WO2015152517A1 - 항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법 - Google Patents

항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing oral film based on oral fructose for protecting antioxidant activity, and more particularly, (a) comprises framine, glycerol formal and antioxidant. Preparing an aqueous solution of alcohol; And (b) evaporating the solvent under reduced pressure from 0 ° C. to 80 ° C., and a method for producing an oral film and a prolamin based oral film comprising an antioxidant prepared by the method. .
  • Oxygen is part of the metabolism of superoxide radicals (02 ⁇ -); It is converted into active harmful oxygen such as hydrogen peroxide (3 ⁇ 40 2 ), hydroxy radicals ( ⁇ 0 ⁇ ), oxygen single molecule (single singlet oxygen, 2 ), which is composed of antioxidants and enzymes and inert antioxidants. Destroys balance and causes damage to biological components.
  • the reactive oxygen species may refer to oxygen having a high reaction resistance of oxygen required for biological maintenance due to stress such as biological stress caused by germs invading organisms or various environmental stresses caused by deterioration of the global environment. Highly reactive oxygen can cause serious physiological disorders. Specifically As a result, free radicals or reactive oxygen species destroy cells, cut off the connective tissue of the dermal layer, or cause cross-linking, which can lead to cancer, myocardial infarction, as well as ⁇ )-related diseases such as wrinkles, atopic dermatitis, acne or skin cancer.
  • cardiovascular diseases including myocardial infarct ion, stroke, atherosclerosis, amyotrophic laternal sclerosis or Alzheimer's disease (AD), Parkin's It has been reported to cause chronic neurodegenerat ive diseases such as Parkins ion's disease (PD).
  • free radicals or reactive oxygen species can produce a harmful substance called lipid peroxide by peroxidating lipids in the human body, and the lipid peroxide acts on blood vessels to prevent various adult diseases and chronic diseases such as atherosclerosis or blood clots. It is reported to be the cause.
  • free radicals or reactive oxygen species are associated with various conditions, and various antioxidant substances are effective in inhibiting the generation of these reactive oxygen species or rapidly removing active oxygen species generated in the body. Efforts to prevent or treat diseases by administering them to the human body continue.
  • the most common and convenient method of drug administration is drug delivery via the oral route.
  • the antioxidant substances when orally administered as it is, during the para migration of the digestive tract of the stomach, small intestine, etc., the biological activity is reduced or eliminated by the dark environment (pH change and various digestive enzymes, etc.) of the digestive organs, There is very limited therapeutic effect in vivo.
  • proteins with therapeutic activity are known to be easily degraded by the environment in the gastrointestinal tract (GI) when administered orally by itself (Woodley, J.F., 1994. Enzymatic barriers for GI pept ide and protein del ivery.Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.11, 61-5.).
  • the present inventors while studying an effective oral drug delivery system that protects the antioxidant activity from the digestive organs, have an aqueous solution of ethanol containing frramine, glycerol formal and antioxidants. When the evaporation of the solvent under pressure conditions and the preparation of the oral film preparation, it was confirmed that the activity of antioxidant substances in the prepared film was maintained at a very high level to complete the present invention.
  • an object of the present invention is to prepare an aqueous solution of alcohol comprising (a) framine, glycerol formal, and an antioxidant; And (b) to provide a method for producing an oral film comprising the step of evaporating the solvent under reduced pressure of 0 ° C to 80 ° C.
  • Another object of the present invention is to provide a framine-based oral film comprising an antioxidant prepared by the above method.
  • the present invention is prepared by the above method,
  • framine-based oral film comprising an antioxidant.
  • (B) it provides a method for producing an oral film, comprising the step of evaporating the solvent under reduced pressure of 0 ° C to 80 ° C temperature.
  • step (a) an aqueous solution of alcohol containing framine, glycerol formal, and antioxidants is prepared.
  • Prolamin refers to any group of globular proteins found in plants such as cereals. Pramine protein is generally soluble in 70-80% alcohol, but not in water and pure alcohol. These proteins contain high levels of glutamic acid fruclin.
  • the plutamine of the present invention is not limited if the known plutamine protein derived from a plant, for example, wheat, rye, barley, oat ), Rice, sorghum, millet, coix, and maize.
  • the pramines of the present invention are zein, gliadin, hordein, secalin, kafirin, coixin, glutenin ( glutenin, GluB-Glutelin, and any one selected from the group consisting of avein (avenin) may be two or more combinations.
  • Glyceryl formal (C43 ⁇ 40 3 ) is Methylidinoglycerol
  • Glyceryl formal of the present invention has the structures of ⁇ Formula 1> and ⁇ Formula 2> 47-67% 5-hydroxy-l, 3-dioxane basis and 33-53% 4-hydr oxyme thy 1-1, 3-di oxo lane basis
  • the glycerol of the present invention can be used commercially purchased or prepared by chemical synthesis known in the art. ⁇ 38>
  • Antioxidation refers to the prevention of various oxidative reactions in the body.
  • Antioxidants or antioxidants are substances that are present in small amounts compared to the amount of the substrate and which delay or inhibit the oxidation of the substrate. it means.
  • Antioxidants of the present invention may be any kind of a substance which has a function of scavenging or inhibiting production (antioxidative force) of free radicals or reactive oxygen species (R0S) and a substance which has an effect of promoting (antioxidative synergism) the function.
  • a substance which has a function of scavenging or inhibiting production (antioxidative force) of free radicals or reactive oxygen species (R0S) and a substance which has an effect of promoting (antioxidative synergism) the function.
  • the antioxidant enzymes refer to proteins having an antioxidant or antioxidant synergistic effect, and any kind of known protein involved in the antioxidant system in vivo is not limited, but preferably superoxide dismutase dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, glutathione -S-transferase hemeoxygenase and their synthetic enzymes Or any one or more selected from the group consisting of peptide mimetic.
  • the non-enzymatic antioxidant means a compound having an antioxidant power or an anti-oxidative synergistic effect, and any kind of known compound involved in the antioxidant system in vivo is not limited, but preferably vitamin E, curcumin (curcumin), carotene, lipoic acid, coenzyme Q10, tocofe, polyphenols, retinyl palmitate, thioctic acid, carotenoids, vitamin C, vitamin C derivatives, caffeine, caffeic acid (Caffeic acid), BHA (butylated hydroxyanisole), BHTCbutylated hydroxytoluene), TBHQCtertiary but ylhydroqui none), epicalocatechin-3-gallate (6 ⁇ 31100 ⁇ 6 ( ⁇ ⁇ -3 311 ⁇ 6, EGCG), proanthocyanate Cyanidin
  • the solvent used in the step (a) of the present invention is not limited if the solvent is a substance capable of dissolving both formalin and glycerol, preferably alcohol may be used (alcohol).
  • the 'alcohol' of the present invention may preferably be a low-cost alcohol having 1 to 6 carbon atoms, most preferably ethanol.
  • the ethanol ethanol, ethyl alcohol
  • ethanol is a colorless liquid having a volatile and flammable, is an alcohol in which one hydrogen atom is substituted with a hydroxy group in ethane (ethane) of two carbon atoms in the chain-shaped hydrocarbon.
  • distilled water 100% alcohol and water (distilled water) may be mixed and dilute in a specific volume ratio (v / v) to use alcohol in an aqueous solution.
  • the alcohol concentration of the present invention is thus expressed as the ratio of alcohol volume to the volume of the total solution.
  • the 'water' may be distilled water (primary distilled water) or deionized water (tertiary distilled water, De ionized water).
  • the amount of alcohol added is not limited, but may be preferably 55% to 75%, most preferably 70% in the range of 40% (v / v) to 95% (v / v).
  • step (a) 'alcohol aqueous solution containing framine, glyceryl formal and antioxidants' is not limited to the preparation method, specifically
  • step (ii) adding glyceryl formal to the aqueous alcohol solution of step (i);
  • the ratio of the framine and the antioxidant is not limited thereto, but may be preferably a weight ratio of 1 to 1,000,000: 1, more preferably 1 to 1000: 1, and most preferably 100 to 600. It may be a weight ratio of 1: 1.
  • the framine and glycerol formal rain is not limited thereto, wind It may be a weight ratio of 1 to 10,000: 1, more preferably a weight ratio of 1 to 100: 1, most preferably a weight ratio of 1 to 10: 1.
  • step (b) the aqueous solution of alcohol containing pramine, glycerol, and antioxidant prepared in step (a) is placed under reduced pressure at 0 ° C. to 80 ° C. In a step of continuing the relative reaction of the materials involved, the conditions cause the solvent to evaporate to form a film.
  • the silver content during evaporation of the solvent is not limited thereto, and specifically, may be in the range of 0 ° C. to 80 ° C., preferably in the range of 0 ° C. to 45 ° C., more preferably 10 ° C. It may be a C to 38 ° C temperature range, most preferably 15 ° C to 35 ° C.
  • the activity of the antioxidant enzyme contained therein In the oral film prepared at ⁇ , 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, etc. as shown in FIG. 12, the activity of catalase contained therein remained relatively high. In the oral film prepared at the temperature of 45 ° C it can be seen that the activity is relatively well maintained up to 203 ⁇ 4>, up to 303 ⁇ 4>. In addition, as shown in FIG. 13, it can be seen that the catalase activity contained in the oral film produced at 0 ° C. was high.
  • the solvent evaporation takes place under reduced pressure, wherein the pressure may preferably be lxio 'mbar to 999 mbar, it can be most preferably 1x1 five bar to about 1x10- 2 mbar pressure range.
  • the silver and reduced pressure can be maintained for a time that the solvent can be evaporated evenly, the time can vary depending on the amount and type of solvent used.
  • the time for maintaining the silver and decompression conditions is not limited thereto, but may be preferably 10 seconds to 12 hours, and most preferably 1 minute to 1 hour.
  • antioxidant Oral films can be prepared in which the activity of the substance is maintained at high levels.
  • the activity of antioxidants contained in the film is maintained at a high level even in the harsh environment of the stomach and small intestine (Example 2).
  • the oral film prepared by the manufacturing method of the present invention when prepared with the same amount of zein and antioxidant, contains a much larger amount of antioxidant than the conventional nanoparticle formulation, and effectively (Experimental Example 1).
  • the present invention provides a plutamine-based oral film containing an antioxidant prepared by the above method.
