KR101780272B1 - siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도 - Google Patents

siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101780272B1
KR101780272B1 KR1020160034772A KR20160034772A KR101780272B1 KR 101780272 B1 KR101780272 B1 KR 101780272B1 KR 1020160034772 A KR1020160034772 A KR 1020160034772A KR 20160034772 A KR20160034772 A KR 20160034772A KR 101780272 B1 KR101780272 B1 KR 101780272B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sirna
sequence
dna
hybrid
rna
Prior art date
Application number
KR1020160034772A
Other languages
English (en)
Inventor
안형준
장미희
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020160034772A priority Critical patent/KR101780272B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101780272B1 publication Critical patent/KR101780272B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 1종 이상의 유전자 사일런싱을 동시에 가능하게 하기 위하여 1종 또는 2종 이상의 siRNA 각각을 포함하는 헤어핀 서열이 반복적으로 나타나는 RNA 전사체가 이와 상보적 서열을 가지고 있는 DNA 접합체와의 RNA/DNA 염기쌍 형성을 통해 혼성화되어있는 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도에 관한 것이다

Description

siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도 {RNA transcripts-DNA zygote hybrid for synchronous silencing of one or more siRNAㄴ and use thereof}
본 발명은 1종 이상의 siRNA를 전달 대상으로 포함하는 RNA 전사체 및 리간드-DNA-소수성 물질의 접합체를 포함하는 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도에 관한 것이다.
RNA 간섭현상(RNA interference, RNAi)은 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA(double strand RNA)을 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적 유전자의 mRNA의 분해를 유도하거나 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다. RNAi 는 처음에 선충에서 발견되었지만, 현재는 효모, 곤충, 식물, 인간 등 각종 동식물에서 매우 잘 보존이 되어 있는 생명현상으로 관찰되고 있다.
small interference RNA(siRNA)는 RNAi를 유도하는 물질로서, 약 20 내지 30개의 뉴클레오타이드(nucleotides)로 구성된 짧은 RNA 이중나선 가닥을 말한다. siRNA를 세포 내로 주입시켜 이 siRNA와 염기서열이 상보적인 mRNA를 표적으로 삼아 유전자 발현을 억제하게 된다. siRNA는 질병에 대한 치료 효과를 가지며, 쉬운 제조법 및 높은 표적 선택성 등으로 인해 표적이 되는 생명 프로세스를 조절할 수 있는 효과적인 수단으로 각광을 받고 있다.
현재 siRNA를 이용하여 치료할 수 있는 질환으로, 암, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환 등이 연구되고 있으며, 임상적 시도로서 노인성 황반변성 (베바시라닙; Opko Health, Inc., Miami, FL, USA; 임상 3상), 호흡기 신시치아 바이러스 감염증 (ALN-RSV01; Alnylam, Cambridge, MA, USA; 임상 2상)에 대한 치료제로서의 가능성이 보고되었다 (Melnikova I.,2007). 또한 트랜스페린을 표적으로 하는 사이클로덱스트린 기반의 나노입자 중합체 (CALAA-01; Calando Pharmaceuticals, Pasadena, CA, USA; 임상 1상)를 이용하여 인간 암 치료에서 siRNA의 전달 시스템이 가능함이 보고되었다 (Oh YK. et al., 2009).
그러나, siRNA는 안정성이 낮아 생체 내에서 단시간에 분해되며, siRNA의 음이온성으로 인하여 같은 음전하를 띄는 세포막을 쉽게 투과하기 힘들어 세포 내로의 전달성이 떨어진다는 문제가 있어, 이들의 세포 내 전달을 용이하게 하는 효과적인 전달체 제조 기술이 요구되고 있다. 이와 같이 siRNA를 세포 내로 효율적으로 전달하기 위해서는, 분해효소 저항성을 가지며 장시간 생체 내에서 순환하며 임상적으로 가능한 주입경로를 통해 표적 세포에 도달할 수 있고 세포투과 후에는 효과적인 세포질 방출이 가능한 효과적인 새로운 전달 시스템이 필요하다.
기존의 siRNA 전달체로, siRNA를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 사용되거나, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 또는 리포좀에 기반한 전달체가 주로 사용되었다. 그러나, 바이러스성 전달체의 경우 전달하려는 유전자의 크기에 제한을 받게 되고 바이러스 벡터의 표면 단백질의 면역원성으로 인한 면역 부작용을 일으켜 체내 안정성이 보장되지 못하는 문제가 지적되었다. 또한, 양이온성 분자 또는 합성 고분자를 이용한 전달체의 경우 세포 내로의 수송 효율이 낮으며 세포 내로의 유전자 전달과정에서 유발될 수 있는 세포 독성에 대한 문제가 지적되었다.
이제까지 가장 많이 보고가 되고 있는 양이온성 분자 또는 양이온성 합성 고분자를 이용한 전달체의 경우 플라스미드 DNA에서는 우수한 전달효율을 보여왔나 플라스미드 DNA와 비교 시 상대적으로 길이가 20 - 23mer에 불과한 siRNA의 낮은 음이온 밀도와 고유의 견고한 구조 때문에 세포 내로의 수송 효율이 낮다는 문제점을 안고 있다 (Lee SH. et al., 2012). 즉, 양이온-음이온 정전기적 상호작용에 의하여 siRNA와 양이온성 고분자 전달체의 결합이 형성될 때 siRNA의 낮은 음이온 밀도와 고유의 견고한 구조는 siRNA/전달체 복합체가 촘촘한 구조를 형성하는 것을 방해하여 느슨하게 결합된 siRNA/전달체 복합체 구조를 형성하게 됨으로써, 결합된 siRNA가 쉽게 분해효소나 혈액내의 음전하를 띄는 단백질의 공격을 받게 된다.
또한 양이온성 합성 고분자 전달체는 높은 양이온 전하 밀도와 제한된 생분해성으로 인해 세포 내로의 siRNA 전달과정에서 세포막 혹은 미토콘드리아 막을 파괴함으로써 세포괴사나 세포사멸이 유발될 수 있는 세포 독성에 대한 문제점이 있어 왔다 (Cho KC. et al., 2006). 따라서 독성문제를 해결하기 위해 독성이 감소된 다양한 신규 양이온성 고분자를 제조하거나 기존의 양이온성 고분자를 변형함으로써 독성이 감소된 양이온성 고분자 전달체를 개발하여 왔으나 여전히 siRNA가 지니는 낮은 전하 밀도와 고유의 견고한 구조 때문에 세포 내로의 수송효율이 낮다는 문제점이 있다.
최근 들어, 항암화학약제 내성 암세포의 항암약물 저항성을 극복하기 위한 치료제 개발 분야에서 siRNA를 이용한 약물 저항성 단백질의 억제가 각광을 받고 있다 (Lopes de Menezes D.E. et al., 2003). 대부분의 다중약물저항성 암세포에서 보여지는 항암약물 저항성은 펌프 타입 저항성과 비펌프 타입 저항성으로 나뉘어지는데, 펌프 저항성은 P-gp 단백질, multidrug resistance protein, breast cancer resistant protein과 같은 막 단백질에 의해 유발되며 세포 내로 유입된 항암화학약물을 세포 밖으로 배출하는 기능을 한다 (Dean M. et al., 2001). 비 펌프 저항성은 주로 BCL2, MCL1, BCL-XL과 같은 anti-apoptotic protein을 활성화하여 세포 사멸 방어기전을 유발함으로써 작용을 하게 된다 (Shi Z. et al., 2007). 그러나 항암내성을 극복하기 위한 siRNA 치료제 개발에서 펌프 저항성 혹은 비 펌프 저항성 중 어느 하나 단독으로 사일런싱을 함으로써 항암내성을 억제하는 것은 한계가 있는 것으로 보고되었는데, 그 이유는 다음과 같다. 펌프 저항성을 억제함으로써 유도되는 세포 내의 항암약물 농도의 증가는 세포 사멸 방어 기전을 급격히 활성화함으로써 결국 세포 사멸이 원하는 정도까지 증가하지 못하는 한계를 보이기 때문인데 이것은 결국 siRNA를 이용하여 항암화학 내성을 억제하기 위해서는 펌프 저항성과 비 펌프 저항성을 동시에 억제해야 할 필요성이 요구된다 (Pakumlu R.I. et al, 2004).
본 발명은 1종 이상의 siRNA를 포함하는 RNA 전사체 및; 리간드, 소수성 물질 및 DNA를 포함하는 DNA 접합체를 함유하는 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드를 제공하여, 세포 내에서 1종 또는 2종 이상의 유전자를 동시에 사일런싱하고 상기 나노입자를 이용하여 각종 분해효소와 같은 외부공격으로부터 안정성을 확보할 수 있으며, 높은 siRNA 탑제효율을 가지고 다양한 세포로 1종 또는 2종 이상의 siRNA를 동시에 표적특이적으로 전달하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 1종 또는 2종 이상의 siRNA를 포함하는 RNA 전사체 및; 리간드, 소수성 물질 및 DNA를 포함하는 DNA 접합체를 함유하는 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드에 관한 것이다.
