KR20100106627A - 프로테아제 저해를 위한 실리카 - Google Patents

Abstract

프로테아제를 저해하는데 사용되는 실리카가 제공된다. 특히 위장관 내 유해한 프로테아제 활성 또는 유해한 단백질분해성 분해와 관련된 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카가 제공된다.

Description

프로테아제 저해를 위한 실리카{Silicia for the inhinition of a protease}

본 발명은 프로테아제의 저해제로서 사용하기 위한 실리카, 상기 실리카를 포함한 실리카 현탁액, 상기 실리카 및 실리카 현탁액을 포함한 약제학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

아스파르트산 프로테아제는 pH 1.5∼5.5에서 활성인 단백질분해 효소 그룹이다. 일반적인 산-염기 촉매제로 작용하고 펩타이드 결합의 분열에 필수적인 효소 활성 부위 내 2개의 아스파르트산기 존재를 특징으로 한다. 특성화된 첫 번째 아스파르트산 프로테아제 중 하나는 인간 여러 아형 즉 펩신 1, 3a, 3b, 3c 및 개스트리신(gastricsin)이 존재하는 인간 위 펩신이다.

펩신은 효소원(zymogen)으로 명명된 불활성 전구체로서 위점막 내에서 합성되고, 위 주세포의 자극 후 위액 내 염산에 의해 활성화되는 위 관강(gastric lumen) 내로 방출된다. 펩신의 주요 기능은 음식물 단백질 및 펩타이드를 흡수에 적당한 아미노산 단편으로 분해하는 것이다. 각각의 펩신 아형의 단백질분해 활성은 위 pH, 단백질 기질 형태, 온도 및 용질 및 기질 농도에 따라 변화된다. 펩신이 광범한 pH 범위에서 활성이더라도 최적 단백질분해 활성은 일반적으로 약 pH 2∼3에서 나타난다.

펩신은 음식물 단백질을 특이적으로 분해하지 않고 어떠한 적당한 단백질, 펩타이드 또는 당단백질로 무차별적으로 분열시킬 것이다. 따라서 이는 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 구성적 단백질 범위뿐만 아니라 정상 생리 기능에 필수적인 헤모글로빈 및 알부민과 같은 기능성 단백질도 분해할 것이다. 종종 자가소화로 명명되는 이들 단백질의 무차별적 분해는 소화불량, 위염, 궤양 및 위식도 역류병을 포함한 많은 질환 상태의 근본적인 병리이다. 이들 질환 상태에서 위장관의 점막은 펩신의 단백질분해 활성에 의해 손상된다.

점막 표면은 많은 구성적 및 기능성 단백질 예를 들어 조직의 구조적 골격인세포외 매트릭스 통합 유지를 돕는 거대 분자량 단백질 콜라겐을 포함한다. 위에서 점막은 점액 겔층의 분비를 포함한 많은 방어 메커니즘에 의해 펩신 분해로부터 보호된다. 점액 겔층은 펩신과 아래의 점막 표면 단백질 사이의 상호작용을 방지하는 확산 장벽으로 작용한다.

그러나 점액층은 펩신에 의해 분해될 수 있고, 따라서 역동적 균형이 분비와 분해 사이에 존재한다. 이러한 균형이 교란되는 경우 점액 장벽이 손상되고 펩신은 아래의 상피 및 콜라겐을 분해할 수 있고 이는 조직 파괴 및 위 손상을 유발한다. 유사하게 펩신이 식도 괄약근을 넘어 식도로 역류되는 경우 식도 점막이 위에 존재하는 보호 메커니즘을 보유하지 않기 때문에 광범위한 조직 손상이 발생할 수 있다.

위장 점막 손상을 방지하기 위해 펩신의 단백질분해 활성을 저해하는 약제가 제안되었다.

US 3,740,319 및 US 3,840,516은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주의 배양 여과물에서 추출된 화합물인 펩스타틴을 기재하고 있다. 펩스타틴은 펩신의 단백질분해 활성을 저해하는 것으로 나타났고 위궤양의 관리에 예방적 역할을 지닌 것으로 제안되었다.

WO 01/87282는 펩신 단백질분해 활성의 저해를 위해 갈조식물강(Phaeophyceae)에 속하는 조류에서 추출된 다당류인 알지네이트(alginate)의 용도를 기재하고 있다. 이는 400 kDa 이상의 분자량을 지닌 알지네이트는 펩신의 단백질분해 활성 및 위액 활성을 각각 70% 및 55%까지 저해함이 나타났다.

US 3,155,575는 알루민산나트륨과 반응하는 키토산의 산성 염의 수성 현탁액을 이용하여 위장 장애의 치료를 위한 제제에 관한 것이다. 반응된 수성 현탁액은 '래트 모델' 내 펩신의 단백질분해 활성을 저해하는 것으로 나타났다.

GB 1217256은 리그노설폰산의 유리산 및 염을 포함한 소화성 궤양의 치료를 위한 조성물을 기재하고 있다. 리그노설폰산은 시험관 내 시험 방법에서 카세인 기질에 대해 펩신의 단백질분해 활성을 감소시키는 것으로 나타났다.

더욱이 GB1253317, US 3,524,859, US 3,459,758 및 US 3,427,305에 기재된 바와 같이 광범한 유기 소분자는 펩신을 저해하는 것으로 알려져 있다.

Qian et al(Eur Polym J, (2006), 42, 1653-1661)은 펩신의 활성을 감소시키는 메타크릴산메틸 공중합체 나노입자를 기재하고 있다.

Mouecoucou et al(J Dairy Sci, (2003), 86, 3857-3865)은 펩타이드를 분해하는 펩신의 능력을 감소시크는 광범한 식물 수성콜로이드를 보고하였다. 이들은 자일란, 아라비아 검 및 저-메톡실화 펙틴이 펩신의 존재 하에 1∼8 kDa의 분자량 범위의 펩타이드의 분열을 저해함을 나타내었다. 단백질 기질에 대한 펩신 활성을 감소시키는 것으로 나타난 또다른 다당류는 알지네이트(Strugala et al, lnt J Pharm, (2005) 304, 40-50), 한천(Gouda and Johdka, Can J Pharm Sci, (1977), 12, 4-7), 황산화 다당류(Levey and Sheinfeld, Gastroenterology (1954), 27, 625-628) 및 산화 전분 황산염(Namekata, Chem Pharm Bull (1962) 10, 171)을 포함한다.

Pearson and Robert(Clin Sci, (2001), 100, 411-417)는 에카베트 나트륨(ecabet sodium)이 위액 내 펩신 활성을 저해함을 나타내었다. 저해 정도는 펩신 아형에 의존적이었다.

Kratzel and Bernkop-Schnurch(Peptides (2000), 21 , 289-293)는 펩스타틴 A의 트리펩타이드 유도체를 합성하고 이는 시험관 내에서 펩신에 대한 저해 작용을 지님을 나타내었다. 이들은 유도체는 효소 분해로부터 펩타이드 약물 보호에 대한 응용을 지니고, 따라서 구강 생체이용률을 증가시키는데 사용됨을 나타낸다.

Foster et al(Clin Sci, (1994), 87, 719-726)은 폴리아크릴산 카보폴(Carbopol) 934P가 펩신 가수분해를 저해할 수 있고, 따라서 생체 내에서 점막 보호제로서의 가능성을 지님을 나타내었다.

Beil et al(Pharmacology, (1993), 47, 141-144)은 비스무스 서브시트레이트(bismuth subcitrate)가 시험관 내에서 pH 의존적 방식으로 돼지의 활성을 저해함을 입증하였다. 더욱이 Stables et al(Aliment Pharmacol Ther, (1993), 7, 237-246)은 비스무스 서브시트레이트 및 라니티딘 비스무스 시트레이트 모두 펩신 1, 2, 3 및 5를 저해함을 발견하였다.

많은 연구자들은 태평양 굴(Faisal et al, Comp Biochem and Physiol B, (1998), 121, 161-168), 안쿠사 스트리고사의 뿌리(Anchusa strigosa)(Abuereish, Phytochemistry, (1998), 48, 217-221), 스쿼시 체관 유출액(Christeller et al, Eur J Biochem (1998), 254, 160), 연맥겨(Galleschi et al, Sciences de Aliments, (1997), 17, 173-182) 및 인삼(Sun et al, Planta Medica, (1992), 58, 432-435)을 포함한 천연 원료 유래의 펩신 저해제를 확인하였다.

