KR20110013485A - 면역자기적으로 농축된 희귀 세포의 개선된 이미지화 - Google Patents
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Abstract
여분의 미결합 자성유체를 제거하는 방법 및 면역자기적으로 농축된 순환 종양 세포의 이미지화가 제공된다. 관측 표면 내에 사전 형성된 홈을 갖는 용기가 세포 정렬 및 이미지화용으로 최적으로 디자인된다. 원심분리에 의해 미결합 입자를 분리한 후, 외부에서 인가되는 힘을 적용하여 자기 응답성 입자-CTC 복합체를 투명한 수집 벽쪽으로 수송한다. 챔버의 관측면의 홈이 파진 내측 표면은 용이한 이미지화를 위한 입자의 균일한 분포를 제공한다. 본 발명은 질환에 있어서 CTC의 정량적 분석에서와 같이 자동 세포 계수 기술과 함께 정량적 분석 및 샘플 준비를 행하는 데 또한 유용하다.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2008년 5월 19일자로 출원된 공계류 중인 미국 가특허 출원 제61/054,219호에 기초한 우선권을 주장하고 그의 이익을 청구한다.
본 발명은 미시적 생물 시편의 정성적 및 정량적 분석을 실시하기 위한 개선된 장치 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유체 매질 내에서 자기적으로 표지된 종을 생성하기 위하여 결합 제제를 갖는 자기-응답성(magnetic-responsive) 입자를 이용하여 면역특이적 또는 비특이적 결합이 가능한 미시적 생물 시편 또는 물질을 단리, 수집, 고정, 및/또는 분석하기 위한 그러한 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "자기적으로 표지된 시편"과 같은 용어는 그러한 자기 표지가 가능한, 조사상 관심대상인 그러한 생물 시편 또는 물질을 말할 것이다.
미국 특허 제5,985,153호에는 외부 경사 자장을 이용하여 수집 챔버에 존재하는 자기적으로 표지된 표적 시편을 상기 챔버의 표면들 중 하나로 끌어당기며, 여기서 내부 경사 자장을 이용하여 상기 표면 상에서 상기 시편이 정확하게 정렬되게 하는 장치 및 방법이 개시되어 있다. 자기적으로 표지된 생물 시편이 수집 표면으로 이동하는 것은 수직 경사 자장을 인가하여 자기적 표지 생물 시편을 수집 표면으로 이동시키는 것에 의해 얻어진다. 수집 표면에는 샘플 챔버의 광투과성 (관측) 면 상에 지지된 복수의 강자성 라인과 같은 강자성 포획 구조체가 제공되어 있다.
자기적으로 표지된 생물 시편이 상기 외부에서 인가되는 경사 자장에 의해 일단 표면에 충분히 가깝게 끌어당겨지면, 시편은 강자성 수집 구조체에 의해 생성되는 강한 국소 경사 자장의 영향 하에 오게 되고 그에 측방향으로 인접한 위치에서 고정된다. 국소 경사 자장은 바람직하게는 부착력을 초과하는데, 이 부착력은 생물 시편이 투명 표면과 충돌한 후 이 표면에 생물 시편을 유지할 수 있다. 대안적으로, 상기 표면의 부착성은 수평 자기력이 자기 표지된 생물 시편을 강자성 구조체 쪽으로 이동시키기에 충분히 약해야 한다. 당해 표면의 평활성 및 소수성 또는 친수성 성질은 수집 표면 또는 이 표면의 처리를 위하여 선택되는 물질에 영향을 주어 미끄러운 표면이 얻어지게 할 수 있는 요인이다.
미국 특허 출원 제10/733829호 및 미국 특허 제6,790,366호에는 유체 샘플 중 생물 물질을 분리, 고정, 및 정량화하기 위한, 상기에 기재된 외부에서 인가되는 경사 자장의 원리를 포함하고 투명 수집 벽 상에 높은 내부 경사 자장 포획 구조체를 추가로 포함하는 방법 및 장치가 개시되어 있다. 상기 포획 구조체는 자동 계수 기술을 이용하여 정량적으로 분석하기 위한 포획된 생물 물질의 균일한 정량을 장려한다.
