KR20110036369A

KR20110036369A - 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드 및 이를 이용한 이리도바이러스 예방용 백신

Info

Publication number: KR20110036369A
Application number: KR1020090093996A
Authority: KR
Inventors: 김태중; 이재일
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2009-10-01
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2011-04-07
Also published as: KR101127926B1

Abstract

본 발명은 각종 해수어에서 치명적인 질명을 일으키는 병원체인 어류 이리도바이러스의 면역원성을 갖는 부위를 이용한 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드 및 이를 이용한 이리도바이러스 예방용 백신에 관한 것으로, 본 발명에 따른 백신은 대상인 어류의 소화기를 통한 효과적인 체액성 면역을 유발하여 이리도바이러스를 예방할 수 있어 생존율을 상승시키는 효과가 있으며, 또한 사료와 섞어 투여함으로써 어류에게 접종으로 인한 스트레스를 전혀 주지 않은 장점이 있다.

이리도바이러스, 백신

Description

해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드 및 이를 이용한 이리도바이러스 예방용 백신{Iridovirus antigenic peptide and vaccine comprising the same}

본 발명은 각종 해수어에서 치명적인 질명을 일으키는 병원체인 어류 이리도바이러스의 면역원성을 갖는 부위를 이용한 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드 및 이를 이용한 이리도바이러스 예방용 백신에 관한 것이다.

이리도바이러스(iridovirus)는 정 20면체 모양을 하고 있고, 게놈의 크기가 170 내지 200 kb인 이중가닥 DNA 바이러스이다. 이리도바이러스는 어류에 전신 감염되어, 높은 이환율 및 치사율을 보이는 특징이 있다. 어류 이리도바이러스는 넓은 지역 분포와 숙주 범위를 가지며, 보통 18 내지 20 ℃에서 25 내지 27 ℃로 수온 상승이 되는 시기에 발병한다.

이리도바이러스병에 걸린 고기는 특별한 외부 증상없이, 비정상적이고 무기력한 유영을 보이고, 2개월 동안 50 내지 90%의 누적 치사율을 보인다. 조직 병리학적 소견의 경우 아가미, 신장, 심장, 간 및 비장에서 비대 호염기 세포가 보인다. 이리도바이러스는 자생어에서 수입어 뿐 아니라, 자연어에서 양식어까지, 그리고 치어에서 성어까지 널리 퍼져 어류산업에 있어 큰 경제적 손실을 주고 있다. 우 리나라의 경우 1998년 8월 내지 10월에 남해안 지역의 양식 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 대량 폐사의 원인이 참돔 이리도바이러스(Red sea bream iridovirus, RSIV)와 유사한 이리도바이러스로 밝혀진 이후, 다양한 종류의 양식어류에서 이리도바이러스 감염증이 발생하고 있다. 넙치(Paralichthys olivaceus)의 경우, 2003년 양식 넙치 치어의 대량폐사 역시 참돔 이리도바이러스와 유사한 이리도바이러스로 밝혀졌다. 이 감염증은 수온 23 내지 26 ℃ 사이에서 발생하였으며, 1년생 뿐 아니라 2 내지 3년생 어류도 폐사하여 막대한 손실을 입혔다. 이러한 발병에도 불구하고 아직 이리도바이러스에 대한 예방백신이나 치료법이 없는 상태여서 시급한 예방대책이 필요한 실정이다. 최근의 연구들을 보면 어류 이리도바이러스의 캡시드 단백질은, 이전에 보고된 같은 이리도 비리데과에 속하는 라나바이러스 (Ranavirus)나 림포시스티바이러스(Lymphocystivirus)와는 유전적으로 상당히 변이가 있지만, 다양한 어종에서 분리되는 어류 이리도바이러스 사이의 캡시드 단백질 은 감염 어종에 무관하게 유전적으로 매우 유하나 것으로 밝혀져 혈청학적 진단 및 재조합 단백질을 이용한 예방백신 개발에 좋은 조건을 보이고 있다.

그러나 아직까지 어류 이리도 바이러스에 대한 진단법만이 존재할 뿐 효과적인 예방백신은 전세계적으로 전무한 상황인 것이 현실이다.