  • Oral film of the present invention is characterized in that it is prepared by a method comprising the steps (a) and (b), the steps are as described above.
  • the amount of the antioxidant substance in the light film of the present invention can be selectively set by those skilled in the art according to the type of film, the thickness of the film and the surface area.
  • the orally administrable films provided herein can accommodate a wide range of antioxidants. Preferably 0.01 to 80% (w / w), more preferably 0.1 to 10% (w / w).
  • the oral film of the present invention contains an antioxidant substance as an active drug component, and can easily and quickly administer the drug into the human body through the oral cavity.
  • an antioxidant substance as an active drug component
  • the oral film of the present invention contains an antioxidant substance as an active drug component, and can easily and quickly administer the drug into the human body through the oral cavity.
  • by preparing a film formulation under specific conditions based on framine it is possible for the antioxidants contained in the body to maintain a high level of activity in the body. Maintained at a high level.
  • the oral film of the present invention is immediate, depending on the timing of drug release.
  • It may be formulated in a release form and / or modified (modi f i ed) release form, preferably in a fast dissolving agent for fast disintegration or an intraorally disintegrating film.
  • the oral film of the present invention may further add additives other than framine, glycerol formal, and an antioxidant in an appropriate amount depending on the compounding purpose.
  • additives other than framine, glycerol formal, and an antioxidant for example, layering agents, plasticizers, acidulants, anticoagulants, solubilizers, stabilizers, sweeteners, tinting agents, emulsifiers, etc. Dissolution aids, coloring agents, fragrances and the like.
  • the film may further include a film forming agent, a thickener, an emulsifier, and other starch.
  • the film forming base agent may impart flexibility to the film, disintegrate well, and may be used without particular limitation as long as it can maintain a viscosity for particle formation, preferably hypromellose, Polymers such as hydroxypropylcellose, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide or polyvinylpyridone can be used.
  • a thickener pullulan, starch, lactose, cellulose, carrageenan, arabian gum, guar gum, locust bean gum, xanthan gum, gellan gum, agar, alginic acid and sodium alginate can be used.
  • the layering agent reduces the slippery properties of the film in the oral cavity and plays a role in imparting a skeleton to the film. It also reduces the sticking properties of the films, and can control the sticking and dissolution rate of the film in the oral cavity and the dissolution rate of the drug.
  • the layering agent for example, microcrystalline cellulose, cellulose polymer, magnesium carbonate, calcium carbonate, limestone powder, silicate, clay, talc, titanium dioxide and calcium phosphate can be used.
  • plasticizer for adding the flexibility of the film for example, triethyl citrate, glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol, sorbide, malty, xylitol, glycerin, polyethylene glycol and the like can be used.
  • the acidulant may be citric acid, malic acid, fumaric acid, tartaric acid, ascorbic acid, succinic acid, adipic acid and lactic acid, and the like.
  • solubilizer for example, sucrose fatty acid ester, sorbitan monostearate, sodium lauryl sulfate and the like can be used, and the stabilizer is, for example, hard silicic anhydride, magnesium metasilicate aluminate, magnesium silicate, aluminum silicate, And siliceous sills and the like can be used.
  • Gamma may also include, for example, aspartame, saccharin, dipotassium glycyrrhinate, stevia, and the like.
  • Mating agents include, for example, 1-mentor, sodium chloride, acesulfame potassium, and sucralose.
  • dissolution aid for example, cyclodextrin, arginine, lysine, trisaminomethane and the like can be used.
  • the oral film of the present invention may further include an amount of a colorant suitable to obtain a desired color.
  • Colorants include, for example, dyes suitable for the color and edible of natural foods. Such colorants are commonly known as FD & D dyes,
  • the oral film of the present invention can be used for the purpose of preventing and treating various tissue damages and diseases caused by various oxidative reactions in vivo, that is, free radicals or reactive oxygen species.
  • tissue damages and diseases caused by various oxidative reactions in vivo that is, free radicals or reactive oxygen species.
  • Various damages and diseases caused by the free radicals or reactive oxygen species are well known in the art, but are not limited to these, but specifically, inflammation, infection, arteriosclerosis, high blood pressure, cancer, radiation damage, neurological diseases, nerves Degenerative planetary disease, ischemia / reperfusion injury, aging, wound healing, glutathione deficiency, acquired immunodeficiency syndrome, sickle cell anemia, diabetes and rheumatoid arthritis.
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing an aqueous solution of alcohol containing framine, glycerol formal and antioxidants; And (b) evaporating the solvent under reduced pressure of 0 ° C. to 80 ° C., to provide an oral film preparation method and an oralamine-based oral film comprising an antioxidant prepared by the method. do.
  • the production method of the present invention it is possible to produce an oral film in which the activity of the antioxidant is maintained at a high level.
  • the activity of antioxidants contained in the film is maintained at a high level even in the dark and dark environment of the stomach and small intestine.
  • FIG. 1 shows SOD activity of each experimental group at pH 7.0 (zein: zein film,
  • Figure 3 shows the catalase activity of each experimental group at pH 7.0 conditions (Gl iadin:
  • Gliadin film, CAT free catalase
  • Gliadin-CAT gliadin-based oral film comprising catalase
  • Figure 4 shows the SOD activity of each experimental group at pH 1,3 conditions (environmental mimic conditions in the gastrointestinal tract) (white graph: pepsin treated group, black graph: pepsin untreated group, zein: zein film, SOD: free superoxide dismutase, Zein-SOD: Jane-based oral film containing SOD).
  • Figure 5 shows the catalase activity of each experimental group at pH 1.3 conditions (imitation of the environment in the gastrointestinal tract) (white graph: pepsin treated group, black graph: pepsin untreated group, zein: zein film, CAT: free catalase, Zein-CAT: zein-based oral film containing catalase).
  • FIG. 7 shows SOD activity of each experimental group at pH 7.4 (environmental mimic conditions in the small intestine) (white graph: trypsin-treated group, black graph: untrypsin group, zein: zein film, SOD: free superoxide dismutase, Zein-SOD: Jane-based oral film containing SOD).
  • Figure 8 shows the catalase activity of each experimental group at pH 7.4 conditions (environmental mimic conditions in the small intestine) (white graph: trypsin treated, black graph: trypsin untreated, zein: zein film, CAT: free catalase, Zein-CAT: a zein based oral film comprising catalase).
  • FIG. 9 shows catalase activity of each experimental group at pH 7.4 (environmental intestine environment) (white graph: trypsin treated group, black graph: trypsin untreated group Gl iadin: gliadin film, CAT : free catalase, Gl iadin-CAT: gliadin-based oral film containing catalase).
  • FIG. 10 shows catalase activity included in conventional nanoparticle (nanoparticle) formulations and in the framine-based oral film formulations of the present invention.
  • FIG. 11 shows the catalase activity contained in each oral film prepared by the conventional method for preparing oral film and the method for preparing the oral film based on the present invention.
  • Catalase activity is shown according to the temperature conditions of ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, 65 ° C and 75 ° C.
  • Figure 13 shows the catalase activity according to the 0 ° C or 15 ° C silver conditions in the preparation of the framine-based oral film of the present invention.
  • FIG. 14 shows catalase activity according to various pressure conditions in the preparation of the plutamine-based oral film of the present invention.
  • Figure 15 shows the antioxidant power according to each pH condition in the preparation of oral film based on framine (zein or gliadin) containing a non-enzymatic antioxidant caffeine.
  • Nanoparticles are prepared using a phase separation method. Briefly, the above prepared. 8.0 mL of water is added to the mixture and homogenized at 21,500 rpm for 1 minute.
  • Dispersion is carried out by the method (homogenization). Centrifugation at 47,500 rpm for 5 minutes separates the resulting nanoparticles, which produce a yellow solid powder. Particle size and shape were confirmed by scanning electron microscopy (SEM) using QUANTA FEG 250 (FEI company, Hi 1 lsboro, Oregon) of Masdar Institute of Science and Technology (Abu Dhabi, UAE).
  • zein 100 mg of zein (Sigma-Aldr ich) is dissolved in 1.825 mL of 70% ethane in an aqueous solution. Add 67.5 mg of glycerol formal (Sigma-Aldrich) and mix until the solution is clear. To the solution was added dropwise 3 mg / mL of catalase (EC 1.11.16.1, Sigma-Aldrich) dropwise to prepare a mixed solution (total 200 ii L of catalase). This mixed solution was widely spread in a glass container and dried at room temperature (25 ° C.) for 24 hours to form a zein film.
  • zein 500 mg is dissolved in 10 mL of an aqueous 70% ethane solution. Add 335 mg of glycerol formal (Sigma-Aldrich) and mix until the solution becomes clear. Transfer 2 mL of the mixed solution (including 100 mg zein) to a reduced pressure flask, and add 3 mg / mL of catalase (EC 1.11.16.1, Sigma-Aldrich) to each dropwise mixture to prepare a mixed solution. (Catalase added in total 200 uL). The mixed solution contained in the reduced pressure flask was evaporated using a rotary evaporator at 35 ° C. under reduced pressure (0.002 mbar) until a thin film (fi lm) was formed.
  • gliadin (Sigma-Aldrich) is dissolved in 10 mL of a 70% aqueous ethanol solution. Add 335 mg of glycerol formal and mix until the solution is clear. Transfer 2 mL of the mixed solution (including 100 mg zein) to a flask under reduced pressure, add 3 mg / mL of catalase to the flask, and give a mixed solution (catalase is added in total 200 iL). The mixed solution in the reduced pressure flask was evaporated using a rotary evaporator to evaporate the solvent (70% ethanol) under reduced pressure at 35 ° C until a thin film was formed.
  • the activity of the antioxidant substance contained in the oral film prepared in Example 1 was measured by the following method.
  • Catalase activity was measured by monitoring the absorbance of 3 ⁇ 40 2 at 240 nm after mixing a catalase or a plutamine-based oral film containing catalase with 10 ⁇ 3 ⁇ 40 2 in 7.0 complete solution.
  • S0D activity was measured by the manufacturer's method using a SOD assay kit (SOD determination kit 19,160, Fluka, St Louis, M0). Significance of results was determined via t ⁇ test between zein film and other films containing SOD or catalase with p ⁇ 0.05 (*) As a result, as shown in [Fig. 1] and [Fig.
