KR20110008022A - 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물 및 이를 이용한 당뇨병의 치료방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물 및 이를 이용한 당뇨병의 치료방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카베올린-1을 유효성분을 함유하는 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물 및 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 치료방법 및 조성물에 의하여 당뇨환자 특히, 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨 환자의 근육조직의 카베올린 양을 증가시킴으로써 인슐린 민감성을 조절함으로서 당뇨병을 개선 및 치료 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물 및 이를 이용한 당뇨병의 치료방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨에서 인슐린 민감성의 조절자로서 카베올린-1의 용도에 관한 것이다.
당뇨병은 인슐린에 대한 의존성에 따라 1형 당뇨병과 2형 당뇨병으로 나뉜다. 당뇨병증 중 가장 많이 차지하는 인슐린 의존성 당뇨병인 1형 당뇨병은 주로 인슐린을 생성하는 췌장의 베타세포의 파괴에 의해서 인슐린을 생산하지 못하여 발병하며, 인슐린 저항성인 2형 당뇨병은 췌장에서 인슐린을 생성하는 능력은 정상이지만, 인슐린이 말초장기에서 작용을 하지 못하여 발병하는 것으로 알려져 있다(1).
근육은 글루코오즈와 지방산을 제거하는 주된 조직이고, 이 조직에서의 인슐린 저항성은 제 2형 당뇨가 시작되고 있음을 알려준다. 제 2형 당뇨는 노화 의존적인 질환이다. 즉, 제 2형 당뇨의 발병율은 노화가 됨에 따라 증가한다는 것을 의미한다 (2). 일반적으로, 당뇨병의 70-80％에 해당하는 대부분의 제 2형 당뇨는 당뇨가 진행될수록 비만의 형태를 보인다. 그러나 동양권 특히, 한국에서의 제 2형 당뇨는 20-30％ 만이 비만의 유형을 보이며, 대부분의 2형 당뇨 환자에서 비만하지 않은 유형의 형태를 보이는 특징이 있다(3).
한편, 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨의 발병에 있어서 노화의 역할에 대해서는 아직 정확하게 밝혀지지 않았으며, 이러한 이유 중에 하나로는 이에 적합한 당뇨 모델이 없기 때문이기도 하다.
일반적으로 당뇨의 연구에 있어서 주로 쥐와 같은 동물모델들이 임상실험에 사용되는데, 비만한 특징과 함께 당뇨현상이 젊었을 때 나타나는 특징을 보이는 ob/ob 마우스나 OLETF 쥐와 같은 기존의 동물 모델이 그 예이다(4, 5). 최근 미합중국 공개특허 US 2007/012487호는 C57BL/6 마우스와 DBA/2마우스를 교배하여 인간 2형 당뇨병의 동물모델을 개시하고 있어 노화 의존적인 제 2형 당뇨의 치료 및 개선 연구에 크게 기여할 것으로 기대된다.
카베올레는 카베올린이라고 불리는 21 내지 24 kDa의 구조적인 단백질을 포함하는 세포내의 50-100 nm 크기의 함입부이다 (6). 카베올린은 크게 카베올린-1, 카베올린-2, 카베올린-3의 세가지 종류가 주로 존재한다. 카베올린-1, 카베올린-2는 많은 종류의 세포에서 공통으로 발현하고 있고 세포막에서 헤테로 올리고머를 형성하는 반면, 카베올린-3는 근육조직 특이적으로 발현을 하고, 근섬유의 형성을 조절한다 (8). 최근, 카베올린-1이 특히 지방세포에서 글루코오즈의 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다 (9,10). 본 발명자들은 또한 카베올린-1이 노화의 형질에 중요한 역할을 하는 것을 보고하였고 (11, 12), 카베올린-1이 젊은 쥐의 조직에서보다 노화된 쥐의 조직에서 많이 발현되어 있음을 개시한바 있다 (13). 이러한 카베올린-1은 근육조직에서 또한 발현되는 것이 보고되었고 (14-16), 근육 조직 특이적으로 카베올린-1과 카베올린-3가 결합되어 있음이 발견되었다 (17). 본 발명자들은 근육조직에서의 카베올린-1과 카베올린-3의 기능적 중요성을 조사한 결과, 카베올린-3이 아닌 카베올린-1이 분화된 근육세포의 글루코오즈 흡수에 중요한 역할을 하고 있음을 발견하였다 (18).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허 및 논문이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 인용된 특허 문헌 및 논문의 개시내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 노화가 됨에 따라 제 2형 당뇨의 특징을 나타내는 C57BL/6 마우스와 DBA 마우스의 자손(이하, JYD 마우스라 한다)을 이용하여 인슐린 저항성에 대한 치료 및 개선 실험을 수행하던 중, 상기 동물모델의 근육조직에서 카베올린의 발현 양상이 정상 동물에 비해 특이적으로 낮은 것을 발견함으로써 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨의 발병 및 진행에 카베올린이 중요한 역할을 수행하는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명자들은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
또한 본 발명의 목적은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료방법을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 실시를 위한 형태, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자는 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨 모델인 JYD 마우스의 근육조직에서의 카베올린-1 발현 감소가 JYD 마우스의 당뇨현상을 발전시킴과 동시에 카베올린-1 발현에 의해 JYD 마우스의 인슐린 민감성을 조절할 수 있음을 확인하였다. 따라서 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨 환자에서 근육조직의 카베올린의 함량을 증가시켜 인슐린 민감성을 조절함으로서 당뇨병을 개선 및 치료하는 방법으로서 효과가 우수하다.
도1은 수컷 JYD 마우스의 혈중 글루코오즈 농도, 당뇨 발병율 및 몸무게를 측정한 그래프로서, A는 정상식이조건에서 혈액내 글루코오즈 농도의 평균값을, B는 당뇨 발병율을 C는 10 주 및 30 주의 몸무게를 측정한 결과이다. 이때 결과 값은 주령 대비 수컷 C57BL/6 (B6)와 DBA/2 (DBA) 마우스를 대조군으로 사용하였다. 수치는 평균 ± 표준오차로 표시하였으며, n = 45/그룹으로 실시하였으며. JYD 마우스와 비교하여 P ＜ 0.05인 것을 *로, P ＜ 0.01인 것을 **로 표시하였다.
도2는 수컷 JYD 마우스의 글루코오즈와 인슐린 내성을 측정한 그래프로서,
A,B는 글루코오즈 내성을 측정한 결과이고, C,D는 인슐린 내성을 측정한 결과이다. 이때 내성 측정시기(age)는 수컷 JYD의 10주 (A,C)와 30주 (B,D)에 시행하였으며, 주령 대비 수컷 C57BL/6 (B6)와 DBA/2 (DBA)를 대조군으로 사용하였다. 수치는 평균 ± 표준오차로 표시하였다. n = 6/그룹으로, 각 결과 값은 독립적인 세번의 실험을 평균하여 표시하였다. JYD 마우스와 비교하여 P ＜ 0.05은 *로, P ＜ 0.01인 것은 **로 표시하였다.
도3은 수컷 JYD 마우스의 체내 양전자 방사 단층촬영 이미지결과를 나타낸 것으로, 글루코오즈 흡수율은 18F-FDG PET로 측정하였다. A는 C57BL/6 (왼쪽), ob/ob (중앙), JYD (오른쪽) 마우스의 두개골을 가로 지르는 형태로 나타낸 것이며, B는 냉동시킨 마우스를 이용하여 각 조직 및 이에 해당되는 부분을 표시한 것이다. 이때, ％ID/g는 그램당 주입된 양을 백분율로 표시한 것이다.
도4는 JYD 마우스 근육에서 인슐린 관련 단백질들과 인산화된 단백질들의 발현양을 나타낸 것으로, A는 3, 10, 30주령의 수컷인 DBA/2, C57BL/6 및 JYD마우스의 근육조직을 분리하여 단백질 면역검출방법을 통해 인슐린 관련 단백질들의 발현양을 측정한 결과이다. 이때, 튜블린(Tubulin)은 같은 양의 단백질을 사용했다는 근거로서 실시되었다. B는 단백질 면역검출방법에서 나타난 단백질 양을 측정한 결과로서, 30주령의 단백질 양을 대조군으로 하여 3주령에서 증가량을 나타내었고, 그 양은 덴시토메트릭 분석기(densitometric analysis)를 이용하여 계산하였다. 각 막대그래프는 평균 ± 표준오차이며, 30주령의 발현양과 비교하여 P＜0.05인 것을 * 로 표시하였다. n=3/그룹. C는 30주령의 마우스에 인슐린을 처리한 그룹(+) (INS)과 처리하지 않은 그룹 (-)에서 근육조직의 인산화된 Akt (p-Akt)와 인산화된 IR (p-IRβ)를 단백질 면역 검출방법을 이용하여 나타낸 결과이다.
도 5는 근육조직과 그 외 인슐린에 민감한 조직의 카베올린 발현양을 나타낸 것으로, 마우스로부터 조직을 분리하여 단백질 면역검출방법을 이용하여 카베올린 발현양을 측정하였다. A는 3, 10, 30주령의 DBA/2, C57BL/6와 JYD에서 근육(Mus), 지방 (Adi), 췌장(Pan), 간 (Liv)을 분리하여 카베올린 -1(Cav-1) 과 카베올린-3 (Cav-3)의 발현양을 단백질 면역 검출방법을 이용하여 나타내었다. 이때 튜블린(Tubulin)은 같은 양의 단백질을 사용했다는 대조군으로 사용하였다. B는 JYD 마우스의 근육에서 단백질 면역검출방법의 양적인 측정 결과로서, 단백질 면역 검출 방법을 이용하여 3주의 양을 대조군으로 하여 30주령에서의 변화양은 덴시토메트릭 분석기 (densitometric analysis)로 측정하였다. 각각의 그래프는 평균 ± 표준오차를 의미하며, 3주의 발현양과 비교하여 P＜0.05인 것을 *로 표시하였다. n=3/group. C는 30주된 DBA/2 (D2), C57BL/6 (B6)와 JYD (JYD) 마우스의 근육 (Mus)과 지방조직 (Adi)에서 렙틴(leptin)과 마이오제닌(myogenin)의 mRNA양을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과로, GAPDH mRNA는 동일양이 RNA를 사용하였다는 것을 확인하기 위해 측정하였다. D는 30주된 DBA/2, C57BL/6, JYD 근육조직에서 마이오제닌(myogenin)과 카베올린-1을 면역조직학적 염색방법을 이용하여 측정한 것이다 (bar=100 μm). E는 JYD 마우스의 1세대 중 당뇨인 것과 당뇨가 나타나지 않은 마우스의 근육조직에서의 카베올린 발현양을 비교한 결과로서 D-M; 당뇨가 생긴 수컷마우스, ND-F; 당뇨가 생기지 않은 암컷마우스, ND-M; 당뇨가 생기지 않은 수컷마우스를 나타낸 것이다.
도 6은 shlenti-카베올린-1을 주입한 C57BL/6 마우스에서 글루코오즈 내성, 또는 인슐린 내성의 손상을 나타낸 결과로서, A는 쥐의 카베올린-1 cDNA (shlenti-cav-1) 와 대조군 바이러스 (shlenti-GFP)를 발현하는 렌티바이러스(lentivirus) 유전자 발현 수송체의 모식도를, B는 L6 세포에 렌티바이러스를 감염시킨 후 형광현미경을 통해서 관찰한 결과를, C는 L6 세포에서 바이러스를 이용한 형질 변환 후, 카베올린-1 단백질 발현양을 단백질 면역검출방법을 이용하여 나타낸 결과를 나타낸 것이다. 이때, 액틴은 같은 양의 단백질을 사용했다는 대조군으로 사용하였다. D는 Shlenti-GFP 와 shlenti-cav-1 바이러스가 감염된 근육세포를 계면활성제(detergent)없이 균질화하여 잘게 부순 후에 슈크로즈 농도 구배 프랙션을 시행하였다(카베올레 부분(cav), 비카베올레 부분(N-C)). 카베올린-1 발현양은 단백질 면역 검출방법으로 관찰하였고, 플로틸린(flotillin) 단백질 발현양은 세포막의 지질 층(lipid raft)의 표지로 사용하였다. E는 30주령의 C57BL/6 다리 근육에 shlenti-cav-1과 shlenti-GFP (3×107 MOI)를 주입 후, 면역조직학적 염색방법으로 카베올린-1 발현양을 측정하였다. F는 글루코오즈 내성실험을, G는 인슐린 내성실험을 실시한 결과를 나타낸 그래프이며, 각 내성 실험은 shlenti-GFP와 shlenti-cav-1 바이러스를 주입 후 2주 후에 시행하였다. 표시된 시간은 글루코오즈 (F) 혹은 인슐린 (G) 주입 후의 시간 (분)을 나타내며, 수치는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. shlenti-GFP와 비교하여 P ＜ 0.05 인것을 * 로 표시하였다. n=5/그룹.
도 7은 아데노바이러스 카베올린-1 수송체의 제작 및 분석에 관한 결과를 나타낸 것으로, A는 쥐의 카베올린-1 cDNA (Ade-cav-1)과 대조군 수송체(Ade-GFP)를 발현하는 아데노바이러스 유전자의 모식도를 나타낸 것이고, B는 감염된 L6 세포를 형광현미경으로 관찰한 사진이다. C는 면역검출방법을 이용하여 유전자형질변환 후 L6 세포에서 카베올린-1 단백질 발현양을 측정하였다. 이때 액틴의 발현양을 단백질 발현의 대조군으로 사용하였다. D는 Ade-GFP와 Ade-cav-1 바이러스가 감염된 근육세포를 계면활성제(detergent)없이 균질화하여 슈크로즈 농도 구배 프랙션(프랙션 1-12)을 시행하였다(카베올레 부분(cav), 비카베올레 부분(N-C)). 단백질 면역검출방법을 이용하여 카베올린-1 발현양을 나타내었고; 플로틸린(flotillin) 단백질 발현양은 세포막의 지질 층(lipid raft)의 표지로 사용하였다. E는 Ade-GFP를 근육에 주입 (IM) 한 후 3일 후에 희생시켜 GFP 단백질 발현양을 측정한 결과로, GFP 단백질은 근육 (Mus), 지방 (Adi), 간 (Liv)에서 단백질 면역검색방법으로 조사하였다. Ade-GFP의 꼬리정맥 주입 (IV)은 대조군으로 사용하였다. 튜블린 발현양은 단백질 발현양의 대조군으로 사용하였다. 이때, CON(대조군)은 마우스의 근육에 식염수를 주입한 것을 의미한다. F는 30주령의 JYD 마우스의 다리근육에 Ade-cav-1, 또는 Ade-GFP (3×1011 PFU)를 주입한 후 카베올린-1 단백질 발현양을 면역 조직학적 방법으로 확인한 결과이다.
도 8은 JYD 마우스에 Ade-카베올린-1을 주입한 후 글루코오즈와 인슐린 내성의 촉진효과를 나타낸 결과로서, 아데노바이러스를 주입 후 3일 후에 18시간동안 마우스를 금식시킨 후 글루코오즈 내성 실험 (A)과 인슐린 민감성 실험 (B)를 시행하였다. 이때 시간은 글루코오즈 혹은 인슐린 주입 후의 시간(분)을 표시한 것이며, 결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었다. Ade-GFP와 비교하여 P ＜ 0.05 인 것을 *로 나타내었다. n = 6/그룹. C는 대조군 (Ade-GFP, 왼쪽) 또는 caveolin-1 (Ade-Cav-1, 오른쪽)를 주입한 마우스의 근육부분의 유전형질 변화의 효율성을 측정한 결과를 나타낸 사진으로, 형광 강도는 p(수소)/sec(초)/cm2 (넓이)/sr(단위면적)로 표시하였다. D는 글루코오즈 흡수정도를 18F를 이용한 양전사 방사단층촬영으로 측정한 결과이다. 이때, 빨간색은 글루코오즈가 높게 흡수된 것을, 검은색은 낮게 흡수된 것을 나타낸다. 이미지는 Ade-GFP 또는 Ade-cav-1 주입한 JYD 마우스의 횡단면을 나타내었다.
발명의 실시를 위한 형태
본 발명은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 제 2형 당뇨병 모델마우스인 JYD를 이용하여 노화 의존적이고 비만하지 않은 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물을 제시하고 있다.
이를 본 발명의 구현예를 참조하여 보다 구체적으로 살펴보면, 상기 제 2형 당뇨병 모델마우스인 JYD를 이용하여 1)글루코오즈 내성 및 2)인슐린 내성 실험을 실시하였고, 양전자 방사 단층촬영을 이용한 3)글루코오즈 흡수율을 측정한다. 상기 측정한 수치는 제 2형 당뇨병 소인의 대조 수치로 기록하여 둔다. 또한 상기 제 2형 당뇨병의 소인을 보이는 JYD 마우스 및 대조군 마우스의 근육조직에서 면역검출 방법을 이용하여 4)카베올린의 발현정도를 측정한 후 본 발명의 카베올린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여한 후 상기 글루코오즈 및 인슐린 내성, 글루코오즈 흡수율, 카베올린의 발현정도 또는 함량을 측정하여 당뇨의 치료정도를 파악할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 카베올린은 카베올린-1, 카베올린-2 및 카베올린-3이며, 바람직하게는 카베올린-1이다. 또한 카베올린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 단백질 또는 DNA 및 RNA와 같은 유전자 형태 중 어떤 형태로도 포함될 수 있으며, 바람직하게는 유전자 형태로 포함된다. 상기 유효성분을 코딩하는 유전자 형태로 포함될 경우 상기 유전자 담체와 함께 포함될 수 있다.
