 생, 약독화 또는 사멸 균주를 포함하는 백신 조성물, 뿐만 아니라 IB-QX-유사 바이러스의 생, 약독화 및/또는 사멸 균주의 제조 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 IB-QX-유사 바이러스의 생, 약독화 또는 사멸 균주를 포함하는 백신 조성물을 새에게 투여하는 것에 의한 감염성 기관지염에 대한 새의 백신접종 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 또 다른 양상들이 본원에서 하기에 기재된 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 명백할 것이다.
도면의 간단한 설명
없음
상세한 설명
본 발명은 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 IB 바이러스를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "IB-QX-유사 바이러스"는 원형 IB-QX 균주의 S1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 95％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 S1 단백질을 갖는 임의의 바이러스를 의미한다. 원형 IB-QX 균주의 S1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 1 (표 1 참조)에 의해 제시되고, NCBI 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 AF193423 하에 입수가능하다.
Figure pct00001
따라서, 서열 1과 95％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 S1 단백질을 갖는 임의의 바이러스가 본 발명을 위한 "IB-QX-유사" 바이러스이다. IB-QX-유사 바이러스의 예가 [Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257]에 기재되어 있고, 여기에는 L-1148 ([Worthington et al., 상기 문헌]에서 "NL/L-1148/04"로 또한 지칭됨), 1449-2 ([Worthington et al., 상기 문헌]에서 "NL/L-1449K/04"로 또한 지칭됨), 1449-10 ([Worthington et al., 상기 문헌]에서 "NL/L-1449T/04""로 또한 지칭됨), 및 로버튼(Roberton) ([Worthington et al., 상기 문헌]에서 "FR/L-1450T/05"로 또한 지칭됨)으로 명시되는 IB 바이러스 유전자형이 포함된다. 본 발명의 IB 바이러스가 유래될 수 있는 예시적인 IB-QX-유사 균주가 하기 표 2에 기재된다. 본 발명을 위해, IB-QX-유사 바이러스라는 용어는 원형 QX IB 바이러스를 특히 포함한다.
Figure pct00002
S1 코딩 서열의 서열 비교에 더하여, 또 다른 방법들을 사용하여 IB-QX-유사 바이러스를 확인할 수 있다. 이같은 방법들은, 예를 들어, 바이러스성 샘플들의 대형 풀(pool)로부터 후보 IB-QX-유사 바이러스를 확인하기 위한 예비 스크린으로서 사용될 수 있다. 바이러스가 이러한 예비 스크린들 중 하나에 의해 IB-QX-유사 바이러스인 것에 대해 양성으로 테스트되면, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 S1 뉴클레오티드 유전자 서열확인 및 비교에 의해 이러한 바이러스의 유전자형을 확인할 수 있다. IB-QX-유사 바이러스 (또는 추정 IB-QX-유사 바이러스)를 확인하기 위한 예시적인 "예비" 방법은 IB-QX 또는 IB-QX-유사 바이러스로 감염된 동물로부터의 항혈청을 후보 바이러스를 중화하는 능력에 대해 테스트하는 혈청 중화이다. 양성 중화 결과는 후보 바이러스가 IB-QX-유사 바이러스임을 시사할 수 있다.
IB-QX-유사 바이러스에 대한 또 다른 예시적인 예비 스크리닝 방법은 제한 단편 길이 다형성 (RFLP: restriction fragment length polymorphism)이다. 이러한 방법에서, 후보 바이러스로부터의 S1 유전자의 DNA 카피가 RT-PCR에 의해 생산된다. 그후, 비-IB-QX-유사 균주의 S1 유전자에서는 절단되지 않는 위치에서 IB-QX-유사 균주의 S1 유전자를 절단 (또는 반대로 작용)하는 것으로 공지된 제한 효소에 DNA 카피가 노출된다. 예를 들어, 젤 전기영동에 의한, 생성된 소화된 DNA의 크기 분리에 의해 제한 단편 소화에서의 차이가 가시화될 수 있다.
본 발명의 단리된 IB 바이러스는 임의의 본원에 언급된 IB-QX-유사 바이러스로부터, 뿐만 아니라 야생에서 단리될 수 있는 임의의 또 다른 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법에 의해 추가적인 IB-QX-유사 바이러스를 수득할 수 있다. 예를 들어, IB 바이러스에 감염된 것으로 추측되거나 또는 감염성 기관지염의 하나 이상의 증상을 나타내는 닭으로부터 채취된 샘플 (예를 들어, 입인두 면봉채취물(swab))을 스크리닝함으로써 IB-QX-유사 바이러스를 수득할 수 있다. 이같은 샘플로부터 RNA를 단리하고, S1 유전자 또는 이의 일부분의 DNA 카피를 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 생성시킨다. 그후, S1 DNA 카피의 서열을 확인하고, 이렇게 수득된 뉴클레오티드 서열을 IB QX의 S1 유전자의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)에 대해 비교하고, 2개의 서열 간의 백분율 동일성을 결정한다.
예시적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 IB-QX-유사 바이러스 L-1148 (서열 2), 1449-2 (서열 3), 또는 1449-10 (서열 4)의 S1 단백질과 아미노산 서열이 동일한 S1 단백질을 갖는 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 IB 바이러스를 포함한다. 이러한 균주들로부터의 S1 단백질의 아미노산 서열이 표 3에서 제시된다:
Figure pct00003
Figure pct00004
재조합 방법 또는 "역 유전학" 방법을 사용하여 당업자에 의해 본 발명의 단리된 IB 바이러스가 또한 생산될 수 있다. 예를 들어, [Casais et al. (2003) J. Virol. 77:9084-9089]에 이종성 스파이크(spike) 유전자를 발현하는 재조합 IB 바이러스의 구축이 기술되어 있다. ([Hodgson et al. (2004) J. Virol. 78:13804-13811]을 또한 참조한다). 이러한 시스템은 IB 바이러스 감염성 클론, 즉, 우두 바이러스 벡터와 같은 벡터 내로 클로닝된 전장 IB 바이러스 cDNA를 사용하는 것을 수반한다. (예를 들어, [Casais et al. (2001) J. Virol. 75:12359-12369] 참조). IB 바이러스 감염성 클론에서 출발하여, 임의의 또 다른 IB 바이러스의 S1 단백질을 발현하는 재조합 IB 바이러스가 구축될 수 있다. 따라서, [Casais et al., 상기 문헌]의 시스템 또는 이의 변형을 사용하여, 임의의 IB-QX-유사 바이러스로부터의 S1 단백질 (즉, 서열 1과 95％ 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 S1 단백질)을 발현하는 재조합 IB 바이러스를 쉽게 제조할 수 있어, 재조합 IB-QX-유사 바이러스가 생산된다. 이렇게 생산된 재조합 IB-QX-유사 바이러스가, 본원에 상세하게 기술된 바와 같이, 천연적으로 수득된 IB-QX-유사 바이러스 (예를 들어, 야생 단리물)가 사용되는 방식과 동일한 방식으로 본 발명의 환경에서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "백분율 동일성"은 모든 검색 파라메터들을 디폴트(default) 값으로 설정하여 프로그램 WU-BLAST-2.0a19 ([Altschul et al. (1997) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 이하 "BLAST"로 지칭됨)에 의해 생성되는 바와 같이, 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 대상 서열 (또는 이의 특정 부분) 내의 뉴클레오티드와 동일한 기준 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율을 의미한다. 매칭되는 동일한 뉴클레오티드의 개수를 백분율 동일성이 보고되는 서열 길이로 나눔으로서 백분율 뉴클레오티드 서열 동일성 값이 결정된다.
IB-QX-유사 바이러스들이 당업계에 공지되어 있지만, IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 IB 바이러스는 당업계에 기술되어 있거나 당업계에서 제안되지 않았고, 따라서 본 발명의 대상이다. IB 바이러스와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "~로부터 유래된"은 IB 바이러스가 (1) IB-QX-유사 바이러스 연속 계대 자손이거나; 또는 (2) 바이러스를 불활성화시키거나 덜 병독성이게 하는 조건에 적용된 IB-QX-유사 바이러스임을 의미한다. 따라서, IB-QX-유사 바이러스"로부터 유래된" 바이러스는 생/약독화 바이러스 또는 불활성화/사멸 바이러스일 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 IB 바이러스는, 특정 실시양태에서, IB-QX-유사 바이러스의 연속 계대 자손이다. "IB-QX-유사 바이러스의 연속 계대 자손"은 IB-QX-유사 바이러스를 바이러스 복제에 도움이 되는 환경에서 증식시키고, 상기 환경에서 제거한 후, 동일하거나 유사한 환경에서 1회 이상 추가적으로 증식시킨 후에 수득되는 바이러스로 본원에서 정의된다. 각각의 증식 및 제거 사이클이 단일 "계대"로 간주된다. 바람직하게는 IB-QX-유사 바이러스의 연속 계대 자손이 약독화된다; 예를 들어, 약독화는 연속 계대의 결과이다.
IB 바이러스 (IB-QX-유사 바이러스 포함)의 예시적인 연속 계대 방법은 가금류 (예를 들어, 닭)의 발육란을 바이러스 복제에 도움이 되는 환경으로 사용하는 것을 수반한다. 예를 들어, 요막강을 통해 다량의 IB-QX-유사 바이러스를 발육 계란에 접종한다. 접종된 발육란을, 예를 들어, 37℃에서 24시간 동안 (또는 또 다른 적절한 인큐베이션 조건, 시간 및 온도 하에) 인큐베이션한다. 발육란으로부터 요막강액을 수확한다. 이러한 시점에, 바이러스가 "1×" 계대되었다. 그후, 적절하게 희석된, 제1 계대로부터의 수확된 요막강액을 새로운 발육란 내로 접종하고, 이를, 예를 들어, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이러한 제2 세트의 발육란으로부터 요막강액을 수확한다. 이러한 시점에, 바이러스가 "2×" 계대되었다. 이러한 방식으로의 계속된 계대를 무기한으로 계속할 수 있다. IB 바이러스를 계대시키는데 사용될 수 있는 바이러스 복제에 도움이 되는 별법적인 환경에는, 예를 들어, 닭 신장 세포 배양물 또는 닭 배아 섬유모세포 배양물과 같은 세포 배양물이 포함된다.
37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하는 것이 IB 바이러스를 계대시키기 위한 예시적인 인큐베이션 단계로서 본원에서 언급되었지만, 당업자는 또 다른 인큐베이션 온도 및/또는 시간이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 20℃ 내지 42℃ 범위의 온도에서 발육란을 인큐베이션할 수 있다. 바이러스 계대를 위한 인큐베이션 시간은 4시간 내지 4일, 더욱 바람직하게는 16시간 내지 36시간 범위일 수 있다.
병독성 정도에 대해 바이러스의 샘플을 각각의 계대 후에 (또는 매 2번째, 4번째, 5번째, 10번째 등의 계대 후에) 테스트할 수 있다. 예를 들어, 계대된 바이러스를 병아리에게 투여하고 감염성 기관지염을 가리키는 다양한 파라메터를 평가함으로써 병독성 정도를 결정할 수 있다. 예시적인 파라메터에는 (i) 기관 체외이식편의 섬모 운동(ciliary activity); (ii) 예를 들어, 눈 또는 코로부터의 수성 삼출물, 헐떡거림, 또는 설사와 같은 임상 징후; (iii) 예를 들어, 상부 기도, 신장, 지라 및/또는 장의 육안 병리 검사; 및 (iv) 기관, 폐 및 신장의 조직학이 포함된다. 각각의 이러한 파라메터의 예시적인 측정이 하기 실시예 2에서 제시된다. 연속 계대에 의해 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 IB 바이러스는 감염성 기관지염을 가리키는 파라메터들 중 하나 이상이 어버이 (계대되지 않은) IB-QX-유사 바이러스로 감염된 병아리에서 관찰된 상응하는 파라메터에 비해 감소되거나, 제거되거나 또는 개선되면 "약독화"된 것으로 간주된다. IB 바이러스의 또 다른 공지된 병독성 균주로 감염된 병아리에 대해 또한 비교가 이루어질 수 있다.
IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 연속 계대된 IB 바이러스의 병독성을 평가하기 위한 비-제한적인 예시적인 방법이 실시예 2에서 설명된다. 간략하게, IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 연속 계대된 IB 바이러스가 접종된 병아리에게 (i) 기관 체외이식편의 섬모 운동, (ii) 임상 징후, 및 (iii) 병리 검사를 반영하는 수치 점수를 부여한다. 총점 [(i) + (ii) + (iii)]을 결정한다. 하기와 같이 병독성 분류가 정해진다:
ㆍ "병독성 아님": 총점이 비-챌린지(non-challenged) 대조군의 총점 이하인 경우.
ㆍ "약독성(mild)": 총점이 비-챌린지 대조군의 총점보다 크지만, IB 바이러스의 공지된 약독 균주 (예를 들어, POULVAC IB H120 (매사추세츠 균주), Fort Dodge Animal Health (Fort Dodge, IA))가 챌린지된 군에 대한 총점 이하인 경우.
ㆍ "중등도 병독성": 총점이 IB 바이러스의 공지된 약독 균주가 챌린지된 군에 대한 총점보다 높지만, IB 바이러스의 공지된 병독성 균주 (예를 들어, 어버이 IB-QX-유사 균주 또는 기타 공지된 병독성 균주 예컨대 IB-M41 균주)가 챌린지된 군에 대한 총점 이하인 경우.
ㆍ "병독성": 총점이 IB 바이러스의 공지된 병독성 균주가 챌린지된 군에 대한 총점 이상인 경우.
상기의 분류 안에 따라 "병독성 아님" 또는 "약독성"으로 분류된 IB 바이러스가 약독화 생 백신 균주로서 적절하다. 특정 상황에서, "중등도 병독성" IB 바이러스가 약독화 생 균주로서 또한 유용할 수 있다.
연속 계대된 IB-QX-유사 바이러스의 백신 균주로서의 적절성을 평가하기 위한 별법적인 방법들이 당업계에 공지되어 있고, 본원에서, 예를 들어, 실시예 3에서 설명된다. 실시예 3에 나타난 바와 같이, 섬모 점수 및 신장 및 기관 형태학이 다중 계대 후 약독화 정도를 결정하는데 사용된다. 차례로, 이러한 파라메터들이 소정의 균주가 백신 목적에 적절한지 (예를 들어, 충분히 안전한지) 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, IB-QX-유사 바이러스"로부터 유래"된 IB 바이러스의 또 다른 카테고리는 바이러스를 불활성화시키거나 덜 병독성이게 하는 조건에 적용된 IB-QX-유사 바이러스이다. 전형적으로 약독화 생 바이러스인 연속 계대된 IB 바이러스와 달리, 이러한 제2 카테고리의 IB 바이러스는 전형적으로 불활성화 또는 사멸된 것으로 간주된다. IB 바이러스가 포함되는 바이러스의 불활성화 방법이 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 상기 논의에 설명된 바와 같이, IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 본 발명의 IB 바이러스는 불활성화 또는 약독화 바이러스일 수 있다. 불활성화된 경우, 바이러스를 불활성화 화합물, 예를 들어, β-프로피오락톤 또는 포르말린과 접촉시킴으로써 본 발명의 IB 바이러스가 불활성화될 수 있다. 약독화된 경우, IB-QX-유사 바이러스의 최초 계대로 시작하여 연속 계대에 의해 본 발명의 IB 바이러스가 약독화될 수 있다. 바이러스 복제에 도움이 되는 임의의 환경에서 IB 바이러스가 계대될 수 있다. 이같은 환경에는, 예를 들어, 가금류 발육란이 포함된다. 가금류 발육란에는, 예를 들어, 발육 계란 예컨대 특정 병원체 부재 (SPF: specific pathogen free) 계란이 포함된다. 또 다른 적절한 환경에는, 예를 들어, 세포 배양물이 포함된다.
본 발명의 IB 바이러스를 약독화시키기 위해, 임의의 횟수로 바이러스가 계대될 수 있다. 특정 실시양태에서, 생성된 바이러스가 본원의 다른 곳에서 언급된 분류 방법을 사용하여 "병원성 아님", "약독성" 또는 (특정 실시양태에서) "중등도 병독성"으로서 특성화되기에 적어도 충분한 횟수로 바이러스가 계대된다. 예시적인 특정 실시양태에서, 본 발명의 IB 바이러스가 5회 내지 400회 계대된다. 예를 들어, IB 바이러스가 5회, 10회, 15회, 20회, 25회, 30회, 35회, 40회, 45회, 50회, 55회, 60회, 65회, 70회, 75회, 80회, 85회, 90회, 95회, 100회, 105회, 110회, 115회, 120회, 125회, 130회, 135회, 140회, 145회, 150회, 155회, 160회, 165회, 170회, 175회, 180회, 185회, 190회, 195회, 200회, 205회, 210회, 215회, 220회, 225회, 230회, 235회, 240회, 245회, 250회, 255회, 260회, 265회, 270회, 275회, 280회, 285회, 290회, 295회, 300회, 305회, 310회, 315회, 320회, 325회, 330회, 335회, 340회, 345회, 350회, 355회, 360회, 365회, 370회, 375회, 380회, 385회, 390회, 395회, 400회, 또는 필요하거나 원한다면 이를 초과하여 계대될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 IB 바이러스는 단리된다. 본원에서 사용된 용어 "단리된"은 바이러스가 살아 있는 동물의 조직 내에 함유되지 않은 것을 의미한다.
본 발명은 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 감염성 기관지염 바이러스의 여러 비-제한적인 실험예를 포함한다. 예를 들어, IB-QX-유사 바이러스 L-1148이 10-11일령 특정 병원체 부재 (SPF) 발육 계란에서 64회 계대되었다. 65번째 계대를 위해, SPF 계란에 계대 수준(passage level) 64로부터의 요막강액의 1000배 희석물 0.2 ㎖을 접종하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 요막강액을 풀로 수확하였다. 이러한 65번째 계대 물질이 본원에서 L-1148(p65)로 지칭된다 (실시예 3 참조). L-1148(p65)의 무균성 풀을 선택하고, 풀링(pooling)하고, 안정화제와 혼합하고, 3 ㎖ 바이알에 채우고 (바이알 당 1 ㎖), 동결건조하여, 마스터 시드(master seed) 바이러스 IB QX L1148 MSV65가 제조되었다. 추가로 15회의 계대를 수행하여, 총 80회의 계대로, L-1148(p80)이 생산되었다 (실시예 3 참조). 65번째로 계대된 물질과 같이, 80번째 계대로부터의 요막강액을 풀로 수확하였다. 무균성 풀을 선택하고, 풀링하고, 안정화제와 혼합하고, 3 ㎖ 바이알에 채우고 (바이알 당 1 ㎖), 동결건조하여, 마스터 시드 바이러스 IB QX L1148A MSV80이 제조되었다. IB QX L1148 MSV65 및 IB QX L1148A MSV80을 각각 추가로 5회 계대시켜, IB QX L1148A MSV65 X+5 및 IB QX L1148A MSV80 X+5가 각각 산출되었다.
IB QX L1148 MSV65는 2009년 6월 10일에 <Fort Dodge Animal Health>의 명의로 ECACC(European Collection of Cell Cultures) (Porton Down, UK)에 기탁되었고, 임시 수탁 번호 09061002가 할당되었다.
IB QX L1148A MSV80은 2009년 6월 10일에 <Fort Dodge Animal Health>의 명의로 ECACC (Porton Down, UK)에 기탁되었고, 임시 수탁 번호 09061004가 할당되었다.
IB QX L1148A MSV65 x+5는 2009년 6월 10일에 <Fort Dodge Animal Health>의 명의로 ECACC (Porton Down, UK)에 기탁되었고, 임시 수탁 번호 09061003이 할당되었다.
IB QX L1148A MSV80 x+5는 2009년 6월 10일에 <Fort Dodge Animal Health>의 명의로 ECACC (Porton Down, UK)에 기탁되었고, 임시 수탁 번호 09061001이 할당되었다.
IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 IB 바이러스의 추가적인 비-제한적인 예들이 본원의 다른 곳에서 기술된다.
본 발명은 (i) IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 IB 바이러스; 및 (ii) 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 제약상 허용가능한 담체는, 예를 들어, 물, 안정화제, 방부제, 배양 배지, 또는 완충제, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 현탁액의 형태로 또는 동결건조 형태로, 또는 별법적으로 동결 형태로 제조될 수 있다. 동결되는 경우, 동결될 때의 안정성을 강화하기 위해 글리세롤 또는 기타 유사한 작용제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은, 특히 조성물 내에 함유된 IB 바이러스가 불활성화 (즉, 사멸) 바이러스인 경우, 애주번트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 애주번트는 아크릴계 중합체, 디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드 (DDA), 또는 아크릴계 중합체와 DDA의 조합물일 수 있다. 본원에서 사용된 아크릴계 중합체는 아크릴계 모이어티(moiety)를 함유하는 임의의 중합체 또는 공중합체이다. 예시적인 아크릴계 중합체에는, 예를 들어, 폴리아크릴산, 메타크릴산, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 아크릴레이트, 아크릴니트릴, 및 폴리아크릴산의 알킬-에스테르가 포함된다. 아크릴계 공중합체의 예로는, 예를 들어, 폴리(아크릴아미드-코-부틸, 메타크릴레이트), 아크릴산-메타크릴산, 아크릴산-아크릴아미드 및 폴리(메타크릴레이트)가 포함된다. 시판되는 아크릴계 중합체의 예로는 카르보폴(Carbopol) (B. F. Goodrich Co. (Cleveland, Ohio)), 카르보셋(Carboset) (B. F. Goodrich Co. (Cleveland, Ohio)), 네오크릴(Neocryl) (Avecia, Inc. (Wilmington, Del.)), 및 유드라짓(Eudragit) (Rohm Tech, Inc. (Malden, Mass.))이 포함된다. 본 발명의 에멀션에서 사용하기 위한 특히 바람직한 아크릴계 중합체는 카르보폴이고, 이는 폴리알릴 수크로스와 가교된 아크릴산의 수용성 중합체로 또한 지칭된다. 애주번트는 수용성 또는 수-분산성 애주번트일 수 있다. 애주번트는 오일 에멀션, 예를 들어, 유중수, 수중유, 또는 수중유중수 에멀션일 수 있다. 유중수 에멀션은 하나 이상의 유용성 계면활성제, 하나 이상의 수용성 계면활성제, 추가적인 애주번트, 추가적인 수성 상 성분, 에멀션 안정화제, 또는 이들의 조합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은, IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 IB 바이러스에 더하여, 또 다른 항원성 성분을 포함할 수 있다. 백신 조성물 내에 포함된 또 다른 항원성 성분은 감염원, 예를 들어, 닭의 감염원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 추가적인, 비-IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 약독화 생 IB 바이러스를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "비-IB-QX-유사 바이러스"는 원형 IB-QX 균주의 S1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 95％ 미만으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 S1 단백질을 갖는 임의의 IB 바이러스를 의미한다. 원형 IB-QX 균주의 S1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 1에 제시되고, NCBI 진뱅크 수탁 번호 AF193423 하에 입수가능하다. 따라서, 서열 1과 95％ 미만으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 S1 단백질을 갖는 임의의 바이러스가 본 발명을 위한 "비-IB-QX-유사" 바이러스이다. 예시적인 비-IB-QX-유사 바이러스에는 매사추세츠, 아칸소, 조지아(Georgia)-98, 이태리-02, 793-B, D274, D1466와 같은 균주, 또는 임의의 상기 비-IB-QX-유사 바이러스의 S1 유전자형을 지니는 균주가 포함된다. 본 발명의 백신 조성물은 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 IB 바이러스에 더하여 하나 이상의 시판되는 IB 백신 균주를 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 IB 바이러스가 아닌 감염원으로부터 유래된 추가적인 항원성 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물은 약독화 생 또는 불활성화 조류 바이러스 예컨대 뉴캐슬병(Newcastle Disease) 바이러스, 마렉병(Marek's Disease) 바이러스, 감염성 점액낭병(Infectious Bursal Disease) 바이러스, 레오바이러스(Reovirus), 조류 인플루엔자(Avian Influenza) 바이러스, 닭 빈혈(Chicken Anemia) 바이러스, 또는 조류 뇌척수염(Avian Encephalomyelitis) 바이러스를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 약독화 생 IB 바이러스의 제조 방법을 또한 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에 따라 제조된 약독화 생 바이러스는, 특히, IB 바이러스에 대한 닭의 백신접종에 유용하다. 본 발명의 이러한 양상에 따른 방법은 IB-QX-유사 바이러스를 계대시키는 것을 포함한다. 예를 들어, IB-QX-유사 바이러스가 가금류 발육란 (예를 들어, 발육 계란)에서, 또는 세포 배양물 (예를 들어, 닭 신장 세포 배양물)에서 계대될 수 있다. IB-QX-유사 바이러스가 약독화되기 위해 계대되어야 하는 횟수는 본원에 기재된 교시내용을 기초로 결정될 수 있다. 예를 들어, IB-QX-유사 바이러스를 계대시킨 후, 생성된 IB 바이러스를 닭에게 투여할 수 있고, 그후, 예를 들어, 기관 체외이식편의 섬모 운동, 임상 징후, 육안 병리학 및/또는 감염성 기관지염의 조직학적 징후에 대해, 닭을 평가한다. 자신이 유래된 어버이 IB-QX-유사 바이러스에 비해 (또는 또 다른 공지된 기준 IB 균주에 비해) IB의 감소된 또는 덜 중증인 적응증을 일으키는 계대된 IB 바이러스가 본 발명을 위한 약독화된 균주로 간주된다. 특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 방법은 생성된 바이러스가 본원의 다른 곳에서 기재된 분류 방법에 따라 "병원성 아님" 또는 "약독성"으로 분류될 때까지 IB-QX-유사 바이러스를 계대시키는 것을 포함한다.