  • Catalase and SOD activity was measured in the same manner ⁇ to that described in Example ⁇ 2-1> (Signi f icance of results was determined via t-test between free enzymes and other del ivery vehicles with p ⁇ 0.05 (*) .
  • catalase activity was compared.
  • Fluorescein isothiocyanate (FITC) and Sigma-Aldrich are chemically bound to catalase, and then, zein nanoparticles and a film are formed using the same.
  • the amount of fluorescence was determined by taking mg, and the content of catalase was determined for each formulation by comparing the amount of fluorescence with the amount of fluorescence used for the first time.
  • Catalase activity measurement was carried out in the same manner as described in ⁇ Example 2-1> at pH 7.0 after forming zein nanoparticles and films using catalase to which phosphors were not bound, taking 1 mg of each formulation. .
  • An oral film was prepared by the same method as described in Example ⁇ 1-1>, except for the pressure and temperature conditions.
  • the activity of the antioxidant enzymes contained in the various oral films prepared by varying the pressure under the same temperature conditions (35 ° C.) was measured .
  • An oral film was prepared by the same method as described in Example ⁇ 1-1>, except for the pressure and temperature conditions.
  • Example 1- using 5 mg of framine based oral caffeine containing non-enzymatic antioxidants and 100 mg of gliadin or 100 mg of framine as framine;
  • the oral film was manufactured by the method similar to the method of description.
  • the gastrointestinal environment was allowed to stand for 20 minutes in a solution of caffeine or caffeine containing framine based oral film in hydrochloric acid (50.1 mM HC1, pH 1.3) solution.
  • the solution was neutralized again to pH 7.0 and used for monocytic cell experiment.
  • the experimental group was divided into the following: A: negative control group, B: treated only 3 ⁇ 40 2 ,
  • C Caffeine solution and 3 ⁇ 40 2 treatment left at pH 1.3 for 20 minutes
  • D Caffeine solution left for 20 minutes at pH 1.3, neutralized with PH 7.0 and 3 ⁇ 40 2 treatment
  • E Glia containing caffeine
  • a solution in which a gliadin-based oral film containing F caffeine was left at pH 1.3 for 20 minutes and neutralized again to pH 7.0
  • G solution containing zein-based oral film containing caffeine for 20 minutes at pH 1.3 and 3 ⁇ 40 2 treatment
  • H solution of zein-based oral film containing caffeine, standing at pH 1.3 for 20 minutes Solution neutralized back to pH 7.0 and treated with H 2 O 2 .
  • Cytotoxicity was measured using a dye (propidium iodide, PI) of the dye only dead cells, each we ll per 100 microL (50 microgram / mL PI ) to insert after 10 minutes, a microplate reader (microplate reader manufactured by Tecan) Fluorescence (excitation: 535 nm, emission: 617 nm) was measured, with only 0% and 100% toxicity for cultures and only hydrogen peroxide, respectively, and the other samples for their relative toxicity.
  • PI sodium iodide
  • Caffeine has a function of protecting cells from free radicals (Silverberg JI, et.al., J Drugs Dermatol. Nov, 11 (11): 1342-6), as shown in FIG. 15.
  • Oral film was prepared in the same manner as in ⁇ Example 1-2>.
  • Oral film was prepared in the same manner as in ⁇ Example 1-1> using 100 mg of hordein, 67.5 tng of glycerol, and 200 uL of catalase.
  • Oral film was prepared in the same manner as in ⁇ Example 1-1>, using 100 mg of cecalin, 67.5 mg of glycerol formal, and 200 uL of catalase.
  • an oral film was prepared in the same manner as in ⁇ Example 1-2>.
  • Oral film was prepared in the same manner as in ⁇ Example 1-1>, using 100 mg of Jane, glyceryl 67.5 mg, and 200 ⁇ of glutathione peroxidase.
  • An oral film was prepared in the same manner as in ⁇ Example 3>, using 100 mg of Jane, 24 mg of glycerol, and 5 mg of vitamin C.
  • An oral film was prepared in the same manner as in ⁇ Example 3>, using 100 mg of Jane, 24 mg of glycerol, and 5 mg of tocope.
  • the present invention relates to a method for preparing an oral film based on oral fructose for protecting antioxidant activity, and more specifically, to a case of framine, glycerol formal and antioxidants.
  • To prepare an aqueous solution containing alcohol step; And (b) evaporating the solvent under reduced pressure of 0 ° C to 80 ° C temperature relates to an oral film production method.
  • the production method of the present invention it is possible to prepare an oral film in which the activity of the antioxidant substance is maintained at a high level, and in particular, even in the harsh environment of the stomach and small intestine, the activity of the antioxidant substance contained in the film is maintained at a high level. As a result, it is highly industrially applicable.

Abstract

본 발명은 항산화 물질 활성 보호를 위한 프롤라민 기반 경구용 필름 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (A) 프롤라민, 글리세를 포르말 (glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하는 알코을 수용액을 제조하는 단계; 및 (B) 0°C 내지 80°C 온도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경구용 필름 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하면, 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되는 경구용 필름을 제조할 수 있으며, 특히 위장 및 소장의 가혹 환경 속에서도 필름 속에 포함된 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되므로 산업상 이용가능성이 높다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
항산화 물질 활성 보호를 위한 프를라민 기반 경구용 필름 제조방법 【기술분야】
<ι> 본 출원은 2014년 03월 31일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0038163 호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
<2>
<3> 본 발명은 항산화 물질 활성 보호를 위한 프를라민 기반 경구용 필름 제조방 법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 프를라민， 글리세를 포르말 (glycerol formal ) 및 항산화 물질을 포함하는 알코을 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0°C 내지 80°C의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는， 경구용 필름 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 항산화제를 포함하는 프롤라민 기반 경구용 필름에 관한 것이다.
<4>
【배경기술】
<5> 생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화 과정 중에 상당량의 활성산소들이 생 성된다. 이들 활성산소는 생체 내 제거 기작에 '의해 대부분 소멸되지만 순간적으로 활성산소가 다량으로 발생되거나 만성적으로 활성산소가 발생되어 항산화방어계와 의 균형이 깨지면 각종 질환의 원인이 된다. 산소는 대사과정증 일부분이 수퍼옥사 이드 라디칼 (02 · -) ; 과산화수소 (¾02)，하이드록시 라디칼 (Η0 · ) , 산소 단분자 (일 중항 산소， 2)와 같은 활성 유해 산소로 변화되는데， 이들은 항산회^ 효소와 비효 소적 항산화제들로 구성된 산화제와 항산화제 균형을 파괴하고 생체 구성 성분들의 손상을 야기시킨다.
<6>
<7> 노화， 암， 뇌혈관 질환， 심혈관계 질환 등과 같은 질환의 주요 원인 중 하나 로 자유라디칼 (free radical ) 또는 활성산소종 (react ive oxygen species , R0S)을 들 수 있다. 상기 활성산소종은 생물체에 침입된 병균 등에 의한 생물학적 스트레 스나 지구 환경 악화에 따른 각종 환경 스트레스 등의 스트레스로 인하여 생물 유 지에 필수적으로 요구되는 산소의 반웅성이 높아진 산소를 의미할 수 있으며, 상기 반웅성이 높은 산소는 심각한 생리적 장애 등을 유발할 수 있게 된다. 구체적으 로, 자유라디칼 또는 활성산소종은 세포를 파괴하거나 피부 진피층의 결합조직을 절단하거나 교차 결합을 일으키므로 주름형성， 아토피성 피부염 , 여드름 또는 피부 암과 같은^]부 관련 질병뿐만 아니라 암， 심근경색증 (myocardial infarct ion) , 뇌 졸증 (stroke) , 동맥경화증 (atherosclerosi s) 등을 포함하는 심혈관계 질환， 근위축 측삭경화증 (amyotrophic laternal sclerosis)이나 알츠하이머성 치매 (Alzheimer ' s disease, AD) , 파킨스씨 병 (Parkins ion' s disease, PD)과 같은 만성퇴행성 신경질 환 (chronic neurodegenerat ive disease)의 원인이 되는 것으로 보고되어 있다. 또 한, 자유라디칼 또는 활성산소종은 인체 내에서 지질을 과산화시켜 과산화지질이라 고 하는 해로운 물질을 생성할 수 있고， 상기 과산화지질은 혈관에 작용하여 동맥 경화나 혈전과 같은 각종 성인병 및 만성 질환의 원인이 되는 것으로 보고 되어있 다.
<8>
<9> 상기와 같이， 자유라디칼 또는 활성산소종이 여러 병증과 관계가 있는바， 이 러한 활성산소종의 생성을 억제하거나 이미 체 내에 생성된 활성산소종을 빠르게 제거하는 효과가 있는 여러 항산화제 물질들을 인체에 투여하여 질병을 예방 또는 치료하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
<10>
<1 1> 질병의 치료에 있어서， 특히 만성적인 질환의 치료에 있어서 가장 일반적이 고 편리한 투약 (drug administrat ion)방식은 구강 (oral route)을 통한 약물 전달 방법이다. 그러나 상기 항산화 물질들은， 그대로 경구투여되었을 때 위장， 소장 등 의 소화관을 파라 이동하는 도중에 소화기관의 가흑한 환경 (pH변화 및 각종 소화 효소 등)에 의해 그 생물학적 활성이 감소하거나 제거되어， 실제 in vivo 상에서 치료효과가 매우 제한적으로 나타난다. 특히 치료활성을 가지는 단백질의 경우에는 그 자체로 경구투여되었을 때 위장관 (gastrointest inal tract , GI ) 내의 환경으로 인해 쉽게 분해되는 것으로 알려져있다 (Woodley, J .F. , 1994. Enzymat ic barriers for GI pept ide and protein del ivery. Crit . Rev.Ther . Drug Carrier Syst . 11， 61-5. ) .
<12>
<13> 이에 위장 및 소장 등에서의 소화 과정으로부터 항산화 물질의 활성을 높은 수준으로 보호하는, 효과적인 구강 약물 전달 시스템을 개발하여 투약 효과를 증진 시키는 새로운 전략이 필요하다.
