KR20100103206A - 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20100103206A
KR20100103206A KR1020090021705A KR20090021705A KR20100103206A KR 20100103206 A KR20100103206 A KR 20100103206A KR 1020090021705 A KR1020090021705 A KR 1020090021705A KR 20090021705 A KR20090021705 A KR 20090021705A KR 20100103206 A KR20100103206 A KR 20100103206A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
monomer
antisense
conjugate
stranded
group
Prior art date
Application number
KR1020090021705A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101141544B1 (ko
Inventor
박태관
목혜정
이수현
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020090021705A priority Critical patent/KR101141544B1/ko
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to EP09731474.4A priority patent/EP2407539B1/en
Priority to US12/514,306 priority patent/US8580946B2/en
Priority to EP17150172.9A priority patent/EP3196306A1/en
Priority to PCT/KR2009/002252 priority patent/WO2010104237A1/ko
Publication of KR20100103206A publication Critical patent/KR20100103206A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101141544B1 publication Critical patent/KR101141544B1/ko
Priority to US14/048,951 priority patent/US9255269B2/en
Priority to US14/312,530 priority patent/US9644209B2/en
Priority to US15/483,528 priority patent/US20180080028A1/en
Priority to US16/040,795 priority patent/US10597659B2/en
Priority to US16/781,766 priority patent/US20200239892A1/en
Priority to US17/945,842 priority patent/US11859184B2/en
Priority to US18/509,130 priority patent/US20240150766A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 (-X-)n 의 구조식을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 상기 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하여 제조된 (-X-)n 의 구조식을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체 제조방법은 그 반응이 간단하고 효율이 높으며, 상기의 방법으로 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체는 기존 에스아이알엔에이에 비해 분자량이 수배 이상으로 크기 때문에 음이온 전하 밀도가 높아 양이온성 유전자 전달체와의 이온성 결합력이 우수하여 유전자 전달 효율을 현저히 높일 수 있다.
에스아이알엔에이(siRNA), 이중가닥 센스/안티센스, 양이온성 유전자 전달체