한편, 유전자 형태로 카베올린을 포함할 경우, 카베올린 유전자를 동물 세포내로 안전하게 운반하고, 이를 세포 내에서 발현시키는 진핵세포용 발현벡터는 동물을 숙주로 하는 바이러스의 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 RNA 바이러스 수송체내에 카베올린이 수송되거나 아데노바이러스 수송체 내에 카베올린이 수송될 수도 있으며, 바람직하게는 짧은 헤어핀의 형태의 RNA 렌티바이러스성 수송체, 아데노바이러스 수송체로 수송될 수 있다. 투여되는 방법으로는 카베올린 유전자를 포함하는 발현벡터의 동물세포 내로의 도입 및 발현된 단백질의 동물세포내로의 투여방법이 있으며, 카베올린 유전자를 포함하는 발현벡터의 동물세포 내로의 도입방법으로는 미세주입법(참조: Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 공동-침전법(참조: Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)) 및 리포좀 이용법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)) 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 1)짧은 헤어핀의 형태의 RNA 바이러스 수송체내에 카베올린이 수송되는 경우는 카베올린 유전자를 목표로 한 짧은 헤어핀구조의 RNA 렌티바이러스 수송체 (shlenti-cav-1)에 넣어 제작하고, U6 프로모터 로부터 shRNA를 생산하여 IRES 시스템으로부터 GFP 단백질을 발현하도록 제작한다. 세포상에서 형질도입된 효율을 조사하기 위하여 L6 세포에 렌티바이러스 수송체를 감염시키고, 형질 변환된 세포의 GFP 발현은 형광현미경과 단백질 면역 검출방법을 이용하여 조사한다. 이때 만들어진 RNA 바이러스 수송체-카베올린은 당뇨가 생긴 JYD 마우스 근육에 감염시킨 후 생체내에 형질도입된 효율을 분석한다; 2)아데노바이러스 수송체 내에 카베올린이 수송되는 경우는 감염성 재조합 아데노바이러스는 AdEasy 방법을 이용하여 만든 다음 카베올린이 발현되는 재조합 아데노바이러스를 셔틀플라스미드에 넣어 제작하고, 상동성 재배열은 이 셔틀 수송체를 가진 E. coli BJ5183에서 만든다. 재조합된 바이러스들은 가나마이신을 이용하여 선택한 후, 제한효소에 의한 절단을 시행하고 HEK293 세포에서 선형화된 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 감염시킨 후 아데노바이러스를 생산한다. 생산된 아데노바이러스는 일반적인 바이러스 증폭 방법에 따라 증폭 및 분리한 후에 당뇨가 생긴 JYD 마우스 근육에 감염시킨 후 생체 내에 형질도입된 효율은 면역조직학적 염색방법 등으로 확인한다.
본 발명의 당뇨병 치료 및 개선용 조성물의 치료대상은 당뇨병이 나타나는 모든 포유동물이며, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 당뇨병은 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 젊은이에서 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병 및 췌장 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 제 2형 당뇨병이며, 가장 바람직하게는 노화 의존적이며 비만하지 않는 제 2형 당뇨병이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기 위해서 적정량의 염 및 PH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다. 본 발명의 유효성분이 효과적으로 작용하게하기 위해서 미량의 효소를 추가적으로 포함할 수도 있다. 또한 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료 및 개선 방법에 관한 것이다.
본 발명의 당뇨병 치료 및 개선 방법은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 치료대상에 투여하여 당뇨병이 치료 및 개선되는 효과가 탁월하므로, 상기 당뇨병 치료 및 개선용 조성물에서 언급한 사항들과 거의 동일하다.
따라서 상기 당뇨병 치료 대상은 당뇨병이 나타나는 모든 포유동물이며, 바람직하게는 인간이다. 또한 카베올린은 단백질 또는 이를 코딩하는 DNA 및 RNA와 같은 유전자 형태 중 어떤 형태로도 투여될 수 있으며, 바람직하게는 유전자 형태이며, 가장 바람직하게는 DNA 형태이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 카베올린은 카베올린-1, 카베올린-2 및 카베올린-3이며, 바람직하게는 카베올린-1이다. 상기 유효성분이 단백질형태로 투여될 경우 단백질 분해효소에 의해 절단되는 것을 보호하기위해서 캡슐의 형태로 투여될 수도 있다. 또한 상기 유효성분의 Pre-형태인 Pre-단백질의 형태로 투여될 수도 있다. 또한 상기 유효성분을 코딩하는 유전자 형태로 투여될 경우 상기 유전자 담체와 함께 투여될 수 도 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, RNA 바이러스 수송체내에 카베올린이 수송되거나 아데노바이러스 수송체 내에 카베올린이 수송될 수도 있으며, 바람직하게는 짧은 헤어핀의 형태의 RNA 렌티바이러스성 수송체, 아데노바이러스 수송체로 수송되어 인체내에서 DNA 또는 단백질을 발현하여 단백질 치료효과 및 개선효과를 나타낸다.
본 발명의 당뇨병은 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 젊은이에서 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병 및 췌장 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 제 2형 당뇨병이며, 가장 바람직하게는 노화 의존적이며 비만하지 않는 제 2형 당뇨병이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기 위해서 적정량의 염 및 PH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다. 본 발명의 유효성분이 효과적으로 작용하게하기 위해서 미량의 효소를 추가적으로 포함하여 투여할 수도 있다. 또한 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물에 단백질이 포함되는 경우, 본 발명의 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이에는 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물의 모든 투여경로로 투여할 수 있다. 상세하게는 경피, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 내 주입, 근육조직 내 주입 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 근육 내 주입으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 약제학적 조성물의 투여방법을 적용할 수 있으며, 이에 따라 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기 위해서 적정량의 염 및 PH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다.
본 발명은 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료 방법은 상기 당뇨병 치료 및 개선 방법에 의해 관련 질환의 치료 및 예방 효과가 있는 것임으로 상기 당뇨병 치료 및 개선 방법에서 언급한 사항들과 거의 동일하다.
본 발명의 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료 방법은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 대상에 투여하는 방법으로, 상기 당뇨병 관련질환으로는 고혈당증(hyperglycemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 내당능 이상(impaired glucose tolerance), 공복혈당장애(impaired fasting glucose), 지질대사이상(dyslipidemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia) 및 인슐린 저항(insulin resistance)등이 있다. 또한 예방 및 치료 대상은 당뇨병 관련 질환이 나타나는 모든 포유동물이며, 바람직하게는 인간이다.
또한 본 발명은 카베올린의 함량을 측정하는 것을 포함하는 포유동물에서 제 2형 당뇨병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 당뇨병 소견이 있는 포유동물 환자의 근육조직에서 카베올린의 함량이 당뇨병 소견이 전혀 없는 정상포유동물에 비해 상당히 감소함을 확인하였고, 이러한 결과를 바탕으로 카베올린의 함량을 분석하여 제 2형 당뇨병을 진단 할 수 있다. 예컨대, 포유동물의 근육조직으로부터 카베올린의 mRNA 함량 및 단백질의 함량을 측정하여 당뇨병 소견이 없는 정상 대조군의 mRNA 함량 및 단백질의 함량과 비교하여 당뇨병의 여부를 진단 할 수 있다.
여기에서, 카베올린 함량은 카베올린의 DNA, RNA 또는 단백질의 함량을 측정하는 것을 의미하며, 바람직하게는 카베올린의 RNA 또는 단백질을, 더욱 바람직하게는 카베올린의 mRNA 또는 단백질의 함량을 측정하는 것을 의미하며, 가장 바람직하게는 단백질의 함량을 측정하는 것을 의미한다. 이때 상기 RNA 함량은 종래 일반적으로 실시되는 어떤 방법으로도 측정가능하나, 바람직하게는 노던 블랏팅, 면역화학염색법(immunohistochemistry)등에 의해 측정될 수 있으며, 상기 단백질의 함량은 종래 일반적으로 실시되는 항원항체 결합반응을 포함하는 어떤 방법으로도 측정가능하나, 바람직하게는 통상의 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), SDS-폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블랏, 면역 블랏 분석 또는 면역화학염색법(immunohistochemistry)등에 의해 측정될 수 있으며, 바람직하게는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), SDS-폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블랏, 면역 블랏 분석 또는 면역화학염색법(immunohistochemistry)이다. 또한 상기 측정된 카베올린의 함량은 정량적인 방법으로 분석할 수 있으며, 이러한 방법에 의하는 경우에는 PAGE 및 블랏팅을 실시함 다음, 발색된 밴드, 사진 또는 필름의 밴드 또는 영역을 덴시토미터(densitometor)로 읽어 그 차이를 정량화할 수 있다.
한편, 본 발명의 당뇨병 진단방법에 있어서, 카베올린의 함량은 바람직하게는 카베올린-1의 함량을 측정하는 것이며, 포유동물의 근육조직으로부터 분리한 세포 또는 조직의 카베올린 함량을 측정하는 것이다. 이때 바람직한 실시예에서 정량화된 카베올린 함량, 특히 카베올린의 단백질 함량이 당뇨병 소견이 없는 정상대조군이 비해 20％ 및 그 이상 감소할 경우 당뇨병 소견으로 진단할 수 있으며, 바람직하게는 50％ 및 그이상, 가장 바람직하게는 80％ 및 그이상이다.
또한 본 발명의 다른 측면에 의하면, 카베올린의 함량을 측정하는 것을 포함하는 포유동물에서 제 2형 당뇨병을 진단하는 키트를 제시할 수 있다.
본 발명의 진단키트는 상기 카베올린의 함량을 측정하는 것을 포함하는 당뇨병 진단방법을 기초로 하여 발명된 것으로서, 상기 당뇨병을 진단하는 방법에 따르는 내용을 모두 포함한다. 따라서, 본 발명의 진단키트에는 포유동물의 근육조직에서 카베올린-1의 함량을 측정하는 것을 포함한다. 바람직하게는 포유동물의 근육조직에서 카베올린-1의 함량을 측정하여 당뇨병 소견이 없는 정상 대조군과 비교하는 것을 포함한다.
다시 말해서 본 발명의 진단키트는 카베올린-1에 대한 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액, 효소반응 정지 용액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 진단키트에는 대조군과의 비교를 위하여, 대조군 카베올린-1 항원 또는 당뇨 소견이 전혀 없는 정상 포유동물의 근육조직으로부터 분리한 카베올린-1 단백질을 더 포함할 수 있다.
상기 키트를 이용하여 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), SDS-폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블랏, 면역 블랏 분석 또는 면역조직화학염색법(Immnohistochemistry)와 같은 통상의 단백질 함량을 측정방법을 수행 할 수 있으며, 상기의 측정법에 의해 측정된 카베올린-1의 함량을 대조군과 비교하여 제 2형 당뇨병을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 요지가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
＜ 실시예 ＞
1. 노화 의존적이고 비만하지 않는 제2형 당뇨 모델쥐의 제작
C57BL/6와 DBA/2 마우스는 찰스 리버 연구소(Charles River Laboratiry, Wilmington, MA)로부터, ob/ob 마우스는 잭슨 연구소(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였고, 노화 의존적이고 비만하지 않는 제2형 당뇨 모델쥐를 제작하기 위하여 미합중국 공개특허 US 2007/012487호에서 개시된 방법에 따라 암컷 C57BL/6 마우스와 수컷 DBA/2 마우스를 교배하여 1세대 마우스를 얻었으며, 상기 마우스를 JYD마우스라 칭하였다.
JYD 마우스는 특별한 실험을 제외하고 정상 식이를 했으며, 12시간의 낮과 밤의 주기를 유지하였다. 몸무게와 혈중 글루코오즈 수준은 10, 30주령에 각각 측정하였다. 혈액 내 글루코오즈 농도가 250 mg/dl 이상인 동물을 당뇨현상이 생긴 것으로 간주하였다. 당뇨병증이 나타나지 않은 대조군으로는 같은 주령의 C57BL/6와 DBA 마우스를 이용하였다. 동물의 사용과 마취에 사용된 모든 실험방법은 캘거리 대학(캐나다 소재)과 서울대학교 의과대학(대한민국 소재)의 실험동물부에서 승인을 받은 방법으로 수행하다.
2. 세포 배양 방법
쥐에서 유래된 근육세포주인 L6는 ATCC (Manassas, VA) 에서 구입하였고 10％ FBS와 100U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12에서 유지하였다.
3. 글루코오즈 내성 및 인슐린 내성 실험
글루코오즈 내성 실험을 위해 마우스는 16시간동안 금식시킨 후에 글루코오즈 (2 g/kg 몸무게, 피하주사)를 주입하였다. 글루코오즈 주입 후 0, 15, 30, 60, 120분 후에 꼬리 정맥혈을 채취한 후 글루코미터 (One Touch, Lifescan, Milpitas, CA)를 사용하여 혈중 글루코오즈 농도를 측정하였다. 인슐린 내성 실험을 위해 금식시킨 마우스는 인슐린 (1 U/kg 몸무게, 피하주사; Humilin, Lilly, Indianapolis, IN)을 주입하였고, 글루코오즈 주입후 0, 15, 30, 60, 120분 후에 꼬리 정맥혈의 글루코오즈 농도를 측정하였다).
4. 양전자 방사 단층촬영을 이용한 글루코오즈 흡수율 측정
양전자 방사 단층촬영(positron emission tomograph)은 소동물 PET 기계(microPET-R4, Concorde Microsystems Inc., Knoxville, TN)를 이용하여 측정하였다. 마우스는 18-20 시간동안 금식하였고, 방사성 18F-플로로디옥시글루코오즈 (FDG; 7.4 MBq [200 μCi] in 0.1 ml; KIRAMS, Seoul, Korea)를 꼬리 정맥을 통하여 주입하였다. 전반적인 체내 PET 영상은 18F-FDG를 주입하고 1시간 후에 시작하여 30분 동안 진행하였다. 마우스는 이소플루란(0.5％ in 100％ oxygen)을 이용하여 마취를 유지하였고, 실험을 진행하는 동안 30℃의 예열된 패드 위에 올려놓고 실험을 진행하였다.
PET 결과는 히스토그램과 Fourier rebinning(FRB)를 이용하여 2-차원적 초음파검사로 변형하였고, 예상 최대화 알고리즘(expectation maximization algorithm)을 이용한 단층촬영 결과로 재구성하였다. 재구성된 PET 이미지는 그램당 주입된 양의 백분율 이미지로 바꾸었다. 이때 ％ID/g는 (count per pixel * cross calibration factor) /injected dose를 나타낸 것이며, 이때 1 ml는 1 g으로 계산하였다.
5. 단백질 면역 검출 실험
3주, 10주 및 30주령의 DBA/2, C57BL/6, JYD 마우스를 CO2 가스를 이용하여 희생시켰다. 다리의 근육과 다른 조직들을 재빨리 분리하여 액체질소에서 급속 냉동을 시켰고, - 70℃에 보관하였다. 생체내 IRβ 와 Akt/PKB 인산화 정도를 측정하기 위해 마우스를 16시간 동안 금식시키고, 인슐린을 (1U/kg 몸무게, 피하주사)을 주입하였다. 30분 후 근육 조직을 빠르게 분리하여 액체질소에 보관하였다. 분리한 조직들 (10- 30 mg)은 액체질소를 이용하여 잘게 부순 후, 단백질 분해효소 저해제가 포함된 1％ SDS buffer (1％ SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1mM 페닐메틸술포닐프로라이드)를 이용하여 용해한다. L6 세포는 1％ SDS가 포함된 용해용 완충용액을 이용하여 용해한다. 단백질 농도를 맞춘 후, SDS-PAGE에서 분리하고 니트로셀룰로오즈막 (Schleicher ＆ Schuell Bioscence lnc., NJ)에 옮겨서 1차 항체를 다음과 같이 반응을 시켰다; anti-IRβ 항체 (Upstate, Lake Placid, NY), anti-IRS 항체 (Upstate), anti-tubulin 및 anti-GLUT-4 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), anti-Akt/PKB 항체 (New England BioLabs, Ipswich, MA), anti-PPARγ (New England BioLabs), anti-caveolin-1 항체 및 anti-caveolin-3 항체 (BD Transduction, Palo Alto, CA), anti-phospho-IRB 항체 및 phospho-Akt/PKB 항체 (Cell signaling technology, Berverly, MA) 및 항 플로틸린(anti-flotillin) 항체 (BD Transduction).
