KR100512691B1 - 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초임계 추출법에 의한 단삼 추출물을 포함하는 나노리포좀을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 20 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는, 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 초임계 추출법에 의해 유효 성분의 함량이 극대화된 단삼 추출물을 나노리포좀에 함유시킴으로써, 보습, 탄력 등의 노화방지 및 미백효과가 뛰어나면서도, 안정성, 피부 투과율 및 사용감이 우수한 화장료 조성물을 얻을 수 있다.

Description

단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING SALVIA MILTORRHIZA BUNGE EXTRACT STABILIZED WITH NANOLIPOSOME}

본 발명은 단삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 특히 초임계 추출법으로 얻어진 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체의 일부분으로 나이를 먹음에 따라 노화현상이 일어난다. 생물학적 연구에 바탕을 둔, 현재 주목 받고 있는 노화에 대한 이론은, 자유라디칼(활성 산소 등) 이론, 즉 과산화지질에 의한 세포장애설이다. 이미 밝혀진 연구결과나 진행중인 연구결과에 따르면, 성장기가 멈춘시기의 피부를 왕성한 상태의 피부구조 재구축에 의하여 재생하는 것은 거의 불가능에 가깝지만, 이미생성된 주름에 대해서는 보다 적극적인 개선이 가능한 것으로 밝혀지고 있다.

한편, 화장품에 있어서 미백작용은 피부에 멜라닌색소가 침착하는 것을 방지하여 기미, 주근깨의 생성을 억제하는 것을 목적으로 한다. 이 멜라닌 색소는 티로신 또는 도파(Dopa)로부터 티로시나제에 의해 도파크롬(Dopachrome)이 되고, 자동산화반응을 거쳐 멜라닌 고분자로 변화되어 생성된다.

마우스 섬유아세포 배양계를 이용해 자외선조사후 생성된 활성산소를 검출동정한 결과, 마우스 진피섬유아세포에서 하이드록실 라디칼이 확인되었고(Masaki H. et.al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,206,474(1995)), 과산화수소가 티로시나제의 수준을 상승시키며(Karg E.et.al.,J.Invest.Dermatol.,100,209S(1993)),멜라닌생성단계인 티로시나제의 도파로의 히드록실화 및 도파 퀴논으로의 산화 과정에 있어서 과산화물 음이온 라디칼이 촉진적인 작용을 하고 있고(Valverde P.et al., Exp. Dermatol.,5,247(1996)), 자외선에 의해 유도된 색소침착에 있어서도 산화 질소가 중요한 작용을 하고 있다는 것이 보고되고 있다(Rmero-Graillet C.et al.,F.Clin. Invest.,9.635(1997).

플라보노이드는 대형 식물에서 나타나는 방향족 물질의 다양한 변종물로서, 현재 대략 5000개의 플라보노이드가 문헌에 기술되어 있다. 플라보노이드는 산화방지제로서 활성 산소종들을 제거하는 능력이 있다. 플라보노이드류 중 하나인 소포레틴(sophoretin)과 루틴(rutin)은 비타민 C보다 적어도 20배, 비타민 E보다 50배 정도로 높은 활성을 갖는다는 사실이 증명되었고, 소포레틴은 생체외 실험에서 지질과산화를 억제한다는 것도 밝혀졌다(SOFW-Journal,127.Jahrgang1/2-2001).

또한, 폴리히드록시페놀류(Polyhydroxyphenols) 중 하나인 카테큐익산(catechuic acid)도 프리라디칼 소거제로 작용하며(Chung et al.,J.Agric.Food.Chum.46:4484-4486,1999), 플라보노이드와 같은 활성 물질로서 단정되었다(SOFW-Journal,127.Jahrgang1/2-2001).

식물성 식품에 함유되어 있는 항산화물질 및 유효성분으로 알려진 상기 플라보노이드류 및 페놀성 화합물(Aruoma,Free Radic.Res.30:419-427,1999)은, 식품의 산화방지제 또는 항산화식품으로 활용되고 있다. 그러나, 이들의 화장품 관련 연구 및 활용은 이제 막 시작단계에 불과하며, 플라보노이드류 및 페놀성화합물들을 화장품에 직접 이용하는 경우, 수용성 성질이 낮아 상온에서 침전되거나 결정물질이 생겨 생체이용률이 현저히 줄어들고, 화장품의 사용감 또한 현저히 나쁘다는 문제점이 발생한다.

단삼은 다년생초본으로 식물 전체에 복모가 있으며, 뿌리에 페난트라키논계 색소인 탄쉬논 화합물이 있어 붉은 밤색을 띠므로 단삼이라고 한다. 단삼의 효능에 대해서는, 본초강목에 丹蔘味苦生新能 破積調經除帶崩(단삼은 미고하다. 생신에 능하며 적체를 파하고 경도를 순조롭게하며, 붕루 대하를 없앤다)라고 기재되어 있으며, 심락과 포락이 혈분으로 들어가며, 함수(鹹水)를 외하고, 여로를 반하고, 오래 복용하면 안적이 많아지며, 단삼 한가지의 효력이 사물탕의 약효와 맞먹는다고 기재되어 있다.