Description

에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법{Multi-conjugate of siRNA and preparing method thereof}
본 발명은 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 (-X-)n 의 구조식을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 상기 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하여 제조된 (-X-)n 의 구조식을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
에스아이알엔에이(siRNA)는 19-22개 정도의 핵산으로 구성된 짧은 이중 나선의 RNA가닥으로 센스 가닥과 염기서열이 동일한 유전자의 mRNA(messenger RNA)를 표적으로 삼아 표적 유전자를 분해하여 해당 유전자의 발현을 억제시키는 역할을 한다(Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-8).
에스아이알엔에이는 기존의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 비해 10배 정도 적은 양으로도 유전자 발현을 저해할 수 있으며, 유전자 선택성이 더욱 우수하여 표적 유전자만을 저해할 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 에스아이알엔에이는 생체내에서의 안정성이 낮아서 단시간내에 분해되고 음이온을 띄기 때문에 세포막을 쉽게 투과하기 어려워 세포내로의 전달 효율이 떨어지는 단점을 가지고 있다.
에스아이알엔에이의 전달 효율을 높이기 위하여 에스아이알엔에이와 다양한 기능성 양이온 고분자, 지질 혹은 양이온 펩타이드의 이온 결합을 통한 나노 크기의 이온 복합체를 이용한 방법이 현재 일반적으로 많이 사용되고 있다. 그러나, 현재 사용되는 에스아이알엔에이는 그 분자량이 ~15000 정도이고 이중 가닥으로 뻣뻣한 구조로 되어있어 양이온성 유전자 전달체와 안정적인 복합체를 이루는데 어려움이 있다 (Gary, D. J., Puri, N., and Won, Y. Y. (2007) Polymer-based siRNA delivery: perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery. J Control Release 121, 64-73).
따라서 에스아이알엔에이가 유전자 전달체와 안정적인 복합체를 형성하도록 하는 연구가 많이 진행되고 있다. 일반적으로 음이온성 유전자인 에스아이알엔에이와 양이온성 유전자 전달체 사이의 이온 결합체의 안정성을 높이는 방법으로써 각각의 전하 밀도를 높이는 연구가 많이 진행되고 있다. 양이온성 고분자나 지질의 분자량을 늘리거나 강한 양이온을 띠는 그룹을 도입하여 음이온을 띠는 유전자와 강한 이온 결합을 시키고자 하는 방법이 있다. 그러나 이러한 방법은 유전자 전달 효율은 증가 시키나, 유전자 전달체의 강한 양이온으로 인해 비특이적인 세포 독성 또한 증가시켜 임상 적용에 어려움이 있다. 따라서 음이온성 유전자인 에스아이알엔에이 자체를 변형시켜서 기존에 사용되고 있는 유전자 전달체와 안정적인 복합체를 이루도록 하는 연구도 최근에 진행되고 있다.
최근 보고에 따르면, 에스아이알엔에이의 분자량을 높이기 위해서 센스 가닥에 4-8개 가량의 여분의 뉴클레오티드(deoxythymine, deoxyadenine)를 첨가하여 이들이 서로 상보적 염기 결합에 의해서 에스아이알엔에이가 서로 연결되도록 하는 방법도 있다고 한다(Bolcato-Bellemin, A. L., Bonnet, M. E., Creusat, G., Erbacher, P., and Behr, J. P. (2007) Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 16050-5). 그러나 이 경우 4-8개의 뉴클레오티드 사이의 상보적 결합이 안정적이지 않아서 전기 영동을 통해서는 확인할 수 없었다.
본 발명의 목적은 기존의 에스아이알엔에이에 비해 유전자 저해 효율이 높은 에스아이알엔에이의 다중 접합체를 제공하고자 함이며, 음전하 밀도가 높아서 유전자 전달체와 안정적으로 결합하는 에스아이알엔에이의 다중 접합체를 간단하고 높은 효율로 제조하는 방법을 제공하고자 함이다.
상기의 과제를 해결하고자,
본 발명은 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 하기 (1)의 구조식을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제공한다.
(-X-)n...구조식(1)
(상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, n은 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체의 개수이다.)
또한 본 발명은 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하여 제조된 상기 (1)의 구조식을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체 제조방법은 그 반응이 간단하고 효율이 높으며, 상기의 방법으로 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체는 기존 에스아이알엔에이에 비해 분자량이 수배 이상으로 크기 때문에 음이온 전하 밀도가 높아 양이온성 유전자 전달체와의 이온성 결합력이 우수하여 유전자 전달 효율을 현저히 높일 수 있다.
본 발명은 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 (-X-)n 의 구조식(상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, n은 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체의 개수이다.)을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제공한다.
본 발명에서 상기 이중가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체는 15 내지 29의 핵산 염기수를 가질 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 이중가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체의 개수 n은 1~100일 수 있다.
본 발명은 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하여 제조된 (-X-)n의 구조식(상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, n은 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체의 개수이다.)을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법을 제공한다.
상기 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법은 말단이 동일한 관능기로 치환된 단일 가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체(yx + x′y)를 상보적 수소 결합을 통해 yXy로 만드는 단계; 및 상기 yXy를 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계;를 포함할 수 있다(상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, x와 x′은 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체, y는 말단에 도입된 관능기이다.).
또한 상기 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법은 말단이 동일한 관능기로 치환된 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체 각각(yx 와 x′y)을 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시켜 이중량체인 xyyx 와 x′yyx′로 만드는 단계; 및 상기 이중량체인 xyyx 와 x′yyx′을 상보적 수소 결합시키는 단계;를 포함할 수 있다(상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, x와 x′은 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체, y는 말단에 도입된 관능기이다.).
또한 상기 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법은 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체(yx + x′z)를 상보적 수소 결합을 통해 yXz로 만드는 단계; 및 상기 yXz를 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계;를 포함할 수 있다(상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, x와 x′은 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체, y와 z 는 말단에 도입된 관능기이다.).
또한 상기 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법은 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체(yx 와 xz, x′y와 x′z) 각각을 가교제 혹은 고분자를 매개로 공유결합시켜 이중량체인 xyzx와 x′yzx′로 만드는 단계; 및 상기 이중량체인 xyzx와 x′yzx′을 상보적 수소 결합시키는 단계;를 포함할 수 있다(상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, x와 x′은 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체, y와 z는 말단에 도입된 관능기이다.).
본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에서, 상기 공유결합은 비분해성인 아마이드 결합, 우레탄 결합; 산분해성인 에스터 결합, 하이드라존 결합, 아세탈 결합; 환원제 분해성인 이황화 결합; 생분해성 결합; 및 효소 분해성 결합;으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 공유결합일 수 있다.
또한 본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에서, 상기 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체의 말단인 하이드록시기(-OH) 대신에 치환된 관능기는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH) 및 아민기(-NH2) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 관능기일 수 있다.
또한 본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에서, 상기 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체는 3′혹은 5′말단이 모두 관능기로 치환되어, 제조된 것일 수 있다.
또한 본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에서, 상기 공유 결합의 매개로 사용되는 고분자는 PEG, 플루로닉(Pluronic), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 및 폴리옥사졸린(polyoxazolin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 비이온성 친수성 고분자; 또는 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산 (poly-glycolic acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic-co-glycolic acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-카프로락톤(polycaprolactone), 폴리-발레로락톤(polyvalerolactone), 폴리-하이드록시 부티레이트(polyhydroxybutyrate) 및 폴리-하이드록시 발러레이트(polyhydroxyvalerate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생분해성 폴리에스테르계 고분자;일 수 있다.