본 발명은 감염성 기관지염에 대한 새의 백신접종 방법을 또한 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에 따른 방법은 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 IB 바이러스를 새에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에 따른 방법은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 임의의 IB 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 활성 또는 항원성 성분이 새의 호흡 점막과 즉각적으로 또는 궁극적으로 접촉되는 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 따라서, 백신 조성물은, 예를 들어, 비강내 투여, 경구 투여 및/또는 안내 투여에 의해, 새에게 투여될 수 있다. 조류에게 투여하기 위한 백신 조성물은 상기 기술된 바와 같이 및/또는 에어로졸이 포함되는 분무에 의한 투여에 적절한 형태 (비강내 투여용)로 또는 음료수 (경구 투여용) 내에 제형될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 피하, 근육내 또는 난내(in ovo) 투여될 수 있다. (미국 특허 번호 7,208,164 참조). 본 발명의 이러한 양상에 따르면, IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 IB 바이러스를 포함하는 백신 조성물은 1일령 내지 18주령의 새에게 투여될 수 있다. 난내 투여되는 경우, 백신 조성물은, 예를 들어, 인큐베이션 기간의 후반기에 투여될 수 있다. 예를 들어, 닭의 경우, 일반적으로 대략 인큐베이션 제12일 내지 대략 인큐베이션 제20일에 계란에 접종한다. 바람직하게는, 제14일 내지 대략 제19일 사이에 접종이 일어난다. 더욱 바람직하게는, 대략 제15일-제18일에 계란에 접종한다.
하기의 실시예들은 본 발명의 방법 및 조성물을 설명하지만, 이를 한정하지 않는다. 본 명세서를 고려하여 당업자에게 명백한 분자 생물학 및 화학에서 일반적으로 마주치게 되는 다양한 조건 및 파라메터의 또 다른 적절한 변형 및 개조가 본 발명의 취지 및 범주 내에 속한다.
실시예
실시예 1: IB - QX -유사 바이러스의 확인
이러한 실시예는 후보 IB 바이러스가 IB-QX-유사 바이러스인지를 결정하는 방법을 제공한다. 후보 IB 바이러스를 감염성 기관지염의 하나 이상의 증상을 나타내는 동물로부터 수득된 조직 면봉채취물이 예를 들어 포함되는 다양한 공급원으로부터, 또는 공공 기탁기관으로부터 수득할 수 있다.
본원에서 사용된 "IB-QX-유사 바이러스"는 최초로 확인된 IB-QX 균주의 S1 뉴클레오티드 서열과 95％ 이상 동일한 S1 뉴클레오티드 서열이 있는 감염성 기관지염 바이러스이다. 원형 IB-QX 균주의 S1 뉴클레오티드 서열은 서열 1이고, NCBI 진뱅크 수탁 번호 AF193423에서 확인할 수 있다.
후보 바이러스가 IB-QX-유사 바이러스인지 여부를 확인하기 위해, 후보 바이러스 입자를 함유하는 샘플 (예를 들어, 조직 면봉채취물)로부터 표준 RNA 단리 방법을 사용하여 RNA를 단리한다. 예를 들어, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 페놀-클로로포름 방법을 사용하여 RNA를 추출할 수 있다. ([Chomcznski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156-159]; [Li et al. (1993), Avian Pathology 22:771-783]). 또한, 여러 RNA 단리 키트가 시판되고, 이러한 목적에 적절하다. 그후, 이러한 RNA를 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에서 사용하여, 전체 S1 유전자 또는 S1 유전자의 소위 "초가변 영역"의 증폭된 DNA 카피를 생성시킨다. 바람직하게는, RT-PCR에서 사용된 프라이머는 IB 바이러스의 대부분의 공지된 균주에 공통적인 것이다. 예시적인 프라이머가, 후보 IB 바이러스의 S1 유전자의 초가변 영역을 증폭시키는데 사용될 수 있는 상응하는 RT-PCR 방법과 함께, 예를 들어, [Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257] 및 [Jones et al. (2005), Veterinary Record 156:646-647]에 기재되어 있다. [Worthington et al., 상기 문헌]에서, 네스티드(nested) PCR이 RT 반응 후 수행되어, 염기쌍 약 393개의 S1 초가변 영역의 DNA 카피가 생산된다. 전장 S1 서열확인을 [Adzhar et al. (1996), Avian Pathology 25:817-836]의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. IB 바이러스에 대한 공개적으로 입수가능한 서열 정보를 사용하여 당업자는 S1 유전자 또는 이의 일부분을 증폭시키는데 적절한 별법적인 프라이머 및 RT-PCR 조건을 쉽게 디자인할 수 있다.
후보 IB 바이러스의의 전체 S1 유전자 또는 이의 일부분 (예를 들어, 초가변 영역)의 뉴클레오티드 서열이 결정된 후, 이러한 서열을 IB-QX 균주에 대한 S1 유전자 서열 (서열 1)과 비교하여 백분율 동일성을 결정한다. 후보 IB 바이러스의 S1 유전자 또는 이의 초가변 영역의 뉴클레오티드 서열이 IB-QX의 S1 유전자의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)과 95％ 이상 동일하면, 후보 IB 바이러스가 IB-QX-유사 바이러스로 간주된다.
후보 IB 바이러스가 IB-QX-유사 바이러스인지 여부를 결정하기 위한 예시적인 방법이, 예를 들어, [Gough et al. (2008), Veterinary Record 162:99-100], 및 [Domanska-Blicharz et al. (2006), Veterinary Record 158:808]에 또한 기술되어 있고, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
실시예 2: IB - QX -유사 바이러스의 약독화
서론
이러한 실시예는 IB-QX-유사 바이러스가 발육 계란에서 여러 번 계대되었고 생성된 바이러스의 약독화가 닭에서 실연된 실험을 요약한다.
재료 및 방법
감염성 기관지염 바이러스
L-1148, 1449-2, 및 1449-10으로 명시된 IB-QX-유사 바이러스의 3가지 균주가 이러한 실시예에서 사용되었다. 이러한 3가지 균주 모두 S1 유전자 서열확인 및 IB-QX 및 기타 IB-QX-유사 바이러스에 대한 뉴클레오티드 비교에 의해 IB-QX-유사 바이러스인 것으로 확인되었다. ([Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257] 참조).
균주 L-1148 및 균주 1449-10은 발육 계란에서 각각 50회 계대되었고, 균주 1449-2는 발육 계란에서 5회 계대되었다. 이러한 다중 계대로부터 수득된 균주들을 각각 L-1148(p50), 1449-10(p50), 및 1449-2(p5)로 명시하였다. 따라서, L-1148(p50)은 L-1148로부터 유래되었고, 1449-10(p50)은 1449-10으로부터 유래되었으며, 1449-2(p5)는 1449-2로부터 유래되었다.
연구 디자인
공지된 약독성 (IB-H120, 백신 균주) 및 병독성 (IB-M41) IB 균주와 함께, L-1148(p50), 1449-10(p50), 및 1449-2(p5) 바이러스를 닭에게 챌린지하였다. 비-챌린지 대조군이 연구에 또한 포함되었다. 연구 디자인이 표 4에 요약된다:
Figure pct00005
동물 및 축산
60마리의 SPF-병아리가 이러한 실시예에서 사용되었다. 15일령에, 50마리의 병아리를 5개의 군 (1-5)으로 나누고, 분리기에서 거주시켰다. 대조군으로 사용된 10마리의 병아리는 우리에 머무르게 하였다. 순응시키기 위해, 분리기로 이동된 병아리들을 3일 동안 단독으로 방치하였다. 음식 및 물은 자유롭게 이용가능하였다. 모든 병아리들을 연구 전반에 걸쳐 IB의 임상 징후에 대해 관찰하였다.
바이러스의 투여
1 ㎖ 주사기를 사용하여, 각각의 병아리의 각각의 눈에 0.1 ㎖를 투여함으로써 일련의 5마리의 병아리에게 IB 바이러스를 챌린지하였다. IB-M41의 경우, 병아리에게 눈 당 0.25 ㎖을 제공하였다. 모든 병아리에게 18일령에 약 106.0 EID50 IB 바이러스를 챌린지하였다. 바이러스 스톡(stock)을 -70℃에서 보관하였고, 투여 전에 적합한 농도로 영양 브로스(broth)에서 희석하였다.
바이러스를 병아리에게 투여한 직후, 사용된 바이러스의 샘플을 역가 재결정을 위해 -70℃의 무균 용기에서 보관하였다.
기관 체외이식편의 섬모 운동
챌린지 4일 후, 기관 체외이식편의 섬모 운동을 검사하였다. 병아리를 34％ O2 및 66％ CO2의 기체 혼합물로 기절시켰다. 완전 마취 상태에 도달했을 때, 100％ CO2의 흡입에 의해 병아리를 사망시켰다. 사망 직후, 기관 (머리 기부에서부터 울대로부터 0.5 ㎝ 근위부까지)을 제거하였다. 기관 제거 직후에, 이를 바늘이 없는 주사기를 사용하여 37℃의 PBS로 헹구고, 추가로 프로세싱할 때까지 37℃의 PBS에서 보관하였다. <McIlwain Tissue Chopper> (Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. (Surrey, United Kingdom))를 사용하여 기관의 0.6 ㎜ 횡단 절편을 제조하였다. 기관의 횡단 절편을 2 ㎖의 37℃ PBS와 함께 페트리 접시에 놓고, 4분 이내에 현미경으로 검사하였다. 기관의 3개의 상부 절편, 4개의 중부 절편 및 3개의 하부 절편의 섬모 운동을 저배율 (400×) 현미경으로 검사하였다. 각각의 기관 절편의 섬모 운동을 새를 사망시키고 나서 20분 이내에 검사하였다.