<14> 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
<15> 이에 본 발명자들은 소화 기관으로부터 항산화물질의 활성을 보호하는, 효과 적인 구강 약물 전달 시스템을 연구하던 중, 프를라민， 글리세를 포르말 및 항산화 물질을 포함하는 에탄올 수용액을 가지고 특정 온도 및 압력 조건에서 용매를 증발 시키며 경구용 필름 제제를 제조하였을 때 상기 제조된 필름에서 항산화 물질들의 활성이 매우 높은 수준으로 유지됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
<16>
<17> 따라서 본 발명의 목적은 (a) 프를라민， 글리세를 포르말 (glycerol formal ) 및 항산화 물질을 포함하는 알코을 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0°C 내지 80°C 의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는， 경구용 필름 제조방법을 제 공하는 것이다.
<18>
<19> 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된, 항산화제를 포함하는 프를라 민 기반 경구용 필름을 제공하는 것이다.
<20>
【기술적 해결방법】
<21> 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 프를라민， 글리세를 포르말
(glycerol formal ) 및 항산화 물질을 포함하는 알코을 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0°C 내지 80t 은도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 경 구용 필름 제조방법을 제공한다.
<22>
<23> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여ᅳ 본 발명은 상기 방법으로 제조된,
항산화제를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름을 제공한다.
<24>
<25> 이하본 발명을 상세히 설명한다.
<26>
<27> 본 발명은
<28> (a) 프를라민, 글리세를 포르말 (glycerol formal ) 및 항산화 물질을 포함하 는 알코을 수용액을 제조하는 단계; 및
<29> (b) 0°C 내지 80°C 온도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하 는， 경구용 필름 제조방법을 제공한다. <30>
<3i> (a) 단계에서는 프를라민, 글리세를 포르말 (glycerol formal) 및 항산화 물 질을포함하는 알코올 수용액을 제조한다.
<32>
<33> 프를라민 (prolamin)은 곡물 (cereal)과 같은 식물에서 발견되는 어떠한 일군 의 구형 단백질을 나타낸다. 프를라민 단백질은 일반적으로 70 내지 80% 알코을에 는 용해되지만， 물과 순수한 알코올에는 용해되지 않는다. 이들 단백질은 글루탐산 과프를린을 높은 수준으로 함유한다.
<34> 본 발명의 프를라민은 식물에서 유래된 공지의 프를라민 단백질이라면 그 종 류가 제한되지 않으나， 예를 들어 밀 (wheat), 호밀 (rye), 보리 (barley), 귀리 (oat), 쌀 (rice), 수수 (sorghum), 기장 (millet), 율무 (coix) 및 옥수수 (maize)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 식물 유래 프를라민 일 수 있다. 바람직하 게 본원 발명의 프를라민은 제인 (zein), 글리아딘 (gliadin), 호르데인 (hordein)， 세칼린 (secalin) , 카피린 (kaf irin)， 코익신 (coixin), 글루테닌 (glutenin)， 글루비 -글루텔린 (GluB-Glutelin) 및 아베인 (avenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 흑은 두 개 이상의 흔합물일 수 있다.
<35>
<36> 글리세를 포르말 (glycerol formal , C4¾03)은 Methylidinoglycerol；
Sericosol N; 1 , 3-D i oxo 1 ane-4-me t hano 1； l,2-(Methyl idene)glycerol ,* 5一 hydroxy- 1,3-dioxane 및 4-hydr oxyme thyl-l,3-dioxol ane 흔합물; Glycerin formal； Formal Glycerol 등의 다양한 이명을 지니며, 비수용성 (water-insoluble) 화합물의 용해를 위한 가용화제 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
<37> 본 발명의 글리세를포르말은 하기 <화학식 1>및 <화학식 2>의 구조를 지니 는 것으로 47-67% 5-hydroxy-l , 3-dioxane basis 및 33-53% 4-hydr oxyme thy 1-1, 3- di oxo lane basis 의 흔합물이다. 본 발명의 글리세를 포르말은 상업적으로 구입하 여 사용하거나또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조한 것을 사용할 수 있 다. <38>
^화확식 D 2
Figure imgf000006_0001
<39>
<40> 항산화 (antioxidation)란 체내에서 일어나는 여러 산화작용을 방지하는 것을 말하며， 항산화 물질 (또는 항산화제)는 기질의 양과 비교하여 적은 양으로 존재하 면서 기질의 산화를 지연시키거나 억제하는 물질을 의미한다.
<4i> 본원 발명의 항산화 물질은 자유라디칼 또는 활성산소종 (R0S)의 소거 또는 생성 억제 기능 (항산화력)이 있는 물질 및 상기 기능을 촉진 (항산화 상승 작용)하 는 효과가 있는 물질이라면 그 종류가 제한되지 않으나, 구체적으로 항산화 효소 및 비효소적 항산화 물질을 포함한다.
<42>
<43> 상기 항산화 효소는 항산화력 또는 항산화 상승 작용 효과가밌는 단백질을 의미하는 것으로, 생체 내 항산화 시스템에 관여하는 공지의 단백질이라면 그 종류 가 제한되지 않으나， 바람직하게 수퍼옥시드 디스무타아제 (superoxide dismutase), 카탈라아제 (catalase), 글루타티온 퍼옥시다제 (glutathione peroxidase), 글루타티 온 환원효소 (glutathione reductase), 글루타티은 -S-전달효소 헴옥시게나제 (glutathione一 S-transferase hemeoxygenase) 및 이들의 합성 효소 또는 펩티드 유 사체 (mimetic)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
<44>
<45> 상기 비효소적 항산화 물질은 항산화력 또는 항산화 상승 작용 효과가 있는 화합물을 의미하는 것으로， 생체 내 항산화 시스템에 관여하는 공지의 화합물이라 면 그 종류가 제한되지 않으나， 바람직하게 비타민 E， 커큐민 (curcumin), 카로틴 (carotene), 리포산 (lipoic acid), 코엔자임 Q10, 토코페를， 폴리페놀, 레티닐 팔 미테이트, 티옥트산, 카로티노이드， 비타민 C, 비타민 C 유도체， 카페인 (Caffeine) , 카페산 (Caffeic acid) , BHA(butylated hydroxyanisole) , BHTCbutylated hydroxytoluene), TBHQCtertiary but ylhydroqui none ) , 에피칼로카테 킨-3-갈레이트(6^ 31100^6(±^-3 311^6, EGCG), 프로안토시아니딘
(proanthocyanidin), 몰식자산 (Gal lie acid), 셀레늄， 아연, 타우린, 플라보노이드 및 스코폴레틴 (Scopoletin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다. 본원 발명의 상기 (a) 단계에서 사용되는 용매는, 프를라민 및 글리세를 포 르말을 모두 용해시킬 수 있는 물질이라면 그 종류가 제한되지 않으나， 바람직하게 알코을 (alcohol)이 사용 될 수 있다.
본원발명의 상기 '알코올'은 바람직하게 탄소수 1 내지 6의 저가 알코올 일 수 있으며， 가장 바람직하게 에탄을 (ethanol) 일 수 있다. 상기 에탄올 (ethanol, 에틸알코을)은 휘발성과 가연성을 가진 무색의 액체로， 사슬모양의 탄화수소 중 탄 소의 수가 2개인 에테인 (ethane)에서 수소 원자 하나가 하이드록시기로 치환된 알 코올이다.
본원 발명의 상기 알코올은， 100% 알코을과 물 (증류수)을 특정 부피비율 (v/v)로 흔합 및 회석하여 알코을 수용액 상태로 사용할 수 있다. 따라서 본 발명 의 알코올 농도는 전체 용액의 부피에 대한 알코올 부피 비율로서 나타낸다. 상기 '물'은 증류수 (1차 증류수， distilled water) 또는 탈이온수 (3차 증류수， De ionized water)일 수 있다. 알코올 첨가량은 이쎄 제한되지 않으나 40%(v/v) 내 지 95%(v/v)의 범위로 바람직하게 55%내지 75%일 수 있으며， 가장 바람직하게 70% 일 수 있다. 상기 (a) 단계에서 ' 프를라민, 글리세를 포르말 및 항산화물질을 포함하는 알코을 수용액 '은 그 제조방법에 제한을 두지 않지만, 구체적으로
(i) 프를라민을 알코을 수용액에 녹이는 단계;
(ii) 상기 (i) 단계의 알코올 수용액에 글리세를 포르말을 첨가하는 단계;
(iii) 상기 (ii) 단계의 용액에 항산화 물질을 첨가하는 단계;
를 포함하여， 순차적으로 수행될 수 있다. 상기 프를라민 및 항산화물질의 비율은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 1 내지 1,000,000 ： 1의 중량비율일 수 있으며, 더욱 바람직하게 1 내지 1000 ： 1의 중량비율일 수 있으며, 가장 바람직하게 100내지 600: 1의 중량비율일 수 있다. 또한 상기 프를라민 및 글리세를 포르말 비을은 이에 제한되지 않으나， 바람 직하게 1 내지 10,000 ： 1의 중량비율일 수 있으며, 더욱 바람직하게 1 내지 100 ： 1의 중량비율일 수 있으며, 가장 바람직하게 1 내지 10 ： 1의 중량비율일 수 있다.
<61>
<62> (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 제조된 프를라민, 글리세를 포르말 및 항산화 물질이 포함된 알코을 수용액을 0°C 내지 80 °C 온도의 감압 조건에 두어 알콜 수용 액 속에 포함된 물질들의 상대적인 반웅을 계속하는 단계로, 상기 조건으로 인하여 용매가 증발되어 필름이 형성된다.
<63>
<64> 상기 용매 증발 시 은도는 이에 제한되지 않으나， 구체적으로 0°C 내지 80°C 온도 범위 일 수 있고, 바람직하게 0°C 내지 45°C 온도 범위 일수 있으며, 더욱 바 람직하게는 10°C 내지 38 °C 온도 범위 일수 있으며， 가장 바람직하게는 15 °C 내지 35 °C 일 수 있다.