니트로셀룰로오즈 막을 씻은 후 1시간 동안 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈-컨쥬게이트화 된 2차 항원 (Zymed, San Francisco, CA)을 반응시킨다. 면역방법에 의해 결합된 단백질은 ECL(enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블랏 검침 키트(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 확인하였다. 각 밴드의 양은 노출된 필름을 덴시토메트릭 스캐닝을 통해 측정하였다.
6. RT-PCR 방법을 통한 mRNA 측정
RNA는 트리졸 용액(Sigma, St.Louys, MO)를 사용하여 근육조직과 지방조직에서 분리하였고, 역전사 반응은 2 μg의 RNA를 사용하였다. 각각의 단일가닥 cDNA는 마이오제닌과 렙틴에 특이적인 프라이머(primer)(마이오제닌; 순방향 (sense), 5'-AGC GGC TGC CTA AAG TGG AGA T 역방향 (antisense), 5'-GGA CGT AAG GGA GTG CAG ATT GTG) (렙틴; 순방향 (sense), 5'-CCT GTG GCT TTG GTC CTA TCT G; 역방향 (antisense), 5'-AGG CAA GCT GGT GAG GAT CTG)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시켰다. 마이오제닌 cDNA는 94℃에서 5분간 변성 반응 후, 94℃ 에서 30 초, 60℃에서 30 초, and 72℃에서 30 초를 30 회 반복하여 신장반응을 시켜 72℃에서 5분간 종결반응을 한 후 266 bp의 PCR 결과물을 확인하였다. 렙틴 (leptin) cDNA는 94℃에서 5분간 변성 반응 후, 94℃ 에서 30 초, 61℃에서 30 초, and 72℃ 에서 30 초를 30 회 반복하여 신장반응을 시켜 72℃에서 5분간 종결반응을 한 후 244 bp의 PCR 결과물을 확인하였다. PCR 결과물은 1.2 ％ 아가로오즈 젤에서 EtBr (ethidium bromide)로 가시화하여 전기영동을 이용하여 분리하였다.
7. 면역조직학적 염색
근육조직은 분리하여 Tissue-Tek (Sakura, Netherland) 용액에 고정한 후 저온유지장치 에서 4 μm 두께로 잘라, H ＆ E (hematoxylin-eosin )과 면역조직학적 염색을 위해 슬라이드 글라스에 올려놓는다. 조직내의 페록시다아제 (peroxidase )를 제거하기 위하여 3.0％ H2O2에서 배양 한 후 TBS 버퍼 (0.05 M, pH 7.6)에서 씻어낸다. 슬라이드는 상온에서 5％ 탈지분유 용액에서 1시간동안 반응시킨 후 카베올린-1 항체 (BD transduction, 1:100)와 마이오제닌 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., 1:100)를 4℃에서 하룻밤 반응시킨다. LSAB 키트(DAKO, Denmark)를 사용하여 아비딘- 비오틴 퍼록시다제 콤플렉스 방법으로 염색하였고, 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 대비염색을 하였다. 이 후 슬라이드를 에탄올로 탈수화 시키고, 자일렌으로 씻어낸 후 퍼마운트로 고정시켰다.
8. 카베올레 추출 및 분리
카베올레는 송 등의(8) 방법으로 계면활성제 없이 분리하였다. 간단히 설명하자면, 바이러스가 감염된 근육세포 (L6)를 차가운 PBS로 씻어낸 후 1ml의 0.5 M NaCO3, pH 11.0 buffer로 긁어내어 균질화한다. 균질화된 세포를 MES buffer (25 mM MES, pH 6.5, 0.15 M NaCl)에 녹인 80％ 슈크로즈 용액에 같은 용량으로 넣은 후 섞어서 초원심분리 튜브에 넣고 0.25 M Na2CO3가 포함된 4 ml 30 ％ 슈크로즈 (MES에 녹임)와 4 ml 5 ％ 슈크로즈 (MES에 녹임)를 위에 넣었다. SW41 로터 (Beckman, Fullerton, CA)를 이용하여 39,000 rpm 에서 18시간동안 원심분리 시켰다. 위쪽으로부터 12 구획을 수집하였고, 카베올린 단백질이 발현하는 구획을 카베올레 부분으로, 카베올린 단백질이 발현하지 않는 구획은 비카베올레 부분으로 사용하였다.
9. 짧은 헤어핀 lenti-카베올린-1 바이러스 수송체의 제작 및 분석
카베올린-1 유전자를 목표로 한 짧은 헤어핀구조의 RNA 렌티바이러스 수송체 (shlenti-cav-1)는 shLenti1.1-렌티바이러스성 수송체 (Macrogen, Seoul, Korea)의 EcoR I- Xba I 제한효소 부분에 두 가닥의 올리고 뉴클레오티드 (5'-CGGAATTCCATCTACAAGCCCAACAACttcgGTTGTTGGGCTTGTAGATGTTTTTGATATCTAGACA-3')(상기서열에서 소문자, 밑줄은 상보적인 서열이 없는 헤어핀루프의 루프에 해당하는 부분임)를 넣어 제작하였다. shLenti1.1-렌티바이러스성 수송체는 U6 프로모터 로부터 shRNA를 생산하여 IRES 시스템으로부터 GFP 단백질을 발현하도록 제작하였다. 대조군 수송체로서 (shlenti-GFP) 다음의 올리고뉴클레오티드(5'-AATCGCATAGCGTATGCCGTT-3')를 위와 같이 shLenti1.1-렌티바이러스성 수송체에 넣었다. 세포상에서 형질도입된 효율을 조사하기 위하여 L6 세포에 렌티바이러스 수송체를 (3× 105 MOI)로 감염시켰다. 형질 변환된 세포의 GFP 발현은 형광현미경과 단백질 면역 검출방법을 이용하여 조사하였다.
Shlenti-카베올린-1과 shlenti-GFP 수송체 (3× 107 MOI)를 30주령의 C57BL/6 마우스의 다리 근육에 주입하였다. 생체내 형질이 도입된 효율을 알아보기 위해 근육 조직을 4 μm 두께로 조각을 내어 면역조직학적 염색을 시도하였다.
10. 아데노바이러스 성 카베올린-1 수송체의 제작 및 분석
감염성 재조합 아데노바이러스는 AdEasy 방법을 이용하여 만들었다 (20). 카베올린-1이 발현되는 재조합 아데노바이러스 (Ade-cav-1)는 야생형(wild-type) caveolin-1 cDNA를 셔틀플라스미드 (pAdTRACK-CMV; Invitrogen)에 넣어 제작하였고, 상동성 재배열은 이 셔틀 수송체를 가진 E. coli BJ5183에서 만들었다. 재조합된 바이러스들은 가나마이신을 이용하여 선택한 후, 제한효소에 의한 절단을 시행하였다. HEK293 세포에서 선형화된 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 감염시킨 후 아데노바이러스를 생산하였다.
15cm 플레이트에서 HEK 293 세포를 불린 후 BD Adeno-X 정제키트 (Clontech, Palo Alto, CA)로 순수 정제하였다. 대조군 수송체 (Ade-GFP)는 위에서 언급된 그린 형광 단백질을 가진 cDNA를 이용하여 생산하였다. Ade-카베올린-1과 Ade-GFP의 효율은 GFP 발현양과 단백질 면역검출 방법으로 조사하였다.
30주가 되어 당뇨가 생긴 JYD 마우스 근육에 Ade-GFP와 Ade-cav-1 (3 × 1011 PFU/mouse)를 감염시켰다. 생체 내에 형질도입된 효율은 면역조직학적 염색방법과 IVIS 이미지화 시스템 100 시리즈(Xenogen, Alameda, CA)를 이용하여 생체내 형광 이미지로 확인하였다 (21).
11. 통계처리
모든 실험결과들은 평균 ±±준오차로 나타내었다. 통계분석은 1차 팩토리얼(1-xay factorial) ANOVA를 이용하였고 쌍 비교(pair-wise comparisons)는 피셔의 최소유효차(Fisher's least significant differences)로 평가하였다.
통계적 유의성은 P＜0.05로 가정하였다.
＜ 실험결과 ＞
1. JYD 마우스의 제2형 당뇨모델로서의 타당성
JYD 마우스의 당뇨가 생기는 현상을 확인하기 위하여, 우리는 수컷 JYD 마우스와 모체인 수컷 C57BL/6와 DBA/2 마우스의 혈액내 글루코오즈 수준을 비교하였다. 10주령의 수컷 JYD 마우스의 평균 혈중 글루코오즈 농도(182.8 mg/dl)는 대조군인 수컷 C57BL/6 (163.0 mg/dl)와 DBA/2 (151.3 mg/dl) 마우스에 비해 유의적으로 높았다. 30주령의 수컷 JYD 마우스의 혈중 글루코오즈 농도는 10주령에 비해서도 유의적으로 높았다 (도1A). 혈액의 글루코오즈 농도가 250mg/dl이상인 것을 당뇨증상이 생긴 것으로 간주하였다 (22). 30주령의 수컷 JYD 마우스 당뇨 발병율(51％, 24/47)은 같은 시기의 수컷 C57BL/6와 DBA/2 마우스(8.7％, 4/46과 2.2％, 1/46, 도1B)와 비교하여 유의적으로 높았다. 10주령의 수컷 JYD의 당뇨 발병율은 10.6％를 보인 반면, 같은 시기의 수컷 C57BL/6와 DBA/2 마우스나 (도1B), 암컷 JYD에서는 (결과는 나타내지 않음) 당뇨가 생기지 않음을 확인하였다. 10주령의 수컷 JYD의 몸무게는 같은 시기의 수컷 C57BL/6나 DBA/2 마우스보다 유의적으로 높게 나타났으나 30주령에는 유의적으로 차이가 나지 않음을 확인하였다 (도1C). 암컷 JYD 마우스는 모든 시기에 혈액내 글루코오즈 농도나 몸무게가 정상임을 확인하였다 (결과는 나타내지 않음).
2. 글루코오즈와 인슐린 내성 측정
우리는 각각 10주와 30주령에 수컷 JYD 마우스의 글루코오즈 내성실험을 시행하였다. 10주령의 JYD 마우스에서 글루코오즈 주입 15분 후 혈액내 글루코오즈 농도가 최대를 이루었고, 실험을 수행하는 모든 지점에서 수컷 C57BL/6와 DBA2마우스와 비교하여 유의적으로 높게 나타났다 (도2A). 30주령의 수컷 JYD 마우스는 10주령에 비해 글루코오즈 저항성에 좀 더 심각한 손상이 온 것을 관찰하였다. 수컷 C57BL/6 또한 30주령에 글루코오즈 저항성에 손상이 있는 것을 발견한 반면, 수컷 DBA/2는 외부의 글루코오즈를 정상적으로 제거하는 것을 관찰하였다 (도2B). 또한 수컷 JYD 마우스가 인슐린 민감성에도 문제가 있는지 확인하기 위하여 인슐린 저항성 실험을 시행하였다. 10주령의 수컷 JYD마우스의 혈액내 글루코오즈 농도는 인슐린 주입 후 수컷 C57BL/6와 DBA/2와 비교하여 유의적으로 감소되지 않았다 (도2C). 30주령의 수컷 JYD는 인슐린에 반응하지 않아 혈액내 글루코오즈가 감소되지 않음을 확인하였다 (도2D).
3. 양전자 방사 단층촬영을 이용한 글루코오즈 대사율 측정
제 2형 당뇨환자는 체내 글루코오즈 활용률이 감소되어 있기 때문에 방사성 fluoro-Deoxyglucose (FDG) 흡수가 낮은 것으로 보고되었다. (23). 양전자 방사 단층촬영을 이용하여 조직의 FDG 양을 측정하는 것은 국부적인 글루코오즈 대사율을 측정하는 방법으로 사용되어 왔다 (24). 따라서 우리는 이 방법을 이용하여 수컷 JYD 마우스의 전반적인 글루코오즈 이용률을 조사하였다; C57BL/6와 ob/ob 마우스는 대조군으로 사용하였다. 30주령의 C57BL/6 마우스의 FDG 흡수율은 같은 주수의 JYD 마우스나 10주령의 ob/ob 마우스와 비교하여 특히, 뇌와 폐, 척추에서 높은 것으로 나타났다 (도3). JYD 마우스의 전반적인 글루코오즈 흡수율은 ob/ob마우스와 비슷하게 나타났다.
4. 근육조직에서 인슐린 신호전달 단백질들과 인산화된 단백질들 발현양 측정
JYD 마우스의 노화 의존적인 제 2형 당뇨의 발병기전을 알아보기 위해, 인슐린 수용체기질(IRS-1 (insulin receptor substrate)), 인슐린 수용체 (insulin receptor β, IRβ), Akt/PKB(Akt/protein kinase B), PPAR-γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ), 그리고 글루코오즈 수송체-4 (glucose transporter-4, GLUT-4)와 같은 인슐린 신호전달 관련 단백질들의 발현을 3, 10, 30주령의 JYD와 대조군인 DBA/2, C57BL/6에서 측정해 보았다 (도 4A). JYD와 C57BL/6 두 마우스 모두에서 노화가 되면서 IRS-1, Akt/PKB, PPAR-γ의 발현양이 유의적으로 감소된 반면, IRβ와 GLUT-4의 발현양은 변화하지 않았다 (도4B). DBA/2 마우스에서는 이러한 단백질들의 발현양이 노화에 따라서 아무런 변화가 없었다 (도 4B).
인슐린 작용의 손상은 인슐린 신호전달에 포함되는 단백질들의 발현양 뿐 만 아니라 그들의 활성 변화에 의해서도 영향을 받는 것으로 알려져 있다 (25). 따라서 우리는 30주령의 DBA/2, C57BL/6, JYD 마우스에 인슐린 주입 후 IRβ와 Akt/PKB의 인산화 정도를 측정하였다. DBA/2 마우스에서는 인슐린 주입에 의해 IRβ와 Akt/PKB의 인산화가 증가하는 것을 관찰하였으나, C57BL/6와 JYD 마우스에서는 대조군과 비교하여 인산화에 차이가 나지 않음을 확인하였다 (도4C). 이러한 결과는 30주령의 C57BL/6와 JYD 마우스에서 손상된 인슐린 민감성이 인슐린 신호전달 단백질들의 발현양의 감소 및 그의 활성이 감소됨으로서 나타난 결과임을 제시한다.
5. 근육조직과 그외 인슐린에 민감한 조직에서 카베올린의 발현양 측정
JYD 마우스의 당뇨 발병기전에 카베올린이 관여하는지 알아보기 위해, 우리는 3, 10, 30주령의 DBA/2, C57BL/6, JYD 마우스 근육조직에서 카베올린 발현양을 측정하였고, 단백질 면역 검출방법을 통해 카베올린-1 발현양이 3주에 비해 30주령에 증가되어 있음을 확인하였다 (도5A). 그러나 DBA/2나 C57BL/6 마우스의 근육 조직에서는 카베올린-1 발현양이 약 8배정도 증가됨에 반해, JYD 마우스는 약 2배정도 증가되었다 (도5B). 근육조직에 특이적인 카베올린-3의 발현양은 DBA/2, JYD, C57BL/6에서 노화가 됨에 따라 변화하지 않음을 확인하였다.
근육조직 외에도 우리는 3, 10, 30주령의 DBA/2, C57BL/6, JYD의 지방조직, 간, 췌장에서 카베올린-1 발현양을 조사하였다. 도5A에서 보다시피, 이러한 조직에서 노화에 따른 카베올린-1 발현양의 증가폭은 C57BL/6와 DBA/2 마우스에 비해 JYD 마우스에서 유의적으로 낮은 것으로 나타났고 다른 조직에서의 변화의 정도도 근육만큼 크지는 않았다.
노화된 근육조직은 지방조직을 포함할 수도 있다는 보고가 있다 (26). 따라서 우리는 근육조직에서 발현된 카베올린-1 단백질이 노화된 근육조직내의 지방세포에서 비롯되었다는 것을 배제하기 위해, 30주된 마우스의 근육조직에서 RT-PCR 방법으로 아디포제닉 (adipogenin) 유전자인 렙틴 (leptin)과 근육조직의 표지자인 마이오제닌 (myogenin)을 측정하였다. 도5C에서 볼 수 있듯이, 렙틴 (leptin)의 발현은 근육조직이 아닌 지방조직에서만 발현되었고, 반면 마이오제닌 (myogenin)은 근육조직에서만 발현함을 확인하였다. 이러한 결과들로서, 근육에서 발현된 카베올린-1은 지방조직에서 유래한 것이 아님을 확인하였다. 또한 면역조직학적 염색방법을 이용하여 30주된 JYD 마우스의 근육조직에서 카베올린-1 발현양이 C57BL/6 마우스와 DBA2 마우스와 비교하여 낮은 것을 확인하였고 (도5D), 이것은 단백질 면역 검출실험에서 나타난 결과와 비슷한 현상임을 관찰하였다 (도5A,5B).
또한 우리는 당뇨가 생기지 않은 F1 수컷과 암컷 마우스의 카베올린-1 발현양을 측정하였다. 도5E에서 보시다시피, 당뇨가 생기지 않은 마우스의 카베올린-1 발현양은 당뇨가 생긴 마우스의 발현양보다 높게 나타나고 있었다.
6. C57BL/6 마우스에서 렌티바이러스를 이용한 카베올린-1 발현양 감소가 글루코오즈 내성과 인슐린 민감성을 감소시킨다.
C57BL/6, DBA 마우스와 비교하여 JYD 마우스에서 노화가 되면서 카베올린-3가 아닌 카베올린-1의 증가폭의 차이를 관찰하였고, 또한 지방세포와 관련된 카베올린-1은 글루코오즈 대사와 에너지 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 이미 보고가 되었으므로 (10), 우리는 비만하지 않은 형태의 당뇨모델인 JYD 마우스를 사용하여 근육의 인슐린 민감성에 카베올린-1의 효과에 대해 중점적으로 연구를 하였다. C57BL/6와 DBA/2마우스는 JYD 마우스에 비해 카베올린-1의 발현이 유의적으로 높게 나타났기 때문에 (도5), 우리는 카베올린-1 발현 감소가 C57BL/6 마우스의 글루코오즈, 인슐린 내성에 부정적인 영향을 미치는지에 대해 의문을 가졌다. 이 질문에 답을 하기 위해, 우리는 카베올린-1 발현을 감소시키는 짧은 헤어핀 RNA를 발현하는 렌티바이러스를 제작하였고, 표지로서 그린 형광 단백질 (GFP)를 발현하도록 하였다. 대조군으로 스크램블드 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GFP-발현 렌티바이러스를 사용하였다 (도6A). 우리는 우선, L6세포 수준에서 렌티바이러스에 의한 카베올린-1 발현 감소의 효과를 측정하였다. 형광현미경을 이용하여 L6 세포에서 virus가 성공적으로 감염되는 것을 확인하였고 (도6B), 단백질 면역 검출방법으로 shlenti-카베올린-1 감염의 결과 카베올린 발현양이 감소됨을 확인하였다 (도6C). 슈크로즈 농도 구배 프랙션 후에 카베올레 부분/비카베올레 부분을 조사한 결과, 카베올레 구획에서의 카베올린-1 발현양이 shlenti-카베올린-1이 감염된 세포에서 저하되어 있었다 (도6D). 우리는 30주령의 C57BL/7 마우스의 근육에 shlenti-GFP와 shlenti-카베올린-1을 주입하였다. 도6E에서 보는 바와 같이, 면역 조직학적 방법을 통해 shlenti-GFP를 처리한 마우스에서보다 shlenti-cav-1을 처리한 경우 카베올린-1 발현이 감소되어 있음을 확인하였다. 주입한 후 2주 후에 shlenti 바이러스 발현 효율이 감소되었기 때문에 (결과는 나타내지 않음), 바이러스 주입후 2주내에 실험을 시행하였다. 바이러스 주입 12일 후, shlenti-카베올린-1을 주입한 마우스의 혈액내 글루코오즈 수준이 대조군 마우스에 비해 유의적으로 감소되었다 (결과는 나타내지 않음). 주입 후 14일 후, 카베올린-1 발현이 저하된 마우스가 shlenti-GFP를 주입한 마우스보다 글루코오즈, 인슐린 내성이 심각하게 손상되어 있음을 관찰하였다 (도6F, 6G). 몸무게를 비교해 보았을 때, lentivirus를 주입하고 4주 후까지 큰 변화를 보이지 않았다 (결과는 나타내지 않음).
7. 30주령의 JYD 마우스에서 아데노바이러스를 이용한 카베올린-1 발현양 증가가 글루코오즈, 인슐린 내성과 글루코오즈 흡수를 증가시킨다.
JYD 마우스의 카베올린-1 발현양이 C57BL/6 마우스에 비해 유의적으로 감소되어 있었기 때문에, 우리는 30주령의 JYD 마우스에 카베올린-1 과발현이 글루코오즈, 인슐린 내성에 긍정적으로 영향을 미치는지 의문을 가졌다. 우리는 대조군으로 GFP만 발현되는 아데노바이러스 수송체와 함께 카베올린-1과 GFP가 발현되는 아데노바이러스를 사용하였다 (도7A). 우리는 우선 L6 세포상에서 카베올린-1이 과발현되는 바이러스의 효율을 측정하였다. 형광 현미경을 이용하여 세포에 성공적으로 감염되는 것을 확인하였고 (도7B), 단백질 면역검출방법을 통해 카베올린-1 아데노바이러스에 감염된 세포가 대조군 바이러스에 의해 감염된 세포보다 카베올린-1 발현양이 증가되어 있음을 관찰하였다 (도7C). 슈크로즈 농도 구배 프랙션을 한 후 카베올레 부분/비카베올레 부분을 조사한 결과 카베올린-1 아데노바이러스에 감염된 세포의 카베올레 부분에서 카베올린-1 발현양이 증가된 것을 확인하였다 (도7D). 근육부분에 아데노바이러스를 주입한 것이 다른 조직에도 영향을 미치는지 알아보기 위하여 우리는 GFP만 발현되는 아데노바이러스 (3 × 1011 pfu)를 근육부분에 주입한 후 근육과 지방세포, 간에서 조사해 보았다. 단백질 면역 검출방법과 (도7E) 형광 이미지화 (결과는 나타내지 않음)를 이용하여 GFP 단백질을 근육에 주입 후, 형광이 근육부분에서만 나타남을 확인하였고, 정맥을 통해 주입하였을 경우에는, 다른 조직에서도 형광 단백질 발현을 관찰하였다. 카베올린-1 아데노바이러스를 JYD 마우스의 근육에 주입 후 근육의 면역염색 방법으로 관찰한 결과, 카베올린-1 발현양이 대조군 바이러스를 주입한 경우보다 증가되어 있음을 확인하였다 (도7F). 생체 내 형광 이미지화방법을 통해 우리는 카베올린-1 발현양이 주입 후 3일 후 최대로 발현되는 것을 확인하였고 (결과는 나타내지 않음), 따라서 바이러스를 주입 후 3일째 되는 날 실험을 시행하였다.
카베올린-1 아데노바이러스와 GFP 아데노바이러스를 JYD의 근육에 주입 후, 3일이 지난 후 글루코오즈, 인슐린 내성실험을 수행하였다. 대조군인 GFP 바이러스를 주입한 경우보다 카베올린-1 바이러스를 주입하였을 때 외부에서 주입된 글루코오즈가 효과적으로 제거되었다 (도8A). 또한 카베올린-1 바이러스를 처리한 마우스에서 외부에서 주입한 인슐린에 의해 혈액 내 글루코오즈 양이 유의적으로 감소되어 있음을 확인하였고, 이러한 결과는 이 마우스에서 인슐린 민감성이 증가된 것을 의미한다 (도8A). GFP 아데노바이러스와 카베올린-1 아데노바이러스를 JYD 마우스의 다리 근육에 각각 한쪽씩 주입후, 양전자방사단층 촬영 방법(23) 으로 글루코오즈 흡수량을 확인하였다. 주입 후 3일 후, 카베올린-1 바이러스를 주입한 근육의 글루코오즈 흡수량이 대조군에 비해 증가한 것을 관찰하였다 (도8C, 8D). 이러한 결과들은 카베올린-1의 과발현이 근육의 글루코오즈 흡수를 촉진시킴으로서 JYD 마우스의 인슐린 민감성을 증가시키는데 중요한 역할을 하고 있음을 제안한다.
＜ 토의 ＞
우리는 수컷 JYD 마우스가 노화가 되면서 심각한 고지혈증으로 발전하고 또한 모체인 C57BL/6와 DBA와 비교하여 비만하지 않음을 관찰하였다. 따라서 JYD 마우스는 성인성 질환인 제 2형 당뇨의 발병에서 노화의 역할을 연구하기에 적합한 모델이라 여겨진다.
근육은 인슐린을 매개로 한 글루코오즈 흡수에 기본이 되는 조직인 반면, 지방조직은 글루코오즈 흡수가 느리게 일어나고, 전체 글루코오즈 흡수의 약 2-3％만 담당하는 것으로 알려져 있다 (27). 글루코오즈 흡수에서 노화의 역할에 대한 많은 연구들은 근육의 인슐린 민감성 감소에 대해 집중적으로 보고하고 있다 (28, 29). 이러한 연구결과들은 노인들에게서 근육의 인슐린 저항성이 중요하다는 것을 제안하는 것이지만, 근육에서의 노화 의존적인 글루코오즈 흡수에 대한 정확한 기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 따라서 우리는 본 논문에서 이러한 부분을 초점을 맞추어 JYD 마우스를 이용하여 연구하고자 하였다.
말초 조직에서 인슐린에 저항성이 있을 경우, 혈액내의 글루코오즈는 조직으로 효과적으로 흡수 되거나 대사되지 못하게 되어 고지혈증이 나타나게 된다. 수컷 JYD 마우스는 모체인 DBA/2와 비교하여 외부에서 주입된 글루코오즈를 효과적으로 제거하지 못하였고, 외부에서 주입된 인슐린에 의해서도 혈액내의 글루코오즈 농도를 효과적으로 낮추지 못하였다. 흥미롭게도 C57BL/6 마우스도 30주가 되었을 때 글루코오즈 내성이 손상되었고, 인슐린 반응에도 약간의 결함이 있음을 확인하였다. 그러나 C57BL/6 마우스는 수컷 JYD 마우스와 비교하여 심각한 고지혈증으로 발전되지는 않았다.
인슐린은 인슐린 수용체를 활성화하여 인슐린 수용체의 인산화 잔기, PI3-키나아제 (phosphatidylinositol 3-kinase)와 Akt/PKB의 인산화를 활성화시킨다 (30, 31). 이러한 신호전달체계의 활성화는 글루코오즈 수송체-4와 글루코오즈 대사를 통한 글루코오즈 이동을 증가시킨다. IRS는 인슐린 수용체와 PI3-키나아제와 같은 다른 여러 신호전달 분자들 사이에서 다리역할을 하고 있다 (31). 따라서 이러한 신호전달체계에 있는 분자들의 발현 감소 또는 그들의 기능감소는 인슐린 저항성을 가져오게 된다 (32). 예를 들어, 인슐린 수용체나 IRS-2(33), 또는 Akt (34) 들의 발현억제와 같은 인슐린 신호전달체계에서의 어느 한 분자의 결함은 제 2형 당뇨현상을 나타내게 된다.
노화에 따른 제 2형 당뇨의 기전을 알아보기 위해, 우리는 우선 근육조직에서 인슐린 신호전달 단백질들을 측정해보았다. 30주령의 C57BL/6와 JYD 마우스에서 글루코오즈 내성, 인슐린 내성이 손상되어있음을 관찰하였고 이러한 현상은 근육에서의 IRS-1, Akt/PKB, PPAR-γ의 발현감소와 인슐린 주입에 의한 IRβ, Akt/PKB의 인산화 활성 감소에 의해서 부분적으로 일어나고 있음을 확인하였다. 그러나 C57BL/6의 당뇨병 발병율(8.7％)은 JYD 마우스의 당뇨병 발병율(51％)보다 유의적으로 낮았으며, 이러한 결과는 직접적인 인슐린 신호전달 체계 외에 또 다른 결함에 의해서 당뇨현상이 나타나고 있음을 제시해준다.
선행연구를 통해 우리는 카베올린이 세포막의 중요한 분자이고, 이것은 세포의 노화 현상에 결정적인 역할을 하고 있음을 보고하였다 (35). 따라서 우리는 카베올린 발현양이 모체 마우스와 비교하여 JYD 마우스에서 노화에 따라서 어떻게 변화하는지 조사해 보았다. 카베올린-3 발현양은 모든 마우스 종류에서 어떠한 변화도 나타나지 않았다. 흥미롭게도 모든 종류의 마우스에서 노화에 따라 근육조직의 카베올린-1 발현양이 증가된 것을 관찰하였고, 그러나 C57BL/6와 DBA/2 마우스에서의 증가율은 JYD 마우스에서 보다 높게 나타났다. 이러한 결과들은 카베올린-1의 결함이 제 2형 당뇨의 발병과 JYD 마우스 모델에서 인슐린 민감성에 중요한 요소임을 나타낸다. 이와 비슷한 결과로, 카베올린-1 발현이 감소된 마우스는 인슐린 저항성을 나타내고 특히 지방조직에서 인슐린 수용체 단백질들의 발현 감소를 가져왔다고 보고되었다 (10). 비록 근육 조직에서처럼 다른 조직에서도 노화에 따라서 카베올린 발현양이 마우스별로 비슷한 경향을 보였지만, 우리는 제 2형 당뇨에서 근육조직의 인슐린 저항성에 중요성을 두었고, 또한 선행연구를 통해서 카베올린-1이 근육세포에서 글루코오즈 흡수에 중요한 역할을 한다(18)는 보고를 하였기 때문에 근육에서의 카베올린-1 수준을 조절하는데 초점을 맞추었다.
인슐린 민감성 조절에 있어서 카베올린-1의 역할을 알아보기 위해 우리는 C57BL/6 마우스에서 카베올린-1의 발현을 감소시켰고, 또한 JYD 마우스에서는 카베올린-1 발현을 증가시켰다. C57BL/6 마우스에서 RNA 간섭에 의해 카베올린-1 발현을 감소시켰을 때 혈액내 글루코오즈 수준이 증가하였고, 글루코오즈 내성과 인슐린 내성이 대조군 C57BL/6와 비교하여 손상되어 있음을 관찰하였다. 반대로 JYD 마우스에 카베올린-1을 과발현시킬 경우 글루코오즈 민감성과 인슐린 민감성이 증가하였고, 근육조직에서 글루코오즈 흡수량이 증가하였다. 우리는 또한 C57BL/6와 DBA의 교배에서 생긴 1세대 마우스중 당뇨가 생기지 않은 마우스를 조사한 결과, 카베올린 발현양이 당뇨가 생긴 마우스 보다 높게 발현되고 있음을 관찰하였다. 이상의 결과들은 근육조직에서 카베올린-1 수준과 JYD 마우스의 당뇨현상의 발생이 큰 상관성을 가지고 있음을 나타낸다.
세포내에서의 글루코오즈 수송과 이용률은 인슐린 저항성의 발병원인으로 여겨지고 있다 (18, 32, 36). 우리는 기존연구를 통해 글루코오즈 수송체-4가 카베올린이 존재하는 세포막 부분에서만 (18, 37) 발현되고 있음을 확인하였고, 카베올린-1이 글루코오즈 수송체-4의 발현양을 변화시키기보다는 근육세포에서의 글루코오즈수송체-4의 이동에 따른 인슐린 의존적인 글루코오즈 흡수와 관련된다는 것을 확인하였다 (18). 카베올린-1은 세포의 이동에 관여하고 카베올레에는 글루코오즈 수송에 필요한 수송체 형성에 필요한 (31) soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor (SNARE) 단백질을 포함한 많은 분자들이 포함되어 있음이 잘 알려져 있다 (38, 39). 따라서, 카베올린-1이 이러한 분자들을 조절함으로서 글루코오즈 수송체-4의 이동에 영향을 주었을 것이다. 또한, 운동에 의한 근육에서의 카베올린-1 과발현이 인슐린 민감성에 영향을 미치는 중요한 요소가 될 것이다 (40). 이러한 결과들은 카베올린-1 발현 증가가 글루코오즈 흡수 시스템을 통해 인슐린 민감성을 증가시킨다는 개념을 뒷받침해주고 있다.
우리는 노화 의존적인 제 2형 당뇨모델인 JYD 마우스와 ob/ob 마우스를 비교하였다. 이를 위해 ob/ob 마우스에서 카베올린 뿐만 아니라 인슐린 신호전달체계와 관련된 분자들의 발현양을 확인하였다. 흥미롭게도 비만증상을 가진 ob/ob 마우스의 인슐린 저항성은 지방세포의 글루코오즈 수송체-4의 감소에 의해서 나타나는 현상임을 확인하였고(결과는 나타내지 않음), 대조군 마우스와 비교하여 카베올린-1 발현에는 큰 차이가 없음을 관찰하였다.
카베올린-1 발현 저하된 마우스가 지방조직에서 인슐린 저항성을 나타내는 것은 이미 보고가 되었다 (10). 그러나 이러한 현상은 노화 의존적인 현상이 아니며, 카베올린-1이 지방조직에서 인슐린 수용체와 직접적으로 결합하고 있기 때문에 카베올린-1 발현저하에 따른 인슐린 수용체 발현의 결함에 의한 것이다. 근육 조직에서는 카베올린-3 발현 저하 마우스가 인슐린 주입에 의한 IRB, IRS-1/2 인산화 결함에 의한 인슐린 저항성을 보인다고 보고된 바가 있다. 그러나 기존에 우리가 선행연구를 통해 제안하였다시피 근육세포에서의 GLUT-4 수송은 지방세포에서 알려진 것처럼 IRβ 신호전달체계와는 다른 기전을 통해서 이루어지기 때문에 근육에서의 카베올린-1의 역할은 지방조직의 카베올린-1과는 다르다. 게다가 카베올린-3 저하 마우스는 근육에서 근섬유 형성의 이상을 초래하고 (41), 카베올린-3 결함은 사지연결근육퇴행위축(limb girdle muscular dystrophy)에 의한 근육의 세포사멸과 근육질환을 초래한다 (42). 따라서 카베올린-3 결함 마우스에 있어서, 인슐린 저항성이 카베올린-3에 의한 것인지, 근육 조직 자체의 이상에 의한 것인지는 확실하지가 않았다.
