KR20110030802A

KR20110030802A - 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20110030802A
Application number: KR1020090088405A
Authority: KR
Inventors: 서은종; 안기웅; 조병기
Original assignee: (주)더페이스샵
Priority date: 2009-09-18
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-03-24
Also published as: KR101135444B1

Abstract

본 발명은 팔미토일올리고펩타이드(Palmitoyl Oligo peptide; Palmitoyl-Glycyl-Histidyl-Lysine (Pal-Gly-His-Lys))와 두충 추출물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 팔미토일올리고펩타이드와 두충추출물이 콜라겐 합성을 매우 효과적으로 증진시킴으로써 피부주름을 효과적으로 개선한다.

팔미토일올리고펩타이드, 두충 추출물, 피부 노화, 주름 개선, 화장료

Description

팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for improvement of the skin wrinkles containing Palmitoyl Oligo peptide and Eucommia ulmoides extract}

피부는 인체의 가장 큰 기관으로서 전체 인체 부피의 약 16%를 차지하고 있고 보호기능과 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 다양한 역할을 담당하고 있는 아주 중요한 기관이다. 그러나, 나이가 들어감에 따라 각종 외부 환경요인 특히 여러 오염물질, 강한 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등으로 인해 피부 세포들이 손상을 입게 되고, 세포 증식이 제대로 이루어지지 않게 되어 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하 조직의 두께가 얇아지고, 피부장벽의 기능을 맡고 있는 Lipid barrier의 lipid 조성과 함량이 변화하면서 그 기능이 급격하게 저하됨 으로써 피부의 수분함량이 떨어지며 이로 인하여 피부에 주름, 탄력 손실 및 각질화 등이 발생한다.

사람의 피부는 노화가 진행됨에 따라 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역세포 및 피부세포의 기능과 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역단백질 및 생체 구성단백질들의 생합성이 줄어들게 되며 이로 인해 피부의 탄력이 감소하고, 피부결이 거칠어지며, 깊은 주름이 생기며 색소가 침착되는 내인적 노화(Arch Dermatol., 130:87-95(1994)와 외적으로는 각종 오염물질과 자외선에 의한 광노화 등에 의한 주름증가, 탄력감소, 피부건조의 증가가 나타날 뿐만 아니라 기미, 주근깨 및 검버섯 등이 생성되는 외인적 노화가 있는 것으로 알려져 있다(J. Am. Acad. Dermatol., 21:610-613(1989)).

피부의 노화 기작을 규명하기 위한 여러 연구들이 진행되어 여러 가지 피부 노화의 원인들이 밝혀졌다.　피부는 인체를 덮고 있는 최외곽에 있는 조직으로서 여러 유해 환경과 접촉하고 있으며 온도의 변화, 습도의 저하 또는 바람 등에 의해 건조하게 되면 외부에 대한 방어벽으로서의 피부 생리 활성이 저하되어 노화가 촉진된다. 특히 산소와 항상 접촉하고 있으며 자외선에 노출됨으로써 활성산소종으로 유도된 광산화적 손상을 계속 받게 된다. 자외선은 피부에 활성산소종을 유발시키고 그 결과 피부세포의 손상, 색소 침착을 증가시키게 되며 이는 피부 주요성분들의 직접적인 기능의 손실을 초래하며 피부 노화로 이어진다. 활성산소는 인체 내에서 질병과 노화를 일으키는 원인으로서 활성산소의 항산화력 및 노화억제 작용의 척도로 평가 될 수 있다. 피부 노화의 특성으로는 탄력성의 감소, 주름살, 기미 또 는 주근깨 등을 들 수 있고, 그 원인 중의 하나는 지질과산화에 의한 탄력섬유인 collagen과 elastin의 사슬 절단과 비정상적인 교차 결합 및 hyaluronic acid의 사슬 절단이다. 지질과산화는 oxidative stress에 의해서 초래되며, 그 과정 중에서 ROS인 free radical (superoxide, hydroxyl radical, nitric oxide)이 생성된다. 이러한 free radical 생성과정은 피부에 유해한 대사적 활성화의 전 단계일 뿐만 아니라, 피부 세포 및 조직 손상을 일으킨다고 보고되었다. 특히 주름과 관련하여 활성산소종에 의해 단백질 분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)의 발현이 유발되어 피부에 탄력을 부여하는 콜라겐 또는 엘라스틴 등을 변성 또는 파괴시켜 주름을 야기시킬 수 있다. 콜라겐(혹은 엘라스틴 등)은 피부 진피층의 매트릭스를 이루는 성분 중 가장 많은 성분이기 때문에 콜라겐의 생합성과 분해의 조절은 피부노화 과정 중에서 핵심이 되고 있다.