초임계 유체 추출 기술은, 특정 물질이 일정한 고압 및 고온(임계점)을 넘어서면 유체 상태가 되는데, 이 상태의 특정 물질을 용매로 사용하여 독성이나 잔류 물질 없이 인간에게 이로운 유효 성분만을 고순도로 분리, 정제해 내는 기술이다. 이러한 용매로서의 초임계 유체는, 임계온도(critical temperature, Tc)와 임계압력(critical pressure, Pc) 부근 또는 그 이상의 상태로 사용되며, 일반적으로 사용되는 초임계 유체로는 임계온도가 낮아 열에 불안정한 물질의 분리 정제에 용이한 이산화탄소를 들 수 있다. 이와 같은 초임계 유체 용매인 이산화탄소를 사용하면, 일반적인 용매 대신 인체에 무해한 이산화탄소를 이용하므로 피부에 무독성이고, 제품으로부터 쉽게 제거가능하므로 유기용매 추출시에 문제가 되는 환경오염을 방지할 수 있으며, 가격이 저렴하고, 추출과정을 최대한 단순화함으로써 생화학적 안정성(산소차단, 미생물 오염방지)을 얻을 수 있다.

본 발명자들은, 세포독소물질로 작용하는 활성산소종에 대한 강력한 소거활성 및 생성억제, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 새로운 식물 추출물 및 이의 유효성분을 찾고자 연구한 결과, 초임계 추출법으로 얻은 단삼 추출물에 활성산소종 소거 및 생성억제효과가 뛰어난 플라보노이드성분 및 폴리히드록시페놀 성분과, 프로토카테큐알데하이드가 다량 함유되었음을 밝혀내고, 동시에 이들 물질들이 안고 있는 생체 이용률 저하 및 화장품 응용시의 사용성에 대한 문제점을 해결하여, 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명은, 노화방지 및 미백 관련 유효성분을 최대한 추출하여 미백 및 주름개선을 통한 노화방지 효과가 뛰어나고, 나노리포좀 안정화를 통하여 생체이용률 및 사용감이 우수한, 단삼 초임계 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물을 얻는 것을 목적으로 한다.

따라서, 본 발명에 따르면, 초임계 추출법에 의한 단삼 추출물을 포함하는 나노리포좀을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 20 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는, 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본발명에 따른 단삼은 전초를 사용할 수 있다.

단삼 추출물을 제조하기 위해서는, 먼저 단삼을 건조시킨 후 분쇄하여 단삼 분말을 제조한다.

추출 용매로는, 1,3-부틸렌 글리콜과 에탄올을 같은 질량비로 혼합한 후 교반하여 단일상이 되도록 하고 이를 공용매로 사용하거나, 에탄올을 단독으로 사용할 수 있으나, 1,3-부틸렌 글리콜 및 에탄올 공용매를 사용하는 것이 더 바람직하다.

본 발명에 사용되는 초임계 유체 추출은 이산화탄소를 이용한 통상적인 방법으로 실시할 수 있으며, 구체적으로 다음과 같이 실시하는 것이 바람직하다.

분쇄된 단삼과 공용매를 혼합하여 교반한다. 혼합 비율은 단삼과 공용매를 1:2의 질량비로 혼합하는 것이 수율 면에서 가장 우수하다. 이어서, 이 혼합물을 초임계 추출조에 투입하고, 고압용 기체펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 공급한 후 압력을 높인다. 이어서, 추출조 내부의 온도를 40℃ 까지 승온시키고 이를 유지시킨다. 그리고나서, 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급하면서, 출구 쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물을 방출시킨다. 압력조절기의 온도를 조절하여, 방출물의 압력 및 온도강하로 인해 이산화탄소가 고체 드라이아이스로 전이되어 최종 출구쪽의 튜브가 막히는 현상을 방지한다. 방출된 추출물은 상압으로 감압되어 이산화탄소와 단삼 추출물이 분리되며, 이산화탄소는 대기로 방출되고 단삼 추출물은 회수된다.

이와 같이 얻어진 단삼 추출물을 안정화시켜 피부 침투가 용이하도록 하기 위하여 나노리포좀에 함유시킨다.

본 발명에서의 나노리포좀은, 인지질, 글루타치온, 폴리솔베이트20, 에탄올로 구성되는 리포좀을 고압유화장치에 7회 통과시켜 약 75nm 정도로 크기를 작게 한 것을 사용한다.

이 때, 상기 단삼 추출물은 추출물 함유 나노리포좀의 총 중량에 대하여 10~40 중량%로 첨가한다. 10 중량% 미만으로 첨가하면 효과를 기대하기 힘들고, 40 중량%를 초과하면 함량이 증가해도 뚜렷한 효능 효과의 상승이 보이지 않는다.

얻어진 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀은, 영양 화장수, 영양크림, 에센스 등의 보습 화장료에 첨가할 수 있으며, 특히 액상 또는 투명 화장료에 첨가할 수 있다.

단삼 추출물을 안정화 시킨 나노리포좀은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 20 중량%로 첨가하는 것이 바람직하고, 1 ~ 10 중량%가 더욱 바람직하다. 0.1 중량% 미만 및 20 중량% 초과이면 유효한 효과를 기대하기 힘들다.

이하 실시예 및 비교예, 제조예, 시험예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

(실시예 1)

단삼 추출물의 제조

단삼을 중량의 변화가 없을 때까지 건조시키고, 분쇄기를 이용하여 직경 0.3cm 이하의 크기로 분쇄하였다. 또한, 1,3-부틸렌글리콜과 에탄올을 같은 질량비율로 혼합한 후 교반시켜 단일상의 공용매를 제조하였다.

분쇄된 단삼과 공용매를 1:2의 질량비로 혼합하여 30분간 교반시킨 후, 혼합물을 내부 용적 1.5L의 초임계 추출조에 투입하고 추출조를 밀봉하였다. 고압용 기체펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 공급하고 압력을 높인 뒤, 추출조의 압력이 300기압에 달하면 이산화탄소의 공급을 중단하였다.

PID 온도제어기를 이용하여 추출조 외부를 감싸고 있는 열선을 이용하여 추출조 내부의 온도를 0.5 /min 속도로 40℃ 까지 승온하여 50분간 유지시켰다.

고압용 기체 펌프를 재가동하여 12L/min의 유량으로 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급하였다. 동시에 출구쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물 을 방출시키되, 압력조절기의 온도를 60℃로 유지시켰다. 방출된 추출물은 상압으로 감압되어 이산화탄소와 단삼추출물이 분리되었고 이산화탄소는 대기로 방출되었다. 분리된 단삼 추출물을 유리 포집기를 이용하여 회수하였다.

(비교예 1)

단삼을 분쇄기를 이용하여 직경 0.3㎝이하의 크기로 분쇄한 후, CH₂Cl₂를 SiO₂ 컬럼 크로마토 그래피를 이용하여 각 분획물을 얻고, 이어서 각 분획물을 2,4-디하이드록시벤질하이드라진으로 테스트 하여, 남은 물층에 n-BuOH 를 넣어 분획하여 단삼 추출물을 얻었다.

(비교예 2)

단삼을 분쇄기를 이용하여 직경 0.3㎝이하의 크기로 분쇄한 후, 80 부피% 에탄올(단삼과 용매의 비율 기재)로 30분간 추출하여, 단삼 추출물을 얻었다.

(비교예 3)

단삼을 분쇄기를 이용하여 직경 0.3㎝이하의 크기로 분쇄한 후, 정제수에서 30분간 증탕하여 추출하여, 단삼 추출물을 얻었다.

(시험예 1)

실시예 1, 비교예 1 내지 3의 단삼 추출물에 대하여 HPLC법으로 유효성분을 분석하고, 단삼 추출물 100 중량%에 대한 함량으로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

추출법 차이에 의한 유효성분 비교

유효 성분	실시예 1	비교예 1	비교예 2	비교예 3
카테큐익산	32.9%	-	4.5%	1.8%
소포레틴	32.8%	-	2.9%	0.9%
프로토카테큐알데하이드(Protocatecualdehyde)	30.3%	0.0003%	-	-

상기 표 1에 따르면, 본 발명에 따른 이산화탄소 초임계 추출법을 사용하는 경우에 단삼의 유효성분이 다량 추출된다는 것을 알 수 있다.

(시험예 2)

섬유아세포 증식능 비교실험

실시예 1의 단삼추출물을 사용하여, 사람 피부 유래 섬유아세포를 이용한 세포 증식을 실험하였다. 섬유아세포는 -70℃ 또는 액체질소에 보관된 세포를 증식시켜 사용하였다. T-75 플라스크에서 배양한 섬유아세포를 PBS로 2-3회 세척하고, 트립신을 이용하여 부착된 세포를 떨어뜨린 후, 1500rpm에서 5분간 원심분리(Heraeus, Labofuge 400R)하여 세포를 모았다. 원심분리 후 상등액은 버리고, 침전세포에 10㎖의 DMEM(10% FBS)을 첨가하여 고르게 섞었다. 혈구 계수기를 이용하여 세포수를 측정하여 10⁴ea/웰 정도의 세포를 96 웰의 각 웰에 200㎕씩 분주하였다. 37℃, 5% CO₂에서 배양하면서 웰 면적의 약 50 %정도의 세포가 자라면 새로운 DMEM(FBS10%)으로 배지를 교환해 주면서, 실시예 1의 단삼 추출물을 농도별(0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%)로 첨가하여, 48시간동안 세포를 배양하였다.

MTT{(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(Sigma)}를 PBS에 2㎎/㎖가 되도록 용해시켜 냉장고에 보관해서 사용하였으며, 각 웰에 MTT시약(5㎎/㎖ in PBS)을 20㎕씩 처리하고, 2시간 더 배양한 후 상등액을 버리고 150㎕의 DMSO를 넣고 잘 섞어주거나 또는 0.04N-HCl 100㎕를 넣고 섞어주었다. 모든 단계가 끝난 후 ELISA 판독기(μQuant, Bio-Tek instrument INC.)를 이용해 560nm에서 흡광도를 측정하였다(Reference : 650nm).

세포증식능을 다음 식에 따라 계산하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서, 실시예 1의 단삼추출물은, 무처리구는 40% 정도인 데 반해 처리구 0.01%에서 48시간 후에 120%정도의 세포 증식효과를 보였다.

(시험예 3)

콜라겐 생합성 효과

T-75 플라스크에 배양되어진 섬유아세포를 PBS로 2∼3회 세척하고, 트립신을 이용하여 부착된 세포를 떨어뜨린 후, 1500rpm에서 5분간 원심분리(Heraeus; Labofuge 400R)하여 세포를 모았다. 원심분리 후 상등액은 버리고, 모아진 세포에 10㎖의 DMEM(10% FBS)을 첨가하여 고르게 섞었다. 혈구계수기를 이용하여 세포수를 측정하여 10⁴ea/웰 정도의 세포를 96웰의 각 웰에 200㎕씩 분주하였다. 37℃, 5% CO₂에서 배양하면서 웰 면적의 약 50%정도의 세포가 자라면 새로운 DMEM(FBS10%)으로 교환해 주면서, 실시예 1의 단삼추출물을 농도별(0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%)로 첨가하여, 48시간동안 세포를 배양하였다.

콜라겐 합성능 측정키트 (Procollagen Type-I C-peptide EIA kit (Takara, MK 101))를 사용하였다. 면역학적 방법을 이용한 측정법을 위하여 100㎕의 Ab-POD 컨쥬게이트 용액을 하나의 웰에 옮겨 분주하고 , 20㎕의 세포배양액 또는 표준용액을 첨가하였다. 호일 등으로 96 웰 플레이트를 싸서 37℃에서 3시간 정도 배양하였다. 3시간 경과 후 각 웰에 들어있는 용액을 모두 제거하고 PBS로 4번정도 세척하였다. 세척 단계 후에 100㎕의 기질용액을 각 웰에 첨가하여 20∼30℃에서 15분간 배양하였다. 최종 단계로 반응종료 용액인 1N H₂SO₄를 100㎕ 첨가하여 부드럽게 혼합하였다. ELISA 판독기로 흡광도를 측정하여 그 결과를 사용하였다. 반응종료용액이 첨가되된 플레이트를 약 1시간 정도 실온에서 보관한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

합성(%)를 다음 식에 따라 계산하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서, 세포증식능의 결과와 마찬가지로 그 증강효과가 크게 나타남을 알 수 있다.

(시험예 4)

멜라닌 생성 저해 효과

실시예 1의 단삼 추출물을 이용하여 멜라닌 생성량 억제 효과를 실험하였다.

인체 조직으로부터 분리한 멜라닌 세포를 1차 배양하여 2계대 후, 60㎜ 배양 접시에서 RPMI 1640 배지를 사용하여 2×10⁴/dish의 농도로 배양하였다. 세포가 접시에 부착한 것을 확인한 후, 단삼 추출물을 0.001, 0.01, 0.1, 1%까지 농도별로 처리하였다. 처리한 3일 후, 트립신-EDTA로 세포를 떼어내어 2×10⁵세포를 일정하게 분배하였다. 여기에 100㎕의 1N NaOH 용액을 넣고 37℃에서 12시간 처리하여 세포를 완전히 용해시켰다. 세포가 완전히 용해된 시료 500㎕에 대하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 추출물 무처리구를 대조구로 하여 흡광도를 측정하였다.

표준 지표로, 합성 멜라닌(M8601, 시그마사제) 10㎎을 1N NaOH 10㎖에 녹여 모용액(1㎎/㎖)을 제조한 후, 700㎍/㎖, 300㎍/㎖, 100㎍/㎖, 70㎍/㎖, 30㎍/㎖, 10㎍/㎖, 7㎍/㎖, 3㎍/㎖, 1㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 0㎍/㎖의 희석액을 제조하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 식에 따라 멜라닌 감소량을 계산하였다

그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

멜라닌 감소량

단삼 추출물(%)	멜라닌 감소량(%)
1	26.35
0.1	34.26
0.01	48.26
0.001	21.10

표 2에 따르면, 단삼 추출물은 멜라닌을 생합성하는 작용을 억제함으로써 미백의 효능도 나타냄을 알 수 있다.

(시험예 5)

활성산소 소거 능력 측정

상기 실시예 1에서 얻은 초임계 단삼 추출물과 비교예 1 내지 3의 단삼 추출물에 대하여, 활성 산소 소거 능력을 갖는 물질인 카테큐익산 및 소포레틴의 함량을 측정하였다. 활성 산소 종은 각종 성인병과 노화 및 멜라닌 생성, 특히 피부노화 및 과색소침착의 원인이 되므로, 기능성 항주름 및 미백화장품에서는 이의 소거 능력은 필수적이다.

구체적으로, 실시예 1과 비교예 1 내지 3의 단삼 추출물, 카테큐익산 표준품(Sigma제) 및 소포레틴 표준품(Sigma제)을 각각 5.0mg씩 정밀하게 달아, 이동상 50ml에 녹인 다음, 다시 이동상을 넣어 100ml로 만들어 검액 및 표준액으로 하였다.

검액 및 표준액 20㎕로 액체 크로마토그라피(1100Series, AT사)를 이용해 카테큐익산, 소포레틴의 피크면적 비율{Q_T(검액 면적)/Qs(표준품 면적)×100}를 구하였다.

상기 시험을 위한 액체 크로마토그라피의 조작 조건은 하기와 같다.

이동상 : 인산 1.0g을 50% 메탄올 용액에 녹여 2L로 만든다.

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 280nm)

컬럼 : C₁₈

유량 : 1.0ml/분

시험결과는 하기 표 3에 나타내었다.

시료	시험횟수	카테큐익산 함량(%)	소포레틴함량(%)
실시예 1	1	94.2	87.6
	2	94.4	88.2
	3	94.6	87.9
	평균	94.4	87.9
비교예 1	1	0.0002	-
	2	0.0001	-
	3	0.0001	-
	평균	0.00013	-
비교예 2	1	3.2	2.1
	2	3.1	2.3
	3	3.4	2.1
	평균	3.23	2.2
비교예 3	1	1.65	0.40
	2	1.52	0.45
	3	1.57	0.39
	평균	1.58	0.41

상기 표 1에 따르면, 본 발명에 따른 이산화탄소 초임계 추출법으로 얻은 단삼 추출물이, 활성 산소 소거 능력을 갖는 물질인 카테큐익산 및 소포레틴을 다량 함유하여, 활성 산소 소거 능력이 우수한 것을 알 수 있다.

(시험예 6)

피부 보습 효과

나노리포좀화 이전의 단순 원료를 대상으로 피부 보습효과를 측정하기 위하여, 실시예 1의 단삼 추출물과 비교 대상으로서 NMF(Natural Moisturizing Factor)의 구성성분인 Na-PCA(Sodium Pyrolidone Carboxylic acid), 콘드로이틴 황산나트륨(Na-Condroitin Sulfate), Na-하이알루로네이트 1% 수용액에 대하여 각각 피부장벽기능의 표준 측정법인 장벽손상 후 경표피 수분 손실(TEWL) 감소를 측정하였다.

구체적인 방법은 다음과 같다.

8∼12주령된 무모생쥐의 배부에 피부장벽이 손상되도록 아세톤을 점적하였다. 경피수분손실량(TEWL: transepidermal water loss)이 4.0g/m²/h 에 도달하면 시료를 5cm² 면적에 도포하였다. TEWL은 C-K(Courage+Khazaka, Cologne, Germany)사의 증발계(evaporimeter)인 Tewameter로 측정하였다. 도포 6시간 경과 후에 TEWL을 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 평가함으로써 피부장벽 기능이 회복되는 정도를 평가하였다.

효능평가에 사용된 회복율은 다음 식에 따라 계산하였다.

(단, Bt=6 : 피부장벽 손상 후 6시간 경과 후의 TEWL 측정값

Bt=0 : 피부장벽 손상 이전의 TEWL 측정값

Bt=d : 피부장벽 손상 직후의 TEWL 측정값)

결과를 표 4에 나타내었다(단위는 ㎎/㎡/hr).

	단삼추출물(1%)	Na-PCA수용액(1%)	Na-CS수용액(1%)	Na-하이알루로네이트수용액(1%)
1	12	18.5	17.4	18.4
2	16.5	19	18	19
3	16.1	20.1	19	19.2
4	18.5	21	19	19.6
5	14.3	20.5	20	19.7
6	13	18.5	21	20.2
7	14.9	18.9	18	20.3
8	15	18.3	19.3	21.4
9	16.5	18.8	19	19.7
10	14.6	20.3	18	18.9
11	13.8	17.4	18.2	18.6
12	13.5	17.5	17.9	19.3
13	16.8	19.8	19	20.1
14	15.2	18.8	17.6	21.1
15	16.4	18.5	20	19.8
16	15.3	21.5	18	18.6
17	16.8	19.3	18	19
18	17.0	19.1	19.5	19.2
19	16.2	20.7	19.8	20.1
20	16.8	19.5	20.2	20.1
평균측정수치	14.75	19.3	18.845	19.615

상기 TEWL 측정 결과, 본 발명에 사용되는 단삼 추출물은, 비교 검토 대상으로 사용된 Na-PCA(Sodium Pyrolidone Carboxylic acid)에 비해 23.58%, 콘드로이틴 황산나트륨(Na-Condroitin Sulfate)에 비해 21.73%, Na-하이알루로네이트에 비해 24.8%정도 좋은 효과를 나타내었다.

(실시예 2)

단삼 초임계 추출물을 안정화시킨 나노리포좀의 제조

표 5의 A상을 95℃까지 가온하여 균일하게 혼합, 용해시켰다. 이를 40℃까지 냉각하여 B상을 넣고 혼합하였다. 이를 압력 1200 바, 유속 500m/s의 조건하에서 고압유화장치(Microfludizer M210EH, Microfluidies, USA)에 7회 통과시켜, 단삼 초임계 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 얻었다. 1회 통과하여 얻은 리포좀의 크기는 약 133nm이지만, 7회째의 크기는 약 75nm로 나타났다.

	원료명	함량(중량%)
A	인지질	4
	글루타치온	0.1
	95% 변성에탄올	20
	글리세린	30
	폴리솔베이트 20	4
B	실시예 1의 단삼추출물	20
	정제수	잔량
계		100

(비교예 4)

단삼 추출물을 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 나노리포좀을 제조하였다.

(제조예 1)

단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료의 제조

하기 원료를 사용하여, 통상적인 화장료의 제조 방법에 따라 에멀젼을 제조하였다.

원료명	함량(단위: 중량%)
폴리솔베이트-60	1.5
소르비탄스테아레이탄	0.5
스테아린산	1
스쿠알란	5
세토스테아릴알콜	2
세틸 옥타노에이트	5
카보머	0.15
트리에탄올 아민	0.2
글리세린	5
실시예 2의 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀	0.1
향	적당량
방부제	적당량
정제수	잔량
총합	100

(비교제조예 1 내지 3)

실시예 2의 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 사용하는 대신, Na-PCA, 콘드로이틴 황산나트륨, Na-하이알루로네이트 5 중량%를 각각 사용하는 것을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법으로 에멀젼을 제조하고, 각각을 비교제조예 1 내지 3으로 하였다.

(비교제조예 4)

실시예 2의 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 사용하는 대신, 실시예 1의 단삼추출물 1 중량% 및 비교예 1의 나노리포좀 4 중량%를 사용하는 것을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법으로 에멀젼을 제조하였다.

(비교제조예 5)

실시예 2의 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 사용하는 대신, 실시예 1의 단삼 추출물 1 중량%를 사용하는 것을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법으로 에멀젼을 제조하였다.

(제조예 2 내지 5)

실시예 2의 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 각각 1, 5, 10, 20 중량% 첨가하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 에멀젼을 제조하고, 각각 제조예 2 내지 5로 하였다.

(비교제조예 6 및 7)

실시예 2의 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 각각 0.05, 25 중량% 첨가하는 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 에멀젼을 제조하고, 각각 비교제조예 6 및 7로 하였다.

(시험예 7)

피부 탄력효과

온도 22~24℃, 상대습도 55% 조건에서 20세 이상의 건강한 여성 60명(평균연령 29.5세)을 6 그룹으로 나누고, 제조예 3, 비교제조예 1 내지 5의 화장료 조성물을 각각 눈가를 중심으로 12주간 도포(2회/일)한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 시험 결과는 하기 표 5에 Cutometer SEM 575의 각 시험 그룹별 평균값인 △R5값[R5(12주)-R5(0주)] 값으로 기재하였는데, R5 값은 실탄성 계수를 나타내는 값으로 1에 가까워지면 보다 탄력도가 우수함을 나타낸다.

또한 개선도는 하기 식에 의해 계산하였다.

개선도(%) = ( △R5 / 도포전 ) X 100

피부탄력도 측정실험결과(12주)

	도포전	도포후	피부탄력증강효과(△R5)	개선도(%)
제조예 3	0.74	1.16	0.42	56.76
비교제조예 1	0.71	0.80	0.09	12.68
비교제조예 2	0.71	0.81	0.1	14.08
비교제조예 3	0.73	0.75	0.02	2.74
비교제조예 4	0.72	0.80	0.08	10.00
비교제조예 5	0.73	0.77	0.04	5.19

상기 표 7에 따르면, 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유한 제조예 3를 사용한 경우, 피부 탄력이 비교제조예 1에 비해 44.08%, 비교제조예 2에 비해 42.68%, 비교제조예 3에 비해 54.02%, 비교제조예 4에 비해 46.76%, 비교제조예 5에 비해 51.57% 증가했다. 따라서, 본 발명에 따른 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유한 화장료는, NMF(Natural Moisturizing Factor)의 구성성분을 사용하거나 나노리포좀으로 안정화되지 않는 단삼 추출물을 사용하는 경우보다, 피부탄력을 효과적으로 증진시킴을 알 수 있다.

