KR20110023483A

KR20110023483A - EGCG(에피가로카테킨 갈레이트: Epigallocatechin gallate)와 자외선 차단성분을 함유하는 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR20110023483A
Application number: KR1020090081401A
Authority: KR
Inventors: 박진오; 이지원; 최명수; 정석균; 박영진
Original assignee: 유씨엘 주식회사
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2011-03-08

Abstract

본 발명은 EGCG(에피가로카테킨 갈레이트: Epigallocatechin gallate)와 자외선 차단성분을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 EGCG와 자외선 차단성분을 함유함으로써 유해한 자외선으로부터 피부를 보호하고 미백기능을 갖는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

EGCG, 자외선 차단, 미백기능, 피부 외용제

Description

EGCG(에피가로카테킨 갈레이트: Epigallocatechin gallate)와 자외선 차단성분을 함유하는 피부 외용제 조성물{omitted}

Tyrosinase 는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 수행하는 rate-limiting enzyme이다. 피부의 색소를 생성하는 세포인 색소생성세포(melanocyte)의 색소형성기관 (melanosome)에서 tyrosine을 산화시켜 dopa를 만들고, 다시 dopa를 산화시켜 dopachrome을 만드는 dopa oxidase로 작용한다. 좀 더 정확히 표현하면, tyrosinase (EC 1.14.18.1)는 인간 피부 색소인 멜라닌 합성에서 가장 중요한 역할을 수행하며 인간 염색체 11q14-21에 위치하는 TYR 혹은 c-locus에 의해서 발현된다. 이 tyrosinase는 멜라닌 합성 단계에서 3가지 구별되는 반응을 촉매하하는데, 1)monophenol (L-tyrosine)의 hydroxylation 2) catechol (L-DOPA)의 dehydrogenation 3) DHI의 dehydrogenation 등이다. 따라서 다양한 미백 기능성 원료의 tyrosinase 활성 억제는 미백 활성의 중요한 척도가 될 수 있다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 온도 및 습도의 변화, 자외선, 및 공해물질과 같은 외부환경의 자극으로부터 체내의 기관을 보호해 주는 기능을 한다. 그러나, 내적으로는 나이가 들어감에 따라 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되고, 외적으로는 오존층 파괴와 같은 환경오염으로 인한 자외선, 자유 라디칼 및 활성산소의 증가로 인하여 발생하는 물리적, 화학적 자극 및 스트레스로 인해 피부의 정산기능이 약화되고 노화가 촉진된다. 이러한 현상을 방지하고 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위해서, 기존에 알려진 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리 활성 물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키고 피부세포를 활성화시켜 피부노화를 효과적으로 억제하기 위한 노력이 있어 왔다.

EGCG는 인체의 면역력을 증가시키고, 우수한 항산화 효과를 갖고 있으며, 경구투여 시 우수한 항암 효과 및 항산화 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, EGCG는 피부에 도포할 경우 연골, 모세혈관, 근육 등의 구성요소인 콜라겐의 생성을 촉진하며 자외선이 피부에 침투하여 생기는 화학물질을 파괴하여 피부 손상을 막아주는 역할을 할 뿐만 아니라, 주름을 방지하고, 피부를 건강하게 유지시키며, 우수한 미백효과를 갖는 것으로 알려져 있어 화장료 조성물 뿐 아니라 의약 조성 물, 생활용품 등에 적용할 경우 우수한 기능을 발휘할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나, EGCG는 폴리페놀의 화학구조로서 강력한 항산화제 기능을 지니고 있기 때문에, 그 자체는 공기, 특히 산소와 열, 빛 등의 외부환경에 민감하게 반응하여 산화에 의해 쉽게 분해되는 문제점이 있다. 본 개발은 주로 아시아 지역에서 소비되는 녹차는 폴리페놀류 중 카테킨 성분으로 잘 알려져 있다. 카테킨의 주요 성분인 EGCG(Epigallocatechin gallate)는 폴리페놀의 화학구조를 가진 강력한 항산화제로서 대개 인접한 페놀기가 라디칼등의 산화제에 의해 분해되고 케톤기로 전환되어 페닐기의 환구조를 끊는 메커니즘을 갖는 것으로서 알려져 있다. 또한 피부종양, 전립선암에서도 세포증식을 억제하는 치료효과가 있다고 알려져 있으며, 멜라닌세포의 증식을 억제하는 것으로도 알려져 있다.

