KR20110022759A

KR20110022759A - 개과 동물의 양수 유래 중간엽 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제

Info

Publication number: KR20110022759A
Application number: KR1020090080159A
Authority: KR
Inventors: 김민규; 최선아; 이지혜; 김근중
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-03-08

Abstract

본 발명은 개의 임신 전반기 1/3 기간 내에 양수에서 채취한 세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양하여 골아세포, 지방세포, 및 연골세포로의 분화능을 확인한 것이다. 상기 양수 유래의 중간엽 줄기세포는 상당부분 배아 줄기세포와 유사하여 다른 공급원으로부터 분리 배양한 중간엽 줄기세포에 비해 뛰어난 분화능이 있어 배아 줄기세포를 대체할 조직재생 치료제로서의 활용이 가능하다.

개, 양수, 중간엽 줄기세포, 분화

Description

개과 동물의 양수 유래 중간엽 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제{Canine amniotic fluid derived mesenchymal stem cell and cellular therapeutics containing the same}

본 발명은 개과 동물의 양수 유래 중간엽 줄기세포 및 조직재생 치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 개 양수 유래 중간엽 줄기세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포, 상기 중간엽 줄기세포를 분화시키는 방법, 중간엽 줄기세포의 분화 조절 조성물, 상기 중간엽 줄기세포 또는 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료제에 관한 것이다.

최근 줄기세포가 인체의 여러 기관들을 구성하는 세포들로 분화 가능하다는 것이 밝혀지면서 줄기 세포를 이용한 질병치료를 목적으로 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.

중간엽 줄기세포(MSC; Mesenchymal Stem Cell)는 체외에서 쉽게 증식할 수 있으며, 여러 가지 세포형태 (지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포)로 분화가 가능한 세포이다. 따라서 중간엽 줄기세포는 유전자 치료와 세포치료에 있어서 유용한 표적으로 이용될 수 있으며 중간엽 줄기세포의 분화기전에 대한 이해는 다양한 세포의 초기분화를 이해하는데 중요한 역할을 한다.

현재 MSC에 대한 연구 결과에 따르면 MSC에서 줄기세포 마커인 OCT-4와 NANOG가 발현되며, 세포의 분화를 유도하여 뼈와 연골, 지방 및 신경세포로 분화시킬 수 있다는 결과가 보고되고 있어 MSC가 배아 줄기세포를 대신할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 따라서 많은 연구들이 MSC의 출처로 사용하기에 적합한 것들을 찾고, 그 특성을 조사하여 분화능력을 확인하는 것에 초점을 맞추어 수행되고 있다. 밝혀진 MSC의 출처 중 주로 사용되는 것은 골수(bone marrow), 지방조직(adipose tissue), 제대혈(umbilical cord blood) 등이 있는데, 이들에서 유래한 MSC들은 여러 세포들로 분화할 수 있는 다분화능은 가지고 있으나, 배아 줄기 세포의 분화 능력에 비하면 제한된 면이 있다. 따라서, 요즘에는 MSC들 중에서도 배아 줄기세포와 비슷한 분화능력을 가진 출처를 찾는 연구들이 진행되고 있는데, 이 중에서 양막 및 양수 유래 줄기세포에 대한 연구 결과들이 조금씩 나오고 있다. 그러나 아직 양수 유래 (AFS: amniotic fluid derived stem)의 MSC에 대한 연구들이 많이 진행되어 있지 않은 상태이다. 따라서 AFS의 분리와 배양 및 분화 조건을 연구하여 조건들을 확립한다면 앞으로 많은 질병치료에 도움이 될 것이다.

만성질환이나 암 등으로 인해 손상된 조직과 장기를 치료하는 기술은 약물요법 등의 내과적 치료와, 수술 등의 외과적 치료가 주류를 이루고 있다. 그러나, 이 는 증상만을 완화시키는 대증적 치료에 그치는 경우가 많고, 수술 후 합병증이 많이 일어나며, 장기간 치료 시 경제적 부담이 크다는 등의 문제점이 있다. 최근에는 기존의 문제점을 해결하고 더욱 우수한 치료효과를 기대할 수 있는 조직 및 장기의 치료 기술의 한 방편으로, 자가복제(self-renewal) 및 분화(differentiation)가 가능한 세포를 재생이 필요한 조직 및 장기에 주입하는 방법이 주목을 받고 있다.