미국 특허 출원 제11/447562호에는 자동화된 광학적 분석을 위하여 표적 시편을 정렬하기 위한 챔버의 광투명성 (관측) 면의 유체측 상의 소형 V형 홈이 개시되어 있다. 챔버의 광투과성 (관측) 면의 유체측 상의, 그리고 자기-표지된 시편이 최적으로 희석된 소형 V형 홈은 자동화된 광학적 분석을 위한 정렬 표면을 제공한다. 자기-표지된 시편 및 미결합 자기 입자는 외부에서 인가된 경사 자장의 영향 하에서 챔버의 관측 면의 내측 표면 쪽으로 이동한다. 이들이 내측 표면에 접근할 때, 이들은 V형 홈의 사면과 접촉하게 되어, 자기-표지된 시편 및 미결합 자기 입자가 상기 홈의 상부로 강제로 이동하게 된다.
미국 특허 출원 제11/344757호에는 검출가능하게 표지된 희귀 표적 세포의 자동 수집 및 이미지 분석을 위한 장치 및 방법이 개시되어 있다. 이들 자기 표지된 희귀 세포는 셀트랙스 플랫폼(CellTracks Platform)에서 시간 지연 적분 이미지화법(Time Delay Integration Imaging, TDI)에 처해진다. 그러나, 암 환자의 혈액 중 순환 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)를 평가하여 질환 활성과 상관시킬 때, 면역자기 분리로부터 남겨진 미결합 자기 입자는 이미지를 왜곡하여 포획된 표적을 CTC로서 확인하는 것을 방해할 것이다.
본 발명은 셀트랙스 플랫폼에서 TDI를 사용하여 표지 희귀 세포를 분석함에 있어서 미결합 자기 입자의 완벽한 제거를 허용하는 소형 홈 디자인을 제공한다.
<도 1>
도 1은 세포 정렬 구조체의 개략도이다.
<도 2>
도 2는 평활 정렬 표면 및 이미지화 표면을 갖는, 주사 전자 현미경을 사용한 PDMS 각인(imprint)의 사진을 도시한다.
<도 3>
도 3은 1.0 ㎜ 두께의 전형적인 현미경 유리 슬라이드와 비교하여 1.3 ㎜ 두께의 PDMS 슬래브 및 0.5 ㎜ 두께의 PMMA 슬래브의 투과 스펙트럼을 도시한다.
<도 4>
도 4는 이미지의 강도에 대한 여분의 미결합 자기 입자의 영향을 도시한다. EpCAM 자성유체(ferrofluid)의 수준을 증가시키면 이미지 강도가 감소되고 평가 강도의 변동이 증가된다.
<도 5>
도 5는 40 ug/ml의 자성유체가 존재할 때 그리고 존재하지 않을 때 총 강도에서의 차이를 도시한다. 자성유체가 존재하면 분포가 더 불량해진다.
<도 6>
도 6은 정렬된 SKBR3 세포를 보여주는 조합된 명시야, DAPI 및 PE의 이미지를 예시한다.
도 1은 세포 정렬 구조체의 개략도이다.
<도 2>
도 2는 평활 정렬 표면 및 이미지화 표면을 갖는, 주사 전자 현미경을 사용한 PDMS 각인(imprint)의 사진을 도시한다.
<도 3>
도 3은 1.0 ㎜ 두께의 전형적인 현미경 유리 슬라이드와 비교하여 1.3 ㎜ 두께의 PDMS 슬래브 및 0.5 ㎜ 두께의 PMMA 슬래브의 투과 스펙트럼을 도시한다.
<도 4>
도 4는 이미지의 강도에 대한 여분의 미결합 자기 입자의 영향을 도시한다. EpCAM 자성유체(ferrofluid)의 수준을 증가시키면 이미지 강도가 감소되고 평가 강도의 변동이 증가된다.
