KR101478485B1 - 항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법 - Google Patents

항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0℃ 내지 80℃ 온도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하면, 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되는 경구용 필름을 제조할 수 있으며, 특히 위장 및 소장의 가혹 환경 속에서도 필름 속에 포함된 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되므로 산업상 이용가능성이 높다.

Description

항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법{Film formulation method of prolamin-based oral delivery systems for antioxidants}
본 발명은 항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0℃ 내지 80℃의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 항산화제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름에 관한 것이다.
생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화 과정 중에 상당량의 활성산소들이 생성된다. 이들 활성산소는 생체 내 제거 기작에 의해 대부분 소멸되지만 순간적으로 활성산소가 다량으로 발생되거나 만성적으로 활성산소가 발생되어 항산화방어계와의 균형이 깨지면 각종 질환의 원인이 된다. 산소는 대사과정중 일부분이 수퍼옥사이드 라디칼 (O2·-), 과산화수소 (H2O2),하이드록시 라디칼(HO·), 산소 단분자(일중항 산소, 1O2)와 같은 활성 유해 산소로 변화되는데, 이들은 항산화 효소와 비효소적 항산화제들로 구성된 산화제와 항산화제 균형을 파괴하고 생체 구성 성분들의 손상을 야기시킨다.
노화, 암, 뇌혈관 질환, 심혈관계 질환 등과 같은 질환의 주요 원인 중 하나로 자유라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 들 수 있다. 상기 활성산소종은 생물체에 침입된 병균 등에 의한 생물학적 스트레스나 지구 환경 악화에 따른 각종 환경 스트레스 등의 스트레스로 인하여 생물 유지에 필수적으로 요구되는 산소의 반응성이 높아진 산소를 의미할 수 있으며, 상기 반응성이 높은 산소는 심각한 생리적 장애 등을 유발할 수 있게 된다. 구체적으로, 자유라디칼 또는 활성산소종은 세포를 파괴하거나 피부 진피층의 결합조직을 절단하거나 교차 결합을 일으키므로 주름형성, 아토피성 피부염, 여드름 또는 피부암과 같은 피부 관련 질병뿐만 아니라 암, 심근경색증(myocardial infarction), 뇌졸증(stroke), 동맥경화증(atherosclerosis) 등을 포함하는 심혈관계 질환, 근위축측삭경화증(amyotrophic laternal sclerosis)이나 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease, AD), 파킨스씨 병(Parkinsion's disease, PD)과 같은 만성퇴행성 신경질환(chronic neurodegenerative disease)의 원인이 되는 것으로 보고되어 있다. 또한, 자유라디칼 또는 활성산소종은 인체 내에서 지질을 과산화시켜 과산화지질이라고 하는 해로운 물질을 생성할 수 있고, 상기 과산화지질은 혈관에 작용하여 동맥경화나 혈전과 같은 각종 성인병 및 만성 질환의 원인이 되는 것으로 보고 되어있다.
상기와 같이, 자유라디칼 또는 활성산소종이 여러 병증과 관계가 있는바, 이러한 활성산소종의 생성을 억제하거나 이미 체 내에 생성된 활성산소종을 빠르게 제거하는 효과가 있는 여러 항산화제 물질들을 인체에 투여하여 질병을 예방 또는 치료하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
질병의 치료에 있어서, 특히 만성적인 질환의 치료에 있어서 가장 일반적이고 편리한 투약(drug administration)방식은 구강(oral route)을 통한 약물 전달 방법이다. 그러나 상기 항산화 물질들은, 그대로 경구투여되었을 때 위장, 소장 등의 소화관을 따라 이동하는 도중에 소화기관의 가혹한 환경(pH변화 및 각종 소화 효소 등)에 의해 그 생물학적 활성이 감소하거나 제거되어, 실제 in vivo 상에서 치료효과가 매우 제한적으로 나타난다. 특히 치료활성을 가지는 단백질의 경우에는 그 자체로 경구투여되었을 때 위장관(gastrointestinal tract, GI) 내의 환경으로 인해 쉽게 분해되는 것으로 알려져있다(Woodley, J.F., 1994. Enzymatic barriers for GI peptide and protein delivery. Crit. Rev.Ther. Drug Carrier Syst. 11, 61-5.).
이에 위장 및 소장 등에서의 소화 과정으로부터 항산화 물질의 활성을 높은 수준으로 보호하는, 효과적인 구강 약물 전달 시스템을 개발하여 투약 효과를 증진시키는 새로운 전략이 필요하다.
이에 본 발명자들은 소화 기관으로부터 항산화물질의 활성을 보호하는, 효과적인 구강 약물 전달 시스템을 연구하던 중, 프롤라민, 글리세롤 포르말 및 항산화 물질을 포함하는 에탄올 수용액을 가지고 특정 온도 및 압력 조건에서 용매를 증발시키며 경구용 필름 제제를 제조하였을 때 상기 제조된 필름에서 항산화 물질들의 활성이 매우 높은 수준으로 유지됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0℃ 내지 80℃ 의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된, 항산화제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0℃ 내지 80℃ 온도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 항산화제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
(a) 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및
(b) 0℃ 내지 80℃ 온도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법을 제공한다.
(a) 단계에서는 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조한다.
프롤라민(prolamin)은 곡물(cereal)과 같은 식물에서 발견되는 어떠한 일군의 구형 단백질을 나타낸다. 프롤라민 단백질은 일반적으로 70 내지 80% 알코올에는 용해되지만, 물과 순수한 알코올에는 용해되지 않는다. 이들 단백질은 글루탐산과 프롤린을 높은 수준으로 함유한다.