WO 00/10527, WO 00/10528, WO 00/10529 및 WO 00/10530은 실리카, 티타니아, 점토 및 그의 혼합물에서 선택된 콜로이드 입자를 포함한 점막점착 조성물을 개시한다. 이들 문헌의 점막점착 조성물은 연동운동에 저항적이고 위장관에 활성 성분을 전달하는데 사용된다. 그러나 이들 문헌 내에 활성 위장 물질로 작용하는 실리카의 능력에 관해서는 어떠한 지침도 존재하지 않는다.

펩신의 단백질분해 활성 상의 저해 효과를 지닌 것으로 나타난 다양한 범위의 물질에도 불구하고 실리카가 당분야에서 프로테아제의 저해에 적당한 것으로 논의된 적은 없었다.

발명의 간단한 개요

첫 번째 관점에서 프로테아제를 저해하는데 사용되는 실리카가 제공된다.

두 번째 관점에서 위장관 내 유해한 프로테아제 활성과 관련한 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카가 제공된다.

세 번째 관점에서 위장관 내 유해한 단백질분해성 분해와 관련한 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카가 제공된다.

네 번째 관점에서 소화불량, 위염, 소화성 궤양 및 위식도 역류병, 식도외 역류병, 과민 대장 증후군, 직장 관련 염증 질환 및 염증성 장질환에서 선택된 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카가 제공된다.

다섯 번째 관점에서 내부 뮤신 상호작용을 증가시키는데 사용되는 실리카가 제공된다.

여섯 번째 관점에서 점액 점도를 증가시키는데 사용되는 실리카가 제공된다.

참고를 용이하게 하기 위해 본 발명의 이들 및 추가적인 관점은 적당한 섹션 표제 하에 논의된다. 그러나 각각의 섹션 하의 지침은 각각의 특정한 섹션에 항상 한정적인 것은 아니다.

이점

본 발명은 많은 이점을 지닌다.

펩신(및 창자 내 박테리아 기원의 유사한 단백질분해 효소)은 중요한 공격자이고 역류 질환 병리에 강하게 관련된다. 실리카에 의한 펩신의 단백질분해 활성의 저해는 역류 또는 관강 내용물의 손상 가능성을 감소시킴으로서 효과적인 질환 치료제가 될 수 있다. 본 발명의 실리카는 펩신과 같은 단백질분해 활성을 저해 가능하고, 따라서 치료제로 효과적이다.

더욱이 본 발명의 실리카는 백혈구 및 박테리아의 존재에 의해 염증시 증가되는 유리 라디칼을 약화시키는 능력을 나타낸다. 유리 라디칼을 약화시키는 능력은 물질 유리 라디칼 제거 능력 및 염증성 장질환의 손상 용량을 감소시키는 능력의 척도이다.

또한 본 발명의 특히 작은 입자 크기(10∼50 nm)의 실리카는 점막층을 통과하는 펩신의 확산을 지연시킴으로서 상피 세포를 보호하는 것이 가능하다(이는 식도 점막으로의 펩신 접근성의 감소를 나타내고, 결국 역류 질환 및 소화불량의 병리 상에 병변을 에방하고 유리하게 작용하도록 강하게 영향을 미칠 것임). 펩신에 의해 식도에 수행되는 손상 양이 용량-의존적이기 때문에 식도에 도달하는 공격자 함량 감소는 환자 증상 및 역류 질환 병리 상에 현저한 영향을 지닐 것이다.

또한 본 발명의 실리카는 손상된 점액 겔을 복구시키고 겔 특성을 개선시키는 것으로 나타났다. 이들 발견은 점액층이 손상되고 하부 점막을 보호할 수 없는 궤양성 대장염 및 소화성 궤양의 치료를 위한 치료 가능성을 지닌다.

또한 본 발명의 실리카는 펩신이 점액 겔을 분해하고 그의 겔-형성 특성에 영향을 미치는 것을 방지할 수 있다. 따라서 본 발명의 실리카는 과량의 공격자(즉 펩신)가 존재하는 상황에서 보호적일 수 있다.

도 1은 시험 방법 1 및 펩신 용액 A를 이용한 0.4% 실리카에 의한 입자 크기와 평균 펩신 저해간의 관계를 나타낸다.

실리카

본 발명의 첫 번째 관점에 따라 프로테아제를 저해하는데 사용되는 실리카가 사용된다.

본 발명에서 프로테아제의 저해제는 기질 상의 프로테아제의 작용을 방지하는 것이 가능한 물질을 나타낸다. 이러한 점에 있어서, 저해 효과를 나타내기 위한 저해 물질에 의한 프로테아제 결합 부위의 점유는 필요하지 않음이 이해될 것이다. 또한 저해제는 프로테아제와 그의 기질간의 접촉을 방지하는 단순한 장벽 물질이 아님이 이해될 것이다. 따라서 본 발명은 기질 상의 프로테아제의 작용을 저해하는데 사용되는 실리카를 제공한다.

하나의 실시태양에서 프로테아제의 결합 부위를 점유함을 특징으로 하는 기질 상의 프로테아제의 저해제로 사용되는 실리카가 제공된다.

실리카

실리카는 이산화규소에 대한 당분야의 일반적인 명칭이다. 이는 훈증 실리카(fumed silica), 침전 실리카, 비정질 실리카, 콜로이드 실리카, 액적(coacervated) 실리카, 비정질 실리카 겔, (수성) 실리카 졸, 하이드로겔 실리카 및 크세로겔 실리카와 같은 많은 형태로 존재한다. 또한 실리카는 액체(용해성 규산염), 현탁액, 분말, 과립 또는 정제 형태로 존재한다.

본 발명에 따른 실리카는 훈증 실리카, 침전 실리카, 비정질 실리카, 액적 실리카 및 비정질 실리카 겔, (수성) 실리카 졸, 분말로 구성된 군에서 선택된다.

바람직한 실시태양에서 본 발명의 실리카는 비정질 실리카이다. 비정질 실리카는 콜로이드 실리카로도 표기될 수 있음이 당분야에 알려져 있다. 따라서 비정질 실리카 표기는 콜로이드 실리카를 포함함이 이해된다.

본 발명의 실리카는 일반적으로 나노입자로 존재해야 한다.

따라서 하나의 실시태양에서 본 발명의 실리카는 나노입자로 존재한다. 또다른 실시태양에서 실리카는 20,000 nm 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 또다른 실시태양에서 실리카는 18,000 nm 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다.

바람직한 실시태양에서 실리카는 10,000 nm 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 또다른 바람직한 실시태양에서 실리카는 약 1∼5,000 nm의 평균 입자 크기(d50)의 평균 입자 크기를 지닌다. 또다른 바람직한 실시태양에서 실리카는 4,300 nm 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 또다른 바람직한 실시태양에서 실리카는 800 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 또다른 바람직한 실시태양에서 실리카는 180 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 또다른 바람직한 실시태양에서 실리카는 5∼100 nm의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 바람직한 실시태양에서 실리카는 1 내지 1,800의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 바람직한 실시태양에서 실리카는 10 내지 80의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 바람직한 실시태양에서 실리카는 80 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 또다른 바람직한 실시태양에서 실리카는 20 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 5 nm 내지 약 100 nm 범위의 평균 입자 크기(d50)를 지닌 실리카(실리카 졸과 같은)는 유의적인 침전 없이 연장된 기간 동안 유지되거나 유의적인 정도로 응집되지 않는다.

또다른 바람직한 실시태양에서 실리카는 100 nm 이하의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다. 또다른 바람직한 실시태양에서 실리카는 5∼50 nm의 평균 입자 크기(d50)를 지닌다.

표 13 및 상기 데이터는 4300 nm 이하, 바람직하게는 800 nm 이하, 더욱 바람직하게는 180 nm 이하, 더욱 더 바람직하게는 80 nm 이하, 가장 바람직하게는 20 nm 이하의 입자 크기의 실리카가 바람직함을 입증한다.