이에 본 발명자들은 이리도 바이러스에 대한 위험성을 가지고 있지 않으면서, 면역원성을 갖는 부위를 이용한 재조합 단백질 백신에 대한 연구를 지속적으로 한 결과, 어류 이리도 바이러스인 icosahedral cytoplasmic DNA virus의 유전자 중 구조단백질인 캡시드 단백질이 면역원성이 있음을 확인한 바, 이를 이용한 이리도 바이러스의 재조합 단백질의 놀라운 백신효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 각종 해수어에서 치명적인 질명을 일으키는 병원체인 어류 이리도바이러스의 면역원성을 갖는 부위를 이용한 이리도 바이러스 예방용 백신을 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 효모 발현시스템을 이용하기 위한 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드 및 이를 코딩하는 재조합 핵산을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 발현하는 형질전환 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 해수어 이리도바이러스의 캡시드 단백질을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 효모 발현시스템을 이용하기 위한 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드 및 이를 코딩하는 재조합 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 발현하는 형질전환 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 해수어 이리도바이러스의 캡시드 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드는 효모 발현시스템을 이용하기 위한 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드인 것이 특징이며, 이는 해수어 이리도바이러스의 캡시드 단백질의 면역원성 부위를 바이러스와 효모의 코 돈의 사용 방식(codon usage)을 최적화하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 이리도바이러스 예방용 백신은 대상인 어류의 소화기를 통한 효과적인 체액성 면역을 유발하는 예방백신인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 해수어 이리도바이러스(iridovirus)의 캡시드(capsid) 단백질의 아미노산 1 내지 21 및 427 내지 454번이 제거되고, 아미노산 99번, 153번, 197번, 203번, 204번, 306번, 346번 및 395번 부위의 CGC 코돈이 AGA 코돈으로 부위-특이적 돌연변이화(site-directed mutagenesis)된, 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 제공한다.

보다 상세하게는 약 1.21 kb의 해수어 이리도바이러스(iridovirus)의 캡시드(capsid) 유전자의 항원성 펩타이드를 제조하기 위하여, 항원성의 분석한 후 해수어 이리도바이러스(iridovirus)의 캡시드(capsid) 유전자의 염기서열 1번부터 63번까지(아미노산 1번부터 21번) 및 염기서열 1281번부터 마지막 1362번(아미노산 427번부터 454번)의 항원성이 약하고 소수성인 부분을 제거하였다. 다음 단계로 효모에서는 잘 해독되지 않는 8개의 아르기닌(R) 코돈을 효모에서 잘 해독되는 AGA로 최적화하였다. 도 3을 참조한다. 이는 목적으로 하는 이리도바이러스 예방용 백신을 효모를 이용하여 어류에게 접종 및 투여하기 가장 간편한 방법인 사료에 첨가하는 형태의 예방백신을 제조하기 위함이다. 또한 대장균과 같은 원핵세포에서의 발현에서는 나타나지 않는 현상인 N-당화(N-glycosylation)가 효모에서는 일어남으로 인해 훨씬 강화된 면역력 및 항원성을 부여하게 된다. 이러한 당화(glycosylation) 부위는 해당 항원성 펩타이드내에 5개 부위(237번째, 302번째, 311번째, 398번째, 419번째의 아스파라긴)에서 일어난다.

본 발명의 해수어 이리도바이러스 캡시드 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며, 본 발명에 따른 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산은 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산으로 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 및 상기 재조합 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 상기 재조합 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 발현하는 형질전환 미생물을 제공하며, 상기 미생물은 피치아 파스토리스(Phichia pastoris)인 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 재조합 벡터는 효모 발현용 벡터로 pGAPZα A 벡터를 이용하였으며, 발현 여부를 확인하기 위하여 SDS-PAGE와 Western blot assay로 발현을 확인하였다. 그 결과, 형질전환된 효모로부터 발현되는 단백질은 대장균에서 발현되는 재조합 단백질(약 46 kDa) 보다 약간 큰 크기의 약 55 kDa의 밴드가 생성되었으며, 이는 효모에서 나타나는 당화(glycosylation)의 영향으로 약 9 kDa 정도의 분자량이 증가된 것으로 확인하였다. 도 7을 참조한다.

본 발명은 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 발현하는 형질전환 미 생물을 배양하여 해수어 이리도 바이러스의 캡시드 단백질을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법으로 제조된 캡시드 단백질 내 항원성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 이리도바이러스 예방용 백신을 제공한다.