본 발명의 프롤라민은 식물에서 유래된 공지의 프롤라민 단백질이라면 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 밀(wheat), 호밀(rye), 보리(barley), 귀리(oat), 쌀(rice), 수수(sorghum), 기장(millet), 율무(coix) 및 옥수수(maize)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 식물 유래 프롤라민 일 수 있다. 바람직하게 본원 발명의 프롤라민은 제인(zein), 글리아딘(gliadin), 호르데인(hordein), 세칼린(secalin) , 카피린(kafirin), 코익신(coixin), 글루테닌(glutenin), 글루비-글루텔린(GluB-Glutelin) 및 아베인(avenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 혹은 두 개 이상의 혼합물일 수 있다.
글리세롤 포르말(glycerol formal, C4H8O3)은 Methylidinoglycerol; Sericosol N; 1,3-Dioxolane-4-methanol; 1,2-(Methylidene)glycerol; 5-hydroxy-1,3-dioxane 및 4-hydroxymethyl-1,3-dioxolane의 혼합물; Glycerin formal; Formal Glycerol 등의 다양한 이명을 지니며, 비수용성(water-insoluble) 화합물의 용해를 위한 가용화제 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 글리세롤 포르말은 하기 <화학식 1> 및 <화학식 2>의 구조를 지니는 것으로 47-67% 5-hydroxy-1,3-dioxane basis 및 33-53% 4-hydroxymethyl-1,3-dioxolane basis 의 혼합물이다. 본 발명의 글리세롤 포르말은 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조한 것을 사용할 수 있다.
Figure 112014031028272-pat00001

항산화(antioxidation)란 체내에서 일어나는 여러 산화작용을 방지하는 것을 말하며, 항산화 물질(또는 항산화제)는 기질의 양과 비교하여 적은 양으로 존재하면서 기질의 산화를 지연시키거나 억제하는 물질을 의미한다.
본원 발명의 항산화 물질은 자유라디칼 또는 활성산소종(ROS)의 소거 또는 생성 억제 기능(항산화력)이 있는 물질 및 상기 기능을 촉진(항산화 상승 작용)하는 효과가 있는 물질이라면 그 종류가 제한되지 않으나, 구체적으로 항산화 효소 및 비효소적 항산화 물질을 포함한다.
상기 항산화 효소는 항산화력 또는 항산화 상승 작용 효과가 있는 단백질을 의미하는 것으로, 생체 내 항산화 시스템에 관여하는 공지의 단백질이라면 그 종류가 제한되지 않으나, 바람직하게 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 글루타티온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase), 글루타티온 환원효소(glutathione reductase), 글루타티온-S-전달효소 헴옥시게나제(glutathione-S-transferase hemeoxygenase) 및 이들의 합성 효소 또는 펩티드 유사체(mimetic)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 비효소적 항산화 물질은 항산화력 또는 항산화 상승 작용 효과가 있는 화합물을 의미하는 것으로, 생체 내 항산화 시스템에 관여하는 공지의 화합물이라면 그 종류가 제한되지 않으나, 바람직하게 비타민 E, 커큐민(curcumin), 카로틴(carotene), 리포산(lipoic acid), 코엔자임 Q10, 토코페롤, 폴리페놀, 레티닐 팔미테이트, 티옥트산, 카로티노이드, 비타민 C, 비타민 C 유도체, 카페인(Caffeine), 카페산(Caffeic acid), BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene), TBHQ(tertiary butylhydroquinone), 에피칼로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate, EGCG), 프로안토시아니딘(proanthocyanidin), 몰식자산(Gallic acid), 셀레늄, 아연, 타우린, 플라보노이드 및 스코폴레틴(Scopoletin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.
본원 발명의 상기 (a) 단계에서 사용되는 용매는, 프롤라민 및 글리세롤 포르말을 모두 용해시킬 수 있는 물질이라면 그 종류가 제한되지 않으나, 바람직하게 알코올(alcohol)이 사용 될 수 있다.
본원발명의 상기 '알코올'은 바람직하게 탄소수 1 내지 6의 저가 알코올 일수 있으며, 가장 바람직하게 에탄올(ethanol) 일 수 있다. 상기 에탄올(ethanol, 에틸알코올)은 휘발성과 가연성을 가진 무색의 액체로, 사슬모양의 탄화수소 중 탄소의 수가 2개인 에테인(ethane)에서 수소 원자 하나가 하이드록시기로 치환된 알코올이다.
본원 발명의 상기 알코올은, 100% 알코올과 물(증류수)을 특정 부피비율(v/v)로 혼합 및 희석하여 알코올 수용액 상태로 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 알코올 농도는 전체 용액의 부피에 대한 알코올 부피 비율로서 나타낸다. 상기 '물'은 증류수(1차 증류수, distilled water) 또는 탈이온수(3차 증류수, Deionized water)일 수 있다. 알코올 첨가량은 이에 제한되지 않으나 40%(v/v) 내지 95%(v/v)의 범위로 바람직하게 55%내지 75%일 수 있으며, 가장 바람직하게 70%일 수 있다.
상기 (a) 단계에서 ' 프롤라민, 글리세롤 포르말 및 항산화물질을 포함하는 알코올 수용액'은 그 제조방법에 제한을 두지 않지만, 구체적으로
(i) 프롤라민을 알코올 수용액에 녹이는 단계;
(ii) 상기 (i) 단계의 알코올 수용액에 글리세롤 포르말을 첨가하는 단계;
(iii) 상기 (ii) 단계의 용액에 항산화 물질을 첨가하는 단계;
를 포함하여, 순차적으로 수행될 수 있다.
상기 프롤라민 및 항산화물질의 비율은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 1 내지 1,000,000 : 1의 중량비율일 수 있으며, 더욱 바람직하게 1 내지 1000 : 1의 중량비율일 수 있으며, 가장 바람직하게 100 내지 600: 1의 중량비율일 수 있다.
또한 상기 프롤라민 및 글리세롤 포르말 비율은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 1 내지 10,000 : 1의 중량비율일 수 있으며, 더욱 바람직하게 1 내지 100 : 1의 중량비율일 수 있으며, 가장 바람직하게 1 내지 10 : 1의 중량비율일 수 있다.