콜라겐 합성 촉진물질로 기존에 레티노인산(retinoic acid), 표피성장인자(Epidermal growth factor: EGF), TGF(trans forming growth factor, 발암증식인자; Cardinale G. et al., Adv. Enzymol., 41, p. 425, 1974), 동물 태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid(JP8-208424)), 클로렐라 추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 알려져 있다. 특히 표피성장인자는 상피세포, 내피세포 및 섬유아세포 세포증식의 강력한 촉진제로 작용하며, 상피세포 결손 시 상피세포의 이동과 증식을 촉진시키기 때문에 상처치유 효과가 우수하다. 또한 레티놀은 콜라겐 합성과 분해억제에 매우 효과적으로 피부주름 개선 효과는 미국 특허 제4,603,146호 및 제4,877,805호 등에 명시되어 있다.

그러나 레티노인산의 경우 불안정하고, 피부 적용 시 자극, 발적 등의 안정성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성을 촉진하여 피부 기능 개선 효과를 기대할 수 없다. 따라서, 생체에 안전하고 기존의 콜라겐 합성능 촉진 물질보다 효과가 높은 새로운 콜라겐 합성 촉진제의 개발이 절실히 요망되고 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 노력한 결과 팔미토일올리고펩타이드가 단독으로 사용할 경우에 콜라게네이즈 발현저해 효과가 미미하나 두충 추출물과 혼합하였을 때 피부 내의 콜라겐 합성을 촉진함에 있어 상승작용을 나타냄과 동시에 더욱 효과적으로 피부 주름을 개선시키고 피부의 탄력을 증진시킴을 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유하여 피부 주름을 개선시키고 피부의 탄력을 증진시키는 화장료 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 팔미토일올리고펩타이드와 두충추출물이 히아루론산의 생성을 증가시켜 피부보습을 개선하는 화장료 조성물을 제공한다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 다음과 같은 수단을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 주름 개선용 화장료 조성물은 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 유효성분으로 함유한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 팔미토일올리고펩타이드는 화장료 조성물 총 중량에 대해서 10^-6~10^-2중량%로, 두충 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~20.0 중량%로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 피부보습개선용 화장료 조성물은 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 또는 분무제의 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 팔미토일올리고펩타이드(Palmitoyl Oligopeptide; Palmitoyl-Glycyl-Histidyl-Lysine (Pal-Gly-His-Lys))와 두충 추출물을 함유하여 피부 내의 콜라겐 합성을 촉진함에 있어 상승작용을 나타내어 피부 주름을 개선시키고 피부의 탄력을 증진시키며 하아누로난(hyaluronan)생성을 증진시켜 피부 보습을 증진시키는 효과를 도모한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하다.

본 발명에 따른 피부주름개선용 화장료 조성물은 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부 주름을 개선시키고 피부의 탄력을 증진시키고 나아가 피부보습에 뛰어난 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 팔미토일올리고펩타이드는 생체 유사 단백질로서 상대적으로 다른 펩타이드보다 분자량이 작아 표피층 침투가 용이하고 나아가, 친유기인 Palmitoyl를 포함하고 있어 피부의 표피층 침투가 더 용이하다. 또한 팔미토일올리고펩타이드의 구조는 Palmitoyl - Glycyl - Histidyl - Lysine (Pal - Gly - is - Lys)으로서, 친수기인 아미노산기에 의해 진피층 침투가 용이하여 진피층에 존재하는 섬유아세포에 효과적으로 작용할 수 있다. 따라서 매우 낮은 농도에서도 콜라겐 합성과 진피층 세포외기질의 주 성분으로 피부의 보습에 중요한 역할을 하는 GAGs (Glycosaminoglycans)의 합성을 매우 효과적으로 증진시킨다. 본 발명에서 목적하는 효과를 얻기 위하여 상기 팔미토일올리고펩타이드는 조성물 총 중량에 대하여 10^-6∼10^-2 중량%, 바람직하게는 10^-5∼10^-3 중량%의 양으로 함유하는 것이 좋다.