섬모 운동을 0 (100％ 섬모 운동) 내지 4 (0％ 섬모 운동)의 등급으로 채점하였다. 각각의 군에 대해, 정지를 나타낸 기관 절편의 합계를 군 당 병아리 마릿수로 나눔으로써 평균 섬모정체(ciliostasis)를 계산하였다. 계산된 군 당 평균 섬모정체를 풀백(Poulvac) IB 120 및 IB-M41이 챌린지된 군 및 비-백신접종 군의 평균 섬모정체와 비교하였다. IB-M41은 병독성으로 분류되고, 풀백 IB H120 내의 IB 바이러스는 약독성으로 분류된다.
임상 징후
연구 전반에 걸쳐 동물 전문가에 의해 임상 징후에 대해 새를 매일 관찰하였다. IB 감염에 기인하는 임상 징후들을 하기와 같이 채점하였다:
Figure pct00006
육안 병리 검사
각각의 병아리를 부검하여, IB 감염의 결과일 수 있는 모든 이상을 결정하였다. 이탈을 하기와 같이 채점하였다:
ㆍ 상부 기도: 정상적인 외관 = 0; 점액 = 1; 기관지염/기관염 = 2.
ㆍ 신장: 정상적인 외관 = 0; 팽윤 또는 창백, + 요산염 결정 = 1.
ㆍ 지라: 정상적인 외관 = 0; 팽윤 = 1.
ㆍ 장: 정상적인 외관 = 0; 이상 = 2.
기관, 폐 및 신장의 조직학
기관, 폐 및 신장 샘플을 바이러스를 투여하고 나서 4일 후에 채취하였다. 모든 샘플을 조직학적으로 검사하였다. IBV를 검출하기 위해, IBV 에피토프 48.4 (핵단백질)에 대한 면역조직화학 염색을 모든 샘플에 적용하였다.
평가
SPF 병아리에서의 IB 바이러스의 병독성을 하기에 의해 결정하였다:
ㆍ 기관 체외이식편의 섬모 운동;
ㆍ 임상 징후의 존재 및 중증도; 및
ㆍ 병리 검사에서 발견된 이상.
SPF 병아리에서의 IBV의 병독성은 하기와 같이 분류되었다:
ㆍ 병독성 아님: 군의 총점이 비-챌린지 군의 총점 이하인 경우.
ㆍ 약독성: 군의 총점이 대조군의 총점보다 높지만, 풀백 IB H120이 챌린지된 군의 총점 이하인 경우.
ㆍ 중등도 병독성: 군의 총점이 풀백 IB H120이 챌린지된 군의 총점보다 높지만, IB M4가 챌린지된 군의 총점 이하인 경우.
ㆍ 병독성: 군의 총점이 IB-M41이 챌린지된 군의 총점 이상인 경우.
10％를 초과하는 병아리가 백신 바이러스에 기인하지 않는 원인으로 사망하면 테스트가 유효한 것으로 간주되지 않았다. 이러한 실시예에서, 하기와 같은 경우 백신 바이러스가 충분히 안전한 것으로 간주되었다:
ㆍ 병아리가 조류 감염성 기관지염의 두드러진 임상 징후를 나타내지 않았거나, 또는 백신 바이러스에 기인하는 원인으로 사망하지 않음;
ㆍ 평균 섬모정체 점수가 25점을 초과하지 않음; 및
ㆍ 신장의 조직 검사 동안 기껏해야 중등도의 염증성 손상이 나타남.
중등도 병독성 또는 병독성으로 분류되고 상기 언급된 요건을 따르지 않는 바이러스들이 그럼에도 불구하고 챌린지 바이러스로서 사용하기에 잠재적으로 적절하다.
결과
병아리에게 투여한 후의 IB 바이러스의 역가측정
병아리에게 챌린지한 후의 여러 IB 바이러스의 역가가 표 5에 제시된다. 이러한 표에 제시된 바와 같이, 모든 경우에 106.0 EID50을 초과하는 IB 바이러스를 병아리에게 챌린지하였다.
Figure pct00007
임상 징후, 섬모 운동, 및 병리 검사
연구 동안 병아리가 사망하지 않았다. 병아리의 취급 후 매우 경미한 삼출성 안비 분비물 (콧구멍에서의 작은 액적) 및 헐떡거림만이 IB 1449-10(p50)이 챌린지된 일부 병아리에서 관찰되었다.
어떠한 대조군 병아리에서도 섬모정체가 관찰되지 않았지만, IB-M41이 챌린지된 병아리에서는 명확하게 실연되었다. 풀백 IB H120 바이러스가 챌린지된 10마리의 병아리 중 3마리는 완전한 섬모정체를 나타냈다. 병아리가 IBV 1148(p50) (6개의 절편), IBV 1449-2(p5) (20개의 절편) 및 IBV 1449-10(p50) (41개의 절편)으로 챌린지된 경우 섬모정체가 있는 기관 절편의 수가 증가하였다.
병아리들의 병리 검사 동안, IB 1449-2(p5), 풀백 IB H120 또는 IB-M41이 챌린지된 병아리에서 카타르성 삼출물이 기관 내에 존재하였음이 발견되었다. IB 1449-2(p5)가 챌린지된 병아리 1마리에서, 팽윤된 창백한 신장이 발견되었다.
표 6에 요약된 섬모 운동, 임상 징후 및 사후 연구 결과를 기초로, IB-QX-유사-유래 바이러스의 분류가 이루어졌다. 풀백 IB H120 및 IB-M41과 비교하여, 균주 L-1148(p50)은 약독성으로, IBV 1449-10(p50)은 중등도 병독성으로, IBV 1449-2(p5)는 약간 병독성인 것으로 분류되었다.
Figure pct00008
기관, 폐 및 신장의 조직학
L-1148(p50), 1449-2(p5) 및 IB-H120이 챌린지된 병아리의 기관에서 이상이 발견되지 않았다. 1449-10(p50)로의 챌린지 후, 괴사가 있는 국소적인 기관염이 4개의 기관 중 1개에서 발견되었다. IB-M41이 챌린지된 병아리들의 모든 기관은 급성 기관염을 나타냈다. IB-M41로 감염된 병아리의 기관에서만 IBV가 검출될 수 있었다.
어떠한 병아리의 폐에서도 이상이 발견되지 않았고 IBV가 검출되지 않았다.
L-1148(p50) 및 1449-10(p50)이 챌린지된 병아리의 신장의 조직학은 일부 경우에 단핵 및 형질세포성 세포의 약간의 침윤을 나타냈다. 관상 상피가 영향을 받지 않았다. 면역조직화학을 사용했을 때, 감염 4주 후에 채취된 신장 샘플의 관의 상피 세포에서 IBV-항원이 검출되지 않았다. 면역조직화학적 염색 후 어떠한 군의 신장에서도 IBV를 검출할 수 없었다.
논의
IBV는 먼저 기관 점막을 감염시킨 후, 또 다른 장기의 상피, 예를 들어, 신장의 관상 상피 세포 및 난관의 상피에서 복제된다. 상피 세포에서의 IBV의 복제는 세포의 변성을 초래할 수 있고, 이어서 장기/조직에서의 병리학적 변화가 일어날 수 있다. 임상 징후의 발생 여부는 IBV의 병독성, 감염된 장기, 2차 감염 발생 및 병아리의 전반적인 건강과 같은 여러 인자에 좌우된다. 이는 IBV가 챌린지된 병아리의 기관에서 나타나고, 이때 전체 동물 (IBV-M41), 동물의 40％ (1449-10(p50)), 동물의 20％ (1449-2(p5)) 및 동물의 10％ (IBV L-1148(p50))에서 섬모 운동이 손상된다. 카타르성 삼출물이 IBV 1449-2(p5), 풀백 IB H120 및 IB-M41이 챌린지된 병아리의 기관 내에 존재하였다. 병아리가 IBV 1449-10(p50)으로 챌린지된 경우에만 경미한 임상 징후가 나타났고, 이는 섬모정체 및 이어지는 점막 증강의 결과였던 것으로 보인다. 병아리들이 고용량의 IBV로 챌린지되었음을 염두에 두었을 때, 이러한 실시예의 결과는 유망하다. IBV L-1148(p50) 및 IBV 1449-2(p5)로 병아리를 챌린지한 후의 임상 징후의 부재는 상응하는 야생 균주에 의해 야기되는 임상 징후가 경미하다는 사실을 아마 반영할 것이다. SPF 병아리를 IBV 1449-10(p50)으로 챌린지한 후 경미한 호흡 징후만이 나타났고, 이는 이러한 균주의 약독화를 실연하는데, IBV 1449-10의 야생 균주는 병독성이었기 때문이다.
결론
이러한 실시예에 나타난 바와 같이, IB-QX-유사 바이러스가 다중 계대에 의해 약독화될 수 있다. IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 생성된 약독화된 균주는 감염성 기관지염에 대한 새로운 백신 균주로서의 탁월한 전망을 나타낸다. 닭에게 투여되는 경우 중등도의 병독성 효과를 야기하는 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 계대된 바이러스는 신규 IB 백신, 특히 IB-QX-유사 바이러스에 대한 백신을 연구하고 추가로 개발하기 위한 챌린지 물질로서 유용할 것이다.
실시예 3: IB - QX -유사 균주 L-1148의 추가적인 계대 및 안전성
서론
이러한 실시예에서, IB-QX-유사 바이러스 균주 L-1148을 발육 계란에서 여러 번 계대시켰다. 닭에서 섬모정체의 정도 및 신장 형태학을 측정함으로써 다양한 계대 수준의 바이러스의 안전성을 평가하였다. 하기 설명된 바와 같이, 균주 L-1148의 다중 계대는 IB-QX-유사 바이러스에 의한 감염에 대한 백신으로서 적절한 약독화된 균주를 초래하였다.
SPF 발육 계 란에서의 L-1148의 계대
바이러스 계대를 위해, 10일령 내지 11일령의 특정 병원체 부재 (SPF) 발육 계란이 사용되었다. 먼저 균주 L-1148이 SPF 계란에서 7회 계대되었다. 최초의 5회의 계대에 대해서는, 희석되지 않은 요막강액이 접종되었다. 살아 있는 배아가 있는 계란으로부터의 요막강액으로만 계대가 이루어졌다. 이는 약 50％의 배아 사망을 초래하였다. 생리식염수 내의 100배 희석된 요막강액으로 계대를 계속하기로 결정하였고, 이는 더 적은 배아 사망을 초래하였다. 계대 73까지 계대를 계속하였다. 계대 73에서의 수확 시, IB L-1148 균주 내에 뉴캐슬병 (ND) 바이러스로의 오염이 있음을 알게 되었다. 균주 IB L-1148의 계대 50이 백신접종된 닭으로부터의 혈액 샘플이 ND 바이러스에 대한 항체를 함유하였다. 계대 8의 샘플의 RT-PCR 분석은 균주 IB L-1148이 처음부터 이러한 바이러스로 오염되었음을 드러냈다. 계대를 정지하고 바이러스 균주 IB L-1148을 오염으로부터 정화하기로 결정하였다.
L-1148 계대의 오염제거
계대 22, 47 및 73으로부터 샘플을 채취하고, ND 특이적 항혈청으로 처리하였다. 간략하게, 요막강액의 샘플을 1:2의 요막강액:혈청 부피비로 ND 특이적 폴리클로날 항혈청의 샘플과 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 일련의 10배 희석물을 제조하고, 희석물 당 5개의 계란에 각각 0.1 ㎖을 접종하였다. 2일 후, 요막강액을 수확하고, RT-PCR에 의해 IB에 대해 여전히 양성인 최고 희석물로부터의 샘플을 수집하였다. 사망한 배아로부터의 계란은 폐기하였다. 요막강액을 다시 상기와 같이 ND 항혈청으로 처리하고, 다시 일련의 희석물을 계란에 접종하였다. 인큐베이션 후, 또다시 RT-PCR에 의해 IB에 대해 여전히 양성인 최고 희석물을 수집하고, 분할하여 채우고, 동결시키고, -70℃에서 보관하였다.