(b) 단계는 상기 (a) 단계에서 제조된 프롤라민, 글리세롤 포르말 및 항산화 물질이 포함된 알코올 수용액을 0℃ 내지 80℃ 온도의 감압 조건에 두어 알콜 수용액 속에 포함된 물질들의 상대적인 반응을 계속하는 단계로, 상기 조건으로 인하여 용매가 증발되어 필름이 형성된다.
상기 용매 증발 시 온도는 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 0℃ 내지 80℃ 온도 범위 일 수 있고, 바람직하게 10℃ 내지 38℃ 온도 범위 일수 있으며, 가장 바람직하게 15℃ 내지 35℃ 일 수 있다.
상기 용매 증발은 감압 조건에서 이루어지며, 이때 압력은 바람직하게 1x10-5mbar 내지 999 mbar일 수 있으며, 가장 바람직하게 1x10-4mbar 내지 1x10-2mbar 압력 범위 일 수 있다.
상기 온도 및 감압은 용매가 충분히 증발 될 수 있는 시간만큼 유지 할 수 있으며, 상기 시간은 사용되는 용매의 양과 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 온도 및 감압 조건을 유지하는 시간은 이에 제한되지 않으나 바람직하게 10초 내지 12시간 일 수 있으며, 가장 바람직하게 1분 내지 1 시간 일 수 있다.
상기 (a) 내지 (b) 단계를 포함하는 본 발명의 제조방법에 의하면, 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되는 경구용 필름을 제조할 수 있다. 특히, 위장 및 소장의 가혹 환경 속에서도 필름 속에 포함된 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지된다 (실시예 2).
또한, 상기 본원 발명의 제조방법으로 제조된 경구용 필름은, 동일한 양의 제인과 항산화제로 제조하였을 때 기존의 나노파티클 제형보다 훨씬 많은 양의 항산화제를 함유하며, 효과적으로 항산화 물질의 활성을 보존한다(실험예 1).
따라서 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 항산화제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름을 제공한다.
본 발명의 경구용 필름은 상기 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하며, 상기 단계에 대해서는 전술한 바와 같다.
본원 발명의 경구용 필름 중의 항산화 물질의 양은 필름의 유형, 필름의 두께 및 표면적에 따라 당업자가 선택적으로 설정할 수 있다. 본원에 제공된 경구 투여 가능한 필름은 광범위한 양의 항산화 물질을 수용할 수 있다. 바람직하게 0.01 내지 80% (w/w)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10% (w/w) 일 수 있다.
본 발명의 경구용 필름은 유효 약물 성분으로서 항산화 물질을 포함하며, 구강을 통하여 간편하고 신속하게 약물을 인체 내로 투여할 수 있다. 또한 프롤라민을 기반으로 하여 특정 조건에서 필름 제제를 제조함으로써 내부에 포함된 항산화 물질이 체 내에서 그 활성을 높은 수준으로 유지하는 것이 가능하며, 특히 소화관내 가혹한 환경에서도 항산화 효소의 생리활성이 높은 수준으로 유지된다.
또한 본원 발명의 경구용 필름은 약물 방출의 시기에 따라, 즉시(immediate) 방출형 및/또는 변형(modified) 방출형으로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 속붕해를 위한 속용정제 또는 구강 내 붕해용 필름으로 제제화될 수 있다.
한편 본 발명의 경구용 필름은 프롤라민, 글리세롤 포르말 및 항산화제 외의 첨가물을 그 배합 목적에 따른 적량으로 더욱 첨가할 수 있다. 예컨대 충전제, 가소제, 산미제, 응집 방지제, 가용화제, 안정화제, 감미료, 교미제, 유화제, 기타 용해 보조제, 착색료, 향료 등을 들 수 있다. 특히 필름의 제조시에는 필름형성기제, 점증제, 유화제, 기타 전분 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 필름형성기제는 필름에 유연성을 부여할 수 있고, 붕해가 잘 이루어질 수 있으며 입자 형성을 위한 점도를 유지 할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있으며, 바람직하게는 히프로멜로스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌옥사이드 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 고분자를 사용할 수 있다. 또한 점증제로는 풀루란, 전분, 유당, 셀룰로오스, 카라기난, 아라비아검, 구아검, 로커스트빈검, 잔탄검, 겔란검, 아가, 알긴산, 알긴산 나트륨 등을 사용할 수 있다.
충전제는 구강에서 필름이 미끈거리는 특성을 감소시키고, 필름에 골격을 부여하는 역할을 한다. 또한 필름끼리 점착되는 성질도 감소시키며, 끈적거림과 구강에서의 필름의 분해속도와 약물의 용출속도를 조절할 수 있다. 충전제로는 예컨대 미세결정 셀룰로오스, 셀룰로스 중합체, 탄산마그네슘, 탄산칼슘, 석회석 가루, 실리케이트, 점토, 활석, 이산화티타늄 및 인산칼슘 등을 사용할 수 있다.
필름의 유연성을 부가하기 위한 가소제로서는, 예컨대 시트르산트리에틸, 글리세린지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비톨, 말티톨, 자일리톨, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다.
또한 산미제는 예컨대, 구연산, 사과산, 푸말산, 타르타르산, 아스코르브산, 숙신산, 아디핀산 및 락트산 등을 사용할 수 있고, 응집 방지제는, 예컨대 탈크, 스테아르산칼슘 등을 사용할 수 있다.
가용화제는, 예컨대 자당 지방산 에스테르, 모노스테아르산소르비탄, 라우릴황산나트륨 등을 사용할 수 있으며, 안정화제는 예컨대 경질무수규산, 메타규산알루민산마그네슘, 규산마그네슘, 규산알루미늄, 및 규산칼슘 등을 사용할 수 있다.