또한 본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에서, 상기 가교제는 분자량이 100~10000이 되는 것으로 DTME(Dithio-bis-maleimidoethane), BM(PEG)2(1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol), 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페일아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide) 및 하이드로시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에서, 상기 에스아이알엔에이 다중 접합체 말단에 세포 선택적 리간드가 더 구비되어지는 질 수 있다.
상기 더 구비되어지는 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산(folic acid), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 알지디(RGD) 및 트렌스페린(transferrin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법에서, 상기 에스아이알엔에이가 갖는 관능기를 활성화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 에스아이알엔에이가 갖는 관능기를 활성화시키는 물질은 1-에틸-3, 3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl carbodiimide), 이미다졸(imidazole), N-하이드로실숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 디클로로헥실카보디이미드(dichlorohexylcarbodiimide), N-β-말레이미도프로피오닉엑시드(N-β-Maleimidopropionic acid), N-β-말레이미도프로필로실 숙신이미드에스터(N-β-maleimidopropyl succimimide ester) 및 N-숙신이미딜피리딜다이싸이오 프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 에스아이알엔에이 다중 접합체;와 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 양이온성 유전자 전달체; 간의 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 형성되는 이온 복합체를 제공한다.
본 발명에서 상기 양이온성 펩타이드는 KALA(cationic fusogenic peptide), 폴리라이신(polylysine), 폴리글루타믹엑시드(polyglutamic acid) 및 프로타민(portamine)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 양이온성 지질은 다이올레일 포스페티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine) 또는 콜레스테롤 다이올레일 포스페티딜콜린(cholesterol dioleoyl phosphatidyl choline) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리아민(polyamines) 및 폴리비닐아민(polyvinylamine)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
이하 본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조 방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 난치성 질환의 유전자 치료용으로 최근 큰 관심을 받고 있는 에스아이알엔에이(siRNA, small interfering RNA)의 말단에 관능기를 도입하여 가교제 혹은 고분자를 매개로 한 분해성 혹은 비분해성 공유결합을 통해 에스아이알엔에이 다중 접합체(multi-siRNA)를 제조하는 방법과 그 다중 중합체와 다양한 기능성 양이온 고분자, 양이온 지질 혹은 양이온 펩타이드의 이온 결합을 통한 이온 복합체 의 제조 및 응용에 관한 것이다.
본 발명은 크게 두가지 방법으로 에스아이알엔에이 다중 접합제를 제조한다.
첫 번째 방법은 말단에 관능기가 도입된 단일가닥의 센스 에스아이알엔에이 (sense siRNA)와 안티센스 에스아이알엔에이(antisense siRNA) 각각을 가교제 혹은 고분자를 이용하여 반응 시켜서 단일가닥의 센스와 안티센스 에스아이알엔에이 (antisense siRNA) 2량체를 준비한다. 준비된 각각의 2량체를 수용액상에서 상보적 결합(annealing)을 시킴으로써 에스아이알엔에이 다중 접합체가 제조된다(도 1의 B 및 D 참조).
보다 상세하게는 말단이 설프하이드릴기로 치환된 센스 가닥과 안티센스 가닥 에스아이알엔에이를 각각을 설프하이드릴기와 반응하는 가교제인 DTME(Dithio-bis-maleimidoethane)혹은 BM(PEG)2(1,8-bis(maleimido)diethylene glycol)를 이용하여 분해성 혹은 비분해성 공유결합을 통해 2중량체를 제조한 뒤, 제조된 2중량체 각각을 동량으로 넣어 인산 완충용액(PBS) 상에서 수소 결합을 통한 상보적 결합을 하도록 섞어주어 에스아이알엔에이의 다중 접합체가 제조된다.
두 번째 방법은 말단이 관능기로 치환되어 있는 이중가닥의 에스아이알엔에이(상보적 수소 결합 되어진)를 가교제 혹은 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시켜서 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제조한다(도 1의 A 및 C 참조).
보다 상세하게는 양쪽 말단에 설프하이드릴기가 도입된 단일가닥의 에스아이알엔에이를 상보적으로 수소 결합시키고, 상기 수소 결합된 것을 가교제 혹은 DMSO 를 사용하여 산화 반응을 이용한 공유결합을 통해 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제조한다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체와 다가 양이온성 고분자, 지질 또는 펩타이드와의 이온 결합에 의해 수용액 상에서 나노 크기의 복합체를 형성하는 유전자 치료제 전달체의 제조방법과 그것의 질병모델로의 응용에 관한 것이다.
본 발명은 치료 유전자인 에스아이알엔에이만을 이용하여 다중 접합체를 만들었으므로 생체 적합성이 뛰어나고, 다중 접합체를 제조한 후에도 본래의 에스아이알엔에이의 유전자 저해 기능에는 영향을 미치지 않고 유전자 전달체와의 결합력은 증대시켜 세포내로의 도입 효율을 높임으로써 기존의 에스아이알엔에이에 비해 높은 유전자 저해 효과를 보인다는데 그 의의가 있다.
상기 에스아이알엔에이 다중 접합체 제조 중 에스아이알엔에이의 올리고 가닥은 바람직하게는 분자량 10,000에서 50,000 사이에서 선택되어진다. 본 발명에서 사용가능한 에스아이알엔에이(siRNA)는 치료용 또는 연구용으로 사용되어지고 있는 것인 한 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어 c-myc, c-myb, c-fos, c-jun, bcl-2 혹은 VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF 등 유전자 치료 또는 연구를 위해 사용되어지거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 에스아이알엔에이도 채택되어질 수 있다.
또한 상기 에스아이알엔에이 말단의 하이드록시기(-OH)는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기 (-COOH) 또는 아민기 (-NH2)의 관능기로 치환되어질 수 있다.
또한 상기 에스아이알엔에이는 3′혹은 5′말단을 모두 사용하며, 바람직하게는 센스와 안티센스 모두 3′말단에 관능기로 치환된 것이 사용된다.
또한 상기 고분자는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 폴리옥사졸린(polyoxazolin) 등의 비이온성 친수성 고분자나 PLGA, PLA 등의 소수성 고분자가 있으나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다.
또한 상기 가교제는 분자량이 100~10000이 되는 것으로 DTME(Dithio-bis-maleimidoethane), BM(PEG)2(1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol), 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페일아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide), 하이드로시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide) 등에서 선택되어질 수 있다.
가교제 내에 비분해성 결합인 아마이드 결합, 우레탄 등의 공유결합, 산분해성 결합인 에스터, 하이드라존, 아세탈 등의 공유결합, 환원제 분해성인 이황화결합 등 외부 자극에 의해 분해될 있는 결합을 가진 것과 외부 자극에 의해 분해되지 않는 것을 모두 사용한다. 또한, 여기서 언급된 가교제에 한정되지 않고 통상적으로 약물 변형에 사용되고 있는 모든 가교제는 본 발명의 제조 방법의 대상이 된다.
상기 본 발명에 따른 에스아이알엔에이 다중 접합체는 바람직하게는 에스아 이알엔에이 접합체 말단에 도입되는 세포 선택적 리간드가 더 구비되어질 수 있다.
상기 구비되어지는 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산, 갈락토스, 만노스, 알지디, 트렌스페린 중 선택된 1종 이상의 것으로 한다. 이들 리간드는 이황화결합(disulfide bond)를 포함해 아마이드결합(amide bond)이나 에스테르결합(ester bond)등의 결합을 통해 상기 접합체의 말단에 도입될 수 있다.
상기 에스아이알엔에이 다중 접합체 제조방법은 바람직하게는 에스아이알엔에이가 갖는 관능기를 활성화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 상기 에스아이알엔에이의 관능기를 활성화시키는 물질은 1-에틸-3, 3-디에틸아미노프로필 카보디이미드, 이미다졸, N-하이드로실숙신이미드와 디클로로헥실카보디이미드, N-β-말레이미도프로피오닉엑시드, N-β-말레이미도프로필로실숙신이미드에스터, N-숙신이미딜피리딜다이싸이오 프로피오네이트에서 선택되어지는 적어도 하나이다.
본 발명은 에스아이알엔에이와 양이온성 펩타이드, 양이온성 유전자 전달체 (지질, 고분자, 펩타이드 등) 간의 이온 상호작용에 의해 형성되는 에스아이알엔에이 이온 복합체를 제공한다.
본 발명에서 상기 유전자 전달체 중 양이온성 펩타이드는 KALA(cationic fusogenic peptide), 폴리라이신 (polylysine), 폴리글루타믹엑시드 (polyglutamic acid) 또는 프로타민 (portamine) 일 수 있다.
상기에서 KALA는 WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALAACEA의 펩타이드 서열을 가질 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 유전자 전달체 중 양이온성 지질은 다이올레일 포스페티딜에탄올아민 또는 콜레스테롤 다이올레일 포스페티딜콜린 일 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 유전자 전달체 중 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리아민 또는 폴리비닐아민일 수 있다.