상기의 오염제거 공정은 정화 및 클로닝된 계대 24, 49 및 75를 초래하였다. 107배 희석물을 0.2 ㎖/계란으로 계란에 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 후 수확함으로써 계대 수준 25의 뱃치(batch)가 제조되었다. 요막강액을 작게 분할하여 채우고, -70℃에서 보관하였다. 동일한 절차에 따라 계대 50의 뱃치를 제조하였다. 계대 75를 추가로 계대 80까지 계대시켰다. 계대 80의 요막강액을 풀링하고, 작게 분할하여 채우고, 동결시키고, -70℃에서 보관하였다.
안전성 테스트
닭에서의 여러 계대 수준의 IB L-1148 균주의 안전성을 여러 번 테스트하였다. 병독성 매사추세츠-유사 균주 IB-M41 및 약독성 백신 균주 풀백 IB H120과 함께, 약독화되지 않은 IB-QX-유사 균주 1449-10이 연구에 또한 포함되었다.
1일령 SPF 닭이 각각의 테스트에 사용되었다. 표준 절차에 따라 테스트를 수행하였다. 간략하게, 1 ㎖ 주사기를 사용하여, 1 ㎖ 주사기를 사용하여, 각각의 병아리의 각각의 눈에 0.1 ㎖를 투여함으로써 일련의 5마리의 병아리에게 IB 바이러스를 챌린지하였다. IB-M41의 경우, 병아리에게 눈 당 0.25 ㎖을 제공하였다. 동결-건조된 바이러스를 주사용수에서 재구성시켰고, 추가적인 희석물을 영양 브로스에서 제조하였다. 이어서, 임상 징후에 대해 새를 매일 관찰하였다.
바이러스 투여 5일 후, 기관 체외이식편의 섬모 운동을 5마리의 닭에 대해 검사하였다. 안락사된 닭에서 기관을 제거하고, 기관의 0.6 ㎜ 횡단 절편 (기관의 3개의 상부 절편, 4개의 중부 절편 및 3개의 하부 절편)을 제조하였다. 기관의 횡단 절편을 2 ㎖의 37℃ PBS를 함유하는 페트리 접시에 놓고, 4분 이내에 현미경으로 검사하였다.
섬모 운동을 0 (100％ 섬모 운동) 내지 4 (0％ 섬모 운동)의 등급으로 현미경에 의해 채점하였다. 각각의 군에 대해, 정지를 나타낸 기관 절편의 합계를 군 당 병아리 마릿수로 나눔으로써 평균 섬모정체를 계산하였다.
기관, 폐 및 신장의 샘플을 안락사된 동물로부터 채취하였다. 모든 샘플을 조직학적으로 검사하였다. IB 바이러스를 검출하기 위해, IBV 에피토프 48,4 (핵단백질)에 대한 면역조직화학 염색을 수행하였다.
결과가 표 7에 요약된다.
Figure pct00009
결과는 IB-M41 (병독성 균주)의 섬모 점수가 높았음을 나타낸다; 달성될 수 있는 최대 점수는 40이다. IB 1449-10 균주 또한 섬모 점수가 높았다. 백신 균주 IB H120은 규제 요건 (예를 들어, 25 미만)을 따르는 낮은 점수였다. IB L-1148 균주의 계대 8은 연구 A에서 39점으로 점수가 높았다. 계대 수준 25에서 18점으로 현저하게 감소되었다. 계대 수준 40 및 50에서, 연구 A에서 p50에 대해 섬모정체 점수가 31점으로 증가하였다. 연구 A에서 테스트된 IB L-1148 균주의 샘플들은 모두 ND 바이러스로 오염되었다. 계대 수준 25 및 50을 ND 오염으로부터 정화한 후 다시 테스트하였다. 이번에는 섬모정체 점수가 명백하게 더 낮았고, 백신 균주에 대한 허용가능한 범위 내였다. 연구 B에서, 계대 80을 또한 테스트하였다. 이러한 계대는 IB H120보다 훨씬 더 낮은 매우 낮은 섬모정체 점수를 제공하는 것으로 나타났다. 계대 수준 80이 안전한 백신 균주에 대해 필요한 것 이상으로 약독화되었을 수 있는 것으로 예상되었다.
표 7은 신장 및 기관의 검사 결과를 또한 나타낸다. 경증 내지 중등도 신장염은 일시적인 한 허용가능한 것으로 간주되었다. 기관염은 일시적인 경우에만 허용가능한 것으로 간주되었고, 기관 내의 점액에 대해서 동일하게 생각되었다. 결과는 IB L-1148의 계대 8, 25, 40 및 50이 기준 백신 균주 IB H120과 마찬가지로 신장에 영향을 미쳤지만 IB 균주 1449-10만큼 중증이지는 않았음을 나타낸다. 계대 80 또한 신장에 대한 약간의 효과가 있었다.
연구 A 및 B의 결과를 분석한 후, 계대 수준 65의 IB L-1148 (즉, L-1148(p65))의 뱃치를 생산하고 생성된 바이러스의 안전성을 평가하기로 결정하였다. 계대 수준 64까지, 이전 계대로부터의 요막강액으로부터의 풀링된 상등액의 100배 희석물 0.1 ㎖를 각각의 계란에 접종함으로써 계대 50에서부터 계대 64까지 계대물을 제조하였다. GMP 하에 계대 수준 65에서 대형 뱃치를 생산하였다. 계대 수준 64로부터의 요막강액의 1000배 희석물 0.2 ㎖를 각각의 계란에 접종하였다. 37℃에서 24시간 인큐베이션한 후, 요막강액을 풀로 수확하였다. 풀들 중 하나로부터 샘플을 채취하고, 역가를 결정하고, 안전성 테스트에 적용하였다. 결과가 표 7 (연구 C)에 요약된다. 결과는 평균 섬모정체 점수가 IB H120에 대한 이전의 테스트에서 발견된 것과 유사한 18점이었음을 나타낸다. 신장염이 관찰되지 않았고, 15마리의 닭 중 오직 1마리에서만 약간의 점액이 기관에서 발견되었다.
결론
이러한 실시예는 발육 계란에서 IB-QX-유사 균주를 여러 번 계대시킴으로써 IB-QX-유사 바이러스에 대한 안전한 백신 균주가 생산될 수 있음을 나타낸다. 이러한 실시예에서, 25에서부터 80까지의 계대 수준이 공지된 허용가능한 IB 백신과 동등한 안전성 프로파일을 지니는 약독화된 바이러스를 초래하였다.
실시예 4: IB - QX -유사 균주 L-1148로부터 유래된 백신의 효능
이러한 실시예에서, IB-QX-유사 균주 L-1148로부터 유래된 2개의 백신 균주의 효능이 평가되었다. 테스트된 백신 균주는 L-1148(p65) 및 L-1148(p80)이었다 (실시예 3 참조).
1일령 SPF 산란형 닭을 분무 (용량 당 0.5 ㎖)에 의해 백신접종하였다. 백신접종 3주 후, 각각 104.0 EID50 용량의 IB 균주 D388 (네덜란드에서 단리된 병독성 IB-QX-유사 균주)를 닭에게 챌린지하였다.
기관 체외이식편의 섬모 운동을 챌린지 5일 후 검사하였다. 사망 직후, 기관을 제거하고, 37℃의 생리식염수로 헹구고, 추가적으로 프로세싱할 때까지 이러한 생리식염수 내에서 보관하였다. 기관의 소형 횡단 절편을 손으로 절단하였다. 기관의 3개의 상부 절편, 4개의 중부 절편 및 3개의 하부 절편의 섬모 운동을 저배율 현미경으로 검사하였다.
섬모 운동을 하기의 분류 기준을 사용하여 채점하였다:
Figure pct00010
소정의 기관 절편에 대해, 50％ 이상 (0점)의 내부 고리가 격렬한 섬모 운동을 나타낸 경우 섬모 운동이 정상으로 간주되었다. 10개의 고리 중 9개 이상이 정상적인 섬모 운동을 나타내면 닭이 영향을 받지 않은 것으로 간주되었다. 기관 샘플을 채취하고 나서 2시간을 초과한 후에 기관 절편이 현미경으로 검사되면 테스트가 유효하지 않았다.
결과가 표 8에서 요약된다.
Figure pct00011
백신접종되지 않은 비-챌린지 대조군에서, 20마리의 닭 중 1마리가 특별한 이유 없이 섬모 운동에서의 감소를 나타냈다. 다른 닭에서는, 섬모 운동이 정상이었다. 백신접종되지 않은 챌린지 군에서, 모든 닭이 감소된 섬모 운동을 나타냈다. 보호가 관찰되지 않은 102.4 EID50의 L-1148(p65)가 백신접종된 군을 제외하고는, L-1148(p65) 및 L1148(p80)이 백신접종된 군에서, 규제 기관이 규정한 것보다 보호가 양호하였다 (예를 들어, 80％ 이상의 보호).
이러한 실시예는 연속 계대에 의해 IB-QX-유사 균주로부터 유래된 백신 균주의 효능을 나타낸다.
실시예 5: 추가적인 IB - QX -유사 백신 균주의 안전성 평가
서론
이러한 실시예에서, 닭에서의 IB-QX-유사 균주 L-1148(p80) (본원에서 "마스터 시드 바이러스" 또는 "MSV-p80"으로 또한 지칭됨)의 안전성을 계대 수준 101의 L-1148 균주 ("L-1148(p101)") 및 계대 수준 18의 1449-2 균주 ("1149-2(p18)")와 함께 평가하였다.
각각 50마리의 5개의 군으로 분할된 250마리의 건강한 암컷 백색 레그혼(White Leghorn) 병아리가 표 9에 제시된 연구 디자인에 따라 이러한 실시예에서 사용되었다.
Figure pct00012
안비 경로에 의해 백신접종을 수행하였고, 이때 각각의 병아리에게 0.2 ㎖ (각각의 눈에 0.1 ㎖)의 부피로 상응하는 백신을 제공하였다. 모든 백신은 105.0 EID50/새의 용량으로 투여되었다.
연구 동안, 임상 징후에 대해 새를 매일 관찰하였다. 모든 임상 징후 또는 사망률을 기록하였다. 연구 동안 사망한 새는 사후 검사용으로 제출되었다.
군 2의 영계를 12주령에 검사한 것을 제외하고는, 11주령에 난관을 검사하였다. 영계를 안락사시키고, 체강을 개방하고, 온전한 난관을 낭종, 협착, 기형 또는 무형성의 존재에 대해 외부적으로 및 내부적으로 (가위로 세로로 개방하여) 현미경에 의해 검사하였다.
결과
사망률 결과가 표 10에서 요약된다.
Figure pct00013
난관 검사 결과가 표 11에서 요약된다.
Figure pct00014
군 1에서, 48마리의 닭 중 6마리 (12.5％)에 낭종성 난관 및 상부 분절의 무형성이 있었다. 닭 1마리는 직경 4.4 ㎜의 소형 낭종이 있었다. 이는 벽에 가깝게 위치하였고, 난관의 관상 구조에 영향을 미치지 않았다.
군 2에서, 49마리의 생존 닭 모두가 정상적인 난소 및 난관이 있었다. 닭 1마리는 2.4×4.1 ㎜의 소형 낭종이 있었다. 이는 난소에 가깝게 위치하였지만, 난관의 관상 구조에 영향을 미치지 않았다.
군 3에서, 43마리의 닭 중 4마리 (9.3％)에 낭종성 난관 및 상부 분절의 무형성이 있었다.
군 4에서, 39마리의 닭 중 2마리 (5.13％)에 낭종성 난관 및 상부 분절의 무형성이 있었다.