이에, 본 개발은 EGCG와 자외선차단 성분을 함유한 피부 외용제를 사용할 경우 피부에 유해한 자외선으로부터 피부를 보호하여 멜라닌 생성에 의한 피부의 흑화를 방지해 줄 뿐아니라, 본 발명의 목적인 미백 효과가 우수하여 여성의 미백피부의 욕구를 충족시켜 주는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 본 발명은 EGCG(에피가로카테킨 갈레이트: Epigallocatechin gallate)와 자외선 차단성분을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 EGCG와 자외선 차단성분을 함유함으로써 유해한 자외선으로부터 피부를 보호하고 미백기능을 갖는 피부외용제 조성물을 제 공할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 EGCG 및 자외선 차단성분을 함유하는 것을 특징으로 한다. 여기서 상기 EGCG는 회색이 도는 흰색 또는 연한 분홍색의 분말 것이 바람직하고, 상기 자외선 차단성분은 무기 및 유기 자외선 차단성분인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 EGCG 분말은 차나무 Camellia sinensis (L) O. Kuntze(Theaveae)의 잎을 정제수 및 에칠아세테이트로 추출한 것을 분리 정제한 것이고 순수한 EGCG를 95％ 중량 이상을 함유하고 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성에 있어서, EGCG 분말의 함량은 조성물의 총 중량에 대하여 0.01∼10중량％ 가 바람직하다. 만일 EGCG 분말의 함량이 조성물의 총 중량에 대하여 0.01중량％ 미만이라면 그 효과를 기대하기 어렵고, 10중량％를 초과한다면 과도한 사용에 따른 피부 부작용 및 산화에 의한 산패가 우려되기 때문이다. 자외선 차단성분 중 무기 자외선 차단성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.10∼20중량％가 바람직하다. 만일 무기 자외선 차단 성분의 함량이 조성물의 총 중량에 대하여 0.10중량％ 미만이라면 자외선 차단 효과가 미미하고, 20중량％를 초과하면 피부의 백탁 현상이 발생하여 제품으로서 가치가 떨어지기 때문이다. 상기의 무기 자외선 차단제로서는 징크옥사이드, 티타늄디옥사이드를 사용할 수 있으나, 더욱 바람직하게는 티타늄디옥사이드를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 유기 자외선 성분을 사용하여 자외선 차단효과를 극대화하며, 더 상세하게는 자외선 차단지수가 50이상 및 자외선 A 차단 지수가 8.60이상을 유지하기 위해 여러 가지 유기 자외선 차단성분을 사용한다. 자외선은 파장에 따라 파장이 긴 자외선 UVA (320 ～ 400 nm), 파장이 중간인 자외선 UVB (290 ～ 320 nm), 파장이 짧은 자외선 UVC (200 ～ 290 nm)로 나눌 수 있다. 이 중 화장품에 사용되는 자외선 차단성분의 흡수파장은 파장이 긴 자외선 UVA (320 ～ 400 nm), 파장이 중간인 자외선 UVB (290 ～ 320 nm)을 사용한다. 따라서 이에 해당하는 성분으로서 이소아밀p-메톡시신나메이트, 비스-에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 에칠헥실메톡시신나메이트를 사용할 수 있다. 상기 유기 자외선 차단성분의 조성은 조성물의 총 중량에 대하여 이소아밀p-메톡시신나메이트 0.10∼ 20중량％, 비스-에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진 0.10∼10％ , 4-메칠벤질리덴캠퍼 0.10∼30％, 에칠헥실메톡시신나메이트 0.10∼20％를 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 EGCG 및 자외선 자단성분을 함유한 자외선 차단용 및 미백기능의 피부외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없다. 예를 들어 본 발명의 피부 외용제 조성물은 유중수자외선차단크림, 수중유 자외선차단크림, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 형태로 제형화 될 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여형으로 제형화 될 수 있다.