본 발명의 구체적 일예에서, 1종, 또는 다양한 2종 이상의 siRNA를 포함하는 RNA 전사체와 폴레이트-DNA-콜레스테롤 접합체가 상보적인 RNA/DNA 염기쌍이 형성된 하이브리드 또는 나노입자에 관한 것으로서, 세포 내에서 1종 또는 2종 이상의 유전자를 동시에 사일런싱할 수 있고, 상기 나노입자를 이용하여 각종 분해효소와 같은 외부공격으로부터 안정성을 확보할 수 있으며, 높은 siRNA 탑제 효율을 가지고 다양한 세포로 1종 또는 2종 이상의 siRNA를 동시에 표적특이적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 일 예는, 5'방향에서 3'방향으로 순차적으로 위치한, 1종 이상의 siRNA의 센스가닥 서열, 루프영역 서열, 상기 센스가닥 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 서열 및 링커 서열을 함유하는 반복단위를 포함하는 RNA 전사체; 및 상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열, 및 상기 DNA서열의 적어도 일 말단에 결합되며 소수성 물질 및 표적지향형 리간드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 DNA 접합체를 포함하는, siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 하이브리드로 이루어진 나노입자 또는, 상기 하이브리드를 유효성분으로 포함하는 병용 투여용 약학 조성물 또는 약물 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 5'방향에서 3'방향으로 순차적으로 위치한, 1종 이상의 siRNA의 센스가닥 서열, 루프영역 서열, 상기 센스가닥 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 서열 및 링커 서열을 함유하는 반복단위를 포함하는 RNA 전사체에 상보적인 DNA 주형을 제조하는 단계; 상기 DNA 주형 및 RNA 폴리머라제를 이용한 롤링-서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)를 수행하여 상기 반복단위를 1 이상 포함하는 RNA 전사체를 제조하는 단계; 상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열, 및 상기 DNA서열의 적어도 일 말단에 결합되며 소수성 물질 및 표적지향형 리간드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 DNA 접합체를 혼합하여 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드를 형성하는 단계를 포함하는 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 하이브리드에 의하면 1종 이상의 siRNA를 포함하는 RNA 폴리머를 하나의 하이브리드 또는 나노입자로 압축하여 약물 저항성(예를 들어, 항암 내성)을 유발하는 1 이상의 유전자를 동시에 사일런싱할 수 있으며, 표적 특이적 전달능을 갖고 각종 분해효소와 같은 외부공격으로부터 안정성을 확보할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 5'방향에서 3'방향으로 순차적으로 위치한, 1종 이상의 siRNA의 센스가닥 서열, 루프영역 서열, 상기 센스가닥 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 서열 및 링커 서열을 함유하는 반복단위를 포함하는 RNA 전사체; 및 상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열, 및 상기 DNA서열의 적어도 일 말단에 결합되며 소수성 물질 및 표적지향형 리간드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 DNA 접합체를 포함하는, siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드에 관한 것이다.
상기 RNA 전사체의 반복단위는, 1종 또는 서로 상이한 2종 이상의 siRNA 반복단위를 포함하고, 상기 서로 상이한 2종 이상의 siRNA 반복단위 각각은 siRNA의 센스가닥 서열 및 안티센스가닥 서열이 상이한 것일 수 있으며, 예를 들어 1 내지 1,000,000회, 바람직하게는 10 내지 1,000 반복하여 연결된 것 일 수 있다.
상기 RNA 전사체에 서로 상이한 n종의 siRNA를 포함하는 경우에는 상기 RNA 전사체의 반복단위는 제1 siRNA 내지 제n siRNA의 반복단위를 포함할 수 있다(n은 1 이상의 정수). 바람직하게는 상기 siRNA가 서로 상이 한 2종의 siRNA인 경우, 상기 RNA 전사체의 반복단위가 제1 siRNA의 반복단위와 제2 siRNA의 반복단위로 이루어지며 상기 제1 siRNA와 제2siRNA는 서로 상이하며, 상기 제1 siRNA의 반복단위는 제1 siRNA의 센스 가닥 서열, 루프영역 서열, 제1 siRNA의 안티센스 가닥 서열, 및 링커를 포함하고, 상기 제2 siRNA의 반복단위는 제2 siRNA의 센스 가닥 서열, 루프영역 서열, 제2 siRNA의 안티센스 가닥 서열, 및 링커를 포함할 수 있다.
상기 반복단위는 상보적으로 결합된 센스서열과 안티센스서열; 및 상기 센스서열의 3'말단 및 안티센스 서열의 5'말단 각각에 연결된 루프영역 서열이 헤어핀 구조를 이룰 수 있으며, 이때 상기 헤어핀 구조는 하이브리드 내부에 위치할 수 있다.
이와 같이 RNA 나노입자 내부에 위치하는 RNA 헤어핀은 외부와 물리적으로 차단되므로 뉴클레아제(nuclease)와 같은 분해효소로부터 자유로워 안정성이 우수하다. 이와 같은 본 발명의 siRNA의 동시전달용 조성물은 RNA 헤어핀을 전달체 외부에 노출된 표적지향성 폴레이트에 의해 효과적으로 표적 세포에 결합한 후 세포 내로 투과되며 세포질에서의 Dicer 효소에 의하여 siRNA로 분해된 후 효과적으로 mRNA의 발현을 억제할 수 있다. 특히 서로 상이한 2종 이상의 siRNA를 포함하는 경우, 2 이상의 항암화학약제 내성 유전자와 같은 유전자를 동시에 발현 억제하고 암세포에서의 항암저항성을 억제함으로써 항암화학약제 내성 암세포의 치료가 가능하게 할 수 있다.
상기 siRNA가 첫 번째 siRNA 및 두 번째 siRNA로 이루어진 2종류의 siRNA일 때, 상기 반복단위는 5'말단에서 3'말단 방향으로 순차적으로 첫 번째 siRNA의 센스서열, 루프영역 서열, 첫 번째 siRNA의 안티센스 서열, 제2 RNA서열, 두 번째 siRNA의 센스서열, 루프 영역 서열, 두 번째 siRNA의 안티센스 서열 및 링커 서열로 이루어진 것일 수 있다.
구분 RNA 서열 상보적 DNA 서열
서열 서열번호 서열 서열번호
RNA 전사체 AGGGAUAUGCCUCUAAGACAUUGGUUUCUUUUCCACCAGGGUUUCCGGGCAAGUAAGGAAAAGAAACCAACUGUCUUGUUGGUACGUUAAUACGACAGCUUAUAAUGGAUGUACACCAGGGUUUCCGGGCAAGUAAGUACAUCCAUUAUAAGCUGUCUUGUUGGUACGU UAAUACGACUCACUAU 1 ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAAGACAGCTTATAATGGATGTACTTACTTGCCCGGAAACCCTGGTGTACATCCATTATAAGCTGTCGTATTAACGTACCAACAAGACAGTTGGTTTCTTTTCCTTACTTGCCCGGAAACCCTGGTGGAAAAGAAACCAACTGTCTTAGAGGCATATCCCT 2
루프 영역 ACCAGGGUUUCCGGGCAAGUAA 3 TTACTTGCCCGGAAACCCTGGT 4
링커 AUGCCUCUAA 5 TTAGAGGCAT 6
예를 들어 본 발명에 사용되는 RNA 전사체의 반복단위는 상기 표 1의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 루프영역 서열은 5 내지 50개의 염기로 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 상기 표 1의 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 이는 서열번호 1의 RNA 전사체 염기 서열 중 5' 말단으로부터 36 내지 53번째 염기에 해당할 수 있다.
상기 링커 서열은 5 내지 50개의 염기로 이루어질 수 있다. 상기 링커 서열의 예는 상기 표 1의 서열번호 5의 서열일 수 있으며, 이는 서열번호 1의 RNA 전사체 염기 서열 중 5'말단으로부터 7 내지 16번째 염기에 해당할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 RNA 전사체는 상기 반복단위의 5'말단 및 3'말단 중 적어도 하나 이상의 말단에 연결되고, 전사 프로모터 서열에 상보적인 RNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 전사 프로모터는 T7 전사 프로모터, 예를 들면 서열번호 7의 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 이에 상보적인 RNA 서열은 서열번호 8일 수 있다.
본 발명의 DNA 접합체에서 상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것 일 수 있으나, 이에 한정하지 않으며, 상기 RNA 전사체의 서열에 따라 적절히 제조할 수 있다.
상기 표적지향형 리간드 또는 소수성 물질은 상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열의 5' 말단, 3'말단 및 서열내부로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 위치에 결합할 수 있다.
상기 링커 서열에 결합하는 리간드는 siRNA를 전달하고자 하는 표적세포에 특이적인 리간드일 수 있으며, 상기 표적지향형 리간드는 표적지향형 화합물, 표적지향형 펩타이드, 표적지향형 항체 및 표적지항형 압타머로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다. 예를 들면 암세포의 경우 상기 표적지향형 리간드는 암 세포, 암 줄기세포, 또는 암 표지인자에 특이적으로 반응하는 리간드는 표적지향성을 부여하는 암 특이적 결합성분을 의미한다. 바람직하게는, 상기 표적지향형 리간드는 폴레이트 또는 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩타이드일 수 있다.
DNA 접합체는 소수성 물질을 포함할 수 있어, 하이브리드가 양친매성 성질을 획득하여 수용액상에서 자가조립을 통해 고밀도로 응축된 나노입자를 형성하여 신체 내에 주사할 경우 혈액 안에서의 핵산분해효소의 공격으로부터 안정성을 높일 수 있다. 상기 소수성 물질은 콜레스테롤, 지방산 및 콜렌산으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으며, 바람직하게는 콜레스테롤을 사용할 수 있다.
이에 본 발명의 DNA 접합체 중 일 예는, 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열의 5'말단에 폴레이트가 결합되고 3'말단에 콜레스테롤이 결합된 DNA 접합체(폴레이트-DNA-콜레스테롤 접합체, FA-DNA-CHOL 접합체)를 포함한다. 본 발명에서 폴레이트-DNA-콜레스테롤 접합체는 폴레이트 수용체 표적지향성 리간드인 폴레이트를 도입하였기 때문에 표적 세포로의 전달성을 향상시킬 수 있다. 구체적으로, 폴레이트는 두 종류 siRNA의 동시 전달용 RNA 나노입자의 외부에 노출되어, 암세포에 특이적으로 과 발현되어 있는 폴레이트 수용체 막단백질에 결합함으로써 암세포 특이적인 세포 표적화를 나타낼 수 있다.
본 발명에 사용되는 1종 이상의 siRNA는 하이브리드를 이용하여 전달하고자 하는 대상 siRNA의 센스서열 및 안티센스 서열으로서, 바람직하게는 질환 관련 유전자의 mRNA 발현을 억제하여 질환 치료효과를 유도하는 것이다. 상기 질환은 항암 약물 저항성일 수 있으며, 예를 들어 상기 항암 약물 저항성은 펌프 타입 저항성 및 비펌프 타입 저항성으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것일 수 있다.
상기 siRNA 서열은 5 내지 50개의 염기, 바람직하게는 15 내지 50개의 염기, 더욱 바람직하게는 19 내지 30개의 염기로 이루어질 수 있다.