본 발명에서 이용되는 두충(Eucommia ulmoides OLIVER)은 일명 사충, 사선, 목금, 두면, 두중 또는 당두충이라고도 하며, 예로부터 고유한 약용식물로서 당두충과에 속하는 낙엽교목이며, 1과1속에 단일식물이다. 중국에서는 인삼보다 귀했기 때문에 환상의 약초로 불렸으며 선목으로 알려져 왔다. 두충은 은행나무처럼 암수 딴 그루이며, 두충잎은 느릅나무잎과 비슷한 타원형이며 봄에 작은 흰색의 꽃이 피며, 수피를 자르면 고무나무처럼 흰색의 고무질 유액이 흐른다. 두충은 병충해와 세균, 박테리아에 강하며, 방충제 같은 농약을 살포하지 않아도 잘 자라며, 산성토양을 싫어하지만 토양개량 이외에는 손을 쓸 필요가 없는 식물이다. 두충의 효과에 대해서는 옛 문헌 등에서부터 언급이 되어 있다. '본초강목'에서는 두충이 간, 신을 보하며 근육을 튼튼하게 하고, 두충을 오래 먹으면 몸이 가벼워지고 늙지 않는다고 하였으며, '동의보감'에서는 두충은 신허로 허리가 조여들며 아프고 다리가 시큰시큰한 것도 잘 낳게 한다고 쓰여져 있고, '향약성집성방' 에서는 두충은 허리 와 다리통증을 낳게 하며 속을 보호하며 힘줄과 뼈를 튼튼하게 한다고 언급하고 있다.

본 발명에서 제공하는 화장료 조성물은 두충 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기에서 두충 추출물은 두충의 잎 또는 두충 줄기의 껍질을 추출용매를 사용하여 추출한 것이 바람직하다. 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다.

한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다.　예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 상기 두충 추출물을 전체 화장료 조성물에 대하여 0.001 내지 20.0 중량%를 포함하는 것이 좋다. 본 발명의 화장료 조성물이 0.001 중량 미만으로 상기 추출물을 포함할 경우에는 화장료 조성물의 콜라겐 합성 촉진, 콜라겐 분해 억제 및 피부노화 방지 효과가 미미하며 20.0 중량%를 초과하여 투입할 경우에는 초과투입에 따른 상승 효과가 적어 경제적이지 못하다. 더욱 바람직하기로는 본 발명의 화장료 조성물이 상기 추출물들을 0.01 내지 10.0 중량%, 더더욱 바람직하게는 0.1-5.0 중량%를 포함하는 것이 좋다.

본 발명은 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물의 시너지 효과에 의해 피부 주름을 효과적으로 개선시키는 화장료 조성물에 관한 것으로 이와 같은 사실은 하기의 실시예에 명시되어 있다.　상기 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 에센스, 팩 등 그 제형에 있어 특별히 한정되지 않고 화장료의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 제조될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.　이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 배합량은 중량%로 나타낸다.

팔미토일올리고펩타이드

하기에서 이용되는 팔미토일올리고펩타이드는 Palmitoyl - Glycyl - Histidyl - Lysine (Pal - Gly - His - Lys) 구조로 갖는 것을 프랑스 SEDERMA사로부터 구입하여 사용하였다.

제조예 1: 두충 추출물의 제조

두충의 잎과 잘게 썬 두충줄기 껍질 혼합물 1 kg을 추출 용매로서 물을 10 ~ 20 배 부피량 가하였다.　이를 70℃에서 1시간 가량 가열하였다.　이어, 여과한 후 상온에서 식힌 다음 4℃에서 7일간 저온 숙성시킨 다음 여과하여 사용하였다.