상기 백신은 경구용 또는 식용 섭취가 가능한 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 해수어 이리도 바이러스의 캡시드 재조합 단백질을 이용한 백신 접종이 이리도 바이러스 감염증에 대한 방어 효과를 확인한 결과, 효모에서 발현된 해수어 이리도 바이러스의 재조합 캡시드 단백질을 백신으로 사용한 시험군 그룹에서는 생존률이 91.7% 로 대조군의 사망률 100%에 비해 효모에서 발현된 이리도 바이러스 재조합 캡시드 단백질 백신의 놀라운 이리도 바이러스 감염에 대한 확실한 방어능이 있는 것을 확인 할 수 있었다.

또한, 효모에서 발현되는 해수어 이리도 바이러스의 재조합 캡시드 단백질을 경구투여 후 혈중 항체가 생성 여부를 알아본 결과, 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 항-이리도바이러스 유전자가 유도됨을 확인할 수 있었고, 또한 혈중 항체가가 상승되어 면역반응이 유도됨을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 재조합 캡시드 단백질이 항원성 캡시드 항체와 반응함으로써, 기존의 서열번호 1의 해수어 이리도바이러스 캡시드 단백질의 항원과 동일한 항원성이 있는 것을 보여주는 결과이기도 하다. 도 8을 참조한다.

본 발명에 따른 이리도바이러스 예방용 백신은 대상인 어류의 소화기를 통한 효과적인 체액성 면역을 유발하여 이리도바이러스를 예방할 수 있어 생존율을 상승 시키는 효과가 있으며, 또한 사료와 섞어 투여함으로써 어류에게 접종으로 인한 스트레스를 전혀 주지 않은 장점이 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 실시예 1] 해수어 이리도바이러스 캡시드 유전자의 클로닝

넙치(Paralichthys olivaceus)의 비장으로부터 phenol/chloroform 방법을 실시하여 DNA를 추출하여 TE buffer(10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 7.5)에 녹여 50 ng/㎕의 농도로 맞춘 후, 중합효소연쇄반응 template로 사용하였다.

프라이머는 GenBank에 등록되어 있는 rockbream iridovirus major capsid protein(MCP, AY849393)를 이용해서 제한효소 EcoRI 부위(밑줄 친 염기서열)를 포함하는 정방향 프라이머(5'-GAA GAATTC ATG TCT GCA ATC TCA GGT GCG-3')와 KpnI 부위(밑줄 친 염기서열)를 포함하는 역방향 프라이머(5'-GGT GGTACC TTA CAG GAT AGG GAA GCC TGC-3')를 제작하여 사용하였다.

중합효소연쇄반응 조건은 2 ㎕ DNA와 10×reaction buffer 5 ㎕안의 상기 제작한 각 프라이머(50 pM) 1 ㎕, 10 mM dNTPs(각 2.5 mM) 5 ㎕, 5U Ex TaqTM DNA polymerase 1㎕을 혼합한 후, 총 50 ㎕이 되도록 멸균수를 첨가하고 중합효소연쇄반응로 증폭하였다. 중합효소연쇄반응은 변성(95℃, 1분), 어닐링(60℃, 1분), 연장(72℃, 2분), 30 싸이클의 조건으로 반응하였다.

상기 중합효소연쇄반응로 증폭된 생성물을 1.0% 아가로스 겔에서 증폭된 특이적인 밴드는 1.21 kb의 사이즈를 확인하였고, 특이적인 밴드만 분리하여 중합효소연쇄반응 산물 정제 키트(PCR purification kit)를 이용하여 순수분리하고, 이를 pGEM-T easy vector에 삽입하여 클로닝한 후, 대장균(E. coli) JM109에 형질전환시켜 배양하였다.

상기 배양된 형질전환 대장균을 QIAprepTM Spin Mini Kit를 이용하여 pGEM-T easy vector에 클로닝된 DNA 플라스미드를 추출하였다. 추출한 DNA 플라스미드 내에 증폭된 특이적인 밴드가 삽입되었는지 알아보기 위하여 제한효소 EcoRI + KpnI를 이용하여 확인하였다. 그리고 이 삽인된 DNA의 염기서열을 확인하기 위하여 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였으며, 분석된 염기서열을 GenBank에 등록된 rockbream iridovirus MCP 유전자의 염기서열과 비교분석한 결과, 도 2의 아미노산 서열(서열번호 1)을 가지는 이리도바이러스 캡시드 유전자를 클로닝 할 수 있었다.