노화 의존적인 제 2형 당뇨의 기전에 대한 선행 연구들은 비만인 동물모델을 이용해서 진행되어 왔다 (43-45). 본 발명에 의해 노화에서 제 2형 당뇨의 발병이 증가되는 것을 설명할 수 있고, JYD 모델이 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨를 연구하는데 적합하며, 상기 JYD 마우스의 근육에서 카베올린-1 상태가 노화 상태에서 비만상태 없이 제 2형 당뇨의 발병을 증가시키는 기전에 중요한 요소임을 제안하는 증거를 제시하였다.
결론적으로, 본 발명자는 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨 모델인 JYD 마우스의 근육조직에서의 카베올린-1 발현 감소가 JYD 마우스의 당뇨현상을 발전시킴과 동시에 카베올린-1 발현에 의해 JYD 마우스의 인슐린 민감성을 조절할 수 있음을 확인하였다. 따라서 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨 환자에서 근육조직의 카베올린양을 증가시켜 인슐린 민감성을 조절함으로서 당뇨병을 개선 및 치료하는 방법으로서 효과가 우수하다.
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도2는 수컷 JYD 마우스의 글루코오즈와 인슐린 내성을 측정한 그래프로서,
A,B는 글루코오즈 내성을 측정한 결과이고, C,D는 인슐린 내성을 측정한 결과이다. 이때 내성 측정시기(age)는 수컷 JYD의 10주 (A,C)와 30주 (B,D)에 시행하였으며, 주령 대비 수컷 C57BL/6 (B6)와 DBA/2 (DBA)를 대조군으로 사용하였다. 수치는 평균 ± 표준오차로 표시하였다. n = 6/그룹으로, 각 결과 값은 독립적인 세번의 실험을 평균하여 표시하였다. JYD 마우스와 비교하여 P ＜ 0.05은 *로, P ＜ 0.01인 것은 **로 표시하였다.
도3은 수컷 JYD 마우스의 체내 양전자 방사 단층촬영 이미지결과를 나타낸 것으로, 글루코오즈 흡수율은 18F-FDG PET로 측정하였다. A는 C57BL/6 (왼쪽), ob/ob (중앙), JYD (오른쪽) 마우스의 두개골을 가로 지르는 형태로 나타낸 것이며, B는 냉동시킨 마우스를 이용하여 각 조직 및 이에 해당되는 부분을 표시한 것이다. 이때, ％ID/g는 그램당 주입된 양을 백분율로 표시한 것이다.
도4는 JYD 마우스 근육에서 인슐린 관련 단백질들과 인산화된 단백질들의 발현양을 나타낸 것으로, A는 3, 10, 30주령의 수컷인 DBA/2, C57BL/6 및 JYD마우스의 근육조직을 분리하여 단백질 면역검출방법을 통해 인슐린 관련 단백질들의 발현양을 측정한 결과이다. 이때, 튜블린(Tubulin)은 같은 양의 단백질을 사용했다는 근거로서 실시되었다. B는 단백질 면역검출방법에서 나타난 단백질 양을 측정한 결과로서, 30주령의 단백질 양을 대조군으로 하여 3주령에서 증가량을 나타내었고, 그 양은 덴시토메트릭 분석기(densitometric analysis)를 이용하여 계산하였다. 각 막대그래프는 평균 ± 표준오차이며, 30주령의 발현양과 비교하여 P＜0.05인 것을 * 로 표시하였다. n=3/그룹. C는 30주령의 마우스에 인슐린을 처리한 그룹(+) (INS)과 처리하지 않은 그룹 (-)에서 근육조직의 인산화된 Akt (p-Akt)와 인산화된 IR (p-IRβ)를 단백질 면역 검출방법을 이용하여 나타낸 결과이다.
도 5는 근육조직과 그 외 인슐린에 민감한 조직의 카베올린 발현양을 나타낸 것으로, 마우스로부터 조직을 분리하여 단백질 면역검출방법을 이용하여 카베올린 발현양을 측정하였다. A는 3, 10, 30주령의 DBA/2, C57BL/6와 JYD에서 근육(Mus), 지방 (Adi), 췌장(Pan), 간 (Liv)을 분리하여 카베올린 -1(Cav-1) 과 카베올린-3 (Cav-3)의 발현양을 단백질 면역 검출방법을 이용하여 나타내었다. 이때 튜블린(Tubulin)은 같은 양의 단백질을 사용했다는 대조군으로 사용하였다. B는 JYD 마우스의 근육에서 단백질 면역검출방법의 양적인 측정 결과로서, 단백질 면역 검출 방법을 이용하여 3주의 양을 대조군으로 하여 30주령에서의 변화양은 덴시토메트릭 분석기 (densitometric analysis)로 측정하였다. 각각의 그래프는 평균 ± 표준오차를 의미하며, 3주의 발현양과 비교하여 P＜0.05인 것을 *로 표시하였다. n=3/group. C는 30주된 DBA/2 (D2), C57BL/6 (B6)와 JYD (JYD) 마우스의 근육 (Mus)과 지방조직 (Adi)에서 렙틴(leptin)과 마이오제닌(myogenin)의 mRNA양을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과로, GAPDH mRNA는 동일양이 RNA를 사용하였다는 것을 확인하기 위해 측정하였다. D는 30주된 DBA/2, C57BL/6, JYD 근육조직에서 마이오제닌(myogenin)과 카베올린-1을 면역조직학적 염색방법을 이용하여 측정한 것이다 (bar=100 μm). E는 JYD 마우스의 1세대 중 당뇨인 것과 당뇨가 나타나지 않은 마우스의 근육조직에서의 카베올린 발현양을 비교한 결과로서 D-M; 당뇨가 생긴 수컷마우스, ND-F; 당뇨가 생기지 않은 암컷마우스, ND-M; 당뇨가 생기지 않은 수컷마우스를 나타낸 것이다.
도 6은 shlenti-카베올린-1을 주입한 C57BL/6 마우스에서 글루코오즈 내성, 또는 인슐린 내성의 손상을 나타낸 결과로서, A는 쥐의 카베올린-1 cDNA (shlenti-cav-1) 와 대조군 바이러스 (shlenti-GFP)를 발현하는 렌티바이러스(lentivirus) 유전자 발현 수송체의 모식도를, B는 L6 세포에 렌티바이러스를 감염시킨 후 형광현미경을 통해서 관찰한 결과를, C는 L6 세포에서 바이러스를 이용한 형질 변환 후, 카베올린-1 단백질 발현양을 단백질 면역검출방법을 이용하여 나타낸 결과를 나타낸 것이다. 이때, 액틴은 같은 양의 단백질을 사용했다는 대조군으로 사용하였다. D는 Shlenti-GFP 와 shlenti-cav-1 바이러스가 감염된 근육세포를 계면활성제(detergent)없이 균질화하여 잘게 부순 후에 슈크로즈 농도 구배 프랙션을 시행하였다(카베올레 부분(cav), 비카베올레 부분(N-C)). 카베올린-1 발현양은 단백질 면역 검출방법으로 관찰하였고, 플로틸린(flotillin) 단백질 발현양은 세포막의 지질 층(lipid raft)의 표지로 사용하였다. E는 30주령의 C57BL/6 다리 근육에 shlenti-cav-1과 shlenti-GFP (3×107 MOI)를 주입 후, 면역조직학적 염색방법으로 카베올린-1 발현양을 측정하였다. F는 글루코오즈 내성실험을, G는 인슐린 내성실험을 실시한 결과를 나타낸 그래프이며, 각 내성 실험은 shlenti-GFP와 shlenti-cav-1 바이러스를 주입 후 2주 후에 시행하였다. 표시된 시간은 글루코오즈 (F) 혹은 인슐린 (G) 주입 후의 시간 (분)을 나타내며, 수치는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. shlenti-GFP와 비교하여 P ＜ 0.05 인것을 * 로 표시하였다. n=5/그룹.
도 7은 아데노바이러스 카베올린-1 수송체의 제작 및 분석에 관한 결과를 나타낸 것으로, A는 쥐의 카베올린-1 cDNA (Ade-cav-1)과 대조군 수송체(Ade-GFP)를 발현하는 아데노바이러스 유전자의 모식도를 나타낸 것이고, B는 감염된 L6 세포를 형광현미경으로 관찰한 사진이다. C는 면역검출방법을 이용하여 유전자형질변환 후 L6 세포에서 카베올린-1 단백질 발현양을 측정하였다. 이때 액틴의 발현양을 단백질 발현의 대조군으로 사용하였다. D는 Ade-GFP와 Ade-cav-1 바이러스가 감염된 근육세포를 계면활성제(detergent)없이 균질화하여 슈크로즈 농도 구배 프랙션(프랙션 1-12)을 시행하였다(카베올레 부분(cav), 비카베올레 부분(N-C)). 단백질 면역검출방법을 이용하여 카베올린-1 발현양을 나타내었고; 플로틸린(flotillin) 단백질 발현양은 세포막의 지질 층(lipid raft)의 표지로 사용하였다. E는 Ade-GFP를 근육에 주입 (IM) 한 후 3일 후에 희생시켜 GFP 단백질 발현양을 측정한 결과로, GFP 단백질은 근육 (Mus), 지방 (Adi), 간 (Liv)에서 단백질 면역검색방법으로 조사하였다. Ade-GFP의 꼬리정맥 주입 (IV)은 대조군으로 사용하였다. 튜블린 발현양은 단백질 발현양의 대조군으로 사용하였다. 이때, CON(대조군)은 마우스의 근육에 식염수를 주입한 것을 의미한다. F는 30주령의 JYD 마우스의 다리근육에 Ade-cav-1, 또는 Ade-GFP (3×1011 PFU)를 주입한 후 카베올린-1 단백질 발현양을 면역 조직학적 방법으로 확인한 결과이다.
도 8은 JYD 마우스에 Ade-카베올린-1을 주입한 후 글루코오즈와 인슐린 내성의 촉진효과를 나타낸 결과로서, 아데노바이러스를 주입 후 3일 후에 18시간동안 마우스를 금식시킨 후 글루코오즈 내성 실험 (A)과 인슐린 민감성 실험 (B)를 시행하였다. 이때 시간은 글루코오즈 혹은 인슐린 주입 후의 시간(분)을 표시한 것이며, 결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었다. Ade-GFP와 비교하여 P ＜ 0.05 인 것을 *로 나타내었다. n = 6/그룹. C는 대조군 (Ade-GFP, 왼쪽) 또는 caveolin-1 (Ade-Cav-1, 오른쪽)를 주입한 마우스의 근육부분의 유전형질 변화의 효율성을 측정한 결과를 나타낸 사진으로, 형광 강도는 p(수소)/sec(초)/cm2 (넓이)/sr(단위면적)로 표시하였다. D는 글루코오즈 흡수정도를 18F를 이용한 양전사 방사단층촬영으로 측정한 결과이다. 이때, 빨간색은 글루코오즈가 높게 흡수된 것을, 검은색은 낮게 흡수된 것을 나타낸다. 이미지는 Ade-GFP 또는 Ade-cav-1 주입한 JYD 마우스의 횡단면을 나타내었다.
발명의 실시를 위한 형태
본 발명은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 제 2형 당뇨병 모델마우스인 JYD를 이용하여 노화 의존적이고 비만하지 않은 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물을 제시하고 있다.
이를 본 발명의 구현예를 참조하여 보다 구체적으로 살펴보면, 상기 제 2형 당뇨병 모델마우스인 JYD를 이용하여 1)글루코오즈 내성 및 2)인슐린 내성 실험을 실시하였고, 양전자 방사 단층촬영을 이용한 3)글루코오즈 흡수율을 측정한다. 상기 측정한 수치는 제 2형 당뇨병 소인의 대조 수치로 기록하여 둔다. 또한 상기 제 2형 당뇨병의 소인을 보이는 JYD 마우스 및 대조군 마우스의 근육조직에서 면역검출 방법을 이용하여 4)카베올린의 발현정도를 측정한 후 본 발명의 카베올린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여한 후 상기 글루코오즈 및 인슐린 내성, 글루코오즈 흡수율, 카베올린의 발현정도 또는 함량을 측정하여 당뇨의 치료정도를 파악할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 카베올린은 카베올린-1, 카베올린-2 및 카베올린-3이며, 바람직하게는 카베올린-1이다. 또한 카베올린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 단백질 또는 DNA 및 RNA와 같은 유전자 형태 중 어떤 형태로도 포함될 수 있으며, 바람직하게는 유전자 형태로 포함된다. 상기 유효성분을 코딩하는 유전자 형태로 포함될 경우 상기 유전자 담체와 함께 포함될 수 있다.
한편, 유전자 형태로 카베올린을 포함할 경우, 카베올린 유전자를 동물 세포내로 안전하게 운반하고, 이를 세포 내에서 발현시키는 진핵세포용 발현벡터는 동물을 숙주로 하는 바이러스의 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 RNA 바이러스 수송체내에 카베올린이 수송되거나 아데노바이러스 수송체 내에 카베올린이 수송될 수도 있으며, 바람직하게는 짧은 헤어핀의 형태의 RNA 렌티바이러스성 수송체, 아데노바이러스 수송체로 수송될 수 있다. 투여되는 방법으로는 카베올린 유전자를 포함하는 발현벡터의 동물세포 내로의 도입 및 발현된 단백질의 동물세포내로의 투여방법이 있으며, 카베올린 유전자를 포함하는 발현벡터의 동물세포 내로의 도입방법으로는 미세주입법(참조: Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 공동-침전법(참조: Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)) 및 리포좀 이용법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)) 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 1)짧은 헤어핀의 형태의 RNA 바이러스 수송체내에 카베올린이 수송되는 경우는 카베올린 유전자를 목표로 한 짧은 헤어핀구조의 RNA 렌티바이러스 수송체 (shlenti-cav-1)에 넣어 제작하고, U6 프로모터 로부터 shRNA를 생산하여 IRES 시스템으로부터 GFP 단백질을 발현하도록 제작한다. 세포상에서 형질도입된 효율을 조사하기 위하여 L6 세포에 렌티바이러스 수송체를 감염시키고, 형질 변환된 세포의 GFP 발현은 형광현미경과 단백질 면역 검출방법을 이용하여 조사한다. 이때 만들어진 RNA 바이러스 수송체-카베올린은 당뇨가 생긴 JYD 마우스 근육에 감염시킨 후 생체내에 형질도입된 효율을 분석한다; 2)아데노바이러스 수송체 내에 카베올린이 수송되는 경우는 감염성 재조합 아데노바이러스는 AdEasy 방법을 이용하여 만든 다음 카베올린이 발현되는 재조합 아데노바이러스를 셔틀플라스미드에 넣어 제작하고, 상동성 재배열은 이 셔틀 수송체를 가진 E. coli BJ5183에서 만든다. 재조합된 바이러스들은 가나마이신을 이용하여 선택한 후, 제한효소에 의한 절단을 시행하고 HEK293 세포에서 선형화된 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 감염시킨 후 아데노바이러스를 생산한다. 생산된 아데노바이러스는 일반적인 바이러스 증폭 방법에 따라 증폭 및 분리한 후에 당뇨가 생긴 JYD 마우스 근육에 감염시킨 후 생체 내에 형질도입된 효율은 면역조직학적 염색방법 등으로 확인한다.
본 발명의 당뇨병 치료 및 개선용 조성물의 치료대상은 당뇨병이 나타나는 모든 포유동물이며, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 당뇨병은 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 젊은이에서 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병 및 췌장 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 제 2형 당뇨병이며, 가장 바람직하게는 노화 의존적이며 비만하지 않는 제 2형 당뇨병이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기 위해서 적정량의 염 및 PH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다. 본 발명의 유효성분이 효과적으로 작용하게하기 위해서 미량의 효소를 추가적으로 포함할 수도 있다. 또한 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 치료 및 개선 방법에 관한 것이다.
본 발명의 당뇨병 치료 및 개선 방법은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 치료대상에 투여하여 당뇨병이 치료 및 개선되는 효과가 탁월하므로, 상기 당뇨병 치료 및 개선용 조성물에서 언급한 사항들과 거의 동일하다.