이러한 세포의 대표적인 예로 중간엽 줄기세포 및 조혈모세포를 들 수 있다. 그 중 조혈모세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 혈관 내의 혈구세포로 분화되는 반면, 중간엽 줄기세포는 보다 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성(multipotent) 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 골수의 간질세포를 비롯하여 연골, 골, 지방조직, 근육, 건, 인대 및 신경조직 등 인체를 구성하는 각종 세포와 조직으로 분화할 수 있으므로, 재생의학의 실용화 측면에서 가장 핵심적인 세포로 각광받고 있다.

현재 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 대표적 기원 조직은 골수(bone marrow)를 들 수 있다. 골수에는 중간엽 줄기세포가 풍부하지만, 골수 채취는 수회 수술침으로 찌르는 등 침습적인(invasive) 기술이므로 실용화하기 어렵고, 시술할 경우 전신마취를 필요로 하므로 환자에게 정신적ㆍ육체적으로 큰 부담이 되며, 시술 시 겪게 되는 고통 또한 크다. 이러한 채취과정의 어려움으로 인해, 골수보관은행 등의 인프라 구축은 비현실적이고 불가능한 실정이다.

반면 양수의 채취는 간단하게 시행할 수 있으며, 임신견과 태아에게 전혀 해가 없어 실용화 가능성이 높다. 양세정포는 태아가 산모의 뱃속에서 자라고 있을 때 양수로 탈락되어 나오는 태아의 세포이다. 양세정포는 양수 내에서 그 함량비율이 매우 적지만, 분열능이 왕성하므로 적절한 조건에서 초기 배양을 진행하여 다량의 세포를 얻을 수 있다.

분화를 위한 유도인자에 관하여는 여러 연구결과가 있다. 일반적으로 사용된 지방세포 유도인자로서 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine), 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indometacinum), 및 인슐린 (IDII cocktail) 등이 있으며, 골아세포 유도인자로서 덱사메타손, β-인산글리세롤(β-glycerophosphate), 아스코르빅 2-인산(ascorbate-2-phosphate) 등이 있으며, 연골세포 유도인자로서는 TGF-β1(Transforming Growth Factor-β Type 1 Receptor), 인슐린, 아스코르빅 2-인산, 덱사메타손, 피루브산나트륨(sodium pyruvate), ITS, 프롤린(proline) 등이 있다. 그러나 성체 줄기세포로부터 이러한 세포로의 분화를 위한 유도인자에 관한 연구가 아직 많이 되어 있지 않아 분화유도조건이 확립되어 있지 않다.

앞으로 양수 줄기세포로부터 특정 질병의 치료에 알맞은 순도 높은 기능성 세포로의 분화 조건의 확립과 개발이 지속적으로 이루어져야 할 것이다. 이러한 분화 조건의 확립을 통하여 여러 질병 치료를 위한 질병 모델로서의 개의 가치가 더욱 높아질 것이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 임신견의 양수에서 채취한 세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양하여, 배아 줄기세포로서의 특성을 확인하고, 골아세포, 지방세포, 및 연골세포로 분화시킴으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 개 양수 유래 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 배아 줄기세포의 특성을 가지는 중간엽 줄기세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포를 배양하여 지방세포, 골아세포 및 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포의 지방세포, 골아세포 및 연골세포로의 분화 조절 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포 또는 상기 분화된 지방세포, 골아세포 및 연골세포를 유효성분으로 함유하는 세포 치료제를 제공한다.

개의 임신 전반 1/3 기간에 분리한 양수 유래 중간엽 줄기세포는 상당부분 배아 줄기세포와 유사하여 다른 공급원으로부터 분리 배양한 중간엽 줄기세포에 비 해 뛰어난 분화능력이 있어 배아 줄기세포를 대체할 조직재생 치료제로서의 활용이 가능하다. 이러한 결과는 사람을 비롯하여 개, 소, 돼지, 말, 양 등 모든 포유류에 적용이 가능할 것으로 기대되며, 특히 사람의 경우 양수검사 시 잉여 양수로부터 분리가 가능하여 중간엽 줄기세포의 보관 및 치료제로서의 사용이 용이하여 세포치료제로서의 가치가 무한할 것으로 기대된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 임신견에서 주사기로 양수를 채취하는 단계;

(b) 채취한 양수를 원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하는 단계;

(c) bFGF(basic Fibroblast Growth Factor) 및 EGF(Epidermal Growth Factor) 함유 배지에서 배양하여 배양세포를 수집하는 단계; 및

(d) 상기 수집한 세포로부터 개 양수 유래 줄기세포를 분리 및 정제하는 단계;를 포함하여 이루어지는 개 양수 유래 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 (d) 단계에 앞서, 수집한 배양세포를 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세정하여, bFGF 및 EGF 함유 배지의 배양접시 바닥에 세포부착을 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 세포 배양을 위한 배지 및 시약은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, DMEM, α-MEM, McCoys 5A 배지, Eagle's basal 배지, CMRL 배지, Glasgow 최소 필수 배지, Ham's F-12 배지, Iscove's modified Dulbecco's 배지, Liebovitz' L-15 배지, RPMI 1640 배지 등 일반적으로 사용되는 세포배양용 배지 중에서 선택 수 있으며, 더욱 바람직하게는, L-DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지이다.