또한 본 발명은 에스아이알엔에이와 양이온성 유전자 전달체간의 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 형성되는 에스아이알엔에이의 세포 전달을 용이하게 할 수 있는 이온 복합체의 제조방법을 제공한다.
에스아이알엔에이의 다중 접합체의 제조 반응은 특별히 한정되는 것은 아니며, 통상적으로는 상온에서 수행이 가능하고, 대략 24 ~48 시간 동안 반응시켜 얻어질 수 있다. 반응에 요구되는 상기 각 반응물의 첨가비는 특별히 한정되지는 않으며, 가교제와 에스아이알엔에이가 몰비(%)를 통해 에스아이알엔에이의 길이를 조절할 수 있다.
본 발명에서 상보적 결합을 시켜주는 수용액은 인산 완충용액(PBS), 트리스(Tris) 완충 용액 또는 히피스(HEPES) 완충용액으로, 바람직하게는 염 농도 100 mM 이상인 완충 용액이 사용된다.
본 발명에 따른 상기 에스아이알엔에이 다중 접합체와 양이온성 고분자 전달체간에 이온 결합을 이용하여 이온 복합체를 형성할 수 있다. 이온 복합체란, 음이온성 유전자와 이와 반대 이온을 지닌 고분자(예를 들어 양이온성 물질)간의 상호작용에 의해 형성되는 작은 집합체로서 100-200 nm 정도의 크기를 가진다.
본 발명에서, 상기 이온 복합체을 형성하기 위해 사용되어지는 양이온성 물질은 KALA, 폴리라이신(polylysine), 폴리글루타믹엑시드(polyglutamic acid) 또는 프로타민(portamine)의 양이온성 펩타이드, 폴리에틸렌이민, 폴리아민 또는 폴리비닐아민의 양이온성 고분자, 다이올레일 포스페티딜에탄올아민 또는 콜레스테롤 다이올레일 포스페티딜콜린의 양이온성 지질일 수 있다.
이와 같은 이온 복합체의 제조과정을 설명하면 다음과 같다. 얻어진 에스아이알엔에이 다중 중합체를 인산완충용액 등에 희석한 후 여기에 양이온성 물질을 첨가하여 상온에서 방치하면 수용액 상에서 이온 복합체를 형성한다. 이때 양이온성 물질의 첨가량은 사용되는 양이온성 물질의 양전하와 에스아이알엔에이의 음전하의 전하 비가 1:1 (+/- = 1/1) ~100:1까지 조절할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는, 혈관내피세포 성장인자를 억제하기 위해 hVEGF (human vascular endothelial growth factor) 에스아이알엔에이를 사용하였다. 혈관내피세포 성장인자는 혈관내피세포 (Vascular endotherlial cell)의 표면에 존재하는 VEGF 수용체와 결합하여 내피세포의 성장, 이동을 촉진하여 새로운 혈관의 생성을 촉진하는 역할을 한다. 특히, 암세포의 성장이나 전이는 이러한 혈관의 신생과 밀접한 관계가 있기 때문에 혈관의 신생을 억제함으로서 암세포의 성장을 저해하는 방법이 새로운 암치료방법의 하나로 주목을 받고 있다.
본 발명의 후술하는 실시예에서는, 바람직한 실시예로서 세포질 내에서 자발적으로 분해되는 생분해성 결합인 이황화결합을 지닌 에스아이알엔에이 다중 접합체를 이용하였다.
본 발명에서 생체내에서 에스아이알엔에이 다중 접합체의 세포 전달을 위한 이온 복합체를 형성하기 위해 양이온 고분자인 linear PEI(polyethylenimine)를 사용하였다.
본 발명에서 혈관내피세포 성장인자 에스아이알엔에이 다중 접합체/linear PEI 이온 복합체를 전립선 암세포주인 PC-3 세포를 이용하여 혈관내피세포 성장인자의 발현에 대한 저해를 알아보았다. 그 결과 기존의 에스아이알엔에이/linear PEI 보다 에스아이알엔에이 다중 접합체/linear PEI 이온 복합체가 혈관내피세포 성장인자의 발현을 크게 억제하는 것을 관찰 할 수 있었다(도 5 참조).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 말단이 동일한 관능기로 치환된 센스 가닥 에스아이알엔에이와 안티센스 가닥 에스아이알엔에이를 수소 결합을 이용하여 이중 가닥의 에스아이알엔에이를 준비 후, 가교제를 이용하여 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조
1. 설프하이드릴기로 3′말단이 치환된 센스 혹은 안티센스 가닥 에스아이알엔에이 100 nmol을 1X 인산 완충 용액 260 ㎕에 녹인 후, 37도에서 1시간 방치하여 이중가닥의 에스아이알엔에이를 준비하였다. 준비된 이중가닥의 에스아이알엔에이 의 양쪽 말단의 설프하이드릴기를 환원시키기 위해, 22 ㎕의 25X PBS 완충용액, 260 ㎕ 2M DTT (dithiothreitol) 용액, 그리고 pH를 맞추기 위해 4 ㎕의 5N NaOH 용액을 넣어준 뒤, 12시간 정도 반응시켜 주었다. 반응이 끝나면 투석 과정을 통해서 남아 있는 DTT를 제거하고 용액을 농축시켜서 최종 1 nmol/㎕의 농도로 준비한 후, 최종 5X 인산 완충 용액이 되도록 25X PBS 완충용액을 넣어주고, 가교제인 DTME 혹은 BM(PEG)2를 티올기의 농도의 절반이 되는 농도로 넣어준 뒤 24시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후에는 투석 과정으로 통해 남아있는 가교제등의 이물질을 제거하고 농축시켜서 최종 1-2 ㎍/㎕의 농도가 되도록 이중 가닥의 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제조하였다(도 1 A). 준비된 에스아이알엔에이는 전기 영동을 통해 확인하였다(도 2).
2. 또한, 이중 가닥의 에스아이알엔에이를 가교제를 사용하지 않고 직접 산화 작용을 매개로 한 공유결합을 통해 다중 접합체를 제조하였다. 센스와 안티센스의 3′말단에 티올기로 치환된 이중가닥의 에스아이알엔에이를 위의 방법으로 DTT를 처리한후, 투석과 농축을 하여 최종 1 nmol/㎕의 농도로 준비하였다. 준비된 용액에 DMSO (dimethylsulfoxide)와 diamide를 넣어서 설프하이드릴을 산화시켜 이황화결합을 형성하도록 하였다. 만들어진 이중가닥의 에스아이알엔에이 다중 접합체는 전기 영동을 통해서 확인하였다(도 3 A).
<실시예 2> 말단이 동일한 관능기로 치환된 센스 가닥 에스아이알엔에이와 안티센스 가닥 에스아이알엔에이를 가교제를 이용하여 각각 2중량체 제조 후 수소 결합을 이용하여 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조
설프하이드릴기로 3′말단이 치환된 센스 혹은 안티센스 가닥 에스아이알엔에이 100 nmol을 260 ㎕ DEPC (Diethyl pyrocarbonate) 가 처리된 3차 증류수로 녹인 후, 22 ㎕의 25X PBS 완충용액을 넣어주었다. 여기에 260㎕ 2M DTT (dithiothreitol) 용액을 넣고, pH를 맞추기 위해 4 ㎕의 5N NaOH 용액을 넣어준 뒤, 12시간 정도 반응시켜 주었다. 반응이 끝나면 투석 과정을 통해서 남아 있는 DTT를 제거하고 용액을 농축시켜서 최종 1 nmol/㎕의 농도로 센스 혹은 안티센스 가닥 에스아이알엔에이를 준비하였다. 준비된 1 nmol/㎕의 농도로 센스 혹은 안티센스 가닥 에스아이알엔에이에 25 X PBS를 최종 5X PBS 용액이 되도록 넣어주고, 가교제인 DTME 혹은 BM(PEG)2를 티올기의 농도의 절반이 되는 농도로 넣어준 뒤 24시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후에는 투석 과정으로 통해 남아있는 가교제등의 이물질을 제거하고 농축시켜서 최종 1-2 ㎍/㎕의 농도가 되도록 2중량체의 센스 혹은 안티센스 가닥 에스아이알엔에이를 준비하였다(도 1 B 참조). 준비된 각각의 분해성 이황화결합 혹은 비분해성 공유결합으로 이루어진 2중량체(도 3 C 참조)와 공유 결합으로 이루어진 2중량체(도 3 D 참조)를 전기 영동을 통해 확인하였다. 준비된 동량의 센스와 안티센스 2중량체들을 인산 완충용액에서 37도 1시간 방치시켜 수소결합을 통한 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제조한 후, 전기 영동을 통해 확인하였다 (도 3 B 참조).
<실시예 3> 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 센스 가닥 에스아이알엔에이와 안티센스 가닥 에스아이알엔에이를 수소결합을 통해 이중 가닥의 에스아이알엔에이 제조 후, 가교제를 이용하여 에스아이알엔에이 접합체 제조
3′말단에 각각 아민기와 설프하이드릴기로 치환된 두 종류의 센스 가닥과 안티센스 가닥을 각각 준비하였다. 각각의 센스 혹은 안티센스 가닥 100 nmol을 260㎕의 인산완충 용액에 넣고, 37도에서 1시간 방치시켜, 이중 가닥의 에스아이알엔에이를 준비한다. 말단이 설프하이드릴기로 치환된 단일 가닥의 에스아이알엔에이를 준비하기 위해 DTT를 처리한 후, 투석과 농축을 하여 최종 1 nmol/㎕의 농도로 준비한다. 준비된 이중 가닥의 에스아이알엔에이에 가교제인 sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-car boxylate)를 넣고 24시간 동안 반응시켜 다중 접합체 에스아이알엔에이를 준비하였다. 반응 후에는 투석 과정으로 통해 남아있는 가교제등의 이물질을 제거하고 농축시켜서 최종 1-2 ㎍/㎕의 농도가 되도록 준비하였다(도 1 C 참조).
<실시예 4> 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 센스 가닥 에스아이알엔에이와 안티센스 가닥 에스아이알엔에이를 가교제를 이용하여 2중량체의 센스 혹은 안티센스 에스아일알엔에이를 제조한 후, 수소결합을 통해 에스아이알엔에이 다중 접합체 제조
센스와 안티센스의 3′말단에 각각 아민기와 설프하이드릴기로 치환된 이중가닥의 에스아이알엔에이를 가교제인 sulfo-SMCC를 사용하여 서로 연결 되도록 하였다. 말단이 설프하이드릴기로 치환된 단일 가닥 에스아이알엔에이의 경우 DTT를 처리한후, 투석과 농축을 하여 최종 1 nmol/㎕의 농도로 준비하였다. 말단이 아민기로 치환된 단일가닥 에스아이알엔에이는 DEPC처리된 증류수에 녹여서 1 nmol/㎕의 농도로 준비하였다. 아민기와 설프하이드릴기로 치환된 센스와 안티센스 각각을 준비된 용액에 sulfo-SMCC를 넣어서 센스 혹은 안티센스 2중량체를 제조하였다. 제조된 각각의 센스와 안티센스 2중량체는 인산 완충용액 상에서 서로 섞고 37도에서 1시간 방치하여 이중가닥의 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제조하였다(도 1 D 참조).
<실험예 1> GFP 발현양 측정 실험
GFP 유전자를 저해하는 에스아이알엔에이를 이용하여, 기존의 에스아이알엔에이와 가교제를 이용하여 분해성 이황화결합 혹은 비분해성 공유결합으로 연결된 에스아이알엔에이 다중 접합체(도 1A 방법으로 제조한 것)를 linear PEI를 이용하여 이온 복합체를 만들어 암세포인 GFP를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-435 세포에 5시간 동안 처리한 후, 48시간 후에 발현된 GFP양을 형광 분석기 (fluorophotometer)를 이용하여 정량하였다 (도 4 참조).
상기 실험결과에서 알 수 있듯이, 기존의 에스아이알엔에이에 비하여 본 발명에서 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체가 양이온성 유전자 전달체를 이용한 유전자 전달 효율이 뛰어나 표적 유전자 저해 효능이 뛰어난 것을 알 수 있었다.
<실험예 2> 에스아이알엔에이 다중 접합체의 양이온성 유전자 전달체와의 결합력 및 안정성 측정 실험
제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체(도 1 B의 방법으로 제조된 것)가 기존의 에스아이알엔에이와 비교하여 양이온성 유전자 전달체와 결합력이 강하고 안정된 이온 복합체를 이루는지 확인하기 위해, 대표적 유전자 전달체인 Linear PEI와 각 에스아이알엔에이를 섞어서 이온 복합체를 만든 뒤 AFM을 이용하여 그 모양과 크기를 관찰하였다 (도 5 참조).
상기 실험결과에서 알 수 있듯이, 기존의 에스아이알엔에이에 비하여 본 발명에서 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체가 양이온성 고분자와 결합력이 우수하여 크기가 작고 균일한 나노 입자를 만들 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 각각의 에스아이알엔에이와 결합되는 양이온성 고분자의 양을 확인하기 위해 gel retardation assay를 진행하였다 (도 6 참조).