논의
테스트 백신이 백신접종된 새에서 관찰된 비교적 낮은 사망률 및 낮은 낭종성-무형성 난관 발생은 이러한 백신이 일반적으로 안전하다는 것을 가리킨다. 7일령 영계에게 투여된 MSV-p80 백신은 안전성 프로파일이 특히 양호한 것으로 나타났고, 유럽 약전(European Pharmacopoeia) 안전성 요건을 따른다.
실시예 6: 병독성으로의 복귀 연구
서론
실시예 5에서 언급된 바와 같이, IB-QX-유사 균주 L-1148(p80)이 마스터 시드 바이러스 또는 "MSV-p80"으로 명시되었다. 이러한 실시예에서, 병독성으로 복귀되는 MSV-p80 및 이의 역-계대 유도체 "MSV+1BP"의 경향을 평가하였다.
하기의 백신이 이러한 실시예에서 사용되었다:
(A) 닭 당 106.0 EID50의 용량의 IB-QX MSV-p80 (즉, L-1148(p80)).
(B) 닭 당 106.0 EID50의 용량의 1회의 닭 역-계대 후에 회수된 역-계대 IB-QX MSV-p80 ("MSV+1BP"). 역-계대 절차는 하기와 같다: (i) 5마리의 14일령 SPF 닭에게 점안액에 의해 용량 당 104.0 EID50의 MSV-p80을 함유하는 0.1 ㎖을 백신접종하였다; (ii) 닭을 백신접종 4일 후에 안락사시키고, 기관 점막의 현탁액을 제조하였다; (iii) 제2 군의 5마리의 14일령 SPF 닭에게 기관 현탁액을 접종하였다. 기관 점막 샘플을 RT-PCR 및 계란 접종에 의해 바이러스의 존재에 대해 테스트하였다. 제1 닭 역-계대에서, 바이러스가 PCR 및 계란 접종에 의해 검출되었다; 그러나, 제2 닭 역-계대에서 바이러스를 검출할 수 없었다. 제1 닭 계대에 기관 점막 샘플로부터 수득된 바이러스를 증폭시키고, MSV+1BP로 명명하였다.
총 51마리의 1일령 SPF 닭을 표 12에 제시된 연구 디자인에 따라 3개의 군으로 분할하고 백신접종하였다.
Figure pct00015
안비 경로에 의해 백신접종을 수행하였고, 이때 각각의 병아리에게 0.1 ㎖ (각각의 눈에 0.05 ㎖)의 부피로 상응하는 백신을 제공하였다.
기관 체외이식편의 섬모 운동을 백신접종 후 제5일, 제7일 및 제10일에 검사하였다. 100％ CO2의 흡입에 의해 닭을 안락사시켰다. 사망 직후, 기관을 제거하고, 37℃의 생리식염수로 헹구고, 추가적으로 프로세싱할 때까지 이러한 생리식염수 내에서 보관하였다. 기관의 0.6 ㎜ 횡단 절편을 <McIlwain Tissue Chopper> (Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. (Surrey, UK))를 사용하여 제조하였다. 기관의 횡단 절편을 페트리 접시에서 2.0 ㎖의 37℃ 생리식염수와 합쳤다. 기관의 3개의 상부 절편, 4개의 중부 절편 및 3개의 하부 절편의 섬모 운동을 저배율 현미경으로 검사하였다. 모든 기관 체외이식편을 샘플 채취 후 2시간 이내에 검사하였다. 섬모 운동을 하기의 정의를 사용하여 0 내지 4의 등급으로 채점하였다:
Figure pct00016
각각의 군 내의 닭을 (a) 기관 체외이식편의 섬모 운동, (b) 육안 병리 검사, (c) 신장의 조직학 및 (d) 혈청학에 대해 평가하였다. 정지를 나타낸 기관 절편의 합계를 군 당 병아리 마릿수로 나눔으로써 섬모정체를 계산하였다. 육안 병리 검사를 위해, 각각의 닭에서 부검을 수행하여 백신과 관련될 수 있는 모든 이상을 결정하였다. 포르말린-고정 신장 조직의 조직학적 검사를 수행하였고, 연구 결과는 신장염 없음, 경증 신장염, 중등도 신장염 또는 중증 신장염으로 기록하였다. 혈청학 분석을 위해, 10마리의 1일령 닭으로부터 수집된 혈청에 대한 혈청 중화 및 ELISA 테스트를 수행하였다.
결과
1. 임상 징후.
MSV-p80 또는 MSV+1BP에 기인하는 임상 징후가 연구 동안 관찰되지 않았다. 그러나, MSV-p80이 백신접종된 닭 1마리가 백신접종 2일 후 사망한 것으로 발견되었다. 부검 시, 기관염 및 폐렴이 관찰되었다. 기관 내의 대량의 점액으로 인한 질식인 것으로 사망 원인이 결정되었다. 다른 닭들은 어떠한 임상 징후도 나타내지 않았고, IB에 대한 인큐베이션 기간 (4일)보다 훨씬 짧은 기간인 백신접종하고 나서 단지 2일 후에 사망이 발생하였기 때문에, 감염성 기관지염은 가능한 사망 원인으로 간주되지 않았다.
2. 섬모 운동.
제5일, 제7일 및 제10일의 섬모정체 점수가 표 13에서 제시된다. 1개의 절편의 1개의 기관 샘플을 제외하고는, 백신접종 후 제5일에 수집된 어떠한 기관 샘플에서도 섬모 운동의 정지가 없었다. 그러나, 제7일 및 제15일에, 비교적 작은 정도의 섬모 운동 정지가 양쪽 군에서 관찰되었다. MSV-p80 및 MSV+1BP에 대해 평균 섬모정체 점수는 각각 15점 및 10점이었다.
3. 기관 및 신장의 병리 검사 및 조직학
신장의 약간의 비-특이적 창백함 이외에, 육안으로 보이는 이상이 기관 및 신장에서 관찰되지 않았다. (표 13 참조). 약간의 장 림프세포 침윤이 신장 샘플의 조직병리 검사 동안 관찰되었다. 또 다른 손상의 부재 (과립 변성, 관상 상피의 박리 및 공포형성, 및 대량 이염색백혈구 침윤의 부재)는 관찰된 림프구 침윤이 아마도 면역 응답의 개시에 기인할 것임을 시사하였다.
Figure pct00017
4. 혈청학
감염성 기관지염 바이러스에 대한 항체가 전-혈청(pre-serum)에서 검출되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
논의 및 결론
MSV-p80이 백신접종된 닭 및 MSV+1BP가 백신접종된 닭 양쪽 모두에 대한 평균 섬모정체 점수는 25점 미만이었고, 닭이 조류 감염성 기관지염의 두드러진 임상 징후를 나타내지 않았다. MSV-p80 (즉 L-1148(p80))이 기도 및 신장에 안전하고 표준 요건을 따르는 것으로 결론지어졌다. 또한, 닭에서의 역-계대 후 MSV-p80의 병독성의 증가가 지시되지 않았다.
실시예 7: IB - QX -유사 백신의 효능 및 최소 보호 용량
서론
이러한 실시예에서, 4가지 상이한 IB-QX-유사 백신의 최소 보호 용량을 병독성 IB-QX-유사 바이러스가 챌린지된 닭에서 결정하였다.
하기의 생 백신이 이러한 실시예에서 사용되었다:
(1) 본원에서 "MSV-p80 X+2"로 지칭되는, 추가로 2회 계대된 MSV-p80 (따라서 총 82회 계대됨);
(2) 본원에서 "MSV-p80 X+5"로 지칭되는, 추가로 5회 계대된 MSV-p80 (따라서 총 85회 계대됨);
(3) 본원에서 L-1148(p101)로 지칭되는, 101회 계대된 L-1148 균주; 및
(4) 본원에서 1449-2(p19)로 지칭되는, 19회 계대된 1449-2 균주.
총 208마리의 건강한 1일령 SPF-닭이 이러한 연구에서 사용되었다. 상이한 용량의 상기 언급된 백신을 조제(coarse) 분무 (시판되는 화초용 분무기 사용)에 의해 닭에게 백신접종하였다. 백신접종 21일 후, 닭에게 104.0 EID50의 병독성 IB-QX-유사 균주 D388을 점안액 (각각의 눈에 0.05 ㎖)에 의해 챌린지하였다. 챌린지 5일 후, 기관 체외이식편에서의 섬모 운동을 닭 20마리에서 결정하였다. 백신접종일 및 백신접종 21일 후에 혈액을 채취하였다. 실험 디자인이 표 14에서 요약된다.
Figure pct00018
기관 체외이식편의 섬모 운동을 닭 20마리에서 챌린지 5일 후에 검사하였다. 닭을 안락사시키고, 사망 직후 기관을 제거하고, 37℃의 생리식염수로 헹구고, 추가적으로 프로세싱할 때까지 이러한 생리식염수 내에서 보관하였다. 기관의 소형 횡단 절편을 손으로 절단하였다. 기관의 3개의 상부 절편, 4개의 중부 절편 및 3개의 하부 절편의 섬모 운동을 저배율 현미경으로 검사하였다. 섬모 운동을 하기의 분류 기준을 사용하여 채점하였다:
Figure pct00019
소정의 기관 절편에 대해, 50％ 이상 (0점)의 내부 고리가 격렬한 섬모 운동을 나타낸 경우 섬모 운동이 정상으로 간주되었다. 10개의 고리 중 9개 이상이 정상적인 섬모 운동을 나타내면 닭이 영향을 받지 않은 것으로 간주되었다. 기관 샘플을 채취하고 나서 2시간을 초과한 후에 기관 절편이 현미경으로 검사되면 테스트가 유효한 것으로 간주되지 않았다.
챌린지 5일 후에 각각의 닭을 부검하여, IBV 감염의 결과일 수 있는 신장에서의 모든 이상을 결정하였다. 하기의 기준이 신장에서의 육안 연구결과를 채점하는데 사용되었다: 정상 = n.a.; 팽윤, 창백 또는 요산염 결정 = 1.
결과
1. 백신접종 후의 임상 징후
섬모 및 육안 병리 검사 결과가 표 15에서 요약된다.
Figure pct00020
표 15에 제시된 결과는 103.0 EID50 이상의 용량이 사용되는 한 MSV-p80 백신이 효율적이라는 것을 나타낸다. 102.7 EID50의 용량은 보호를 유도하지 않았다. MSV-p80 X+2 및 MSV-p80 X+5에 의해 생성된 보호에 유의하지 않은 작은 차이가 있었다; 이러한 연구에서 X+2가 X+5보다 다소 양호한 보호를 제공하였다. L-1148(p101) 균주는 더 낮은 계대 수준보다 보호를 덜 제공하였다.
요약
이러한 실시예는 IB-QX MSV-p80으로부터 유래된 백신의 안전성 및 효능을 추가로 실연한다.
실시예 8: 닭들 사이의 약독화된 IB QX 의 확산 및 체내에서의 파종
서론
이러한 실시예에서는 체내에서의 약독화된 IB QX 백신 균주 IB-QX MSV-p80의 파종 및 비-백신접종 닭으로의 IB-QX MSV-p80의 확산이 연구되었다.
실험 디자인
1. 동물
총 165 마리의 SPF 닭을 표 16에 제시된 군으로 분할하였다. 닭들을 일반적인 절차에 따라 거주시켰다. 음식 및 물은 자유롭게 이용가능하였다. 모든 닭들을 연구 전반에 걸쳐 임상 징후에 대해 관찰하였다.
Figure pct00021
2. 방법
2.1 백신접종
108.2 EID50을 함유하는 IB-QX MSV-p80 바이알 1개를 157.5 ㎖ 완충제에 희석하고, 제조하고 나서 2시간 이내에 사용하였다. 군 1의 1일령 닭에게 0.1 ㎖의 희석된 바이러스를 점안액에 의해 백신접종하였다 (닭 당 105.0 EID50 IB-QX MSV-p80). 백신접종 후, 사용된 백신의 샘플을 -50℃에서 보관하였다. 역-역가적정을 수행하여 투여된 백신 내의 바이러스의 역가를 결정하였다. 투여된 백신은 닭 당 105.07 EID50의 용량에 상응하는, 1 ㎖ 당 106.07 EID50 IB QX를 함유하는 것으로 확인되었다.