<65>
<66> 본 발명의 일실시예에 따르면， 본원 발명의 필름 제조방식을 이용하여 동일 한 감압조건에서 다양하게 은도 조건을 변화시키며 제조한 여러가지 경구용 필름에 서， 내부에 포함된 항산화 효소의 활성을 _측정하였는데， [도 12] 에서 보이는 바와 ^이, 15°C , 25 °C , 35°C 등에서 제조된 경구용 필름에서는 내부에 포함된 카탈라아 제의 활성이 상대적으로 매우 높게 유지되었으며， 45°C 온도조건에서 제조된 경구 용 필름에서도 상대적으로 20¾>， 최대 30¾>까지 활성이 잘 유지되는 것을 확인할 수 있다. 또한， [도 13]에서 보이는 바와 같이, 0°C 온도조건에서 제조된 경구용 필름 에서 내부에 포함된 카탈라아제꾀 활성이 높게 나타난 것을 확인할 수 있다.
<67>
<68> 상기 용매 증발은 감압 조건에서 이루어지며， 이때 압력은 바람직하게 lxio' mbar 내지 999 mbar일 수 있으며， 가장 바람직하게 1x1오 bar 내지 1x10— 2mbar 압력 범위 일 수 있다.
<69>
<70> 상기 은도 및 감압은 용매가 층분히 증발 될 수 있는 시간만큼 유지 할 수 있으며, 상기 시간은 사용되는 용매의 양과 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 은 도 및 감압 조건을 유지하는 시간은 이에 제한되지 않으나 바람직하게 10초 내지 ' 12시간 일 수 있으며， 가장 바람직하게 1분 내지 1 시간 일 수 있다.
<71>
<72> 상기 (a) 내지 (b) 단계를 포함하는 본 발명의 제조방법에 의하면, 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되는 경구용 필름을 제조할 수 있다. 특히, 위장 및 소장의 가혹 환경 속에서도 필름 속에 포함된 항산화 물질의 활성이 높은 수준 으로유지된다 (실시예 2) .
<73>
<74> 또한， 상기 본원 발명의 제조방법으로 제조된 경구용 필름은, 동일한 양의 제인과 항산화제로 제조하였을 때 기존의 나노파티클 제형보다 훨씬 많은 양의 항 산화제를 함유하며, 효과적으로 항산화 물질의 활성을 보존한다 (실험예 1) .
<75>
<76> 따라서 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 항산화제를 포함하는 프를라민 기 반 경구용 필름을 제공한다.
<77>
<78> 본 발명의 경구용 필름은 상기 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조되 는 것을 특징으로 하며, 상기 단계에 대해서는 전술한 바와 같다.
<79>
<80> 본원 발명의 경¾용 필름 중의 항산화 물질의 양은 필름의 유형, 필름의 두 께 및 표면적에 따라 당업자가 선택적으로 설정할 수 있다. 본원에 제공된 경구 투 여 가능한 필름은 광범위한 양의 항산화 물질을 수용할 수 있다. 바람직하게 0.01 내지 80% (w/w)일 수 있고， 더욱 바람직하게는 0. 1 내지 10% (w/w) 일 수 있다.
<81>
<82> 본 발명의 경구용 필름은 유효 약물 성분으로서 항산화 물질을 포함하며， 구 강을 통하여 간편하고 신속하게 약물을 인체 내로 투여할 수 있다. 또한 프를라민 을 기반으로 하여 특정 조건에서 필름 제제를 제조함으로써 내부에 포함된 항산화 물질이 체 내에서 그 활성을 높은 수준으로 유지하는 것이 가능하며， 특히 소화관 내 가혹한 환경에서도 항산화 효소의 생리활성이 높은 수준으로유지된다.
<83>
<84> 또한 본원 발명의 경구용 필름은 약물 방출의 시기에 따라， 즉시 ( immedi ate)
방출형 및 /또는 변형 (modi f i ed) 방출형으로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 속 붕해를 위한 속용정제 또는구강 내 붕해용 필름으로 제제화될 수 있다.
<85>
<86> 한편 본 발명의 경구용 필름은 프를라민, 글리세를포르말 및 항산화제 외의 첨가물을 그 배합 목적에 따른 적량으로 더욱 첨가할 수 있다. 예컨대 층전제, 가 소제， 산미제， 응집 방지제， 가용화제， 안정화제， 감미료, 교미제， 유화제， 기타 용해 보조제， 착색료， 향료 등을 들 수 있다. 특히 필름의 제조시에는 필름형성기 제， 점증제， 유화제， 기타 전분 등을 추가로 포함할 수 있다.
<87>
<88> 상기 필름형성기제는 필름에 유연성을 부여할 수 있고， 붕해가 잘 이루어질 수 있으며 입자 형성을 위한 점도를 유지 할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않 고 사용할 수 있으며， 바람직하게는 히프로멜로스, 히드록시프로필셀를로오스， 폴 리비닐알콜， 폴리에틸렌옥사이드 또는 폴리비닐피를리돈과 같은 고분자를 사용할 수 있다. 또한 점증제로는 풀루란, 전분， 유당， 셀를로오스, 카라기난， 아라비아 검 , 구아검， 로커스트빈검， 잔탄검 , 겔란검， 아가， 알긴산， 알긴산 나트륨 등을 사 용할 수 있다.
<89>
<90> 층전제는 구강에서 필름이 미끈거리는 특성을 감소시카고， 필름에 골격을 부 여하는 역할을 한다. 또한 필름끼리 점착되는 성질도 감소시키며, 끈적거림과 구강 에서의 필름의 분해속도와 약물의 용출속도를 조절할 수.있다. 층전제로는 예컨대 미세결정 셀를로오스， 셀를로스 중합체， 탄산마그네슴， 탄산칼슘， 석회석 가루， 실 리케이트, 점토, 활석， 이산화티타늄 및 인산칼슘 등을 사용할 수 있다.
<91>
<92> 필름의 유연성을 부가하기 위한 가소제로서는， 예컨대 시트르산트리에틸, 글 리세린지방산 에스테르， 폴리에틸렌글리콜， 소르비를, 말티를， 자일리틀， 글리세 린, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있다.
<93>
<94> 또한 산미제는 예컨대， 구연산， 사과산, 푸말산 , 타르타르산， 아스코르브산， 숙신산， 아디핀산 및 락트산 등을 사용할 수 있고, 웅집 방지제는， 예컨대 탈크， 스테아르산칼슴 등을 사용할 수 있다.
<95>
<96> 가용화제는, 예컨대 자당 지방산 에스테르, 모노스테아르산소르비탄， 라우릴 황산나트륨 등을 사용할 수 있으며， 안정화제는 예컨대 경질무수규산, 메타규산알 루민산마그네슴， 규산마그네슴, 규산알루미늄， 및 규산칼슴 등을사용할 수 있다.
<97>
<98>
<99> 또한 감마료는 예컨대 아스파탐， 사카린 , 글리시리진산이칼륨， 스테비아 등 을 들 수 있으며， 교미제는 예컨대， 1-멘틀， 염화나트륨, 아세술팜칼륨， 수크랄로 스 등을 사용할 수 있고， 유화제는 글리세린 지방산에스테르， 슈크로스 지방산에스 테르， 레시틴, 효소분해 레시틴, 폴리솔르베이트， 솔비탄 지방산 에스테르 및 프로 필렌글리콜 등을사용할 수 있다.
<100>
<101> 용해 보조제는 예컨대 시클로덱스트린， 아르기닌， 리신， 트리스아미노메탄 등을 사용할 수 있다.
<102>
<103> 또한， 본 발명의 경구용 필름은 목적하는 색상을 얻기에 적합한 양의 착색제 를 추가로 포함할 수 있다. 착색제는 예를 들어 천연식품의 색상 및 식용에 적합한 염료를 포함한다. 이러한 착색제는 통상적으로 FD&D 염료로 공지되어 있다,
<104>
<105> 본원 발명의 경구용 필름은 생체 내 다양한 산화 반응， 즉 자유라디칼 또는 활성산소종에 의해서 야기되는 다양한 조직 손상 및 질병의 예방 및 치료용 목적으 로 사용될 수 있다. 상기 자유라디칼 또는 활성산소종에 의해서 야기되는 다양한 손상 및 질병에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며， 이쎄 제한되지 않으나 구체 적으로 염증， 감염, 동맥경화， 고혈압， 암， 방사선 손상， 신경학적 질환, 신경 퇴 행성 질환， 허혈 /재관류 손상, 노화， 상처 치료， 글루타치은 결핍증, 후천성 면역 결핍 증후군， 겸상 세포 빈혈, 당뇨병 및 류마티스 관절염 등 일 수 있다.
<106>
[유리한 효과】
<107> 본 발명은 (a) 프를라민， 글리세를 포르말 (glycerol formal ) 및 항산화 물질 을 포함하는 알코을 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0°C 내지 80°C 은도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함하는， 경구용 필름 제조방법 및 상기 방법 으로 제조된 항산화제를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름을 제공한다. 본 발명 의 제조방법에 의하면， 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되는 경구용 필름 을 제조할 수 있다. 특히, 위장 및 소장의 가흑 환경 속에서도 필름 속에 포함된 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로유지된다.
<108>
【도면의 간단한 설명】
<109> 도 1은 pH 7.0 조건에서 각 실험군의 SOD 활성을 나타낸다 (zein: 제인 필름,
SOD ： free superoxide dismutase, Zein-SOD ： SOD를 포함하는 제인 기반 경구용 필름) . <iio> 도 2는 pH 7.0 조건에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다 (zein: 제 인 필름， CAT ： free catalase , Zein-CAT ： 카탈라 '아제를 포함하는 제인 기반 경구 용 필름) .
<ιιι> 도 3은 pH 7.0 조건에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다 (Gl iadin:
글리아딘 필름， CAT ： free catalase, Gl iadin-CAT ： 카탈라아제를 포함하는 글리 아딘 기반 경구용 필름) .
<ιΐ2> 도 4는 pH 1 ,3 조건 (위장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 SOD 활성을 나타낸다 (흰색 그래프: 펩신 처리군， 검정색 그래프: 펩신 비처리군, zein: 제인 필름, SOD ： free superoxide dismutase, Zein-SOD ： SOD를 포함하는 제인 기반 경 구용 필름) .
<ιΐ3> 도 5는 pH 1.3 조건 (위장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다 (흰색 그래프: 펩신 처리군， 검정색 그래프: 펩신 비처리군， zein: 제인 필름， CAT ： free catalase, Zein-CAT ： 카탈라아제를 포함하는 제인 기반경 구용 필름) .