상기 실험결과에서 알 수 있듯이, 기존의 에스아이알엔에이에 비하여 본 발명에서 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체가 전하 밀도가 높아서 낮은 농도의 양이온성 고분자와도 결합하여 이온 복합체를 형성할 수 있음을 알 수 있었다.
<실험예 3> VEGF 유전자를 이용한 유전자 저해 효율 측정 실험
VEGF 유전자를 저해하는 에스아이알엔에이를 이용하여, 기존의 에스아이알엔 에이와 분해성 이황화결합 혹은 비분해성 공유결합으로 연결된 에스아이알엔에이 다중 접합체(도 1 B의 방법으로 제조된 것)를 linear PEI를 이용하여 이온 복합체를 만들어 암세포인 PC3 세포에 5시간 동안 처리한 후, 21시간 동안 분비된 VEGF양을 ELISA를 이용하여 정량하였다. 에스아이알엔에이의 농도별 (0, 18, 45, 90 nM)과 뉴클리오티드 내의 인산에 대한 양이온성 전달체 내 아민의 비율인 NP ratio 별 (0, 10, 15, 20)으로 실험하였다(도 7 A-B). 또한, 세포내의 mRNA 양을 선택적으로 줄이는지 확인하기 위해, 암세포에 각각의 이온 복합체를 5시간 처리한 후 18 시간 후에 RNA를 분리하여 PCR을 통해 세포내의 VEGF mRNA양을 확인하였다(도 7 C).
상기 실험결과에서 알 수 있듯이, 기존의 에스아이알엔에이에 비하여 본 발명에서 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체가 양이온성 고분자와 안정적이고 균일한 이온 복합체를 형성하여, 유전자 전달 효과가 우수하고 표적 유전자를 선택적으로 저해시키는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> VEGF 유전자 저해 효율 측정 실험 결과
VEGF 에스아이알엔에이 다중 접합체(도 1 B의 방법으로 제조된 것)를 전기 영동 후 젤 분리방법을 이용하여 에스아이알엔에이 크기별로 분리를 한 후 전기 영동을 통해 확인하였다 (도 8 A 참조). 분리된 각각의 Linear PEI와 복합체를 형성하여 90 nM의 에스아이알엔에이들을 PC3 세포에 처리한 후, VEGF 유전자의 저해 효과를 확인하였다 (도 8 B 참조).
상기 실험결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에서 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체가 분자량이 커질수록 전하 밀도가 높아져서, 양이온성 고분자를 이용한 유전자 전달 효율이 증가됨을 알 수 있었다.
<실험예 5> 에스아이알엔에이 다중 접합체의 면역반응 유도 정도 확인 실험
에스아이알엔에이 다중 접합체(도 1B 방법으로 제조된 것)의 면역반응 유도 정도를 확인하기 위해, 인간 혈액으로부터 단핵구세포인 PBMC세포를 Fisher lymphocyte speration medium을 이용하여 분리하였다. VEGF 에스아이알엔에이를 이용하여, 기존의 에스아이알엔에이와 이황화결합 혹은 비분해성 공유결합으로 연결된 에스아이알엔에이 다중 접합체를 세종류의 양이온성 유전자 전달체인 linear PEI, jet PEI, DOTAP을 이용하여 이온 복합체를 만들어, 최종 농도가 360 nM이 되도록 각각의 에스아이알엔에이 복합체들을 인간 혈액 단핵구세포인 PBMC세포에 24시간 동안 처리하였다. 분비된 인터페론 알파의 양을 확인하기 위해 세포의 상층액을 이용하여 ELISA를 진행하였다 (도 9 A 참조).
상기 실험결과에서 알 수 있듯이, 기존의 에스아이알엔에이에 비하여 본 발명에서 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체가 인터페론 알파의 유도를 크게 일으키지 않음을 알 수 있었다. 특히, 이황화결합을 이용한 에스아이알엔에이 다중 접합체의 경우 기존의 에스아이알엔에이와 비슷한 정도의 인터페론 알파 유도를 나타내었다.
또한 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체가 마우스에서 인터페론 알파의 분비를 유도하는지 확인하기 위하여, 40 ㎍의 기존의 에스아이알엔에이와 이황화결합 혹은 비분해성 공유결합으로 연결된 에스아이알엔에이 다중 중합체를 양이온성 유전자 전달체인 linear PEI와 이온 복합체를 형성하여 7 주령된 ICR마우스에 정맥주사로 주입하였다. 6시간 동안 처리한 후에, 마우스의 심장에서 혈액을 채취하여 ELISA를 통해 혈액내의 인터페론 알파의 양을 정량하였다 (도 9 B 참조).
상기 실험결과에서 알 수 있듯이, 동물 모델 실험에서도 기존의 에스아이알엔에이에 비해 본 발명에서 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체가 인터페론 알파의 유도를 크게 일으키지 않음을 알 수 있었다.
본 발명의 에스아이알엔에이 다중 접합체는 유전자 전달 효율을 높여 유전자 치료용 등의 의약분야에 이용이 가능하며, 이에 관련된 다양한 분야로의 응용을 가능케 하여 궁극적으로는 국가의 산업발전에 이바지 할 것으로 기대된다.
도 1은 에스아이알엔에이의 다중 접합체 제조방법의 모식도를 나타낸 것이다. (A)는 한쪽 말단이 동일한 관능기로 치환된 단일가닥 센스 에스아이알엔에이와 단일가닥 안티센스 에스아이알엔에이를 수소 결합을 통한 상보적 염기 결합으로 양쪽 말단이 관능기가 도입된 이중가닥의 에스아이알엔에이를 만든 후, 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제조한 경우를 나타내며, (B)는 한쪽 말단이 동일한 관능기로 치환된 단일가닥 센스 에스아이알엔에이와 단일가닥 안티센스 에스아이알엔에이를 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 2중량체의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 에스아이알엔에이를 제조한 후, 각각을 올리고뉴클레오티드 자체의 수소 결합을 이용하여 상보적으로 결합시켜서 에스아이알엔에이의 다중 접합체를 제조한 경우를 나타내며, (C)는 한쪽 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 단일가닥 센스 에스아이알엔에이와 단일가닥 안티센스 에스아이알엔에이를 수소 결합을 이용한 상보적 결합으로 양쪽 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 이중가닥의 에스아이알엔에이를 만든 후, 공유결합이나 가교제를 매개로 한 공유결합을 통해 에스아이알엔에이의 다중 접합체를 제조한 경우를 나타내며, (D)는 한쪽 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 단일가닥 센스 에스아이알엔에이와 단일가닥 안티센스 에스아이알엔에이를 공유결합 혹은 가교제를 매개로 한 공유결합을 통해 2중량체의 센스 가닥과 안티센스 가닥의 에스아이알엔에이를 제조한 후, 각각을 올리고뉴클레오티드 자체의 수소 결합을 이용하여 상보적으로 결합시켜서 에스아이알엔에이의 다중 접합체를 제조한 경우를 나타낸 것이다.
도 2는 센스와 안티센스 모두 3′말단이 설프하이드릴기로 치환된 센스 가닥 에스아이알엔에이와 안티센스 가닥 에스아이알엔에이를 수소 결합을 이용하여 이중가닥의 에스아이알엔에이를 준비 후, (A) 가교제인 DTME를 이용하여 혹은 (B) 가교제인 BM(PEG)2를 이용하여 각각 에스아이아엔에이 다중 접합체 제조(도 1 A 방법으로) 후, 전기 영동을 통한 관찰결과를 나타낸다.
도 3의 (A)는 센스와 안티센스 모두 3′말단이 설프하이드릴기로 치환된 이중 가닥의 에스아이알엔에이를 이용하여 에스아이알엔에이의 다중 접합체를 제조한 후 전기 영동을 통해 관찰한 것을 나타내며, (B)는 3′말단이 설프하이드릴기로 치환된 센스 가닥과 안티센스 가닥의 에스아이알엔에이를 가교제를 사용하여 2중량체 제조한 후, 제조된 이중량체를 상보적으로 결합시켜서 에스아이알엔에이의 다중 접합체를 제조한 후 전기 영동을 통해 관찰한 것을 나타내며, (C) 및 (D)는 3′말단이 설프하이드릴기로 치환된 센스 가닥의 에스아이알엔에이와 안티센스 가닥의 에스아이알엔에이를 각각 분해성 공유결합인 이황화결합(C)나 비분해성 공유결합(D)로 연결할 수 있는 가교제를 사용하여 2중량체의 센스 가닥 에스아이알엔에이와 안티센스 가닥의 에스아이알엔에이를 제조한 후 전기 영동을 통해 제조된 2중량체를 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 도 1 A 및 도 1 B의 방법을 이용하여 제조된 GFP 유전자에 대한 에스아이알엔에이 다중 접합체와 기존의 에스아이알엔에이를 각각 양이온성 유전자 전달체인 linear PEI를 이용하여 NP ratio 20에서 복합체를 형성한 후, GFP단백질을 안정적으로 발현하는 암세포주인 MDA-MB-435에 처리하여 세포의 GFP 발현을 저해하는 정도를 정량적으로 비교 분석한 것이다.
도 5는 제조된 에스아이알엔에이의 다중 접합체(도 1 B의 방법으로 제조된)와 기존의 에스아이알엔에이(Naked)를 각각 양이온성 유전자 전달체인 linear PEI를 사용하여 NP ratio 2와 10에서 이온 복합체를 형성한 후, 그 모양과 크기를 AFM(atomic force microscopy)를 통해 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 제조된 에스아이알엔에이의 다중 접합체(도 1 B의 방법으로 제조된)와 기존의 에스아이알엔에이(Naked)를 각각 양이온성 유전자 전달체인 linear PEI를 사용하여 NP ratio별로 이온 복합체를 형성한 후, 전기 영동을 통하여 이온 복합체의 형성 정도를 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 VEGF(Vascular endothelial growth factor)를 저해하는 에스아이알엔에이를 이용하여 분해성 공유결합인 이황화결합(cleavable) 이나 비분해성 공유 결합(noncleavable)으로 연결된 다중 접합체(multi-siRNA)를 제조(도 1 B의 방법으로 제조된)한 후, 기존의 에스아이알엔에이(Naked)와 유전자 저해 효율을 비교한 것을 나타낸 것이다. 유전자 전달체로는 linear PEI를 사용하여 에스아이알엔에이의 농도별(A)과 NP ratio 별(B)로 유전자 저해 효율 정도를 ELISA 실험을 통해 VEGF 단백질의 양을 정량함으로써 비교한 것을 나타낸 것이다. (C)는 각각의 유전자 저해 효율 정도를 RT-PCR을 통해 mRNA양을 비교 함으로써 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 8의 (A)는 에스아이알엔에이 다중 접합체를 제조(도 1 B의 방법으로 제조된)한 후, 에스아이알엔에이 개수에 따라 각각을 분리한 후 전기 영동을 통해 분리 된 것을 확인한 것을 나타내며, (B)는 에스아이알엔에이 개수에 따라 분리된 다중 접합체 에스아이알엔에이 각각의 유전자 저해 효율 정도를 ELISA 실험을 통해 VEGF 단백질의 양을 정량함으로써 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 9는 제조된 에스아이알엔에이 다중 접합체(도 1 B의 방법으로 제조된)로 인한 인터페론-알파(IFN-α) 유도 정도를 확인한 실험을 나타낸 것이다. (A)는 혈액에서 분리된 단핵구 세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cell)에 기존의 에스아이알엔에이와 이황화결합(cleavable)이나 공유결합(noncleavable)으로 연결된 다중 중합체 에스아이알엔에이를 세 가지의 양이온성 유전자 전달체인 Linear PEI, Jet-PEI, DOTAP을 사용하여 이온 복합체를 형성한 후 유전자 도입을 시킨 후 세포에서 방출된 인터페론-알파의 양을 ELISA를 통해 정량한 것을 나타내며, (B)는 기존의 에스아이알엔에이와 분해성 이황화결합(cleavable)이나 비분해성 공유결합(noncleavable)으로 연결된 다중 접합체 에스아이알엔에이를 양이온성 유전자 전달체인 Linear PEI와 이온 복합체를 형성한 후 ICR 마우스에 정맥 주사를 통해 주입한 뒤, 혈액에서 방출된 인터페론-알파의 양을 ELISA를 통해 정량한 것을 나타낸 것이다.