[ 실시예 2] 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드의 제조

상기 실시예 1에서 pGEM-T Easy에 클로닝된 약 1.21 kb의 MCP 유전자의 항원 성 펩타이드를 제조하기 위하여, 항원성의 분석한 후 해수어 이리도바이러스(iridovirus)의 캡시드(capsid) 유전자의 염기서열 1번부터 63번까지(아미노산 1번부터 21번) 및 염기서열 1281번부터 마지막 1362번(아미노산 427번부터 454번)의 항원성이 약하고 소수성인 부분을 제거하였다.

상기 제거된 펩타이드를 도 3에서 보는 바와 같이 효모에서는 잘 해독되지 않는 8개의 아르기닌(R) 코돈을 AGA로 최적화하였다. 이를 위해 바꾸고자 하는 해당 염기서열을 가진 프라이머 세트를 준비하였다. 즉, 1번째 아르기닌 코돈인 CGC를 AGA로 바꾸기 위해 CGC 부위 좌우의 15 mer씩을 포함하여 정방향 프라이머를 gag aac agc tac att AGA tgg tgt gat aat ttg를 준비하고, 역방향 프라이머로 caa att atc aca cca TCT aat gta gct gtt ctc로 준비하여 부위-특이적 돌연변이화(site-directed mutagenesis)를 실시하였다. 마찬가지로 나머지 7개의 아르기닌 코돈도 하기 표 1과 같이 프라이머를 각각 준비하여 중합효소연쇄반응을 실시하였다.

중합효소연쇄반응은 5-3 exonuclease 기능이 없는 pfu DNA polymerase를 사용하였고 증폭이 끝난 다음 증폭된 pGEM-T Easy 벡터를 제거하기 위해 제한효소 DpnI으로 처리 후, 대장균인 JM109에 형질전환하고 아르기닌 코돈인 CGC가 AGA로원하는 대로 변화되었는지 확인하기 위해 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 도 5 및 6에서도 확인 할 수 있듯이, 이리도바이러스 항원성 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산은 서열로 이루어지고, 상기 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 코딩하는 서열번호 3의 재조합 핵산을 제조할 수 있었다.

[실시예 3] 해수어 이리도바이러스의 캡시드 단밸질의 발현

(1) 해수어 이리도바이러스의 재조합 단백질 발현용 벡터제조

상기 실시예 2의 pGEM-T easy에 클로닝된 코돈이 최적화된 재조합 핵산을 2 가지 제한효소(EcoRI + KpnI)로 처리한 다음 양쪽 끝을 점착성 말단(sticky ends)을 만들었다. 효모 발현용 벡터인 pGAPZα A 벡터를 동일한 제한효소로(EcoRI + KpnI) 처리하여 T4 DNA ligase(Promega)를 이용하여 재조합 핵산과 효모 발현용 벡터를 라이게이션 하였다. 상기 라이게이션에 의해서 만들어진 하나의 플라스미드 construct를 대장균인 JM109에서 배양한 후 재조합 핵산의 존재 및 open reading frame의 shift 여부를 시퀀싱을 통해 재확인 하였다.

상기 확인된 플라스미드 construct를 단백질 발현용 효모인 Phichia pastoris에 형질전환시키기 위하여 Pichia를 YPD 액체배지[1 %(w/v) yeast extract, 2%(w/v) peptone, and 1%(v/v) glycerol] 및 YPD 고체배지에서 증식 후 competent cell을 준비하고 Pichia EasyComp^TM Kit를 이용하여 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 Phichia만을 찾아내기 위하여 배지에 항생제인 Zeocin을 100 ㎍/ml 농도로 첨가하여 해수어 이리도바이러스의 재조합 단백질이 발현되는 형질전환 효모를 분리 선별하였다.

(2) 이리도 바이러스 캡시드 단백질의 발현확인

상기 선별 분리된 형질전환 효모 선택하여 100 ml의 YPD 배지에서 약 18시간 동안 160 rpm으로 28℃에서 교반하면서 배양 세포 농도가 OD₆₀₀에서 0.2정도 될 때 발현배지(1 % yeast extract, 2% peptone, 4×10^-5% Biotin)에 접종 후 2 내지 4일간 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 발현 여부를 확인하기 위하여 SDS-PAGE와 Western blot assay로 발현을 확인하였다. 대조군으로 대장균에서 발현된 MCP 단백 질을 사용하였다.