<도 5>
도 5는 40 ug/ml의 자성유체가 존재할 때 그리고 존재하지 않을 때 총 강도에서의 차이를 도시한다. 자성유체가 존재하면 분포가 더 불량해진다.
<도 6>
도 6은 정렬된 SKBR3 세포를 보여주는 조합된 명시야, DAPI 및 PE의 이미지를 예시한다.
암 환자의 혈액 중 순환 종양 세포(CTC)는 질환 활성과 상관된 것으로 공지되어 있다. 셀트랙스 플랫폼은 질환 상태와의 상관성 및 계수를 위한 의심되는 표적 세포의 자기적 농축 및 이미지 분석을 제공한다. 표적, 예를 들어 세포, 세포 잔해, 및 세포 성분은 강자성 수집 구조체에 인접하여 후속적으로 정렬됨이 없이 용기의 수집 표면에 수집된다. 이들 세포는 백혈구 세포, 상피 기원의 세포, 내피 세포, 진균류 세포, 및 박테리아 세포를 포함한다. 수집 표면은 외부 자석에 의해 생성되는 경사 자계에 수직으로 배향된다. 생성된 이미지는 챔버의 광투과성 면 상에 사실상 균질하게 분포된 형태로 수집되는, 자기 나노입자 및 자기 표지된 생물 시편을 포함하는 한편, 선택되지 않은 실체(entity)는 유체 매질에서 아래에 남아있다.
희귀 세포 분석에서 셀트랙스 플랫폼 내로 시간 지연 적분법 (미국 특허 출원 제11/344757호)을 포함시키는 것을 이용하여 CTC를 신속하게 탐지 및 특성화한다. 표적 희귀 세포 (CTC)의 면역자기 분리는 EpCAM 양성 선별에 의해 달성된다. 상피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)에 대한 항원을 발현하는 순환 세포는 EpCAM 특이적 단클론 항체에 의해 선별되어 자기 나노입자에 공유 결합된다. 이 복합체는 자계에 노출될 때 나머지 혈액 구성성분으로부터 분리된다.
포획된 표적의 후속적인 분석은 상기 세포 내의 성분들의 일련의 형광 표지를 통하여 결정된다. 형광 염료 DAPI를 사용하여 CTC의 핵을 표지하고, CTC의 세포골격, 비-특이적 선별 백혈구는 사이토케라틴-PE로 그리고 백혈구는 CD45-APC로 표지된다. 표지된 세포는 자기적으로 조작되어 분석 표면을 따라 정렬한다. 그러나 이 시스템에서, 면역자기 분리로부터 남겨지는 미결합 자기 입자는 이미지 왜곡을 야기하여 CTC의 존재를 확인하는 능력을 감소시킬 것이다.
미시적 생물 샘플의 정성적 및 정량적 분석을 위한 표적 시편의 공간적 패턴화 수집을 제공하기 위하여, 본 발명은 이미지화 챔버의 내측 표면 상의 사전 성형된 구조체를 제조 및 사용하는 것에 관한 것이다. 일반적으로, 사전 성형된 홈은 긴 V형 홈이며, 이는 이미지화 챔버 상의 관측 표면의 내측 부분으로 사전 성형된다. 이들 구조체는 이전에 보고된 Ni 라인만큼 우수한 또는 그보다 훨씬 더 우수한 세포 정렬을 제공한다. 더욱이, 이들 구조체는 전체 세포의 이미지화에 광학적으로 적합한 고도로 투과성인 물질로 만들어진다.
도 1은 본 발명의 홈을 사용하여 세포를 정렬하는 원리를 도시한다. 챔버 내에서의 자기적으로 유도된 세포 이동은 경사 자장의 존재 하에 일어난다. 여기서, 자기적 표지 세포는 구조체의 경사진 표면(정렬 표면)과 충돌하여 홈(나타낸 이미지화 표면)의 상부 내로 활주하거나, 또는 상기 세포는 이미지화 표면의 상부를 직접 타격할 것이다. 어느 상황에서든, 상기 세포는 홈에서 정렬하여 후속적인 이미지화를 허용할 것이다.