또한 감미료는 예컨대 아스파탐, 사카린, 글리시리진산이칼륨, 스테비아 등을 들 수 있으며, 교미제는 예컨대, l-멘톨, 염화나트륨, 아세술팜칼륨, 수크랄로스 등을 사용할 수 있고, 유화제는 글리세린 지방산에스테르, 슈크로스 지방산에스테르, 레시틴, 효소분해 레시틴, 폴리솔르베이트, 솔비탄 지방산 에스테르 및 프로필렌글리콜 등을 사용할 수 있다.
용해 보조제는 예컨대 시클로덱스트린, 아르기닌, 리신, 트리스아미노메탄 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 경구용 필름은 목적하는 색상을 얻기에 적합한 양의 착색제를 추가로 포함할 수 있다. 착색제는 예를 들어 천연식품의 색상 및 식용에 적합한 염료를 포함한다. 이러한 착색제는 통상적으로 FD&D 염료로 공지되어 있다.
본원 발명의 경구용 필름은 생체 내 다양한 산화 반응, 즉 자유라디칼 또는 활성산소종에 의해서 야기되는 다양한 조직 손상 및 질병의 예방 및 치료용 목적으로 사용될 수 있다. 상기 자유라디칼 또는 활성산소종에 의해서 야기되는 다양한 손상 및 질병에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이에 제한되지 않으나 구체적으로 염증, 감염, 동맥경화, 고혈압, 암, 방사선 손상, 신경학적 질환, 신경 퇴행성 질환, 허혈/재관류 손상, 노화, 상처 치료, 글루타치온 결핍증, 후천성 면역결핍 증후군, 겸상 세포 빈혈, 당뇨병 및 류마티스 관절염 등 일 수 있다.
본 발명은 (a) 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0℃ 내지 80℃ 온도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 항산화제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름을 제공한다. 본 발명의 제조방법에 의하면, 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되는 경구용 필름을 제조할 수 있다. 특히, 위장 및 소장의 가혹 환경 속에서도 필름 속에 포함된 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지된다.
도 1은 pH 7.0 조건에서 각 실험군의 SOD 활성을 나타낸다(zein: 제인 필름, SOD : free superoxide dismutase, Zein-SOD : SOD를 포함하는 제인 기반 경구용 필름).
도 2는 pH 7.0 조건에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다(zein: 제인 필름, CAT : free catalase, Zein-CAT : 카탈라아제를 포함하는 제인 기반 경구용 필름).
도 3은 pH 7.0 조건에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다(Gliadin: 글리아딘 필름, CAT : free catalase, Gliadin-CAT : 카탈라아제를 포함하는 글리아딘 기반 경구용 필름).
도 4는 pH 1.3 조건(위장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 SOD 활성을 나타낸다(흰색 그래프: 펩신 처리군, 검정색 그래프: 펩신 비처리군, zein: 제인 필름, SOD : free superoxide dismutase, Zein-SOD : SOD를 포함하는 제인 기반 경구용 필름).
도 5는 pH 1.3 조건(위장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다(흰색 그래프: 펩신 처리군, 검정색 그래프: 펩신 비처리군, zein: 제인 필름, CAT : free catalase, Zein-CAT : 카탈라아제를 포함하는 제인 기반 경구용 필름) .
도 6은 pH 1.3 조건(위장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다(흰색 그래프: 펩신 처리군, 검정색 그래프: 펩신 비처리군, Gliadin: 글리아딘 필름, CAT : free catalase, Gliadin-CAT : 카탈라아제를 포함하는 글리아딘 기반 경구용 필름).
도 7은 pH 7.4 조건(소장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 SOD 활성을 나타낸다(흰색 그래프: 트립신 처리군, 검정색 그래프: 트립신 비처리군, zein: 제인 필름, SOD : free superoxide dismutase, Zein-SOD : SOD를 포함하는 제인 기반 경구용 필름).
도 8은 pH 7.4 조건(소장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다(흰색 그래프: 트립신 처리군, 검정색 그래프: 트립신 비처리군, zein: 제인 필름, CAT : free catalase, Zein-CAT : 카탈라아제를 포함하는 제인 기반 경구용 필름) .
도 9는 pH 7.4 조건(소장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다(흰색 그래프: 트립신 처리군, 검정색 그래프: 트립신 비처리군 Gliadin: 글리아딘 필름, CAT : free catalase, Gliadin-CAT : 카탈라아제를 포함하는 글리아딘 기반 경구용 필름).
도 10은 종래의 나노입자(나노파티클) 제형과 본원 발명의 프롤라민 기반 경구용 필름 제형 속에 포함된 카탈라아제 활성을 나타낸다.
도 11은 종래의 경구용 필름 제조방법과 본원 발명의 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법으로 제조된 각각의 경구용 필름 속에 포함된 카탈라아제 활성을 나타낸다.
도 12는 본원 발명의 프롤라민 기반 경구용 필름 제조 시의 다양한 온도 조건에 따른 카탈라아제 활성을 나타낸다.
도 13은 본원 발명의 프롤라민 기반 경구용 필름 제조 시의 다양한 압력 조건에 따른 카탈라아제 활성을 나타낸다.
도 14는 비효소적 항산화 물질인 카페인을 포함하는 프롤라민(제인 또는 글리아딘)기반 경구용 필름 제조시, 각 pH 조건에 따른 항산화력을 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 비교예 1>
항산화 효소를 포함하는 나노입자( 나노파티클 ) 제조
< 비교예 1-1>
제인(zein, Sigma-Aldrich) 100mg을 1.825 mL의 70% 에탄올 수용액에 녹인다. 소르비톨(Sorbitol, Sigma-Aldrich) 52.5 mg 및 글리세롤 포르말(glycerol formal, Sigma-Aldrich) 67.5mg 을 넣고 용액이 투명해질때까지 섞는다. 항산화 물질을 제인으로 캡슐화하기 위해서, 상기 용액에 카탈라아제(EC 1.11.16.1, Sigma-Aldrich) 3 mg/mL을 한방울씩 떨어뜨리며 저어주어 혼합용액을 제조한다(카탈라아제 총 200μL 첨가). 나노파티클은 상분리 방법(phase separation method)을 이용하여 제조한다. 간략히, 상기 제조된 혼합용액에 8.0 mL의 물을 첨가하고, 1분동안 21,500 rpm에서 균질화(homogenization) 방법으로 분산시킨다. 47,500 rpm으로 5분동안 원심분리(centrifugation)하여 결과적으로 생긴 나노 파티클을 분리하며, 이때 노란색의 고체 파우더가 생성된다. 파티클 사이즈 및 모양은 Masdar Institute of Science and Technology (Abu Dhabi, UAE)의 QUANTA FEG 250 (FEI company, Hillsboro, Oregon)을 사용하여 scanning electron microscopy(SEM) 로 확인하였다.