또한 상기 RNA 나노입자는 1종 이상의 siRNA 서열이 무수히 반복되어 있는 파티클이므로 상기 siRNA는 전체 하이브리드의 중량 대비 10 내지 50 중량%, 예를 들면 37.3 중량%에 해당되는 siRNA를 전달할 수 있는 높은 siRNA 탑제효율을 보여준다.
상기 siRNA는 타겟인 MDR1의 siRNA 서열인 서열번호 9, 및 BCL2의 siRNA 서열인 서열번호 10로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으나, 질환 치료효과를 유도하는 것이면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 하이브리드의 분자량은 2240kDa의 10 내지 1000%의 범위 일 수 있으며, 바람직하게는 2240kDa일 수 있으며, 표면 전하가 -25 내지 +25mV일 수 있으며, 바람직하게는 -13 mV일 수 있다.
본 발명의 하이브리드는 나노입자 형태일 수 있으며, 이는 수용액상에서 자가조립하여 나노입자가 형성된 것일 수 있다.
상기 나노입자는 직경이 1 내지 1,000 nm, 예를 들면 50nm 내지 200nm, 더욱 바람직하게는 50 내지 450nm일 수 있다.
본 발명의 하이브리드는 1종 또는 2종 이상의 siRNA를 동시에 전달할 수 있으며, 세포 특이적, 특히 암세포 특이적 표적 리간드 및 콜레스테롤과 결합하여 암세포 특이적 표적성 및 세포투과성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 하이브리드로 이루어진 나노입자를 포함한다. 상기 하이브리드에 관한 사항은 나노입자에 동일하게 적용될 수 있다.
RNA 전사체 (Dsi RNA transcripts)의 마이크로미터 크기의 사이즈를 세포투과가 가능한 나노미터 크기로 감소시키고자 리간드(예, 폴레이트)-DNA-소수성 물질(예, 콜레스테롤) 접합체를 상보적 서열을 이용한 RNA/DNA 혼성화를 시켰으며 소수성 물질의 소수성 성질을 이용하여 결과적으로 양친매성 하이브리드(예, Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL)를 제조하였으며 이러한 하이브리드는 나노미터 사이즈의 나노입자를 형성할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 하이브리드 또는 나노입자를 포함하는 siRNA전달체에 관한 것이다. 상기 하이브리드 또는 나노입자에 관한 사항은 전달체에 동일하게 적용될 수 있다.
기존의 두 종류 siRNA 동시 전달체들은 단순히 하나의 siRNA 전달체에 서로다른 두가지 siRNA를 탑제하는 방법을 채용하기 때문에, 전달체의 낮은 탑제효율을 고려할 때 각각의 siRNA 탑제효율이 절반으로 줄어드는 문제점을 가지고 있다. 또한 두 종류 siRNA를 동시에 탑제하는 방법으로 대부분의 경우에서 리포좀을 사용하기 때문에 리포좀이 가지는 낮은 표적성으로 인한 전달효율이 떨어지는 한계를 보여왔다.
본 발명은 Dsi RNA transcript에 리간드(예, 폴레이트)-DNA-소수성 물질(예, 콜레스테롤) 접합체를 상보적 서열을 이용한 RNA/DNA 혼성화를 시킴으로써 하이브리드(예, Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL )가 암세포 특이적인 표적성 및 세포투과성을 모두 나타낼 수 있어 세포구별 능력 없이 단순히 세포의 투과성만을 구현한 종래 기술의 문제점을 개선하였다.
본 발명의 하이브리드 또는 나노입자는 30% 혈청조건하에서의 핵산분해효소 공격으로부터 우수한 안정성을 가지고 있음을 확인하였다. 세포안으로 투과된 후 Dicer 효소에 의하여 잘려나가 siRNA를 생성할 수 있으며, 폴레이트 수용체의 유무에 따라 암세포 선택적으로 RNA 나노입자가 전달될 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 RNA 나노입자는 세포질로 전달된 후 두 종류 표적 유전자들의 동시 사일런싱을 일으키므로, 두 종류 siRNA의 동시 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
이와 같이 생체면역독성의 위험성이 높은 양이온성 합성 폴리머의 사용이 없이 DNA접합체를 이용하여 세포투과가 가능한 나노입자를 제조함으로써 생체독성을 획기적으로 감소시키고 암세포 선택적인 siRNA 전달이 가능하도록 하여 세포독성의 위험성이 감소되며, 수송효율이 개선되었다.
또한, 본 발명은 상기 하이브리드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
상기 하이브리드에 관한 사항은 약학 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 바람직하게는 병용 투여용이며, 바람직하게는 약물 저항성을 치료하는 것을 특징으로 하여, 약물 저항성을 갖는 약물과 병용 투여 될 수 있다. 상기 약물 저항성은 펌프 타입 저항성 및 비펌프 타입 저항성으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.
상기 약물 저항성은 siRNA로 저항성 단백질의 발현을 저해하여 치료할 수 있는 것으로 알려진 질환에 대한 약물 저항성을 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 질환은 암, 노인성 황반병선, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 상기 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 뇌암, 복부암, 결장암, 식도암, 위암, 위장암, 간암, 설암, 신경아세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 빌립스 종양, 망막아세포종, 다발성 골수종, 피부암, 림프종 및 혈액암 등을 포함하나 특별히 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 상기 암은 내성 암세포에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약물 저항성을 유발하는 약물로서, siRNA에 의해 약물저항성 단백질의 발현이 저해되는 약물을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 항암제, 구체적으로 독소루비신(doxorubicin)을 추가로 포함할 수 있다.
기존의 전통적인 항암화학약제와의 병행치료 (combination therapy)에 적용되는 siRNA 치료법으로서는 현재 한 종류 siRNA만을 사용하는 병행치료법이 가장 널리 연구되고 있고 두 종류 siRNA를 사용하는 병행치료법은 보고된 바가 매우 적다. 리포좀을 이용한 2종류 siRNA용 전달체의 경우 항암약물과의 병행치료에서 효과적으로 항암내성 암세포를 사멸할 수 있으나, 리포좀을 갖는 전달체로서의 한계점들, 즉, 비선택적 약물전달 및 세포투과로 인한 낮은 전달효율 문제로 인해 임상적용의 어려움을 가지고 있다. 또한, Cationic poly(β-amino esters)을 이용한 2종류 siRNA용 전달체의 경우 단일 siRNA를 전달할 때와 비교 시 전달효율이 현저히 떨어지는 문제점이 알려져 있고, silica 나노입자를 이용한 2종류 siRNA용 전달체의 경우에서도 역시 단일 siRNA를 전달할 때와 비교 시 전달효율이 현저히 떨어지는 문제점이 보고되었다. 이에 본 발명은 1종 이상의 siRNA를 포함하는 하이브리드를 병행치료 또는 병용투여용으로 제공하여, 상기 전달효율의 문제점을 개선하였다.
특히, siRNA를 전달하는 항암내성 억제 치료법에서 고려해야 할 점들은, 첫 번째, 항암화학약제와 siRNA의 병행 치료 시 예상되는 현저한 세포독성으로 인하여 원치 않는 side effect를 최소화할 수 있는 암세포 선택적 전달체 기술이 요구된다는 점이다. 두 번째, 서로 상이한 2종 이상의 siRNA용 전달체는 단일 siRNA 전달체와 비교 시 전달 효율 면에서 떨어지지 말아야 하고, 특히 병행치료에 함께 주입되는 항암화학약물의 세포투과를 방해하지 말아야 한다. 셋째 2종 이상의 siRNA는 하나의 전달체에 동시에 봉입되어 전달되어야 하며, 만약 분리되어서 서로 다른 전달체에 봉입된다면 두 가지 유전자의 동시 사일런싱을 기대할 수 없으므로 two-in-one 전달체가 필요하다. 넷째, 항암화학약제는 siRNA가 암세포에 처리된 후 "얼마만의 시간"이 지나서 항암약물 저항성 단백질의 억제가 충분히 일어난 후에 주사되어야만 최적의 시너지효과를 발휘할 수 있으므로 항암화학약제와 siRNA 치료제의 시간차를 둔 암세포 처리가 필수적이다. 또한, 앞에서 언급했었던 siRNA를 암 조직에 선택적으로 전달하는데 요구되는 다양한 이슈들, 예를 들어, siRNA의 낮은 세포투과문제, 낮은 siRNA 봉입효율, 면역반응 유발 문제, 혈액 내에서의 낮은 안정성, 낮은 암세포 표적 기능들은 2종류 siRNA용 전달체 개발에서도 역시 해결 되어야 하는 문제점들이다. 이에 본 발명은, 세포 투과 및 봉입 효율이 높고 핵산 분해효소 공격으로부터 우수한 안정성을 가질 뿐 아니라, 혈액 내 안정성과 표적 유전자에 동시 사일런싱을 우수하게 할 수 있는 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드를 개발하였다.
상기 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
바람직하게는 상기 조성물은 항암제와 병용투여 될 수 있다. 조성물 및 항암제가 동시 또는 순차적으로 병용투여(sequential treatment)될 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물 및 항암제는 순차적으로 투여될 수 있다.
상기와 같은 순차적 투여에 의하여, 표적 세포(예, 암세포) 내에서 siRNA가 작동할 시간적 여유를 부여하여, 동시 투여 시에 약물 내성 유전자의 억제가 감소하고 궁극적으로 암세포 약물 반응성이 떨어지는 문제점을 극복할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 예는, 5'방향에서 3'방향으로 순차적으로 위치한, 1종 이상의 siRNA의 센스가닥 서열, 루프영역 서열, 상기 센스가닥 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 서열 및 링커 서열을 함유하는 반복단위를 포함하는 RNA 전사체; 및 상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열, 및 상기 DNA서열의 적어도 일 말단에 결합되며 소수성 물질 및 표적지향형 리간드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 DNA 접합체를 포함하는, siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드; 및 약물을 포함하며, 상기 하이브리드는 상기 약물 저항성을 치료하는 것을 특징으로 하는 병용 투여용 약물 키트를 포함한다.
상기 하이브리드 및 약물이 각각 제제화되어 동시적 또는 순차적으로 투여되는 형태일 수 있으며, 바람직하게는 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 상기 약물 키트는 상기 하이브리드 및 약물이 각각 제제화 되어 동시적 또는 순차적으로 투여되는 형태일 수 있으며, 또는 상기 하이브리드 및 약물이 하나로 제제화 되어 투여되는 형태일 수 있다.