도 7의 결과에서 확인할 수 있듯이, 형질전환된 효모로부터 단백질 발현 여부를 SDS-PAGE로 확인 한 결과, 대장균에서 발현되는 재조합 단백질(약 46 kDa) 보다 약간 큰 크기의 약 55 kDa의 밴드가 생성되었다. 이는 효모에서 나타나는 당화(glycosylation)의 영향으로 약 9 kDa 정도의 분자량이 증가된 것으로 확인하였다.

[ 실시예 4] 이리도 바이러스 감염증에 대한 방어 효과

(1) 경구투여 실험

본 발명의 해수어 이리도 바이러스의 캡시드 재조합 단백질을 이용한 백신 접종이 이리도 바이러스 감염증에 대한 방어 효과를 나타내는지 알아보기 위해 방어 실험을 실시하였다. 즉, 2개월령 넙치를 대상으로 2개의 그룹으로 나누어 각 그룹 당 60마리의 실험개체를 준비한 뒤, 사료를 준비함에 있어 대조군은 증류수에 치어용 EP 사료를 담근 후 충분히 적시고 다시 꺼내어 건조하여 준비하였고, 시험군은 치어용 EP 사료 1 kg를 본 발명의 해수어 이리도바이러스의 재조합 단백질의 효모 배양액 1 ℓ를 담근 후 충분히 적시고 다시 꺼내어 건조하여 준비하였다. 사료의 급여는 1일 5회 100 마리당 약 50 g씩 급여하였고 2주일간 급여하였다.

상기 내용을 좀 더 간략히 하기 표 2에 나타내었다.

그리고 다시 2주일간의 휴지기를 가진 다음 다시 2주일간 같은 방법으로 효모에서 발현된 해수어 이리도 바이러스의 재조합 캡시드 단백질의 함유 및 비함유 사료를 급여하였다.

경구백신의 효과는 이리도 바이러스 공격에 대한 생존율을 조사함으로써 확인하였다. 즉, 이리도 바이러스에 자연 감염된 개체의 조직으로부터 바이러스를 취하여 감염에 이용하였다. 정량 중합효소연쇄반응을 통해 계산된 감염개체 조직으로 부터의 바이러스 개체수는 1×10⁵ copy/㎖로 나타났다.

그 결과, 효모에서 발현된 해수어 이리도 바이러스의 재조합 캡시드 단백질을 백신으로 사용한 시험군 그룹에서는 5 마리만이 사망(8.3% 사망률)하였고, 나머지 55 마리(91.7% 생존률)가 생존한 반면, 대조군에서는 60 마리 모두 사망(100% 사망률)하였다. 이로써 효모에서 발현된 이리도 바이러스 재조합 캡시드 단백질 백신은 이리도 바이러스 감염에 대한 확실한 방어능이 있는 것으로 나타났다.

(2) 항체가 측정

상기 시험군 및 대조군의 항체가 측정을 위해 사료 급여 종료 5일째 미정맥 으로부터 소량의 혈액을 채취하고 혈청을 분리 후 사용하였다. 즉, 분리된 혈청내의 항-이리도바이러스 MCP 항체(IgM)의 존재를 알아보기 위해 대장균에서 발현된 재조합 단백질 항원을 96-well ELISA 플레이트에 1 ug/㎖의 농도로 100 ㎕씩 코팅 후, 1차 항체로 실험어의 혈청을 1:100 희석하여 사용, 2차 항체로 항-넙치 IgM 단클론 항체 1:100 희석액을 2차항체로 사용, 마지막으로 항-마우스 IgG HRP-conjugated를 3차 항체로 사용하여 항체가 측정을 실시하였다.

효모에서 발현되는 해수어 이리도 바이러스의 재조합 캡시드 단백질을 경구투여 후 혈중 항체가 생성 여부를 알아본 결과, 도 8에서도 확인할 수 있듯이 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 항-이리도바이러스 유전자가 유도됨을 확인할 수 있었고, 또한 혈중 항체가가 상승되어 면역반응이 유도됨을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 재조합 캡시드 단백질이 항원성 캡시드 항체와 반응함으로써, 기존의 서열번호 1의 해수어 이리도바이러스 캡시드 단백질의 항원과 동일한 항원성이 있는 것을 보여주는 결과이기도 하다.