실험예 1: 항산화 효과

팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물의 항산화 효능을 확인하기 위하여, 자유 라디칼인 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질 (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl; 이하 DPPH)을 이용하였다. DPPH는 2×10^-4 M 농도가 되도록 에탄올에 용해시켜 사용하였다. DPPH 0.1㎖에 팔미토일올리고펩타이드, 두충 추출물 시료 또는 비타민 C를 각각 농도별로 0.1㎖ 첨가하여 30분간 실온에서 반응시킨 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 소거 효과는, 하기와 같은 수학식 1을 이용하여 계산된 DPPH 라디칼 소거활성 값이 50 % 이상인 시료에 대해서 SC₅₀(50 % Scavenging activity)를 비교하였다.

DPPH 라디칼 소거활성 (%) = ((A control-B control) - (A sample-B sample)) / (A control -B control) × 100

A control : 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도

A sample : 시료를 첨가한 반응군의 흡광도

B control : DPPH를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도

B sample : DPPH를 첨가하지 않은 반응군의 흡광도

하기 표 1 에는 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물, 비타민 C(Roche사, Switzerland)의 DPPH를 이용한 자유라디칼의 소거 효과를 측정한 결과를 나타내었다.

시료	SC₅₀
두충추출물	0.98%
팔미토일올리고펩타이드	-
비타민C	32.1ppm

상기 표 1에 의하면, 팔미토일올리고펩타이드는 실험최고농도(50ppm)까지 항산화 효과를 나타내지 않았으나, 두충 추출물은 우수한 항산화 효과를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 세포독성 시험

화장품에 사용되는 원료로서 1차 안전성을 검증하고자, 본 발명의 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물에 대하여 HaCaT Cell(인체각질형성세포)를 배양하여 MTT 시험(참고문헌: Mossman T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth & survival: application to proliferation & cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, 65, 55-63)을 수행하여 세포독성을 시험하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

시료	^aIC₅₀(%, W/V)
소디움라우릴설페이트(SLS)	0.005
팔미토일올리고펩타이드	-
두충 추출물	5.0

^aIC₅₀: Inhibitory Concentration 50, 50%의 세포를 사멸시키는 농도

표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 이용되는 팔미토일올리고펩타이드는 실험최고농도(50ppm)까지 어떠한 세포독성도 나타내지 않았으며, 두충 추출물의 IC₅₀ 값은 약 5.0%로 소디움라우릴설페이트에 비하여 세포독성이 낮아 안전성이 우수함을 알 수 있다.

실험예 3: 피부 세포 증식 효과

팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물이 피부 세포 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 인체 정상 섬유아세포(한국세포주은행)를 96-웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰에 1 x 10⁴ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma사)에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다.　이어, 상기 시료가 농도별로 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 시료가 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다.　그런 다음, MTT 용액(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일) 2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드: 5 mg/㎖)을 각각 10 ㎕씩 첨가하고, 4시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고, 각 웰 당 100 ㎕의 DMSO 용액을 가하여 20분 동안 진탕시키고, 마이크로 플레이트 판독기 (microplate reader, Molecular Devices, 미합중국)를 이용하여 570 nm에서 상층액의 흡광도를 측정하였다.　측정값을 하기의 수학식 2에 대입하여 세포 증식 효과를 산출하고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

세포증식효과 (%) = [(실험군 흡광도 - 대조군의 흡광도)/대조군의 흡광도] x 100

팔미토일올리고펩타이드 (%)	흡광도 (570nm)	세포증식효과 (%)	두충 추출물 (%)	흡광도 (570nm)	세포증식효과 (%)
대조군	0.629		대조군	0.631	-
0.000001	0.631	0.32	0.01	0.765	21.2
0.00005	0.692	10.0	0.05	0.854	35.3
0.0001	0.765	21.6	0.10	0.981	55.5
0.0005	0.871	38.5	0.50	1.064	68.6
0.001	0.953	51.5	1.00	1.245	97.3

상기 표 3에서 알 수 있듯이, 대조군과 비교하여, 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물이 처리된 실험군의 경우 매우 높은 섬유아세포 증식 효과를 나타낸다.실험예 4: 콜라겐 합성 증진 효과

인체 정상 섬유아세포(한국세포주은행)를 48-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 2 x 10⁴ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.　이어, 상기 팔미토일올리고펩타이드의 최종농도가 0.000001, 0.000005 및 0.000010%, 두충 추출물이 최종 농도 0.01, 0.05 및 0.10%, 팔미토일올리고펩타이드 + 두충 추출물(1:10000) 0.01, 0.05및 0.010%로 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 시료가 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 48시간 동안 추가로 배양하였다.　배양 후, 각 웰의 상층액의 각각 동일한 양을 모아 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 키트 (Takara, 일본국)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다.　PICP 양은 ng/2x10⁴ 세포로 환산하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타나 있다.