따라서 상기 당뇨병 치료 대상은 당뇨병이 나타나는 모든 포유동물이며, 바람직하게는 인간이다. 또한 카베올린은 단백질 또는 이를 코딩하는 DNA 및 RNA와 같은 유전자 형태 중 어떤 형태로도 투여될 수 있으며, 바람직하게는 유전자 형태이며, 가장 바람직하게는 DNA 형태이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 카베올린은 카베올린-1, 카베올린-2 및 카베올린-3이며, 바람직하게는 카베올린-1이다. 상기 유효성분이 단백질형태로 투여될 경우 단백질 분해효소에 의해 절단되는 것을 보호하기위해서 캡슐의 형태로 투여될 수도 있다. 또한 상기 유효성분의 Pre-형태인 Pre-단백질의 형태로 투여될 수도 있다. 또한 상기 유효성분을 코딩하는 유전자 형태로 투여될 경우 상기 유전자 담체와 함께 투여될 수 도 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, RNA 바이러스 수송체내에 카베올린이 수송되거나 아데노바이러스 수송체 내에 카베올린이 수송될 수도 있으며, 바람직하게는 짧은 헤어핀의 형태의 RNA 렌티바이러스성 수송체, 아데노바이러스 수송체로 수송되어 인체내에서 DNA 또는 단백질을 발현하여 단백질 치료효과 및 개선효과를 나타낸다.
본 발명의 당뇨병은 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 젊은이에서 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병 및 췌장 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 제 2형 당뇨병이며, 가장 바람직하게는 노화 의존적이며 비만하지 않는 제 2형 당뇨병이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기 위해서 적정량의 염 및 PH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다. 본 발명의 유효성분이 효과적으로 작용하게하기 위해서 미량의 효소를 추가적으로 포함하여 투여할 수도 있다. 또한 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물에 단백질이 포함되는 경우, 본 발명의 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이에는 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물의 모든 투여경로로 투여할 수 있다. 상세하게는 경피, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 내 주입, 근육조직 내 주입 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 근육 내 주입으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 약제학적 조성물의 투여방법을 적용할 수 있으며, 이에 따라 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 유효성분의 생리적 활성을 최대한 유지시키기 위해서 적정량의 염 및 PH 조절제가 용해된 완충용액을 포함할 수 있다.
본 발명은 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료 방법은 상기 당뇨병 치료 및 개선 방법에 의해 관련 질환의 치료 및 예방 효과가 있는 것임으로 상기 당뇨병 치료 및 개선 방법에서 언급한 사항들과 거의 동일하다.
본 발명의 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료 방법은 카베올린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 대상에 투여하는 방법으로, 상기 당뇨병 관련질환으로는 고혈당증(hyperglycemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 내당능 이상(impaired glucose tolerance), 공복혈당장애(impaired fasting glucose), 지질대사이상(dyslipidemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia) 및 인슐린 저항(insulin resistance)등이 있다. 또한 예방 및 치료 대상은 당뇨병 관련 질환이 나타나는 모든 포유동물이며, 바람직하게는 인간이다.
또한 본 발명은 카베올린의 함량을 측정하는 것을 포함하는 포유동물에서 제 2형 당뇨병을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 당뇨병 소견이 있는 포유동물 환자의 근육조직에서 카베올린의 함량이 당뇨병 소견이 전혀 없는 정상포유동물에 비해 상당히 감소함을 확인하였고, 이러한 결과를 바탕으로 카베올린의 함량을 분석하여 제 2형 당뇨병을 진단 할 수 있다. 예컨대, 포유동물의 근육조직으로부터 카베올린의 mRNA 함량 및 단백질의 함량을 측정하여 당뇨병 소견이 없는 정상 대조군의 mRNA 함량 및 단백질의 함량과 비교하여 당뇨병의 여부를 진단 할 수 있다.
여기에서, 카베올린 함량은 카베올린의 DNA, RNA 또는 단백질의 함량을 측정하는 것을 의미하며, 바람직하게는 카베올린의 RNA 또는 단백질을, 더욱 바람직하게는 카베올린의 mRNA 또는 단백질의 함량을 측정하는 것을 의미하며, 가장 바람직하게는 단백질의 함량을 측정하는 것을 의미한다. 이때 상기 RNA 함량은 종래 일반적으로 실시되는 어떤 방법으로도 측정가능하나, 바람직하게는 노던 블랏팅, 면역화학염색법(immunohistochemistry)등에 의해 측정될 수 있으며, 상기 단백질의 함량은 종래 일반적으로 실시되는 항원항체 결합반응을 포함하는 어떤 방법으로도 측정가능하나, 바람직하게는 통상의 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), SDS-폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블랏, 면역 블랏 분석 또는 면역화학염색법(immunohistochemistry)등에 의해 측정될 수 있으며, 바람직하게는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), SDS-폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블랏, 면역 블랏 분석 또는 면역화학염색법(immunohistochemistry)이다. 또한 상기 측정된 카베올린의 함량은 정량적인 방법으로 분석할 수 있으며, 이러한 방법에 의하는 경우에는 PAGE 및 블랏팅을 실시함 다음, 발색된 밴드, 사진 또는 필름의 밴드 또는 영역을 덴시토미터(densitometor)로 읽어 그 차이를 정량화할 수 있다.
한편, 본 발명의 당뇨병 진단방법에 있어서, 카베올린의 함량은 바람직하게는 카베올린-1의 함량을 측정하는 것이며, 포유동물의 근육조직으로부터 분리한 세포 또는 조직의 카베올린 함량을 측정하는 것이다. 이때 바람직한 실시예에서 정량화된 카베올린 함량, 특히 카베올린의 단백질 함량이 당뇨병 소견이 없는 정상대조군이 비해 20％ 및 그 이상 감소할 경우 당뇨병 소견으로 진단할 수 있으며, 바람직하게는 50％ 및 그이상, 가장 바람직하게는 80％ 및 그이상이다.
또한 본 발명의 다른 측면에 의하면, 카베올린의 함량을 측정하는 것을 포함하는 포유동물에서 제 2형 당뇨병을 진단하는 키트를 제시할 수 있다.
본 발명의 진단키트는 상기 카베올린의 함량을 측정하는 것을 포함하는 당뇨병 진단방법을 기초로 하여 발명된 것으로서, 상기 당뇨병을 진단하는 방법에 따르는 내용을 모두 포함한다. 따라서, 본 발명의 진단키트에는 포유동물의 근육조직에서 카베올린-1의 함량을 측정하는 것을 포함한다. 바람직하게는 포유동물의 근육조직에서 카베올린-1의 함량을 측정하여 당뇨병 소견이 없는 정상 대조군과 비교하는 것을 포함한다.
다시 말해서 본 발명의 진단키트는 카베올린-1에 대한 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액, 효소반응 정지 용액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 진단키트에는 대조군과의 비교를 위하여, 대조군 카베올린-1 항원 또는 당뇨 소견이 전혀 없는 정상 포유동물의 근육조직으로부터 분리한 카베올린-1 단백질을 더 포함할 수 있다.
상기 키트를 이용하여 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), SDS-폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블랏, 면역 블랏 분석 또는 면역조직화학염색법(Immnohistochemistry)와 같은 통상의 단백질 함량을 측정방법을 수행 할 수 있으며, 상기의 측정법에 의해 측정된 카베올린-1의 함량을 대조군과 비교하여 제 2형 당뇨병을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 요지가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
＜ 실시예 ＞
1. 노화 의존적이고 비만하지 않는 제2형 당뇨 모델쥐의 제작
C57BL/6와 DBA/2 마우스는 찰스 리버 연구소(Charles River Laboratiry, Wilmington, MA)로부터, ob/ob 마우스는 잭슨 연구소(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였고, 노화 의존적이고 비만하지 않는 제2형 당뇨 모델쥐를 제작하기 위하여 미합중국 공개특허 US 2007/012487호에서 개시된 방법에 따라 암컷 C57BL/6 마우스와 수컷 DBA/2 마우스를 교배하여 1세대 마우스를 얻었으며, 상기 마우스를 JYD마우스라 칭하였다.
JYD 마우스는 특별한 실험을 제외하고 정상 식이를 했으며, 12시간의 낮과 밤의 주기를 유지하였다. 몸무게와 혈중 글루코오즈 수준은 10, 30주령에 각각 측정하였다. 혈액 내 글루코오즈 농도가 250 mg/dl 이상인 동물을 당뇨현상이 생긴 것으로 간주하였다. 당뇨병증이 나타나지 않은 대조군으로는 같은 주령의 C57BL/6와 DBA 마우스를 이용하였다. 동물의 사용과 마취에 사용된 모든 실험방법은 캘거리 대학(캐나다 소재)과 서울대학교 의과대학(대한민국 소재)의 실험동물부에서 승인을 받은 방법으로 수행하다.
2. 세포 배양 방법
쥐에서 유래된 근육세포주인 L6는 ATCC (Manassas, VA) 에서 구입하였고 10％ FBS와 100U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12에서 유지하였다.
3. 글루코오즈 내성 및 인슐린 내성 실험
글루코오즈 내성 실험을 위해 마우스는 16시간동안 금식시킨 후에 글루코오즈 (2 g/kg 몸무게, 피하주사)를 주입하였다. 글루코오즈 주입 후 0, 15, 30, 60, 120분 후에 꼬리 정맥혈을 채취한 후 글루코미터 (One Touch, Lifescan, Milpitas, CA)를 사용하여 혈중 글루코오즈 농도를 측정하였다. 인슐린 내성 실험을 위해 금식시킨 마우스는 인슐린 (1 U/kg 몸무게, 피하주사; Humilin, Lilly, Indianapolis, IN)을 주입하였고, 글루코오즈 주입후 0, 15, 30, 60, 120분 후에 꼬리 정맥혈의 글루코오즈 농도를 측정하였다).
4. 양전자 방사 단층촬영을 이용한 글루코오즈 흡수율 측정
양전자 방사 단층촬영(positron emission tomograph)은 소동물 PET 기계(microPET-R4, Concorde Microsystems Inc., Knoxville, TN)를 이용하여 측정하였다. 마우스는 18-20 시간동안 금식하였고, 방사성 18F-플로로디옥시글루코오즈 (FDG; 7.4 MBq [200 μCi] in 0.1 ml; KIRAMS, Seoul, Korea)를 꼬리 정맥을 통하여 주입하였다. 전반적인 체내 PET 영상은 18F-FDG를 주입하고 1시간 후에 시작하여 30분 동안 진행하였다. 마우스는 이소플루란(0.5％ in 100％ oxygen)을 이용하여 마취를 유지하였고, 실험을 진행하는 동안 30℃의 예열된 패드 위에 올려놓고 실험을 진행하였다.
PET 결과는 히스토그램과 Fourier rebinning(FRB)를 이용하여 2-차원적 초음파검사로 변형하였고, 예상 최대화 알고리즘(expectation maximization algorithm)을 이용한 단층촬영 결과로 재구성하였다. 재구성된 PET 이미지는 그램당 주입된 양의 백분율 이미지로 바꾸었다. 이때 ％ID/g는 (count per pixel * cross calibration factor) /injected dose를 나타낸 것이며, 이때 1 ml는 1 g으로 계산하였다.
5. 단백질 면역 검출 실험
3주, 10주 및 30주령의 DBA/2, C57BL/6, JYD 마우스를 CO2 가스를 이용하여 희생시켰다. 다리의 근육과 다른 조직들을 재빨리 분리하여 액체질소에서 급속 냉동을 시켰고, - 70℃에 보관하였다. 생체내 IRβ 와 Akt/PKB 인산화 정도를 측정하기 위해 마우스를 16시간 동안 금식시키고, 인슐린을 (1U/kg 몸무게, 피하주사)을 주입하였다. 30분 후 근육 조직을 빠르게 분리하여 액체질소에 보관하였다. 분리한 조직들 (10- 30 mg)은 액체질소를 이용하여 잘게 부순 후, 단백질 분해효소 저해제가 포함된 1％ SDS buffer (1％ SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1mM 페닐메틸술포닐프로라이드)를 이용하여 용해한다. L6 세포는 1％ SDS가 포함된 용해용 완충용액을 이용하여 용해한다. 단백질 농도를 맞춘 후, SDS-PAGE에서 분리하고 니트로셀룰로오즈막 (Schleicher ＆ Schuell Bioscence lnc., NJ)에 옮겨서 1차 항체를 다음과 같이 반응을 시켰다; anti-IRβ 항체 (Upstate, Lake Placid, NY), anti-IRS 항체 (Upstate), anti-tubulin 및 anti-GLUT-4 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), anti-Akt/PKB 항체 (New England BioLabs, Ipswich, MA), anti-PPARγ (New England BioLabs), anti-caveolin-1 항체 및 anti-caveolin-3 항체 (BD Transduction, Palo Alto, CA), anti-phospho-IRB 항체 및 phospho-Akt/PKB 항체 (Cell signaling technology, Berverly, MA) 및 항 플로틸린(anti-flotillin) 항체 (BD Transduction).
니트로셀룰로오즈 막을 씻은 후 1시간 동안 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈-컨쥬게이트화 된 2차 항원 (Zymed, San Francisco, CA)을 반응시킨다. 면역방법에 의해 결합된 단백질은 ECL(enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블랏 검침 키트(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 확인하였다. 각 밴드의 양은 노출된 필름을 덴시토메트릭 스캐닝을 통해 측정하였다.
6. RT-PCR 방법을 통한 mRNA 측정
RNA는 트리졸 용액(Sigma, St.Louys, MO)를 사용하여 근육조직과 지방조직에서 분리하였고, 역전사 반응은 2 μg의 RNA를 사용하였다. 각각의 단일가닥 cDNA는 마이오제닌과 렙틴에 특이적인 프라이머(primer)(마이오제닌; 순방향 (sense), 5'-AGC GGC TGC CTA AAG TGG AGA T 역방향 (antisense), 5'-GGA CGT AAG GGA GTG CAG ATT GTG) (렙틴; 순방향 (sense), 5'-CCT GTG GCT TTG GTC CTA TCT G; 역방향 (antisense), 5'-AGG CAA GCT GGT GAG GAT CTG)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시켰다. 마이오제닌 cDNA는 94℃에서 5분간 변성 반응 후, 94℃ 에서 30 초, 60℃에서 30 초, and 72℃에서 30 초를 30 회 반복하여 신장반응을 시켜 72℃에서 5분간 종결반응을 한 후 266 bp의 PCR 결과물을 확인하였다. 렙틴 (leptin) cDNA는 94℃에서 5분간 변성 반응 후, 94℃ 에서 30 초, 61℃에서 30 초, and 72℃ 에서 30 초를 30 회 반복하여 신장반응을 시켜 72℃에서 5분간 종결반응을 한 후 244 bp의 PCR 결과물을 확인하였다. PCR 결과물은 1.2 ％ 아가로오즈 젤에서 EtBr (ethidium bromide)로 가시화하여 전기영동을 이용하여 분리하였다.
7. 면역조직학적 염색
근육조직은 분리하여 Tissue-Tek (Sakura, Netherland) 용액에 고정한 후 저온유지장치 에서 4 μm 두께로 잘라, H ＆ E (hematoxylin-eosin )과 면역조직학적 염색을 위해 슬라이드 글라스에 올려놓는다. 조직내의 페록시다아제 (peroxidase )를 제거하기 위하여 3.0％ H2O2에서 배양 한 후 TBS 버퍼 (0.05 M, pH 7.6)에서 씻어낸다. 슬라이드는 상온에서 5％ 탈지분유 용액에서 1시간동안 반응시킨 후 카베올린-1 항체 (BD transduction, 1:100)와 마이오제닌 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., 1:100)를 4℃에서 하룻밤 반응시킨다. LSAB 키트(DAKO, Denmark)를 사용하여 아비딘- 비오틴 퍼록시다제 콤플렉스 방법으로 염색하였고, 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 대비염색을 하였다. 이 후 슬라이드를 에탄올로 탈수화 시키고, 자일렌으로 씻어낸 후 퍼마운트로 고정시켰다.
8. 카베올레 추출 및 분리
카베올레는 송 등의(8) 방법으로 계면활성제 없이 분리하였다. 간단히 설명하자면, 바이러스가 감염된 근육세포 (L6)를 차가운 PBS로 씻어낸 후 1ml의 0.5 M NaCO3, pH 11.0 buffer로 긁어내어 균질화한다. 균질화된 세포를 MES buffer (25 mM MES, pH 6.5, 0.15 M NaCl)에 녹인 80％ 슈크로즈 용액에 같은 용량으로 넣은 후 섞어서 초원심분리 튜브에 넣고 0.25 M Na2CO3가 포함된 4 ml 30 ％ 슈크로즈 (MES에 녹임)와 4 ml 5 ％ 슈크로즈 (MES에 녹임)를 위에 넣었다. SW41 로터 (Beckman, Fullerton, CA)를 이용하여 39,000 rpm 에서 18시간동안 원심분리 시켰다. 위쪽으로부터 12 구획을 수집하였고, 카베올린 단백질이 발현하는 구획을 카베올레 부분으로, 카베올린 단백질이 발현하지 않는 구획은 비카베올레 부분으로 사용하였다.