도 1은 중합효소연쇄반응을 이용한 해수어 이리도바이러스(iridovirus)의 캡시드(capsid) 유전자의 증폭 사진이고,

도 2는 해수어 이리도바이러스(iridovirus)의 캡시드(capsid) 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이고,

도 3은 해수어 이리도바이러스(iridovirus)의 캡시드(capsid) 단백질 내 제거된 아미노산 부위 및 부위-특이적 돌연변이화(site-directed mutagenesis)가 이루어지는 위치를 보여주는 도면이며,

도 4는 본 발명에 따른 해수어 이리도바이러스(iridovirus) 항원성 펩타이드의 부위-특이적 돌연변이화를 확인한 결과이다.

도 5는 본 발명에 따른 해수어 이리도바이러스(iridovirus) 항원성 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸 것이고,

도 6은 본 발명에 따른 해수어 이리도바이러스(iridovirus) 항원성 펩타이드 를 코팅하는 재조합 핵산의 염기서열(서열번호 3)을 나타낸 것이고,

도 7은 형질전환 효모로부터 본 발명에 따른 해수어 이리도바이러스(iridovirus) 항원성 펩타이드의 발현여부를 확인한 결과이며,

(M: size marker, 1: 대장균 MCP 단백질, 2: 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드, 3: 해수어 이리도바이러스의 캡시드 단백질)

도 8은 본 발명에 다른 해수어 이리도바이러서의 재조합 캡시드 단백질의 항원인식 후 유도되는 항체가를 측정한 도면이다.

(1: 대조군, 2: 시험군, P < 0.001)

