KR101340290B1 - 유전자 표적용 ｓｉＲＮＡ 하이드로젤 및 그 제조방법 - Google Patents

유전자 표적용 ｓｉＲＮＡ 하이드로젤 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 및 그 제조방법이 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]를 포함하는 3차원 망상구조의 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤이 제공될 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112011071268235-pat00013
[구조식 2]
Figure 112011071268235-pat00014

Description

유전자 표적용 ｓｉＲＮＡ 하이드로젤 및 그 제조방법{NANOSTRUCTURED siRNA HYDROGELS FOR GENE SILENCING AND PREPARING METHOD THEREOF}
본 발명은 siRNA 하이드로젤 및 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전자 표적을 위해 나노 구조화되어 제조되는 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 및 그 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA, 이하 siRNA)는 19 내지 27개의 핵산으로 구성되는 짧은 이중나선 구조를 가지며, 센스 가닥과 동일한 염기서열을 갖는 메신저 RNA(messenger RNA, 이하 mRNA)를 표적으로 삼아 RNA유도침묵복합체(RNA induced silencing complex, RISC)가 결합된 상기 mRNA를 분해함으로써 해당 유전자의 발현을 저해하는 것으로 알려져 있다(Dykxhoorn, D., M. and Lieberman, J. (2006) Knocking down disease with siRNAs. Cell, 126, 231-235).
이러한 siRNA는 적은 양으로도 정확하게 표적 mRNA 발현을 억제하는 효과를 지니므로, siRNA를 유전자 관련 질병치료에 이용하고자 하는 시도가 매우 활발히 진행되고 있는 실정이다.
그러나, siRNA는 생체내에서의 안정성이 매우 낮아 쉽게 분해되므로 화학적/생물학적으로 불안정성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 음이온성을 지니므로 세포막을 투과하기가 어려워 실제 임상치료에 적용이 어렵다는 문제가 있었다.
상술한 문제점을 해결하기 위하여, 종래에는 siRNA를 양이온 펩타이드, 지질 분자 또는 고분자와 같은 양이온성 유전자 전달체와 이온 결합시켜 나노 크기의 이온복합체를 형성시키는 방법이 이용되어 왔다. 이는 siRNA를 분해 효소로부터 보호하고 음이온성을 갖는 세포막과 상호작용하게 함으로써, 세포 내 전달 효율성을 효과적으로 증가시키기 위함이다.
그러나, siRNA은 낮은 분자량을 가지고 있을 뿐만 아니라(대략, 15000 달톤 이하) 짧고 뻣뻣한 이중가닥 구조를 가지고 있으므로, 상기 이온복합체 형성을 위해서는 강한 양이온성 유전자 전달체를 사용하여야만 하였고 이는 비특이적인 세포 독성을 증가시키는 문제점을 야기하였다.
한편, 하이드로젤(Hydrogels)은 수용성 고분자가 물리적(수소결합, 소수성 상호작용, 반데르 발스 힘등) 또는 화학적(공유결합)으로 결합하여 3차원의 가교중합을 형성하여 망상구조를 갖는다. 이러한 하이드로젤 구조는 높은 함수율(water content)을 가지고 생체에 적합한 물리화학적 성질을 지니므로, 의학 및 약물학 분야에서 주목 받고 있다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 siRNA를 안정적이고 효율적으로 세포내로 전달할 수 있도록 하이드로젤 구조를 이용하는 방법을 강구하게 되었다.
본 발명의 실시예들은 유전자를 안정적이고 효율적으로 세포내로 전달할 수 있는 3차원 망상구조의 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤과 양이온성 유전자 전달체를 이온결합시켜 제조되고 유전자 치료제 전달체로 기능하는 이온복합체 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 [구조식 1] 또는 하기 [구조식 2]를 포함하는 3차원 망상구조의 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤이 제공될 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112011071268235-pat00001
[구조식 2]
Figure 112011071268235-pat00002
(여기에서 X1,X2 및 X3은 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체이고, Y1,Y2 및 Y3은 말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 나타냄. 한편, A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자임. n은 1 이상의 정수를 나타냄).
또한, 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 센스 siRNA 단량체 및 안티센스 siRNA 단량체는 13 내지 60의 핵산 염기수를 가질 수 있다.
또한, 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 제1 관능기 및 제2 관능기는 동일하거나 서로 다른 관능기로, 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 히드록시기(-OH), 포르밀기(-CHO), 카르보닐기(-CO-), 에테르기(-O-), 에스테르기(-COO-), 니트로기(-NO2), 아자이드기(-N2), 설폰산기(-SO3H)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 관능기일 수 있다.