바람직하게는 상기 하이브리드 또는 나노입자를 포함하고, 상기 하이브리드 또는 나노입자가 제제화된 단위 투여 형태를, 각 단위 투여량으로 투여한 후 상기 약물를 추가로 투여하는 것에 관한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약물은 바람직하게는 siRNA에 의해 발현이 저해되는 약물 저항성을 유발하는 약물일 수 있으며, 바람직하게는 항암 내성을 유발하는 항암제, 구체적으로 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(Cisplatin), 카본플라틴(carbonplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 및 도세탁셀(docetaxel) 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 를 포함하는 세포기반 약물 스크리닝 조성물에 관한 것이며, 스크리닝 조성물에 대하여는 상기 하이브리드/나노입자에 대한 사항이 동일하게 적용될 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 조성물을 투여하여 질병을 치료하는 방법을 포함할 수 있다.
상기 하이브리드, 나노입자 및 조성물에 대한 사항은 치료 방법에 동일하게 적용될 수 있다.
상기 조성물은 항암제와 병용투여 될 수 있으며, 조성물 및 항암제가 동시 또는 순차적으로 병용투여(sequential treatment)될 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물 및 항암제는 순차적으로 투여될 수 있으며, 상기 조성물 및 항암제의 순차적 투여 사이의 시간은 24시간 일 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 또는나노입자를 제조하는 방법을 포함한다.
상기 하이브리드에 관한 사항은 제조방법에 동일하게 적용될 수 있다.
구체적으로 상기 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 제조방법은 5'방향에서 3'방향으로 순차적으로 위치한, 1종 이상의 siRNA의 센스가닥 서열, 루프영역 서열, 상기 센스가닥 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 서열 및 링커 서열을 함유하는 반복단위를 포함하는 RNA 전사체에 상보적인 DNA 주형을 제조하는 단계; 상기 DNA 주형 및 RNA 폴리머라제를 이용한 롤링-서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)를 수행하여 상기 반복단위를 1 이상 포함하는 RNA 전사체를 제조하는 단계; 및 상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열, 및 상기 DNA서열의 적어도 일 말단에 결합되며 소수성 물질 및 표적지향형 리간드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 DNA 접합체를 혼합하여 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드를 형성하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 상기 하이브리드 형성 단계는 수용액상에서 이루어져 자가조립으로 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드로 이루어진 나노입자가 형성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 롤링-서클 전사를 이용하여 두 종류 siRNA가 반복적으로 연결되어있는 polymerized RNA 전사체를 siRNA 전달체로 이용하여 낮은 수송효율을 개선할 수 있다.
구체적으로 상기 DNA 주형은 선형 DNA로서, 주형을 롤링-서클 전사 반응에 의해 RNA 중합효소를 이용하여 반복 단위를 반복적으로 포함하는 RNA 전사체를 제조할 수 있다. 일 예로서, 상기 선형 DNA 주형은 서열번호 2의 서열일 수 있으며, 상기 반복단위는 서열번호 1의 서열일 수 있다.
일 예로서, 전사 프로모터가 T7 전사 프로모터, 예를 들면 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 경우 T7 RNA 중합효소로 합성된 RNA 전사체를 얻을 수 있다. 상기 선형 DNA 주형의 양 말단은 T7 프로모터 서열과 상보적이며, 반복적인 헤어핀 구조를 형성하면서 반복적으로 두 종류 siRNA 각각의 센스 및 안티센스 서열을 포함하고, FA-DNA-CHOL 접합체에 상보적인 서열이 무수히 반복될 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 DNA 접합체는 5'말단 아민이 변형된 DNA-소수성물질(예, 콜레스테롤)과 리간드(예, 폴레이트)를 EDC 커플링(EDC coupling) 반응을 이용하여 결합시킬 수 있다.
상기와 같이, RCT 반응으로 생성된 RNA 전사체에 리간드-DNA-소수성 물질 전합체를 상보적으로 결합시켜서 양친매성 성질을 갖는 하이브리드를 제조하며 이러한 하이브리드는 자가조립을 통해 나노미터 사이즈의 나노입자를 형성할 수 있다.
본 발명의 siRNA의 동시 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드/나노입자는 동일한 암세포에서 약물 저항성 유전자를 사일런싱할 수 있고, 특히 2종 이상의 siRNA 동시 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드/나노입자는 2종 이상의 약물 저항성 유전자를 동시에 사일런싱 할 수 있어, 항암내성 암세포의 펌프 및 비펌프 약물저항성을 동시에 억제할 수 있으면서 각종 분해효소와 같은 외부공격으로부터 siRNA의 안정성을 확보할 수 있으며, 매우 우수한 siRNA 탑제효율을 보이고, 기존 siRNA 전달체의 생체독성을 지닌 양이온성 축합제(polycationic condensing agents)의 사용 없이 siRNA를 전달할 수 있다는 점에서 우수한 생체적합성을 보인다. 또한 암세포를 표적으로 하는 표적지향성 폴레이트에 의하여 1종 이상의 siRNA를 암세포 및 암조직으로 선택적으로 전달할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 항암화학약물 내성 암세포의 항암내성 억제를 목적으로 하는 siRNA 치료제, 생체 내 안정성을 향상시킨 siRNA 치료제, 세포기반 약물 스크리닝 조성물 및 연구용 siRNA의 동시 전달체로서 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1는 본 발명에 따른 두 종류 siRNA의 서열이 포함된 RNA 전사체의 반복단위에 해당되는 DNA template에 대한 모식도 및 본 발명의 일예에 따른 두 종류 siRNA의 동시 전달용 RNA 나노입자를 생성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 RCT 반응 후 얻은 RNA 전사체(Dsi RNAtr) 및 Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드를 3% 아가로스겔 전기영동한 결과(A), Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL를 동적 광 산란기를 이용하여 직경을 측정한 결과(B), 원자간력 현미경(AFM)을 이용하여 RNA 나노입자의 직경을 측정한 결과(C), 투과 전자 현미경을 이용하여 Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드 (1:0.3, w/w)의 파티클 모양과 사이즈를 분석한 결과(D) 및 동적 광 산란기를 이용하여 RNA 전사체(Dsi RNAtr) 및 RNA 나노입자(Dsi RNPs)의 표면전하를 측정한 결과(E)를 나타낸 것이다.
도 3는 RNA 나노입자(Dsi RNPs)의 분자량 측정을 위한 Debye 플롯을 나타낸 것이다.
도 4는 30% Fetal bovine serum (FBS) 조건하에서 RNA 전사체(Dsi RNAtr) 및 RNA 전사체/FA-DNA-CHOL 하이브리드 (Dsi RNPs)를 반응시켰을 경우, 핵산분해효소에 대한 안정성을 보여준다.
도 5는 RNA 전사체/FA-DNA-CHOL 하이브리드 (Dsi RNPs) 및 컨트롤로 monomeric siRNA duplex에 Dicer (1.5 unit)를 처리한 후 시간에 따라 siRNA가 생성되는 것을 나타낸 것이다.
도 6는 다양한 siRNA 전달물질을 처리한 PBMC에서 24시간이 경과한 후에 내제적 면역 반응에 의한 interferon-α release 및 IL-6 release를 나타낸 것이다; monomeric siRNA (50 nM MDR1 siRNA 및 50 nM BCL2 siRNA), monomeric siRNA/lipofectamine complexes (equivalent to 50 nM MDR1 siRNA plus 50 nM BCL2 siRNA), Dsi transcripts (20 μg/mL), or Dsi RNPs (26 μg/mL). 5 μM CpG oligodeoxynucleotide은 INF-α대한 positive control로 사용되었고, 10 ng/mL R-848은 IL-6 대한 positive control로 사용되었다.
도 7은 폴레이트 receptor-negative HepG2 human liver carcinoma cell 및 폴레이트 receptor-positive KB-V1 human cervical 종양세포에 Cy5 형광표지된 Dsi RNPs 나노입자 (최종농도 26 μg/mL)을 처리하고 3시간 경과한 후의 flow cytometry 및 형광현미경 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 항-폴레이트 수용체 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과를 보여주는데, 폴레이트 receptor-negative HepG2 human liver carcinoma cell 및 폴레이트 receptor-positive KB-V1 human cervical 종양세포에서의 폴레이트 수용체의 발현량을 보여주고 있다.
도 9는 항-P-glycoprotein 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과를 보여주는데, 약물 저항성 KB-V1 암세포와 KB 암세포 각각에서의 P-glycoprotein의 발현량을 보여주고 있다.
도 10은 약물 저항성 KB-V1 암세포에 다양한 RNA 나노입자를 처리하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리한 뒤, 또 다시 24시간 경과한 후에 qRT-PCR를 수행하여 mRNA의 변화량을 측정한 결과(A) 및 약물 저항성 KB-V1 암세포에 다양한 RNA 나노입자를 독소루비신과 동시에 처리하고 48시간 경과 후에 qRT-PCR를 수행하여 mRNA의 변화량을 측정한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 11은 약물 저항성 KB-V1 암세포에 다양한 RNA 나노입자를 각각 처리하고 48시간 경과한 후 독소루비신을 처리한 뒤, 또다시 24시간 경과한 후에 qRT-PCR를 수행하여 mRNA의 변화량을 측정한 결과이다.
도 12는 약물 저항성 KB-V1 암세포에 다양한 RNA 나노입자를 각각 처리하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리한 뒤, 또다시 24시간 경과한 후에 항-P-glycoprotein 항체 혹은 항-BCL2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과(A) (즉, two-step RNPs-24h-Dox-24h sequential treatment한 후의 웨스턴 블롯 결과) 및 약물 저항성 KB-V1 암세포에 다양한 RNA 나노입자, 다시 말해 Dsi RNPs (MDR1 siRNA 및 BCL2 siRNA), scrambled Dsc RNPs(scrambled MDR1 siRNA 및 scrambled BCL2 siRNA), siBCL2 RNPs(BCL2 siRNA 및 scrambled MDR1 siRNA), 및 siMDR1 RNPs(MDR1 siRNA 및 scrambled BCL2 siRNA) 각각을 독소루비신과 동시에 처리하고 48시간 경과 후에 항-P-glycoprotein 항체 혹은 항-BCL2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과(B)이다(즉, RNPs/Dox-48h simultaneous treatment한 후의 웨스턴 블롯 결과).