< 비교예 1-2>
제인 100mg을 1.825 mL의 70% 에탄올 수용액에 녹인다. 소르비톨(Sorbitol) 52.5 mg 및 글리세롤 포르말 67.5mg 을 넣고 용액이 투명해질때까지 섞는다. 항산화 물질을 제인으로 캡슐화하기 위해서, 상기 용액에 수퍼옥시드 디스무타아제((EC 1.15.1.1, Sigma-Aldrich) 100 U/mL(수퍼옥시드 디스무타아제 1 U은 수퍼옥시드 1마이크로 몰 (micro mole)을 1분에 처리할 수 있는 활성을 의미함)을 한방울씩 떨어뜨리며 저어주어 혼합용액을 제조한다(SOD 총 200μL 첨가). 나노파티클은 상분리 방법(phase separation method)을 이용하여 제조한다. 간략히, 상기 제조된 혼합용액에 8.0 mL의 물을 첨가하고, 1분 동안 21,500 rpm에서 균질화(homogenization) 방법으로 분산시킨다. 47,500 rpm으로 5분동안 원심분리(centrifugation)하여 결과적으로 생긴 나노 파티클을 분리하며, 이때 노란색의 고체 파우더가 생성된다. 파티클 사이즈 및 모양은 Masdar Institute of Science and Technology (Abu Dhabi, UAE)의 QUANTA FEG 250 (FEI company, Hillsboro, Oregon)을 사용하여 scanning electron microscopy(SEM) 로 확인하였다.
< 비교예 2>
항산화 효소를 포함하는 경구용 필름 제조
< 비교예 2-1>
제인 450mg 을 1.825 mL의 50% 에탄올 수용액에 녹인다. 소르비톨(Sorbitol) 52.5 mg 및 글리세롤 포르말 67.5 mg 을 넣고 용액이 투명해질 때까지 섞는다. 여기에 카탈라아제 3 mg/mL을 한 방울씩 떨어뜨리며 섞어 주어 혼합용액을 제조한다(카탈라아제 총 200μL 첨가). 상온(25℃)에서 24 시간동안 증발시켜 필름을 제조한다.
< 비교예 2-2>
제인 450mg 을 1.825 mL의 50% 에탄올 수용액에 녹인다. 소르비톨(Sorbitol) 52.5 mg 및 글리세롤 포르말 67.5mg 을 넣고 용액이 투명해질 때까지 섞는다. 여기에 수퍼옥시드 디스무타아제 100 U/mL을 한방울씩 떨어뜨리며 섞어 주어 혼합용액을 제조한다(SOD 총 200 μL 첨가). 상온(25℃)에서 24 시간동안 증발시켜 필름을 제조한다.
< 비교예 2-3>
제인(zein, Sigma-Aldrich) 100mg을 1.825 mL의 70% 에탄올 수용액에 녹인다. 글리세롤 포르말(glycerol formal, Sigma-Aldrich) 67.5mg 을 넣고 용액이 투명해질때까지 섞는다. 상기 용액에 카탈라아제(EC 1.11.16.1, Sigma-Aldrich) 3 mg/mL을 한방울씩 떨어뜨리며 저어주어 혼합용액을 제조한다(카탈라아제 총 200μL 첨가). 이 혼합용액을 유리용기에 넓게 펼치고 상온(25℃)에서 24시간 건조시켜 제인 필름을 형성하였다.
< 실시예 1>
본 발명에 따른, 항산화 효소를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름 제조
< 실시예 1-1> 카탈라아제( catalase )를 포함하는, 제인( zein ) 기반 경구용 필름 제조
제인(zein, Sigma-Aldrich) 500 mg을 70% 에탄올 수용액 10 mL에 용해시킨다. 글리세롤 포르말(glycerol formal, Sigma-Aldrich) 335mg을 넣고 용액이 투명해질 때까지 섞는다. 상기 혼합용액 2 mL (100 mg 제인 포함)을 감압플라스크에 옮겨 넣고, 여기에 카탈라아제(EC 1.11.16.1, Sigma-Aldrich) 3 mg/mL을 한 방울씩 떨어뜨리며 섞어 주어 혼합용액을 제조한다(카탈라아제는 총 200μL 첨가). 감압플라스크에 담긴 혼합용액은 rotary evaporator 를 사용하여 얇은 필름(film)이 형성될 때까지 35℃ 온도의 감압조건(0.002 mbar)에서 용매(에탄올)를 증발시켰다.
< 실시예 1-2> 수퍼옥시드 디스무타아제( superoxide dismutase , SOD )를 포함하는, 제인( zein ) 기반 경구용 필름 제조
제인 500 mg을 70% 에탄올 수용액 10 mL에 용해시킨다. 글리세롤 포르말(glycerol formal) 335mg을 넣고 용액이 투명해질 때까지 섞는다. 상기 혼합용액 2 mL (100 mg 제인 포함)을 감압플라스크에 옮겨 넣고, 여기에 수퍼옥시드 디스무타아제((EC 1.15.1.1, Sigma-Aldrich) 100 U/mL(수퍼옥시드 디스무타아제 1 U은 수퍼옥시드 1마이크로 몰 (micro mole)을 1분에 처리할 수 있는 활성을 의미함) 100 U/mL을 한 방울씩 떨어뜨리며 섞어 주어 혼합용액을 제조한다(SOD는 총 200μL 첨가). 감압플라스크에 담긴 혼합용액은 rotary evaporator 를 사용하여 얇은 필름(film)이 형성될 때까지 35℃ 온도의 감압조건에서 용매(70% 에탄올)를 증발시켰다.