홈의 경사진 표면을 따라 충분히 이동하는 것을 위하여, 상기 표면은 평탄해야 하며 세포는 벽에 점착되지 않아야 한다. 평활하고 정밀한 디자인을 성취하기 위하여, 공지된 웨이퍼 에칭 기술이 이용된다. 그러나, 비용 및 광학적 요건 때문에, 규소 웨이퍼는 적절하지 않으며, 오히려 폴리다이메틸실록산(PDMS) 복제 성형이 이들 요건을 충족시킬 구성물을 제공한다. 이들 기준을 충족시킬 구성물이 본 발명에서 또한 고려된다. 규소 웨이퍼 상에 에칭되는 구조체는 궁극적인 디자인의 역상이며, 규소 주형 상에 부어질 때 올바른 형상을 갖는 PDMS 주형을 제공한다. 경화 후, 이 형태는 이미지화 챔버의 유리 표면의 대체를 허용하는 치수로 절단된다.
에칭은 챔버의 제조에 사용될 수 있는 임의의 광투과성 물질 상에서 달성될 수 있다. 예로서, 규소 웨이퍼가 정밀도의 용이성, 미세한 디테일(fine detail), 및 용이한 재현성으로 인해 에칭에 사용될 수 있다. 유사한 특성을 갖는 그리고 당업계에 공지된 임의의 물질이 본 발명에서 고려된다. 구조체의 에칭에서는 두 가지 일반적인 에칭 기술이 사용된다. 첫째, 홈을 에칭하는 데 필요한 에칭 마스크가 생성된다. 이 마스크는 BHF(완충된 플루오르화수소산(Buffered Hydrofluoric acid)) 에칭을 사용하여 생성된다. 일단 BHF 에칭이 완료되면, 어떠한 홈도 에칭되지 않아야 하는 장소에 SiO2의 박층이 규소 웨이퍼 상에 남겨진다. 홈을 에칭하기 위하여 이방성 에칭이 또한 이용된다. 여기서, KOH가 에칭제로서 사용된다. 적절하게 배향된 웨이퍼에 이러한 공정이 적용될 때, V형 홈이 에칭되며, 이는 규소 웨이퍼의 결정면에 의해 제한된다. 따라서, 고도로 재현가능하고 일정한 에칭각이 생성된다. 70.5도로 도 1에 도시된 바와 같이 일 실시 형태에서 에칭각은 웨이퍼 배향에 의존적이다. 다른 기술로는 심도 반응성 이온 에칭(Deep Reactive Ion Etching, DRIE)이 있다. 이 기술을 이용함으로써 높은 종횡비 (구조체의 길이와 폭 사이의 비)를 갖는 구조체를 에칭하는 것이 가능해진다. DRIE는 에칭 단계와 침착 단계 사이에서 주기적으로 교번하여 가리비형(scalloped) 측벽을 형성한다.
제작된 웨이퍼 상에 양각(positive imprint)을 얻기 위하여 PDMS 성형이 이용된다. PDMS 또는 폴리다이메틸실록산 (다우 코닝(Dow Corning) (실가드(Sylgard) 184, 미국 미시간주 미들랜드 소재의 다우 코닝)은 Si(규소)와 O(산소) 사이에 실록산 결합을 함유하는 중합체이다. 이 중합체 분자는 평균 개수가 대략 50 내지 100개인 보다 긴 중합체를 형성하도록 함께 결합된다.