도 13는 약물 저항성 KB-V1 암세포에 다양한 RNA 나노입자를 각각 처리하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리한 뒤, 또다시 3시간 경과한 후에 형광현미경을 이용하여 세포질에서의 독소루비신의 세포투과 정도를 관찰한 결과(A) 및 96-well plate에 약물 저항성 KB-V1 암세포를 부착하고 다양한 RNA 나노입자를 각각 처리하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리한 뒤, 또다시 3시간 경과한 후에 Xenogen IVIS Lumina imaging system 을 이용하여 세포질에서의 독소루비신 농도를 독소루비신 형광세기를 기반으로 측정한 결과(B)이다.
도 14는 약물 저항성 KB-V1 암세포에 다양한 RNA 나노입자를 처리한 뒤, 또다시 24시간 경과한 후에 annexin-V-FITC와 propidium iodide로 염색하여 세포사멸을 flow cytometry를 이용하여 분석한 결과이다.
도 15는 약물 저항성 KB-V1 암세포 또는 약물 민감성 KB 암세포에 다양한 RNA 나노입자를 처리하고 바로, 혹은 24시간 경과 후에 독소루비신에 대한 MTT 에세이를 수행하여 IC50 값을 측정한 결과이다.
도 16는 도 15의 MTT 실험결과에 대한 그래프(A 및 B) 및 TUNEL 에세이 결과(C)를 나타낸다.
도 17은 약물 저항성 KB-V1 암세포 또는 약물 민감성 KB 암세포에 scrambled Dsc RNPs (scrambled MDR1 siRNA 및 scrambled BCL2 siRNA)를 처리하고 24시간 경과 후에 독소루비신에 대한 MTT 에세이를 수행한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. siRNA 전달용 RNA 전사체 -DNA 접합체 하이브리드 제조
1.1 DNA 주형으로서 DNA/T7 프로모터 하이브리드 제조
RNA 전사체의 DNA 주형을 제조하기 위하여, 선형 DNA (서열번호 2)및 T7 promoter primer(서열번호 7) (모두 바이오니어㈜에서 구입) 을 몰 비 1:1로 섞은 후 95 에서 2분간 denature시키고 25 까지 냉각하면서 선형 DNA와 T7 프로모터 프라이머가 어닐된(annealed) 개방된 원형 DNA/T7 프로모터 하이브리드를 제조하였다(도 1의 B). 이러한 개방된 원형 DNA/T7 프로모터 하이브리드에 T4 DNA 리가아제(ligase)와 5 mM ATP를 첨가한 후 16 에서 12시간 동안 반응시켜서 닉(nick) 부분이 연결된 닫힌 원형 DNA/T7 프로모터 하이브리드를 제조하였다.
1.2 RNA 전사체 제조
실시예 1.1에서 제조한 DNA/T7 프로모터 하이브리드에 T7 RNA 폴리머라제 (5 U/μL), 반응버퍼 (4 mM Tris-HCl, 0.6 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.2 mM spermidine), rNTP (2 mM, ribonucleotide solution mix, NEB), 및 RNase inhibitor (1 U/μL)를 첨가한 후 37 에서 1시간 동안 롤링-서클 전사(rolling circle transcription, RCT) 반응을 수행하였다. RCT 반응을 정지시키기 위하여 DNase 1 (2 U/μL)을 15분간 15 에서 반응시키고 난 후, 0.2 M EDTA를 첨가한 후 90 에서 5분간 열처리하여 폴리머화 된 서열번호 1의 RNA 전사체를 제조하였다.
1.3 폴레이트-DNA-콜레스테롤(FA-DNA-CHOL) 제조
10 mM 5'-amine-modified DNA-콜레스테롤(Bioneer, Korea로부터 구입)를 conjugation 버퍼 (100 mM MES, 500 mM NaCl, pH 6.0)에 녹인 후 Sulfo-NHS (10 mM) 및 EDC (4 mM) 용액과 섞었다. 혼합물에 몰 비 10배 과량의 폴레이트를 첨가한 후 22 로 3시간 동안 반응시켜서 DNA-콜레스테롤의 5'-아민그룹에 폴레이트의 카복시기가 결합된 폴레이트-DNA-콜레스테롤 접합체를 제조하였다. 반응이 끝나고 반응하지 않고 남아있는 EDC를 비활성화시키기 위하여 머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 첨가한 후, 폴레이트-DNA-콜레스테롤 접합체만을 amicon ultra-centrifugal filter (3K MWCO, Millipore)를 사용하여 정제하였다. 결합된 폴레이트의 비율은 스탠다드 커브(standard curve)를 이용하여 흡광 계수를 측정한 결과 0.93으로 계산되었다.
1.4 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 제조
혼성화 버퍼 (30 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10mM MgCl2, 10mM DTT)에서 상기 실시예 1.2에서 제조된 RNA 전사체 및 실시예 1.3에서 제조된 FA-DNA-Chol 접합체를 무게비율 1:0.2로 섞은 후, 65 에서 5분간 denature시키고 4 로 2시간 동안 냉각하면서 RNA 전사체/FA-DNA-CHOL (Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL) 하이브리드 (1:0.3, w/w)를 제조하였다. 상기 제조방법을 도 1의 B에 개략적으로 나타내었다.
실시예 2. RNA 전사체 -DNA 접합체 나노입자 형성 확인
RNA 전사체(Dsi RNAtr) 및 Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드의 w/w 비율을 1:0, 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4 및 1:0.5으로 하여 3% 아가로스 겔 전기 영동을 하였다. 그 결과를 도 2의 A에 나타내었으며, 자가 조립이 될 경우 분자량이 큰 나노입자가 되므로 젤 전기영동에서 웰에 갇히게 되어 아래로 이동하지 못한다는 점을 고려할 때, 1:0.3 (w/w)에서 웰에 갇힌 것이 관찰되어 자가조립에 의한 파티클이 형성 되었음을 확인하였다.
상기 최적의 하이브리드 비율 (1:0.3, w/w)에서 파티클의 모양 및 크기는 동적 광 산란기(dynamic light scatter), 원자간력 현미경(Atomic force microscopy, AFM) 및 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy)을 이용하여 측정하였으며 그 결과를 각각 도 2(B 내지 D(에 나타내었다. 그 결과 최적의 하이브리드 비율(1:0.3, w/w)에서 파티클의 직경이 각각 107.3, 109 및 98.6nm인 것으로 측정되어 약 100nm의 직경을 갖는 나노 사이즈임을 확인하였다.
또한, 상기 동적 광 산란기를 이용하여 표면전하를 측정한 결과(도 2의 E), Dsi RNAtr (RNA 전사체)의 전하는 약 -22 mV인 반면 Dsi RNPs(Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 나노입자)는 약 -13 mV인 것을 확인하였다.
실시예 3. 물리적 특성 평가
3.1 전기영동 결과
상기 RNA 전사체(Dsi RNA transcripts) 및 Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드의 w/w 비율을 1:0, 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4 및 1:0.5 으로 하여 3% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하고 그 결과를 도 2의 A에 나타내었다. 도면에서 볼 수 있듯 젤에서 위 아래에 걸쳐 넓은 밴드 패턴이 관찰되어 RNA 전사체는 넓은 범위의 분자량을 가지며, Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드 (1:0.3, 1:0.4 및 1:0.5 w/w)는 하이브리드 형성으로 나노입자가 되어 거대 파티클이 되어 웰에서 내려오지 않았으며, 이로써 1:0.3 (w/w)에서 최적으로 자가조립에 의한 파티클이 형성되었음을 확인하였다.
3.2 입자 모양 및 크기
상기 3.1의 최적의 하이브리드 비율 (1:0.3, w/w)에서 RNA 전사체(Dsi RNA transcripts) 및 Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드의 파티클의 모양 및 크기는 동적 광 산란기(dynamic light scatter), 원자간력 현미경(Atomic force microscopy, AFM) 및 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy)을 이용하여 측정하였으며 그 결과를 각각 도 2(B 내지 D)에 나타내었으며 RNA 전사체는 1 μm 이상의 마이크로 파티클을 형성하였으나 상기 Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드 파티클은 구형으로, 약 100nm의 직경을 갖는 나노입자임을 확인하였다.
상기 결과로 마이크로미터 사이즈의 RNA 전사체가 FA-DNA-CHOL 접합체와의 혼성화를 통하여 나노미터 사이즈의 나노입자를 형성함을 알 수 있었다. 또한 생체독성 문제를 일으킬 수 있는 양이온성 폴리머를 사용하지 않고, 두 종류의 siRNA로 구성된 고밀도의 RNA 나노입자를 제조할 수 있음을 확인하였다.
3.3 입자 분자량 측정
상기 3.1의 RNA 나노입자(Dsi RNPs)의 분자량을 알아보기 위하여 Debye 플롯 중 제로 농도에서의 교차점으로부터 분자량을 측정하여 쌍극자 모멘트를 산출하였으며 이때 Debye 플롯을 도 3에 나타내었다. Debye 플롯 중 제로 농도에서의 교차점으로부터 RNA 나노입자의 분자량이 22400kDa임을 확인하였다.
3.4 입자 표면전하
상기 RNA 전사체(Dsi RNA transcripts) 및 Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드를 동적 광 산란기를 이용하여 표면전하(제타 포텐셜)를 측정한 결과(도 2의 E), Dsi RNAtr (RNA 전사체)의 전하는 약 -22 mV인 반면 Dsi RNPs 나노입자는 약 -13 mV인 것을 확인하였다. 이는 용액 내에 남아있는 마그네슘 이온들이 훨씬 밀도가 높게 응축되어있는 Dsi RNAtr/FA-DNA-CHOL 하이브리드에 더 많이 결합하여 강한 음이온을 상쇄시키기 것에서 기인한 것으로 보인다.