두충 추출물 (%)	콜라겐 합성량 (ng/2 x 10⁴)	팔미토일올리고 펩타이드 (%)	콜라겐 합성량 (ng/2 x 10⁴	팔미토일올리고펩타이드 +두충 추출물(1:10000)	콜라겐 합성량 (ng/2 x 10⁴)
대조군	120	대조군	120	대조군	120
0.01	135	0.000001	144	0.01	161
0.05	171	0.000005	286	0.05	346
0.10	216	0.000010	388	0.10	442

상기 표 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물의 농도가 증가함에 따라 콜라겐의 합성이 증가함을 알 수 있고, 특히 팔미토일올리고펩타이드의 콜라겐 합성 능력이 뛰어남을 알 수 있었다. 나아가, 본 발명에 따른 상기 팔미토일올리고펩타이드와 두충추출물의 두 가지 시료를 같이 사용하였을 때 가장 많은 콜라겐을 합성하는 것을 확인하였다. 이에 본 발명의 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물이 탁월한 콜라겐 합성 증진 상승 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 5: 콜라게네이즈 생성 억제 효과

팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물의 콜라게네이즈 생성 저해능을 측정하였다. 시험은 2.5 %의 우태아 혈청이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 함유된 48공 평판배양기 (96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 2x10⁴ 세포/웰(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그리고 시료가을 농도별로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채위하였다. 채위한 세포배양액을 상업적으로 이용가능한 콜라게네이즈 측정기구 (미국 아머샴파마샤 사. Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 콜라게네이즈 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게네이즈 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판 (96-well plate)에 채위된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판 (96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타난다. 노란색을 띈 96-공 평판 (96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고 콜라게네이즈의 합성 정도를 계산하였다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군의 채위된 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다. 세포에서의 콜라게네이즈 발현의 저해를 측정한 결과 in vitro 에서 상기물질은 표 5와 같이 콜라게네이즈 발현을 저해함을 확인하였다. 발현 저해능은 비처리군의 합성능을 100으로 하여 대비한 것이다.

두충 추출물 (%)	콜라게네이즈 발현 정도 (%)	팔미토일올리고 펩타이드 (%)	콜라게네이즈 발현 정도 (%)	팔미토일올리고펩타이드 +두충 추출물(1:10000)	콜라게네이즈 발현 정도 (%)
대조군	100	대조군	100	대조군	100
0.01	85	0.000001	102	0.01	83
0.05	78	0.000005	95	0.05	75
0.10	72	0.000010	88	0.10	64

표 5로부터 세포에서의 콜라게네이즈 발현 저해를 측정한 결과 두충 추출물의 콜라게네이즈 발현 저해 효과가 대조군에 비하여 매우 우수함을 확인할 수 있는 반면 팔미토일올리고펩타이드의 콜라게네이즈 발현 저해는 미미한 것으로 확인 되었다. 하지만 두충 추출물과 팔미토일올리고펩타이드를 동시에 처리한 처리군에서는 놀랍게도 두충 추출물 단일 처리군보다 높은 콜라게네이지 억제 효과를 나타내고 있음을 알 수 있었다.

실험예 6: Hyaluronan 생성 증진 효과-보습효과

Hyaluronan(또는 "Hyaluronic acid")은 피부보습을 증진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있는 것으로 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물의 Hyaluronan 생성 증진 효과를 측정하였다. 시험은 2.5 %의 우태아 혈청이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 함유된 24 well plate에 인간의 섬유아세포를 high density로 배양하고 실험에 사용하기 전에 우태아 혈청이 함유되지 않은 배지로 2번 세척하여 세포가 자라는 동안 생성하는 Hyaluronan를 완전하게 제거하였다. 배양된 인간의 섬유아세포에 시료를 처리하고 24시간 배양 후 배양 상등액을 이용하여 Hyaluronan 발현량을 측정하였다. Hyaluronan의 분석은 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (Echelon bioscience, Salt Lake, UT, USA)을 이용하여 측정하였다.