최종 PDMS는 가교결합제의 첨가에 의해 얻어진다. 가교결합제는 중합체들과 연결되어 중합체들의 긴 네트워크를 형성하며, 이는 투명한 탄성, 화학적 불활성, 열 안정성 물질을 생성한다. 중합 후, PDMS는 흡습성이 아니며 매우 적은 물질에 부착되는 투명한 가요성 물질을 형성하며, 따라서 PDMS가 매우 적은 물질에 부착된다는 사실로 인하여 측면에 세포가 점착되지 못하게 한다. 더욱이, PDMS는 대략 300 내지 900 ㎚에서 투과성을 가지며 열 안정성을 갖는다. 이들 특성은 가시광의 투과 및 형광 이미지화 시스템에서의 그의 사용에 모두 중요하다. 형성 후, 홈을 챔버의 관측면의 치수로 절단한다.
세포 손실을 최소로 하여 여분의 자기 입자 대부분을 제거하기 위하여, 도 1에 도시된 세포 정렬 구조체를 관측 표면에 대해 현상하였다. 도 1은 세포 정렬 구조체의 개관을 제공한다. 도 1에 도시된 PDMS 미세구조체는 소정의 영역에서 세포가 정렬되도록 그리고 이미지화 시간이 감소되도록 현상되었다. 상기 디자인은 폭이 80 um이고 길이가 30 ㎜인 6개의 채널을 포함하는 30×2.7 ㎟의 PDMS 칩으로 이루어진다. 이들 PDMS 칩은 웨이퍼 주형으로부터 각인된다. 본 출원인은 PDMS를 그의 탁월한 투과 특성, 복제 능력 및 사용의 용이성 때문에 선택하였다. 이러한 구성은 샘플의 이미지화 시간을 32분으로부터 12분으로 감소시킨다.
도 2는 본 발명에서 사용되는 구조체를 갖는 PDMS 각인의 주사 전자 현미경 사진을 예시한다. 이 사진은 관측 표면 상의 평활한 정렬 및 이미지화 표면을 보여준다.
도 3은 본 발명에서 사용되는 PDMS의 두께 부분의 투과 스펙트럼을 전형적인 현미경 유리 슬라이드와 비교한 것이다. 0.5 ㎜ 두께에서, PMMA는 현미경 유리 슬라이드의 400 ㎚ 내지 800 ㎚ 파장의 투과성을 추적한다.
과량의 콘쥬게이션된 자기 입자 (EpCAM-자성유체)가 최대 CTC 회수의 보장을 위하여 사용된다. 그러나, 이미지화 동안에, 여분의 자성유체가 이미지화 표면 상에 연장된 응집체를 형성하며, 이는 세포의 정량적 및 정성적 이미지화에 영향을 준다. 도 4는 이미지화에 대한 여분의 미결합 자기 입자의 영향을 예시한다. 총 핵 강도는 2 ug/ml 초과의 자성유체의 농도에 있어서 급격하게 강하되는 반면 (원), CV는 환자 샘플에서 보통 발견되는 농도, 예를 들어 40 ug/ml에 있어서 40%로 증가한다 (삼각형).
이미지화에 대한 여분의 자성유체의 영향 및 제거 방법의 결과가 도 5에 도시되어 있다. 40 ug/ml의 자성유체 농도 및 0 ug/ml의 자성유체를 이용하여 SKBR-3 세포를 이미지화하였다. 총 강도의 분포는 여분의 자성유체를 포함하는 샘플에 있어서 유의하게 더 불량해졌다.
본 발명은 이러한 쟁점을 피하며, 900 rpm에서 코니칼 튜브 내부의 샘플을 회전시키는 방법을 제공한다. 이는 튜브 내의 모든 세포를 강제로 바깥쪽으로 향하게 한다. 자성유체 입자는 훨씬 더 작으며 (직경이 대략 175 ㎚) 샘플 중에 랜덤하게 분포된 채 남아있다. 수분 후, 샘플 중 60%를 회전 튜브의 바닥으로부터 자동으로 흡인한다. 본 발명에서 이 공정을 5회 반복하고, 본 PDMS 구조체를 사용하여 관측 표면을 따라 SKBR-3 세포를 정렬시킨다. 도 6은 관측 표면을 따라 정렬된 포획된 SKBR-3 세포의 조합된 명시야, DAPI 및 PE의 이미지를 예시한다.