< 실시예 1-3> 카탈라아제를 포함하는, 글리아딘 ( gliadin ) 기반 경구용 필름 제조
글리아딘(gliadin, Sigma-Aldrich) 500 mg을 70% 에탄올 수용액 10 mL에 용해시킨다. 글리세롤 포르말(glycerol formal) 335mg을 넣고 용액이 투명해질 때까지 섞는다. 상기 혼합용액 2 mL (100 mg 제인 포함)을 감압플라스크에 옮겨 넣고, 여기에 카탈라아제 3 mg/mL을 한 방울씩 떨어뜨리며 섞어 주어 혼합용액을 제조한다(카탈라아제는 총 200μL 첨가). 감압플라스크에 담긴 혼합용액은 rotary evaporator 를 사용하여 얇은 필름(film)이 형성될 때까지 35℃ 온도의 감압조건에서 용매(70% 에탄올)를 증발시켰다.
<실시예 2>
본 발명에 따른, 프롤라민 기반 경구용 필름의 항산화 효소 활성 보호 효과
상기 <실시예 1>에서 제조된 경구용 필름에 포함된 항산화 물질의 활성은 다음과 같은 방법으로 측정되었다.
< 실시예 2-1> 프롤라민 기반의 경구용 필름 시스템
카탈라아제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름에서, 카탈라아제의 활성은 과산화수소(H2O2) 분해율(decomposition rate)을 측정함으로써 확인하였다. pH 7.0 완충용액에서 카탈라아제 또는 카탈라아제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름을 10 μM H2O2와 혼합한 후, 240nm 에서 H2O2의 흡광도를 모니터링하여 카탈라아제 활성을 측정하였다. SOD 를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름에서, SOD 활성은 SOD assay kit(SOD determination kit 19,160, Fluka, St Louis, MO)를 이용하여 제조사의 방법으로 측정하였다.Significance of results was determined via t-test between zein film and other films containing SOD or catalase with p<0.05 (*)
그 결과 [도 1] 및 [도 2]에서 보는 바와 같이, pH7.0에서 SOD 또는 카탈라아제의 단독 활성과 제인 기반 필름 속에 포함된 SOD 또는 카탈라아제의 활성이 거의 유사했다. 이는 SOD 또는 카탈라아제가 제인과 함께 필름형 약물 전달 시스템을 형성한 후에도, 각 물질의 활성을 동일한 수준으로 유지함을 나타낸다,
마찬가지로 [도 3]에서 보는 바와 같이, 글리아딘을 이용하여 필름 제조 후에도 내부에 포함된 카탈라아제가 항산화 기능을 유지함을 확인하였다.
< 실시예 2-2> 위장내 환경에서의 항산화 효소 활성 평가
위장내 환경(GI condition)에서 제인의 항산화 단백질 보호 능력을 평가하였다. 카탈라아제 또는 카탈라아제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름을 염산(50.1 mM HCl, pH 1.3)용액에 넣어 20 분간 방치하여 위장 내 환경을 모방하였다. 이때 실험군을 나누어 349.1mM 펩신(pepsin) 처리군 및 펩신 비처리군으로 구분하여 실험하였다(Metheny, N.A., Stewart, B.J., et al., 1997. pH and concentrations of pepsin and trypsin in feeding tube aspirates as predictors of tube placement. J. Parenter. Enteral Nutr. 21, 279-85.). 카탈라아제 및 SOD 활성은 상기 실시예 <2-1>에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정하였다(Significance of results was determined via t-test between free enzymes and other delivery vehicles with p<0.05 (*)).
그 결과 [도 4] 및 [도 5]에서 보는 바와 같이, SOD 또는 카탈라아제 단독으로는 위장 내 산성 환경(pH 1.3)에서 활성이 거의 소실되었다. 그러나 제인 기반 필름 속에 포함된 SOD 또는 카탈라아제는 위장 내 환경(pH 1.3)에서도 그 활성이 높은 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 또한 위장에서 분비되는 효소인 펩신을 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 SOD 또는 카탈라아제의 활성에 유의적인 차이는 없었다. 이로서 본원 발명의 제조방법으로 제조된 제인 기반 필름은 항산화 물질의 활성을 보호하는 효과가 뛰어남을 확인하였다.
또한 [도 6]에서 보는 바와 같이, 글리아딘 필름 내에 존재하는 카탈라제가 위장조건(pH 1.3)에서 항산화 기능을 보호받고 있음을 확인하였다.
< 실시예 2-3> 소장 내 환경에서의 항산화 효소 활성 평가
소장 내 환경을 모방하기 위하여 실험군을 나누어 143.0 mM 트립신(trypsin) 처리군 및 트립신 비처리군으로 구분하여 pH 7.4의 환경에서 30분간 방치하였다. 카탈라아제 및 SOD 활성은 상기 실시예 <2-1>에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정하였다(Significance of results was determined via t-test between free enzymes and other delivery vehicles with p<0.05 (*)).
그 결과 [도 7] 및 [도 8]에서 보는 바와 같이, SOD 또는 카탈라아제 단독으로는 pH7.4 조건에서는 그 활성이 유지되었으나, 소장 환경과 같이 트립신을 함께 처리한 군에서는 그 활성이 매우 낮은 수준으로 감소하는 경향을 나타냈다. 이에 반해 제인 기반 필름 속에 포함된 SOD 또는 카탈라아제는 트립신 처리에 관계없이 높은 수준으로 그 활성을 유지함을 확인하였다.