두충 추출물 (%)	Hyaluronan (ng/ml)	팔미토일올리고 펩타이드 (%)	Hyaluronan (ng/ml)	팔미토일올리고펩타이드 +두충 추출물(1:10000)	Hyaluronan (ng/ml)
대조군	826	대조군	826	대조군	826
0.01	854	0.000001	981	0.01	1090
0.05	948	0.000005	1036	0.05	1192
0.10	1064	0.000010	1214	0.10	1432

표 6으로 세포에서 Hyaluronan의 생산량을 측정한 결과, 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물 모두에서 Hyaluronan의 생산량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 팔미토일올리고펩타이드에서 증가량이 많았으며 두 가지 시료를 함께 처리했을 때 그 효과가 더 뛰어남을 확인하여 본 발명에 함유되는 두충추출물과 팔미토일오리고펩타이드는 피부보습효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

제조예 2: 실시예 및 비교예

본 발명의 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유하는 화장료의 피부 주름 및 탄력 개선 효과에 대한 임상 시험을 실시하기 위해 실시예 및 비교예를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
성분	실시예	비교예1	비교예 2	비교예 3
팔미토일올리고펩타이드	0.0001	0.0001	-	-
두충추출물	2.0	-	2.0	-
바셀린	7.0	7.0	7.0	7.0
유동파라핀	5.0	5.0	5.0	5.0
밀납	2.0	2.0	2.0	2.0
폴리솔베이트-60	2.0	2.0	2.0	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5	2.5	2.5	2.5
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0
프로필렌글리콜	6.0	6.0	6.0	6.0
글리세린	4.0	4.0	4.0	4.0
트리에탄올아민	0.5	0.5	0.5	0.5
카르복시비닐폴리머	0.5	0.5	0.5	0.5
토코페롤아세테이트	0.1	0.1	0.1	0.1
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100
향, 방부제	미량	미량	미량	미량

실험예 8: 피부주름 개선 효과

본 발명의 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부주름 개선 효과를 건강한 35세에서 50세의 여성 40명을 대상으로 측정하였다. 먼저 네 그룹으로 나누고, A 그룹에는 실시예를, B 그룹에는 비교예 1를, C 그룹에는 비교예 2, D 그룹에는 비교예 3의 제형을 안면부에 하루 2회씩 (아침 및 저녁) 3개월간 도포하였다. 3개월 후 주름의 개선 정도를 피험자의 설문 및 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

피험자의 설문은 사용전과 비교하여 개선 없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4단계로 판단하였으며 결과는 표8에 나타내었다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전에 대한 주름 밀도에 대한 감소율로 표 9에 나타내었다.

시료	개선없음	약간의 개선	중등도의 개선	상당한 개선
실시예	1	3	2	4
비교예 1	3	4	2	1
비교예 2	2	5	2	1
비교예 3	7	3	-	-

시료	주름 밀도 감소율 (%)
실시예	51
비교예 1	34
비교예 2	31
비교예 3	11

표 8, 9의 결과에서와 같이, 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유한 실시예의 피부주름 개선 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

실험예 8: 피부탄력효과

본 발명의 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 탄력 증진효과를 측정하였다. 온도 24-26℃, 습도 75의 조건에서 20세 이상의 건강한 여성 40명(평균연령 37세)을 네 그룹으로 나누고, A 그룹에는 실시예를, B 그룹에는 비교예 1를, C 그룹에는 비교예 2, D 그룹에는 비교예 3의 제형을 눈가를 중심으로 하루 2회씩 (아침 및 저녁) 12주간 도포한 후, 피부탄력 측정기(Cutometer MPA580, Conrage + Khazaka사, 독일연방국)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다.　시험결과는 cutometer MPA580의 R2(R2(12주)-R2(0주)) 값으로 기재하였는데, R2 값은 피부탄력도 (Gross elasticity)의 성질을 나타내며, 결과는 하기 표 10에 기재되어 있다.

