KR20100108497A - 내부 세포 덩어리의 분리 방법 및 이를 이용한 배아 줄기 세포주의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내부 세포 덩어리의 분리 방법 및 이를 이용한 배아 줄기 세포주의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포를 바탕영양세포 등의 영양공급층 위에 놓고 커버로 덮어 일정한 압력을 가함으로써 일관된 높은 수율로 내부 세포 덩어리를 분리할 수 있는 방법과 이를 이용한 배아 줄기 세포주의 효과적인 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상실배 또는 배반포에 일정 압력을 가한 상태로 최대한 자연적인 변화를 유도하기 때문에 세포 덩어리를 미분화 상태로 손상 없이 분리 및 배양하여 배아 줄기 세포주로 성립시키는데 유용하며, 조작이 간단하여 작업 시간을 절약할 수 있다.
내부 세포 덩어리, 배아 줄기 세포주, 커버
Description
본 발명은 세포에 일정한 압력을 가하여 고수율로 안정적으로 내부 세포 덩어리(ICM)를 분리 및 배양할 수 있는 방법과 이를 이용한 배아 줄기 세포주의 제조 방법에 관한 것이다.
정자와 난자가 결합하면 수정란이 형성되고 수정란은 세포분열을 통해 상실배(morula)를 형성하고, 그 후 배반포(blastocyst)로 성숙된다. 이 배반포의 안쪽에는 내세포괴라고도 불리는 내부 세포 덩어리(inner cell mass)가 있는데, 이 세포들이 세포분열과 분화를 거쳐 배아(embryo)를 형성한다. 배아는 임신 기간을 거쳐 하나의 개체로 발생하게 된다. 최근 학계에서는 상실배의 내부에도 배반포의 경우와 마찬가지로 내부 세포 덩어리가 존재하는 것으로 보고 있다.
내부 세포 덩어리의 세포를 상실배 또는 배반포로부터 분리하여 일정한 환경에서 배양하면 더 이상 분화는 일어나지 않지만 분화할 수 있는 능력은 여전히 가 지고 있는 세포를 만들 수 있다. 이 세포를 배아 줄기 세포(embryonic stem cell)라고 한다. 즉, 배아 줄기 세포는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로서 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 아직 분화되지 않은 세포를 말한다.
배아 줄기 세포는 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖고 있으며 이론적으로는 무한정 세포분열을 할 수 있다. 이러한 특성 때문에 배아 줄기 세포는 부상이나 질병 등으로 조직이 손상되었을 때 그 조직을 재생시키는 데 이용할 수 있을 것이라고 기대되고 있다. 특히, 1998년 톰슨(Thomson) 등이 인간 배아 줄기 세포의 배양에 성공한 이후에는 줄기세포를 이용한 세포 치료(cell therapy) 분야의 연구가 더욱 활발해 지고 있다.
이에 따라, 배아 줄기 세포를 만들기 위한 전제가 되는 내부 세포 덩어리의 분리 및 배양 방법에 대한 연구도 활발히 진행되어 왔다. 그 중 현재 통상적으로 사용되고 있는 방법은 면역학적 분리 방법(immunosurgery)이다. 면역학적 분리 방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 수정란의 투명대(zona pellucida)를 프로네이즈(pronase) 0.1% 로 약 1-2분간 녹인다. 그 후 투명대 안에 들어 있는 배반포 세포덩어리를 100%의 항-휴먼 혈청 항원 용액(anti-human serum antibody)에 약 20분간 정치시킨 후 다시 기니피그 혈장액(guinea pig complement)에 약 30분간 정치시키면 영양 배엽층이 파괴되어 내부 세포 덩어리를 분리할 수 있게 되는 것이다. 이와 같이 면역학적 내부 세포 덩어리 분리 방법은 화학적 처리를 바탕으로 한다.
면역학적 분리 방법에 따라 분리된 내부 세포 덩어리는 태아 섬유아세포(바 탕영양세포)에 정착을 해서 증식이 되고, 이의 밀도 및 크기가 증가하게 되면 이를 배아줄기세포주가 성립된 것으로 판단한다. 이렇게 얻은 배아 줄기 세포를 더 작은 세포 집합체로 분리하고 이를 같은 조건의 새로운 배양 접시로 옮겨 계대 배양을 반복하면 미분화 상태를 유지한 채 계속 증식된다. 이와 같은 과정을 반복함으로써 다량의 배아줄기세포를 만들 수 있다.
그런데 위와 같은 면역학적 분리 방법은 면역학적 및 화학적 처리를 통해 배반포를 파괴하여 내부 세포 덩어리를 분리하기 때문에 분리된 세포들이 바탕영양세포에 제대로 정착하지 못하는 경우가 많다. 또한 화학적 처리로 인해서, 분리된 내부 세포 덩어리 부분이 미분화 상태를 유지하지 못하고 다른 세포로 분화를 하여 얻고자 하는 미분화 상태의 배아 줄기 세포주 확립에 효율적이지 못한 면이 있었다. 이에 따라 면역학적 분리 방법을 사용하면 최종적으로 바탕영양세포에 충분한 세포가 배양되어 배아 줄기 세포주로 확립된 것의 개수는 처음 사용된 수정란의 개수를 기준으로 할 때 일반적으로 10-20%에 불과한 한계가 있었다. 또한, 실험 조건 및 작업자의 숙련도 등에 따라 수율이 일관되지 못한 문제가 있었다.