또한, 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 가교제는 100 내지 10000 달톤(Dalton)의 분자량을 가지고, 디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜{1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM(PEG)2}, 트리스-2-말레이미도에틸-아민{Tris-(2-maleimidoethyl)-amine, TMEA), 트리-석신이미딜 아미노트리아세테이트 (Tri-succinimidyl aminotriacetate, TSAT) 및 3-암-폴리에틸렌 글리콜 {Poly(ethylene glycol), 3-arm-PEG}, 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페닐아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide) 및 하이드록시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 고분자는, PEG(polyethylene glycol), 플루로닉(Pluronic), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 및 폴리옥사졸린(polyoxazolin) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 비이온성 친수성 고분자; 또는 폴리-D,L-락트산(poly-D,L-lactic acid), 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-D-락트산(poly-D-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycolic acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic-co-glycolic acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-카프로락톤(polycaprolactone), 폴리-발레로락톤(polyvalerolactone), 폴리-하이드록시 부티레이트(polyhydroxybutyrate) 및 폴리-하이드록시 발러레이트(polyhydroxyvalerate) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 생분해성 폴리에스테르계 고분자;일 수 있다.
또한, 상기 siRNA 하이드로젤은 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 말단에 구비되는 세포 선택적 리간드를 더 포함하고, 상기 세포 선택적 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 유전자 앱타머(aptamer), 세포성장인자, 엽산(folic acid), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid) 및 트렌스페린(transferrin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤은 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 제1 관능기 및 제2 관능기를 활성화시키는 관능기 활성제를 더 포함하고, 상기 관능기 활성제는 1-에틸-3, 3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl carbodiimide), 이미다졸(imidazole), N-하이드로실숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 디클로로헥실카보디이미드(dichlorohexylcarbodiimide), N-β-말레이미도프로피오닉엑시드(N-β-Maleimidopropionic acid), N-β-말레이미도프로필로실 숙신이미드에스터(N-β-maleimidopropyl succimimide ester) 및 N-숙신이미딜피리딜다이싸이오 프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체를 하기 [구조식 3]과 같이 제1 연결하여 센스 siRNA 다중 접합체를 제조하는 제1 단계; 말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 하기 [구조식 4]와 같이 제2 연결하여 안티센스 siRNA 다중 접합체를 제조하는 제2 단계; 및 상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 상기 안티센스 siRNA 다중 접합체를 결합시켜 3차원 망상구조의 siRNA 하이드로젤을 제조하는 제3 단계를 포함하는 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법이 제공될 수 있다.
[구조식 3]
Figure 112011071268235-pat00003
(여기에서 X1,X2 및 X3은 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체를 나타냄. 한편, A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자임. n은 상기 단량체의 개수로 1 이상의 정수를 나타냄).
[구조식 4]
Figure 112011071268235-pat00004
(여기에서 Y1,Y2 및 Y3은 말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 나타냄. 한편, A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자임. n은 상기 단량체의 개수로 1 이상의 정수를 나타냄).
또한, 상기 제3 단계에서 상기 다중 접합체들의 결합은, 상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 안티센스 siRNA 다중 접합체가 단일가닥인 경우에는 상보적 수소 결합이고, 상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 안티센스 siRNA 다중 접합체가 이중가닥인 경우에는 직접 공유결합, 상기 가교제를 매개로 하는 공유결합 또는 상기 고분자를 매개로 하는 공유결합일 수 있다.
또한, 상기 가교제를 매개로 하는 공유결합 또는 상기 고분자를 매개로 하는 공유결합은, 비분해성인 아마이드 결합, 우레탄 결합; 산분해성인 에스터 결합, 하이드라존 결합, 아세탈 결합; 환원제 분해성인 이황화 결합; 생분해성 결합; 및 효소 분해성 결합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 공유결합일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤; 및 상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤과 이온결합하는 양이온성 유전자 전달체를 포함하고, 상기 양이온성 유전자 전달체는 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 이온복합체가 제공될 수 있다.
또한, 상기 양이온성 펩타이드는 KALA(cationic fusogenic peptide), 폴리라이신(polylysine) 및 프로타민(protamine)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드, 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판, 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸-암모니오)부탄오일-sn-글리세롤, 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판, 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판, 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸포스포콜린, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리아민, 폴리비닐아민, 폴리(알킬아민 하이드로클로라이드), 폴리아미도아민 덴드리머, 디에틸아미노에틸-덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카이토산 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 제조되는 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤을 준비하는 제 1단계; 및 상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤을 희석시킨 후, 양이온성 유전자 전달체를 첨가하는 제 2단계를 포함하는 이온복합체 제조방법이 제공될 수 있다.