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Iridovirus antigenic peptide and vaccine comprising the same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Paralichthys olivaceus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(453) <223> iridovirus capsid protein <400> 1 Met Ser Ala Ile Ser Gly Ala Asn Val Thr Ser Gly Phe Ile Asp Ile 1 5 10 15 Ser Ala Phe Asp Ala Met Glu Thr His Leu Tyr Gly Gly Asp Asn Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Phe Ala Arg Glu Thr Val Arg Ser Ser Trp Tyr Ser Lys 35 40 45 Pro Pro Val Thr Leu Ser Lys Gln Thr Gly His Ala Asn Phe Gly Gln 50 55 60 Glu Phe Ser Val Thr Val Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Leu Ile Asn Val 65 70 75 80 Trp Leu Arg Val Lys Ile Pro Ser Ile Thr Ser Ser Lys Glu Asn Ser 85 90 95 Tyr Ile Arg Trp Cys Asp Asn Leu Met His Asn Leu Val Glu Glu Val 100 105 110 Ser Val Ser Phe Asn Asp Leu Val Ala Gln Thr Leu Thr Ser Glu Phe 115 120 125 Leu Asp Phe Trp Asn Ala Cys Met Met Pro Gly Ser Lys Gln Ser Gly 130 135 140 Tyr Asn Lys Met Ile Gly Met Arg Ser Asp Leu Val Gly Gly Ile Thr 145 150 155 160 Asn Gly Gln Thr Met Pro Ala Ala Tyr Leu Asn Leu Pro Ile Pro Leu 165 170 175 Phe Phe Thr Arg Asp Thr Gly Leu Ala Leu Pro Thr Val Ser Leu Pro 180 185 190 Tyr Asn Glu Val Arg Ile His Phe Lys Leu Arg Arg Trp Glu Asp Leu 195 200 205 Leu Ile Ser Gln Ser Thr Gln Ala Asp Met Ala Ile Ser Thr Val Thr 210 215 220 Leu Ala Asn Ile Gly Asn Val Ala Pro Ala Leu Thr Asn Val Ser Val 225 230 235 240 Met Gly Thr Tyr Ala Val Leu Thr Ser Glu Glu Arg Glu Val Val Ala 245 250 255 Gln Ser Ser Arg Ser Met Leu Ile Glu Gln Cys Gln Val Ala Pro Arg 260 265 270 Val Pro Val Thr Pro Val Asp Asn Ser Leu Val His Leu Asp Leu Arg 275 280 285 Phe Ser His Pro Val Lys Ala Leu Phe Phe Ala Val Lys Asn Val Thr 290 295 300 His Arg Asn Val Gln Ser Asn Tyr Thr Ala Ala Ser Pro Val Tyr Val 305 310 315 320 Asn Asn Lys Val Asn Leu Pro Leu Leu Ala Thr Asn Pro Leu Ser Glu 325 330 335 Val Ser Leu Ile Tyr Glu Asn Thr Pro Arg Leu His Gln Met Gly Val 340 345 350 Asp Cys Phe Thr Ser Val Asp Pro Tyr Tyr Phe Ala Pro Ser Met Pro 355 360 365 Glu Met Asp Gly Val Met Thr Tyr Cys Tyr Thr Leu Asp Met Gly Asn 370 375 380 Ile Asn Pro Met Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Arg Leu Ser Asn Val Thr 385 390 395 400 Leu Ser Cys Lys Val Ser Asp Asn Ala Lys Thr Thr Ala Ala Gly Gly 405 410 415 Gly Gly Asn Gly Thr Gly Tyr Thr Val Ala Gln Lys Phe Glu Leu Val 420 425 430 Val Ile Ala Val Asn His Asn Ile Met Lys Ile Ala Asp Gly Ala Ala 435 440 445 Gly Phe Pro Ile Leu 450 <210> 2 <211> 406 <212> PRT <213> Paralichthys olivaceus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(406) <223> iridovirus antigen peptide <400> 2 Met Glu Thr His Leu Tyr Gly Gly Asp Asn Ala Val Thr Tyr Phe Ala 1 5 10 15 Arg Glu Thr Val Arg Ser Ser Trp Tyr Ser Lys Pro Pro Val Thr Leu 20 25 30 Ser Lys Gln Thr Gly His Ala Asn Phe Gly Gln Glu Phe Ser Val Thr 35 40 45 Val Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Leu Ile Asn Val Trp Leu Arg Val Lys 50 55 60 Ile Pro Ser Ile Thr Ser Ser Lys Glu Asn Ser Tyr Ile Arg Trp Cys 65 70 75 80 Asp Asn Leu Met His Asn Leu Val Glu Glu Val Ser Val Ser Phe Asn 85 90 95 Asp Leu Val Ala Gln Thr Leu Thr Ser Glu Phe Leu Asp Phe Trp Asn 100 105 110 Ala Cys Met Met Pro Gly Ser Lys Gln Ser Gly Tyr Asn Lys Met Ile 115 120 125 Gly Met Arg Ser Asp Leu Val Gly Gly Ile Thr Asn Gly Gln Thr Met 130 135 140 Pro Ala Ala Tyr Leu Asn Leu Pro Ile Pro Leu Phe Phe Thr Arg Asp 145 150 155 160 Thr Gly Leu Ala Leu Pro Thr Val Ser Leu Pro Tyr Asn Glu Val Arg 165 170 175 Ile His Phe Lys Leu Arg Arg Trp Glu Asp Leu Leu Ile Ser Gln Ser 180 185 190 Thr Gln Ala Asp Met Ala Ile Ser Thr Val Thr Leu Ala Asn Ile Gly 195 200 205 Asn Val Ala Pro Ala Leu Thr Asn Val Ser Val Met Gly Thr Tyr Ala 210 215 220 Val Leu Thr Ser Glu Glu Arg Glu Val Val Ala Gln Ser Ser Arg Ser 225 230 235 240 Met Leu Ile Glu Gln Cys Gln Val Ala Pro Arg Val Pro Val Thr Pro 245 250 255 Val Asp Asn Ser Leu Val His Leu Asp Leu Arg Phe Ser His Pro Val 260 265 270 Lys Ala Leu Phe Phe Ala Val Lys Asn Val Thr His Arg Asn Val Gln 275 280 285 Ser Asn Tyr Thr Ala Ala Ser Pro Val Tyr Val Asn Asn Lys Val Asn 290 295 300 Leu Pro Leu Leu Ala Thr Asn Pro Leu Ser Glu Val Ser Leu Ile Tyr 305 310 315 320 Glu Asn Thr Pro Arg Leu His Gln Met Gly Val Asp Cys Phe Thr Ser 325 330 335 Val Asp Pro Tyr Tyr Phe Ala Pro Ser Met Pro Glu Met Asp Gly Val 340 345 350 Met Thr Tyr Cys Tyr Thr Leu Asp Met Gly Asn Ile Asn Pro Met Gly 355 360 365 Ser Thr Asn Tyr Gly Arg Leu Ser Asn Val Thr Leu Ser Cys Lys Val 370 375 380 Ser Asp Asn Ala Lys Thr Thr Ala Ala Gly Gly Gly Gly Asn Gly Thr 385 390 395 400 Gly Tyr Thr Val Ala Gln 405 <210> 3 <211> 1217 <212> DNA <213> Paralichthys olivaceus <220> <221> transit_peptide <222> (1)..(1217) <223> iridovirus antigen peptide sequence <400> 3 atggagaccc acttgtatgg cggcgacaat gccgtgacct actttgcccg tgagaccgtg 60 cgtagttcct ggtacagcaa gccgcccgtc accctatcaa aacagactgg ccatgctaat 120 ttcggccagg agtttagtgt gactgtggca aggggtggcg actacctcat taatgtgtgg 180 ctgcgtgtta agatcccctc catcacgtcc agcaaggaga acagctacat tcgctggtgt 240 gataatttga tgcacaatct agttgaggag gtgtcggtgt catttaacga cctggtggca 300 cagaccctga ccagcgagtt ccttgacttt tggaacgcct gcatgatgcc tggcagcaaa 360 caatctggct acaacaagat gattggcatg cgcagcgacc tggtgggcgg tatcaccaac 420 ggtcagacta tgcccgccgc ctaccttaat ttgcccattc ccctgttctt tacccgtgac 480 acaggccttg cattgcctac tgtgtctctg ccgtacaatg aggtgcgcat ccacttcaag 540 ctgcggcgct gggaggacct gctcatcagc cagagcaccc aggccgacat ggccatatcg 600 actgtcaccc tggctaacat tggcaatgta gcacccgcac tgaccaacgt gtccgtgatg 660 ggcacctacg ctgtactgac aagtgaggag cgtgaggttg tggcccagtc tagccgtagc 720 atgctcattg agcagtgtca ggtggcgcct cgtgtgcctg tcacacccgt agacaattcc 780 ttggtgcatc tcgacctgag gttcagtcac cctgtgaagg ccttgttctt tgcagtcaag 840 aatgtcactc accgcaacgt gcaaagcaat tacaccgcgg ccagccccgt gtatgtcaac 900 aacaaggtga atctgccttt gctggccacc aatcccctgt ccgaggtgtc gctcatttac 960 gagaacaccc ctcggctcca ccagatggga gtagactgct tcacatctgt cgacccctac 1020 tactttgcgc ccagcatgcc tgagatggat ggtgttatga cctactgtta tacgctggac 1080 atgggcaata tcaaccctat gggctcgacc aactacggcc gcctgtccaa cgtcaccctg 1140 tcatgtaagg tgtcggacaa tgccaagacc accgcggcgg gcggtggagg caacggcacc 1200 ggctacacgg tcgccca 1217