<ιΐ4> 도 6은 pH 1.3 조건 (위장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다 (흰색 그래프： 펩신 처리군， 검정색 그래프： 펩신 비처리군， Gl iadin: 글리아딘 필름， CAT ： free catalase, Gl iadin-CAT ： 카탈라아제를 포함 하는 글리아딘 기반 경구용 필름) .
<ιΐ5> 도 7은 pH 7.4 조건 (소장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 SOD 활성을 나타낸다 (흰색 그래프: 트립신 처리군, 검정색 그래프： 트립신 비처리군， zein: 제 인 필름, SOD ： free superoxide dismutase, Zein-SOD ： SOD를 포함하는 제인 기반 경구용 필름) .
<ιΐ6> 도 8은 pH 7.4 조건 (소장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다 (흰색 그래프: 트립신 처리군， 검정색 그래프: 트립신 비처리군, zein: 제인 필름, CAT ： free catalase, Zein-CAT ： 카탈라아제를 포함하는 제인 기반 경구용 필름) . ·
<ι ΐ7> 도 9는 pH 7.4 조건 (소장 내 환경 모방 조건)에서 각 실험군의 카탈라아제 활성을 나타낸다 (흰색 그래프: 트립신 처리군, 검정색 그래프: 트립신 비처리군 Gl iadin: 글리아딘 필름, CAT ： free catalase, Gl iadin-CAT ： 카탈라아제를 포함 하는 글리아딘 기반 경구용 필름) .
<118> 도 10은 종래의 나노입자 (나노파티클) 제형과 본원 발명의 프를라민 기반 경 구용 필름 제형 속에 포함된 카탈라아제 활성을 나타낸다. <119> 도 11은 종래의 경구용 필름 제조방법과 본원 발명의 프를라민 기반 경구용 필름 제조방법으로 제조된 각각의 경구용 필름 속에 포함된 카탈라아제 활성을 나 타낸다.
<120> 도 12는 본원 발명의 프를라민 기반 경구용 필름 제조 시의 2°C , 15°C , 25
°C , 35 °C , 45 °C , 55°C , 65 °C 및 75°C 온도 조건에 따른 카탈라아제 활성을 나타낸 다.
<i2i> 도 13은 본원 발명의 프를라민 기반 경구용 필름 제조시 0°C 또는 15°C 은도 조건에 따른 카탈라아제 활성을 나타낸다.
<122> 도 14는 본원 발명의 프를라민 기반 경구용 필름 제조시의 다양한 압력 조건 에 따른 카탈라아제 활성을 나타낸다.
<123> 도 15는 비효소적 항산화 물질인 카페인을 포함하는 프를라민 (제인 또는 글 리아딘)기반 경구용 필름 제조시， 각 pH조건에 따른 항산화력을 나타낸다.
<124>
【발명의 실시를 위한 형태】
<125> 이하본 발명을 상세히 설명한다 .
<126> '
<127> 단， 하가 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<128>
<129> <비교예 1>
<130> 항산화 효소를 포함하는 나노입자 (나노파티클) 제조 '
<131> .
<132> <비교예 1-1>
<133> 제인 (zein, Sigma-Aldrich) lOOmg을 1.825 mL의 70% 에탄을 수용액에 녹인 다. 소르비를 (Sorbi tol , Si ma-Aldrich) 52.5 mg 및 글리세를 포르말 (glycerol formal , Sigma-Aldrich) 67.5mg 을 넣고 용액이 투명해질때까지 섞는다. 항산화 물 질을 제인으로 캡슐화하기 위해서， 상기 용액에 카탈라아제 (EC 1.11.16.1， Sigma- Aldrich) 3 mg/mL을 한방울씩 떨어뜨리며 저어주어 흔합용액을 제조한다 (카탈라아 제 총 200 y L 첨가) . 나노파티클은 상분리 방법 (phase separat ion method)을 이용 하여 제조한다. 간략히, 상기 제조된 흔합용액에 8.0 mL의 물을 첨가하고， 1분동안 21 ,500 rpm에서 균질화 (homogenizat ion) 방법으로 분산시킨다. 47，500 rpm으로 5분 동안 원심분리 (centri fugat ion)하여 결과적으로 생긴 나노 파티클을 분리하며， 이 때 노란색의 고체 파우더가 생성된다. 파티클 사이즈 및 모양은 Masdar Institute of Science and Technology (Abu Dhabi , 飄)의 QUANTA FEG 250 (FEI company, Hi 1 lsboro, Oreg이 i)을 사용하여 scanning electron microscopy(SEM) 로 확인하였 다.
<134>
<135> <비교예 1-2>
<136> 제인 lOOmg을 1.825 mL의 70% 에탄올 수용액에 녹인다. 소르비를 (Sorbitol)
52.5 mg 및 글리세를 포르말 67.5mg 을 넣고 용액이 투명해질때까지 섞는다. 항산 , 화 물질을 제인으로 캡슐화하기 위해서, 상기 용액에 수퍼옥시드 디스무타아제 ((EC
1.15.1.1, Sigma-Aldrich) 100 U/mL (수퍼옥시드 디스무타아제 1 U은 수퍼옥시드 1 마이크로 몰 (micro mole)을 1분에 처리할 수 있는 활성을 의미함)을 한방을씩 떨 어뜨리며 저어주어 흔합용액을 제조한다 (SOD 총 200iiL 첨가). 나노파티클은 상분 리 방법 (phase separation method)을 이용하여 제조한다. 간략히， 상기 제조된 흔 . 합용액에 8.0 mL의 물을 첨가하고, 1분 동안 21,500 rpm에서 균질화
(homogenization) 방법으로 분산시킨다. 47,500 rpm으로 5분동안 원심분라 (centrifugation)하여 결과적으로 생긴 나노 파티클을 분리하며， 이때 노란색의 고 체 파우더가 생성된다. 파티클 사이즈 및 모양은 Masdar Institute of Science and Technology (Abu Dhabi , UAE)의 QUANTA FEG 250 (FEI company, Hi 1 lsboro, Oregon) 을사용하여 scanning electron microscopy(SEM) 로 확인하였다.
<137>
<138> <비교예 2>
<139> 항산화효소를포함하는 경구용필름 제조
<140>
<i4i> <비교예 2-1>
<142> 제인 450mg을 1.825 mL의 50% 에탄올 수용액에 녹인다. 소르비를 (Sorbitol )
52.5 mg 및 글리세를 포르말 67.5 mg 을 넣고 용액이 투명해질 때까지 섞는다. 여 기에 카탈라아제 3 mg/mL을 한 방을씩 떨어뜨리며 섞어 주어 흔합용액을 제조한다( 카탈라아제 총 200 iL 첨가). 상은 (25°C)에서 24 시간동안 증발시켜 필름을 제조한 다.
<143>
<144> <비교예 2-2>
<145> 제인 450mg을 1.825 mL의 50% 에탄올 수용액에 녹인다. 소르비를 (Sorbitol ) 52.5 mg 및 글리세를 포르말 67.5mg 을 넣고 용액이 투명해질 때까지 섞는다. 여기 에 수퍼옥시드 디스무타아제 100 U/mL을 한방을씩 떨어뜨리며 섞어 주어 흔합용액 을 제조한다 (SOD 총 200 u L 첨가) . 상온 (25°C )에서 24 시간동안 증발시켜 필름을 제조한다.
<146>
<147> <비교예 2-3>
<148> 제인 (zein, Sigma-Aldr ich) lOOmg을 1.825 mL의 70% 에탄을 수용액에 녹인 다. 글리세를 포르말 (glycerol formal , Sigma-Aldrich) 67.5mg 을 넣고 용액이 투 명해질때까지 섞는다. 상기 용액에 카탈라아제 (EC 1.11.16.1, Sigma-Aldrich) 3 mg/mL을 한방울씩 떨어뜨리며 저어주어 흔합용액을 제조한다 (카탈라아제 총 200 ii L 첨가) . 이 흔합용액을 유리용기에 넓게 펼치고 상온 (25°C. )에서 24시간 건조시켜 제 인 필름을 형성하였다.
<149>
<150> <실시예 1>
<151> 본 발명에 따른. 항산화 효소를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름 제조
<152>
<153> <실시예 1-1>카탈라아제 (catalase)를포함하는， 제인 (zein) 기반경구용필 름 제조
<154> 제인 (zein, Sigma-Aldrich) 500 mg을 70% 에탄을 수용액 10 mL에 용해시킨 다. 글리세를 포르말 (glycerol formal , Sigma-Aldrich) 335mg을 넣고 용액이 투명 해질 때까지 섞는다. 상기 흔합용액 2 mL (100 mg 제인 포함)을 감압플라스크에 옮 겨 넣고, 여기에 카탈라아제 (EC 1.11.16.1, Sigma-Aldrich) 3 mg/mL을 한 방을씩 떨어뜨리며 섞어 주어 흔합용액을 제조한다 (카탈라아제는 총 200 u L 첨가) . 감압플 라스크에 담긴 흔합용액은 rotary evaporator 를 사용하여 얇은 필름 (f i lm)이 형성 될 때까지 35°C 은도의 감압조건 (0.002 mbar)에서 용매 (에탄올)를 증발시켰다.
<155>
<156> <실시예 1-2>수퍼옥시드 디스무타아제 (superoxide dismutase, SOD)를 포함 하는, 제인 (zein) 기반 경구용 필름 제조
<157> " 제인 500 mg을 70¾> 에탄을 수용액 10 mL에 용해시킨다. 글리세를 포르말
(glycerol formal ) 335mg을 넣고 용액이 투명해질 때까지 섞는다. 상기 흔합용액 2 mL (100 mg 제인 포함)을 감압플라스크에 옮겨 넣고, 여기에 수퍼옥시드 디스무타 아제 ( (EC 1.15.1.1 , Sigma-Aldrich) 100 U/mL (수퍼옥시드 디스무타아제 1 U은 수퍼 옥시드 1마이크로 몰 (micro mole)을 1분에 처리할 수 있는 활성을 의미함) 100 U/mL을 한 방을씩 떨어뜨리며 섞어 주어 흔합용액을 제조한다 (SOD는 총 200 iL 첨 가). 감압플라스크에 담긴 흔합용액은 rotary evaporator 를 사용하여 얇은 필름 (film)이 형성될 때까지 35 °C 온도의 감압조건에서 용매 (70% 에탄을)를 증발시켰 다.