또한 [도 9]에서 보는 바와 같이, 글리아딘 필름 내에 존재하는 카탈라제가 소장조건(pH7.4)에서 항산화 기능을 보호받고 있음을 확인하였다.
<실험예 1>
제형별 활성 평가
상기 <비교예 1-1> 및 <실시예 1-1>에서 제조된 경구용 필름에서, 카탈라아제 활성을 비교하였다. 먼저 각 제형별로 카탈라아제의 함유량을 결정하기 위해 형광물질 (Fluorescein isothiocyanate (FITC), Sigma-Aldrich)을 카탈라아제에 화학적으로 결합시킨 후, 이를 이용하여 제인 나노파티클 및 필름을 형성하고, 각 제형별로 1 mg씩을 취하여 형광의 양을 재고, 이를 처음 사용한 형광의 양과 비교하여 제형별로 카탈라아제의 함유량을 결정하였다. 카탈라아제 활성 측정은 형광물질이 결합되지 않은 카탈라아제를 사용, 제인 나노파티클 및 필름을 형성하고, 각 제형별로 1 mg씩을 취한 후, pH 7.0에서 <실시예 2-1>에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.
제형별 카탈라아제 함유율(Loading efficiency of catalase)
Catalase in Zein Nanoparticle Catalase in Zein Film
40.99 ± 4.27 % 98.58 ± 1.23 %
상기 [표 1] 및 [도 10]에서 보는 바와 같이, 경구용 필름제형이 나노입자에 비하여 내부에 포함된 카탈라아제가 훨씬 높은 수준의 활성을 유지하고 있음을 확인하였다. 이는 제조 과정에서 필름이 훨씬 많은 양의 카탈라제를 보유하고 있기 때문으로 해석할 수 있다.
<실험예 2>
제조방법에 따른 활성 평가
< 실험예 2-1> 종래의 경구용 필름 제조방법과 본원 발명의 경구용 필름 제조 방법 비교
상기 <비교예 2-3> 및 <실시예 1-1>에서 제조된 경구용 필름에서 각 1 mg의 필름을 취하여, 카탈라아제 활성을 비교하였다. 카탈라아제 활성 측정은 pH 7.0에서 <실시예 2-1>에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.
그 결과 [도 11]에서 보는 바와 같이, 종래의 방법으로 제조된 필름에서는 카탈라아제의 활성이 거의 소멸되었으나, 본원 발명의 제조 방법으로 생산된 필름에서는 카탈라아제가 매우 높은 수준으로 활성을 유지하고 있음을 확인하였다.
< 실험예 2-2> 다양한 온도 조건에 따른 경구용 필름 비교
본원 발명의 필름 제조방식으로, 동일한 감압조건(0.002 mbar)에서 온도를 변화시키며 제조한 여러가지 경구용 필름에서, 내부에 포함된 항산화 효소들의 활성을 측정하였다.
압력조건 및 온도조건을 제외하고는 실시예<1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
그 결과 [도 12]에서 보는 바와 같이, 15-35 ℃ 조건에서 제조된 경구용 필름에서, 카탈라아제의 활성이 상대적으로 높은 활성을 유지하고 있음을 확인하였다.
< 실험예 2-3> 다양한 압력 조건에 따른 경구용 필름 비교
본원 발명의 필름 제조방식으로, 동일한 온도조건(35℃)에서 압력을 변화시키며 제조한 여러가지 경구용 필름에서, 내부에 포함된 항산화 효소들의 활성을 측정하였다.
압력조건 및 온도조건을 제외하고는 실시예<1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
그 결과 [도 13] 에서 보는 바와 같이, 압력이 낮아질수록 필름 속에 포함된 카탈라아제의 활성이 높은 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 특히, 압력0.002 mbar 에서 상대적으로 높은 활성을 유지하였다.
< 실시예 3>
본 발명에 따른, 비효소적 항산화 물질을 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름
카페인(caffeine) 5 mg과, 프롤라민으로서 글리아딘 100 mg 또는 제인 100 mg을 이용하여, 상기 실시예 1-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다. 위장내 환경에서 프롤라민의 항산화 단백질 보호 능력을 평가하기위하여 카페인 또는 카페인을 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름을 염산(50.1 mM HCl, pH 1.3)용액에 넣어 20 분간 방치하여 위장 내 환경을 모방하였으며, 이 용액을 다시 pH 7.0으로 중화하여서 다음 세포실험에 사용하였다.
경구용 필름내의 카페인의 항산화성 효과를 측정하기 위해 12 well plate에 세포(RAW264.7, 4x105 cells/well)를 배양 후 각 well에 상기에서 제조된 경구용 필름 1 mg씩을 세포와 2시간 배양한 후, 위의 배양액을 제거하고, 세포를 과산화수소(H2O2) (100 microM)로 4시간동안 처리하여, 세포가 얼마나 과산화수소에 의하여 죽었는지 또한 카페인이 얼마나 세포를 과산화수소로부터 보호할 수 있을 지를 측정하였다.
구체적인 실험군은 다음과 같이 나누었다 ; A: 음성대조군, B: H2O2만 처리, C: pH 1.3 에서 20분동안 방치한 카페인 용액 및 H2O2 처리, D: pH 1.3 에서 20분동안 방치한 카페인 용액을 다시 pH 7.0으로 중화한 용액 및 H2O2 처리, E: 카페인을 포함하는 글리아딘 기반 경구용 필름을 pH 1.3 에서 20분간 방치한 용액 및 H2O2 처리, F: 카페인을 포함하는 글리아딘 기반 경구용 필름을 pH 1.3 에서 20분간 방치한 용액 을 다시 pH 7.0으로 중화한 용액 및 H2O2 처리, G : 카페인을 포함하는 제인 기반 경구용 필름을 pH 1.3 에서 20분간 방치한 용액 및 H2O2 처리, H: 카페인을 포함하는 제인 기반 경구용 필름을 pH 1.3 에서 20분간 방치한 용액을 다시 pH 7.0으로 중화한 용액 및 H2O2 처리.