일반적으로 산화 환원작용은 피부에서 흑화과정의 조절에도 많은 영향을 미친다. 이에 EGCG(Epigallocatechin gallate)가 황산화제로서 피부 미백의 효능을 측정하였다. 이하, 시험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[시험예 1] in vitro tyrosinase 활성저해 시험

본 시험은 시험관내에서 (in vitro) EGCG의 mushroom tyrosinase효소 활성을 저해하는 정도를 측정하는 것이다. EGCG를 적절한 용매에 녹여 0.1M 인산염완충액(pH 6.5) 220 ㎕와 시료액 20 ㎕ 그리고 mushroom tyrosinase (1500 U/ml - 2000 U/ml) 20 ㎕를 순서적으로 넣었다. 이 용액에 1.5 mM tyrosine 액 40 ㎕를 넣고 37℃에서 10 - 15분 동안 반응 시켰다. 이것을 ELISA reader를 이용하여 490 mn에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액 (pH 6.5)을 넣어 분석에 사용하였다.

tyrosinase 활성 저해율 (％) = 100 - [(b-b')/(a-a') X 100]

a: 공시료액의 반응 후의 흡광도

b: 시료액의 반응 후의 흡광도

a', b': tyrosinase 대산 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

In vitro tyrosinase 연구법을 통하여 최대 0.5％ 까지의 EGCG의 tyrosinase 저해활성을 조사한 결과 vesicle만을 사용한 대조군에 비해서 64.52％의 저해 활성을 표1에 보였다.

[시험예 2] EGCG의 in vitro tyrosinase DOPA 산화 저해 활성

본 시험은 시험관내에서 (in vitro) EGCG의 mushroom tyrosinase DOPA 산화 반응에 대한 효소 활성을 저해하는 정도를 측정하는 것이다. EGCG를 적절한 용매에 녹여 0.1M 인산염완충액 (pH 7.0) 850 ㎕와 시료액 50 ㎕ 그리고 mushroom tyrosinase (1500 U/ml - 2000 U/ml) 50 ㎕를 순서적으로 넣고 37℃에서 6분간 반응 시켰다. 이 용액에 0.06 mM L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalaine)액 50 ㎕를 넣은 다음 37℃에서 추가로 1분간 반응 시켰다. 이것을 ELISA reader를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액 (pH 7.0)을 넣어 분석에 사용하였다.

DOPA 산화활성저해율 (％) = 100 - (각시료액의 반응흡광도/공시료액의 반응흡광도)X100

In vitro tyrosinase DOPA oxidation 저해 연구법을 통하여 최대 0.5％ 까지의 EGCG의 tyrosinase 저해활성을 조사한 결과 vesicle만을 사용한 대조군에 비해서 74.42％의 저해 활성을 보였다.

[시험예 3] EGCG의 melanocyte 유래 tyrosinase 억제 활성 측정

본 실험은 murine melanocyte cell line (B16-F10)를 적량의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 혹은 동등이상의 성장력을 갖는 배지로 6-well plate에 well당 1×10⁵ 개로 접종한 후 5 ％ CO₂, 37 ℃하에서 세포가 well 바닥에 약 80 ％ 이상 부착될 때까지 배양한다. 배양 후 배지를 제거하고 시료인 EGCG가 적절한 농도로 희석된 배지로 교체한 후 5％ CO₂, 37 ℃하에서 일정시간 배양한다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수한다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000～10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻는다. 이 세포 pellet은 1％ Tween20을 포함하는 PBS에 현탁한 후 -70℃에서 30분간 정치 후 sonication을 이용하여 세포를 lysis 시킨다. Lysis된 세포를 원심분리한 후 상등액을 취하고 여기에 L-DOPA를 넣어 준 후 37℃에서 반응 시킨 후 490nm에서 흡광도를 측정하여 tyrosinase의 억제 활성을 구한다.

EGCG의 melanocyte의 cell lysate에서 분리한 tyrosinase가 L-DOPA의 산화활성 억제도를 측정하기 위하여 vesicle에 용해된 0.5％ EGCG를 배양 배지에 첨가하여 tyrosinase의 억제활성을 측정하였다. 그림 3에서 보듯이 48시간 배양시간동안 vesicle만이 처리된 대조군에 비해 0.5％ EGCG가 처리된 시험군에서 77.58 ± 0.2％의 tyrosinase 활성이 감소된 것을 확인하였다.