<158>
<159> <실시예 1-3>카탈라아제를 포함하는， 글리아딘 (gliadin) 기반 경구용 필름 제조
<160> 글리아딘 (gliadin, Sigma-Aldrich) 500 mg을 70% 에탄올 수용액 10 mL에 용 해시킨다. 글리세를 포르말 (glycerol formal) 335mg을 넣고 용액이 투명해질 때까 지 섞는다. 상기 흔합용액 2 mL (100 mg 제인 포함)을 감압플라스크에 옮겨 넣고， 여기에 카탈라아제 3 mg/mL을 한 방을씩 떨어뜨리며 어 주어 흔합용액을 제조한 다 (카탈라아제는 총 200 iL 첨가). 감압플라스크에 담긴 흔합용액은 rotary evaporator 를 사용하여 얇은 필름 (film)이 형성될 때까지 35°C 은도의 감압조건에 서 용매 (70%에탄올)를 증발시켰다.
<161>
<162> <실시예 2>
<163> 본 발명에 따른. 프롤라민 기반 경구용 필름의 항산화효소 활성 보호 효과
<164> 상기 <실시예 1>에서 제조된 경구용 필름에 포함된 항산화 물질의 활성은 다 음과 같은 방법으로측정되었다.
<165>
<166> <실시예 2-1>프를라민 기반의 경구용 필름시스템
<167> 카탈라아제를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름에서， 카탈라아제의 활성 은 과산화수소 (¾02) 분해을 (decomposition rate)을 측정함으로써 확인하였다. pH
7.0 완층용액에서 카탈라아제 또는 카탈라아제를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름을 10 μΜ ¾02와 흔합한후, 240nm에서 ¾02의 흡광도를모니터링하여 카탈라 아제 활성을 측정하였다. S0D를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름에서， S0D 활 성은 SOD assay kit (SOD determination kit 19,160, Fluka, St Louis, M0)를 이용 하여 제조사의 방법으로 측정하였다. Significance of results was determined via t一 test between zein film and other films containing SOD or catalase with p<0.05 (*) <169> 그 결과 [도 1] 및 [도 2]에서 보는 바와 같이, pH7.0에서 SOD 또는 카탈라 아제의 단독 활성과 제인 기반 필름 속에 포함된 SOD 또는 카탈라아제의 활성이 거 의 유사했다. 이는 SOD 또는 카탈라아제가 제인과 함께 필름형 약물 전달 시스템을 형성한후에도， 각 물질의 활성을 동일한 수준으로 유지함을 나타낸다，
<170> 마찬가지로 [도 3]에서 보는 바와 같이， 글리아딘을 이용하여 필름 제조 후 에도 내부에 포함된 카탈라아제가 항산화 기능을 유지함을 확인하였다.
<171>
<172> <실시예 2-2>위장내 환경에서의 항산화 효소 활성 평가
<173> 위장내 환경 (GI condit ion)에서 제인의 항산화 단백질 .보호 능력을 평가하였 다. 카탈라아제 또는 카탈라아제를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름을 염산 (50.1 mM HC1 , pH 1 ,3)용액에 넣어 20 분간 방치하여 위장 내 환경을 모방하였다. 이때 실험군을 나누어 349. ImM 펩신 (pepsin) 처리군 및 펩신 비처리군으로 구분하 여 실험하였다 (Metheny, N.A. , Stewart , B.J . , et al . , 1997. pH and concentrat ions of pepsin and trypsin in feeding tube aspirates as predictors of tube placement . J . Par enter . Enteral Nutr . 21 , 279-85. ) . 카탈라아제 및 SOD 활성은 상기 실시예 <2-1>에 기재된 것과 동일한 방^으로 ' 측정하였다 (Signi f icance of results was determined via t-test between free enzymes and other del ivery vehicles with p<0.05 (*) ) .
<174>
<i75> 그 결과 [도 4] 및 [도 5]에서 보는 바와 같이， SOD 또는 카탈라아제 단독으 로는 위'장 내 산성 환경 (pH 1.3)에서 활성이 거의 소실되었다. 그러나 제인 기반 필름 속에 포함된 SOD 또는 카탈라아제는 위장 내 환경 (pH 1.3)에서도 그 활성이 높은 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 또한 위장에서 분비되는 효소인 템신을 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 SOD 또는 카탈라아제의 활성에 유의적인 차이는 없었다. 이로서 본원 발명의 제조방법으로 제조된 제인 기반 필름은 항산화 물질의 활성을 보호하는 효과가 뛰어남을 확인하였다.
<176> 또한 [도 6]에서 보는 바와 같이, 글리아딘 필름 내에 존재하는 카탈라제가 위장조건 (pH 1.3)에서 항산화 기능을 보호받고 있음을 확인하였다.
<177>
<178> <실시예 2-3>소장 내 환경에서의 항산화 효소 활성 평가
<179> 소장 내 환경을 모방하기 위하여 실험군을 나누어 143.0 mM트립신 (trypsin) 처라군 및 트립신 비처리군으로 구분하여 pH 7.4의 환경에서 30분간 방치하였다. 카탈라아제 및 SOD 활성은 상기 실시예 <2-1>에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정 하였다 (Signi f icance of results was determined via tᅳ test between free enzymes and other del ivery vehicles with p<0.05 (*) ) .
<180>
<i8i> 그 결과 [도 7] 및 [도 8]에서 보는 바와 같이， SOD또는 카탈라아제 단독으 로는 pH7.4 조건에서는 그 활성이 유지되었으나， 소장 환경과 같이 트립신을 함께 처리한 군에서는 그 활성이 매우 낮은 수준으로 감소하는 경향을 나타냈다. 이에 반해 제인 기반 필름 속에 포함된 SOD 또는 카탈라아제는 트립신 처리에 관계없이 높은 수준으로 그 활성을 유지함을 확인하였다.
<182> 또한 [도 9]에서 보는 바와 같이， 글리아딘 필름 내에 존재하는 카탈라제가 소장조건 (PH7.4)에서 항산화 기능을 보호받고 있음을 확인하였다.
<183> ' ―
<184> <실험예 1>
<185> 체형범 활성 평가
<186> 상기 <비교예 1-1> 및 <실시예 1-1〉에서 제조된 경구용 필름에서, 카탈라아 제 활성을 비교하였다. 먼저 각 제형별로 카탈라아제의 함유량을 결정하기 위해 형 광물질 (Fluorescein isothiocyanate (FITC) , Sigma-Aldrich)을 카탈라아제에 화학 적으로 결합시킨 후, 이를 이용하여 제인 나노파티클 및 필름을 형성하고， 각 제형 별로 1 mg씩을 취하여 형광의 양을 재고, 이를 처음 사용한 형광의 양과 비교하여 제형별로 카탈라아제의 함유량을 결정하였다. 카탈라아제 활성 측정은 형광물질이 결합되지 않은 카탈라아제를 사용， 제인 나노파티클 및 필름을 형성하고， 각 제형 별로 1 mg씩을 취한 후， pH 7.0에서 <실시예 2-1>에 기재된 방법과 동일하게 수행 되었다.
<187>
<188> 【표 1】
<189> 제형별 카탈라아제 함유율 (Loading ef f iciency of catalase)
Figure imgf000018_0001
<190> 상기 [표 1] 및 [도 10]에서 보는 바와 같이， 경구용 필름제형이 나노입자에 비하여 내부에 포함된 카탈라아제가 훨씬 높은 수준의 활성을 유지하고 있음을 확 인하였다. 이는 제조 과정에서 필름이 훨씬 많은 양의 카탈라제를 보유하고 있기 때문으로 해석할 수 있다.
<191> <192> <실험예 2>
<193> 제조방법에 따른 활성 평가
<194>
<195> <실험예 2-1>종래의 경구용 필름 제조방법과 본원 발명의 경구용 필름 제조 방법 비교
<196> 상기 <비교예 2-3〉 및 <실시예 1-1〉에서 제조된 경구용 필름에서 각 1 mg의 필름을 취하여， 카탈라아제 활성을 비교하였다. 카탈라아제 활성 측정은 pH 7.0에 서 <실시예 2-1>에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.
<197>
<198> 그 결과 [도 11]에서 보는 바와 같이 , 종래의 방법으로 제조된 필름에서는 카탈라아쩨의 활성이 거의 소멸되었으나， 본원 발명의 제조 방법으로 생산된 필름 에서는 카탈라아제가 매우 높은 수준으로 활성을 유지하고 있음을 확인하였다.
<199>
<200> <실험예 2-2>다양한온도 조건에 따른 경구용 필름 비교
<20i> 본원 발명의 필름 제조방식으로， 동일한 감압조건 (0.002 mbar )에서 은도를 변화시키며 제조한 여러가지 .경구용 필름에서， 내부에 포함된 항산화 효소들의 활 성을 측정하였다.
<202> 압력조건 및 온도조건을 제외하고는 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방 법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<203> '
<204> 그 결과 [도 12] 및 [도 13]에서 보는 바와 같이， 0-45 °C , 특히 15-35 °C 조건에서 제조된 경구용 필름에서, 카탈라아제의 활성이 상대적으로 높은 활성을 유지하고 있음을 확인하였다.
<205>
<206> <실험예 2-3>다양한 압력 조건에 따른 경구용 필름 비교
<207> 본원 발명의 필름 제조방식으로, 동일한 온도조건 (35°C )에서 압력을 변화시 키며 제조한 여러가지 경구용 필름에서 , 내부에 포함된 항산화 효소들의 활성을 측 정하였다,
<208> 압력조건 및 온도조건을 제외하고는 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방 법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<209>
<210> 그 결과 [도 14] 에서 보는 바와 같이， 압력이 낮아질수록 필름 속에 포함된 카탈라아제의 활성이 높은 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 특히， 압력 0.002 mbar 에서 상대적으로높은 활성을 유지하였다.
<실시예 3>
본발명에 따른， 비효소적 항산화 물질을포함하는 프를라민 기반경구용 필 카페인 (caffeine) 5 mg과， 프를라민으로서 글리아딘 100 mg 또는 제인 100 mg을 이용하여, 상기 실시예 1-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다. 위장내 환경에서 프를라민의 항산화 단백질 보호 능력을 평가하기위하 여 카페인 또는 카페인을 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름을 염산 (50.1 mM HC1 , pH 1.3)용액에 넣어 20 분간 방치하여 위장 내 환경을 모방하였으며, 이 용액 을 다시 pH 7.0으로 중화하여서 단율 세포실험에 사용하였다.