본원에 사용된 용어 '평균 입자 크기'는 해당 크기의 d50을 지닌 입자군을 의미한다. 실리카 졸의 평균 입자 크기 d50은 표면적 적정에 의해 측정되고 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 확인된다. 또다른 실리카 형태의 평균 입자 크기는 Mastersizer에 의해 측정되었다. 본 발명자들은 입자를 측정하기 위해 광 산란 검출을 이용하는 Malvern Mastersizer S를 이용한다. 상기 기계는 선택적 초음파 출력을 지닌 명목 1000 ml 표본 분산 유니트를 지닌다. 본 발명자들은 300RF 렌즈를 지닌 0.05 ㎛ 내지 880 ㎛ 크기 범위를 제공하는 단일 렌즈 형상 및 2개의 후방산란 검출기를 지닌 42개 원소 고형 상태 검출기 배열을 이용한다. 본 발명자들은 15∼25% 암흑화로 표본을 적가하였고, 측정 파라미터는 80% 펌프 속도, 80% 교반 속도, 50% 초음파 및 3분 체류 시간이다.

실리카는 20 내지 1200 ㎡/g 범위의 표면적으로 지니고, 바람직하게는 실리카는 20 내지 750 ㎡/g의 표면적, 더욱 바람직하게는 실리카는 50 내지 350 ㎡/g의 표면적을 지닌다.

특히 바람직한 실시태양에서 실리카는 10 내지 80의 평균 입자 크기(d50) 및 50 내지 350 ㎡/g의 표면적을 지닌다. 이러한 관점에서 실리카는 바람직하게는 졸 형태이다.

프로테아제

프로테아제는 단백질분해를 수행하는 효소이다. 따라서 이는 단백질의 폴리펩타이드 사슬 내에서 아미노산을 함께 결합시키는 펩타이드 결합을 가수분해한다.

프로테아제는 다수의 그룹으로 분류된다. 일반적으로 이들은 하기 6개 그룹으로 분류된다: 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 글루탐산 프로테아제.

아스파르트산 프로테아제는 인간 위 펩신을 포함한다. 전술된 바와 같이 여러 아형의 인간 위 펩신 즉 펩신 1, 3a, 3b, 3c 및 개스트리신이 존재한다.

따라서 하나의 실시태양에 따라 본 발명의 프로테아제는 아스파르트산 프로테아제이다. 바람직한 실시태양에서 본 발명에 따른 프로테아제는 펩신이다.

바람직한 실시태양에서 본 발명에 따른 프로테아제는 포유류 펩신이다.

바람직한 실시태양에서 본 발명에 따른 프로테아제는 인간 펩신, 돼지 펩신, 말 펩신, 마우스 펩신, 양 펩신, 개 펩신, 염소 펩신 및 소 펩신으로 구성된 군에서 선택된다.

바라직한 실시태양에서 본 발명의 프로테아제는 인간 펩신이다.

바람직한 실시태양에서 본 발명의 프로테아제는 인간 위 펩신이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 프로테아제는 인간 위 펩신의 아형이다. 더욱 더 바람직하게는 본 발명에 따른 프로테아제는 펩신 1, 3a, 3b, 3c 및 개스트리신으로 구성된 군에서 선택된다.

또다른 실시태양에서 프로테아제는 세린 프로테아제, 바람직하게는 트립신이다. 또다른 실시태양에서 프로테아제는 트립신이다.

기질

전술된 프로테아제는 기질 상에서 작용한다. 일반적으로 단일 프로테아제는 많은 상이한 기질 상에서 작용할 수 있다.

본 발명의 실시에 의해 저해된 프로테아제는 일반적으로 위장관 내에 존재하거나 그에서 기인한 것이다. 따라서 본 발명에 따른 기질은 일반적으로 위장관에서 발견되거나 그에서 기인한 기질이다. 따라서 본 발명에 따른 기질은 위장관에서 발견되는 단백질을 포함한다.

위장관에서 발견되는 단백질은 일반적으로 구성적 단백질, 당단백질 및 기능성 단백질을 포함한다.

구성적 단백질은 위장관의 일부를 형성하는 것으로 간주되어 위장관 내에 고유하게 존재하는 것으로 간주된다. 기능성 단백질은 위장관 내에 존재하는 것으로 간주되나 반드시 위장관 자체의 일부는 아니다.

본 발명에 따른 구성적 단백질의 예는 콜라겐, 뮤신 및 엘라스틴이다. 콜라겐은 위에 정렬된 상피 세포의 기저막을 형성한다. 콜라겐은 펩신 또는 더욱 특이적인 매트릭스 메탈로프로테아제와 같은 광범한 프로테아제에 의해 분해될 수 있다.

뮤신은 단백질 골격 상에 탄수화물 측쇄로 구성된 뮤신 당단백질(뮤신)으로 이루어진다. 프로테아제에 의한 뮤신의 분열은 겔 특성 소실 및 당단백질의 분열을 유발하여 용해를 야기한다.

하나의 실시태양에서 본 발명의 기질은 구성적 단백질이다. 바람직한 실시태양에서 구성적 단백질은 콜라겐 및/또는 뮤신이다.

하나의 실시태양에서 뮤신은 위 또는 결장 기원이다.

기능성 단백질의 예는 위장관 내에 존재하나 위장관의 일부를 형성하지 않는 단백질을 포함한다. 따라서 본 발명의 작용에 의해 보호되는 기능성 단백질의 예는 알부민이다.

하나의 실시태양에서 기질은 기능성 단백질이다. 하나의 실시태양에서 기능성 단백질은 알부민이다.

실리카 액체 투여 형태

바람직한 관점에서 본 발명에 사용되기 위해 제공되는 실리카는 현탁액 또는 졸, 더욱 바람직하게는 실리카 졸과 같은 실리카 액체 투여 형태의 형태이다. 따라서 하나의 실시태양에서 본 발명의 실리카는 현탁액 또는 실리카 졸로 존재한다. 현탁액 또는 졸의 조성은 특별히 한정적인 것은 아니다. 그러나 하나의 실시태양에서 현탁액 또는 졸은 알칼리성 매개물을 포함한다. 또다른 실시태양에서 현탁액 또는 졸은 산성 매개물을 포함한다.

현탁액 또는 졸이 알칼리성 매개물을 포함하는 경우 알칼리성 매개물은 바람직하게는 물 및 암모니아 및/또는 수산화나트륨을 포함한다.

하나의 실시태양에서 본 발명의 실리카 현탁액 또는 졸은 실리카, 물 및 안정화 알칼리를 포함한다. 또다른 실시태양에서 안정화 알칼리는 암모니아 및 수산화나트륨에서 선택된다.

하나의 실시태양에서 실리카는 현탁액 또는 졸의 중량을 기반으로 약 10% 내지 약 60%의 함량으로 본 발명의 현탁액 또는 졸 내에 존재한다. 바람직하게는 실리카는 현탁액 또는 졸의 중량을 기반으로 약 20% 내지 약 50%의 함량으로 존재한다. 특히 바람직한 실시태양에서 실라카는 현탁액 또는 졸의 중량을 기반으로 약 25% 이하의 함량으로 현탁액 또는 졸 내에 존재한다. 특히 바람직한 실시태양에서 실라카는 현탁액 또는 졸의 중량을 기반으로 약 20% 이하의 함량으로 현탁액 또는 졸 내에 존재한다. 더욱 바람직한 실시태양에서 실라카는 현탁액 또는 졸의 중량을 기반으로 약 1 내지 20%의 함량으로 현탁액 또는 졸 내에 존재한다.

매우 바람직한 실시태양에서 실리카는 1 내지 180 nm의 평균 입자 크기(d50)을 지니고 현탁액 또는 졸의 중량을 기반으로 약 1 내지 20%의 함량으로 현탁액 또는 졸 내에 존재한다.

또한 본 발명의 실리카 현탁액 또는 졸은 보관 동안 미생물 성장을 방지 및/또는 저해하는 방부제와 같은 성분을 더욱 포함한다.

특히 바람직한 실시태양에서 실리카 현탁액 또는 졸은 현탁액의 총 중량을 기반으로 약 30%의 함량으로 약 20 nm의 평균 입자 크기(d50)를 지닌 실리카를 포함한다.

또한 본 발명에 사용되는 실리카는 본원에 기재된 실리카 또는 실리카 현탁액 또는 실리카 졸 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 보강제 또는 희석제를 포함한 약제학적 조성물의 형태로 제공됨이 인식될 것이다. 따라서 본 발명의 또다른 관점에 따라 실리카 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 보강제 또는 희석제를 포함한 프로테아제 저해제로서 사용하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.