또한 본 발명에서 사용하는 세포 배양용 배지는 상기 성분 이외에도 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다. 그 예로, 성장인자(growth factor), 아미노산, 저해제 또는 그 유사물질뿐만 아니라 우아혈청(FCS: Fetal Calf Serum) 또는 우태아혈청을 비롯하여 미생물의 오염을 막기 위해 암포테리신 B(amphotericin B), 젠타마이신(gentamycin), 또는 니스타틴(nystatin) 등의 추가적인 항생제 및 항진균제(antifungal agent) 등을 추가할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 있어서 상기 배지는 L-DMEM 배지에 0.5∼20 ng bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), 1∼40 ng EGF(Epidermal Growth Factor), 1∼40% FBS 및 0.5∼4% 페니실린(penicillin)-스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는, L-DMEM (Sigma, Cat No.:D6046) 배지에 5 ng bFGF, 10 ng EGF, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 배양은 일반적으로 세포가 유래된 종의 세포들을 배양하기 위해 사용하는 조건(온도,대기), 예를 들면 39℃, 100% 상대습도에서, 5%의 이산화탄소를 포함하는 대기조건에서 수행될 수 있다. 또한 상기 배양은 원하는 세대만큼 수행될 수 있으며, 원하는 세포 수에 달하면 즉시 종료될 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게는, 1 내지 10 세대까지 배양할 수 있다. 상기 배양 시간(한 세대 동안의)은 세포가 성장하는데 필요한 적절한 시간이면 어떤 정도도 가능하며, 일반적으로는 약 하 루 내지 수일, 바람직하게는, 7일 동안 수행되며, 어떠한 경우에도 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 배양접시는 동물세포 배양에서 통상적으로 이용되며 동물세포의 부착이 가능한 조직 배양 디쉬, 멀티웰 플레이트 또는 폴리-L-라이신 코팅-유리 커버슬립이 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포의 제조방법에 의해 제조되고, 다음과 같은 특성을 가지는 중간엽 줄기세포를 제공한다.

(a) CD34에 대하여 음성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD44, CD29, CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

(b) 배양접시 바닥에 부착하여 성장하며, 콜로니를 형성하며, 섬유아세포(fibroblast) 모양의 형태학적 특성을 나타냄;

(c) Nanog, Oct4, Sox2, 및 SSEA-4 유전자를 발현함;

(d) SRY 유전자 검사에서 성별검사가 가능함; 및

(e) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명에서의 상기 중배엽 유래 세포는 골아세포, 연골세포 또는 지방세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포를 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine), 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indometacinum), 및 인슐린(insuline)이 포함된 L-DMEM 배지; 또는 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, IBMX, 덱사메타손, 인도메타신, 인슐린, EGF 및 bFGF이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 지방세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기 배지는 바람직하게는, 1∼40% FBS, 0.5∼4% 페니실린/스트렙토마이신, IBMX 0.5∼2 mM, 덱사메타손 0.5∼2 μM, 인도메타신 0.05∼0.4 mM, 및 인슐린 0.2∼4 mg/mL이 포함된 L-DMEM 배지; 또는 1∼40% FBS, 0.5∼4% 페니실린/스트렙토마이신, IBMX 0.5∼4 mM, 덱사메타손 0.5∼4 μM, 인도메타신 0.05∼0.8 mM, 인슐린 0.2∼6 ㎎/mL 및, 1∼40 ng EGF 및 0.5∼20 ng bFGF가 추가 포함된 L-DMEM 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, IBMX 1 mM, 덱사메타손 1μM, 인도메타신 0.2 mM, 및 인슐린 1 mg/mL이 포함된 L-DMEM 배지; 또는 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, IBMX 1mM, 덱사메타손 1μM, 인도메타신 0.2 mM, 인슐린 1 ㎎/mL 및, 10 ng EGF 및 5 ng bFGF가 추가 포함된 L-DMEM 배지일 수 있다.

