CN101972229B - 一种过氧化氢酶固体脂质纳米粒制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种过氧化氢酶固体脂质纳米粒制剂的制备方法，属于医药技术领域。本发明以过氧化氢酶作为原料药，采用两步乳化法进行制备，所制备的固体脂质纳米粒制剂形态呈多重乳状液(W/O/W)。将过氧化氢酶溶于水中作为内水相加入至含有固体脂质、液态脂质和乳化剂的有机溶剂中，进行第一步超声乳化；再将得到的乳状液加入到含有亲水性乳化剂的外水相中，进行第二步超声乳化；旋转蒸发除去有机溶剂，冷冻离心即得过氧化氢酶固体脂质纳米粒。本发明制备简单，使过氧化氢酶包埋于脂质材料中，大大提高了酶的稳定性，延长酶的有效作用时间；且粒子属于纳米级，更有利于酶在体内的释放；同时固体脂质中混合液态脂质，可扰乱固体脂质的规则性晶型结构，增加纳米粒晶体结构中不规则晶型的比例，使脂质体承载的空间容量增加，提高纳米粒载药能力。

Description

一种过氧化氢酶固体脂质纳米粒制剂的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种过氧化氢酶固体脂质纳米粒制剂的制备方法。

背景技术：

自由基是人体进行生命活动时所产生的一种活性分子，在正常代谢过程中，自由基具有调节细胞间的信号传递和细胞生长、抑制病毒和细菌的作用；但如果体内自由基过多，将导致细胞和组织器官损伤，并诱发各种疾病、加速机体衰老。正常情况下，机体通过自我产生或者从外界摄取的方式获得超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等内源性抗氧化剂和维生素、微量元素等外源性抗氧化剂，这些抗氧化剂对自由基的损害构成了一个天然的屏障。由于某些情况(如高血压病人)下，机体自我产生的内源性抗氧化剂(如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶型、谷胱甘肽还原酶)会不足，因此通过外在手段给这些病人加入内源性抗氧化剂十分必要。

过氧化氢酶作为生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，是一种非常有效的抗氧化剂，被广泛用于医药行业，起到抗氧化、清除自由基等作用。但是过氧化氢酶作为一种蛋白类药物，存在诸多缺点，主要表现在稳定性差，在酸、碱或酶的作用下易失活；分子量大且常以多聚体形式存在，难以通过胃肠道豁膜细胞，导致吸收屏障的产生；使用不便，一般只能注射给药；体内半衰期短，消除快，无法充分发挥其疗效；在体内只与特定的受体结合而起作用，受体在组织的分布特性会显著影响蛋白药效。因此需对其进行适当处理改善上述问题。

固体脂质纳米粒(solid lipid nanopartieles，SLN)是以固态的天然或合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体，将药物包裹于类脂核中，经不同方法制成的粒径在50-1000nm之间的固态胶粒给药体系，是用于保护药物和控制药物释放的新型给药系统。SLN的优点在于颗粒粒径小，在纳米数量级，可用于注射给药；生理相容、体内可降解，生理可接受性佳，制备过程无毒物残留；制备过程简单、毒性低、药物泄漏慢、物理稳定性高、通过对其表面进行特征修饰，可实现靶向给药、具有工业大规模生产潜力等优点。

发明内容：

本发明的目的是提供一种过氧化氢酶固体脂质纳米粒制剂的制备方法。

本发明的有益效果：采用将固态脂质中加入一定量液态脂质作为基质载体的方法制备产品，固体脂质中混合液态脂质，可扰乱固体脂质的规则性晶型结构，增加纳米粒晶体结构中不规则晶型的比例，使承载药物的空间容量增加，纳米粒载药能力提高。

技术方案：采用两步乳化法，将过氧化氢酶溶于水中作为内水相加入至含有固体脂质、液态脂质和乳化剂的有机溶剂中，进行第一步超声乳化；再将得到的乳状液加入到含有亲水性乳化剂的外水相中，进行第二步超声乳化；旋转蒸发有机溶剂，冷冻离心即得过氧化氢酶固体脂质纳米粒。

如将上述离心得到的过氧化氢酶固体脂质纳米粒冷冻干燥即得冻干制剂。

过氧化氢酶固体脂质纳米粒制剂的制备方法更为详细的步骤如下：

1、称取过氧化氢酶加至水中形成酶溶液构成内水相。

2、第一步乳化：称取80-100mg固态脂质，按固态脂质的0-20％称取液态脂质，两者共同溶于1-3mL有机溶剂，按固态脂质的10-18％向其中加入乳化剂，将内水相加入其中并超声乳化20-25s，即得W/O乳状液。

3、第二步乳化：将W/O乳状液加入至含有1-3％外相乳化剂的外水相中，超声乳化25-30s，即得W/O/W乳状液。

4、将得到的W/O/W乳状液旋转蒸发(30-35℃)去除有机溶剂，并冷冻离心(12000-15000rpm，25-30min，4-8℃)即得过氧化氢酶固体脂质纳米粒。