본 발명은 물리적인 방법으로 내부 세포 덩어리를 분리 및 배양하는 방법과 이를 이용한 배아 줄기 세포주의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상실배 또는 배반포를 커버로 덮어 이들에 압력을 가함으로써 내부 세포 덩어리를 미분화 상태로 효과적으로 분리 및 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 압력에 의해 영양공급층 위에 놓여진 상실배 또는 배반포의 높이가 100㎛ 이하가 되도록 함으로써 상실배 또는 배반포로부터 내부 세포 덩어리를 분리 및 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 영양공급층 위에 놓여진 상실배 또는 배반포에 커버의 무게에 의한 압력을 가함으로써 내부 세포 덩어리를 분리 및 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포를 커버로 덮어 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 100㎛ 이하가 되도록 압력을 가하는 단계를 포함하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포는 영영공급층 위에 놓여진 것인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
3. 위 1에 있어서, 영양공급층은 바탕영양세포(feeder cell) 또는 바탕영양세포가 없는 영양배지(feeder-independent medium)인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
4. 위 1에 있어서, 커버는 마이크로 커버 글라스인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
5. 위 1에 있어서, 커버는 상기 상실배 또는 배반포와 닿지 않는 면 쪽에 리프팅부를 구비하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
6. 위 5에 있어서, 리프팅부는 고리 또는 커버의 구부러진 말단부인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
7. 위 1에 있어서, 커버의 상기 상실배 또는 배반포와 닿는 면 쪽에 4 내지 100㎛ 길이의 스페이서가 구비된 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
8. 위 7에 있어서, 스페이서는 커버에 형성된 하나 이상의 다리인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
9. 위 7에 있어서, 스페이서는 바탕영양세포 또는 영양 배지에 놓여진 유리섬유, 나일론 필라멘트 또는 플라스틱 필라멘트인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
10. 위 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 4 내지 40㎛가 되도록 압력을 가하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
11. 위 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 10 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
12. 위 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 20 내지 30㎛가 되도 록 압력을 가하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
13. 위 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포에 가해지는 압력은 커버의 무게에 의한 것인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
14. 위 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포에 가해지는 압력은 0.001-0.003g/mm2인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
15. 위 1에 있어서, 압력을 가한 지 3 내지 20시간 후에 커버를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
16. 위 1에 있어서, 압력을 가한 지 13 내지 20일 후에 커버를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
17. 바탕영양세포 또는 영양배지 위에 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포를 놓는 단계; 상기 상실배 또는 배반포를 커버로 덮어 상실배 또는 배반포의 두께가 100㎛ 이하가 되도록 압력을 가하는 단계; 및 분리된 내부 세포 덩어리를 증식시키는 단계를 포함하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
18. 위 17에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 4 내지 40㎛가 되도록 압력을 가하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
19. 위 17에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 20 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
20. 위 17에 있어서, 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포는 사전에 트리코스타틴-A로 처리된 것인 배아 줄기 세포주의 제조방법.
본 발명은 종래의 면역학적(화학적) 방법들과 달리 내부 세포 덩어리가 바탕영양세포 등의 영양공급층에 정착하는 비율이 매우 높고, 수득된 내부 세포 덩어리가 미분화 상태를 잘 유지하는 효과가 있다.
본 발명은 종래 방법들에 비해 현저히 수율이 높아 적은 양의 수정란으로부터 많은 배아 줄기 세포주를 얻을 수 있다.
본 발명은 종래 방법들에 비해 작업 시간이 짧으며 조작이 간단하다.
본 발명은 최대한 자연적인 변화를 유도하여 내부 세포 덩어리를 분리하기 때문에 미분화된 배아 줄기 세포주 제조에 효과적으로 활용될 수 있다.
본 발명은 줄기 세포주 제조 과정에서 영양배엽층이 생기는 것을 방지하는데 효과적이다.
본 발명에 따라 제조된 배아 줄기 세포는 분화 조건에서 배아체를 잘 형성하여 다양한 조직으로 분화되는 능력이 우수하며 미분화 조건에서는 미분화 세포의 세포학적, 면역학적, 유전학적 특징을 잘 유지한다.
본 발명은 내부 세포 덩어리를 분리하는 동안 지속적으로 영양분을 공급할 수 있고 커버의 로딩 및 언로딩시 내부 세포 덩어리에 손상을 주지 않는다. 또한, 경우에 따라서는 줄기 세포주로 성립될 때까지 커버를 제거하지 않아도 되는 장점도 있다.
본 발명은 인간 배아 줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사 용될 수 있다.
본 발명은 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포를 바탕영양세포 등의 영양공급층 위에 놓고 커버로 덮어 일정한 압력을 가함으로써 일관된 높은 수율로 내부 세포 덩어리를 분리할 수 있는 방법과 이를 이용한 배아 줄기 세포주의 효과적인 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상실배 또는 배반포에 일정 압력을 가한 상태로 최대한 자연적인 변화를 유도하기 때문에 세포 덩어리를 미분화 상태로 손상 없이 분리 및 배양하여 배아 줄기 세포주로 성립시키는데 유용하며, 조작이 간단하여 작업 시간을 절약할 수 있다.
이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 투명대(zona pellucida)가 제거된 상실배(morula) 및 배반포(blastocyst)로부터 내부 세포 덩어리(inner cell mass)를 분리하기 위한 방법이다. 상실배와 배반포는 수정란을 체외 배양하여 얻을 수 있다. 상실배와 배반포는 모두 내부 세포 덩어리(inner cell mass)를 포함하고 있다고 알려져 있다. 특히, 배반포는 통상 100-200개의 세포로 이루어져 있다고 알려져 있는데, 이 중 내부 세포 덩어리는 30-40개이며 나머지는 내부 세포 덩어리를 둘러싸는 영양배엽층을 포함한다.