또한 본 발명에서 사용하는 세포 분화용 배지는 상기 성분 이외에도 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 추가로 포함할 수 있다. 그 예로, 성장인자(growth factor), 아미노산, 저해제 또는 그 유사물질뿐만 아니라 우아혈청(FCS, Fetal Calf Serum) 또는 우태아혈청을 비롯하여 미생물의 오염을 막기 위해 암포테리신 B, 젠타마이신, 또는 니스타틴 등의 추가적인 항생제 및 항진균제(antifungal agent) 등을 추가할 수 있다.

또한, 본 발명은 FBS, IBMX, 덱사메타손, 인도메타신, 및 인슐린을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화 조절 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 바람직하게는, 1∼40% FBS, 0.5∼4% 페니실린/스트렙토마이신, IBMX 0.5∼2 mM, 덱사메타손 0.5∼2 μM, 인도메타신 0.05∼0.4 mM, 및 인슐린 0.2∼4 mg/mL을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, IBMX 1 mM, 덱사메타손 1μM, 인도메타신 0.2 mM, 및 인슐린 1 mg/mL을 유효성분으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 FBS, IBMX, 덱사메타손, 인도메타신, 인슐린, EGF 및 bFGF를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화조절 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 바람직하게는, 1∼40% FBS, 0.5∼4% 페니실린/스트렙토마이신, IBMX 0.5∼4 mM, 덱사메타손 0.5∼4 μM, 인도메타신 0.05∼0.8 mM, 인슐린 0.2∼6 ㎎/mL 및, 1∼40 ng EGF 및 0.5∼20 ng bFGF를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, IBMX 1 mM, 덱사메타손 1μM, 인도메타신 0.2 mM, 인슐린 1 mg/mL, 10 ng EGF 및 5 ng bFGF를 유효성분으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포를 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, 덱사메타손, β-인산글리세롤(β-glycerophosphate), 및 아스코르빅 2-인산(ascorbate-2-phosphate)이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 골아세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기 배지는 바람직하게는, 1∼40% FBS, 0.5∼4% 페니실린/스트렙토마이신, 덱사메타손 0.5∼4 μM, β-인산글리세롤 1∼20 mM, 및 아스코르빅 2-인산 5∼100 μM이 포함된 L-DMEM 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 덱사메타손 0.1 μM, β-인산글리세롤 10 mM, 및 아스코르빅 2-인산 50 μM이 포함된 L-DMEM 배지일 수 있다.

또한, 본 발명은 덱사메타손, β-인산글리세롤, 및 아스코르빅 2-인산을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화 조절 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 바람직하게는, 덱사메타손 0.5∼4 μM, β-인산글리세롤 1∼20 mM, 및 아스코르빅 2-인산 5∼100 μM을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 덱사메타손 0.1 μM, β-인산글리세롤 10 mM, 및 아스코르빅 2-인산 50 μM을 유효성분으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

(a) 상기 중간엽 줄기세포를 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, TGF-β1, 인슐린, 아스코르빅 2-인산이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 연골세포로 분화시키는 단계; 및

(b) 상기 분화된 연골세포를 페니실린/스트렙토마이신, TGF-β1, 덱사메타손, 아스코르빅 2-인산, 피루브산나트륨, ITS, 프롤린이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 분화된 연골세포를 유지시키는 단계.

바람직하게는, 상기 방법은

1∼40% FBS, 0.5∼4% 페니실린/스트렙토마이신, TGF-β1 1∼20 ng/㎖, 인슐 린 1.25∼25 ㎍/㎖, 아스코르빅 2-인산 10∼200 nM이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 연골세포로 분화시키는 단계; 및

(b) 상기 분화된 연골세포를 0.5∼4% 페니실린/스트렙토마이신, TGF-β1 1∼20 ng/㎖, 덱사메타손 0.5∼4 μM, 아스코르빅 2-인산 5∼100 μM, 피루브산나트륨 20∼400 ㎍/㎖, ITS 10∼200 mg/㎖, 프롤린 5∼100 ㎍/㎖이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 분화된 연골세포를 유지시키는 단계를 포함하며,

더욱 바람직하게는, 상기 방법은

(a) 상기 중간엽 줄기세포를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, TGF-β1 10 ng/㎖, 인슐린 6.25 ㎍/㎖, 아스코르빅 2-인산 50 nM이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 연골세포로 분화시키는 단계; 및