본 발명의 방법을 이용하면 여분의 자성유체 중 95% 내지 97%를 제거하여 환자 샘플에서의 최종 농도가 2 ug/ml 미만으로 내려가게 할 수 있다. 이는 여분의 자성유체를 충분히 제거하여 최적의 정량적 측정이 행해지게 하고 이미지의 품질이 상당히 개선되게 한다. 또한, 95% 내지 99%의 CTC의 회수율을 장담하였다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용한 자성유체의 제거는 최적의 정량적 측정에 충분한 여분의 자성유체의 제거를 제공한다. 이미지의 품질이 향상되며, 명시야 이미지화에 의해 개개의 CTC에 대한 추가적인 형태 데이터를 얻는 것이 가능해진다.
본 발명의 바람직한 실시 형태들 중 일부는 상기에 기재되었고 구체적으로 예시되었지만, 본 발명은 상기 실시 형태에 제한되는 것이 아니다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 본 발명에서 이루어질 수 있고, 향상의 전체 범주는 하기 특허청구범위에 기술된다.
Claims (8)
- 유체 매질에 현탁된 희귀 세포(rare cell)의 개선된 광학적 분석 방법으로서,
a. 혈액 샘플을 암을 가질 것으로 의심되는 환자로부터 얻는 단계;
b. 상기 혈액 샘플을 상피 세포의 표면 상의 EpCAM 항원에 특이적인 항체에 결합된 자성유체(ferrofluid) 입자와 혼합하는 단계;
c. 미결합 자성유체를 결합 자성유체로부터 제거하는 단계; 및
d. 관측 챔버에서 시간 지연 적분법(Time Delay Integration)을 이용하여 상기 혈액 샘플 중 자기 응답성(magnetically responsive) 성분을 관측하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 성분은 상기 챔버의 광투과성 면의 내부 표면 상에 상기 관측 표면을 따라 사전 형성된 정렬 구조 내에 균일하게 분포된, 유체 매질에 현탁된 희귀 세포의 개선된 광학적 분석 방법. - 제1항에 있어서, 상기 정렬 구조는 참호 형태의 홈(foxhole-shaped groove)인, 유체 매질에 현탁된 희귀 세포의 개선된 광학적 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정렬 구조는 이미지 관측 표면 및 정렬 표면을 갖는 홈을 포함하는, 유체 매질에 현탁된 희귀 세포의 개선된 광학적 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 이미지 관측 표면은 80 ㎛인, 유체 매질에 현탁된 희귀 세포의 개선된 광학적 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 미결합 자성유체를 제거하는 상기 단계는
a. 코니칼 튜브(conical tube)에서 자성유체 입자를 포함하는 상기 혈액 샘플을 900 rpm으로 회전시키는 단계;
b. 상기 샘플을 상기 코니칼 튜브의 바닥으로부터 흡인하는 단계; 및
c. 단계 (a) 및 단계 (b)를 5회 반복하는 단계를 포함하는, 유체 매질에 현탁된 희귀 세포의 개선된 광학적 분석 방법. - 제1항에 있어서, 상기 관측 단계는 상기 결합 상피 세포를 순환 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)로서 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 유체 매질에 현탁된 희귀 세포의 개선된 광학적 분석 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 확인 단계는
a. DAPI를 이용한 핵의 양성 제1 표지;
b. 사이토케라틴-PE를 이용한 세포골격(cytoskeleton)의 양성 제2 표지; 및
c. CD45-APC를 이용한 백혈구의 양성 제3 표지를 포함하는, 유체 매질에 현탁된 희귀 세포의 개선된 광학적 분석 방법. - 제7항에 있어서, 포획된 CTC의 명시야 조사 단계를 추가로 포함하는, 유체 매질에 현탁된 희귀 세포의 개선된 광학적 분석 방법.
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