Claims (21)

  1. 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 연결시킨 하기 (1)의 구조식을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체.
    (-X-)n...구조식(1)
    (상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, n은 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체의 개수이다.)
  2. 제1항에 있어서, 상기 이중가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체는 15 내지 29의 핵산 염기수를 가지는 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이중가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체의 개수 n은 1~100임을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체.
  4. 이중가닥 센스/안티센스(sense/antisense) 에스아이알엔에이(siRNA) 단량체를 직접 또는 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계를 포함하여 제조된 하기 (1)의 구조식을 가지는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
    (-X-)n...구조식(1)
    (상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, n은 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체의 개수이다.)
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제조방법은 말단이 동일한 관능기로 치환된 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체(yx + x′y)를 상보적 수소 결합을 통해 yXy로 만드는 단계; 및
    상기 yXy를 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
    (상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, x와 x′은 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체, y는 말단에 도입된 관능기이다.)
  6. 제4항에 있어서,
    상기 제조방법은 말단이 동일한 관능기로 치환된 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체 각각(yx 와 x′y)을 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시켜 이중량체인 xyyx 와 x′yyx′로 만드는 단계; 및
    상기 이중량체인 xyyx 와 x′yyx′을 상보적 수소 결합시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
    (상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, x와 x′은 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체, y는 말단에 도입된 관능기이다.)
  7. 제4항에 있어서,
    상기 제조방법은 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체(yx + x′z)를 상보적 수소 결합을 통해 yXz로 만드는 단계; 및
    상기 yXz를 가교제나 고분자를 매개로 공유결합시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
    (상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, x와 x′은 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체, y와 z는 말단에 도입된 관능기이다.)
  8. 제4항에 있어서,
    상기 제조방법은 말단이 서로 다른 관능기로 치환된 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체(yx 와 xz, x′y와 x′z) 각각을 가교제 혹은 고분자를 매개로 공유결합시켜 이중량체인 xyzx와 x′yzx′로 만드는 단계; 및
    상기 이중량체인 xyzx와 x′yzx′을 상보적 수소 결합시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
    (상기에서, X는 이중가닥 에스아이알엔에이 단량체, x와 x′은 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체, y와 z는 말단에 도입된 관능기이다.)
  9. 제4항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서,
    상기 공유결합은 비분해성인 아마이드 결합, 우레탄 결합; 산분해성인 에스터 결합, 하이드라존 결합, 아세탈 결합; 환원제 분해성인 이황화 결합; 생분해성 결합; 및 효소 분해성 결합;으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 공유결합인 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  10. 제4항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체의 말단인 하이드록시기(-OH) 대신에 치환된 관능기는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH) 및 아민기(-NH2) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 관능기임을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  11. 제4항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일가닥 센스/안티센스 에스아이알엔에이 단량체는 3′혹은 5′말단이 모두 관능기로 치환되어, 제조된 것임을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  12. 제4항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서,
    상기 공유 결합의 매개로 사용되는 고분자는 PEG, 플루로닉(Pluronic), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 및 폴리옥사졸린(polyoxazolin)로 이루어진 군 에서 선택된 어느 하나 이상의 비이온성 친수성 고분자; 또는 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-글리콜산 (poly-glycolic acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic-co-glycolic acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-카프로락톤(polycaprolactone), 폴리-발레로락톤(polyvalerolactone), 폴리-하이드록시 부티레이트(polyhydroxybutyrate) 및 폴리-하이드록시 발러레이트(polyhydroxyvalerate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생분해성 폴리에스테르계 고분자;인 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  13. 제4항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서,
    상기 가교제는 분자량이 100~10000이 되는 것으로 DTME(Dithio-bis-maleimidoethane), BM(PEG)2(1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol), 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페일아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide) 및 하이드로시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  14. 제4항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서,
    상기 에스아이알엔에이 다중 접합체 말단에 세포 선택적 리간드가 더 구비되어지는 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 더 구비되어지는 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 엽산(folic acid), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 알지디(RGD) 및 트렌스페린(transferrin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  16. 제4항 내지 제8항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서,
    상기 에스아이알엔에이가 갖는 관능기를 활성화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 에스아이알엔에이가 갖는 관능기를 활성화시키는 물질은 1-에틸-3, 3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl carbodiimide), 이미다졸(imidazole), N-하이드로실숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 디클로로헥실카보디이미드(dichlorohexylcarbodiimide), N-β-말레이미도프로피오닉엑시드(N-β- Maleimidopropionic acid), N-β-말레이미도프로필로실 숙신이미드에스터(N-β-maleimidopropyl succimimide ester) 및 N-숙신이미딜피리딜다이싸이오 프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 에스아이알엔에이 다중 접합체의 제조방법.
  18. 에스아이알엔에이 다중 접합체;와 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 양이온성 유전자 전달체; 간의 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 형성되는 이온 복합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 양이온성 펩타이드는 KALA(cationic fusogenic peptide), 폴리라이신(polylysine), 폴리글루타믹엑시드(polyglutamic acid) 및 프로타민(portamine)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이온 복합체.
  20. 제18항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 다이올레일 포스페티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine) 또는 콜레스테롤 다이올레일 포스페티딜콜린(cholesterol dioleoyl phosphatidyl choline) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이온 복합체.
  21. 제18항에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이 민(polyethylenimine), 폴리아민(polyamines) 및 폴리비닐아민(polyvinylamine)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이온 복합체.
KR1020090021705A 2009-03-13 2009-03-13 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법 KR101141544B1 (ko)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090021705A KR101141544B1 (ko) 2009-03-13 2009-03-13 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법
EP09731474.4A EP2407539B1 (en) 2009-03-13 2009-04-29 MULTIMERIC siRNA AND PREPARATION METHOD THEREFOR
US12/514,306 US8580946B2 (en) 2009-03-13 2009-04-29 Multi-conjugate of siRNA and preparing method thereof
EP17150172.9A EP3196306A1 (en) 2009-03-13 2009-04-29 Multimeric sirna and preparation method therefor
PCT/KR2009/002252 WO2010104237A1 (ko) 2009-03-13 2009-04-29 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법
US14/048,951 US9255269B2 (en) 2009-03-13 2013-10-08 Multi-conjugate of siRNA and preparing method thereof
US14/312,530 US9644209B2 (en) 2009-03-13 2014-06-23 Multi-conjugate of siRNA and preparing method thereof
US15/483,528 US20180080028A1 (en) 2009-03-13 2017-04-10 Multi-conjugate of sirna and preparing method thereof
US16/040,795 US10597659B2 (en) 2009-03-13 2018-07-20 Multi-conjugate of SiRNA and preparing method thereof
US16/781,766 US20200239892A1 (en) 2009-03-13 2020-02-04 Multi-conjugate of sirna and preparing method thereof
US17/945,842 US11859184B2 (en) 2009-03-13 2022-09-15 Multi-conjugate of siRNA and preparing method thereof
US18/509,130 US20240150766A1 (en) 2009-03-13 2023-11-14 Multi-conjugate of sirna and preparing method thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090021705A KR101141544B1 (ko) 2009-03-13 2009-03-13 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100103206A true KR20100103206A (ko) 2010-09-27
KR101141544B1 KR101141544B1 (ko) 2012-05-03