2.2 실험 디자인
군 1 닭에게 IB-QX MSV-p80을 백신접종하였다. 백신접종 3일 후, 군 1로부터의 백신접종 닭 30마리를 동일한 연령 및 태생의 군 2로부터의 35마리의 비-백신접종 닭을 함유하는 오염관리 유닛(containment unit)에 첨가하였다. 백신접종 7일 후, 군 4로부터의 30마리의 비-백신접종 닭의 군을 오염관리 유닛에 첨가하였다. 백신접종 14일 후, 백신접종 닭과 동일한 연령 및 태생의 군 3으로부터의 35마리의 비-백신접종 닭을 오염관리 유닛에 첨가하였다. 규칙적인 간격으로, 군 2-4 각각으로부터의 닭 2마리를 100％ CO2의 흡입에 의해 사망시키고, 점액낭, 십이지장, 폐, 신장, 췌장 및 기관으로부터 샘플을 채취하여, IBV의 존재를 결정하였다.
포르말린-고정 샘플의 IBV 에피토프 48.4 (핵단백질)에 대한 면역조직화학 염색에 의해 장기 샘플에서 IBV를 검출하였다. 닭이 사망한 후, 배설강 및 입인두로부터 면봉채취물을 채취하였다.
면봉채취물 내의 IB QX의 존재를 수퍼스크립트(SuperScript)™ III 1단계 qRT-PCR 키트 (Invitrogen)를 사용하여 PCR에 의해 검출하였다. PCR 혼합물은 25 ㎕ 2× 믹스, 18 ㎕ 물, 1 ㎕ Taq 백금, 2 ㎕ 전방향 프라이머, 2 ㎕ 역방향 프라이머 및 2 ㎕ 주형 (RNA)을 함유하였다. 하기의 프라이머들이 사용되었다:
IBV 공통 프라이머
SX3 + A/B 전방향
Figure pct00022
(서열 5)
SX4 - 역방향
Figure pct00023
(서열 6)
IB QX 특이적 프라이머
Alg-QX-139 전방향
Figure pct00024
(서열 7)
Alg-QX-394-역방향
Figure pct00025
(서열 8)
기관 RNA가 주형으로 사용되었다. 바이러스가 양성 대조군으로 사용되었다.
RT-PCR을 하기의 프로그램에 따라 수행하였다:
1. 30분 50℃
2. 10분 95℃
3. 30초 95℃
4. 30초 50℃
5. 45초 72℃, 40 사이클의 단계 3-5
6. 7분 72℃
7. 5분 4℃
RT-PCR 생성물을 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였다.
혈액 샘플을 10마리의 1일령 닭으로부터, 그리고 연구 제21일에 군 1, 2, 3 및 4 각각의 닭 10마리로부터 채취하였다. 1일령 닭의 단두에 의해 또는 날개 정맥의 천자에 의해 혈액을 수집하였다. 항체 역가를 플록첵(Flockchek)™ IBV 항체 테스트 키트 (IDEXX, US) 또는 플록스크린(Flockscreen)™ IB-HI 키트 (X-Ovo, France)로 결정하였다.
3. 결과
결과가 표 17에서 요약된다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
IB를 가리키는 호흡 징후 또는 기타 임상 징후가 연구 동안 관찰되지 않았다. 군 2의 닭 1마리가 난황낭의 염증으로 인해 사망하였다. 군 1의 닭 1마리가 동종포식작용(cannibalism)으로 인해 사망하였다. 혈청학적 테스트를 위해, IB QX 항원은 양호한 적혈구응집을 제공하지 않았기 때문에 적혈구응집 억제 (HI) 테스트를 IB 793B 항원으로 수행하였다. HI-테스트 또는 ELISA에 의해 어떠한 혈청에서도 IB 항체가 검출되지 않았다.
IHT-염색으로, 바이러스에 최초로 노출된 후 제4일 및 제11일의 췌장 및 4-11일의 닭의 기관에서 IB QX가 검출되었다. IHT-염색으로, 점액낭, 십이지장, 폐 또는 신장에서 IB QX가 검출되지 않았다.
IB QX의 존재를 모든 군으로부터의 후두 및 배설강 면봉채취물의 PCR 및 IHT-염색에 의해 검출하였다. IB QX에 대한 최초의 노출 후 2-15일의 배설강 및 후두 면봉채취물에서 PCR에 의해 IB가 검출되었다. 후두 면봉채취물이 배설강 면봉채취물보다 더욱 빈번하게 IB QX에 대해 양성이었다.
4. 논의
4.1 파종
기관에서의 IB QX 검출이 예상되었는데, 이는 상부 기도가 IBV 복제의 주요 부위이기 때문이다. 이어서, 바이러스혈증이 발생하고, 바이러스가 다른 조직으로 파종된다. 췌장에서의 IB QX의 검출에 의해 파종이 실연되었다. IBV는 본래 상피친화성(epitheliotropic) 바이러스이지만, 계대 수준 80의 IB QX이 신장 또는 폐에서 검출될 수 없었고, 이는 바이러스가 닭 당 105.0 EID50의 백신 투여 용량에서 이러한 장기로부터 소거되었음을 시사한다. 닭 당 106.0 EID50 IB QX로 닭이 백신접종된 동일한 계대 수준의 IB QX로의 안전성 연구에서, 바이러스가 백신접종 후 10일 동안 신장 및 폐에서 검출되었다. 본 연구에서, IB QX가 11일 동안 기관에서, 15일 동안 후두에서 검출되었다. IB가 기관에서 임상 단계 동안 감염 후 5-10일 동안, 그리고 기관에서 감염 후 28일까지 검출될 수 있음이 문헌의 보고서에서 발견되었다. IB QX가 췌장에서 검출되었지만, 육안 병리 검사 동안 이상이 관찰되지 않았다.
4.2 확산
IB QX의 존재가 비-백신접종 군 모두에서 검출됨에 따라 IB QX의 확산이 명확하게 실연되었다.
4.3 안전성
점안액에 의해 닭 당 105.07 EID50의 용량으로 투여된 계대 수준 80의 IB QX는 백신접종 후 어떠한 백신-관련 임상 징후도 야기하지 않았다. 백신접종 닭에게 노출된 후 IB QX로 감염된 비-백신접종 닭에서 IB의 임상 징후가 관찰되지 않았다.
5. 결론
백신접종 후, IB-QX MSV-p80 바이러스의 증식이 기관에서 발생하였고, IB QX가 다른 장기로 파종되었다. IB-QX MSV-p80이 1회 이상 닭들 사이에서 확산되었다. IB-QX MSV-p80 및 군들 사이에 계대된 백신이 안전하였다.
실시예 9: IB MM 및 IB QX 백신의 조합 백신접종
IB MM 및 IB QX 백신의 조합 백신접종의 효능을 SPF 닭에서 테스트하였다. 닭에게 제0일에 풀백 IBMM 백신 (Fort Dodge Animal Health)을 백신접종하고, 제14일에 생 IB QX 백신을 백신접종하였다. 백신접종 균주에게 제14일에 IB 균주 IT02를, 그리고 제35일에 IB 균주 793B를 챌린지하였다. 기관 절편의 섬모정체 테스트 (CST)의 분석 및 신장 병리학의 결정에 의해 백신접종 결과를 결정하였다. 백신접종 닭이 IT02 및 793 균주의 챌린지로부터 완전히 보호되었다.
각각의 백신접종 프로토콜 및 결과의 요약이 표 18에서 제공된다.
Figure pct00030
* * * * * * *
이해를 명확하게 하기 위한 목적으로 설명 및 예에 의해 상기의 발명이 일부 상세하게 기술되었지만, 본 발명은 개시된 특정 실시양태에 한정되지 않고, 첨부된 청구항에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 취지 및 범주 내에 속하는 모든 변화 및 변형을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 명확하게 및 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
ECACC 09061001 20090610 ECACC 09061002 20090610 ECACC 09061003 20090610 ECACC 09061004 20090610
SEQUENCE LISTING <110> Wyeth Geerligs, Harmen Jacob Meinders, Cindy Aleida Maria Boelm, Geert Jan Stuurman, Bastiana Geertruida Elisabeth <120> INFECTIOUS BRONCHITIS VACCINES DERIVED FROM IB-QX-LIKE STRAINS <130> AM103152 <150> 61/087228 <151> 2008-08-08 <160> 8 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1657 <212> DNA <213> Infectious Bronchitis Virus QX <400> 1 atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg 60 ttcgattctg ctaataatta tgtgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120 tggcatttgc aagggggtgc ttatgcagta gtgaattcca ctaattatag taataatgca 180 ggttctgcac ctcagtgcac tgttggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240 tctatagcta tgacagcacc tcttcagggt atggcttggt ctaagtcaca attttgtagt 300 gcacactgta acttttctga aattacagtt tttgtcacac attgttatag tagtggtagc 360 gggtcttgtc ctataacagg catgattcca cgtgatcata ttcgtatttc tgcaatgaaa 420 aatggttctt tattttataa tttaacagtt agcgtatcta aataccctaa ttttaaatct 480 tttcaatgtg ttaacaactt cacatctgtt tatttaaatg gtgatcttgt ttttacttcc 540 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Pro Arg Asp His Ile Arg Ile Ser Ala Met Lys Asn Gly Ser Leu 130 135 140 Phe Tyr Asn Leu Thr Val Ser Val Ser Lys Tyr Pro Asn Phe Lys Ser 145 150 155 160 Phe Gln Cys Val Asn Asn Phe Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly Asp Leu 165 170 175 Val Phe Thr Ser Asn Lys Thr Thr Asp Val Thr Ser Ala Gly Val Tyr 180 185 190 Phe Lys Ala Gly Gly Pro Val Asn Tyr Ser Ile Met Lys Glu Phe Lys 195 200 205 Val Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala Gln Asp Val Val Leu Cys 210 215 220 Asp Asn Ser Pro Lys Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn 225 230 235 240 Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Ser Thr Leu Val Arg Glu 245 250 255 Lys Phe Ile Val Tyr Arg Glu Ser Ser Val Asn Thr Thr Leu Ala Leu 260 265 270 Thr Asn Phe Thr Phe Thr Asn Val Ser Asn Ala Gln Pro Asn Ser Gly 275 280 285 Gly Val Asn Thr Phe His Leu Tyr Gln Thr Gln Thr Ala Gln Ser Gly 290 295 300 Tyr Tyr Asn Phe Asn Leu Ser Phe Leu Ser Gln Phe Val Tyr Lys Ala 305 310 315 320 Ser Asp Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Ser Cys Ser Phe Arg Pro 325 330 335 Glu Thr Ile Asn Ser Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Leu 340 345 350 Thr Tyr Gly Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Ser Gly 355 360 365 Lys Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Lys Gly Pro Met Ala Cys 370 375 380 Lys Gly Val Tyr Ser Gly Glu Leu Ser Thr Asn Phe Glu Cys Gly Leu 385 390 395 400 Leu Val Tyr Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Arg Thr 405 410 415 Glu Pro Leu Val Leu Thr Gln Tyr Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asp 420 425 430 Lys Cys Val Ala Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly Phe Ile 435 440 445 Thr Asn Val Thr Asp Ser Ala Ala Asn Phe Ser Tyr Leu Ala Asp Gly 450 455 460 Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Val Phe Val Val 465 470 475 480 Gln Gly Ile Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp 485 490 495 Val Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Ile Val Gly Ile Leu 500 505 510 Thr Ser Arg Asn Glu Thr Gly Ser Glu Gln Val Glu Asn Gln Phe Tyr 515 520 525 Val Lys Leu Thr Asn Ser Ser His Arg Arg Arg Arg Ser Ile Gly Gln 530 535 540 Asn Val Thr Ser Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Arg Phe Cys Ile Glu 545 550 555 560 Pro Asp Gly Ser Leu Lys Met Ile Val Pro Glu Glu Leu Lys Gln Phe 565 570 575 Val Ala Pro Leu Leu Asn Ile Thr Glu Ser Val Leu Ile Pro Asn Ser 580 585 590 Phe Asn Leu Thr Val Pro Pro Arg Asn 595 600 <210> 3 <211> 567 <212> PRT <213> Infectious Bronchitis Virus QX LIke L1449-2 <400> 3 Met Leu Val Lys Ser Leu Phe Leu Val Thr Ile Leu Cys Ala Leu Cys 1 5 10 15 Ser Ala Asn Leu Phe Asp Ser Asp Asn Asn Tyr Val Tyr Tyr Tyr Gln 20 25 30 Ser Ala Phe Arg Pro Pro Asn Gly Trp His Leu Gln Gly Gly Ala Tyr 35 40 45 Ala Val Val Asn Ser Thr Asn Tyr Thr Asn Asn Ala Gly Ser Ala His 50 55 60 Gly Cys Thr Val Gly Val Ile Lys Asp Val Tyr Asn Gln Ser Val Ala 65 70 75 80 Ser Ile Ala Met Thr Ala Pro Leu Gln Gly Met Ala Trp Ser Lys Ser 85 90 95 Gln Phe Cys Ser Ala His Cys Asn Phe Ser Glu Ile Thr Val Phe Val 100 105 110 Thr His Cys Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Ser Cys Pro Ile Thr Gly Met 115 120 125 Ile Pro Arg Asp His Ile Arg Ile Ser Ala Met Lys Asn Gly Ser Leu 130 135 140 Phe Tyr Asn Leu Thr Val Ser Val Ser Lys Tyr Pro Asn Phe Lys Ser 145 150 155 160 Phe Gln Cys Val Asn Asn Phe Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly Asp Leu 165 170 175 Val Phe Thr Ser Asn Lys Thr Thr Asp Val Thr Ser Ala Gly Val Tyr 180 185 190 Phe Lys Ala Gly Gly Pro Val Asn Tyr Ser Ile Met Lys Glu Phe Lys 195 200 205 Val Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala Gln Asp Val Ile Leu Cys 210 215 220 Asp Asn Ser Pro Lys Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn 225 230 235 240 Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Ser Thr Leu Val Arg Glu 245 250 255 Lys Phe Ile Val Tyr Arg Glu Ser Ser Val Asn Thr Thr Leu Ala Leu 260 265 270 Thr Asn Phe Thr Phe Thr Asn Val Ser Asn Ala Gln Pro Asn Ser Gly 275 280 285 Gly Val Asn Thr Phe His Leu Tyr Gln Thr Gln Thr Ala Gln Ser Gly 290 295 300 Tyr Tyr Asn Phe Asn Leu Ser Phe Leu Ser Gln Phe Val Tyr Lys Ala 305 310 315 320 Ser Asp Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Ser Cys Ser Phe Arg Pro 325 330 335 Glu Thr Ile Asn Ser Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Leu 340 345 350 Thr Tyr Gly Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Ser Gly 355 360 365 Lys Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Lys Gly Pro Met Ala Cys 370 375 380 Lys Gly Val Tyr Ser Gly Glu Leu Ser Thr Asn Phe Glu Cys Gly Leu 385 390 395 400 Leu Val Tyr Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Arg Thr 405 410 415 Glu Pro Leu Val Leu Thr Gln Tyr Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asp 420 425 430 Lys Cys Val Ala Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly Phe Ile 435 440 445 Thr Asn Val Thr Asp Ser Ala Ala Asn Phe Ser Tyr Leu Ala Asp Gly 450 455 460 Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Val Phe Val Val 465 470 475 480 Gln Gly Ile Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp 485 490 495 Val Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Ile Val Gly Ile Leu 500 505 510 Thr Ser Arg Asn Glu Thr Gly Ser Glu Gln Val Glu Asn Gln Phe Tyr 515 520 525 Val Lys Leu Thr Asn Ser Ser His Arg Arg Arg Arg Ser Ile Gly Gln 530 535 540 Asn Val Thr Ser Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Arg Phe Cys 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Asp Val Thr Ser Ala Gly Val Tyr 180 185 190 Phe Lys Ala Gly Gly Pro Val Asn Tyr Ser Ile Met Lys Glu Phe Lys 195 200 205 Val Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala Gln Asp Val Ile Leu Cys 210 215 220 Asp Asn Ser Pro Lys Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn 225 230 235 240 Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Ser Thr Leu Val Arg Glu 245 250 255 Lys Phe Ile Val Tyr Arg Glu Ser Ser Val Asn Thr Thr Leu Ala Leu 260 265 270 Thr Asn Phe Thr Phe Thr Asn Val Ser Asn Ala Gln Pro Asn Ser Gly 275 280 285 Gly Val Asn Thr Phe His Leu Tyr Gln Thr Gln Thr Ala Gln Ser Gly 290 295 300 Tyr Tyr Asn Phe Asn Leu Ser Phe Leu Ser Gln Phe Val Tyr Lys Ala 305 310 315 320 Ser Asp Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Ser Cys Ser Phe Arg Pro 325 330 335 Glu Thr Ile Asn Ser Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Leu 340 345 350 Thr Tyr Gly Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Ser Gly 355 360 365 Lys Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Lys Gly Pro Met Ala Cys 370 375 380 Lys Gly Val Tyr Ser Gly Glu Leu Ser Thr Asn Phe Glu Cys Gly Leu 385 390 395 400 Leu Val Tyr Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Arg Thr 405 410 415 Glu Pro Leu Val Leu Thr Gln Tyr Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asp 420 425 430 Lys Cys Val Ala Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly Phe Ile 435 440 445 Thr Asn Val Thr Asp Ser Ala Ala Asn Phe Ser Tyr Leu Ala Asp Gly 450 455 460 Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Val Phe Val Val 465 470 475 480 Gln Gly Ile Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp 485 490 495 Val Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Ile Val Gly Ile Leu 500 505 510 Thr Ser Arg Asn Glu Thr Gly Ser Glu Gln Val Glu Asn Gln Phe Tyr 515 520 525 Val Lys Leu Thr Asn Ser Ser His Arg Arg Arg Arg Ser Ile Gly Gln 530 535 540 Asn Val Thr Ser Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Arg Phe Cys Ile Glu 545 550 555 560 Pro Asp Gly Ser Leu Lys Met Ile Val Pro Glu Glu Leu Lys Gln Phe 565 570 575 Val Ala Pro Leu Leu Asn 580 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Infectious Bronchitis Virus primer <400> 5 taatactggy aatttttcag atgg 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Infectious Bronchitis Virus primer <400> 6 aatacagatt gcttacacca cc 22 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Infectious Bronchitis Virus primer <400> 7 gcttatgcag tagtcaat 18 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Infectious Bronchitis Virus primer <400> 8 cacgtggaat catgcctgtt at 22

Claims (35)

  1. IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 감염성 기관지염 (IB) 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 불활성화 바이러스인 단리된 IB 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 약독화 생 바이러스인 단리된 IB 바이러스.
  4. 제3항에 있어서, 계대에 의해 약독화된 단리된 IB 바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 5회 이상의 계대에 의해 약독화된 단리된 IB 바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 50회 이상의 계대에 의해 약독화된 단리된 IB 바이러스.
  7. 제1항에 있어서, 균주 명칭이 L-1148인 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 IB 바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 균주 명칭이 1449-2 또는 1449-10인 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 IB 바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 S1 단백질을 갖는 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 IB 바이러스.
  10. 제1항에 있어서, 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 S1 단백질을 갖는 IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 IB 바이러스.
  11. (i) IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 감염성 기관지염 (IB) 바이러스; 및 (ii) 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 백신 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단리된 IB 바이러스가 불활성화 바이러스인 백신 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 백신 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 단리된 IB 바이러스가 약독화 생 바이러스인 백신 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 비-IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 하나 이상의 추가적인 약독화 생 IB 바이러스를 추가로 포함하는 백신 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 약독화 생 IB 바이러스가 793B, 매사추세츠(Massachusetts), 이태리(Italy)-02, D274, 아칸소(Arkansas), D1466, B1648, 및 조지아(Georgia)-98로 구성된 군으로부터 선택된 비-IB-QX-유사 바이러스로부터 유래되는 백신 조성물.
  17. 제11항에 있어서, IB 바이러스 이외의 감염원으로부터 유래된 하나 이상의 추가적인 항원성 성분을 추가로 포함하는 백신 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 추가적인 항원성 성분이 뉴캐슬병(Newcastle Disease) 바이러스, 마렉병(Marek's Disease) 바이러스, 감염성 점액낭병(Infectious Bursal Disease) 바이러스, 레오바이러스(Reovirus), 조류 인플루엔자(Avian Influenza) 바이러스, 닭 빈혈(Chicken Anemia) 바이러스, 또는 조류 뇌척수염(Avian Encephalomyelitis) 바이러스로부터 유래되는 백신 조성물.
  19. 가금류 발육란에서 IB-QX-유사 바이러스를 계대시키는 것을 포함하는 약독화 생 감염성 기관지염 (IB) 바이러스의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 IB-QX-유사 바이러스가 가금류 발육란에서 5회 내지 400회 계대되는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 IB-QX-유사 바이러스가 가금류 발육란에서 10회 내지 100회 계대되는 방법.
  22. 제11항의 백신 조성물을 새에게 투여하는 것을 포함하는 감염성 기관지염 (IB)에 대한 새의 백신접종 방법.
  23. 조류 숙주 당 약 102 TCID50 내지 조류 숙주 당 약 106 TCID50의 대략적인 범위로 면역원성 유효량의 약독화 생 균주 IB QX 또는 IB QX-유사 바이러스로 본질적으로 구성되는 백신을 상기 조류 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 기관지염 (IB) QX 또는 QX-유사 바이러스로부터 조류 숙주를 보호하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 조류 숙주 당 약 105 TCID50을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 조류 숙주가 닭인 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신이 점안제를 통해 또는 분무에 의해 투여되는 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 QX 또는 QX-유사 바이러스가 난을 통한 계대에 의해 약독화되는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 약독화 바이러스가 30회 이상 계대되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 약독화 바이러스가 65회 이상 계대되는 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 약독화 바이러스가 70회 이상 계대되는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 약독화 바이러스가 80회 이상 계대되는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 약독화 바이러스가 85회 이상 계대되는 방법.
  33. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 임시 수탁 번호 09061002 하에 ECACC (European Collection of Cell Cultures)에 기탁된 IB QX L1148 MSV65, 임시 수탁 번호 09061004 하에 ECACC에 기탁된 IB QX L1148A MSV80, 임시 수탁 번호 09061003 하에 ECACC에 기탁된 IB QX L1148A MSV65 x+5, 또는 임시 수탁 번호 09061001 하에 ECACC에 기탁된 IB QX L1148A MSV80 x+5로 명시되는 균주들 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, IB 바이러스 이외의 하나 이상의 추가적인 감염원에 대한 백신접종을 추가로 포함하는 방법.
  35. 임시 수탁 번호 09061002 하에 ECACC (European Collection of Cell Cultures)에 기탁된 IB QX L1148 MSV65, 임시 수탁 번호 09061004 하에 ECACC에 기탁된 IB QX L1148A MSV80, 임시 수탁 번호 09061003 하에 ECACC에 기탁된 IB QX L1148A MSV65 x+5, 또는 임시 수탁 번호 09061001 하에 ECACC에 기탁된 IB QX L1148A MSV80 x+5로 명시되는 균주들로부터 선택된, IB-QX-유사 바이러스로부터 유래된 단리된 약독화 감염성 기관지염 (IB) 바이러스.
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