상실배와 배반포의 투명대는 본 발명의 방법을 사용하기 전에 제거되는 것이 바람직하다. 투명대를 제거하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 예컨대 0.1%의 프로네이즈(pronase)로 1-2분 정도 녹여 제거하는 방법이 통상 사용된다. 인간에서 유래한 상실배 또는 배반포는 투명대를 제거한 후 예컨대 25-125 nmol/ml의 트리코스타틴-A로 약 4시간 정도 처리하면 유전자적 메틸화 현상을 방지할 수 있고 수정란의 발육률을 높일 수 있다. 보다 구체적으로는, 인공수정(정자를 난자가 들어있는 드롭(drop)에 같이 넣음) 후 하나의 전핵 형성을 하면 트리코스타틴-A(TSA) 35-40 nmol/ml이 들어있는 배양액에서 4 시간 배양한 후, TSA가 들어있지 않은 배양액으로 옮겨서 계속 배양하는 것이 가능하다.
투명대가 제거된 상실배와 배반포는 대략 구형 또는 타원형을 나타내며 지름이 100 내지 140 ㎛ 정도이다. 상실배와 배반포는 말랑말랑하면서 탄성을 갖기 때문에 바탕영양세포 또는 영양 배지에 놓고 위에서 압력을 가하면 압력의 세기에 비례하여 그 두께(지름)가 100㎛ 이하로 줄어들 수 있게 된다.
본 발명에서는 커버를 덮어 원래 두께가 100 내지 140 ㎛ 정도인 상실배와 배반포를 그 두께가 100㎛ 이하가 되도록 압력을 가하여 내부 세포 덩어리를 분리 및 배양한다. 위와 같은 압력을 가하면 상실배와 배반포의 영양배엽층은 파괴되고 그 속의 내부 세포 덩어리가 서서히 영양공급층에 정착하게 된다.
본 발명의 상실배와 배반포는 바탕영양세포(feeder cell), 바탕영양세포가 없는 영양배지(feeder-independent medium) 등의 영양공급층으로부터 영양분(배양액)을 공급받을 수 있다. 바탕영양세포로는 쥐 태아 섬유아세포를 사전에 방사능 처리 또는 마이토마이신 C와 같은 화학적 처리를 하여 분화 능력을 떨어뜨린 것을 사용할 수 있다. 바탕영양세포는 자체 증식이 되지 않으면서 배아 줄기 세포의 분 화억제 및 증식을 돕는 역할을 할 수 있다. 바타영양세포가 없는 영양배지로는 배아 줄기 세포주 제조에 필요한 성분(바탕영양세포가 생산하는 물질)이 포함된 것들을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예컨대 mTsSRTM 또는 mTeSRTM 배지(Stem Cell Technologies사)가 있다.
특히, 인간 배아 줄기 세포는 생쥐 배아 줄기 세포(mouse embryonic stem cell)와 달리 미분화 상태를 계속 유지하며 증식시키기 위하여 바탕영양세포가 반드시 필요하다. 지금까지의 인간배아 줄기세포의 배양에서는 주로 생쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)를 영양세포층으로 사용하여 왔다. 최근에는 생쥐와 같이 다른 종의 세포를 영양세포층으로 이용하지 않고 인간에서 유래한 세포를 이용한 배양방법에 대한 연구가 이루어지고 있으므로 바탕영양세포가 특별히 생쥐 배아 섬유아세포로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 커버는 투명대가 제거된 상실배와 배반포를 덮어 이들에 압력을 가할 수 있는 것이면 재료, 구조, 모양, 두께 등에 관계없이 사용될 수 있다. 커버는 내부 세포 덩어리의 분리 과정을 관찰할 수 있도록 투명한 것이 바람직하며, 마이크로 커버 글라스가 보다 바람직하다. 마이크로 커버 글라스는 바이오테크놀로지 분야에서 통상 사용되는 얇은 커버 글라스를 포함한다.
본 발명의 커버는 상실배 또는 배반포와 닿지 않는 면 쪽에 리프팅부를 구비할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 커버는 크게 상실배 또는 배반포를 덮는 커버부와 로딩(덮기) 또는 언로딩(제거)을 위한 리프팅부로 구성된다. 리프팅부는 커버 를 편리하게 로딩 또는 언로딩할 수 있게 할 뿐만 아니라 커버 조작 과정에서 상실배 또는 배반포가 손상되는 것을 방지할 수도 있다. 리프팅부가 구비되어 있으면 로딩 또는 언로딩시 미세조작기(micro manipulator), 핀셋(pincette), 손집게(forcep) 등의 도구를 사용하기에 좋다.
리프팅부의 일례는 도 1에 도시되어 있다. 리프팅부는 도 1A 및 도 1B와 같이 커버에 부착된 고리(11a, 11b)일 수 있다. 예컨대, 고리는 미세한 철사로 제조된 것일 수 있다. 커버의 윗면(상실배 또는 배반포와 닿지 않는 면)에 미세한 철사를 고리 형태로 만들어 붙일 수 있다. 철사를 붙이는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예컨대 마이크로 포지(Micro Forge, MF-900 narishige) 장비를 이용하여 유리를 녹여 그 부분에 미세한 철사를 붙이는 방법이 가능하다.
또한, 리프팅부는 커버의 일부일 수도 있다. 예컨대 마이크로 커버 글라스의 말단 부분에 열을 가하면 마이크로 커버 글라스의 무게 때문에 그 말단 부분이 구부러지게 되는데, 이 구부러진 부분(11c)이 핀셋, 손집게 등의 도구로 잡기에 충분하다면 그 말단 부분이 리프팅부로 기능할 수 있다(도 1C).
본 발명의 커버가 리프팅부가 구비된 마이크로 커버 글라스일 경우의 사용례에 대해서는 도 2에 도시되어 있다. 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포(20)를 바탕영양세포(41) 위에 놓은 후, 미세조작기(30)로 리프팅부(11)를 잡아 마이크로 커버 글라스(10)를 서서히 내린다(도 2A). 마이크로 커버 글라스(10)가 바탕영양세포로부터 4 내지 100 ㎛의 거리를 유지할 때(즉, 상실배 또는 배반포의 두께가 4 내지 100 ㎛일 때)까지 내려 상실배 또는 배반포(20)에 압력을 가한다(도 2B).
또한, 본 발명의 커버는 상실배 또는 배반포와 닿는 면 쪽에 스페이서를 구비할 수도 있다. 스페이서는 상실배 또는 배반포의 두께가 4 내지 100 ㎛로 유지되도록 할 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 스페이서의 길이가 4 내지 100㎛일 수 있다. 예컨대, 도 3A와 같이 커버부(12)에 형성된 하나 이상의 다리(13a)가 스페이서로 기능할 수도 있다. 또한, 도 3B와 같이 커버부(12)와 바탕영양세포 또는 영양 배지(40) 사이에 유리섬유, 나일론 필라멘트 또는 플라스틱 필라멘트 등(13b)을 겹쳐 놓아 스페이서로 기능하게 할 수도 있다. 또한, 코팅 접시 등의 바닥면 일부가 적절히 도출되어 스페이서로 작용할 수도 있다. 스페이서가 구비된 커버를 사용하여 상실배 또는 배반포를 덮는 경우에 대해서는 도 4에 예시되어 있다. 도 4의 마지막 그림에 도시된 것처럼 상실배 또는 배반포는 압력에 의해 그 두께가 줄어들게 된다.
본 발명에서는 외부에서 가해지는 압력에 의해 원래 100 내지 140㎛ 정도인 상실배 또는 배반포의 두께(높이)가 100㎛ 이하가 된다. 특히, 내부 세포 덩어리의 분리 수율과 관련해서, 상실배 또는 배반포의 두께가 4 내지 40㎛가 되도록 압력을 가하는 것이 바람직하고, 두께가 10 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하는 것이 보다 바람직하고, 두께가 20 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하는 것이 가장 바람직하다.
상실배 또는 배반포에 가해지는 압력은 커버의 무게에 의한 것일 수 있고, 커버의 무게에 별도의 외부 압력(예컨대, 커버에 수직으로 가해지는 기계에 의한 압력 등)이 더해진 것일 수도 있다. 또는 커버의 무게에 의한 압력 중 일부만이 상실배 또는 배반포에 가해질 수도 있다. 이러한 경우의 예로는 스페이서 없이 상실배 또는 배반포를 덮을 경우 상실배 또는 배반포의 두께를 10㎛가 되도록 압력을 가할 수 있는 커버를 미세조정기로 바탕영양세포로부터 약 50㎛가 되는 위치에서(즉 상실배 또는 배반포의 두께가 50㎛가 되도록) 고정하는 경우가 있을 수 있다.
압력의 세기는 상실배 또는 배반포의 두께가 100㎛ 이하가 되도록 하는 정도이다. 상실배 또는 배반포에 압력이 가해지면 내부 세포 덩어리가 바탕영양세포 등의 영양공급층과 접촉할 수 있게 되고 영양공급층에 정착하게 된다. 예컨대, 커버가 통상의 마이크로 커버 글라스(CLASS 1)인 경우 그 무게로 인한 압력은 약 0.001-0.003g/mm2이다.
커버의 크기는 상실배 또는 배반포를 완전히 덮을 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 마이크로 커버 글라스를 잘라서 만들 경우 가로가 3 내지 8 mm이고 세로가 2 내지 6 mm인 사각형 모양일 수 있다. 예컨대, 가로 및 세로가 각각 5 mm인 마이크로 커버 글라스의 무게는 0.008-0.01g이며 단위 면적당(1mm×1mm) 0.002g 정도의 무게로 배반포를 누를 수 있다. 또한, 정밀한 기계를 이용하여 커버를 제작할 수 있는 경우에는 가로 및 세로가 100㎛이고 각 모서리 부분에 40㎛의 다리가 구비된 마이크로 커버 글라스가 바람직하다.
커버의 표면은 흠이 없는 것이 바람직하다. 특히 상실배 또는 배반포와 닿는 부분의 경우에는 흠이 있으면 분리된 내부 세포 덩어리가 바탕영양세포 또는 영양 배지에 붙지 않고 커버 표면에 붙어 수율이 떨어지게 되는 문제가 발생될 수 있 다. 표면이 거친 커버는 불로 가열하거나 하이드로플로릭산 등을 처리하여 미세한 흠을 제거한 후 사용하는 것이 바람직하다.
커버가 상실배 또는 배반포를 덮는 시간은 다양하게 결정될 수 있다. 예컨대, 상실배 또는 배반포의 두께가 50㎛ 이하일 경우에는 배양액의 원활한 공급을 위해 적절한 시기에 커버를 제거해 주는 것이 바람직하다. 예컨대, 압력을 가한 지 3 내지 20시간 후에 커버를 제거할 수 있다. 또한, 상실배 또는 배반포의 두께가 50 초과 100㎛ 이하 정도일 경우에는 배양액만 충분히 공급될 수 있다면 내부 세포 덩어리가 배아 줄기 세포로 충분히 자랄 때까지(약 15 내지 20일 정도 후까지) 커버를 제거할 필요가 없다. 또한, 경우에 따라서는 커버를 덮은 후 13 내지 16일 정도에 충분히 자란 줄기 세포를 작게 1/4 등분하여 다른 접시로 옮기기 위해 커버를 제거할 수도 있다. 또한, 인간 배반포의 경우에는 커버를 덮은 후 3 내지 20 시간 후에, 특히 13 내지 15 시간 후에 커버를 제거하는 것이 바람직하다.
커버 글라스를 덮거나 일정 시간이 지난 후 걷어낼 때에는 상실배 또는 배반포와 분리된 세포 덩어리가 뭉개지거나 손상되지 않도록 주의하는 것이 바람직하다. 스페이서가 있는 커버를 사용하면 내부 세포 덩어리에 배양액이 지속적으로 공급될 수 있는 장점이 있을 뿐만 아니라 커버를 제거할 때에 다소 흔들림이 있더라도 안정적으로 일정 거리만큼 이격되어 있을 수 있기 때문에 분리된 세포 덩어리를 손상시키지 않는 장점이 있다. 또한, 리프팅부가 구비된 커버를 사용하는 것이 상실배 또는 배반포와 분리된 세포 덩어리의 보호 관점에서 바람직하다. 또한, 미세조작기의 사용이 보다 바람직하다.
본 발명의 배아 줄기 세포주의 제조방법은 영양공급층 위에 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포를 놓는 단계; 상기 상실배 또는 배반포를 커버로 덮어 상실배 또는 배반포의 두께가 100㎛ 이하가 되도록 압력을 가하는 단계; 및 분리된 내부 세포 덩어리를 증식시키는 단계를 포함한다.
위에서 언급된 바와 같이, 상실배 또는 배반포의 두께가 4 내지 40㎛가 되도록 압력을 가하고, 바람직하게는 상실배 또는 배반포의 두께가 10 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하고, 보다 바람직하게는 상실배 또는 배반포의 두께가 20 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하는 것이 고수율로 안정적으로 배아 줄기 세포주를 제조할 수 있게 한다.
본 발명의 분리 방법에 따라 분리된 내부 세포 덩어리(ICM)는 원래의 바탕영양세포 등에서 그대로 증식되거나 별도의 바탕영양세포로 옮겨져서 증식되어 배아 줄기 세포주로 제조될 수 있다. 분리된 내부 세포 덩어리를 증식하는 방법과 배아 줄기 세포주로 제조하는 방법은 통상 바이오테크놀로지 분야에서 사용되는 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 다만 본 발명의 분리 방법에 따르면, 수득된 내부 세포 덩어리의 양이 많고 그 세포가 바탕영양세포에 정착하는 비율 및 바탕영양세포에서 성공적으로 배양되는 비율이 높기 때문에, 어느 통상의 방법을 사용하더라도 배아 줄기 세포주로 성립될 가능성은 종래에 비해 현저히 높다.
배양액은 배아 줄기 세포 배양에 사용되는 통상의 것들을 제한 없이 사용할 수 있다. 특히, Memα-gluta max (Gibco Brl사, 32571)용액에 20% Knockout Serum Replacement(Gibco Brl사)를 배합한 기본 배양액에 0.1mM β-메르캅토에탄 올(mercaptoethanol, Sigma사), 100 유닛/ml 페니실린(penicillin), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin) 및 4 ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF, invitorgen 13256-029)를 넣은 것을 사용하는 것이 바람직하다.
배양액은 사용 전에 생쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 영양세포층에 하루 또는 이틀 정도 공배양을 한 후에 수거하여 사용할 수 있다. 수거된 배양액은 필터링은 하지 않고 원심분리기로 원심분리를 한 후 상층액만 걷어서(conditioned media) 사용할 수 있다.
또한, 줄기세포 배양을 위한 배양액을 제조하기 위해 기존의 배아줄기세포주가 배양되던 줄기세포주 배양액을 회수하여 원심분리 후 상층액만 걷어서 새로 만들어진 배양액과 50%:50% 비율로 섞어 초기 줄기 세포주 성립을 위한 배양액(conditioned media)으로 사용하면 배반포에서 줄기세포주로 배양되는 성공률이 증가한다.
치료용 줄기 세포주의 배양을 위해서는, 경우에 따라 내부 세포 덩어리를 생쥐 배아 섬유아세포(MEF)가 없는 배양 접시에서 배양할 수도 있으며, 조건은 동일하나 접시 표면을 마트리겔과 PBS의 1:30 혼합물 및 젤라틴 0.1%로 4℃에서 1 시간 정도 정치시켜 코팅한 후 상층액을 버리고 배양접시로 이용할 수 있다.
