KR20110024037A - 원숭이 ｃｄ4에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주 - Google Patents

원숭이 ｃｄ4에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주 Download PDF

Info

Publication number
KR20110024037A
KR20110024037A KR1020090081881A KR20090081881A KR20110024037A KR 20110024037 A KR20110024037 A KR 20110024037A KR 1020090081881 A KR1020090081881 A KR 1020090081881A KR 20090081881 A KR20090081881 A KR 20090081881A KR 20110024037 A KR20110024037 A KR 20110024037A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
monkey
cells
monoclonal antibody
antigen
Prior art date
Application number
KR1020090081881A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101176704B1 (ko
Inventor
박정규
김정식
김상준
전태훈
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020090081881A priority Critical patent/KR101176704B1/ko
Publication of KR20110024037A publication Critical patent/KR20110024037A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101176704B1 publication Critical patent/KR101176704B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70514—CD4

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 원숭이 CD4 항원에 특이적으로 결합하는 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD4 항체 (anti-monkey CD4 antibody), 이를 생산하는 융합 세포주 (hybridoma)에 관한 것이다. 본 발명은 원숭이 CD4 항원에 높은 친화력을 가지고 있는 상기 단일클론항체를 이용한 CD4+T 세포 검출방법, 상기 항체 또는 항체 변형물을 이용한 CD4+T 세포 매개 질병 치료제, 자가 면역질환의 치료제 및 이식 거부 반응 억제제에 관한 것이다.
단일클론 항 원숭이 CD4 항체 (monoclonal anti-monkey CD4 antibody), 유세포 분석, 면역조직염색

Description

원숭이 ＣＤ4에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주{monoclonal antibody to specific monkey CD4 and a hybridoma producing the same}
본 발명은 원숭이의 혈액으로부터 직접 분리한 CD4+T 세포을 이용하여 얻은 고친화성 단일클론 항 원숭이 CD4 항체 및 이를 생산하는 융합 세포주에 관한 것이다.
원숭이류 (Non-human primates)에는 유인원 (Apes)과 원숭이 (Monkey)로 대별된다. 원숭이 중 실험용 동물로서 이용되고 있는 것은 약 30종 정도이며, 세계적으로 널리 이용되고 있는 원숭이류는 Rhesus 원숭이, Cynomolgus 원숭이 등의 Macaca 원숭이와 Baboon 원숭이 및 Common marmoset 등이 있다. 그 중 수많은 연구 들이 Rhesus 원숭이를 중심으로 보고되고 있다. 현재 원숭이를 이용한 AIDS, 뇌질 환, 유전자치료 등의 질환연구, 이종간 장기이식 등의 인공장기개발 연구 등 영장류를 이용하는 연구의 붐이 일어나고 있는 상황이다 (생명공학 정책 연구센터, Biozine, 2004-06-17). 하지만 이를 성공시키기 위해서는 우선 원숭이 면역체계의 이해와 분석방법의 확립이 무엇보다도 중요하다. 이를 위해서는 각 면역세포의 변화 및 기능 분석을 위해 필수적인 원숭이 특이항체의 생산이 선행되어야 한다.
전신홍반루프스 (Systemic lupus erythematosus), 제 1형 당뇨병 (type I diabete), 중증 근육 무력증 (Myasthenia gravis), 다발 경화증 (Multiple sclerosis)과 같은 자가 면역질환에서 일부의 CD4+T 세포는 자신의 세포와 반응하여 질환을 야기하는 직접적인 질환야기 세포이거나 질환을 야기 할 수 있는 항체 생산을 촉진하는 보조자로서 역할을 한다(Immunobiology 6th edition, Janeway et al).
또한 CD4+T 세포의 일부는 조절 T 세포로서 상기의 질환야기 T 세포의 활동을 저해하여 평소 자가 면역질환을 예방하는 역할을 한다 (Von Herrath, M.G., and Harrison, L.C.: Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity. Nat.Rev.Immunol.2003, 3:223-232). 동종 및 이종간의 장기 이식시 이식된 장기의 거부반응 및 면역관용유도 또한 CD4+T 세포의 종류에 의해 결정된다(Zelenika, D. et al., The role of CD4+T -cell subsets in determining transplantation rejection or tolerance. Immuno.Rev.2001, 182; 164-176). 따라서 자가 면역 질환이나 장기 이식시 CD4+T 세포의 활성 검사나 조직학적인 검출법의 개발은 향후 자가 면역 질환의 치료나 이식된 장기의 거부반응 억제를 위한 연구/진단/치료제 개발을 위한 가장 기본적인 수단이 된다.
CD4+T 세포의 검출법으로는 일반적으로 유세포 분석(FACS analysis), 면역조직염색법 (Immunohistochemistry), 면역형광법 (Immunofluoresce) 등의 방법이 시행되고 있으며, 이들은 모두 CD4 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 개발을 요구하고 있다.
Rhesus 원숭이 CD4 항원을 인식하며 현재 상용화되고 있는 항체는 Leu-3A (SK3, BD bioscience), M-T477 (BD bioscience), OKT4 (eBioscience), 7E14 (AbD Serotec), 7e14 (Exalpha), M-T466 (Miltenyi), BC/1F6 (Abcam) 및 4B12 (Leica) 등이 있다. 하지만 상기의 항체는 모두 항사람 CD4 항체 (anti-human CD4 antibody)로서 Rhesus 원숭이 CD4 항원과 교차반응이 있는 성질을 이용하여 사용되고 있으므로 원숭이 CD4 항원에 대한 친화력이 떨어진다. 따라서 상기의 항체는 유세포 분석을 위한 시약으로는 이용되고 있으나 면역조직염색을 통한 분석에는 부적합하여, 원숭이 CD4항원에만 특이적으로 인식하는 항체의 개발이 절실하다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 원숭이 CD4 항원에 친화력이 높은 항 원숭이 CD4 항체를 개발하고자, Rhesus 원숭이의 PBMC로부터 CD4+T 세포를 직접분리하고, 이를 생쥐에 면역 (immunization)함으로서 원숭이 CD4항원을 인지하는 항체를 생산할 수 있는 융합 세포주를 선별해내고, 상기 항체가 CD4+T 세포을 검출하거나 장기 이식시 거부 반응 억제를 위한 치료제로 활용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 한 목적은 원숭이 CD4 항원에 특이적으로 결합하는 고 친화성 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 부위에 대한 CDRs의 염기서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 사용하여 CD4+ T 세포 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체 또는 이의 변형물을 사용하여 CD4+T 세포매개 질병 치료제를 제공하는 것이고 상기 단일클론항체 또는 이의 변형물을 사용하여 자가 면역질환의 치료제 및 이식거부 반응의 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명은 원숭이 CD4 항원에 특이적으로 결합하는 고 친화성 단일클론항체 에 관한 것이다. 보다 구체적으로 수탁번호 KCLRF-BP-00211의 융합세포주에 의해 분비되는 원숭이 CD4 항원을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 제공하는 것이다.
상기 단일클론 항체를 얻기 위해서 한 실시예로 Rheus 원숭이의 혈액으로부터 CD4+T 세포를 자기 비드 (magnetic beads) 통해 분리하고, 이를 생쥐 복강에 면역 주사한 후 분리한 비장세포를 쥐의 골수종 세포 (myeloma cell)와 융합하여 얻어진 융합 세포주에서 단일클론 항 원숭이 CD4항체를 분리 정제할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 단일클론항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 부위에 대한 CDRs의 염기서열을 제공하는 것이다. 항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위인 중사슬과 경사슬의 가변 부위, 특히 CDR (complementarity determining region) 이 복합체의 친화력을 결정하므로 상기 단일클론항체 유전자를 클로닝하여 항체 중사슬과 경사슬의 가변부위에 대한 유전자 염기서열을 분석할 수 있다. 염기서열을 분석하기 위해 융합 세포주로부터 RNA 을 추출하여 Mouse Ig-Primer set (Novagen, CA, USA)을 이용하여 RT-PCR을 수행할 수 있다.
상기의 "PCR" 은 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다. 상기의 "RT-PCR" 은 역전사 효소 중합 연쇄반응 (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 으로, 특정 부위의 RNA을 주형으로 하여 이에 상응하는 cDNA (complementary DNA) 을 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 역전사 효소를 이용하여 RNA로부터 cDNA 을 제조하는 과정과 cDNA 을 이용하여 특정부위를 증폭하는 과정으로 나누어진다. cDNA을 이용한 증폭과정은 상기의 PCR의 증폭과정과 동일하다. 상기 단일클론항체의 염기서열은 항체의 중사슬 (heavy chain) 및 경사슬 (light chain)의 가변부위가 각각 서열번호 1,2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 단일클론 항체는 항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체의 결합특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경사슬 및 2개의 전체 길이의 중사슬을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로는 상기의 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주에 관한 것이다. 한 실시예로, Rheus 원숭이의 혈액으로부터 CD4+T 세포를 순수 분리하고, 이를 생쥐 복강에 면역 주사한 후 분리한 비장세포를 쥐의 골수종 세포 (myeloma cell)와 융합하여 단일클론 항 원숭이 CD4항체를 생산하는 융합 세포주를 얻었다. 이를 한계희석 배양법 (limit dilution culture)을 통해 CD4+T 세포에 친화력이 높은 항체를 생산하는 융합 세포주를 최종 선별하였다. 본 발명의 실시예들을 통해 얻어진 융합 세포주에서 분비되는 단일클론 항체는 기존에 사용되었던 Leu-3A (SK3, BD bioscience), M-T477 (BD bioscience), OKT4 (eBioscience), 7E14( AbD Serotec), 7e14 (Exalpha), M-T466 (Miltenyi), BC/1F6( Abcam) 및 4B12 (Leica) 등의 항 사람 CD4 항체 (anti-human CD4 antibody)보다 원숭이 CD4항원에 대한 친화력이 높음을 확인할 수 있다. 상기의 특징을 가지는 단일클론항체를 분비하는 융합 세포주는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2009년 4월 27일자로 한국 세포주 은행 (KCLB, Korean Cell Line Bank)에 수탁번호 제 KCLRF-BP-00211호로서 기탁하였다.
본 발명의 또 다른 양태로는 상기의 융합 세포주에서 얻은 항 원숭이 CD4 단일클론항체의 원숭이 CD4+T 세포에 대한 높은 친화력을 이용하여 CD4+T 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.
상기의 항체는 기존의 항사람 항체보다 원숭이 CD4항원에 높은 친화력을 보이므로, 본 발명의 일 실시예에서 유세포 분석, 형광 면역, 면역조직 염색 등을 통해 CD4+T 세포의 분석에 탁월하고, 높은 효율로 CD4+T 세포를 분리해낼 수 있음을 확인하였다.
상기 유세포 분석법은 수많은 세포를 플루이드 컬럼 (fluid column) 안에서 single flow로 형성하여 레이저 빔 (laser beam)을 통과하면서 각 세포의 크기, 구조 및 과립도 등을 측정하므로 다양한 세포의 특징을 분석할 수 있는 방법이다. 극히 미량의 형광 물질도 인지할 수 있어 정확도와 민감도가 높고 다양한 혼합 세포군에서 소수의 아형군을 측정 혹은 분리할 수 있다. 상기 유세포 분석법은 단클론 항체를 이용한 백혈병 마커 검사 등 세포 표지자 검사, 세포의 DNA량 측정에 따른 성장 주기 분석, 망상 적혈구수 측정, 호중구 기능검사, 항-혈소판 항체 검사 및 망상 혈소판수 검사, 종양 단백 검출과 기타 연구목적의 검사 등에 사용되는 것을 포함한다. 기존의 항체보다 항원과의 친화력이 우수한 본 발명의 항체를 사용하면 CD4+T 세포를 보다 정확하고 효율적으로 분리해 낼 수가 있다.
상기의 형광 면역법은 항체와 항원이 선택적으로 결합하는 특성을 이용하여 특정한 생물분자의 정량과 분자량의 측정 및 그 분자가 세포나 조직 내에서 존재하는 위치 등을 알아내는 방법을 말한다. 이때 사용되는 항체에는 형광물질이 인위적으로 부착되어 있어서 특정 파장의 빛을 받으면 형광이 발생할 수 있다. 연구대상이 되고 있는 분자를 항원으로 하여 그 분자에만 선택적으로 결합하는 항체를 얻을 수 있다. 쉽게 탐색할 수 있게 하기 위해 얻어진 항체에 형광 물질을 결합시킨 후 항원으로 사용되었던 분자를 탐지하는 수단으로 이용할 수 있다. 찾고자 하는 분자가 세포 안에 존재할 경우, 세포의 절편을 이용하거나 세포막을 항체가 통과할 수 있도록 특수 처리하여 항체가 분자와 반응할 수 있도록 한다. 항체로 처리한 후 형광 현미경으로 항원분자에 결합된 항체의 형광을 관찰하게 된다. 생물을 구성하고 있는 여러 종류의 분자들을 확인하고 그 위치나 배열 모습을 연구하는 데 이용되고 있는 방법으로, 본 발명에 의한 항원과의 결합력이 우수한 항체를 사용할 경우 효율적인 항체 선택이 가능해진다.
상기의 면역 조직염색법의 감수성은 사용하는 일차 항체에 의해 많은 영향을 받는데, 일차 항체는 다클론 항체와 단일클론 항체로 나눌 수 있다. 일차 항체의 항원과의 결합력은 일차항체의 HV (hypervariable) 부위와 항원과의 이온 결합력 (ionic interaction), 수소 결합 (hydrogen bonging), 반데르 발스 힘 (van der Waals forces) 에 의해 결정되는데 이는 결합 상수 (association constant(Ka))를 사용하여 항체의 친화력 (antibody affinity)으로 표시할 수 있고 면역염색에는 친화력이 높은 항체가 유리한 바, 기존 항체보다 항원과의 친화력이 우수한 본 발명의 항체를 이용하면 면역 조직 염색법에서 CD4+T 세포를 보다 정밀하게 분리해낼 수 있다.
또한, 상기의 항체 또는 이의 변형물은 CD4+T 세포 매개 질병의 진단에 응용하는 모든 방법에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 원숭이 CD4항원의 분석, CD4+T 세포의 정량 및 정성 분석 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에서 생산된 항 원숭이 CD4 항체 또는 이의 변형물을 이용하여, CD4+T 세포 매개 질병에 대한 치료제를 제공한다. 상기 CD4+T 세포 매개 질병 치료제에는 자가 면역질환의 치료제 및 동종 및 이종간의 장기 이식시 이 식된 장기의 거부반응 억제제가 포함될 수 있다.
상기의 자가 면역 질환은 자가 면역 내성에 이상으로 인하여 자체 항원에 대하여 면역 반응이 나타나는 모든 현상을 포함한다. 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 담당하는 T 세포는 흉선에서 성숙하는 과정을 거침으로써 자신의 조직 적합성 항원 (HLA)에 결합된 외부 항원만을 인식하도록 교육받는데 간혹 자신의 조직 적합성 항원에 자신의 항원이 결합된 복합체를 인식하는 T세포가 얻어지는 경우를 포함한다. 보다 구체적으로, 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 전신성 경피증 (Progressive systemic sclerosis, Scleroderma), 전신홍반루프스(Systemic lupus erythematosus), 제 1형 당뇨병 (type I diabete), 중증 근육 무력증 (Myasthenia gravis), 다발 경화증 (Multiple sclerosis) 등을 포함한다.
상기의 변형물은 항 CD4항체를 이용하여 생체 내 CD4+T 세포의 제거(depletion) 및 무력화(inactivation)에 응용되는 모든 변형체의 제조에 해당되는 것을 포함한다. 보다 구체적으로 CD4 항체에 화학적 결합(conjugation)에 의한 변형체나, 상기 단일클론항체의 cDNA염기서열 정보를 이용하여 항체의 유전학적 변형 및 그로 인해 생산된 모든 변형물을 의미한다.
상기 화학적 결합에 의한 변형체의 생산을 위한 화학적 방법 및 화학적 첨가물의 한계는 없으나, 구체적으로는 단일사슬 박테리아 톡신 (Pseudomonas exotoxin, diphtheria toxin), 식물 홀로톡신 (plant holotoxins: class II ribosome 불활성화 단백질인 리신 (ricin), 아브린 (abrin), 미슬토 (mistletoe), 렉틴 (lectin), moceccin) 이나 헤미톡신 (hemitoxins: class I ribosome 불활성화 단백질인 gelonin, saporin, pokeweed antiviral 단백질) 과 같은 세포 독소의 부착을 통한 변형물을 포함한다. 즉, 항 원숭이 CD4 항체의 Fc부분에 독소 (toxin) 인 박테리아 유래 내독소 및 외독소를 화학적 방법 및 유전학적 방법을 이용하여 결합시킨 독소 융합 항체의 생산이 포함될 수 있다.
상기의 유전학적 방법에 의한 변형체 생산은 cDNA 정보 및 재조합 기술을 이용하여 만들어지는 모든 형태의 단일사슬, 이중사슬 재조합 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 항 원숭이 CD4항체는 원숭이 특이 CD4 항원을 높은 친화성을 가지고 인지할 수 있으며, 유세포 분석, 형광 면역, 면역 조직 염색시 CD4+T 세포의 검출에 응용될 수 있다. 또한, 본 발명의 고 친화성 단일클론항체는 CD4+T 세포 매개 질환의 치료제, 자가 면역 질환의 치료 및 이식거부 반응의 억제제로 사용할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 항 원숭이 CD4 항체를 분비하는 융합 세포주의 제작
원숭이 CD4항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위해, 융합세포주를 도면 1로 표시되는 과정으로 제작하였다.
1-1. 원숭이의 혈액으로부터 CD4 +T 세포의 분리
Rhesus Macaqu로부터 전혈을 채혈하여 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)을 분리하였다. PBMC은 Ficoll-gradient centrifugation으로 분리했다. PBMC 중에서 CD4+T 세포는 magnetic beads를 이용하여 각각 분리했다. 분리한 세포들은 유세포 분석을 통해 검증했다.
1-2. 항원면역( Immunization )
분리된 6X105 CD4+T 세포를 다음과 같은 조건으로 면역하였다.
항원면역
(Immunization)		 기간 면역경로 양 마리수 면역증강제
2 달-1 달-1 달-총 3번 복강 6X 105 세포/생쥐 5 마리/각 그룹 ODN
1-3. 융합( fusion )
융합 세포주를 생성하기 위해 면역이 유도된 생쥐에서 얻은 비장세포를 P3X63Ag8.653 mouse myeloma 세포와 융합하였다. 골수종 (myeloma) 세포는 10%의 FBS를 함유한 RPMI 배지에서 성장시켜, 세포융합 전 우태아혈청 (FBS :Fetal bovine serum) 이 들어가지 않은 RPMI 배지로 3회 세척하여 부유시키고 세포수를 확인하였다. 비장 세포는 비장을 적출한 뒤 잘게 절제 후 유리시키며 튜브에 옮겨 2분 정도 정치시키고 3회 세척한 후 세포를 계수했다. 골수종 세포 (myeloma)와 비장세포를 1:5 의 비율로 혼합하고 원심분리한 후 상등액을 완전히 제거하였다. 미리 37 ℃로 데운 50% PEG-1500 1ml을 1분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 튜브(tube)를 1분 동안 부드럽게 흔들어 주었다. 이 후 RPMI 배지를 1ml, 1ml, 3ml을 각각 1분 동안 떨어뜨리고, 14ml을 2분 동안 떨어뜨리면서 천천히 단계적으로 희석하였다. 이를 1200 rpm 으로 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 융합된 세포의 펠렛 (pellet)을 서서히 풀어준 뒤 1x HAT이 포함된 RPMI 배지 (20% FBS, 히포잔틴 (hypoxanthine), 아미노프테린 (aminopterin), 티미딘 (thymidine))에 부유시키고, 96 웰 배양판에 200ul 씩 분주한 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양했다. 융합 후 7일째에 배지를 HT 로 교환했다. 4~5일 이후 군락이 형성한 웰에서 상층액을 150~200ul 취하여 유세포 분석법으로 원숭이 PBMC에 특이하게 반응하는 융합 세포주를 선별하였다.
1-4. 항체생성 융합세포의 클로닝
마우스의 복강에서 분리한 복강 마크로 파지 (macrophage)를 이용한 공급자 세포 배양 또는 융합세포용 배지를 제조하여, 특히 항체를 생성하는 것으로 확인된 융합 세포주를 24 웰에 옮겨 배양했다. 세포 군락이 50~70% 정도로 자랐을 때 배양 상층액을 취하여 원숭이 PBMC에 활성도를 보이는지 확인하고 활성도가 높은 융합 세포주는 HT 배지에 희석하여 한계희석 배양법 (limit dilution culture)으로 2회 또는 3회의 단일세포 배양을 실시하였다.
1-5. CD4 항원 트랜스펙턴트 확립
CD4 항원들에 대해선 cDNA를 CHO 세포에서 유전자 전달감염(트랜스펙션, transfection) 함으로써 특정 CD 항원이 발현되는 유전자 전달 감염체 (트랜스펙턴트, transfectant)를 확립하였다.