응용

본원에 기술된 바와 같이 본 발명은 소화불량, 위염, 소화성 궤양, 위식도 역류병, 식도외 역류병, 과민 대장 증후군 및 염증성 장질환과 같은 위장관 내 부적당한 단백질 분해와 관련된 이상 및 질환의 치료에 적당하다. 따라서 하나의 관점에서 소화불량, 위염, 소화성 궤양, 위식도 역류병, 식도외 역류병, 과민 대장 증후군 및 염증성 장질환으로 구성된 군에서 선택된 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카가 제공된다. 또다른 관점에서 소화불량, 위염, 소화성 궤양, 위식도 역류병, 식도외 역류병 및 염증성 장질환으로 구성된 군에서 선택된 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카가 제공된다.

또한 위장관 내에 존재하는 증가된 수치의 유리 라디칼과 관련된 질환 또는 이상의 치료도 고려된다. 따라서 하나의 관점에서 위장관 내에 존재하는 증가된 수치의 유리 라디칼과 관련된 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카가 제공된다.

상기 한 바는 예를 들어 ⅰ) 광범한 기질에 대한 프로테아제 저해, ⅱ) 유리 라디칼 제거 및 ⅲ) 점액 재생 및 회복에 의해 달성된다.

이론에 구속됨이 없이 실리카는 아마도 뮤코다당류 및 콜라겐과 같은 생체분자의 교차-결합 및 구조 조직화를 촉진시킴으로서 뮤신 분자간의 상호작용을 강화시키는 작용을 한다. 따라서 뮤신과 실리카간의 상호작용은 점액 겔의 생리화학적 특성을 개선시킨다. 이는 하부 점막에 더 큰 보호를 가능하게 한다.

높게 정제된 뮤신 당단백질과 함께 실리카와의 상호작용이 존재하여 점액 용액의 유동학적 특성이 광대하게 증가되었다. 특히 100 nm 이하, 더욱 바람직하게는 20 nm 이하의 콜로이드 실리카의 첨가는 조장(G') 및 소실(G") 계수의 매우 큰 증가를 야기하였다. 이들 실리카와의 상호작용은 점액과 에카베트 나트륨 또는 알지네이트 사이에서 종전 나타난 것 보다 더 높으나 카보폴(carbopol)에서 나타난 영역 내에 존재한다.

치료

실리카는 치료제로서 즉 치료 응용에 사용됨이 인식될 것이다. 용어 "치료"는 치료 효과, 완화 효과 및 예방 효과를 포함한다.

치료는 인간 또는 동물, 바람직하게는 인간에게 이루어진다.

약제학적 조성물

하나의 관점에서 본 발명은 실리카 및 선택적으로는 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제(이의 혼합 포함)를 포함하는 본 발명에 사용되는 약제학적 조성물을 제공한다.

약제학적 조성물은 인간 및 수의학 약물 내 인간 또는 동물 용법을 위한 것이고, 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제 담체 또는 부형제를 포함한다. 치료적 사용을 위한 허용 가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실시와 관련하여 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이에 더하여 어떠한 적당한 바인더(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들)를 포함한다.

방부제, 안정호제, 염료 및 방향제가 약제학적 조성물 내에 제공된다. 방부제의 예는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제도 사용된다.

상이한 전달 시스템에 따라 상이한 조성물/제형 필요조건이 존재한다. 예로서 본 발명의 약제학적 조성물은 미니-펌프를 이용하여 또는 예를 들어 흡입 또는 섭취 용액/현탁액을 위한 비강 스프레이 또는 에어로졸과 같은 점막 경로에 의해 전달되도록 제형화된다.

병용 약제

본 발명의 화합물은 하나 이상의 또다른 약제학적 활성제와 같은 하나 이상의 또다른 활성제와 병용하여 사용된다.

예로서 본 발명의 화합물은 또다른 프로테아제 저해제와 병용하여 사용된다. 또다른 프로테아제 저해제의 예는 상기 참고문헌에서 발견된다.

투여

일반적으로 의사는 개인 피험체에 가장 적당하고 연령, 체중 및 특정 환자의 반응에 따라 변화될 실질적인 용량을 결정할 것이다. 하기 용량은 평균 사례의 예이다. 물론 더 높거나 낮은 용량 범위가 유리한 개별적인 경우가 존재할 수 있다.

필요에 따라 약제는 0.1 내지 150 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg 체중과 같이 0.01 내지 200 mg/kg 체중의 용량으로 투여된다.

또다른 예로서 본 발명의 약제는 1일 1 내지 4회, 바람직하게는 1일 1회 또는 2회의 요법에 따라 투여된다. 어떠한 특정 환자에 대한 특정 용량 수준 및 용량 빈도는 변화되고 사용되는 특정 화합물 활성, 화합물의 대사 안정성 및 작용 길이, 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 식이, 투여 양식 및 시간, 배출 속도, 약물 조합, 특정 이상의 중증도 및 주요 수행 치료법을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.

용어 "투여된다"는 예를 들어 섭취 용액에 의한 전달을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

따라서 약제학적 투여를 위해 본 발명의 실리카는 통상의 약제학적 제형 기술 및 약제학적 담체, 보강제, 부형제, 희석제 등을 이용한 어떠한 적당한 방식으로도 제형화될 수 있다. 적당한 효과적인 투여 속도는 의문의 실리카의 개별적 활성 및 환자의 평균(70 kg) 체중에 따라 다르게 10 내지 10000 mg/일 또는 100 내지 5000 mg/일과 같이 1 내지 15000 mg/일의 범위이다. 바람직하고 더욱 활성적인 실리카에 대한 더욱 일반적인 투여 속도는 200 내지 2000 mg/일, 더욱 바람직하게는 200 내지 1000 mg/일, 가장 바람직하게는 200 내지 500 mg/일의 범위가 될 것이다. 이들은 단일 투여 요법, 분할 투여 요법 및/또는 며칠간 지속되는 다중 투여 요법으로 제공된다. 경구 투여의 경우 이들은 단위 용량 당 10 내지 2000 mg의 화합물을 함유한 정제, 캡슐, 용액 또는 현탁액으로 제형화된다. 그러나 이러한 효과적인 1일 용량은 활성 성분의 고유 활성 및 환자 체중에 따라 달라질 것이고, 이러한 변화는 의사의 기술 및 판단 내에 존재한다.

실시예

본 발명은 예로서 도면을 참고로 더욱 상세히 설명될 것이다.

재료

본 발명에 사용된 실리카 재료는 영국 워링턴 Precision Colloids LLC, Cartersville USA and INEOS Silicas에서 구입하였다. 사용된 다른 시약은 표준 실험 공급업체에서 수득되었다.

액체 또는 졸 형태로 공급되는 실리카 재료는 탈이온수 내에 필요한 농도로 1회 희석되고 완전하게 진탕되었다. 이러한 원액으로부터 시험 용액(즉 펩신 및/또는 기질을 함유한 시험 용액의) 내 필요한 최종 농도를 제공하는 부피(이후 각각의 시험 방법에 대해 명기된 바와 같은)가 취해진다.

분말 형태의 실리카 재료는 탈이온수 내에 분산되고 필요시 추가 희석되고 완전하게 진탕된다. 이러한 원액으로부터 시험 용액(즉 펩신 및/또는 기질을 함유한 시험 용액의) 내 필요한 최종 농도를 제공하는 부피(이후 각각의 시험 방법에 대해 명기된 바와 같은)가 취해진다.

표 1. 실리카 화합물

pH 측정

졸 형태로 공급되는 실리카 재료의 pH는 공급시 제공되었다. 분말 형태로 공급되는 실리카 재료는 5% w/v 현탁액 형태로 측정되었다.

제조실시예 18 및 19 - 콜로이드 분쇄 실리카

필요한 입자 크기로 Gasil HP270의 콜로이드 분쇄를 위해 사용된 장비는 하기와 같다:

● Eiger Torrance minimill 250

● 182ml Zirconium beads

분쇄기는 182 ml의 지르코늄 구슬을 이용하여 분쇄기 제조사의 지침에 따라 조립되었다.

12% w/v 고형 함량을 지닌 Gasil HP270 슬러리가 제조되었고(100 ml 탈염수 내 120 g) 오버헤드 패들 교반기를 이용하여 10분간 교반되었다. 슬러리는 분쇄기에 도입되고 4000 rpm으로 60분간 분쇄되었다. 분쇄 과정을 평가하기 위해 Malvern Mastersizer를 통해 입자 크기 분포(PSD) 분석을 위한 일정량이 10분 마다 채취되었다.