또한, 상기 양이온성 유전자 전달체의 첨가량은, 상기 양이온성 유전자 전달체의 양전하와 상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤의 음전하의 전하 비가 1:1 내지 200:1 범위에서 결정될 수 있다.
본 발명의 실시예들은 siRNA를 3차원 망상구조를 갖도록 결합하여 양이온성 유전자 전달체와의 이온성 결합력을 증가시킴으로써, 강한 양이온성 유전자 전달체 사용시 발생하는 세포 독성 문제를 완화 또는 방지할 수 있다.
또한, siRNA만을 이용하여 siRNA 하이드로젤을 제조함으로써, 생체적합성이 뛰어날 뿐만 아니라 siRNA의 기능을 저해하지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법에 관한 모식도이다.
도 2는 siRNA 하이드로젤을 15% PAGE에 전기영동한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 siRNA 하이드로젤의 AFM 분석 사진이다.
도 4는 종래 siRNA 이온복합체와 도 3의 siRNA 하이드로젤 이온복합체의 AFM 분석 사진이다.
도 5는 측정된 GFP양을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤(이하, siRNA 하이드로젤)의 구조 및 구성에 대하여 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 siRNA 하이드로젤은 하기 [구조식 1] 또는 [구조식 2]를 포함하며, 3차원 망상구조를 갖는다.
[구조식 1]
Figure 112011071268235-pat00005
[구조식 2]
Figure 112011071268235-pat00006
[구조식 1] 및 [구조식 2]에서 X1, X2 및 X3은 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체이고, Y1, Y2 및 Y3은 말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 나타낸다. 또한, X1, X2 및 X3이 안티센스 siRNA 단량체이고, Y1, Y2 및 Y3이 센스 siRNA 단량체인 경우도 가능하다. 다만, 이하에서는 설명의 편의를 위해서 X1, X2 및 X3이 센스 siRNA 단량체이고, Y1, Y2 및 Y3이 안티센스 siRNA 단량체인 경우를 중심으로 설명하도록 한다.
[구조식 1] 및 [구조식 2]에서 A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자를 나타낸다. 또한, n은 1 이상의 정수를 나타낸다.
센스 siRNA 단량체 및 안티센스 siRNA 단량체는 단일가닥 또는 이중가닥으로 구성될 수 있으며, 13 내지 60의 핵산 염기수를 가질 수 있다.
여기에서 상기 siRNA는 치료용 또는 연구용으로 사용되는 siRNA인 이상, 특정 종류로 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 siRNA는 c-myc, c-myb, c-fos, c-jun, bcl-2 혹은 VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF 등일 수 있다. 또한, 상기 siRNA의 올리고 가닥은 500 내지 50,000 달톤의 분자량을 가질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
[구조식 1] 및 [구조식 2]에서 상기 센스 siRNA 단량체의 말단에는 제1 관능기가 도입될 수 있으며, 상기 안티센스 siRNA 단량체의 말단에는 제2 관능기가 도입될 수 있다. 여기에서 상기 '말단'은 상기 siRNA 단량체의 3' 및/또는 5'말단기를 의미한다.
상기 제1 관능기 및 제2 관능기는 동일한 관능기이거나, 서로 다른 관능기 일 수 있다. 또한, 상기 제1 관능기 및 제2 관능기는 설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 히드록시기(-OH), 포르밀기(-CHO), 카르복시기(-COOH), 카그보닐기(-CO-), 에테르 결합(-O-), 에스테르 결합(-COO-), 니트로기(-NO2), 아자이드(-N3), 설폰산(-SO3H) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 관능기일 수 있다.
[구조식 1] 및 [구조식 2]의 A는 있거나 없을 수 있으며, A가 없는 경우에는 센스 siRNA 단량체 또는 안티센스 siRNA 단량체는 말단에 도입된 관능기끼리 직접 공유결합함으로써, 다중 접합체를 이룰 수 있다.
상기 A가 가교제인 경우에 센스 siRNA 단량체 또는 안티센스 siRNA 단량체는 상기 가교제를 매개로 한 공유결합을 통해 다중 접합체를 이룰 수 있다. 여기에서 상기 가교제는 100 내지 10000 달톤(Dalton)의 분자량을 가지고, 디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜{1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM(PEG)2}, 트리스-2-말레이미도에틸-아민{Tris-(2-maleimidoethyl)-amine, TMEA), 트리-석신이미딜 아미노트리아세테이트 (Tri-succinimidyl aminotriacetate, TSAT) 및 3-암-폴리에틸렌 글리콜 {Poly(ethylene glycol), 3-arm-PEG}, 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페닐아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide) 및 하이드록시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 A가 고분자인 경우에는 센스 siRNA 단량체 또는 안티센스 siRNA 단량체는 상기 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 다중 접합체를 이룰 수 있다. 여기에서 상기 고분자는 PEG(polyethylene glycol), 플루로닉(Pluronic), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 폴리옥사졸린(polyoxazolin) 및 그 공중합체등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 비이온성 친수성 고분자; 또는 폴리-D,L-락트산(poly-D,L-lactic acid), 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-D-락트산(poly-D-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycolic acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic-co-glycolic acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-카프로락톤(polycaprolactone), 폴리-발레로락톤(polyvalerolactone), 폴리-하이드록시 부티레이트(polyhydroxybutyrate), 폴리-하이드록시 발러레이트(polyhydroxyvalerate) 및 그 공중합체 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 생분해성 폴리에스테르계 고분자일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 siRNA 하이드로젤은 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 말단에 구비되는 세포 선택적 리간드를 더 포함할 수 있다.