실시예 2: 유세포 분석을 통한 항 원숭이 CD4 항체를 생산하는 단일 클론 융합 세포주 선별
원숭이 CD4 특이적인 항체를 생성하는 융합세포주를 선별하기 위해서 유세포 분석을 실시하였다. 상기의 CD4 항원 트랜스펙턴트를 이용하여 선별된 각각의 항체를 1차(primary) 항체로, FITC-conjugated anti-IgG (Sigma, MO, USA) 항체를 2차 항체로 유세포 분석을 실시하였다. 이중 CD4 항원에 가장 결합력이 높은, 즉 MFI (mean fluorescence intensity) 값이 가장 높게 나오는 항체를 생산하는 융합 세포 주를 결합력이 높은 항 원숭이 CD4 항체로 선별하였다. 이때 음성대조군으로는 CD4 항원을 발현하지 않는 CHO 세포를 사용하였다 (도 1).
실시예 3: 개발된 항 원숭이 CD4 항체의 연구/진단용 시약으로서 이용성 조사
선별된 항 원숭이 CD4 항체의 연구용 시약으로서 이용성을 조사하기 위해 비장 (spleen) 조직에 대한 면역조직염색법을 실시하였다. 비장 조직은 안락사시킨 원숭이로부터 비장을 적출하여 O.C.T compound (Sakura Finetet Inc., Torrance,CA.USA)에 넣고 2-메틸부탄 (2-methylbutan) 과 드라이아이스를 이용하여 동결법 (frozen)으로 만들었으며, 냉동자 (cryotome microsector (Leica CM 1850))를 이용하여 5mm 두께로 절편을 자른 후 아세톤 고정과정을 거쳐 -70℃에 보관 후 사용하였다. 이 중 일부를 꺼내어 양성 대조군으로 anti-human CD4 (clone: 16F, Novocastra)를, 음성 대조군으로 anti-human IgG를 사용하였고, 실험군으로는 본 발명에서 얻은 anti-monkey CD4 항체를 사용하였으며 DAB kit(Vector Laboratories,Inc, Burlingame, CA, USA)을 이용하여 갈색으로 염색하였다. 도 3의 A는 음성대조군(human Igg), B는 양성 대조군 (anti-human CD4 항체), C 는 실험군 (anti-monkey CD4 항체)의 염색정도를 보여주고 있다.
면역조직염색을 통해 본 발명에 의한 원숭이 CD4 항체가 기존의 항-사람 CD4항체에 비해 월등이 높은 염색력을 가지는 것을 알 수 있으며, 이는 본 발명의 실시예에서 얻은 항 원숭이 CD4 항체가 CD4 항원에 대해서 높은 친화력을 가지고 있 음을 의미한다.
실시예 4: 친화력이 높은 항체의 CDRs 에 대한 cDNA 염기서열 분석
항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위는 중사슬과 경사슬의 가변 부위, 특히 CDR (complementarity determining region)이 복합체의 친화력을 결정하므로 상기 실시예를 통해 얻어진 항체 유전자를 클로닝하여 항체 중사슬과 경사슬에 대한 가변부위에 대한 유전자 염기서열을 분석하였다. 융합세포주로부터 RNA를 추출하여 Mouse Ig-Primer set (Novagen, CA, USA)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 유전자를 셔틀 벡터 (shuttle vector)에 클로닝 하여 해당 유전자의 염기서열을 분석하였다. 중사슬의 가변 영역인 VH (variable region of heavy chain) 및 경사슬의 가변 영역인 VL (variable region of light chain) 유전자 염기서열은 아미노산으로 치환하여 서열화하였다 (도 4 참고).
도 1은 원숭이 면역세포 CD4 항원에 특이성을 갖는 단일클론 항체의 제작 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명을 통해서 얻은 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD4 항체를 이용하여 원숭이 PBMC 염색 후, 유세포 분석을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명을 통해서 얻은 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD4 항체를 이용하여 원숭이의 CD4항원이 발현되는 CHO 세포 (B)를 염색하고, 유세포 분석을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명을 통해서 얻은 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD4 항체를 이용하여 원숭이 비장 조직 절편을 염색한 사진을 나타낸 것이다. A는 음성 대조군으로 사용한 사람 면역글로불린인 human IgG를 염색한 것이고, B는 양성 대조군으로 사용한 항-사람 CD4 항체(anti-human CD4 항체)를 염색한 것이고, C는 실험군인 본 발명의 실시예에서 얻은 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD4 항체(anti-monkey CD4항체)의 염색을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명을 통해서 얻은 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD4항체의 cDNA염기서열 중 친화력을 결정하는 CDRs지역에 대한 유전자 정보를 중사슬과 경사슬의 가변 부위(variable region)으로 나누어서 나타낸 것이다. 각 아미노산 서열상에서 CDR1, CDR2, CDR3 부분은 굵은 글씨로 표시하였다. VH는 중사슬 가변부위, VL는 경사슬 가변부위를 뜻한다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Monoclonal antibody to specific monkey CD4 and a hybridoma producing the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal antibody VH (VH means Variable region of Heavy chain.) <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Val Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Tyr Arg Tyr Asp Gly Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser <210> 2 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody VL (VL means Variable region of Light chain.) <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser 20 25 30 Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 110