Malvern Mastersizer 방법 파라미터는 하기와 같다:

● 50%로 조정된 펌프, 교반기 및 초음파

● 2.5분 분산 시간

실시예 22 - 하소 에어로질(Calcined Aerosil)

10 g 에어로질이 12 cm 접시에 위치한 후 냉각되도록 건조기로 이동되기 전에 2시간 동안 소성로 내에서 300℃로 하소되었다.

펩신 용액

펩신(EC.3.4.23.1)의 형태는 하기와 같다:

A) 2500∼3500 유니트/mg 단백질의 규격을 지닌 돼지 펩신 A(Sigma P-7012). 펩신은 0∼100 ㎍/ml의 농도로 0.01 M HCl(pH 2.2) 내에 용해되었다.

B) 0.01 M HCl 내에 희석된 인간 위액(0∼100 ㎍/ml의 돼지 펩신과 동일한 농도)

C) 0.01 M HCl 내에 희석된 정제된 인간 펩신 3(0∼100 ㎍/ml의 돼지 펩신과 동일한 농도)

D) 2500∼3500 유니트/mg 단백질의 규격을 지닌 돼지 펩신 A(Sigma P-7012). 펩신은 1 mg/ml의 농도로 글리신/HCl 완충액 pH 2 내에 용해되었다.

E) 2500∼3500 유니트/mg 단백질의 규격을 지닌 돼지 펩신 A(Sigma P-7012). 펩신은 3 mg/ml의 농도로 0.01 M HCl 내에 용해되었다.

방법

시험 방법 1 - 콜라겐 기질로 실리카에 의한 펩신 저해

펩신 활성은 Moore (1969) Anal Biochem. 32:122-127; Chavira et al. (1984) Anal Biochem. 136:446-460 and Will et al. (1984) Clin Chem. 30:707-711의 방법을 기반으로 한 Azocoll 분석을 이용하여 검출되었다. 이러한 방법은 콜라겐분해 활성 상의 시험 물질의 저해 효과를 평가한다. 펩신의 콜라겐분해 활성은 Azocoll 분해 분석을 이용하여 측정된다. Azocoll은 소가죽 유래의 상업적으로 이용 가능한 아조 염료 표지된 콜라겐 타입 I 기질이다. 펩신 존재시 적색 아조 염료가 콜라겐으로부터 유리되고 결과적인 색 변화가 측정되고 콜라겐분해 활성과 상호관련된다.

콜라겐 기질은 >100 메쉬의 규격을 지닌 아조-염료 표지 타입 I 콜라겐인 Azocoll(Calbiochem 194933)이었다. Azocoll은 0.25% 농도로 pH 2.0 글리신/HCl 완충액 내에 용해되었고 침전을 방지하기 위해 자기 추적자를 이용하여 지속적으로 교반되었다.

이후 실리카에 의한 펩신 저해는 하기와 같이 측정되었다:

각각의 시험 물질(실리카)에 대해 0, 50 또는 100 ㎍/ml 농도의 펩신 용액 200 ㎕와 함께 혼합된 200 ㎕의 시험 물질(실리카) 각각으로 구성된 3개의 혼합물이 시험관 내에 준비되었다(최종 펩신 농도 0, 25, 50 ㎍/ml를 제공하기 위해). 펩신 용액 A, B 및 C가 사용되었다.

1000 ㎕의 Azocoll 용액이 각각의 시험관에 첨가되고 완전하게 혼합되었다. 시험관은 침전을 방지하기 위해 진탕(1200 rpm) 및 빈번한 전도와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이트되었다. 이후 시험관은 4000 rpm에서 20분간 원심분리되었다. 원심분리 후 200 ㎕의 상청액이 마이크로플레이트로 이동되고 490 nm에서 광학 밀도(OD)가 측정되었다(마이크로플레이트 판독기 이용). 490 nm에서 측정된 OD는 용해성 아조-염료의 방출로 인한 타입 I 콜라겐 분열의 기준이다.

양성 대조군으로 사용되기 위해 펩스타틴 A의 5 ㎍/ml 용액이 0.01 M HCl 내에서 제조된 후 50 ㎍/ml 펩신 표준 용액으로 1:2로 희석되었다. 음성 대조군은 50 ㎍/ml 펩신 표준 용액과 함께 증류수로 1:2로 희석되었다.

50 ㎍/ml 펩신에서 펩신 활성의 저해 비율은 식 1을 이용하여 교정(cal.) 곡선에 대해 계산되었다:

식 1

% 펩신 저해 = (OD_cal-OD_시험)/(OD_cal×100)

OD_cal = 50 ㎍/ml 농도에서 교정 곡선으로부터 측정된 OD 수치

OD_시험 = 50 ㎍/ml 농도에서 시험 표본으로부터 측정된 OD 수치

실리카에 의한 콜라겐 기질에 대한 펩신 활성의 저해 비율(실시예 1∼22)이 측정되었고 데이터는 표 2, 3, 4 및 13에 나타나 있다.

시험 방법 2 - 단백질 기질로서 석시닐 알부민으로 실리카에 의한 펩신 저해

펩신 활성은 Hutton et al (1986) Biochem Soc Trans. 14:735-736 and detailed in Strugala et al (2005) Int J Pharm. 304:40-50의 N-말단 분석을 이용하여 검출되었다. 단백질분해 효소(소화불량 관련)로서 펩신 및 단백질 기질로서 석시닐 알부민을 이용한 N-말단 분석은 단백질 기질이 분해시 새로이 형성된 N-말단을 검출하는 비색 방법이다.

단백질 기질은 하기와 같이 제조된 석시닐 알부민(상업적으로 이용 가능하지 않은)이었다: 우혈청 알부민(분획 V)이 0.2 mg/ml 농도로 인산염 완충 식염수 pH 7.5 내에 용해되고 자기 교반기를 이용하여 일정하게 혼합되었다. 석신산 무수물(0.014 mg/ml)이 매우 서서히 첨가되었고 한 방울씩 2 M NaOH의 첨가와 함께 pH 7.5로 pH가 유지되었다. 혼합물은 탈이온수에 대해 완전하게 투석되고 동결 건조되었다. 이후 석시닐 알부민은 10 mg/ml의 농도로 0.01 M HCl 내에 용해되었고 pH는 기질이 용액 내에 존재할 때까지 1 M HCl의 한 방울씩 첨가를 이용하여 pH 2.2로 적정되었다.

각각의 시험 기질(실리카)의 경우 펩신 0, 25, 50 ㎍/ml의 최종 농도를 제공하도록 0, 50 또는 100 ㎍/ml 농도의 펩신 용액 10 ㎕와 혼합된 시험 물질(실리카) 10 ㎕ 각각으로 구성된 3개의 혼합물이 제조되었다. 펩신 용액 A, B 및 C가 사용되었다.

또한 시험 물질에 의한 분석시 충돌 간섭을 설명하기 위해 NaHCO₃의 첨가 후 100 ㎍/ml 펩신 10 ㎕가 첨가된 10 ㎕ 시험 물질로 시험 블랭크가 제조되었다.

50 ㎕의 석시닐 알부민 용액이 첨가되고 진탕되면서(600 rpm) 37℃에서 30분간 인큐베이트되었다.

펩신 활성은 4% NaHCO₃ 50 ㎕의 첨가에 의해 억제되었다. 색상은 50℃에서 10분간 인큐베이션과 함께 1% 트리니트로벤젠 설폰산 50 ㎕의 첨가에 의해 현색되었다. 반응은 10% 도데실 설폰산 나트륨 50 ㎕ 및 1 M HCl 25 ㎕의 첨가에 의해 중지되었다.

405 nm에서의 광학 밀도(OD)가 측정되었고, 관련한 시험 블랭크에 대한 OD(405 nm)가 시험 표준 곡선의 OD(405 nm)에서 공제되었다. 0 ㎍/ml 펩신을 지닌 시험 물질의 OD(405 nm)는 405 nm에서 0.000 OD로 표준화되었다.

50 ㎍/ml 펩신의 펩신 활성 저해 비율은 식 1로 계산되었고 데이터는 표 13에 나타나 있다.