(b) 상기 분화된 연골세포를 1% 페니실린/스트렙토마이신, TGF-β1 10 ng/㎖, 덱사메타손 0.1 μM, 아스코르빅 2-인산 50 μM, 피루브산나트륨 100 ㎍/㎖, ITS 50 mg/㎖, 및 프롤린 20 ㎍/㎖이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 분화된 연골세포를 유지시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 TGF-β1, 인슐린 및 아스코르빅 2-인산을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 조절 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 바람직하게는, TGF-β1 1∼20 ng/㎖, 인슐린 1.25∼25 ㎍/㎖, 아스코르빅 2-인산 5∼100 μM을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, TGF-β1 10 ng/㎖, 인슐린 6.25 ㎍/㎖ 및 아스코르빅 2-인산 50 nM을 유효성분 으로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 분화 조절 조성물에 추가적으로 포함될 수 있는 분화유도제는 줄기세포의 분화유도제로 알려진 어떠한 것도 가능하며, 레티노산(retinoic acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 멜라토닌(melatonine), 사이토카인(cytokine) 또는 여러 가지 성장인자 [예컨대, GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor), EGF(epidermal growth factor), NGF(nerve growth factor)]를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포 또는 상기 중간엽 줄기세포로부터 분화된 지방세포를 유효성분으로 함유하는 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 의해 상기 중간엽 줄기세포 또는 상기 중간엽 줄기세포로부터 분화된 지방세포를 유효성분으로 하는 치료용 조성물은 세포 단독 혹은 필름상에서 배양된 상태로 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스 콘치올카 (Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있다. 상기 제제에는 유효성분인 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포로부터 분화된 지방세포 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 세포치료제에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 세포치료제는 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하다.

본 발명의 세포치료제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 세포치료제의 투여량은 바람직하게는 1회 5 x 10⁵~ 1 x 10⁷세포이며, 통상적으로 1 회 또는 2 회 투여된다.

본 발명의 세포치료제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포 또는 상기 중간엽 줄기세포로부터 분화된 골아세포를 유효성분으로 함유하는 근골격계 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포 또는 상기 중간엽 줄기세포로부터 분화된 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골계 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 개의 난치성 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 양수의 분리 및 배양

1-1. 양수의 분리

임신이 확인된 암컷 비글견에서 임신 22~23일째 초음파를 통하여 태아낭에서 18G를 장착한 10 ㎖ 주사기로 양수를 채취하여, 50 ㎖ 시험관으로 옮겨 얼음에 넣어 실험실로 운반하였다.

1-2. 양수 유래 줄기세포 배양

양수는 3,000 rpm, 10분간 원심분리한 후 상층액은 버리고 펠렛만을 회수하 여 PBS로 3 회 세척한 후, L-DMEM 배지에 5 ng bFGF, 10 ng EGF, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 39℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 7일간 배양한 후 회수하여, 부유세포를 PBS로 세정한 후 처음 사용하였던 배지를 이용하여 배양접시 바닥에 세포부착을 유도하였으며, 부착된 세포가 바닥에 90% 이상 충만하게 자랄 때까지 배양한 후 계대배양하였다.

2. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

총 RNA는 제조사의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 준비하였다 (MACHEREY-NAGEL, Cat. No. 740955.50). RNA 시료 (총 RNA 1㎕)는 iScript 역전사효소 (BIO-RAD)를 사용하여 올리고 dT 프라이머 및 랜덤(random) 프라이머로 cDNA를 합성하였다. 프라이머는 하기 표 1에 제시되어 있다.

표 1. PCR에 사용된 프라이머

유전자명	프라이머 서열 (5'→3')	서열번호	어닐링 온도 (℃)	PCR 산물의 크기(bp)
Nanog	정방향 GAATAACCCGAATTGGAGCAG	1	60	141
	역방향 AGCGATTCCTCTTCACAGTTG	2
Oct-4	정방향 GAGTGAGAGGCAACCTGGAG	3	60	274
	역방향 GTGAAGTGAGGGCTCCCATA	4
Sox-2	정방향 AGTCTCCAAGCGACGAAAAA	5	60	142
	역방향 GCAAGAAGCCTCTCCTTGAA	6
β2-미세 글로불린	정방향 TCTACATTGGGCACTGTGTCAC	7	60	136
	역방향 TGAAGAGTTCAGGTCTGACCAAG	8

RT-PCR은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 30초를 27 회 반응시켰다. 72℃에서 5분간 최종 연장하였다.

베타 2-미세글로불린(β2-Microglobulin) RT-PCR 반응은 25 회 및 60℃에서의 프라이머 어닐링(annealing)으로 변형하여 수행하였다. 표적 유전자의 RT-PCR 특이적 증폭은 DNA 염기서열분석으로 확인하였다.