Family

ID=42728507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090021705A KR101141544B1 (ko) 2009-03-13 2009-03-13 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법

Country Status (4)

Country Link
US (8) US8580946B2 (ko)
EP (2) EP3196306A1 (ko)
KR (1) KR101141544B1 (ko)
WO (1) WO2010104237A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014208973A1 (ko) * 2013-06-24 2014-12-31 건국대학교 산학협력단 다중 리간드가 도입된 에스아이알엔에이 접합체 및 그 제조방법
KR101495298B1 (ko) * 2013-02-20 2015-02-25 한국과학기술원 소간섭 리보핵산(siRNA)를 친수성 블록으로 갖는 양친매성 블록 공중합체 및 이를 포함하는 다중이온복합체

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101141544B1 (ko) 2009-03-13 2012-05-03 한국과학기술원 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법
KR101184928B1 (ko) * 2009-05-14 2012-09-20 한국과학기술연구원 작은 올리고뉴클레오티드의 중합 방법 및 상기 중합 방법에 의하여 제조된 고분자 올리고뉴클레오티드의 용도
KR101590586B1 (ko) * 2011-05-30 2016-02-01 성균관대학교산학협력단 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ｒｎａ
US8709332B2 (en) 2011-07-20 2014-04-29 Nike, Inc. Thermoforming sheet loading apparatus and method
KR20180039621A (ko) 2015-06-15 2018-04-18 엠펙 엘에이, 엘엘씨 정의된 다중 접합체 올리고뉴클레오티드
DE102015008536A1 (de) * 2015-07-02 2017-01-05 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Diskontinuierliche Oligonukleotid-Liganden
US10478503B2 (en) 2016-01-31 2019-11-19 University Of Massachusetts Branched oligonucleotides
WO2018013640A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 University Of Massachusetts Process of delivering small rnas to sperm
WO2018031933A2 (en) 2016-08-12 2018-02-15 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
EP3576752A4 (en) 2017-02-06 2020-12-16 Mpeg La, LLC MULTIMERIC OLIGONUCLEOTIDES WITH REDUCED RENAL CLEARANCE
KR20210093227A (ko) 2018-08-10 2021-07-27 유니버시티 오브 매사추세츠 Snp를 표적화하는 변형된 올리고뉴클레오티드
CA3132505A1 (en) * 2019-03-04 2020-09-10 Mpeg La, L.L.C. Multimeric oligonucleotides with enhanced bioactivity
KR20230012527A (ko) * 2020-05-19 2023-01-26 엠펙 엘에이, 엘.엘.씨. 직교 연결된 다량체성 올리고뉴클레오타이드
EP4359539A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 University Of Massachusetts Optimized anti-flt1 oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders
WO2023185946A1 (zh) * 2022-03-30 2023-10-05 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种寡核苷酸缀合物、含有该寡核苷酸缀合物的组合物及制备方法和用途