실시예 4. 안정성 실험
4.1 혈액 내 안정성 평가
두 종류 siRNA의 동시 전달용 RNA 나노입자의 혈액 내 안정성을 조사하기 위하여 30% FBS 조건하에서 시간 별로 FBS 내 nuclease에 의해 RNA 등이 분해된 분해산물을 전기 영동하여 분석하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 먼저 대조군으로 monomeric siRNA는 30분 내에서 완전히 분해되었고 RNA 전사체 (Dsi RNAtr)는 30분 후에 약 80% 이상이 분해되었으나 Dsi RNPs 나노입자는 6시간 경과 후에도 약 60%가 온전한 상태로 관찰됨으로써 매우 우수한 핵산분해효소 안정성을 보여주었다. 이는 헤어핀이 나노입자 내부에 위치하여, 내부의 siRNA가 분해 효소의 공격으로부터 물리적으로 차단됨을 나타내며, 특히 외부에 노출되어 있는 폴레이트가 핵산 공격의 접근을 상당부분 막아주기 때문으로 설명할 수 있었다.
4.2 내제적 면역원성(innate immunogenicity) 조사
siRNA 혹은 siRNA 전달체가 일으킬 수 있는 내제적 면역원성(innate immunogenicity)을 조사하기 위하여 human PBMC 세포에서의 INF-α 및 IL-6 유도(induction)를 조사하였다.
siRNA 전달물질을 처리한 human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)에서의 24시간이 경과한 후에 내제적 면역 반응에 의한 INF-α 방출 및 IL-6 방출 결과를 조사하였다. monomeric siRNA (Mono-siRNA, 50 nM MDR1 siRNA 및 50 nM BCL2 siRNA), monomeric siRNA/lipofectamine complexes (Mono-siRNA/Lipof, equivalent to 50 nM MDR1 siRNA plus 50 nM BCL2 siRNA), Dsi transcripts (Dsi RNAtr, 20 ?g/mL), 또는 Dsi RNPs (26 ?g/mL)을 처리하고, 5 ?M CpG oligodeoxynucleotide(CpG ODN)은 INF-α에 대한 양성 대조군으로 사용되었고, 10 ng/mL R-848은 IL-6 대한 양성 대조군로 사용되었다.
그 결과를 도 6에 나타내었으며, 대표적으로 INF-α 유도를 일으키는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(oligodeoxynucleotide)에 비교하여 Dsi RNPs 나노입자는 INF-α 유도를 일으키지 않았다. monomeric siRNA/lipofectamine complexes은 상당히 많은 양의 INF-α 유도를 일으켜, 기존의 리포펙타민(lipofectamine)에 비하여 Dsi RNPs 나노입자가 내제적 면역원성을 자극하지 않음을 확인하였다. IL-6 유도 결과에서는, R-848이 상당히 많은 양의 IL-6 를 분비한 것에 반하여, Dsi RNPs 나노입자는 거의 IL-6 유도를 일으키지 않았다. 상기 결과를 통해 Dsi RNPs 나노입자가 내제적 면역을 자극하지 않음을 알 수 있으며 따라서 임상적용 시에 정맥주사가 가능함을 확인하였다.
실시예 5. Dicer 효소에 의한 siRNA 생성 효과
나노입자가 세포 내 투과되어 유전자 사일런싱을 일으키는지 확인하기 위하여, DICER 효소에 의해 siRNA이 생성되는지 여부를 확인하였다. in vitro에서 Dicer 1.5unit을 처리하여 siRNA가 생성되는 것을 조사하였으며 대조군으로는 monomeric siRNA dublex를 사용하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었으며, 5 μg Dsi RNPs 나노입자가 반응 24시간 후에 1.69 μg siRNA를 생성한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Dsi RNPs 나노입자가 이론적으로 생성할 수 있는 siRNA 양의 약 90.6%를 생성했음을 나타낸다.
실시예 6. 암세포 표적성 실험
폴레이트 수용체 선택적인 표적성을 조사하기 위하여 폴레이트 수용체-양성(receptor-positive) KB-V1 종양세포 및 폴레이트 수용체-음성(receptor-negative) HepG2 carcinoma cell에 형광 표지된 Dsi RNPs 나노입자를 처리하고 3시간 후에 형광현미경과 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였으며, 대조군으로 폴레이트가 결합되지 않은 Cy5 형광표지된 Dsi RNPs 나노입자 또는 폴레이트로 미리 세포를 처리하여 폴레이트 수용체를 포화시킨 후 Cy5 형광표지된 Dsi RNPs 나노입자를 사용하였다.
상기 형광현미경 및 유세포 분석기에 의한 분석 결과를 도 7 및 도 8에 나타냈다. KB-V1 세포에서는 다량의 Dsi RNPs 나노입자가 세포투과 되었으나 HepG2 세포에서는 세포투과 되지 않았다. 유세포 분석에서 처리한지 3시간 후에 KB-V1 세포에서는 약 96% Dsi RNPs 나노입자가 세포투과 되었으나 HepG2 세포에서는 전혀 세포투과가 관찰되지 않았다. 또한 폴레이트를 미리 처리하여 폴레이트 수용체를 포화시켰을 경우 KB-V1 세포에서 단지 약 30% Dsi RNPs 나노입자만이 세포투과 되었다. 폴레이트가 없는 Dsi RNPs의 경우 KB-V1 세포와 HepG2 세포 모두에서 세포투과를 관찰할 수 없었다. 도 8에서 KB-V1 세포에는 폴레이트 수용체가 과발현되어 있으나 대조군으로 사용된 HepG2 세포에서는 폴레이트 수용체의 발현량이 매우 낮았다. 상기 결과를 통해, Dsi RNPs 나노입자가 폴레이트 선택적으로 세포에 결합되어 투과됨을 확인하였다.
실시예 7. 유전자 사일런싱 (gene_silencing) 조사
7.1 qRT-PCR에 의한 mRNA 변화량 평가
약물 저항성 KB-V1 암세포에 Dsi RNPs (MDR1 siRNA 및 BCL2 siRNA)를 처리(최종 농도 20 μg/mL)하고 24시간 또는 48시간 경과한 후 독소루비신(doxorubicin)(최종 농도 30 μg/mL)을 순차적으로 처리한 뒤, 또 다시 24시간 경과한 후에 qRT-PCR를 수행하거나, Dsi RNPs (최종 농도 20 μg/mL) 및 독소루비신 (최종 농도 30 μg/mL)를 동시에 처리하고 48시간 후에 qRT-PCR를 실시하여 MDR1 및 BCL2 mRNA의 변화량을 측정하였다.
RNA 나노입자를 처리하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리한 뒤, 또 다시 24시간 경과한 후에 qRT-PCR를 수행하는 것을 "two-step RNPs-24h-Dox-24h sequential treatment"이라 하며, RNA 나노입자를 독소루비신과 동시에 처리하고 48시간 경과 후에 qRT-PCR를 수행하는 처리 방법을 "RNPs/Dox-48h simultaneous treatment"이라 하며, RNA 나노입자를 처리하고 48시간 경과한 후 독소루비신을 처리한 뒤, 또다시 24시간 경과한 후에 qRT-PCR를 수행하는 처리 방법을 "two-step RNPs-48h-Dox-24h sequential treatment"이라 한다.
MDR1 mRNA에 매칭될 수 있는 프라이머 (정방향 프라이머 5'-GAAATTTAGAAGATCTGATGTCAAACA-3' (서열번호 11)와 역방향 프라이머 5'- ACTGTAATAATAGGCATACCTGGTCA-3' (서열번호 12), BCL2 mRNA에 매칭될 수 있는 프라이머 (정방향 프라이머 5'-AGTACCTGAACCGGCACCT-3' (서열번호 13)와 역방향 프라이머 5'- GCCGTACAGTTCCACAAAGG-3' (서열번호 14), 및 대조군 실험을 위한 β-actin과 매칭되는 프라이머 (정방향 프라이머 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3' (서열번호 15)와 역방향 프라이머 5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3' (서열번호 16)를 이용하여 세포 내의 MDR1 및 BCL2 유전자의 mRNA의 양을 정량하기 위한 qRT-PCR을 수행하였다(변성 단계 95/30초, 어닐링 단계 51/30초, 신장 단계 72/30초, 20 사이클).
항암내성 세포 KB-V1과 항암제 민감 세포 KB에서의 항암내성과 관련된 MDR1 유전자 (P-gp)의 발현정도를 확인한 결과를 도 9에 나타내었으며, 그 결과 KB-V1 세포에서는 P-gp 단백질이 과발현되어 있으나 KB 세포에서는 그렇지 않음을 확인하였다.
대조군으로 독소루비신만을 처리, 또는 Dsi RNPs와 독소루비신, Dsc RNPs와 독소루비신, siBCL2 RNPs와 독소루비신, siMDR1 RNPs와 독소루비신 및 Dsc RNP을 각각 처리하고 한 뒤(각 최종 농도 30 μg/mL) 24시간 경과한 후에 qRT-PCR를 수행하여 MDR1 및 BCL2 mRNA의 변화량을 측정하고 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
Dsi RNPs 처리하고 24시간 후 독소루비신을 순차적으로 처리한 경우, MDR1 및 BCL2 mRNA의 증가가 관찰되지 않은 반면(도 10의 A), Dsi RNPs 처리하고 48시간 후 독소루비신을 순차적으로 처리한 경우에는 MDR1 및 BCL2 mRNA이 각각 46%, 36%씩 증가하였다 (도 11). 독소루비신만을 처리한 경우에도, MDR1 및 BCL2 모두의 mRNA가 59 - 110% 및 37 - 44%만큼 증가하였으며, Dsi RNPs 및 독소루비신을 동시에 처리한 경우, MDR1 및 BCL2 mRNA이 각각 85%, 17%씩 증가하였다(도 10). 상기 결과를 바탕으로, Dsi RNPs를 처리하고 24시간이 지난 후에 독소루비신을 순차적으로 처리하는 것이 약물저항성과 관련된 MDR1 및 BCL2 유전자의 억제에 더 효과적임을 확인하였다.