Claims

해수어 이리도바이러스(iridovirus)의 캡시드(capsid) 단백질의 아미노산 1 내지 21 및 427 내지 454번이 제거되고, 아미노산 99번, 153번, 197번, 203번, 204번, 306번, 346번 및 395번 부위의 CGC 또는 CGG 코돈 (203 및 346번째)이 AGA 코돈으로 부위-특이적 돌연변이화(site-directed mutagenesis)된, 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드.
제 1항에 있어서,

상기 해수어 이리도바이러스의 캡시드 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드.
제 1항에 있어서,

상기 항원성 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산은 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 해수어 이리도바이러스 항원성 펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산.
제4항에 있어서,

서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산.
제 4항에 따른 재조합 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
제 1항 내지 제 3항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 항원성 펩타이드를 발현하는 형질전환 미생물.
제 7항에 있어서,

상기 미생물은 피치아 파스토리스(Phichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 형질전환 미생물.
제 7항에 따른 미생물을 배양하여 해수어 이리도 바이러스의 캡시드 단백질을 생산하는 방법.
제 1항 내지 제 3항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 항원성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 이리도바이러스 예방용 백신.
제 10항에 있어서,

상기 백신은 경구용 또는 식용 섭취가 가능한 것을 특징으로 하는 이리도 바이러스 예방용 백신.