시험 방법 - 유동학 파라미터 및 크기-배제 크로마토그래피로 측정된 실리카에 의한 분해 점액의 복구 및 보호

용액의 점액용해 활성을 측정하는 일련의 방법이 존재한다. 이들은 뮤신 전환을 모니터하기 위한 점도측정법, 유동학, 겔 여과 및 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 포함한다.

기질은 돼지 위에서 채취된 고유 점액이었다(도살장에서 수득됨). 점액은 단백질 골격 상에 탄수화물 측쇄로 구성된 뮤신 당단백질(GP)로 이루어져 있다. 점액의 분열은 겔 특성의 소실 및 GP 분자의 분열을 유발하고 그의 용해 및 분자량 감소를 야기한다.

점액 겔 분해의 시험관 내 모델은 5 ml의 시험 용액과 혼합된 약 1 g의 돼지 위 점액을 포함하는 시험관으로 제작되고 37℃에서 유지되었다. 이러한 혼합물로부터 표본 추출된 1 ml를 대체하는데 사용되는 신선한 시험 용액과 함께 각 시점에서 1 ml가 표본 추출되었다.

시험 용액은 하기와 같다:

펩신 용액 D

펩신 용액 D + 실리카

시험 용액 1 ml가 신선한 시험 용액에 의한 대체와 함께 0, 4, 8 및 24에서 표본 추출되었다. 점액 겔의 조건은 시각적 및 유동체학적으로 평가되었고 용해된 GP의 분열 프로파일은 Sepharose CL-2B(40 x 1 cm 컬럼)를 이용한 크기-배지 컬럼 크로마토그래피에 의해 측정되었다. 150 ㎕ 시험 표본이 적가되었고, 염 아지드(0.2M NaCl/0.02% NaAzide)로 용출되고 48 x 1 ml 분획이 수집되었다. 각각의 분획 내 점액 GP 수치는 Mantle & Allen (1978) Biochem Soc Trans. 6:601-609에 기재된 과요오드산-쉬프(PAS) 분석에 의해 측정되었다. 겔 특성은 점도 및 유동학 데이터를 이용하여 조사되었다.

점도 및 유동학 데이터 분석:

겔 특성은 Cone and Plate geometry(CP 4°/40 mm)를 이용한 Bohlin CVO 제어 스트레스 유량계로 진동 유동학을 이용하여 측정되었다.

시험 물질의 선형 점탄성 영역(LVER)을 발견하기 위해 진폭 스위프(sweep)가 수행되었고, 이후 중심점에서의 진폭은 주파수 스위프에 적용되었다. 측정은 0.1∼100 ㎐의 범위에 대해 37℃에서 수행되었다.

수득된 파라미터는 하기와 같다:

G'(G 프라임) - 탄성 또는 보관 모듈 및 고형-유사 양태의 척도(단위 = Pa);

G"(G 이중 프라임) - 점성 또는 소실 모듈 및 액체-유사 양태의 척도(단위 = Pa);

δ(델타) - 위상 각도 및 겔 강도의 척도. Tan δ = G"/G'. δ<45°인 경우 물질은 겔(G' 우세)이고 위상 각도가 낮을수록 겔은 더 강함.

시험 방법 4 - 유리 라디칼 존재시 실리카의 작용

유리 라디칼 생성 시스템은 과산화수소, 아스코르브산염, FeSO₄ 및 EDTA이었다. 이러한 반응은 Fenton 반응으로 알려져 있고, 하이드록실, 초과산화물 및 아스코르브산염 라디칼을 생성한다. 0.5 mM 아스코르브산염, 0.5 mM FeSO₄, 0.5 mM EDTA를 포함한 원액이 희석제로 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)를 이용하여 제조되었다. 사용 직전 102 ㎕ 30% H₂O₂(9.8 M)가 20 ml의 원액에 첨가되어 유리 라디칼 생성을 개시하였다(용기는 광으로부터 보호됨). 0, 2.5, 5, 7.5 및 10 mM H₂O₂를 포함한 표준 곡선이 준비되었다.

PBS 내 100 ㎕의 2-데옥시-D-리보스(30.8 mM)가 1000 ㎕의 유리 라디칼 반응 혼합물에 첨가되었다(최종 농도 2.8 mM).

이러한 분석에 대한 양성 대조군은 100 μM 갈산프로필(PG)이었다. 음성 대조군은 Millipore 물(또는 시험 물질의 희석액)이었다.

1000 ㎕의 표준물질/표본/대조군은 표지된 시험관에 첨가된 후 100 ㎕의 30.8 mM 데옥시리보스 용액이 첨가되어 잘 혼합되었다. 수조 내에서 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 후 1000 ㎕ 1% 티오바르비탈산 용액 및 1000 ㎕ 2.8% 삼염화아세트산 용액이 첨가되었다. 건조 블록 히터 내에서 100℃로 15분간 가열한 후 시험관을 냉각시킨다. 2000 ㎕ 부탄-1-올이 첨가된 후 4000 g에서 2분간 원심분리되었고, 유기 상층이 일회용 큐벳으로 이동되고 분광계를 이용하여 OD 532 nm가 판독되었다.

계산:

% 저해 = (OD_cal - OD_시험)/OD_cal × 100

OD_cal = 5 mM H₂O₂에서 교정 곡선으로부터 측정된 유리 라디칼 활성

OD_시험 = 5 mM H₂O₂에서 시험 표본으로부터 측정된 유리 라디칼 활성

시험 방법 5 - 펩신 확산에 대한 실리카의 장벽 특성

펩신의 시함관 내 확산은 Franz 세포 모델을 이용하여 측정되었다. Franz-타입 확산 세포는 확산 및 약물 전달을 평가하기 위해 수립된 기술이고 Dr T. Franz에 의해 개발된 것이다. Franz 세포는 피부를 통과하는 국부 약물의 확산을 측정하는 피부 및 경피 분야에서 통상적이나 볼 및 구강 흡수를 포함한 광범위한 적용에 사용된다.

본 발명에 사용된 Franz 세포의 치수는 하기와 같다:

공여 챔버: 1.5 ml

멤브레인: 옥타놀 내에 침지된 Millipore PTFE 멤브레인, 0.45 ㎛ 세공 크기

수용 챔버: 5 ml

구멍: 9 mm 직경

확산 면적: 63.6 ㎟

Franz 세포는 자기 교반기 플레이트 내에 구축된 자동 온도 제어되는 가열 블록을 이용하여 37℃로 유지되었다.

수용 챔버 내 목적 화합물의 검출은 HPLC 펌프(1 ml/분) 및 mm로 측정되는 챠트 판독기 및 반응기를 지닌 검출기를 이용한 지속적 폐쇄 시스템 UV 분광계에 의해 이루어졌다.

수용 챔버는 0.01 M HCl로 충진되고 멤브레인은 그 위치에서 클램프로 고정되었다. 500 ㎕의 펩신 용액 E는 공여 챔버로 적용되었다. 수용 챔버 내 펩신의 출현은 30분간 280 nm(A280)의 파장에서의 흡광도에 의해 검출되었다. 펩신 확산 상의 실리카 영향은 펩신 투여량의 적용 전 멤브레인에 대한 0.1 ml 투여량의 적용에 의해 평가되었다.

Franz 세포의 절편은 하기 위-식도 역류 모델의 생체 내 구성요소와 관련된다:

공여 챔버: 역류액을 나타내는 식도 관강

멤브레인: 식도 편평세포막

수용 챔버: 식도 세포 세포질

확산의 지연 비율은 하기 식을 이용하여 30분의 평균 반응으로부터 계산되었다:

(대조군의 반응 - 시험군의 반응) / 대조군의 반응 X 100

시험 방법 6 - 트립신 활성 분석

트립신 활성은 pH 7.6에서 기질 벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르(BAEE)를 이용한 지속적 속도 분광광도 분석을 이용하여 측정되었다. 아르기닌 잔기의 분열은 253 nm에서 검출 가능한 새로운 생성물을 생성하였다. 253 nm에서의 흡광도는 30℃에서 시간 경과에 따라 모니터되었고 최대 가수분해 속도가 계산되었다.

트립신(EC 3.4.21.4)은 타입 I 소 췌장 트립신(Sigma T8003)이었다. 1 mM HCl 내에 희석된 500 U/ml 트립신 용액이 사용되었다.

기질은 Nα-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르 염산염(BAEE)(Sigma B4500)이었다. 67 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.6) 내의 0.25 mM 용액이 제조되었다.