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9207381D0 (en) 1992-04-03 1992-05-13 Ici Plc Synthesis of oligonucleotides
WO2004030634A2 (en) 2002-10-02 2004-04-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions
EP1605978B1 (en) 2003-03-07 2010-09-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions
US8969543B2 (en) * 2003-04-03 2015-03-03 Bioneer Corporation SiRNA-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of siRNA and method thereof
JP2006522158A (ja) 2003-04-03 2006-09-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ｉＲＮＡ複合体
CA2521464C (en) 2003-04-09 2013-02-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna conjugates
AU2004230927B9 (en) * 2003-04-13 2011-12-01 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric oligonucleotide prodrugs
AU2004232964B2 (en) 2003-04-17 2011-09-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Protected monomers
EP2664672A1 (en) 2003-04-17 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US7851615B2 (en) * 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
PL1807520T3 (pl) * 2004-10-25 2013-01-31 Devgen Nv Konstrukty do RNA
ES2564303T3 (es) 2006-04-07 2016-03-21 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compuestos de ARN inmunomodulador estabilizado (SIMRA) para TLR7 y TLR8
WO2008094254A2 (en) * 2007-01-26 2008-08-07 City Of Hope Methods and compositions for the treatment of cancer or other diseases
US20080287383A1 (en) * 2007-03-02 2008-11-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb gene expression and uses thereof
US20080311040A1 (en) * 2007-03-06 2008-12-18 Flagship Ventures METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVED THERAPEUTIC EFFECTS WITH siRNA
CN102921003B (zh) 2007-07-09 2014-11-26 艾德拉药物股份有限公司 稳定化免疫调控性rna(simra)化合物
EP3604533A1 (en) 2008-04-11 2020-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
EP2323695B1 (en) 2008-08-19 2018-12-05 Nektar Therapeutics Complexes of small-interfering nucleic acids
US8637194B2 (en) 2008-09-02 2014-01-28 Bio-Nano Power, Llc Bio-nano power cells and their uses
JP5645840B2 (ja) 2008-12-02 2014-12-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ リン原子修飾核酸の合成方法
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
KR101141544B1 (ko) 2009-03-13 2012-05-03 한국과학기술원 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법
WO2011031520A1 (en) 2009-08-27 2011-03-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
KR101678876B1 (ko) 2010-01-15 2016-11-23 한국과학기술원 복합 유전자를 표적하는 ｓｉＲＮＡ 다중 접합체 및 이의 제조방법
SI2539451T1 (sl) 2010-02-24 2016-04-29 Arrowhead Research Corporation Sestavki za ciljano dostavo sirna
EP2542247A4 (en) 2010-03-01 2014-05-07 Philadelphia Children Hospital NUCLEIC ACID FOR ADDRESSING MULTIPLE REGIONS OF THE HCV GENOM
JP6128529B2 (ja) 2011-07-19 2017-05-17 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． 官能化核酸の合成のための方法
KR101340290B1 (ko) 2011-09-14 2013-12-11 한국과학기술원 유전자 표적용 ｓｉＲＮＡ 하이드로젤 및 그 제조방법
US9580708B2 (en) 2011-09-14 2017-02-28 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotides compounds
WO2014043544A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
KR101629681B1 (ko) 2013-06-24 2016-06-14 건국대학교 산학협력단 다중 리간드가 도입된 에스아이알엔에이 접합체
EP2845607A1 (en) 2013-09-09 2015-03-11 University of Vienna Antisense oligonucleotides with improved pharmacokinetic properties
AU2014362262B2 (en) 2013-12-12 2021-05-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component iRNA compositions and methods of use thereof
JP2017505623A (ja) 2014-01-30 2017-02-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 生物切断性コンジュゲートを有するポリオリゴマー化合物
KR20180039621A (ko) 2015-06-15 2018-04-18 엠펙 엘에이, 엘엘씨 정의된 다중 접합체 올리고뉴클레오티드
WO2017075030A1 (en) 2015-10-26 2017-05-04 Rana Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing smn expression
IL294411A (en) 2016-01-05 2022-08-01 Omeros Corp masp-2 suppressors for use in suppressing fibrosis
EP3576752A4 (en) 2017-02-06 2020-12-16 Mpeg La, LLC MULTIMERIC OLIGONUCLEOTIDES WITH REDUCED RENAL CLEARANCE
CN111741967A (zh) 2017-11-30 2020-10-02 深圳市真迈生物科技有限公司 核苷类似物、制备方法及应用
CA3144467A1 (en) 2019-07-30 2021-02-04 Jonathan Miles Brown Subcutaneous delivery of multimeric oligonucleotides with enhanced bioactivity
KR20230012527A (ko) 2020-05-19 2023-01-26 엠펙 엘에이, 엘.엘.씨. 직교 연결된 다량체성 올리고뉴클레오타이드

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101495298B1 (ko) * 2013-02-20 2015-02-25 한국과학기술원 소간섭 리보핵산(siRNA)를 친수성 블록으로 갖는 양친매성 블록 공중합체 및 이를 포함하는 다중이온복합체
WO2014208973A1 (ko) * 2013-06-24 2014-12-31 건국대학교 산학협력단 다중 리간드가 도입된 에스아이알엔에이 접합체 및 그 제조방법
KR20150000563A (ko) * 2013-06-24 2015-01-05 건국대학교 산학협력단 다중 리간드가 도입된 에스아이알엔에이 접합체

Also Published As

Publication number Publication date
US9644209B2 (en) 2017-05-09
US20110044931A1 (en) 2011-02-24
WO2010104237A1 (ko) 2010-09-16
US9255269B2 (en) 2016-02-09
EP2407539B1 (en) 2017-01-04
US10597659B2 (en) 2020-03-24
US20240150766A1 (en) 2024-05-09
US20190185861A1 (en) 2019-06-20
US20140309281A1 (en) 2014-10-16
EP2407539A4 (en) 2012-08-15
US8580946B2 (en) 2013-11-12
EP2407539A1 (en) 2012-01-18
US20140039038A1 (en) 2014-02-06
US11859184B2 (en) 2024-01-02
EP3196306A1 (en) 2017-07-26
US20150197754A9 (en) 2015-07-16
KR101141544B1 (ko) 2012-05-03
US20200239892A1 (en) 2020-07-30
US20230070118A1 (en) 2023-03-09
US20180080028A1 (en) 2018-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101141544B1 (ko) 에스아이알엔에이 다중 접합체 및 이의 제조방법
Mok et al. Multimeric small interfering ribonucleic acid for highly efficient sequence-specific gene silencing
De Martimprey et al. Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids: oligonucleotides and siRNA
KR101255149B1 (ko) 금속 나노 입자 기반 핵산 전달용 조성물 및 이의 제조방법
KR101678876B1 (ko) 복합 유전자를 표적하는 ｓｉＲＮＡ 다중 접합체 및 이의 제조방법
CN108026527A (zh) 确定的多偶联寡核苷酸
Lee et al. Dual gene targeted multimeric siRNA for combinatorial gene silencing
JP2009504179A (ja) ｓｉＲＮＡの細胞内伝達のためのｓｉＲＮＡと親水性高分子との間の接合体、及びその製造方法
JP2008527993A (ja) 特異性及び送達の改善のためのｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子又はアンチセンス分子及び機能的実体を含む複合体
Wang et al. Synthetic α-l-Threose nucleic acids targeting BcL-2 show gene silencing and in Vivo antitumor activity for cancer therapy
EP2462938B1 (en) Anionic polymer, polyion complex and ternary polymer composite using anionic polymer, and pharmaceutical composition
JP5252622B2 (ja) 高いヌクレアーゼ耐性と優れたｒｎａ干渉効果を発現可能な二本鎖ｒｎａ
KR101183989B1 (ko) 세포내 유전자 전달용 복합체, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 세포내로의 유전자 전달 방법
Detzer et al. Phosphorothioate-stimulated uptake of siRNA by mammalian cells: a novel route for delivery
Mun et al. Efficient self-assembled microRNA delivery system consisting of cholesterol-conjugated microRNA and PEGylated polycationic polymer for tumor treatment
JP4900943B2 (ja) ヌクレアーゼ耐性及びｒｎａ干渉効果に優れた修飾型二本鎖ｒｎａ
KR101533059B1 (ko) 롤링 서클 트랜스크립션에 의한 siRNA 다량체의 제조방법 및 상기 방법에 의하여 제조된 siRNA 다량체
KR102170266B1 (ko) 다당류 고분자-siRNA 그라프트 접합체, 이를 포함하는 siRNA 전달체 및 이의 제조방법
Ke Functional nucleic acid nanoparticles and their delivery
KR101780272B1 (ko) siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도
Yoon et al. Y-shaped oligonucleotides: a promising platform for enhanced therapy with siRNA and CpG Oligodeoxyribonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150422

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160425

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170417

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180406

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190410

Year of fee payment: 8