<215> 경구용 필름내의 카페인의 항산화성 효과를 측정하기 위해 12 wel l plate에 세포 (RAW264.7, 4xl05 cel ls/wel l )를 배양 후 각 wel l에 상기에서 제조된 경구용 필 름 1 mg씩을 세포와 2시간 배양한 후, 위의 배양액을 제거하고， 세포를 과산화수소 (H202) (100 microM)로 4시간동안 처리하여, 세포가 얼마나 과산화수소에 의하여 죽 었는지 또한 카페인이 얼마나 세포를 과산화수소로부터 보호할 수 있을 지를 측정 하였다 '·
<216> 구체적인 실험군은 다음과 같이 나누었다 ； A: 음성대조군， B: ¾02만 처리，
C: pH 1.3 에서 20분동안 방치한 카페인 용액 및 ¾02 처리， D: pH 1.3 에서 20분동 안 방치한 카페인 용액을 다시 PH 7.0으로 중화한 용액 및 ¾02 처리， E: 카페인을 포함하는 글리아딘 기반 경구용 필름을 pH 1.3 에서 20분간 방치한 용액 및 ¾02 처 리， F: 카페인을 포함하는 글리아딘 기반 경구용 필름을 pH 1.3 메서 20분간 방치 한 용액 을 다시 pH 7.0으로 중화한 용액 및 ¾02 처리， G ： 카페인을 포함하는 제 인 기반 경구용 필름을 pH 1.3 에서 20분간 방치한 용액 및 ¾02 처리， H: 카페인을 포함하는 제인 기반 경구용 필름을 pH 1.3 에서 20분간 방치한 용액을 다시 pH 7.0 으로 중화한 용액 및 H202 처리.
<217> 세포 독성은 죽은 세포만 염색을 시키는 염료 (propidium iodide, PI )를 사 용하여 측정하였으며, 각 wel l당 100 microL (50 microgram/mL PI )를 넣고 10분 후 ， 마이크로 플레이트 리더 (microplate reader manufactured by Tecan)을 사용하여 형광 (excitation: 535 nm, emission: 617nm)을 측정하였다, 배양액만 있는 경우 와 과산화 수소만 있는 경우를 각각 0 %와 100 %의 독성으로 표시하고， 다른 샘플 들은 이의 상대 독성으로 표기 하였다.
<218>
<219> 카페인은 활성산소로부터 세포를 보호해주는 기능이 있으며 (Silverberg JI, et.al., J Drugs Dermatol .Nov; 11(11)： 1342-6) , [도 15]에서 보는 바와 같이， 상기 실험을 통하여 제인과 글리아딘 내에서 Caffeine의 활성이 잘 유지되고 있음을 확 인하였다. 상기 데이터는 본원 발명의 프를아민 (특히, 제인 또는 글리아딘)을 이용 한 경구용 필름 제조방법이 항산화 효소뿐 아니라 비효소적 항산화 물질에서도 잘 적용될 수 있음을 보여준다.
<220>
<221> <제조예 >
<222> 하기에 본 발명에 의한 항산화제를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름의 제조예를 예시한다.
<223>
<224>
<225> 제조예 1 ： SOD를 포함하는， 글리아딘 기반 경구용 필름
<226> '글리아딘 100 mgᅳ 글리세를 포르말 67.5mg, SOD 200 L을 이용하여， 상기
,<실시예 1-2〉와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<227>
<228> 제조예 2 ： 카탈라아제를 포함하는， 호르데인 (hordein) 기반 경구용 필름
<229> 호르데인 100 mg, 글리세를 포르말 67.5tng, 카탈라아제 200uL를 이용하 여， 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<230>
<231> 제조예 3 ： 카탈라아제를 포함하는， 글루테닌 (glutenin) 기반 경구용 필름
<232> 글루테닌 100 mg, 글리세를 포르말 67.5mg, 카탈라아제 200 L를 이용하여， 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<233>
<234> 제조예 4 ： 카탈라아제를 포함하는， 세칼린 (secalin) 기반 경구용 필름
<235> 세칼린 100 mg, 글리세를포르말 67.5mg, 카탈라아제 200 uL를 이용하여, 상 기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<236> <237> 제조예 5 ： SOD를 포함하는 ， 코익신 (coixin) 기반 경구용 필름
<238> 코익신 100 mg , 글리세를 포르말 67.5mg, SOD 200 u L을 이용하여, 상기 <실 시예 1-2>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<239>
<240> 제조예 6: 글루타티온 퍼옥시다제 (glutathione peroxidase)를 포함하는， 제 인 기반 경구용 필름
<24i> 제인 100 mg, 글리세를 포르말 67.5mg, 글루타티온 퍼옥시다제 200 μ ί을 이 용하여, 상기 <실시예 1-1>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<242> "
<243> 제조예 7 ： 글루타티온환원효소 (glutathione reductase)를 포함하는, 제인 기반 경구용 필름
<244> 제인 100 mg, 글리세를 포르말 67.5mg, 글루타티온환원효소 200 ii L을 이용 하여, 상기 <실시예 1ᅳ1>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<245>
<246> 제조예 8 ： 글루타티온 -S-전달효소 햄옥시게나제 (glutathione-S-transf erase hemeoxygenase)를 포함하는 제인 기반 경구용 필름
<247> 제인 100 mg , 글리세를 포르말 67.5mg, 글루타티온 -S-전달효소 헴옥시게나제
200 ii L을 이용하여， 상기 <실시예 1-1>와 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였 다.
<248>
<249> 제조예 9 ： 비타민 C를 포함하는 제인 기반 경구용 필름
<250> 제인 100 mg, 글리세를 포르말 24 mg, 비타민 C 5 mg을 이용하여 , 상기 <실 시예 3>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<251>
<252> 제조예 10 ： 토코페를을포함하는 제인 기반 경구용 필름
<253> 제인 100 mg, 글리세를 포르말 24 mg, 토코페를 5 mg을 이용하여， 상기 <실 시예 3>과 동일한 방법으로 경구용 필름을 제조하였다.
<254>
[산업상 이용가능성 ]
<255> 이상 살펴본 바와 같이 , 본 발명은 항산화 물질 활성 보호를 위한 프를라민 기반 경구용 필름 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ) 프를라민, 글리세 를 포르말 (glycerol formal ) 및 항산화 물질을 포함하는 알코을 수용액을 제조하는 단계; 및 (b) 0°C 내지 80°C 온도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는 단계를 포함 하는， 경구용 필름 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하면， 항산화 물질의 활성이 높은 수준으로 유지되는 경구용 필름을 제조할 수 있으며， 특히 위 장 및 소장의 가혹 환경 속에서도 필름 속에 포함된 항산화 물질의 활성이 높은 수 준으로 유지되므로 산업상 이용 가능성이 높다.

Claims

【청구의 범위】
[청구항 1】
(a) 프를라민, 글리세를 포르말 (glycerol formal) 및 항산화 물질을 포함하 는 알코올 수용액을 제조하는 단계; 및
(b) Ot 내지 80°C 은도의 감압 조건에서 용매를 증발시키는ᅳ단계를 포함하 는, 경구용 필름 제조방법.
【청구항 2】
저 U항에 있어서， 상기 프를라민은 밀 (wheat)ᅳ 호밀 (rye), 보리 (barley), 귀 리 (oat), 쌀 (rice), 수수 (sorghum) , 기장 (millet) 율무 (coix) 및 옥수수 (maize)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 식물 유래 프를라민인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조 방법 .
【청구항 3】
제 2항에 있어서， 상기 프를라민은 제인 (zein), 글리아딘 (gUadin), 호르데인 (hordein), 세칼린 (secal in)， 카피린 (kaf irin)， 코익신 (coixin), 글루테닌 (glutenin), 글루비-글루텔린 (GluB-Glutelin) 및 아베인 (avenin)으로 이루어진 군 으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조 방법.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 항산화 물질은 항산화 효소, 비효소적 항산화 물질 및 이들의 흔합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조 방법 . '
【청구항 5】
제 4항에 있어서， 항산화 효소는 수퍼옥시드 디스무타아제 (superoxide dismutase), 카탈라아제 (ca lase) , 글루타티온 퍼옥시다제 (glutathione peroxidase), 글루타티온환원효소 (glutathione reductase), 글루타티은 -S-전달효소 햄옥시게나제 (glutathione-S-transferase hemeoxygenase) 및 이들의 합성 효소 또 는 펩티드 유사체 (mimetic)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징 으로 하는 경구용 필름 제조 방법 .
【청구항 6】
제 4항에 있어서， 상기 비효소적 항산화 물질은 비타민 E, 커큐민 (curcumin) , 카로틴 (carotene) , 리포산 ( l ipoic acid) , 코엔자임 Q10, 토코페를， 폴리페놀, 레티 닐 팔미테이트, 티옥트산, 카로티노이드， 비타민 (：， 비타민 C 유도체, 카페인 (caffeine) , 카페산 (Caffeic■ acid) , BHACbutylated hydroxyanisole) , BHKbutylated hydroxytoluene) , TBHQCtert iary but ylhydroqui none ) , 에피칼로카테 킨 -3-갈레이트 (epigal locatechin-3-gal late, EGCG) , 프로안토시아니딘
(proanthocyanidin) , 몰식자산 (Gal l ie acid) , 셀레늄， 아연, 타우린， 플라보노이드 및 스코폴레틴 (Scopolet in)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조방법.
【청구항 7】
제 1항에 있어서， 상기 온도는 0°C 내지 45°C 인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조방법.
【청구항 8】 '
제 1항에 있어서, 상기 온도는 10°C 내지 38°C 인 것을 특징으로 하는 경구용 필름 제조방법 .
【청구항 9】
제 1항에 있어서， 상기 압력은 1x10— 5mbar 내지 999mbar인 것을 특징으로 하 는 경구용 필름 제조방법 .
【청구항 10】
제 1항의 방법으로 제조된， 항산화제를 포함하는 프를라민 기반 경구용 필름.
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