若制备冻干制剂，则继续如下步骤：

5、将冷冻离心后的制剂冷冻干燥。

包封率的测定

考马斯亮蓝法间接测定蛋白含量，测定酶溶液和离心后上清液的蛋白含量，根据下式计算包封率：

粒径和电位的测定

将冷冻离心得到的纳米粒稀释至一定浓度用纳米粒度及ZETA电位分析仪测定。

具体实施方式：

实施例1

称取80mg溶于4mL水中，配制成20mg/mL的过氧化氢酶溶液；称取三棕榈酸甘油酯100mg，MCT0mg，PLGA7.5mg，卵磷脂7.5mg溶于1mL二氯甲烷/丙酮(1/1)混合溶剂中制成油相；量取200μL20mg/mL的过氧化氢酶溶液加入至油相中超声乳化20s形成W/O乳状液；将得到的乳状液加入至4mL1％的Poloxmer188溶液中超声乳化30s，制得W/O/W乳状液；旋转蒸发(35℃)去除有机溶剂，并冷冻离心(12000rpm，30min，4℃)得到包封率为73.21％、粒径为275nm、电位为-37.1mV的过氧化氢酶固体脂质纳米粒。

实施例2

称取80mg溶于4mL水中，配制成20mg/mL的过氧化氢酶溶液；称取三棕榈酸甘油酯100mg，MCT5mg，PLGA7.5mg，卵磷脂7.5mg溶于1mL二氯甲烷/丙酮(1/1)混合溶剂中制成油相；量取200μL20mg/mL的过氧化氢酶溶液加入至油相中超声乳化20s形成W/O乳状液；将得到的乳状液加入至4mL2％的Poloxmer188溶液中超声乳化28s，制得W/O/W乳状液；旋转蒸发(35℃)去除有机溶剂，并冷冻离心(14000rpm，30min，4℃)得到包封率为80.32％、粒径为308nm、电位为-39.8mV的过氧化氢酶固体脂质纳米粒。

实施例3

称取80mg溶于4mL水中，配制成20mg/mL的过氧化氢酶溶液；称取三棕榈酸甘油酯100mg，MCT10mg，PLGA7.5mg，卵磷脂7.5mg溶于1mL二氯甲烷/丙酮(1/1)混合溶剂中制成油相；量取200μL20mg/mL的过氧化氢酶溶液加入至油相中超声乳化25s形成W/O乳状液，将得到的乳状液加入至4mL1％的Poloxmer188溶液中超声乳化30s，制得W/O/W乳状液，旋转蒸发(32℃)去除有机溶剂，并冷冻离心(15000rpm，25min，4℃)得到包封率为72.39％，粒径为250nm，电位为-45.6mV的过氧化氢酶固体脂质纳米粒。

实施例4

称取80mg溶于4mL水中，配制成20mg/mL的过氧化氢酶溶液；精密称取三棕榈酸甘油酯100mg，MCT20mg，PLGA7.5mg，卵磷脂7.5mg溶于1mL二氯甲烷/丙酮(1/1)混合溶剂中制成油相；量取200μL20mg/mL的过氧化氢酶溶液加入至油相中超声乳化23s形成W/O乳状液；将得到的乳状液加入至4mL1％的Poloxmer188溶液中超声乳化25s，制得W/O/W乳状液；旋转蒸发(30℃)去除有机溶剂，并冷冻离心(15000rpm，30min，8℃)得到包封率为65.38％、粒径为213nm、电位为-48.7mV的纳米粒子。

Claims (7)

1.一种过氧化氢酶固体脂质纳米粒的制备方法，其特征是以过氧化氢酶作为原料药，选用固体脂质和液态脂质混合物作为脂质基质，采用两步乳化法制备W/O/W型乳状液形式的过氧化氢酶脂质纳米粒子。乳化步骤如下：

a)第一步乳化：将过氧化氢酶溶于水中作为内水相加入至含有固体脂质、液态脂质和乳化剂的有机溶剂中，进行乳化，得到W/O乳状液；

b)第二步乳化：将第一步乳化所得W/O乳状液加入到含有亲水性乳化剂的外水相中，进行乳化，得到W/O/W型乳状液。

2.权利要求1所述的制备方法，两步乳化均采用超声波细胞破碎仪进行超声乳化。

3.权利要求1所述的制备方法，固体脂质为下列脂质之一或它们的组合，甘油三癸酸酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、甘二酯、硬脂酸、棕榈酸、癸酸、二十二酸、鲸蜡醇十六酸酯、胆固醇。

4.权利要求1所述的制备方法，液态脂质为下列脂质之一，中碳链甘三酯、油酸、亚油酸。

5.权利要求1所述的制备方法，有机溶剂为下列溶剂之一或它们的组合，丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯。

6.权利要求1所述的制备方法，内相乳化剂为下列乳化剂之一或它们的组合，卵磷脂、PLGA系列、丁醇、丁酸。

7.权利要求1所述的制备方法，外相乳化剂为下列乳化剂之一，泊洛沙姆系列、聚山梨醇醋系列、去氢胆酸钠。