3. 면역조직화학적 염색( Immunohistochemical staining )

개의 AFS를 상온에서 4% 포름아마이드 용액으로 밤새 고정하였다. 면역조직화학검사(immunohistochemistry)를 위해 제조사의 지침에 따라 콜로니 슬라이드를 항마우스 OCT-4, Nanog, SOX2, SSEA-2 및 SSEA-4에 대해 희석한 일차항체와 배양하였다. 일차항체는 비오틴(biotin)이 부착된 항염소 IgG 항체를 사용하여 검출되어, 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin)과 배양되었다. 상기 복합체는 공초점 현미경(conforcal microscope) 관찰을 위해 3,3'-DAB(3,3'-diamino benzidine) 시약으로 가시화되었다. 음성 대조구는 일차항체를 제거한 것이다.

4. 유세포 분석( Flow cytometry analysis )

개 양수 유래 세포는 하기와 같이 FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 PE(phycoerythrin)와 결합된 다양한 조합의 포화량인 단클론항체로 염색되었다: CD29-FITC, CD34-PE, CD44-FITC (BD PharMingen, USA), 및 CD90-FITC (eBiosciences, USA).

약 5∼10⁵ 개의 세포가 Cellquest 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석(FACScan, BD Biosciences, USA)되었다.

5. 분화

5-1. 지방세포 분화( Adipogenic differentiation )

six-well dish에 100,000 세포/well의 밀도로 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가한 L-DMEM 배지에 IBMX 1 mM, 덱사메타손 1μM, 인도메타신 0.2 mM, 및 인슐린 1 mg/mL (IDII cocktail)을 처리하여 지방세포 분화를 유도한 것과, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가한 L-DMEM 배지에 IBMX 1mM, 덱사메타손 1μM, 인도메타신 0.2 mM, 인슐린 1 ㎎/mL (IDII cocktail) 및 10 ng EGF와 5 ng bFGF를 첨가하여 지방세포 분화를 유도하였다. 이때 3일에 한 번씩 배지를 교환하였다. 이 과정을 7 회 반복하였다.

5-2. 골아세포 분화( Osteogenic differentiation )

six-well dish에 100,000 세포/well의 밀도로 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가한 L-DMEM 배지에 덱사메타손 0.1μM, β-인산글리세롤 10 mM, 아스코르빅 2-인산 50 μM을 처리하여 골아세포 분화를 유도하였다. 3일에 한 번씩 배지를 교환하였으며, 이 과정을 7 회 반복한 후 유도가 되었는지 확인하였다.

5-3. 연골세포 분화( Chondrogenic differentiation )

six-well dish에 100,000 세포/well의 밀도로 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가한 L-DMEM 배지에 TGF-β1 10 ng/㎖, 인슐린 6.25 ㎍/㎖, 아스코르빅 2-인산 50 nM을 처리하여 연골세포 분화를 유도시킨 뒤, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가한 L-DMEM 배지에 TGF-β1 10 ng/㎖, 덱사메타손 0.1 μM, 아스코르빅 2-인산 50 μM, 피루브산나트륨 100 ㎍/㎖, ITS 50 mg/㎖, 프롤린 20 ㎍/㎖ 를 처리한 배지로 3일에 한 번씩 배지를 교환하며, 연골세포 분화를 유도시킨 것을 유지시켜 배양하였다. 분화유지 배지로 6 회 배지를 교환하였다.

실시예 1. 양수 유래 세포의 형태

시험관으로부터 회수한 양수를 원심분리하여 아래에 침전된 펠렛을 PBS로 두 번 세정한 후, 배양 배지에 희석하여 초기배양을 유도하였다. 초기 배양된 양수 유래 세포는 다양한 형태를 나타내었다. 1주일간 배양 배지에서 배양한 후, 부착되지 않은 세포들을 회수하여 다시 배양 배지에 희석하여 배양하였을 때 몇몇 line에서 5∼7일 후에 콜로니를 형성하며 섬유아세포(fibroblast) 유사 세포들이 우세하게 성장하기 시작하였다. 콜로니 형성은 2∼3 계대 시까지 나타나다가, 그 이후 계대 수가 증가함에 따라 콜로니 형성은 나타나지 않았으며, 세포는 섬유아세포(fibroblast) 모양으로 성장하였다. 10 계대 정도 되면 형태가 커지며 잘 자라지 않았다 (도 1).

실시예 2. 특성 규명

2-1. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

줄기세포의 특성이 있는지 알아보기 위해, 개의 양수 유래 세포들에서 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행한 결과, 각각의 줄기세포에서 발현되는 유전자들이 나타남을 확인할 수 있었다 (도 2). Nanog, Oct4, Sox2 유전자의 발현을 확인한 결과 각각의 유전자가 발현됨을 알 수 있었다

2-2. SRY PCR

분리된 세포의 암수 구별을 위하여 SRY 유전자를 PCR을 통해 확인한 결과 자성(female)으로 확인되었다 (도 3).