실험 제형	피부탄력효과
실시예	0.081
비교예 1	0.061
비교예 2	0.054
비교예 3	0.031

표 8의 결과에서와 같이, 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유한 실시예의 피부탄력 효과는 비교예에 비해 증가함을 확인할 수 있었다.

실험예 9: 제형의 안정성 시험

상기 본 발명의 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유한 화장료에 대한 안정성 시험을 하기의 방법으로 실시하였다.

화장료의 안정성을 시험하기 위해 상기 실시예 및 비교예 1, 2를 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관하고 또한 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후, 변색 및 변취, 분리정도를 비교 측정하였다.　그 결과는 하기 표 11에 정리되어 있다.　이 때 제품 변색 및 변취, 분리정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다: 0 : 변화없음; 1 : 극히 조금 분리(변색); 2 : 조금 분리(변색);　 3 : 조금 심하게 분리(변색); 4 :심하게 분리(변색); 및 5 : 극히 심하게 분리(변색).

구 분	제형의 안정성
	실시예		비교예 1		비교예 2		비교예 3
	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃
변색	0	0	0	0	0	0	0	0
변취	0	0	0	0	0	0	0	0
분리	0	0	0	0	0	0	0	0

표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예와 비교예는 45℃에서 변색이나 변취, 분리 현상이 거의 없이 안정하였고 이는 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물이 제형내에서 안정한 상태로 존재함을 나타낸다.

이하 상기한 실험예의 결과를 근거로 하여 본 발명의 팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 함유하는 화장료를 조성하여 제시한다.　그러나, 본 발명의 조성물을 하기의 제형예들로 한정하고자 하는 것은 아니다.

제형예 1: 유연화장수(스킨로션)

하기 표에 나타난 바와 같이 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
팔미토일올리고펩타이드	0.00001
두충 추출물	0.5
1.3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
올레일알코올	0.1
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	15.0
벤조페논-9	0.05
향,방부제	미량
정제수	to 100

제형예 2. 영양화장수(밀크로션)

하기 표에 나타난 바와 같이 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
팔미토일올리고펩타이드	0.0001
두충 추출물	1.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	1.2
토코페닐아세테이트	3.0
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다이아너트오일	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.0
카르복시비닐 폴리머	1.0
비에치티이	0.01
EDTA-2Na	0.01
향,방부제	미량
정제수	to 100

제형예 3. 영양크림

하기 표에 나타난 바와 같이 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
팔미토일올리고펩타이드	0.0001
두충 추출물	2.0
세토스테아릴알콜	2.0
글리세릴스테아레이트	1.5
트리옥타노인	5.0
폴리솔베이트 60	1.2
솔비탄스테아레이트	0.5
스쿠알란	5.0
유동 파라핀	3.0
싸이클로메치콘	3.0
비에이치티이	0.05
델타-토코페롤	0.2
농글리세린	4.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
산타검	0.1
EDTA-2Na	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 4. 마사지크림

하기 표에 나타난 바와 같이 마사지크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
팔미토일올리고펩타이드	0.0001
두충 추출물	0.5
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
밀납	2.0
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	3.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5
세테아릴알코올	2.0
유동파라핀	30.0
카르복시비닐폴리머	0.5
향, 방부제	미량
정제수	to 100

제형예 5. 팩

하기 표에 나타난 바와 같이 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

배합 성분	함량 (중량%)
팔미토일올리고펩타이드	0.00005
두충 추출물	1.0
프로필렌글리콜	2.0
글리세린	4.0
카르복시비닐 폴리머	0.3
에탄올	7.0
피이지-40 히드로게네이티드 캐스터 오일	0.8
트리에탄올아민	0.3
비에치티이	0.01
EDTA-2Na	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

Claims

팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 팔미토일올리고펩타이드는 화장료 조성물 총 중량에 대해서 10^-6~10^-2중량%로, 두충 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001~20.0 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
팔미토일올리고펩타이드와 두충 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부보습개선용 화장료 조성물.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 또는 분무제의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.