(시험예 8)

피부 수분량 측정

22~24℃, 상대습도 55%, 공기의 흐름이 없는 실내에서 건강한 여성 70명(평균연령 29.5세)을 대상으로 각각 10명씩 7그룹으로 분리하였다. 제조예 1 내지 5 및 비교제조예 6 및 7의 화장료를 각 그룹마다 눈가를 중심으로 얼굴 전체에 하루 2회 6주간 도포하게 하였다. Skicon-200(IBS Co. Japan)을 이용하여, 도포 전, 후에 볼 부위의 수분량을 측정하여 보습효과의 지속성을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 8에 각 시험그룹별 평균값으로 나타내었다.

개선도는 다음 식에 따라 계산하였다.

	시험전	도포 6주 후	개선도 (%)
제조예 1	630 ± 10	650 ± 10	3.17
제조예 2	625 ± 10	685 ± 10	9.6
제조예 3	630 ± 10	890 ± 10	41.27
제조예 4	630 ± 10	675 ± 10	7.14
제조예 5	630 ± 10	650 ± 10	3.17
비교제조예 6	630 ± 10	635 ± 10	0.78
비교제조예 7	630 ± 10	630 ± 10	0

상기 표에 따르면, 화장료 중에 단삼추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 0.1 내지 20 중량% 함유시키는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.

(시험예 9)

안정성 실험

본 발명에 따른 단삼추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유한 화장료에 대한 제형의 안정성을 하기의 방법으로 측정하였다.

상기 제조예 3, 비교 제조예 4 및 5를 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12주동안 보관한 시료, 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 시료, -5℃에서 37℃를 순환하는 순환 챔버(1회/일)에 12주동안 보관한 시료에 대하여 분리, 변색 정도 및 침전 정도를 비교 측정하였다.

제품 분리 및 변색 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가한 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

제품 변색 평가 기준 :

0 : 변화 없음 1 : 극히 조금 분리(변색)

2 : 조금 분리(변색) 3 : 조금 심하게 분리(변색)

4 : 심하게 분리(변색) 5 : 극히 심하게 분리(변색)

시험물질의 분리 및 변색 정도

온도	제조예 3	비교제조예 4	비교제조예 5
45℃	0	3	3
4℃	0	2	2
순환	0	2	3

상기 표 9에 따르면, 단삼추출물이 나노리포좀을 통해 안정화된 제조예 3은 4℃, 45℃ 및 순환시험에서 변색이나 분리 증상이 없이 안정하였으나, 안정화시키지 않고 직접 제형에 사용한 비교 제조예 4 및 5의 경우에는 분리(변색)가 일어나 불안정함을 알 수 있었다.

또한, 제품 침전 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가한 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

제품 변색 평가 기준 :

0 : 변화 없음 1 : 극히 조금 침전

2 : 조금 침전 3 : 조금 심하게 침전

4 : 심하게 침전 5 : 극히 심하게 침전

시험물질의 침전 정도

온도	제조예 3	비교제조예 4	비교제조예 5
45℃	0	3	3
4℃	0	3	2
순환	0	3	2

상기 표 10에 따르면, 본 발명에 따른 단삼추출물을 나노리포좀으로 안정화시킨 화장료는 침전이 생기지 않아, 안정화되었음을 알 수 있었다.

이와 같이 단삼 추출물을 안정화 시키지 않고 첨가하면, 제형 내의 다른 약한 이온성 고분자들과 쉽게 반응하여 침전 및 변색이 일어난다. 그러나, 본 발명에서와 같이 단삼 추출물을 나노리포좀으로 안정화시켜 제형에 적용하는 경우에는 단삼 추출물이 과량 첨가되어도 침전 및 변색 반응이 최소화됨을 알 수 있다.

(시험예 10)

나노입자의 크기별 경피흡수 측정

화학결합에 의하여 형광물질을 부가시킨 PMMA 고분자를 이용하여 각각 50nm, 80nm, 120nm 및 500nm의 크기를 갖는 나노입자를 제조하고, 암컷 무모 기니아 피그의 피부에 도포하고 이어서, 일정시간이 경과한 후 피부 단면을 잘라 경피 흡수된 나노입자에서 방출되는 형광을 측정하였다.

형광 PMMA 고분자 나노입자는 폴리메틸메타아크릴레이트-co-메타아크릴산(메틸메타아크릴레이트와 메타크릴산의 몰비는 84:16)의 메타아크릴산의 카르복실기에 형광분자를 공유결합시켜 제조하였다.