배양액은 24시간에 한번 씩 교체하는 것이 바람직하다. 다만, 배양액 대신 mTsSR media (Stem cell Technologies)를 매일 교환하면 바탕영양세포가 없는 환경에서 배아 줄기 세포주를 배양할 수 있다. 하지만 배아 줄기 세포가 다른 세포로 분화를 할 수 있기 때문에 내부 세포 덩어리를 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF) 위에서 배양하는 경우가 주로 사용된다.
배아 줄기 세포가 서로 뭉쳐서 자라도록 방치하면 배아 모양의 세포 덩어리를 형성하게 되고, 배아 줄기 세포는 스스로 분화하기 시작한다. 내부 세포 덩어리(inner cell mass)에서 유래한 세포들은 인간의 몸을 구성하는 삼배엽성 세포들로 분화할 수 있는 능력을 지니고 있다. 앞으로, 본 발명에 기초하여 배아 줄기 세포를 특정 세포로 분화시킬 수 있는 방법을 찾아낸다면 질병 치료에 매우 효과적일 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명이 실제 구현되는 과정을 보다 쉽게 설명하기 위한 것일 뿐 이 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한 또는 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 마이크로 커버 글라스의 제조
본 실시예에서는 내부 세포 덩어리라고 불리는 30-40 개의 세포를 미분화 상태로 배양하기 위해서 마이크로 커버 글라스를 이용하였다. 본 실시예에서는 가로 25mm×세로 25mm 크기의 마이크로 커버 글라스(제조사: VWR International LLC, cat no.48366-089)를 다음의 방법으로 가공하여 사용하였다.
구입한 가로 25mm×세로 25mm 크기의 마이크로 커버 글라스를 가로 7 mm, 세로 5 mm로 절단한 후(도 5a), 가스 버너로 한쪽 말단을 가열하였다(도 5b). 마이크 로 커버 글라스는 그 자체의 무게로 인하여 가열된 부분이 구부러지며 도 5c에 도시된 바와 같이 변형되었다. 그 후 하이드로플로릭산(Hydrofluoric Acid 48-51%)을 10배 희석한 용액에서 마이크로 커버 글라스의 배반포 부분과 닿는 부분(리프팅부 포함) 표면의 미세한 흠집을 모두 제거하고 세정하였다.
2. 마이크로 커버 글라스로 배반포 덮기
위와 같이 제조된 마이크로 커버 글라스를 이용하여 다음과 같이 투명대가 제거된 배반포를 덮었다(도 6).
수정란이 체외에서 배양된 후 5-6일이 지난 배반포(도 7a)를 0.1%의 프로네이즈(pronase)로 1-2분 정도 녹여 배반포의 투명대를 제거하였다(도 7b). 투명대가 제거된 배반포를 바탕영양세포 바닥면에 놓고 손집게를 이용하여 마이크로 커버 글라스의 리프팅부(구부러진 말단 부분)를 잡고 천천히 배반포를 덮었다. 이에 따라 배반포에는 마이크로 커버 글라스의 무게에 의한 압력이 작용한다. 마이크로 커버 글라스를 덮은 직후의 배반포 사진은 도 7c와 같았다. 마이크로 커버 글라스로 누른 후 6시간 후에는 내부 세포 덩어리 부분의 줄기세포들이 영양배엽층 쪽으로 퍼져나가면서 영양배엽층이 점차 줄어들었다(도 7d). 그리고 마이크로 커버 글라스로 누른 후 14시간 후에는 영양배엽층이 보다 더 많이 줄어들었다(도 7e).
3. 마이크로 커버 글라스의 제거
마이크로 커버 글라스를 덮은 후 14 시간 후, 도 7e와 같이 영양배엽층이 거 의 사라지고 그 사이로 내부 세포 덩어리에서 증식을 시작한 줄기세포가 위치하게 되었다. 이때 쯤, 마이크로 커버 글라스를 제거하였다. 제거할 때에는 배반포가 바탕영양세포의 바닥면에 정착한 상태이기 때문에 미세한 외부 자극에도 민감하게 반응한다. 따라서 본 실시예에서는 도 8과 같이 미세조작기를 이용하여 마이크로 커버 글라스를 제거하였다.
도 8a는 마이크로 커버 글라스가 덮여진 상태로 배양되는 사진이며, 도 8b는 미세조작기를 배양접시 상단에 위치한 사진이고, 도 8c는 미세조작기로 배양접시에 놓여진 마이크로 커버 글라스의 리프팅부를 누른 사진이다. 도 8d는 마이크로 커버 글라스의 리프팅부를 미세조작기로 미세하게 천천히 누르면 그 반대쪽이 위로 들어올려지는 작동 원리를 설명한 사진이다.
본 실시예에서는 미세조작기로 마이크로 커버 글라스의 리프팅부를 눌러 그 반대쪽이 들어올려지면 그 상태에서 미세조작기로 내부 세포 덩어리에서 멀리 떨어진 위치로 이동시킨 후 손집게를 이용하여 마이크로 커버 글라스를 제거하였다.
4. 배아 줄기 세포의 배양
마이크로 커버 글라스를 제거한 후, 분리된 내부 세포(줄기 세포)를 5%의 이산화탄소, 온도 37℃인 포화습도 배양기 안에서 배양하였다. 배양 후 2-3일 정도가 경과하였을 때의 사진은 도 7f와 같다. 도 7f의 가운데 부분에는 내부 세포 덩어리가 확인되며, 그 주위로는 좁쌀 같이 미분화된 배아 줄기 세포가 자라는 것이 확인된다. 이와 같이 배양된 배아 줄기 세포는 몇 차례의 계대배양을 통해 도 9의 배아 줄기 세포주로 성립되었다. 본 발명에서 수득된 배아줄기세포를 계대배양하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따랐다.