9. 짧은 헤어핀 lenti-카베올린-1 바이러스 수송체의 제작 및 분석
카베올린-1 유전자를 목표로 한 짧은 헤어핀구조의 RNA 렌티바이러스 수송체 (shlenti-cav-1)는 shLenti1.1-렌티바이러스성 수송체 (Macrogen, Seoul, Korea)의 EcoR I- Xba I 제한효소 부분에 두 가닥의 올리고 뉴클레오티드 (5'-CGGAATTCCATCTACAAGCCCAACAACttcgGTTGTTGGGCTTGTAGATGTTTTTGATATCTAGACA-3')(상기서열에서 소문자, 밑줄은 상보적인 서열이 없는 헤어핀루프의 루프에 해당하는 부분임)를 넣어 제작하였다. shLenti1.1-렌티바이러스성 수송체는 U6 프로모터 로부터 shRNA를 생산하여 IRES 시스템으로부터 GFP 단백질을 발현하도록 제작하였다. 대조군 수송체로서 (shlenti-GFP) 다음의 올리고뉴클레오티드(5'-AATCGCATAGCGTATGCCGTT-3')를 위와 같이 shLenti1.1-렌티바이러스성 수송체에 넣었다. 세포상에서 형질도입된 효율을 조사하기 위하여 L6 세포에 렌티바이러스 수송체를 (3× 105 MOI)로 감염시켰다. 형질 변환된 세포의 GFP 발현은 형광현미경과 단백질 면역 검출방법을 이용하여 조사하였다.
Shlenti-카베올린-1과 shlenti-GFP 수송체 (3× 107 MOI)를 30주령의 C57BL/6 마우스의 다리 근육에 주입하였다. 생체내 형질이 도입된 효율을 알아보기 위해 근육 조직을 4 μm 두께로 조각을 내어 면역조직학적 염색을 시도하였다.
10. 아데노바이러스 성 카베올린-1 수송체의 제작 및 분석
감염성 재조합 아데노바이러스는 AdEasy 방법을 이용하여 만들었다 (20). 카베올린-1이 발현되는 재조합 아데노바이러스 (Ade-cav-1)는 야생형(wild-type) caveolin-1 cDNA를 셔틀플라스미드 (pAdTRACK-CMV; Invitrogen)에 넣어 제작하였고, 상동성 재배열은 이 셔틀 수송체를 가진 E. coli BJ5183에서 만들었다. 재조합된 바이러스들은 가나마이신을 이용하여 선택한 후, 제한효소에 의한 절단을 시행하였다. HEK293 세포에서 선형화된 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 감염시킨 후 아데노바이러스를 생산하였다.
15cm 플레이트에서 HEK 293 세포를 불린 후 BD Adeno-X 정제키트 (Clontech, Palo Alto, CA)로 순수 정제하였다. 대조군 수송체 (Ade-GFP)는 위에서 언급된 그린 형광 단백질을 가진 cDNA를 이용하여 생산하였다. Ade-카베올린-1과 Ade-GFP의 효율은 GFP 발현양과 단백질 면역검출 방법으로 조사하였다.
30주가 되어 당뇨가 생긴 JYD 마우스 근육에 Ade-GFP와 Ade-cav-1 (3 × 1011 PFU/mouse)를 감염시켰다. 생체 내에 형질도입된 효율은 면역조직학적 염색방법과 IVIS 이미지화 시스템 100 시리즈(Xenogen, Alameda, CA)를 이용하여 생체내 형광 이미지로 확인하였다 (21).
11. 통계처리
모든 실험결과들은 평균 ±±준오차로 나타내었다. 통계분석은 1차 팩토리얼(1-xay factorial) ANOVA를 이용하였고 쌍 비교(pair-wise comparisons)는 피셔의 최소유효차(Fisher's least significant differences)로 평가하였다.
통계적 유의성은 P＜0.05로 가정하였다.
＜ 실험결과 ＞
1. JYD 마우스의 제2형 당뇨모델로서의 타당성
JYD 마우스의 당뇨가 생기는 현상을 확인하기 위하여, 우리는 수컷 JYD 마우스와 모체인 수컷 C57BL/6와 DBA/2 마우스의 혈액내 글루코오즈 수준을 비교하였다. 10주령의 수컷 JYD 마우스의 평균 혈중 글루코오즈 농도(182.8 mg/dl)는 대조군인 수컷 C57BL/6 (163.0 mg/dl)와 DBA/2 (151.3 mg/dl) 마우스에 비해 유의적으로 높았다. 30주령의 수컷 JYD 마우스의 혈중 글루코오즈 농도는 10주령에 비해서도 유의적으로 높았다 (도1A). 혈액의 글루코오즈 농도가 250mg/dl이상인 것을 당뇨증상이 생긴 것으로 간주하였다 (22). 30주령의 수컷 JYD 마우스 당뇨 발병율(51％, 24/47)은 같은 시기의 수컷 C57BL/6와 DBA/2 마우스(8.7％, 4/46과 2.2％, 1/46, 도1B)와 비교하여 유의적으로 높았다. 10주령의 수컷 JYD의 당뇨 발병율은 10.6％를 보인 반면, 같은 시기의 수컷 C57BL/6와 DBA/2 마우스나 (도1B), 암컷 JYD에서는 (결과는 나타내지 않음) 당뇨가 생기지 않음을 확인하였다. 10주령의 수컷 JYD의 몸무게는 같은 시기의 수컷 C57BL/6나 DBA/2 마우스보다 유의적으로 높게 나타났으나 30주령에는 유의적으로 차이가 나지 않음을 확인하였다 (도1C). 암컷 JYD 마우스는 모든 시기에 혈액내 글루코오즈 농도나 몸무게가 정상임을 확인하였다 (결과는 나타내지 않음).
2. 글루코오즈와 인슐린 내성 측정
우리는 각각 10주와 30주령에 수컷 JYD 마우스의 글루코오즈 내성실험을 시행하였다. 10주령의 JYD 마우스에서 글루코오즈 주입 15분 후 혈액내 글루코오즈 농도가 최대를 이루었고, 실험을 수행하는 모든 지점에서 수컷 C57BL/6와 DBA2마우스와 비교하여 유의적으로 높게 나타났다 (도2A). 30주령의 수컷 JYD 마우스는 10주령에 비해 글루코오즈 저항성에 좀 더 심각한 손상이 온 것을 관찰하였다. 수컷 C57BL/6 또한 30주령에 글루코오즈 저항성에 손상이 있는 것을 발견한 반면, 수컷 DBA/2는 외부의 글루코오즈를 정상적으로 제거하는 것을 관찰하였다 (도2B). 또한 수컷 JYD 마우스가 인슐린 민감성에도 문제가 있는지 확인하기 위하여 인슐린 저항성 실험을 시행하였다. 10주령의 수컷 JYD마우스의 혈액내 글루코오즈 농도는 인슐린 주입 후 수컷 C57BL/6와 DBA/2와 비교하여 유의적으로 감소되지 않았다 (도2C). 30주령의 수컷 JYD는 인슐린에 반응하지 않아 혈액내 글루코오즈가 감소되지 않음을 확인하였다 (도2D).
3. 양전자 방사 단층촬영을 이용한 글루코오즈 대사율 측정
제 2형 당뇨환자는 체내 글루코오즈 활용률이 감소되어 있기 때문에 방사성 fluoro-Deoxyglucose (FDG) 흡수가 낮은 것으로 보고되었다. (23). 양전자 방사 단층촬영을 이용하여 조직의 FDG 양을 측정하는 것은 국부적인 글루코오즈 대사율을 측정하는 방법으로 사용되어 왔다 (24). 따라서 우리는 이 방법을 이용하여 수컷 JYD 마우스의 전반적인 글루코오즈 이용률을 조사하였다; C57BL/6와 ob/ob 마우스는 대조군으로 사용하였다. 30주령의 C57BL/6 마우스의 FDG 흡수율은 같은 주수의 JYD 마우스나 10주령의 ob/ob 마우스와 비교하여 특히, 뇌와 폐, 척추에서 높은 것으로 나타났다 (도3). JYD 마우스의 전반적인 글루코오즈 흡수율은 ob/ob마우스와 비슷하게 나타났다.
4. 근육조직에서 인슐린 신호전달 단백질들과 인산화된 단백질들 발현양 측정
JYD 마우스의 노화 의존적인 제 2형 당뇨의 발병기전을 알아보기 위해, 인슐린 수용체기질(IRS-1 (insulin receptor substrate)), 인슐린 수용체 (insulin receptor β, IRβ), Akt/PKB(Akt/protein kinase B), PPAR-γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ), 그리고 글루코오즈 수송체-4 (glucose transporter-4, GLUT-4)와 같은 인슐린 신호전달 관련 단백질들의 발현을 3, 10, 30주령의 JYD와 대조군인 DBA/2, C57BL/6에서 측정해 보았다 (도 4A). JYD와 C57BL/6 두 마우스 모두에서 노화가 되면서 IRS-1, Akt/PKB, PPAR-γ의 발현양이 유의적으로 감소된 반면, IRβ와 GLUT-4의 발현양은 변화하지 않았다 (도4B). DBA/2 마우스에서는 이러한 단백질들의 발현양이 노화에 따라서 아무런 변화가 없었다 (도 4B).
인슐린 작용의 손상은 인슐린 신호전달에 포함되는 단백질들의 발현양 뿐 만 아니라 그들의 활성 변화에 의해서도 영향을 받는 것으로 알려져 있다 (25). 따라서 우리는 30주령의 DBA/2, C57BL/6, JYD 마우스에 인슐린 주입 후 IRβ와 Akt/PKB의 인산화 정도를 측정하였다. DBA/2 마우스에서는 인슐린 주입에 의해 IRβ와 Akt/PKB의 인산화가 증가하는 것을 관찰하였으나, C57BL/6와 JYD 마우스에서는 대조군과 비교하여 인산화에 차이가 나지 않음을 확인하였다 (도4C). 이러한 결과는 30주령의 C57BL/6와 JYD 마우스에서 손상된 인슐린 민감성이 인슐린 신호전달 단백질들의 발현양의 감소 및 그의 활성이 감소됨으로서 나타난 결과임을 제시한다.
5. 근육조직과 그외 인슐린에 민감한 조직에서 카베올린의 발현양 측정
JYD 마우스의 당뇨 발병기전에 카베올린이 관여하는지 알아보기 위해, 우리는 3, 10, 30주령의 DBA/2, C57BL/6, JYD 마우스 근육조직에서 카베올린 발현양을 측정하였고, 단백질 면역 검출방법을 통해 카베올린-1 발현양이 3주에 비해 30주령에 증가되어 있음을 확인하였다 (도5A). 그러나 DBA/2나 C57BL/6 마우스의 근육 조직에서는 카베올린-1 발현양이 약 8배정도 증가됨에 반해, JYD 마우스는 약 2배정도 증가되었다 (도5B). 근육조직에 특이적인 카베올린-3의 발현양은 DBA/2, JYD, C57BL/6에서 노화가 됨에 따라 변화하지 않음을 확인하였다.
근육조직 외에도 우리는 3, 10, 30주령의 DBA/2, C57BL/6, JYD의 지방조직, 간, 췌장에서 카베올린-1 발현양을 조사하였다. 도5A에서 보다시피, 이러한 조직에서 노화에 따른 카베올린-1 발현양의 증가폭은 C57BL/6와 DBA/2 마우스에 비해 JYD 마우스에서 유의적으로 낮은 것으로 나타났고 다른 조직에서의 변화의 정도도 근육만큼 크지는 않았다.
노화된 근육조직은 지방조직을 포함할 수도 있다는 보고가 있다 (26). 따라서 우리는 근육조직에서 발현된 카베올린-1 단백질이 노화된 근육조직내의 지방세포에서 비롯되었다는 것을 배제하기 위해, 30주된 마우스의 근육조직에서 RT-PCR 방법으로 아디포제닉 (adipogenin) 유전자인 렙틴 (leptin)과 근육조직의 표지자인 마이오제닌 (myogenin)을 측정하였다. 도5C에서 볼 수 있듯이, 렙틴 (leptin)의 발현은 근육조직이 아닌 지방조직에서만 발현되었고, 반면 마이오제닌 (myogenin)은 근육조직에서만 발현함을 확인하였다. 이러한 결과들로서, 근육에서 발현된 카베올린-1은 지방조직에서 유래한 것이 아님을 확인하였다. 또한 면역조직학적 염색방법을 이용하여 30주된 JYD 마우스의 근육조직에서 카베올린-1 발현양이 C57BL/6 마우스와 DBA2 마우스와 비교하여 낮은 것을 확인하였고 (도5D), 이것은 단백질 면역 검출실험에서 나타난 결과와 비슷한 현상임을 관찰하였다 (도5A,5B).
또한 우리는 당뇨가 생기지 않은 F1 수컷과 암컷 마우스의 카베올린-1 발현양을 측정하였다. 도5E에서 보시다시피, 당뇨가 생기지 않은 마우스의 카베올린-1 발현양은 당뇨가 생긴 마우스의 발현양보다 높게 나타나고 있었다.
6. C57BL/6 마우스에서 렌티바이러스를 이용한 카베올린-1 발현양 감소가 글루코오즈 내성과 인슐린 민감성을 감소시킨다.
C57BL/6, DBA 마우스와 비교하여 JYD 마우스에서 노화가 되면서 카베올린-3가 아닌 카베올린-1의 증가폭의 차이를 관찰하였고, 또한 지방세포와 관련된 카베올린-1은 글루코오즈 대사와 에너지 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 이미 보고가 되었으므로 (10), 우리는 비만하지 않은 형태의 당뇨모델인 JYD 마우스를 사용하여 근육의 인슐린 민감성에 카베올린-1의 효과에 대해 중점적으로 연구를 하였다. C57BL/6와 DBA/2마우스는 JYD 마우스에 비해 카베올린-1의 발현이 유의적으로 높게 나타났기 때문에 (도5), 우리는 카베올린-1 발현 감소가 C57BL/6 마우스의 글루코오즈, 인슐린 내성에 부정적인 영향을 미치는지에 대해 의문을 가졌다. 이 질문에 답을 하기 위해, 우리는 카베올린-1 발현을 감소시키는 짧은 헤어핀 RNA를 발현하는 렌티바이러스를 제작하였고, 표지로서 그린 형광 단백질 (GFP)를 발현하도록 하였다. 대조군으로 스크램블드 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 GFP-발현 렌티바이러스를 사용하였다 (도6A). 우리는 우선, L6세포 수준에서 렌티바이러스에 의한 카베올린-1 발현 감소의 효과를 측정하였다. 형광현미경을 이용하여 L6 세포에서 virus가 성공적으로 감염되는 것을 확인하였고 (도6B), 단백질 면역 검출방법으로 shlenti-카베올린-1 감염의 결과 카베올린 발현양이 감소됨을 확인하였다 (도6C). 슈크로즈 농도 구배 프랙션 후에 카베올레 부분/비카베올레 부분을 조사한 결과, 카베올레 구획에서의 카베올린-1 발현양이 shlenti-카베올린-1이 감염된 세포에서 저하되어 있었다 (도6D). 우리는 30주령의 C57BL/7 마우스의 근육에 shlenti-GFP와 shlenti-카베올린-1을 주입하였다. 도6E에서 보는 바와 같이, 면역 조직학적 방법을 통해 shlenti-GFP를 처리한 마우스에서보다 shlenti-cav-1을 처리한 경우 카베올린-1 발현이 감소되어 있음을 확인하였다. 주입한 후 2주 후에 shlenti 바이러스 발현 효율이 감소되었기 때문에 (결과는 나타내지 않음), 바이러스 주입후 2주내에 실험을 시행하였다. 바이러스 주입 12일 후, shlenti-카베올린-1을 주입한 마우스의 혈액내 글루코오즈 수준이 대조군 마우스에 비해 유의적으로 감소되었다 (결과는 나타내지 않음). 주입 후 14일 후, 카베올린-1 발현이 저하된 마우스가 shlenti-GFP를 주입한 마우스보다 글루코오즈, 인슐린 내성이 심각하게 손상되어 있음을 관찰하였다 (도6F, 6G). 몸무게를 비교해 보았을 때, lentivirus를 주입하고 4주 후까지 큰 변화를 보이지 않았다 (결과는 나타내지 않음).
7. 30주령의 JYD 마우스에서 아데노바이러스를 이용한 카베올린-1 발현양 증가가 글루코오즈, 인슐린 내성과 글루코오즈 흡수를 증가시킨다.