그 제조법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

34g의 폴리메틸메타아크릴레이트-co-메타아크릴산을 150ml의 무수분 메틸렌클로라이드에 녹인 뒤, 132mg의 디시클로헥실카보디이미드와 74mg의 N-하이드록시숙신이미드를 첨가하여 카르복실기를 활성화시켰다. 1시간동안 교반한 뒤, 222mg의 플루오레신아민을 첨가하여 플루오레신아민의 1차 아민과 활성화된 카르복실기가 반응하여 아미드결합을 형성하게 함으로써, 고분자 사슬에 형광분자가 공유결합하게 하였다. 반응은 상온, 암실조건에서 5시간동안 진행시켰다. 반응 후 형성되는 부산물인 디사이클로헥실우레아를 0.45㎛ 나일론 필터를 통해 제거한 뒤, 디에틸에테르에 침전시켜 반응시약 및 미반응 잔류물들을 일차적으로 제거하였다. 이어서, 이를 과량의 3차 증류수에서 하루동안 방치하여 나머지 잔류물들을 제거한 뒤, 40도에서 진공오븐을 이용하여 건조하였다. 그 결과, 형광물질이 부가된 50nm, 80nm, 120nm, 500nm의 크기를 갖는 PMMA 나노입자를 제조하였다.

크기별 나노입자 경피흡수시험을 위하여 8주령 암컷 무모 기니아 피그(strain IAF/ HA-hrBR)를 이용하였다. 기니아 피그의 복부부위의 피부를 절취하여 프라즈-타입 디퓨젼 셀(Franz-type diffusion cells(Lab Fine Instruments, Korea))에 장착하여 실험하였다. 프라즈-타입 디퓨젼 셀의 수용 용기(5ml)에는 50 mM 인산염 완충액(pH 7.4, 0.1M NaCl)을 넣어주었다. 디퓨젼 셀은 32℃를 유지해주면서 600 rpm으로 혼합, 분산시켜주었으며, 각 크기별로 제조된 형광 PMMA나노입자가 10％(w/v) 분산된 용액 50㎕를 각각의 도너(donor) 용기에 넣어주었다. 미리 예정한 시간(평균 12시간)에 따라 흡수 확산시켜 주었으며, 흡수 확산이 일어나는 피부의 면적은 0.64 cm² 가 되게 하였다. 나노입자의 흡수 확산이 끝난 후에는, 건조된 Kimwipes 혹은 에탄올 10ml로 피부위에 남아있는 흡수되지 못한 나노입자를 씻어주고, 피부의 단면을 절개하여 피부단면에 흡수된 형광 PMMA나노입자의 분포를 측정하였다.

나노입자의 피부내 분포측정 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

나노입자의 평균 크기	경피흡수 도달부위
50nm	35㎛
80nm	17㎛
120nm	12㎛
500nm	7㎛

표 11에서, 나노입자의 경피흡수는 평균 입경에 크게 의존함을 확인할 수 있었다. 평균 직경 50nm정도의 크기를 가지는 나노입자는 표피를 통과하여, 진피층 상단까지 흡수, 확산되었으며, 입자의 크기가 500nm를 초과하는 경우에는 나노입자는 피부표면에 머물게 되며, 더 이상 피부내부로의 흡수가 일어나지 않았다. 평균 직경 50nm 내외의 나노입자는 피부의 세포간 지질 사이로 확산되어 들어가고, 고분자의 소수성은 이러한 경피흡수를 촉진해주는 효과가 있는 것으로 판단된다. 따라서, 경피흡수가 잘 안되거나 불안정한 유효 활성성분을 평균 입경 50nm 내외의 나노입자에 포집시켜 주는 경우, 나노입자를 통한 피부 내부로의 전달을 통해 활성성분의 경피흡수 전달이 가능함을 알 수 있었다.

본 발명에 따르면, 초임계 추출법에 의해 유효 성분의 함량이 극대화된 단삼 추출물을 나노리포좀에 함유시킴으로써, 보습, 탄력 등의 노화방지 및 미백효과가 뛰어나면서도, 안정성, 피부 투과율 및 사용감이 우수한 화장료 조성물을 얻을 수 있다.

도 1은 시험예 2에 따른 세포증식능을 나타낸 그래프,

도 2는 시험예 3에 따른 콜라겐 생합성을 나타낸 그래프.

Claims (3)

1. 초임계 추출법에 의한 단삼 추출물을 포함하는 나노리포좀을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 20 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는, 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 나노리포좀은 인지질, 글루타치온, 폴리솔베이트 20, 에탄올로 구성되는 리포좀을 고압유화장치에 7회 통과시켜 얻는 것을 특징으로 하는, 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 초임계 단삼 추출물은 나노리포좀에 대하여 10 ~ 40 중량%로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 단삼 추출물을 안정화시킨 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물.