2-3. 면역조직화학적 염색( Immunohistochemical staining )

초기 배양에서 형성된 콜로니를 면역형광염색을 실시하여 ES 세포와의 유사성을 조사한 결과 ES 세포에서 발현되는 OCT-4, Nanog, SOX2, 및 SSEA-4가 발현되어 개의 AFS 세포는 ES 세포와 매우 유사함을 확인하였다 (도 4).

2-4. 면역 표현형적 특성( Immunophenotypical characterization )

개의 양수 유래 세포들의 면역표현형 검사를 위해 FACS(Flow Analysis Cytometry System)를 실시하였다. 줄기세포 특이적 마커인 CD44, CD29, CA90, CD34를 확인해본 결과, CD44, CD29, CD90에는 양성이었으며, CD34에는 음성이었음을 확인하였다. 따라서 양수 유래 세포들은 중간엽 줄기세포로서의 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 5).

실시예 3. 지방, 연골, 골아세포 분화 실험

3-1. 지방세포 분화 실험

양수 유래 세포는 분화 유도 과정 중 다양한 형태를 나타내었다. 신경세포처럼 가지를 뻗어나간 세포, 섬유아세포(fibroblast) 형태에서 점차 둥근 모양으로 변하였다. 이 세포를 마지막 배지 교환 후 3일 후에 지질 방울이 형성되었는지 알아보기 위해 오일 레드 오(Oil Red O)로 염색한 결과 양성을 관찰할 수 있었다 (도 6).

3-2. 골아세포 분화 실험

골아 세포로 분화를 유도하는 과정에서 양수 유래 세포는 섬유아세포 모양에서 점차 입방형으로 형태의 변화를 보였다. 분화 유도 후 세포 외 기질(extracellular matrix)에 칼슘(calcium) 침전이 일어났는지를 알리자린 레드(alizarin red) 염색으로 확인한 결과 양성으로 염색됨을 알 수 있었다 (도 6).

3-3. 연골세포 분화 실험

3주간 연골 세포로 분화를 유도한 양수 유래 세포에서도 섬유아세포 모양의 세포가 형태의 변화를 일으키는 것을 관찰할 수 있었다. 세포는 크기가 확장되어 넓게 퍼졌으며, 세포 외 기질에 칼슘 침전이 생겼는지 알아보기 위해 알리자린 레드로 염색한 결과 양성으로 염색됨을 확인하였다. 그러나, 일부는 음성으로 염색되었다 (도 6).

도 1은 개 양수 유래 조직의 1차 배양을 보여준다. (A)는 1차 배양 8일 후 양수 유래 세포의 콜로니 형성을 보여준다. 양수 유래 세포는 초기에는 여러 형태의 세포를 포함하고 있다 (X200). (B)는 3 계대 째 양수 유래 세포에서 점차 섬유아세포 유사 세포가 많이 자라며, 여전히 콜로니 형성이 나타나고 있음을 보여준다 (X200).

도 2는 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 유전자들이 발현되는지 확인해 보기 위하여, 개의 양수 유래 세포들의 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행한 결과를 보여준다. Oct3/4, sox2, nanog가 발현됨을 알 수 있다.

도 3은 SRY 유전자의 PCR을 수행한 결과를 보여준다.

도 4는 면역조직화학적 형광 염색의 결과를 보여준다.

도 5는 양수 유래 세포에서 줄기세포의 특성을 확인하기 위해 유세포분석(Flow Analysis Cytometry System)를 수행한 결과를 보여준다. 중간엽 줄기세포의 양성발현 마커인 CD34에서는 음성을, 음성발현 마커인 CD29, CD44 및 CD90에서는 양성 양상을 나타내었다.

도 6은 개의 양수 유래 세포의 지방, 연골, 및 골아 세포 분화 실험을 보여준다. (A)는 개의 양수 유래 세포를 지방 세포 분화 유도 배지에서 21일간 배양한 후 오일 레드 오(Oil Red O)로 염색 시, 양성으로 염색된 것을 보여준다 (X400). (B)는 지방 세포로 분화를 유도한 개의 양수 유래 세포 중 오일 레드 오(Oil Red O)로 염색 시, 음성으로 염색된 세포을 보여준다 (X400). (C)는 골아 세포로 분화 를 유도한 세포를 마지막 배지 교환 후 3일 후에 알리자린 레드(alizarine red)로 염색 시, 양성의 염색된 세포를 보여준다 (X400). (D)는 골아 세포로 분화를 유도한 세포 중 알리자린 레드로 염색 시 음성으로 염색된 세포를 보여준다 (X200). (E)는 연골 세포로 분화를 유도한 개의 양수 유래 세포를 알리자린 레드 염색으로 분화가 유도되었는지 확인한 결과 양성의 염색된 세포를 보여준다(X400). (F)는 연골 세포로 분화를 유도했던 개의 양수 유래 세포에서 알리자린 레드 염색 시, 음성으로 염색된 세포를 보여준다 (X200).