세포 독성은 죽은 세포만 염색을 시키는 염료 (propidium iodide, PI)를 사용하여 측정하였으며, 각 well당 100 microL (50 microgram/mL PI)를 넣고 10분 후, 마이크로 플레이트 리더 (microplate reader manufactured by Tecan)을 사용하여 형광 (excitation: 535 nm, emission: 617nm)을 측정하였다. 배양액만 있는 경우와 과산화 수소만 있는 경우를 각각 0 %와 100 %의 독성으로 표시하고, 다른 샘플들은 이의 상대 독성으로 표기 하였다.
카페인은 활성산소로부터 세포를 보호해주는 기능이 있으며 (Silverberg JI, et.al., J Drugs Dermatol.Nov;11(11):1342-6), [도 14]에서 보는 바와 같이, 상기 실험을 통하여 제인과 글리아딘 내에서 Caffeine의 활성이 잘 유지되고 있음을 확인하였다. 상기 데이터는 본원 발명의 프롤아민(특히, 제인 또는 글리아딘)을 이용한 경구용 필름 제조방법이 항산화 효소뿐 아니라 비효소적 항산화 물질에서도 잘 적용될 수 있음을 보여준다.
< 제조예 >
하기에 본 발명에 의한 항산화제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름의 제조예를 예시한다.
제조예 1 : SOD 를 포함하는, 글리아딘 기반 경구용 필름
글리아딘 100 mg, 글리세롤 포르말 67.5mg, SOD 200μL을 이용하여, 상기 <실시예 1-2>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 2 : 카탈라아제를 포함하는, 호르데인 ( hordein ) 기반 경구용 필름
호르데인 100 mg, 글리세롤 포르말 67.5mg, 카탈라아제 200μL를 이용하여, 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 3 : 카탈라아제를 포함하는, 글루테닌 ( glutenin ) 기반 경구용 필름
글루테닌 100 mg, 글리세롤 포르말 67.5mg, 카탈라아제 200μL를 이용하여, 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 4 : 카탈라아제를 포함하는, 세칼린 ( secalin ) 기반 경구용 필름
세칼린 100 mg, 글리세롤 포르말 67.5mg, 카탈라아제 200μL를 이용하여, 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 5 : SOD 를 포함하는 , 코익신 ( coixin ) 기반 경구용 필름
코익신 100 mg, 글리세롤 포르말 67.5mg, SOD 200μL을 이용하여, 상기 <실시예 1-2>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 6: 글루타티온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase)를 포함하는, 제인 기반 경구용 필름
제인 100 mg, 글리세롤 포르말 67.5mg, 글루타티온 퍼옥시다제 200μL을 이용하여, 상기 <실시예 1-1>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 7 : 글루타티온환원효소( glutathione reductase )를 포함하는, 제인 기반 경구용 필름
제인 100 mg, 글리세롤 포르말 67.5mg, 글루타티온환원효소 200μL을 이용하여, 상기 <실시예 1-1>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 8 : 글루타티온-S-전달효소 헴옥시게나제( glutathione -S- transferase hemeoxygenase)를 포함하는 제인 기반 경구용 필름
제인 100 mg, 글리세롤 포르말 67.5mg, 글루타티온-S-전달효소 헴옥시게나제 200μL을 이용하여, 상기 <실시예 1-1>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 9 : 비타민 C를 포함하는 제인 기반 경구용 필름
제인 100 mg, 글리세롤 포르말 24 mg, 비타민 C 5 mg을 이용하여, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
제조예 10 : 토코페롤을 포함하는 제인 기반 경구용 필름
제인 100 mg, 글리세롤 포르말 24 mg, 토코페롤 5 mg을 이용하여, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0℃ 내지 80℃ 온도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하면, 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되는 경구용 필름을 제조할 수 있으며, 특히 위장 및 소장의 가혹 환경 속에서도 필름 속에 포함된 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되므로 산업상 이용 가능성이 높다.

Claims (9)

  1. (a) 프롤라민, 글리세롤 포르말(glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및
    (b) 0℃ 내지 45℃ 온도 및 1x10-5mbar 내지 999mbar의 압력 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프롤라민은 밀(wheat), 호밀(rye), 보리(barley), 귀리(oat), 쌀(rice), 수수(sorghum), 기장(millet) 율무(coix) 및 옥수수(maize)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 식물 유래 프롤라민인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프롤라민은 제인(zein), 글리아딘(gliadin), 호르데인(hordein), 세칼린(secalin), 카피린(kafirin), 코익신(coixin), 글루테닌(glutenin), 글루비-글루텔린(GluB-Glutelin) 및 아베인(avenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항산화 물질은 항산화 효소, 비효소적 항산화 물질 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 항산화 효소는 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 글루타티온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase), 글루타티온환원효소(glutathione reductase), 글루타티온-S-전달효소 헴옥시게나제(glutathione-S-transferase hemeoxygenase) 및 이들의 합성 효소 또는 펩티드 유사체(mimetic)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 비효소적 항산화 물질은 비타민 E, 커큐민(curcumin), 카로틴(carotene), 리포산(lipoic acid), 코엔자임 Q10, 토코페롤, 폴리페놀, 레티닐 팔미테이트, 티옥트산, 카로티노이드, 비타민 C, 비타민 C 유도체, 카페인(caffeine), 카페산(Caffeic acid), BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene), TBHQ(tertiary butylhydroquinone), 에피칼로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate, EGCG), 프로안토시아니딘(proanthocyanidin), 몰식자산(Gallic acid), 셀레늄, 아연, 타우린, 플라보노이드 및 스코폴레틴(Scopoletin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 온도는 10℃ 내지 38℃ 인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제1항의 방법으로 제조된, 항산화제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름.
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