양성 대조군은 67 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.6) 내에 희석된 500 U/ml의 대두 트립신 저해제(Sigma 93618)이었다.

3000 ㎕의 BAEE 용액이 큐벳 내로 피펫팅되고 30℃로 평형 유지되었다.

253 nm에서의 흡광도는 안정할 때까지 UV 분광계에 의해 모니터되었다. 200 ㎕의 시험 용액은 첨가되고 전도에 의해 즉시 혼합되었다. 253 nm에서의 흡광도는 5분간 기록되었다. 초당 253 nm에서의 흡광도 변화(ΔA253 nm/s)가 계산되었다.

시험 조건은 100 ㎕ 트립신(500 U/ml) + 100 ㎕의 에테르이었다:

1) 1 mM HCl(효소 단독)

2) 대두 트립신 저해제(500 U/ml)

3) 실리카 용액

실리카 유래의 배경은 100 ㎕ 실리카 + 100 ㎕ 1 mM HCl(효소 부재)을 이용하여 평가되었다.

계산

% 트립신 저해 =

((ΔA253 nm/s 트립신 - ΔA253nm/s 시험) ÷ ΔA253nm/s 트립신) x 100

결과

표 2 - 콜라겐 기질로의 0.4% 실리카에 의한 돼지 펩신 저해(반응 혼합물 분석시)

표 2에 나타난 데이터는 콜라겐 기질에 대한 펩신 저해 상의 실리카 입자 크기 효과를 나타내고, 즉 4300 nm 이하, 더욱 바람직하게는 80 nm 이하 입자 크기의 실리카가 바람직하다. 바람직하게는 실리카는 졸 형태로 투여된다. 이는 도 1에 그래프로 입증되어 있다.

표 3 - 펩신 용액 A를 이용한 콜라겐 기질로의 분석 반응 혼합물 내 실리카 % 작용으로서의 돼지 펩신 저해

표 3은 높은 농도의 실리카에서 콜라겐 기질로의 펩신 활성의 완전한 저해가 달성될 수 있음을 나타낸다. 바람직하게는 % 실리카 농도는 0.1% 이상, 더욱 바람직하게는 0.4% 이상이나 바람직하게는 2% 이하이다. 이들 수치는 분석 반응 혼합물 내 실리카의 최종 농도이고, 첨가된 것이 아니며 따라서 더 높은 치료 용량으로서 적절하지 않다.

표 4 콜라겐 기질로의 0.4% 실리카에 의한 인간 펩신 저해(시험 방법 1, 펩신 용액 A, B 및 C)

표 4는 실리카가 인간 기원 펩신(인간 위액 및 분리된 인간 펩신 3)을 저해할 수 있음을 나타낸다. 저해 정도는 돼지 펩신에 대해 달성된 바와 유사하다(각각 93%, 42% 및 98%).

표 5 - 실리카의 존재 및 부재시 고유 돼지 위 점액의 유동학 파라미터

표 5는 실리카 및 고유 점액 혼합물이 상승적인 상호작용으로 실리카 첨가시 겔의 고유 점액 변화를 나타내는 고유 위 돼지 점액의 유동학적 특성의 명백한 증가(G' 및 G"의 증가)를 제공함을 입증한다. 혼합물은 G' 우세로 유지되었고 따라서 실제 겔이었다. 위상 각도(δ)는 7°에서 약 17°로 다소 증가되었고, 이는 겔이 고유 점액-점액 상호작용만큼 강하지는 않았으나 우수한 점액 겔에 대해 예측되는 범위 내에 존재하였다.

일반적으로 건강한 위 점액은 7∼10°의 위상 각도(δ)를 지니는 반면 건강한 결장 점액은 10∼15°범위 내에 존재한다. 위상 각도(δ)가 20°이상인 경우 이는 너무 액체-유사한 점액층을 나타내는 반면 7°이하의 점액은 너무 많은 탄성 또는 고형-유사한 양태를 지녀 유동 능력이 결여된 것으로 간주된다. 37℃에서 4일간 보관에 의해 수득된 분해 점액 또는 각각 29.93 및 55.7의 너무 높은 위상 각도(δ)의 펩신에 의한 분해(표 7)는 실리카 존재시 저하되는 것으로 나타났다.

표 6 - 실리카 존재 및 부재시 분해된 고유 돼지 위 점액의 유동학적 파라미터

표 6에 나타난 분해 점액은 먼저 이를 37℃에서 4일간 보관함으로서 분해되었다. 표 6에 나타난 바와 같이 분해된 점액에 상이한 용량-수치의 실리카가 첨가되었다. 약화된 점액 겔은 겔-형성 능력이 감소되고 하부 점막에 대한 보호를 제공할 수 없는 궤양성 결장염 및 위궤양 질환 상태 모형화한다. 표 6은 약 15°의 위상 각도 및 평가된 또다른 2개의 유동학적 파라미터의 변화(G' 및 G")에 의해 나타난 바와 같이 실리카 용량 첨가가 점액 겔의 회복을 유발하고 이를 건강한 점액에 필요한 겔 강도 내에 존재하게 함을 나타낸다. (G')는 의존적으로 증가된 용량인 반면 유동의 척도인 액체-유사 특성(G")은 실리카의 더 높은 용량에서 매우 일정하게 유지된다. 겔 강도의 척도인 위상 각도(δ)는 용량-의존적으로 감소되어 고유 점액 겔에 근접한다. 이의 치료 이점은 점액층이 손상된 궤양성 결장염 및 소화성 궤양의 치료이다.

표 7 - 실리카의 존재 및 부재시 24시간 동안 펩신(펩신 용액 D)와의 동시-인큐베이션에 의한 분해 후 고유 돼지 위 점액의 유동학적 파라미터

실리카(펩신 및 점액과 동시-인큐베이트된)는 펩신에 의한 분해로부터 점액을 용량 의존적으로 보호할 수 있었다(표 7의 실시예 10). 실리카 부재시 점액은 펩신에 의해 완전하게 분해되었고 더 이상 겔이 아니었다(δ>45). 1∼20%로 투여시 1∼180 nm의 바람직한 입자 크기의 실리카와 점액의 인큐베이션은 펩신에 의한 이러한 겔 특성 소실을 방지할 수 있었다(표 7). 이는 인큐베이션 용액 내에서 측정된 뮤신 당단백질의 용해 감소에 의해 반복되었다(표 8).

특히 거대 분자량 당단백질 분자의 출현의 실질적인 방지가 존재하였고, 이는 중합체 구조 및 그에 따른 점액 겔의 겔 특성이 실리카 존재시 유지되었음을 나타낸다. 그러나 펩신에 의한 분해로부터 점액을 보호하는 능력은 실리카 특성에 따라 변화된다. 바람직하게는 실리카는 10∼180 nm 입자 크기이고, 바람직하게는 실리카 졸 형태로 투여되고 1∼20%로 투여되어야 한다. 실시예 21은 펩신 존재시 점액 분해의 유의적인 저해를 입증하였으나(표 7) 작은 psd(<180 nm)를 지닌 또다른 실리카의 양태와 대조적인 거대 분자량 출현의 감소를 입증하지 못하였고; 이는 실리카 졸과 에어로질 형태의 실리카 사이의 작용 양식의 차이를 나타낸다.

표 8 - 24시간 후 실리카 존재시 펩신(펩신 용액 D)에 의한 분해 후 고유 점액 겔 유래의 거대 및 소 분자량 및 총 당단백질의 방출

표 9 - 시험 방법 5 및 펩신 용액 E를 이용한 막을 투과한 펩신의 확산 상의 실리카 효과

실리카는 모두 펩신 확산을 저해할 수 있었다(표 9 참조). 펩신이 하부층에 도달하는 것을 저지할 수 있는 이러한 능력은 병변 발달을 방지하는데 유리하고 따라서 역류 질환 및 소화불량의 병리에 유리할 것이다.

표 10 - 시험 방법 4를 이용한 유리 라디칼 제거 상의 실리카 효과

표 10에 나타난 바와 같이 실리카는 유리 라디칼을 제거할 수 있었다. 이는 염증으로부터 유발되는 손상의 제어와 관련된다.

표 11 0.09% 농도의 실리카에 의한 트립신 저해

표 12 0.01%∼0.09%의 실시예 8에 의한 트립신 저해

실리카는 세린 프로테아제인 트립신의 효소 활성을 저해할 수 있었다(최종 농도 250 U/ml). 상기 활성은 시험 방법 6을 이용하여 pH 7.6에서 관찰되었고, 표 11 및 12에 나타나 있다.