분리된 내부 세포를 배양하기 위한 배양액은 24시간 주기로 교체하였으며 배양액 및 배양접시는 다음과 같이 제조하였다.
배아줄기세포주 배양액 및 배양접시 제조방법
(1) 배아줄기세포주 배양액 제조방법
본 발명에 사용된 배양액은 Memα-gluta max (Gibco Brl사, 32571)용액에 20% Knockout Serum Replacement(Gibco Brl사)를 배합하여 기본 배양액으로 사용하였으며, 여기에 0.1mM β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol, Sigma사), 100 유닛/ml 페니실린(penicillin), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin) 및 4 ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF, invitorgen 13256-029)을 넣어서 사용하였다.
제조된 배양액은 사용하기 전에 생쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 영양세포층에 하루 또는 이틀 정도 공배양을 한 후에 수거하고, 수거된 배양액을 원심분리를 한 후 상층액만 걷어서 새로 만든 배양액과 50% : 50% 비율로 섞어서(conditioned media) 사용하였다.
(2) 배양접시 제조방법
4 웰(well) 접시(Nunclon, cat no.176740)에 젤라틴(Gelatin, sigma사 G1393)을 10배 희석하여(0.1% 코팅) 1시간 정치시킨 후 4 웰(well) 접시 안 용액을 걷어낸 후 배양 접시로 사용하였다.
생쥐 배아 섬유아세포(MEF) 영양세포층의 제조
내부 세포 덩어리를 생쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 배양 접시에 이식하기 전에, 마이토마이신 C(mitomycin C, sigma) 10㎍/㎖ 가 들어 있는 배양액에 위에서 제작된 배양접시 0.2㎟ 당 50-100개 부착해서 자라는 정도의 생쥐 배아 섬유아세포(바탕영양세포)를 5-6시간 배양을 하여 분화능력을 떨어트린 후 배아줄기세포 배양액으로 세정하였고, 배아줄기세포가 자라는 바탕영양세포로 사용되는 생쥐 배아 섬유아세포(MEF)가 배양되는 접시를 제조하였다.
비교예 1
내부 세포 덩어리를 면역학적 분리 방법(immunosurgery)에 따라 배반포로부터 분리하였다. 먼저 수정란의 투명대(zona pellucida)를 프로네이즈(pronase) 0.1% 로 약 1-2분간 녹인 후, 투명대 안에 들어 있는 배반포 세포덩어리를 100%의 항-휴먼 혈청 항원 용액(anti-human serum antibody, 시그마사)에 약 20분간 정치시켰다. 그 후, 다시 기니피그 혈장액(guinea pig complement)에 약 30분간 정치시켰다.
위와 같이 분리된 세포를 위 실시예와 동일한 방법으로 배양 및 증식시켜 배아 줄기 세포주를 제조하였다(도 10).
시험예 1: 실시예 1 및 비교예 1의 배아줄세기포주 성립결과 비교
위 실시예 1 및 비교예 1의 방법에 따라 제조된 배아줄기세포주의 성립 결과를 정리하면 다음 표 1과 같다.
| 구분 | 배양에 사용된 배반포 수정란의 수 | 바탕영양세포 바닥면에 정착한 내부 세포 덩어리 개수 | 바탕영양세포 바닥면에서 배양을 시작한 내부 세포 덩어리 개수 | 바탕영양세포에서 충분한 숫자가 배양되어 배아 줄기 세포주로 성립된 배아 줄기 세포주 개수 |
| 실시예 | 5 | 5(100%) | 5(100%) | 4(80%) |
| 비교예 | 10 | 7(70%) | 4(40%) | 2(20%) |
위 표 1과 같이 본원의 내부 세포 덩어리 분리 방법 및 배아 줄기 세포주 제조방법은 종래의 면역학적 분리방법 및 그에 따른 배아 줄기 세포주 제조방법에 비해 현저히 우수한 성공률을 나타낸다. 본 발명의 배양방법을 이용하면 다양한 세포로 분화할 수 있는 배아줄기세포주를 다량으로 손쉽게 수득할 수 있고, 앞으로 배아줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 2: 스페이서 간격(배반포의 두께)에 따른 비교
스페이서를 이용하여 커버와 바탕영양세포 사이의 간격(커버와 바탕영양세포 사이에 낀 배반포의 두께)을 다음 표 2와 같이 조절하면서 내부 세포 덩어리를 분리 및 배양하여 배아 줄기 세포주로 성립시켰다. 투명대가 제거된 배반포들의 두께는 100-130㎛이었다.
하기 표 2에서 "자연 스페이스"는 스페이서가 구비되어 있지 않은 마이크로 커버 글라스로 바탕영양세포 위에 놓여진 배반포를 완전히 누른 경우에도 바탕영양세포 등에 의해 발생되는 자연적인 간격(약 2-3㎛)을 의미한다.
하기 표의 "10-15㎛ 스페이서"로는 지름이 10-15㎛의 유리 섬유를 사용하였다. "20-30㎛ 스페이서"로는 위 유리섬유를 복수개 겹쳐 사용하였다.
하기 표의 "50-60㎛ 스페이서", "70-80㎛ 스페이서" 및 "90-100㎛ 스페이서"로는 네 모서리 부분을 각각 "50-60㎛", "70-80㎛" 및 "90-100㎛" 구부린 마이크로 커버 글라스를 사용하였다.