JYD 마우스의 카베올린-1 발현양이 C57BL/6 마우스에 비해 유의적으로 감소되어 있었기 때문에, 우리는 30주령의 JYD 마우스에 카베올린-1 과발현이 글루코오즈, 인슐린 내성에 긍정적으로 영향을 미치는지 의문을 가졌다. 우리는 대조군으로 GFP만 발현되는 아데노바이러스 수송체와 함께 카베올린-1과 GFP가 발현되는 아데노바이러스를 사용하였다 (도7A). 우리는 우선 L6 세포상에서 카베올린-1이 과발현되는 바이러스의 효율을 측정하였다. 형광 현미경을 이용하여 세포에 성공적으로 감염되는 것을 확인하였고 (도7B), 단백질 면역검출방법을 통해 카베올린-1 아데노바이러스에 감염된 세포가 대조군 바이러스에 의해 감염된 세포보다 카베올린-1 발현양이 증가되어 있음을 관찰하였다 (도7C). 슈크로즈 농도 구배 프랙션을 한 후 카베올레 부분/비카베올레 부분을 조사한 결과 카베올린-1 아데노바이러스에 감염된 세포의 카베올레 부분에서 카베올린-1 발현양이 증가된 것을 확인하였다 (도7D). 근육부분에 아데노바이러스를 주입한 것이 다른 조직에도 영향을 미치는지 알아보기 위하여 우리는 GFP만 발현되는 아데노바이러스 (3 × 1011 pfu)를 근육부분에 주입한 후 근육과 지방세포, 간에서 조사해 보았다. 단백질 면역 검출방법과 (도7E) 형광 이미지화 (결과는 나타내지 않음)를 이용하여 GFP 단백질을 근육에 주입 후, 형광이 근육부분에서만 나타남을 확인하였고, 정맥을 통해 주입하였을 경우에는, 다른 조직에서도 형광 단백질 발현을 관찰하였다. 카베올린-1 아데노바이러스를 JYD 마우스의 근육에 주입 후 근육의 면역염색 방법으로 관찰한 결과, 카베올린-1 발현양이 대조군 바이러스를 주입한 경우보다 증가되어 있음을 확인하였다 (도7F). 생체 내 형광 이미지화방법을 통해 우리는 카베올린-1 발현양이 주입 후 3일 후 최대로 발현되는 것을 확인하였고 (결과는 나타내지 않음), 따라서 바이러스를 주입 후 3일째 되는 날 실험을 시행하였다.
카베올린-1 아데노바이러스와 GFP 아데노바이러스를 JYD의 근육에 주입 후, 3일이 지난 후 글루코오즈, 인슐린 내성실험을 수행하였다. 대조군인 GFP 바이러스를 주입한 경우보다 카베올린-1 바이러스를 주입하였을 때 외부에서 주입된 글루코오즈가 효과적으로 제거되었다 (도8A). 또한 카베올린-1 바이러스를 처리한 마우스에서 외부에서 주입한 인슐린에 의해 혈액 내 글루코오즈 양이 유의적으로 감소되어 있음을 확인하였고, 이러한 결과는 이 마우스에서 인슐린 민감성이 증가된 것을 의미한다 (도8A). GFP 아데노바이러스와 카베올린-1 아데노바이러스를 JYD 마우스의 다리 근육에 각각 한쪽씩 주입후, 양전자방사단층 촬영 방법(23) 으로 글루코오즈 흡수량을 확인하였다. 주입 후 3일 후, 카베올린-1 바이러스를 주입한 근육의 글루코오즈 흡수량이 대조군에 비해 증가한 것을 관찰하였다 (도8C, 8D). 이러한 결과들은 카베올린-1의 과발현이 근육의 글루코오즈 흡수를 촉진시킴으로서 JYD 마우스의 인슐린 민감성을 증가시키는데 중요한 역할을 하고 있음을 제안한다.
＜ 토의 ＞
우리는 수컷 JYD 마우스가 노화가 되면서 심각한 고지혈증으로 발전하고 또한 모체인 C57BL/6와 DBA와 비교하여 비만하지 않음을 관찰하였다. 따라서 JYD 마우스는 성인성 질환인 제 2형 당뇨의 발병에서 노화의 역할을 연구하기에 적합한 모델이라 여겨진다.
근육은 인슐린을 매개로 한 글루코오즈 흡수에 기본이 되는 조직인 반면, 지방조직은 글루코오즈 흡수가 느리게 일어나고, 전체 글루코오즈 흡수의 약 2-3％만 담당하는 것으로 알려져 있다 (27). 글루코오즈 흡수에서 노화의 역할에 대한 많은 연구들은 근육의 인슐린 민감성 감소에 대해 집중적으로 보고하고 있다 (28, 29). 이러한 연구결과들은 노인들에게서 근육의 인슐린 저항성이 중요하다는 것을 제안하는 것이지만, 근육에서의 노화 의존적인 글루코오즈 흡수에 대한 정확한 기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 따라서 우리는 본 논문에서 이러한 부분을 초점을 맞추어 JYD 마우스를 이용하여 연구하고자 하였다.
말초 조직에서 인슐린에 저항성이 있을 경우, 혈액내의 글루코오즈는 조직으로 효과적으로 흡수 되거나 대사되지 못하게 되어 고지혈증이 나타나게 된다. 수컷 JYD 마우스는 모체인 DBA/2와 비교하여 외부에서 주입된 글루코오즈를 효과적으로 제거하지 못하였고, 외부에서 주입된 인슐린에 의해서도 혈액내의 글루코오즈 농도를 효과적으로 낮추지 못하였다. 흥미롭게도 C57BL/6 마우스도 30주가 되었을 때 글루코오즈 내성이 손상되었고, 인슐린 반응에도 약간의 결함이 있음을 확인하였다. 그러나 C57BL/6 마우스는 수컷 JYD 마우스와 비교하여 심각한 고지혈증으로 발전되지는 않았다.
인슐린은 인슐린 수용체를 활성화하여 인슐린 수용체의 인산화 잔기, PI3-키나아제 (phosphatidylinositol 3-kinase)와 Akt/PKB의 인산화를 활성화시킨다 (30, 31). 이러한 신호전달체계의 활성화는 글루코오즈 수송체-4와 글루코오즈 대사를 통한 글루코오즈 이동을 증가시킨다. IRS는 인슐린 수용체와 PI3-키나아제와 같은 다른 여러 신호전달 분자들 사이에서 다리역할을 하고 있다 (31). 따라서 이러한 신호전달체계에 있는 분자들의 발현 감소 또는 그들의 기능감소는 인슐린 저항성을 가져오게 된다 (32). 예를 들어, 인슐린 수용체나 IRS-2(33), 또는 Akt (34) 들의 발현억제와 같은 인슐린 신호전달체계에서의 어느 한 분자의 결함은 제 2형 당뇨현상을 나타내게 된다.
노화에 따른 제 2형 당뇨의 기전을 알아보기 위해, 우리는 우선 근육조직에서 인슐린 신호전달 단백질들을 측정해보았다. 30주령의 C57BL/6와 JYD 마우스에서 글루코오즈 내성, 인슐린 내성이 손상되어있음을 관찰하였고 이러한 현상은 근육에서의 IRS-1, Akt/PKB, PPAR-γ의 발현감소와 인슐린 주입에 의한 IRβ, Akt/PKB의 인산화 활성 감소에 의해서 부분적으로 일어나고 있음을 확인하였다. 그러나 C57BL/6의 당뇨병 발병율(8.7％)은 JYD 마우스의 당뇨병 발병율(51％)보다 유의적으로 낮았으며, 이러한 결과는 직접적인 인슐린 신호전달 체계 외에 또 다른 결함에 의해서 당뇨현상이 나타나고 있음을 제시해준다.
선행연구를 통해 우리는 카베올린이 세포막의 중요한 분자이고, 이것은 세포의 노화 현상에 결정적인 역할을 하고 있음을 보고하였다 (35). 따라서 우리는 카베올린 발현양이 모체 마우스와 비교하여 JYD 마우스에서 노화에 따라서 어떻게 변화하는지 조사해 보았다. 카베올린-3 발현양은 모든 마우스 종류에서 어떠한 변화도 나타나지 않았다. 흥미롭게도 모든 종류의 마우스에서 노화에 따라 근육조직의 카베올린-1 발현양이 증가된 것을 관찰하였고, 그러나 C57BL/6와 DBA/2 마우스에서의 증가율은 JYD 마우스에서 보다 높게 나타났다. 이러한 결과들은 카베올린-1의 결함이 제 2형 당뇨의 발병과 JYD 마우스 모델에서 인슐린 민감성에 중요한 요소임을 나타낸다. 이와 비슷한 결과로, 카베올린-1 발현이 감소된 마우스는 인슐린 저항성을 나타내고 특히 지방조직에서 인슐린 수용체 단백질들의 발현 감소를 가져왔다고 보고되었다 (10). 비록 근육 조직에서처럼 다른 조직에서도 노화에 따라서 카베올린 발현양이 마우스별로 비슷한 경향을 보였지만, 우리는 제 2형 당뇨에서 근육조직의 인슐린 저항성에 중요성을 두었고, 또한 선행연구를 통해서 카베올린-1이 근육세포에서 글루코오즈 흡수에 중요한 역할을 한다(18)는 보고를 하였기 때문에 근육에서의 카베올린-1 수준을 조절하는데 초점을 맞추었다.
인슐린 민감성 조절에 있어서 카베올린-1의 역할을 알아보기 위해 우리는 C57BL/6 마우스에서 카베올린-1의 발현을 감소시켰고, 또한 JYD 마우스에서는 카베올린-1 발현을 증가시켰다. C57BL/6 마우스에서 RNA 간섭에 의해 카베올린-1 발현을 감소시켰을 때 혈액내 글루코오즈 수준이 증가하였고, 글루코오즈 내성과 인슐린 내성이 대조군 C57BL/6와 비교하여 손상되어 있음을 관찰하였다. 반대로 JYD 마우스에 카베올린-1을 과발현시킬 경우 글루코오즈 민감성과 인슐린 민감성이 증가하였고, 근육조직에서 글루코오즈 흡수량이 증가하였다. 우리는 또한 C57BL/6와 DBA의 교배에서 생긴 1세대 마우스중 당뇨가 생기지 않은 마우스를 조사한 결과, 카베올린 발현양이 당뇨가 생긴 마우스 보다 높게 발현되고 있음을 관찰하였다. 이상의 결과들은 근육조직에서 카베올린-1 수준과 JYD 마우스의 당뇨현상의 발생이 큰 상관성을 가지고 있음을 나타낸다.
세포내에서의 글루코오즈 수송과 이용률은 인슐린 저항성의 발병원인으로 여겨지고 있다 (18, 32, 36). 우리는 기존연구를 통해 글루코오즈 수송체-4가 카베올린이 존재하는 세포막 부분에서만 (18, 37) 발현되고 있음을 확인하였고, 카베올린-1이 글루코오즈 수송체-4의 발현양을 변화시키기보다는 근육세포에서의 글루코오즈수송체-4의 이동에 따른 인슐린 의존적인 글루코오즈 흡수와 관련된다는 것을 확인하였다 (18). 카베올린-1은 세포의 이동에 관여하고 카베올레에는 글루코오즈 수송에 필요한 수송체 형성에 필요한 (31) soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor (SNARE) 단백질을 포함한 많은 분자들이 포함되어 있음이 잘 알려져 있다 (38, 39). 따라서, 카베올린-1이 이러한 분자들을 조절함으로서 글루코오즈 수송체-4의 이동에 영향을 주었을 것이다. 또한, 운동에 의한 근육에서의 카베올린-1 과발현이 인슐린 민감성에 영향을 미치는 중요한 요소가 될 것이다 (40). 이러한 결과들은 카베올린-1 발현 증가가 글루코오즈 흡수 시스템을 통해 인슐린 민감성을 증가시킨다는 개념을 뒷받침해주고 있다.
우리는 노화 의존적인 제 2형 당뇨모델인 JYD 마우스와 ob/ob 마우스를 비교하였다. 이를 위해 ob/ob 마우스에서 카베올린 뿐만 아니라 인슐린 신호전달체계와 관련된 분자들의 발현양을 확인하였다. 흥미롭게도 비만증상을 가진 ob/ob 마우스의 인슐린 저항성은 지방세포의 글루코오즈 수송체-4의 감소에 의해서 나타나는 현상임을 확인하였고(결과는 나타내지 않음), 대조군 마우스와 비교하여 카베올린-1 발현에는 큰 차이가 없음을 관찰하였다.
카베올린-1 발현 저하된 마우스가 지방조직에서 인슐린 저항성을 나타내는 것은 이미 보고가 되었다 (10). 그러나 이러한 현상은 노화 의존적인 현상이 아니며, 카베올린-1이 지방조직에서 인슐린 수용체와 직접적으로 결합하고 있기 때문에 카베올린-1 발현저하에 따른 인슐린 수용체 발현의 결함에 의한 것이다. 근육 조직에서는 카베올린-3 발현 저하 마우스가 인슐린 주입에 의한 IRB, IRS-1/2 인산화 결함에 의한 인슐린 저항성을 보인다고 보고된 바가 있다. 그러나 기존에 우리가 선행연구를 통해 제안하였다시피 근육세포에서의 GLUT-4 수송은 지방세포에서 알려진 것처럼 IRβ 신호전달체계와는 다른 기전을 통해서 이루어지기 때문에 근육에서의 카베올린-1의 역할은 지방조직의 카베올린-1과는 다르다. 게다가 카베올린-3 저하 마우스는 근육에서 근섬유 형성의 이상을 초래하고 (41), 카베올린-3 결함은 사지연결근육퇴행위축(limb girdle muscular dystrophy)에 의한 근육의 세포사멸과 근육질환을 초래한다 (42). 따라서 카베올린-3 결함 마우스에 있어서, 인슐린 저항성이 카베올린-3에 의한 것인지, 근육 조직 자체의 이상에 의한 것인지는 확실하지가 않았다.
노화 의존적인 제 2형 당뇨의 기전에 대한 선행 연구들은 비만인 동물모델을 이용해서 진행되어 왔다 (43-45). 본 발명에 의해 노화에서 제 2형 당뇨의 발병이 증가되는 것을 설명할 수 있고, JYD 모델이 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨를 연구하는데 적합하며, 상기 JYD 마우스의 근육에서 카베올린-1 상태가 노화 상태에서 비만상태 없이 제 2형 당뇨의 발병을 증가시키는 기전에 중요한 요소임을 제안하는 증거를 제시하였다.
결론적으로, 본 발명자는 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨 모델인 JYD 마우스의 근육조직에서의 카베올린-1 발현 감소가 JYD 마우스의 당뇨현상을 발전시킴과 동시에 카베올린-1 발현에 의해 JYD 마우스의 인슐린 민감성을 조절할 수 있음을 확인하였다. 따라서 노화 의존적이고 비만하지 않은 제 2형 당뇨 환자에서 근육조직의 카베올린양을 증가시켜 인슐린 민감성을 조절함으로서 당뇨병을 개선 및 치료하는 방법으로서 효과가 우수하다.
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Claims (22)
- 카베올린을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료 및 개선용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 카베올린은 카베올린-1인 것을 특징으로 하는 당뇨병의 치료 또는 개선용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 당뇨 합병증의 예방 및 치료적 용도를 추가적으로 더 포함하는 당뇨병의 치료 또는 개선용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 1형 당뇨, 제 2형 당뇨, 젊은이에서 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병 및 췌장 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 당뇨병의 치료 및 개선용 조성물.
- 카베올린을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병을 치료 및 개선하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 카베올린은 카베올린-1, 카베올린-2 및 카베올린-3 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 당뇨병을 치료 또는 개선하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 카베올린은 카베올린-1인 것을 특징으로 하는 당뇨병을 치료 또는 개선하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 1형 당뇨, 제 2형 당뇨, 젊은이에서 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병 및 췌장 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 당뇨병을 치료 및 개선하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 당뇨병을 치료 또는 개선하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 제 2형 당뇨병은 노화 의존적이고 비만하지 않는 것을 특징으로 하는 당뇨병을 치료 또는 개선하는 방법.
- 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 포유동물의 지방조직, 근육조직, 췌장, 췌장 인접조직 또는 말초혈류 중 적어도 한 곳으로 투여하는 것을 특징으로 하는 당뇨병을 치료 또는 개선하는 방법.
- 제 6항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 포유동물의 근육조직에 투여하는 것을 특징으로 하는 당뇨병을 치료 또는 개선하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 당뇨병을 치료 또는 개선하는 방법.
- 카베올린을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 카베올린은 카베올린-1인 것을 특징으로 하는 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 1형 당뇨, 제 2형 당뇨, 젊은이에서 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병 및 췌장 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료방법.
- 제 18 항에 있어서, 상기 제 2형 당뇨병은 노화 의존적이고 비만하지 않는 것을 특징으로 하는 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 당뇨병 관련 질환은 고혈당증(hyperglycemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 내당능 이상(impaired glucose tolerance), 공복혈당장애(impaired fasting glucose), 지질대사이상(dyslipidemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia) 및 인슐린 저항(insulin resistance)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 관련 질환의 예방 및 치료방법.
- 포유동물의 근육조직에서 카베올린-1의 함량을 측정하는 것을 포함하는 포유동물에서 제 2형 당뇨병을 진단하는 방법.
- 포유동물의 근육조직에서 카베올린-1의 함량을 측정하는 것을 포함하는 포유동물에서 제 2형 당뇨병을 진단하는 키트.
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