표 13 - 상이한 기질(콜라겐, 단백질 및 점액)과의 펩신 활성 상의 실리카 효과

시험 방법 1 & 2는 펩신 용액 A를 사용하고, 시험 방법 3은 펩신 용액 D를 사용한다.

표 13에 나타난 데이터는 최고 전체 성능 즉 실리카가 3개의 임상적으로 관련된 물질에 대해 위 효소 펩신의 작용을 저해할 수 있는지 여부를 입증하였다: 기저막 및 피부의 구성성분인 콜라겐, 세포 구축 블록인 단백질 및 위장관에 정렬된 보호 겔인 점액.

표 13은 10 내지 80 nm 입자 크기 및 50 내지 350 ㎡/g의 표면적 및/또는 졸 형태의 실리카가 최상의 전체적 결과를 제공함을 입증한다. 표면적이 너무 큰 경우 펩신의 활성 부위로의 침투 및 점액층으로의 침투가 제한되고, 한편 표면적이 실리카와 펩신 사이의 접촉 표면적보다 너무 작은 경우 펩신 저해를 가능하게 하기에 부적당하다.

표 13 및 상기 데이터는 4300 nm 이하, 바람직하게는 800 nm 이하, 더욱 바람직하게는 180 nm 이하, 더욱 더 바람직하게는 80 nm, 가장 바람직하게는 20 nm 이하 입자 크기의 실리카가 바람직하다. 바람직하게는 실리카는 하이드로겔의 현탁액(즉 Lucilite), 더욱 바람직하게는 스포지-형태 실리카의 현탁액(즉 Gasil-타입), 더욱 더 바람직하게는 현탁액(즉 분쇄 Gasil), 더욱 더 바람직하게는 콜로이드 실리카의 현탁액(Kaolin, Aerosil) 형태, 가장 바람직하게는 졸 형태(즉 Nanosol)로 투여된다. 또한 상기 실리카-타입은 분말 형태로도 투여된다.

본 발명의 기재된 관점의 다양한 변형 및 변동은 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 함께 기재되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시태양에 부당하게 한정되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 관련 분야 업자에게 명백한 본 발명을 수행하는 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 존재한다.

Claims (44)

1. 프로테아제를 저해하는데 사용되는 실리카
   
2. 위장관 내의 유해한 프로테아제 활성과 관련된 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카
   
3. 위장관 내의 유해한 단백질분해성 분해와 관련된 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카
   
4. 소화불량, 위염, 소화성 궤양, 위식도 역류병, 식도외 역류병, 과민 대장 증후군, 직장 관련 염증 질환 및 염증성 장질환으로 구성된 군에서 선택된 질환 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 실리카
   
5. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 메탈로프로테아제 및 글루탐산 프로테아제로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 실리카
   
6. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제 및 아스파르트산 프로테아제로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 실리카
   
7. 제 5항에 있어서, 상기 프로테아제는 아스파르트산 프로테아제임을 특징으로 하는 실리카
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 아스파르트산 프로테아제는 펩신임을 특징으로 하는 실리카
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 펩신은 인간 펩신, 돼지 펩신, 말 펩신, 마우스 펩신, 양 펩신 및 소 펩신으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 실리카
   
10. 제 9항에 있어서, 상기 펩신은 인간 펩신임을 특징으로 하는 실리카
    
11. 제 10항에 있어서, 상기 펩신은 인간 위 펩신임을 특징으로 하는 실리카
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 인간 위 펩신은 펩신 1, 펩신 3a, 펩신 3b, 펩신 3c 및 개스트리신(gastricsin) 중 하나에서 선택됨을 특징으로 하는 실리카
    
13. 제 5항에 있어서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 실리카
    
14. 제 13항에 있어서, 상기 세린 프로테아제는 트립신임을 특징으로 하는 실리카
    
15. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카는 훈증 실리카(fumed silica), 침전 실리카, 비정질 실리카, 액적(coacervated) 실리카, 비정질 실리카 겔, (수성) 실리카 졸, 하이드로겔 실리카 및 크세로겔 실리카로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 실리카
    
16. 제 15항에 있어서, 상기 실리카는 비정질 실리카임을 특징으로 하는 실리카
    
17. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카는 나노입자로 존재함을 특징으로 하는 실리카
    
18. 제 17항에 있어서, 상기 실리카는 20,000 nm 이하의 평균 입자 크기(d50)을 지님을 특징으로 하는 실리카
    
19. 제 18항에 있어서, 상기 실리카는 10,000 nm 이하의 평균 입자 크기(d50)을 지님을 특징으로 하는 실리카
    
20. 제 19항에 있어서, 상기 실리카는 약 1 nm 내지 5,000 nm의 평균 입자 크기(d50)을 지님을 특징으로 하는 실리카
    
21. 제 20항에 있어서, 상기 실리카는 약 5 nm 내지 100 nm의 평균 입자 크기(d50)을 지님을 특징으로 하는 실리카
    
22. 제 21항에 있어서, 상기 실리카는 약 5 nm 내지 50 nm의 평균 입자 크기(d50)을 지님을 특징으로 하는 실리카
    
23. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카는 10 내지 80 nm의 평균 입자 크기(d50) 및 50 내지 350 ㎡/g의 표면적을 지님을 특징으로 하는 실리카
    
24. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제는 위장관에서 발견되는 구성적 단백질, 위장관에서 발견되는 당단백질, 위장관에서 발견되는 기능성 단백질 및 이의 결합에서 선택된 기질에 대한 활성에 대해 저해됨을 특징으로 하는 실리카
    
25. 제 24항에 있어서, 상기 기질은 위장관에서 발견되는 당단백질 또는 위장관에서 발견되는 구성적 단백질임을 특징으로 하는 실리카
    
26. 제 24항에 있어서, 상기 기질은 위장관에서 발견되는 구성적 단백질임을 특징으로 하는 실리카
    
27. 제 26항에 있어서, 상기 기질은 콜라겐 및 뮤신에서 선택됨을 특징으로 하는 실리카
    
28. 제 24항에 있어서, 상기 기질은 위장관에서 발견되는 기능성 단백질임을 특징으로 하는 실리카
    
29. 제 28항에 있어서, 상기 기능성 단백질은 알부민임을 특징으로 하는 실리카
    
30. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카는 실리카 현탁액 형태임을 특징으로 하는 실리카
    
31. 제 30항에 있어서, 상기 현탁액은 알칼리성 현탁액임을 특징으로 하는 실리카
    
32. 제 31항에 있어서, 상기 현탁액은 물 및 암모니아 또는 수산화나트륨에서 선택된 알칼리 매개물을 포함함을 특징으로 하는 실리카
    
33. 제 30항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카는 현탁액의 약 10 중량% 내지 약 50 중량%의 함량으로 현탁액 내에 존재함을 특징으로 하는 실리카 현탁액
    
34. 제 30항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카는 현탁액의 약 15 중량% 내지 약 45 중량%의 함량으로 현탁액 내에 존재함을 특징으로 하는 실리카 현탁액
    
35. 제 34항에 있어서, 상기 실리카는 현탁액의 약 25 중량% 이하의 함량으로 현탁액 내에 존재함을 특징으로 하는 실리카 현탁액
    
36. 제 24항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 방부제를 더욱 포함함을 특징으로 하는 실리카 현탁액
    
37. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 내부 뮤신 상호작용을 증가시키기 위해 사용됨을 특징으로 하는 실리카
    
38. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤신 점도를 증가시키기 위해 사용됨을 특징으로 하는 실리카
    
39. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 점액 겔 특성을 개선시키기 위해 사용됨을 특징으로 하는 실리카
    
40. 제 37항, 제 38항 또는 제 39항에 있어서, 상기 뮤신은 결장 뮤신 또는 위 뮤신이거나 점액은 결장 점액 또는 위 점액임을 특징으로 하는 실리카
    
41. 실시예를 참고로 본원에서 실질적으로 한정된 실리카
    
42. 실시예를 참고로 본원에서 실질적으로 한정된 실리카 현탁액
    
43. 실시예를 참고로 본원에서 실질적으로 한정된 용도
    
44. 실시예를 참고로 본원에서 실질적으로 한정된 약제학적 조성물
    

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