Claims (8)

  1. 원숭이로부터 분리된 CD4 항원에 특이적인 항 원숭이 CD4 단일클론항체.
  2. 제 1항에 있어서, 항체의 중사슬의 가변부위는 서열번호 1, 경사슬의 가변부위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주.
  4. 제 3항에 있어서, 융합 세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00211임을 특징으로 하는 융합 세포주.
  5. 제 1항 또는 제 2항의 단일클론항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 CD4+ T 세포 검출방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 검출방법은 유세포 분석, 형광 면역법 또는 면역조직 염색법에 의한 것임을 특징으로 하는 CD4+ T 세포 검출방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항의 항체 또는 이의 변형물을 치료적 또는 예방적 유효량으로 포함하는, CD4+ T 세포에 의해 매개되거나 CD4+ T 세포와 관련된 질병의 치료제.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 질병은 자가면역질환인 것을 특징으로 하는 치료제.
KR1020090081881A 2009-09-01 2009-09-01 원숭이 ｃｄ4에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주 KR101176704B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090081881A KR101176704B1 (ko) 2009-09-01 2009-09-01 원숭이 ｃｄ4에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090081881A KR101176704B1 (ko) 2009-09-01 2009-09-01 원숭이 ｃｄ4에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110024037A true KR20110024037A (ko) 2011-03-09
KR101176704B1 KR101176704B1 (ko) 2012-08-23