[시험예 4] 멜라닌생성세포에 대한 멜라닌 합성 저해 시험

본 실험은 murine melanoma(B16-F10)를 적량의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 혹은 동등이상의 성장력을 갖는 배지로 6-well plate에 well당 1×10⁵ 개로 접종한 후 5 ％ CO_2, 37 ℃하에서 세포가 well 바닥에 약 80 ％ 이상 부착될 때까지 배양한다. 배양 후 배지를 제거하고 시료인 EGCG가 적절한 농도로 함유된 배지로 교체한 후 5％ CO₂, 37 ℃하에서 일정시간 배양한다. 배지내 EGCG의 자연적 산화영향을 최소화하기 위하여 새롭게 제조된 EGCG를 함유하는 배양배지로 4시간 마다 교환하며 24시간동안 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수한다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000～10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻는다. 이 세포 pellet은 60℃에서 건조한 후 10％ DMSO와 2％ SDS의 cell lysis buffer를 넣어 60 ℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻는다. 이 액을 가지고 microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포일정수당 멜라닌양을 구한다.

EGCG의 melanocyte에서 melanin 합성에 대한 저해 정도를 확인하기 위하여 vesicle에 용해된 0.005％ EGCG를 배양 배지에 첨가하여 살아있는 세포당 melanin 함량을 측정하였다. 그림 4에서 보듯이 48시간 배양시간동안 vesicle만이 처리된 대조군에 비해 0.005％ EGCG가 처리된 시험군에서 38.25 ±13.56％의 melanin 합성감소를 확인하였다 (n = 3).

상기 시험예에서 알 수 있듯이, 먼저 시험관내에서 (in vitro) EGCG의 mushroom tyrosinase효소 활성을 저해하는 정도를 측정을 통해 최대 0.5％ 까지의 EGCG의 tyrosinase 저해활성을 조사한 결과 vesicle만을 사용한 대조군에 비해서 64.52％의 저해 활성을 보였다. 그리고 In vitro tyrosinase DOPA oxidation 저해 측정을 통하여 최대 0.5％ 까지의 EGCG의 tyrosinase 저해활성을 조사한 결과vesicle만을 사용한 대조군에 비해서 74.42％의 저해 활성을 보였고, EGCG의 melanocyte의 cell lysate에서 분리한 tyrosinase가 L-DOPA의 산화활성 억제도를 측정하기 위하여 vesicle에 용해된 0.5％ EGCG를 배양 배지에 첨가하여 tyrosinase의 억제활성을 측정하여48시간 배양시간동안 vesicle만이 처리된 대조군에 비해 0.5％ EGCG가 처리된 시험군에서 77.58 ±0.2％의 tyrosinase 활성이 감소된 것을 확인하였다. 또한 EGCG의 melanocyte에서 melanin 합성에 대한 저해 정도를 확인하기 위하여 vesicle에 용해된 0.005％ EGCG를 배양 배지에 첨가하여 살아있는 세포당 melanin 함량을 측정하여 48시간 배양시간동안 vesicle만이 처리된 대조군에 비해 0.005％ EGCG가 처리된 시험군에서 38.25 ±13.56％의 melanin 합성감소를 확인하였다. 따라서 In vitro상에서 EGCG(Epigallocatechin gallate)가 항산화제로서 피부멜라닌 생성에 관여하는 효소들의 억제하는데 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 EGCG는 피부의 미백효과가 아주 뛰어나다는 것을 증명하였다.

Claims

에피가로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate: EGCG)와 자외선 차단성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 에피가로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate: EGCG)는 상기 차나무 Camellia sinensis (L) O. Kuntze(Theaveae)의 잎을 정제수 및 에칠아세테이트로 추출한 것을 분리 정제한 것이고 순수한 EGCG를 95％ 중량 이상을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제2항에 있어서, 에피가로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate: EGCG)는 조성물의 총 중량에 대하여 0.01∼10중량％로 함유되는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 자외선 차단성분은 무기 자외선 차단제로서 징크옥사이드, 티타늄디옥사이드를 사용할 수 있으나, 더 바람직하게는 티타늄디옥사이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 자외선차단 성분 중 유기 자외선 차단성분의 조성은 조성물의 총 중량에 대하여 이소아밀p-메톡시신나메이트 0.10∼ 20중량％, 비스-에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진 0.10∼10％ , 4-메칠벤질리덴캠퍼 0.10∼30％, 에칠헥 실메톡시신나메이트 0.10∼20％를 함유하는 것을 특징하는 피부 외용제 조성물.