상기 세포 선택적 리간드는 이황화결합(disulfide bone), 아마이드 결합(amide bond) 또는 에스테르결합(ester bond)등의 공유결합, 또는 biotin-streptavidin, metal-ligand complex 등의 비공유결합을 통해 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 말단에 도입될 수 있다.
또한, 상기 세포 선택적 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 유전자 앱타머(aptamer), 세포성장인자, 엽산(folic acid), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid) 및 트렌스페린(transferrin) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 siRNA 하이드로젤은 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 제1 관능기 및 제2 관능기를 활성화시키는 관능기 활성제를 더 포함할 수 있다.
상기 관능기 활성제는 1-에틸-3, 3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl carbodiimide), 이미다졸(imidazole), N-하이드로실숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 디클로로헥실카보디이미드(dichlorohexylcarbodiimide), N-β-말레이미도프로피오닉엑시드(N-β-Maleimidopropionic acid), N-β-말레이미도프로필로실 숙신이미드에스터(N-β-maleimidopropyl succimimide ester) 및 N-숙신이미딜피리딜다이싸이오 프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법에 대하여 설명하도록 한다.
제1 단계
본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조 방법은 우선, 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체를 하기 [구조식 3]과 같이 제1 연결하여 센스 siRNA 다중 접합체를 제조한다.
[구조식 3]
Figure 112011071268235-pat00007
상기 [구조식 3]에서 X1, X2, X3은 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체를 나타낸다. 상기 센스 siRNA 단량체 및 상기 제1 관능기에 대해서는 전술하였으므로, 별도의 설명은 생략하도록 한다.
상기 [구조식 3]에서 A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자를 나타낸다.
A가 없는 경우에는, 상기 센스 siRNA 단량체는 말단에 도입된 제1 관능기를 통해 직접 공유결합하여 다중 접합체를 이룰 수 있다. 또한, 상기 A가 가교제 또는 고분자인 경우에는, 상기 센스 siRNA 단량체는 상기 가교제 또는 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 다중 접합체를 이룰 수 있다. 본 명세서에서는 상기 센스 siRNA 단량체가 직접 공유결합하거나, 상기 가교제 또는 고분자를 매개로 한 공유결합하는 것을 '제1 연결'이라고 지칭하였다. 상기 제1 연결과 관련하여, 반응온도 및 시간은 한정되지 아니하며 예를 들면, 5℃~60℃에서 1 내지 48시간 동안 반응시키는 것이 가능하다.
상기 가교제 또는 상기 고분자를 매개로 하는 공유결합은 비분해성인 아마이드 결합, 우레탄 결합; 산분해성인 에스터 결합, 하이드라존 결합, 아세탈 결합; 환원제 분해성인 이황화 결합; 생분해성 결합; 및 효소 분해성 결합 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 공유결합일 수 있다.
상기 가교제 및 고분자의 첨가량은 한정되지 않는다. 상기 가교제 및 고분자는 siRNA와의 몰비(%)에 따라 상기 다중 접합체의 크기를 결정할 수 있다. 한편, 상기 가교제 및 고분자의 종류와 관련하여서는 전술하였는 바, 별도의 설명은 생략하기로 한다.
마지막으로, 상기 [구조식 3]에서 n은 상기 단량체의 개수로 1 이상의 정수를 나타낸다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법은 상기 센스 siRNA 단량체의 말단에 도입된 상기 제1 관능기를 활성화시키는 관능기 활성제를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 관능기 활성제에 대해서는 전술하였는 바, 별도의 설명은 생략하기로 한다(이상 제1단계).
제2 단계
다음으로, 말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 하기 [구조식 4]와 같이 제2 연결하여 안티센스 siRNA 다중 접합체를 제조한다.
[구조식 4]
Figure 112011071268235-pat00008
상기 [구조식 4]에서 Y1, Y2, Y3은 말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 나타낸다. 상기 안티센스 siRNA 단량체 및 상기 제2 관능기에 대해서는 전술하였으므로, 별도의 설명은 생략하도록 한다.
상기 [구조식 4]에서 A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자를 나타낸다.
A가 없는 경우에는, 상기 안티센스 siRNA 단량체는 말단에 도입된 제2 관능기를 통해 직접 공유결합하여 다중 접합체를 이룰 수 있다. 또한, 상기 A가 가교제 또는 고분자인 경우에는, 상기 안티센스 siRNA 단량체는 상기 가교제 또는 고분자를 매개로 한 공유결합을 통해 다중 접합체를 이룰 수 있다. 본 명세서에서는 상기 안티센스 siRNA 단량체가 직접 공유결합하거나, 상기 가교제 또는 고분자를 매개로 한 공유결합하는 것을 '제2 연결'이라고 지칭하였다. 상기 제2 연결과 관련하여, 반응온도 및 시간은 한정되지 아니하며 예를 들면, 5℃~60℃에서 1 내지 48시간 동안 반응시키는 것이 가능하다.
상기 가교제 또는 상기 고분자를 매개로 하는 공유결합은 비분해성인 아마이드 결합, 우레탄 결합; 산분해성인 에스터 결합, 하이드라존 결합, 아세탈 결합; 환원제 분해성인 이황화 결합; 생분해성 결합; 및 효소 분해성 결합 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 공유결합일 수 있다.
상기 가교제 및 고분자의 첨가량은 한정되지 않는다. 상기 가교제 및 고분자는 siRNA와의 몰비(%)에 따라 상기 다중 접합체의 크기를 결정할 수 있다. 한편, 상기 가교제 및 고분자의 종류와 관련하여서는 전술하였는 바, 별도의 설명은 생략하기로 한다.
마지막으로, 상기 [구조식 4]에서 n은 상기 단량체의 개수로 1 이상의 정수를 나타낸다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법은 상기 안티센스 siRNA 단량체의 말단에 도입된 상기 제2 관능기를 활성화시키는 관능기 활성제를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 관능기 활성제에 대해서는 전술하였는 바, 별도의 설명은 생략하기로 한다(이상 제2단계).
제3단계
다음으로, 상기 센스 siRNA 다중 접합체와 상기 안티센스 siRNA 다중 접합체를 결합시켜 3차원 망상구조의 siRNA 하이드로젤을 제조한다.
예를 들면, 상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 상기 안티센스 siRNA 다중 접합체 각각을 동일한 양을 첨가하여, 완충용액 상에서 결합되도록 섞어줌으로써, 상기 siRNA 하이드로젤이 제조될 수 있다.
이 때, 상기 다중 접합체들의 결합은, 상기 상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 안티센스 siRNA 다중 접합체가 단일가닥인 경우에는 상보적 수소 결합이고, 상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 안티센스 siRNA 다중 접합체가 이중가닥인 경우에는 직접 공유결합, 상기 가교제를 매개로 하는 공유결합 또는 상기 고분자를 매개로 하는 공유결합일 수 있다.
상기 완충용액은 인산 완충용액(PBS), 트리스(Tris) 완충 용액 또는 히피스(HEPES) 완충용액을 이용할 수 있다. 또한, 상기 완충용액의 염 농도는 100mM 이상일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법은 상기 siRNA 하이드로젤의 말단에 구비되는 세포 선택적 리간드를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 세포 선택적 리간드에 대해서는 전술하였으므로, 별도의 설명은 생략하도록 한다(이상 제3단계).
상술한 바와 같이, 본 발명의 실시예들은 siRNA만을 이용하여 siRNA 하이드로젤을 제조함으로써, 생체적합성이 뛰어날 뿐만 아니라 siRNA의 기능을 전혀 저해하지 않을 수 있어 유전자 치료제 전달체를 세포내로 효율적으로 도입 가능하다.
본 발명은 상술한 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤과 양이온성 유전자 전달체를 이온결합하여 제조되고, 유전자 치료제 전달체로 기능하는 이온복합체 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 이온복합체의 구조 및 구성에 대하여 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 이온복합체는 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 및 상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤과 이온결합하는 양이온성 유전자 전달체를 포함할 수 있다.
여기에서 상기 이온복합체는 음이온성 유전자 및 이와 반대 이온을 지닌 고분자간의 상호작용에 의해 형성되는 복합체를 의미한다. 상기 이온복합체는 10 내지 1,000nm의 크기를 가질 수 있으며, 50 내지 300nm의 크기를 갖는 것이 바람직하다.
상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤에 대해서는 전술하였는 바, 별도의 설명은 생략하도록 한다.
상기 양이온성 유전자 전달체는 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 양이온성 펩타이드는 KALA(cationic fusogenic peptide), 폴리라이신(polylysine) 및 프로타민(protamine) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 한편, 상기 KALA는 WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALAACEA의 펩타이드 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드{(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride, DOTMA)}, 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판{(1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio)propane, DOTAP)}, 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸-암모니오)부탄오일-sn-글리세롤{(1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethyl-ammonio)butanoyl-sn-glycerol, DOTB)}, 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판[(1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane, DAP)], 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판[(1,2-diacyl-3 -trimethylammonium-propane, TAP)], 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸포스포콜린(1,2-diacyl-sn-glycerol-3-ethylphosphocholine), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤{3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol,DC-Choloesterol}, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드[(dimethyldioctadecylammonium bromide, DDAB)] 및 그 공중합체 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
그리고, 상기 양이온성 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리아민(polyamines), 폴리비닐아민(polyvinylamine), 폴리(알킬아민 하이드로클로라이드)[poly(allyamine hydrochloride)], 폴리아미도아민 데드리머 (polyamidoamine dendrimer), 디에틸아미노에틸-덱스트란(diethylaminoethyl-dextran), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 카이토산(chitosan) 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트 [poly(2-dimethlamino)ethyl methacrylate] 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 이온복합체 제조방법에 대하여 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 이온복합체 제조방법은 우선, 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤(이하, siRNA 하이드로젤)을 준비한다. 상기 siRNA 하이드로젤을 준비하는 것은 전술한 것과 동일하므로, 별도의 설명은 생략하기로 한다.
다음으로, 상기 siRNA 하이드로젤을 완충용액 등에 희석시킨 후, 양이온성 유전자 전달체를 첨가하여 상온에서 방치하면 수용액 상에서 이온복합체가 형성될 수 있다.
상기 양이온성 유전자 전달체에 대해서는 전술하였으므로, 별도의 설명을 생략하도록 한다. 한편, 상기 양이온성 유전자 전달체의 첨가량은 상기 양이온성 유전자 전달체의 양전하와 상기 siRNA 하이드로젤의 음전하의 비가 1:1 내지 200:1 범위에서 정하는 것이 가능하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 실시예들은 3차원 망상구조를 갖는 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤을 양이온성 유전자 전달체와 결합하여 이온성 결합성을 증가시킴으로써, 강한 양이온성 유전자 전달체 사용시 발생하는 세포 독성 문제를 완화 또는 방지할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 보호범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법에 관한 모식도이다. 도 1을 참조하면, 설프하이드릴기로 3'말단이 치환된 단일가닥의 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 센스 siRNA 및 단일가닥의 안티센스 GFP siRNA 50 nmol을 각각 1X 인산 완충 용액에 녹인 후, 단일가닥 siRNA의 한쪽 말단의 설프하이드릴기를 환원시키기 위해 2M DTT (dithiothreitol) 용액을 넣어준 뒤, 24시간 정도 반응시켜 주었다.
반응이 끝나면 투석 과정을 통해서 남아 있는 DTT를 제거하고 용액을 농축시켜서 가교제인 TMEA(Tris-(2-maleimidoethyl)-amine)를 티올기 mol 수의 1/3이 되는 mol 수로 넣어준 뒤, 24시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후에는 투석 과정을 통해 남아있는 가교제 등의 이물질을 제거하고 농축시켜 센스 siRNA 다중접합체 및 안티센스 siRNA 다중접합체를 제조하였다. 다음으로, 제조된 센스 siRNA 다중접합체 및 안티센스 siRNA 다중접합체를 동일 mol 수로 1X 인산 완충 용액에 첨가한 후, 5℃~60℃에서 1시간 동안 반응시켜 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤을 제조하였다.
다음으로, 준비된 상기 siRNA 하이드로젤을 15% PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 전기 영동을 통해 확인하였다. 이와 관련하여, 도 2는 전기영동 사진이다.
AFM 분석
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 siRNA 하이드로젤의 AFM 분석 사진이다. 도 3을 참조하면, 상기 제조된 siRNA 하이드로젤의 3차원 망상구조를 AFM(atomic force microscopy)을 사용하여 모양 및 크기를 관찰하였다. 상기 siRNA 하이드로젤은 3차원 망상구조를 가짐으로써 종래 siRNA와 비교하여 높은 음전하 밀도를 가짐을 알 수 있다.
도 4는 종래 siRNA 이온복합체와 도 3의 siRNA 하이드로젤 이온복합체의 AFM 분석 사진이다.
한편, 상기 이온복합체들은 모두 Linear polyethylenimine(LPEI, 분자량 2,500 달톤)를 이용하여 nitrogen/phosphate(N/P) 비율 60에서 이온결합되어 제조되었다. 도 4에서 보이는 바와 같이, 본 발명에서 제조된 siRNA 하이드로젤 이온복합체는 양이온성 고분자와 결합력이 우수하여 종래 siRNA 이온복합체보다 크기가 작고 균일한 나노 입자가 생성됨을 확인할 수 있다.
GFP 발현양 측정 실험
GFP 유전자를 저해하는 siRNA를 이용하여, 종래 siRNA와 siRNA 하이드로젤을 각각 양이온 고분자인 linear PEI(분자량 2,500 달톤)을 이용하여 N/P 비율 60에서 결합시켜 이온복합체를 제조하였다. 다음으로, 암세포인 GFP를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-435 세포에 4시간 동안 처리한 후, 48시간 후에 발현된 GFP양을 형광 분석기(fluorophotometer)를 통하여 측정하였다.
이와 관련하여, 도 5는 GFP(green fluorescence protein)를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-435 암세포에 종래 siRNA이온복합체와 siRNA 하이드로젤 이온복합체를 세포 내 전달 한 후, 측정된 GFP 양을 나타내는 그래프이다. 도 5에서 A는 종래 siRNA를 포함하는 이온 복합체이고, B는 siRNA 하이드로젤을 포함하는 이온 복합체이다. 상기 그래프에서 알 수 있듯이, 종래 siRNA에 비하여 본 발명에서 제조된 siRNA 하이드로젤은 양이온성 유전자 전달체를 이용한 유전자 전달 효율이 뛰어나 표적 유전자 저해 효능이 뛰어난 것을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 하기 [구조식 1] 또는 하기 [구조식 2]를 포함하는 3차원 망상구조의 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤.
    [구조식 1]
    Figure 112013061527919-pat00009

    [구조식 2]
    Figure 112013061527919-pat00010

    (여기에서 X1,X2 및 X3은 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체이고, Y1,Y2 및 Y3은 말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 나타냄. 한편, A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자임. 여기에서 상기 고분자는 PEG(polyethylene glycol), 플루로닉(Pluronic), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 및 폴리옥사졸린(polyoxazolin) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 비이온성 친수성 고분자; 또는 폴리-D,L-락트산(poly-D,L-lactic acid), 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-D-락트산(poly-D-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycolic acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic-co-glycolic acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-카프로락톤(polycaprolactone), 폴리-발레로락톤(polyvalerolactone), 폴리-하이드록시 부티레이트(polyhydroxybutyrate) 및 폴리-하이드록시 발러레이트(polyhydroxyvalerate) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 생분해성 폴리에스테르계 고분자임. 그리고 n은 1 이상의 정수를 나타냄).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 센스 siRNA 단량체 및 안티센스 siRNA 단량체는 13 내지 60의 핵산 염기수를 가지는 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 제1 관능기 및 제2 관능기는 동일하거나 서로 다른 관능기로,
    설프하이드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 히드록시기(-OH), 포르밀기(-CHO), 카르보닐기(-CO-), 에테르기(-O-), 에스테르기(-COO-), 니트로기(-NO2), 아자이드기(-N2), 설폰산기(-SO3H)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 관능기인 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 가교제는 100 내지 10000 달톤(Dalton)의 분자량을 가지고,
    디티오-비스-말레이미도에탄(Dithio-bis-maleimidoethane, DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜{1,8-Bis-maleimidodiethyleneglycol, BM(PEG)2}, 트리스-2-말레이미도에틸-아민{Tris-(2-maleimidoethyl)-amine, TMEA), 트리-석신이미딜 아미노트리아세테이트 (Tri-succinimidyl aminotriacetate, TSAT) 및 3-암-폴리에틸렌 글리콜 {Poly(ethylene glycol), 3-arm-PEG}, 말레이미드(maleimide), 엔하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 비닐설폰(vinylsulfone), 이오도아세틸 니트로페닐아자이드(iodoacetyl, nitrophenyl azide), 아이소시아네이트(isocyanate), 피리딜다이설파이드(pyridyldisulfide), 하이드라자이드(hydrazide) 및 하이드록시페닐 아자이드(hydroxyphenyl azide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 siRNA 하이드로젤은 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 말단에 구비되는 세포 선택적 리간드를 더 포함하고,
    상기 세포 선택적 리간드는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 유전자 앱타머(aptamer), 세포성장인자, 엽산(folic acid), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), RGD(Arginine-Glycine-Aspartic acid) 및 트렌스페린(transferrin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤은 상기 [구조식 1] 및 [구조식 2]의 상기 제1 관능기 및 제2 관능기를 활성화시키는 관능기 활성제를 더 포함하고,
    상기 관능기 활성제는 1-에틸-3, 3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3,3-dimethylaminopropyl carbodiimide), 이미다졸(imidazole), N-하이드로실숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), 디클로로헥실카보디이미드(dichlorohexylcarbodiimide), N-β-말레이미도프로피오닉엑시드(N-β-Maleimidopropionic acid), N-β-말레이미도프로필로실 숙신이미드에스터(N-β-maleimidopropyl succimimide ester) 및 N-숙신이미딜피리딜다이싸이오 프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤.
  8. 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체를 하기 [구조식 3]과 같이 제1 연결하여 센스 siRNA 다중 접합체를 제조하는 제1 단계;
    말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 하기 [구조식 4]와 같이 제2 연결하여 안티센스 siRNA 다중 접합체를 제조하는 제2 단계; 및
    상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 상기 안티센스 siRNA 다중 접합체를 결합시켜 3차원 망상구조의 siRNA 하이드로젤을 제조하는 제3 단계를 포함하는 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법.
    [구조식 3]
    Figure 112013061527919-pat00011

    (여기에서 X1,X2 및 X3은 말단에 제1 관능기가 도입된 센스 siRNA 단량체를 나타냄. 한편, A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자임. n은 상기 단량체의 개수로 1 이상의 정수를 나타냄).
    [구조식 4]
    Figure 112013061527919-pat00012

    (여기에서 Y1,Y2 및 Y3은 말단에 제2 관능기가 도입된 안티센스 siRNA 단량체를 나타냄. 한편, A는 있거나 없을 수 있으며, 있는 경우에는 가교제 또는 고분자임. n은 상기 단량체의 개수로 1 이상의 정수를 나타냄).
    상기 [구조식 3] 및 [구조식 4]의 상기 A가 고분자인 경우, 상기 고분자는 PEG(polyethylene glycol), 플루로닉(Pluronic), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 및 폴리옥사졸린(polyoxazolin) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 비이온성 친수성 고분자; 또는 폴리-D,L-락트산(poly-D,L-lactic acid), 폴리-L-락트산(poly-L-lactic acid), 폴리-D-락트산(poly-D-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycolic acid), 폴리-D-락트산-co-글리콜산(poly-D-lactic-co-glycolic acid), 폴리-L-락트산-co-글리콜산(poly-L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid), 폴리-카프로락톤(polycaprolactone), 폴리-발레로락톤(polyvalerolactone), 폴리-하이드록시 부티레이트(polyhydroxybutyrate) 및 폴리-하이드록시 발러레이트(polyhydroxyvalerate) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 생분해성 폴리에스테르계 고분자임.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 제3 단계에서 상기 다중 접합체들의 결합은,
    상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 안티센스 siRNA 다중 접합체가 단일가닥인 경우에는 상보적 수소 결합이고,
    상기 센스 siRNA 다중 접합체 및 안티센스 siRNA 다중 접합체가 이중가닥인 경우에는 직접 공유결합, 상기 가교제를 매개로 하는 공유결합 또는 상기 고분자를 매개로 하는 공유결합인 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 가교제를 매개로 하는 공유결합 또는 상기 고분자를 매개로 하는 공유결합은,
    비분해성인 아마이드 결합, 우레탄 결합; 산분해성인 에스터 결합, 하이드라존 결합, 아세탈 결합; 환원제 분해성인 이황화 결합; 생분해성 결합; 및 효소 분해성 결합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 공유결합인 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤 제조방법.
  11. 제 1항 내지 제 4항, 제 6항, 제7항 중 어느 한 항에 따른 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤; 및
    상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤과 이온결합하는 양이온성 유전자 전달체를 포함하고,
    상기 양이온성 유전자 전달체는 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리아민, 폴리비닐아민, 폴리(알킬아민 하이드로클로라이드), 폴리아미도아민 덴드리머, 디에틸아미노에틸-덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카이토산 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 이온 복합체.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 양이온성 펩타이드는 KALA(cationic fusogenic peptide), 폴리라이신(polylysine) 및 프로타민(protamine) 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 이온복합체.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드, 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판, 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸-암모니오)부탄오일-sn-글리세롤, 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판, 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판, 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸포스포콜린, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 이온복합체.
  14. 삭제
  15. 제 8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조되는 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤을 준비하는 제 1단계; 및
    상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤을 희석시킨 후, 양이온성 유전자 전달체를 첨가하는 제 2단계를 포함하는 이온복합체 제조방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 양이온성 유전자 전달체의 첨가량은,
    상기 양이온성 유전자 전달체의 양전하와 상기 유전자 표적용 siRNA 하이드로젤의 음전하의 전하 비가 1:1 내지 200:1 범위에서 결정되는 이온복합체 제조방법.
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