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Canine amniotic fluid derived mesenchymal stem cell and cellular therapeutics containing the same <130> PN09117 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog F primer <400> 1 gaataacccg aattggagca g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog R primer <400> 2 agcgattcct cttcacagtt g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4 F primer <400> 3 gagtgagagg caacctggag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4 R primer <400> 4 gtgaagtgag ggctcccata 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox-2 F primer <400> 5 agtctccaag cgacgaaaaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox-2 R primer <400> 6 gcaagaagcc tctccttgaa 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta 2-Microglobulin F primer <400> 7 tctacattgg gcactgtgtc ac 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta 2-Microglobulin R primer <400> 8 tgaagagttc aggtctgacc aag 23

Claims

(a) 임신견에서 주사기로 양수를 채취하는 단계;

(b) 채취한 양수를 원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하는 단계;

(c) bFGF(basic Fibroblast Growth Factor) 및 EGF(Epidermal Growth Factor) 함유 배지에서 배양하여 배양세포를 수집하는 단계; 및

(d) 상기 수집한 세포로부터 개 양수 유래 줄기세포를 분리 및 정제하는 단계;를 포함하여 이루어지는 개 양수 유래 중간엽 줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에 앞서, 수집한 배양세포를 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세정하여, bFGF 및 EGF 함유 배지의 배양접시 바닥에 세포부착을 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지는 L-DMEM((low-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 0.5∼20 ng bFGF, 1∼40 ng EGF, 1∼40% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 0.5∼4% 페니실린(penicillin)-스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법에 의하여 제조되고, 다음과 같은 특성을 가지는 중간엽 줄기세포:

(a) CD34에 대하여 음성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD44, CD29, CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

(b) 배양접시 바닥에 부착하여 성장하며, 콜로니를 형성하며, 섬유아세포(fibroblast) 모양의 형태학적 특성을 나타냄;

(c) Nanog, Oct4, Sox2, 및 SSEA-4 유전자를 발현함;

(d) SRY 유전자 검사에서 성별검사가 가능함; 및

(e) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
제4항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 골아세포, 연골세포 또는 지방세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
제4항의 중간엽 줄기세포를 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indometacinum), 및 인슐린(insuline)이 포함된 L-DMEM 배지; 또는 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, IBMX, 덱사메타손, 인도메타신, 인슐린, EGF 및 bFGF이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 지방세포로 분화시키는 방법.
FBS, IBMX, 덱사메타손, 인도메타신, 및 인슐린을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화 조절 조성물.
FBS, IBMX, 덱사메타손, 인도메타신, 인슐린, EGF 및 bFGF를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화조절 조성물.
제4항의 중간엽 줄기세포를 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, 덱사메타손, β-인산글리세롤(β-glycerophosphate), 및 아스코르빅 2-인산(ascorbate-2-phosphate)이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 골아세포로 분화시키는 방법.
덱사메타손, β-인산글리세롤, 및 아스코르빅 2-인산을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화 조절 조성물.
다음의 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법:

(a) 제4항의 중간엽 줄기세포를 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, TGF-β1(Transforming Growth Factor-β Type 1 Receptor), 인슐린, 아스코르빅 2-인산이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 연골세포로 분화시키는 단계; 및

(b) 상기 분화된 연골세포를 페니실린/스트렙토마이신, TGF-β1, 덱사메타손, 아스코르빅 2-인산, 피루브산나트륨(sodium pyruvate), ITS, 프롤린이 포함된 L-DMEM 배지에 배양하여 분화된 연골세포를 유지시키는 단계.
TGF-β1, 인슐린 및 아스코르빅 2-인산을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 조절 조성물.
제4항의 중간엽 줄기세포 또는 제7항의 방법에 의해 분화된 지방세포를 유효성분으로 함유하는 세포치료제.
제4항의 중간엽 줄기세포 또는 제10항의 방법에 의해 분화된 골아세포를 유효성분으로 함유하는 근골격계 질환 치료용 세포치료제.
제4항의 중간엽 줄기세포 또는 제12항의 방법에 의해 분화된 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골계 질환 치료용 세포치료제.
제4항의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 개의 난치성 질환 치료용 세포치료제.