또한 항-P-gp 항체 및 항-BCL2 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하여 Dsi RNPs 나노입자의 두 가지 유전자 동시 사일런싱을 조사하였다. 약물 저항성 KB-V1 암세포에 Dsi RNPs (MDR1 siRNA 및 BCL2 siRNA)를 처리(최종 농도 20 μg/mL)하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리(최종 농도 30 μg/mL)한 뒤, 또다시 24시간 경과한 후에 웨스트 블랏을 수행하여 MDR1 및 BCL2 단백질의 변화량을 측정하였다. 대조군으로 독소루비신만을 처리한 뒤 (최종 농도 30 μg/mL) 24시간 경과한 후에 웨스트 블랏을 수행하여 MDR1 및 BCL2 단백질의 변화량을 측정하였다. 독소루비신만을 처리한 경우 24시간 후에 MDR1 및 BCL2 모두의 단백질이 56% 및 24%만큼 증가하였으나, Dsi RNPs를 처리한 후 24시간 후에 독소루비신을 처리하고 또다시 24시간후에 웨스트 블랏을 실시하면, MDR1 및 BCL2 단백질의 증가가 관찰되지 않고 오히려 9% 및 28%씩 감소함을 알 수 있었다 (도 12의 A). 하지만 KB-V1 암세포에 Dsi RNPs (최종 농도 20 μg/mL) 및 독소루비신 (최종 농도 30 μg/mL)를 동시에 처리하고 48시간 후에 웨스트 블랏을 실시하면 MDR1 및 BCL2 단백질이 각각 10%, 40%씩 증가하였다 (도 12의 B). 다시 말해, Dsi RNPs를 처리하고 24시간이 지난 후에 독소루비신을 처리하는 것이 약물저항성과 관련된 MDR1 및 BCL2 유전자의 발현을 더 효과적으로 억제함을 알 수 있다. 또한, MDR1과 BCL2 두 가지 유전자 중 어느 한쪽만을 사일런싱하는 RNA 나노입자(즉, siMDR1 RNPs 혹은 siBCL2 RNPs)는 오직 한가지 표적 유전자만을 사일런싱할 수 있었지만 Dsi RNPs는 두 유전자 모두를 효과적으로 사일런싱함을 알 수 있었다.
7.2 세포 내 독소루비신 농도 측정
Dsi RNA 나노입자의 MDR1 유전자 사일런싱을 검증하는 또 하나의 방법으로 세포내의 독소루비신의 농도를 형광현미경을 사용하여 관찰하였다. 약물 저항성 KB-V1 암세포에 Dsi RNPs을 처리(최종 농도 20 μg/mL)하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리(최종 농도 30 μg/mL)한 뒤, 또 다시 3시간 경과한 후에 형광현미경으로 세포질에서의 독소루비신의 형광을 관찰하였다.
대조군으로 독소루비신만을 처리, 또는 Dsi RNPs와 독소루비신, Dsc RNPs와 독소루비신, siBCL2 RNPs와 독소루비신, siMDR1 RNPs와 독소루비신 및 Dsc RNP을 처리하고 3시간 후에 형광현미경으로 형광을 관찰하였다.
그 결과를 도 13의 A에 나타내었으며, 독소루비신만을 처리한 경우 형광신호가 매우 약했으나, Dsi RNA 나노입자 혹은 siMDR1 RNA 나노입자를 처리한 경우 강한 형광신호를 관찰할 수 있었다. 이는 Dsi RNA 나노입자가 siMDR1 RNA 나노입자 만큼 세포내의 펌프 저항성과 관련된 MDR1 유전자를 효과적으로 사일런싱 하여 독소루비신이 세포 밖으로 배출되는 것이 억제하는 것을 나타낸 것이다.
7.3 세포 내 독소루비신 농도의 정량적 측정
세포질내의 독소루비신의 농도를 정량적으로 측정하기 위해서 96-웰 플레이트에 약물 저항성 KB-V1 암세포를 배양하고 난 후, Dsi RNPs를 처리(최종 농도 20 μg/mL)하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리(최종 농도 30 μg/mL)한 뒤, 또다시 3시간 경과한 후에 Xenogen IVIV Lumina imaging system을 이용하여 정량적으로 독소루비신의 세포질 농도를 측정하였다. 대조군으로는 독소루비신만을 처리, 또는 Dsi RNPs와 독소루비신, Dsc RNPs와 독소루비신, siBCL2 RNPs와 독소루비신, siMDR1 RNPs와 독소루비신 및 Dsc RNP을 처리하였다.
그 결과를 도 13의 B에 나타내었으며, 상기 실시예 5.2의 형광현미경에서와 마찬가지로 독소루비신만을 처리한 약물 저항성 KB-V1 암세포에서는 거의 독소루비신 형광신호가 검출되지 않았으나, Dsi RNA 나노입자 혹은 siMDR1 RNA 나노입자를 처리한 암세포에서만이 높은 농도의 독소루비신이 관찰되었다. 이러한 결과 역시 Dsi RNA 나노입자가 siMDR1 RNA 나노입자 만큼 세포내의 펌프 저항성과 관련된 MDR1 유전자를 효과적으로 사일런싱하여 독소루비신이 세포 밖으로 배출되는 것이 억제하는 것을 나타낸 것이다.
7.4 세포 사멸 유도 측정
Dsi RNA 나노입자가 독소루비신과 병행처리 될 경우 약물저항성 암 세포의 세포사멸을 촉진시키는지를 확인하기 위하여 유세포 분석기를 이용하여 세포사멸을 조사하였다. 약물 저항성 KB-V1 암세포에 Dsi RNPs를 처리(최종 농도 20 ?g/mL)하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 처리(최종 농도 30 μg/mL)한 뒤, 또다시 24시간 경과한 후에 annexin-V 및 프로피디움 요오드(propidium iodide)로 염색을 하여 세포사멸과 세포괴사를 유세포 분석기를 이용하여 조사하였다.
대조군으로는 독소루비신만을 처리, 또는 Dsi RNPs와 독소루비신, Dsc RNPs와 독소루비신, siBCL2 RNPs와 독소루비신, siMDR1 RNPs와 독소루비신 및 Dsc RNP을 처리한 것을 사용하였다.
상기 결과를 도 14에 나타내었으며, 대조군으로 독소루비신만을 처리한 KB-V1 세포에서 세포사멸은 14.9%, 세포괴사는 2.9%에 머물렀으나, Dsi RNA 나노입자를 독소루비신과 병행처리(two-step Dsi-24h-Dox-24h sequential treatment)하면 세포사멸은 36.7%, 세포괴사는 6.5%로 급격히 증가함을 알 수 있었다. 이는, si RNA 나노입자가 펌프 저항성과 비 펌프 저항성을 동시에 사일런싱하여 독소루비신의 세포독성을 증가시켰음을 나타낸다.
7.5 세포독성 정량적 측정
Dsi RNA 나노입자에 의한 독소루비신의 세포독성의 증가를 정량적으로 측정하기 위하여 Dsi RNA 나노입자와 독소루비신을 병행 처리한 후 암세포에서의 IC50 값을 측정하였다. 대조군으로는 독소루비신만을 처리, 또는 Dsi RNPs와 독소루비신, Dsc RNPs와 독소루비신, siBCL2 RNPs와 독소루비신, siMDR1 RNPs와 독소루비신 및 Dsc RNP을 처리한 것을 사용하였다.
그 결과를 도 15, 도 16에 나타내었으며, 항암 내성 KB-V1 암세포에 독소루비신을 농도 별로 처리하여 MTT 에세이를 수행했을 때의 IC50 값은 약 78.49 μg/mL이었다. 하지만, 항암 내성 KB-V1 암세포에 Dsi RNPs를 처리(최종 농도 20 μg/mL)하고 24시간 경과한 후 독소루비신을 농도 별로 처리하고 또다시 24시간 경과 후에 MTT 에세이를 수행하면 IC50 값은 11.7 μg/mL으로 측정되었으며 약 1/7의 IC50 값의 감소하였다(도 16의 A). 이는 Dsi RNPs 및 독소루비신의 병행처리가 독소루비신 단독만보다 세포독성이 7배 정도 증가했다는 것을 나타내며 항암 내성 암세포의 항암약제 반응성이 7배 증가했음을 보여준다. 그러나 항암 내성 KB-V1 암세포에 Dsi RNPs (최종 농도 20 μg/mL)을 처리하고 시간 경과 없이 바로 독소루비신을 농도 별로 처리하고 48시간 후에 MTT 에세이를 수행한 경우에는 IC50 값은 44.93 μg/mL으로 측정되었으며, 상기 실시예 5.1에서 기술한 바와 같이, 2단계 순차적 투여(two-step sequential treatment)가 동시 투여(simultaneous treatment)보다 항암 약제에 대한 암세포의 민감성을 증가시키는데 훨씬 효과적이었음을 알 수 있었다.
또한, 약물 저항성 KB-V1 암세포 또는 약물 민감성 KB 암세포에 scrambled Dsc RNPs (scrambled MDR1 siRNA 및 scrambled BCL2 siRNA)를 처리하고 24시간 경과 후에 독소루비신에 대한 MTT 에세이를 수행한 결과를 도 17에 나타내었다. 대조군으로 scrambled Dsc RNPs만을 처리하였다. scrambled Dsc RNPs은 독소루비신에 대한 KB-V1 암세포의 약물 저항성을 억제하지 못하고 있음을 보여주며, scrambled Dsc RNPs만을 처리한 대조군은 RNA 나노입자가 세포에 독성이 없음을 확인하였으며 dsiRNPs 만을 단독 처리할 경우 세포 사멸이 유도되지 않음을 확인할 수 있다.
7.6 TUNEL 에세이
실시예 7.5에서 확인한 IC50 값의 감소가 나타내는 세포독성의 증가가 실제로 세포사멸로 연결되는지 검증하기 위하여 TUNEL 에세이를 수행하였다.