각 배반포는 위 각각의 스페이서가 구비된 마이크로 커버 글라스로 13 시간 동안 덮여져 있었고, 다른 조건들은 위 실시예 1과 동일하게 하였다.
| 구분 | 배양에 사용된 배반포 수정란의 수 | 바탕영양세포 바닥면에 정착한 내부 세포 덩어리 개수 | 바탕영양세포 바닥면에서 배양을 시작한 내부 세포 덩어리 개수 | 바탕영양세포에서 충분한 숫자가 배양되어 배아 줄기 세포주로 성립된 배아 줄기 세포주 개수 |
| 자연 스페이스 (2-3㎛) |
28 | 28(100%) | 13(46.4%) | 10(35.7%) |
| 10-15㎛ 스페이서 | 26 | 26(100%) | 16(61%) | 13(50%) |
| 20-30㎛ 스페이서 | 28 | 28(100%) | 24(85.7%) | 22(78.5%) |
| 50-60㎛ 스페이서 | 24 | 15(62.5%) | 10(41.6%) | 8(33%) |
| 70-80㎛ 스페이서 | 12 | 4(33.3%) | 2(16.6%) | 2(16.6%) |
| 90-100㎛ 스페이서 | 16 | 2(12.5%) | 1(6.2%) | 1(6.2%) |
위 표 2와 같이, 20-30㎛ 스페이서가 사용된 경우(배반포의 두께가 20-30㎛인 경우)에는 사용된 배반포 수정란의 100%가 바탕영양세포 바닥면에 정착하였고, 그 중 78.5%나 배아 줄기 세포주로 성립되었음을 알 수 있었다. 자연 스페이스(배반포의 두께는 무시할 정도)에는 배아 줄기 세포주로 성립된 비율이 35.7%였다. 위 표의 결과에 따라 압력을 받아 압축된 배반포 두께가 4-40㎛인 경우가 바람직하고, 10-30㎛가 보다 바람직하고, 20-30㎛인 경우가 보다 더 바람직함을 알 수 있었다.
도 1은 본원의 리프팅부의 일례를 도시한 도면이며,
도 2는 리프팅부가 구비된 커버 글라스를 사용하여 상실배 또는 배반포를 덮는 과정을 나타낸 도면이며,
도 3은 본원의 스페이서의 일례를 도시한 도면이며,
도 4는 스페이서가 구비된 커버 글라스를 사용하여 상실배 또는 배반포를 덮는 과정을 나타낸 도면이며,
도 5는 실시예에 따른 마이크로 커버 글라스의 제조에 관한 사진이며,
도 6은 모서리가 불에 그을린 커버 글라스로 투명대가 제거된 배반포를 덮는 것에 대한 사진이며,
도 7은 마이크로 커버 글라스를 덮은 전, 후의 배반포의 사진이며,
도 8은 미세조작기를 이용하여 마이크로 커버 글라스를 제거하는 방법에 관한 사진이며,
도 9는 실시예에 따라 성립된 배아 줄기 세포주의 사진이며,
도 10은 종래의 면역학적 분리방법에 따라 분리된 내부 세포 덩어리의 사진이다.
<도면 부호의 간단한 설명>
10: 마이크로 커버 글라스 11: 리프팅부 12: 커버부
20: 배반포 21: 내부 세포 덩어리(내세포괴) 22: 영양배엽층
30: 미세조정기
40: 코팅 접시 41: 바탕영양세포층
Claims (20)
- 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포를 커버로 덮어 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 100㎛ 이하가 되도록 압력을 가하는 단계를 포함하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포는 영영공급층 위에 놓여진 것인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 영양공급층은 바탕영양세포(feeder cell) 또는 바탕영양세포가 없는 영양배지(feeder-independent medium)인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 커버는 마이크로 커버 글라스인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 커버는 상기 상실배 또는 배반포와 닿지 않는 면 쪽에 리프팅부를 구비하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 5에 있어서, 리프팅부는 고리 또는 커버의 구부러진 말단부인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 커버의 상기 상실배 또는 배반포와 닿는 면 쪽에 4 내지 100㎛ 길이의 스페이서가 구비된 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 7에 있어서, 스페이서는 커버에 형성된 하나 이상의 다리인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 7에 있어서, 스페이서는 바탕영양세포 또는 영양 배지에 놓여진 유리섬유, 나일론 필라멘트 또는 플라스틱 필라멘트인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 4 내지 40㎛가 되도록 압력을 가하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 10 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 20 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포에 가해지는 압력은 커버의 무게에 의한 것인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포에 가해지는 압력은 0.001-0.003g/mm2인 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 압력을 가한 지 3 내지 20시간 후에 커버를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 청구항 1에 있어서, 압력을 가한 지 13 내지 20일 후에 커버를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 내부 세포 덩어리의 분리 방법.
- 영양공급층 위에 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포를 놓는 단계;상기 상실배 또는 배반포를 커버로 덮어 상실배 또는 배반포의 두께가 100㎛ 이하가 되도록 압력을 가하는 단계; 및분리된 내부 세포 덩어리를 증식시키는 단계를 포함하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 4 내지 40㎛가 되도록 압력을 가하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 상실배 또는 배반포의 두께가 20 내지 30㎛가 되도록 압력을 가하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
- 청구항 17에 있어서, 투명대가 제거된 상실배 또는 배반포는 사전에 트리코스타틴-A로 처리된 것인 배아 줄기 세포주의 제조방법.
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