Family

ID=43931949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090081881A KR101176704B1 (ko) 2009-09-01 2009-09-01 원숭이 ｃｄ4에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101176704B1 (ko)

Also Published As

Publication number Publication date
KR101176704B1 (ko) 2012-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11919970B2 (en) Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ROR1
US11827714B2 (en) Antibodies and chimeric antigen receptors specific for CD19
CN107922497B (zh) 抗vista抗体和片段
TWI828334B (zh) 抗原結合分子類和使用彼等之方法
US20210214433A1 (en) Novel cldn 18.2-specific monoclonal antibodies and methods of use thereof
JP2006526414A (ja) 脱免疫化抗ｃｄ３抗体
EP1461081A2 (en) Anti-cd45rb antibodies for use in treating autoimmune disease and transplant rejection
WO2019114235A1 (zh) Pdl1单克隆抗体及其应用
JP3631750B2 (ja) ヒトｍｄｒ１マルチドラッグ耐性遺伝子産物に対するモノクローナル抗体およびその使用
US20220324977A1 (en) Anti-canine pd-1 antibody binding with canine pd-1
WO2019220110A1 (en) A cd79-specific chimeric antigen receptor
AU2021279028A1 (en) Bispecific molecules for selectively modulating T cells
KR20120013351A (ko) 면역장애 치료 방법
CN107435065B (zh) 鉴定灵长类抗体的方法
CA3231761A1 (en) Anti-human cd3 antibody and use thereof
KR101176704B1 (ko) 원숭이 ｃｄ4에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주
KR101364172B1 (ko) 원숭이 ｃｄ４３에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주
US10796787B2 (en) Method for identifying antigen-specific T cell receptors in primate
KR101650046B1 (ko) 영장류 cd19에 특이적인 항체 및 이를 생산하는 융합세포주
WO2024082383A1 (zh) 抗人白介素36受体单克隆抗体及其应用
WO2022121899A1 (zh) 一种特异性结合Strep-Tag II标签的抗体及其应用
CN117043187A (zh) GARP/TGFβ1抗体及其应用
CN115884987A (zh) 抗gprc5d抗体的抗独特型抗体
CN117529501A (zh) 针对抗cd79b抗体的抗独特型抗体
JP2014162754A (ja) 癌幹細胞特異的に発現する細胞膜タンパク質に対するモノクローナル抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150730

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160212

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170724

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190902

Year of fee payment: 8