그 결과를 도 16의 C에 나타내었으며, 2단계 순차적 투여로 병행 처리된 Dsi RNPs와 독소루비신에서는 세포사멸을 나타내주는 BrdU 염색이 증가했으나 독소루비신만을 처리한 암세포에서는 세포사멸의 증가를 관찰할 수 없어, Dsi RNPs를 독소루비신과 두 단계 순차적 (two-step sequential) 투여 방법으로 처리한 결과에서만 세포사멸이 가장 활발히 일어나, 세포 독성 증가가 세포사멸의 유도까지 연결되었음을 확인하였다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> RNA transcripts-DNA zygote hybrid for synchronous silencing of one or more siRNA and use thereof <130> DPP20160262 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 186 <212> RNA <213> RNA transcript <400> 1 agggauaugc cucuaagaca guugguuucu uuuccaccag gguuuccggg caaguaagga 60 aaagaaacca acugucuugu ugguacguua auacgacagc uuauaaugga uguacaccag 120 gguuuccggg caaguaagua cauccauuau aagcugucuu guugguacgu uaauacgacu 180 cacuau 186 <210> 2 <211> 186 <212> DNA <213> complementary DNA sequence to RNA transcript <400> 2 atagtgagtc gtattaacgt accaacaaga cagcttataa tggatgtact tacttgcccg 60 gaaaccctgg tgtacatcca ttataagctg tcgtattaac gtaccaacaa gacagttggt 120 ttcttttcct tacttgcccg gaaaccctgg tggaaaagaa accaactgtc ttagaggcat 180 atccct 186 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> loop region RNA sequence <400> 3 accaggguuu ccgggcaagu aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> complementary DNA sequecne to loop region RNA sequence <400> 4 ttacttgccc ggaaaccctg gt 22 <210> 5 <211> 10 <212> RNA <213> linker region RNA sequence <400> 5 augccucuaa 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> complementary DNA sequence to linker region RNA seqence <400> 6 ttagaggcat 10 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> promoter <400> 7 taatacgact cactataggg at 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> complementary RNA sequence to promoter <400> 8 aucccuauag ugagucguau ua 22 <210> 9 <211> 38 <212> RNA <213> siRNA of MDR1 <400> 9 ggaaaagaaa ccaacugucc cuuuucuuug guugacag 38 <210> 10 <211> 42 <212> RNA <213> siRNA of BCL2 <400> 10 guacauccau uauaagcugu ccauguaggu aauauucgac ag 42 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> forward primer of MDR1 mRNA <400> 11 gaaatttaga agatctgatg tcaaaca 27 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> reverse primer of MDR1 mRNA <400> 12 actgtaataa taggcatacc tggtca 26 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> forward primer of BCL2 mRNA <400> 13 agtacctgaa ccggcacct 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer of BCL2 mRNA <400> 14 gccgtacagt tccacaaagg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer of beta-actin <400> 15 agagggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> reverse primer of beta-actin <400> 16 caatagtgat gacctggccg t 21

Claims (24)

  1. 5'방향에서 3'방향으로 순차적으로 위치한, 1종 이상의 siRNA의 센스가닥 서열, 루프영역 서열, 상기 센스가닥 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 서열 및 링커 서열을 함유하는 반복단위를 포함하는 RNA 전사체; 및
    상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열, 및 상기 DNA서열의 적어도 일 말단에 결합되며 소수성 물질 및 표적지향형 리간드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 DNA 접합체를 포함하는, siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RNA 전사체의 반복단위는, 서로 상이한 2종 이상의 siRNA 반복단위를 포함하고,
    상기 서로 상이한 2종 이상의 siRNA 반복단위 각각은 siRNA의 센스가닥 서열 및 안티센스가닥 서열이 상이한 것인, 하이브리드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 RNA 전사체의 반복단위가 제1 siRNA의 반복단위와 제2 siRNA의 반복단위로 이루어지며 상기 제1 siRNA와 제2siRNA는 서로 상이하며,
    상기 제1 siRNA의 반복단위는 제1 siRNA의 센스 가닥 서열, 루프영역 서열, 제1 siRNA의 안티센스 가닥 서열, 및 링커를 포함하고,
    상기 제2 siRNA의 반복단위는 제2 siRNA의 센스 가닥 서열, 루프영역 서열, 제2 siRNA의 안티센스 가닥 서열, 및 링커를 포함하는 것인, 하이브리드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 RNA 전사체의 반복단위는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 하이브리드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 DNA 접합체는 5'방향에서 3'방향으로 순차적으로 위치한 소수성 물질, DNA 서열 및 표적지향형 리간드를 포함하는 것인, 하이브리드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 루프영역 서열은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것인, 하이브리드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 링커 서열은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것인, 하이브리드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 RNA 전사체는 상기 RNA 반복단위의 5'말단 및 3'말단 중 적어도 하나 이상의 말단에 연결되고, 전사 프로모터 서열에 상보적인 RNA 서열을 추가로 포함하는 것인, 하이브리드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 전사 프로모터 서열에 상보적인 RNA 서열은 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것인, 하이브리드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것인, 하이브리드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 표적지향형 리간드는 표적지향형 화합물, 표적지향형 펩타이드, 표적지향형 항체 및 표적지항형 압타머로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것인, 하이브리드.
  12. 제1항에 있어서, 상기 소수성 물질은 콜레스테롤, 지방산 및 콜렌산으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것인, 하이브리드.
  13. 제1항에 있어서, 상기 하이브리드는 암세포 특이적 표적성 및 세포투과성을 갖는 것을 특징으로 하는, 하이브리드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드로 이루어진 나노입자.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드를 포함하는, 병용 투여용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 약물 저항성을 갖는 약물과 병용 투여되는 것인, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 약물 저항성은 펌프 타입 저항성 및 비펌프 타입 저항성으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것인, 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 약물은 암, 노인성 황반병선, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약물인 것인, 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 조성물은 상기 약물에 대한 저항성 단백질의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 하이브리드 및 약물 저항성을 갖는 약물을 포함하며,
    상기 하이브리드는 상기 약물 저항성을 치료하는 것을 특징으로 하는 병용 투여용 약물 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 하이브리드 및 약물이 각각 제제화되어 동시적 또는 순차적으로 투여되는 형태인, 약물 키트.
  22. 제20항에 있어서, 상기 하이브리드 및 약물이 하나로 제제화되어 투여되는 형태인, 약물 키트.
  23. 5'방향에서 3'방향으로 순차적으로 위치한, 1종 이상의 siRNA의 센스가닥 서열, 루프영역 서열, 상기 센스가닥 서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 서열 및 링커 서열을 함유하는 반복단위를 포함하는 RNA 전사체에 상보적인 DNA 주형을 제조하는 단계;
    상기 DNA 주형 및 RNA 폴리머라제를 이용한 롤링-서클 전사(Rolling circle transcription, RCT)를 수행하여 상기 반복단위를 1 이상 포함하는 RNA 전사체를 제조하는 단계;
    상기 루프영역 서열에 상보적으로 결합 가능한 DNA 서열, 및 상기 DNA서열의 적어도 일 말단에 결합되며 소수성 물질 및 표적지향형 리간드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 DNA 접합체를 혼합하여 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드를 형성하는 단계를 포함하는 siRNA 전달용 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 하이브리드 형성 단계는 수용액상에서 이루어져 자가조립으로 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드로 이루어진 나노입자가 형성되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
KR1020160034772A 2016-03-23 2016-03-23 siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도 KR101780272B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160034772A KR101780272B1 (ko) 2016-03-23 2016-03-23 siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160034772A KR101780272B1 (ko) 2016-03-23 2016-03-23 siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101780272B1 true KR101780272B1 (ko) 2017-09-21

Family

ID=60034586

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160034772A KR101780272B1 (ko) 2016-03-23 2016-03-23 siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101780272B1 (ko)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Maha Saad 등. Nanomedicine (Lond). Vol. 3, No. 6, 페이지 761-776 (2008.12.)*
Mihue Jang 등. Nature Communications. Vol. 6, No. 7930, 페이지 1-12 (2015.08.06.)*

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Recent developments in nanoparticle‐based siRNA delivery for cancer therapy
Tekade et al. RNAi-combined nano-chemotherapeutics to tackle resistant tumors
Guo et al. Can non-viral technologies knockdown the barriers to siRNA delivery and achieve the next generation of cancer therapeutics?
EP1915449B1 (en) Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of sirna and method thereof
US20190185861A1 (en) Multi-conjugate of sirna and preparing method thereof
CN108779464B (zh) 使用靶向angpt2和pdgfb的rna复合物治疗血管生成相关性疾病
van den Brand et al. siRNA in ovarian cancer–Delivery strategies and targets for therapy
KR101734308B1 (ko) siRNA 표적-특이적 전달을 위한 RNA/DNA 나노입자 및 이를 포함하는 전달체
WO2008091465A2 (en) Peg and targeting ligands on nanoparticle surface
JP5969164B2 (ja) 電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結された高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子担体及びその製造方法
Tam et al. Therapeutic potentials of short interfering RNAs
KR20130085004A (ko) 자성나노입자-SAMiRNA 복합체 및 그 제조방법
KR101678876B1 (ko) 복합 유전자를 표적하는 ｓｉＲＮＡ 다중 접합체 및 이의 제조방법
US20140128451A1 (en) Compositions and Methods for Delivery of MicroRNA to Cells
WO2014165296A1 (en) Methods and formulations to achieve tumor targeted double stranded rna mediated cell death
JP2016531563A (ja) 肝臓癌関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ、そのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体及びこれを含む癌予防または治療用組成物
WO2018175445A1 (en) Poly(lactic-co-glycolic acid) (plga) spherical nucleic acids
US20120029062A1 (en) Interior functionalized hyperbranched dendron-conjugated nanoparticles and uses thereof
Abosalha et al. A comprehensive update of siRNA delivery design strategies for targeted and effective gene silencing in gene therapy and other applications
KR101757840B1 (ko) 암세포 선택적 약물 전달이 가능한 다중 일렬 헤어핀 dna 및 이의 약물전달체로서의 용도
KR101780272B1 (ko) siRNA의 동시 사일런싱이 가능한 RNA 전사체-DNA 접합체 하이브리드 및 이의 용도
KR101183989B1 (ko) 세포내 유전자 전달용 복합체, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 세포내로의 유전자 전달 방법
WO2010005741A1 (en) Nanogels for cellular delivery of therapeutics
Marangoni et al. RNA aptamer-functionalized polymeric nanoparticles in targeted delivery and cancer therapy: an up-to-date review
Jayaswal et al. Precision arrows: Navigating breast cancer with nanotechnology siRNA

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant