KR20100102597A - 에를리히아 카니스 ｄｉｖａ（감염된 동물을 백신접종된 동물과 구별） - Google Patents

에를리히아 카니스 ｄｉｖａ（감염된 동물을 백신접종된 동물과 구별） Download PDF

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Abstract

본 발명은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종 되었는지와 무관하게 에를리히아 카니스에 감염된 동물을 검출하는데 사용될 수 있는 에를리히아 카니스 항원을 제공한다. 본 발명은 또한 에를리히아 카니스 항원 및 항체의 존재를 결정하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

에를리히아 카니스 ＤＩＶＡ（감염된 동물을 백신접종된 동물과 구별）{EHRLICHIA CANIS DIVA (DIFFERENTIATE INFECTION FROM VACCINATED ANIMALS)}
우선권
본 출원은 2007년 10월 31일에 출원된 미국 출원 일련 번호 60/984,019를 우선권으로 주장하며, 상기 미국 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
에를리히아(Ehrlichia)는 포유동물 숙주에서 순환성 백혈구를 감염시키는 편성(obligate) 세포내 병원체이다. 에를리히아 카니스(Ehrlichia canis)는 개과동물(canine)과 사람을 감염시키고 개과동물 단핵구성 에를리히아증(CME)과 사람 단핵구성 에를리히아증(HME)을 각각 일으킬 수 있다. 상기 개과동물 질병은 발열, 림프절증(lymphadenopathy), 체중 감소 및 범혈구감소증(pancytopenia)을 특징으로 한다. 사람의 경우, 상기 질병은 발열, 두통, 근육통 및 백혈구감소증(leukopenia)을 특징으로 한다. 조기 검출 및 치료가 개과동물 에를리히아증과 사람 에를리히아증 둘 모두를 치료하는 데에 있어서 중요하다.
발명의 개요
일 구체예에서, 본 발명은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종 되었는지와 무관하게 에를리히아 카니스에 감염된 동물 (a) 및 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 동물 (b)을 구별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(a) 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하지 않는 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계로서, 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지니고 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드가 에를리히아 카니스에 특이적인 항체에 특이적으로 결합하는 단계; 및
(b) 생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 검출하는 단계를 포함한다.
샘플학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이다. 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드는 약 15개 내지 약 75개 아미노산의 길이일 수 있다. 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드는 이종 아미노산 서열, 지시약(indicator reagent), 아미노산 스페이서(spacer), 아미노산 링커(linker), 신호 서열, 이동 정지 서열(stop transfer sequence), 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다. 상기 방법은 생물학적 샘플 중의 항체가 에를리히아 카니스 백신의 엘리먼트인 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이고 에를리히아 카니스에 대한 백신접종 상태는 알 수 없다. 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 동물은 에를리히아 카니스에 감염되지 않았고 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 것이다. 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되지 않았고 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 구체예는 에를리히아 카니스에 대한 동물의 백신접종 또는 감염 상태를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(a) 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하지 않는 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드 (여기서 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지니고 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드는 에를리히아 카니스에 특이적인 항체에 특이적으로 결합한다) 및 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드 및 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 검출하는 단계를 포함한다.
생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이고 에를리히아 카니스에 대한 백신접종 상태는 알 수 없다. 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염되지 않았고 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 것이다. 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되지 않았고 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 것이다. 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드는 약 15개 내지 약 75개의 아미노산의 길이일 수 있다. 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드는 이종 아미노산 서열, 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다.
여전히 본 발명의 또 다른 구체예는 시험 샘플 중 에를리히아 카니스에 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(a) 시험 샘플을 SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지니는 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계로서, 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 약 15개 내지 약 72개의 아미노산의 길이이고, 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드가 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 하나 이상의 정제된 폴리펩티드의 특이적 결합에 적합한 조건하에 에를리히아 카니스에 특이적인 항체에 특이적으로 결합하는 단계; 및
(b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 하나 이상의 정제된 폴리펩티드의 특이적 결합의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 하나 이상의 정제된 폴리펩티드의 특이적 결합의 존재는 시험 샘플 중 에를리히아 카니스에 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재를 나타낸다. 하나 이상의 정제된 폴리펩티드는 이종 아미노산 서열, 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다. 상기 방법은 특이적 결합의 양을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 정제된 폴리펩티드는 고체 지지체에 고정될 수 있다.
심지어 본 발명의 또 다른 구체예는,
(a) SEQ ID NO:22-33으로 구성된 하나 이상의 정제된 폴리펩티드; 또는
(b) SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지니는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드로서, 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 약 15개 내지 약 75개의 아미노산 길이이고, 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 에를리히아 카니스에 특이적인 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드;
(c) SEQ ID NO:33 (여기서 1번 위치의 X는 부재하거나 C이고, 4번 위치의 X는 H 또는 Q이고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이다);
(b) SEQ ID NO:33의 아미노산 1-27 (여기서 1번 위치의 X는 C이고, 4번 위치의 X는 H이고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이다);
(e) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고; C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(f) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(g) SEQ ID NO:33의 아미노산 1-27 (여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이다);
(h) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(i) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(j) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-27 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(k) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(l) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(m) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(n) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다); 또는
(o) 상기 (a)-(n)의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다.
하나 이상의 정제된 폴리펩티드는 다합체 형태일 수 있다. 하나 이상의 정제된 폴리펩티드 이종 단백질, 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지니는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드 또는 이의 조합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하여 동물에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공하며, 여기서 하나 이상의 정제된 폴리펩티드는 동물에서 면역 반응을 생성한다. 하나 이상의 정제된 폴리펩티드는 약 15개 내지 약 75개의 아미노산의 길이일 수 있다. 하나 이상의 정제된 폴리펩티드는 다합체 형태일 수 있다. 하나 이상의 정제된 폴리펩티드 이종 단백질, 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합될 수 있다.
여전히 본 발명의 또 다른 구체예는
(a) SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 서열 동일성을 지니는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드 또는 이의 조합물; 또는
(b) SEQ ID NO:22-33을 포함하는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 이의 조합물; 또는
(c) SEQ ID NO:22-33을 포함하는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 이의 조합물을 동물에게 투여하여 에를리히아 카니스 감염을 예방, 개선 또는 치료하는 것을 포함하여, 동물에서 에를리히아 카니스 감염을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 구체예는 (a) 제 10항의 방법에 의해 에를리히아 카니스 감염에 대한 치료 이전에 또는 치료의 초기 단계에 환자로부터의 제1 샘플 중 항-에를리히아 카니스 항체의 수준을 측정하는 단계; (b) 제 10항의 방법에 의해 치료가 수행된 후 환자로부터의 제2 샘플 중 항-에를리히아 카니스 항체의 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 제1 샘플 중 항-에를리히아 카니스 항체의 양을 제2 샘플 중 항-에를리히아 카니스 항체의 양과 비교하여 변화를 평가함으로써 치료를 모니터링하는 단계를 포함하여 환자에서 에를리히아 카니스 감염의 치료를 모니터링하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 실험실 비글의 SNAP® 3Dx® 검정 평가를 도시한다. SANP® 장치를 제조자가 개시한 대로 이용하였다. "Pre" 샘플은 0일에 얻은 것이다. "Post" 샘플은 42일에 얻은 것이다. 에를리히아 카니스 양성 스폿은 4마리 개 모두의 42일차 샘플에서 양성이 되었다. 유사한 결과가 70일차 샘플에 대해 관찰되었다.
도 2는 2D 겔 전기영동을 이용하여 분리된 에를리히아 카니스 단백질의 겔을 도시한다. BIOSAFE™ 코마시 블루 (Bio-Rad Inc.)로 염색하였다.
도 3은 0일에 회수된 개 혈청을 이용한 에를리히아 카니스 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한다. 혈장 희석은 1:100이다. 이러한 개들은 에를리히아 카니스 항원과의 반응성이 음성이었다.
도 4는 백신접종된 네 마리 동물의 풀(pool)로부터의 개 혈청을 이용한 에를리히아 카니스 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한다. 혈청 희석은 1:100이다.
도 5는 감염된 동물의 풀로부터의 개 혈장을 이용한 에를리히아 카니스 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한다. 혈청 희석은 1:1000이다.
도 6은 대장균(E. coli)에서 발현되고, 네 마리의 감염된 동물 (A)의 풀로부터의 개 혈청이나 네 마리의 백신접종된 동물 (B)로부터 풀링된 개 혈청으로 프로빙된 여섯 개의 상이한 에를리히아 카니스 DIVA 항원의 웨스턴 블롯을 도시한다. 혈청 희석은 백신접종된 동물에 대해 1:100 또는 감염된 동물에 대해 1:500이었다. 표시된 DIVA 항원은 하기를 포함한다: (1) 200kDa 항원, (2) 리보솜 단백질 L1, (3a 및 3b) "ATPase"-두 상이한 세그먼트, (4) 120kDa 항원, (5) 열 쇼크 단백질/p16 항원.
도 7은 클로닝된 p16 항원이 에를리히아 카니스에 감염되었으나 백신접종되지 않은 개로부터의 혈청("챌린지된 혈청"으로서 제시됨)에 의해 인지됨을 입증한다. p16 항원을 발현시키는 벡터 또는 본래 유전체 단편(+C)으로 형질전환된 유도되지 않거나(U) 유도된(I) 세균으로부터의 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다.
도 8은 감염, 치료 및 회복을 포함하는 시간 경과 동안 개에서 SEQ ID NO:23으로 도시된 폴리펩티드를 이용한 에를리히아 카니스에 특이적인 항체의 검출을 입증한다.
도 9A-B는 감염의 시간 경과에 따라 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되지 않은 두 마리의 개에서 SEQ ID NO:10으로 도시된 폴리펩티드를 이용한 에를리히아 카니스에 특이적인 항체의 검출을 입증한다.
도 10A-C는 감염의 시간 경과에 따라 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 (RIBI 애쥬번트) 세 마리의 개에서 SEQ ID NO:10으로 도시된 폴리펩티드를 이용한 에를리히아 카니스에 특이적인 항체의 검출을 입증한다.
도 11A-C는 감염의 시간 경과에 따라 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 (RIBI + BCG 애쥬번트) 세 마리의 개에서 SEQ ID NO:10으로 도시된 폴리펩티드를 이용한 에를리히아 카니스에 특이적인 항체의 검출을 입증한다.
발명의 상세한 설명
에를리히아 카니스 항원은 에를리히아 카니스에 자연 감염된 동물을 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 동물과 구별하는데 이용될 수 있는 것으로 기술된다. "백신접종된"은 병원체에 대한 면역성을 수립하거나 개선시킴에 의해 병원체에 의한 감염 효과를 예방하거나 개선시킬 수 있는 백신 조성물의 투여를 의미한다. 백신 조성물은 죽은, 불활성화된 또는 약독화된 병원체나 병원체의 정제된 생성물 또는 일부를 포함할 수 있다. 백신접종이 반드시 100% 효과적인 것은 아니다.
본 발명을 상세하게 기술하기에 앞서, 다수의 용어를 정의할 것이다. 본원에서 사용된 단수형은 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 단일 사슬의 화합물 또는 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기의 둘 이상의 사슬의 복합체를 언급한다. 사슬(들)은 임의의 길이일 수 있고 융합 단백질을 포함할 수 있다. "단백질"이 종종 비교적 큰 폴리펩티드에 관해 이용되고 "펩티드가" 종종 작은 폴리펩티드에 관해 이용되나, 이러한 용어들의 사용은 당 분야에서 부분적으로 중복되며 변화된다. 따라서 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 달리 언급되지 않는 한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 융합 단백질과 상호교환적으로 사용된다. 용어 "아미노산"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단량체 유닛을 언급한다. 용어 "폴리펩티드"는 한 유형의 폴리펩티드 중 하나 이상을 언급할 수 있다 (한 세트의 폴리펩티드). "폴리펩티드"는 또한 둘 이상의 상이한 유형의 폴리펩티드의 혼합물을 언급할 수 있다 (폴리펩티드의 혼합물). 용어 "폴리펩티드들" 또는 "폴리펩티드"는 또한 "하나 이상의 폴리펩티드들"을 각각 의미할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 "분리될" 수 있다. 분리된 폴리펩티드는 자연 상태에서 이것이 결합되어 있는 아미노 및 카르복시 플랭킹(flanking) 아미노산 서열 중 하나 또는 둘 모두와 바로 연속된 상태로 존재하지 않는 폴리펩티드이다. 특히, "SEQ ID NO:22-33에 도시된 분리된 폴리펩티드"는 폴리펩티드가 에를리히아 카니스 단백질 분자에서 (폴리펩티드가 천연 폴리펩티드인 경우) 자연 상태에서 이것이 결합되어 있지 않은 아미노 및 카르복시 플랭킹 아미노산 서열 중 하나 또는 둘 모두와 바로 연속된 상태로 존재하지 않는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "항원"은 피검체가 이에 대해 체액 및/또는 세포 면역 반응을 개시할 수 있는 분자를 언급한다. 항원은 예를 들어 단순한 중간 대사산물, 당, 지질 및 호르몬뿐만 아니라 복합 탄수화물, 인지질, 핵산 및 단백질과 같은 거대분자를 포함하는 임의의 유형의 생물학적 분자일 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에서, 항원은 폴리펩티드일 수 있고, 예컨대 적어도 약 6개 이상의 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용된 에를리히아 카니스 항원 폴리펩티드의 "유도체" 또는 에를리히아 카니스 항원 또는 폴리펩티드"로부터 유래된" 항원 또는 폴리펩티드는 원시 형태가 정제, 개질 또는 변경된 항원 또는 폴리펩티드를 언급한다. 이러한 개질은 이로 제한되는 것은 아니나 아미노산 치환, 변형, 첨가 또는 결실; 지질화, 글리코실화 또는 포르포릴화 패턴의 변경; 폴리펩티드에 존재하는 유리 아미노, 카르복실, 또는 아미노산 잔기의 히드록실 측기와 다른 유기 및 무기 분자의 반응; 및 다른 변형을 포함하며, 이들 중 어느 것도 일차, 이차 및 삼차 구조의 변화를 초래할 수 있다.
"생물학적 샘플"은 면역글로불린을 함유할 것으로 예상되는 동물로부터의 임의의 샘플이다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 혈장, 혈액, 혈청, 타액, 소변, 대변, 창상 삼출액(wound exudate), 뇌척수액(CSF), 정액, 가래(sputum)뿐만 아니라 조직 추출물, 및 세포 추출물일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 시험 샘플은 말, 개, 소, 야마, 양, 염소, 사슴, 엘크, 설치류 또는 임의의 다른 동물과 같은 동물로부터 수득될 수 있다. 사람은 본원에서 동물로 고려된다. 이러한 예가 본 발명에 적용될 수 있는 샘플 유형이나 동물을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
"감염", 예컨대 에를리히아 카니스 감염은 동물이 에를리히아 카니스의 임상적 징후를 나타내는 지와 무관하게 동물이 에를리히아 카니스에 노출된 것을 의미한다. 천연 감염은 진드기에 의한 전파와 같이 에를리히아 카니스에 대한 천연 전파 방법 중 하나의 결과로서 발생하는 노출을 언급한다. 감염은 백신접종을 통한 에를리히아 카니스로의 노출을 포함하지 않는다.
"에를리히아 카니스 백신의 엘리먼트가 아닌 폴리펩티드 또는 항원"은 특정 에를리히아 카니스 백신 또는 백신들에 존재하지 않는 임의의 에를리히아 카니스 폴리펩티드 또는 항원이다. "에를리히아 카니스 백신의 엘리먼트가 아닌 폴리펩티드 또는 항원"은 또한 에를리히아 카니스 백신의 면역원적으로 활성인 부분이 아닌 임의의 에를리히아 카니스 폴리펩티드 또는 항원이다. 즉, 폴리펩티드 또는 항원은 백신에 존재할 수 있으나 폴리펩티드 또는 항원에 대한 면역 반응 (예컨대 폴리펩티드 또는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생성)은 에를리히아 카니스 백신의 투여에 반응하여 일어나지 않는다. 백신(들)의 엘리먼트는 전체에 못 미치는 세균을 포함하는 서브유닛 백신의 부분들일 수 있고; 이러한 부분들은 백신의 일부가 되기 전에 화학적으로 합성되거나 재조합에 의해 발현될 수 있으며, 이러한 부분들은 생체내 면역원성 조성물을 발현시키는 하나 이상의 벡터에 의해 엔코딩될 수 있다.
"에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체"는 에를리히아 카니스 백신으로의 백신접종 결과로서 유도된 항체를 언급한다. 이러한 항체는 천연 에를리히아 카니스 감염의 결과로서 유도된 항체와 동일하거나 유사할 수 있다. 이러한 항체는 충분한 역가를 유지하여 세균에 대한 보호 및 중화 효과를 제공할 것이다. 성공적인 백신접종은 에를리히아 카니스 백신의 구성요소에 의해 유도된 항체(또는 항체들)의 측정가능한 수준을 제공한다. 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소일 수 있는 항체들을 유도하는 에를리히아 카니스 항원의 예는 p28-1, p28-2, p28-3, p28-4, p28-5, p28-6, p28-7, p28-8, p28-9 (미국특허 6,660,269; 6,458,942; 6,403,780; 6,392,023 참조), proA, ProB, mmpA, 시토크롬 옥시다아제 (미국특허공개 20040170972 참조), p153의 N-말단 부분인 p43 (미국특허 6,355,777 참조), 당단백질 (미국특허공개 2004/0121433 참조), p153, 및 p30-1, p30-2, p30-3, p30-4, p30-5, p30-6, p30-7, p30-8, p30-9, p30-10, p30-11, p30-12, p30-13, p30-14, p30-15, p30-16, p30-17, p30-18, p30-19, p30-20 (Ohashi et al. 2001, Infection and Immunity 69(4): 2083-91)이다.
면역 반응이란 생물체에서 폴리펩티드와 같은 항원에 대한 세포 및/또는 항체 매개된 면역 반응의 발생이다. 일반적으로 이러한 반응은 이로 제한되는 것은 아니나 하기 중 하나 이상을 포함한다: 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서(suppressor) T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생성. 면역 반응은 당업자에게 공지된 여러 검정 중 어느 것을 이용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드
에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 동물로부터의 생물학적 샘플은 백신에 반응하여 생성된 항체의 존재로 인해 에를리히아 카니스 감염에 대한 시험에서 양성 결과를 생성할 가능성이 있다. 일 측면에서, 본 발명은 동물이 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되었는 지와 무과한게, 에를리히아 카니스에 감염된 동물과 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 동물을 구별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 동물로부터의 생물학적 샘플을 특정 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하지 않으나 에를리히아 카니스에 의한 감염에 반응하여 생성된 항체에 특이적으로 결합하는 에를리히아 카니스로부터 유래된 항원과 접촉시키는 것을 포함한다.
동물에서 백신에 대한 에를리히아 카니스 항체의 발생은 동물을 백신접종하기 위해 사용된 특정 백신에 의존적이다. 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 동물과 자연적으로 또는 실험적으로 에를리히아 카니스에 감염된 동물의 면역 반응의 차이는 동물이 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되었는 지와 무관하게 동물이 자연적으로 또는 실험적으로 에를리히아 카니스에 감염되었는 지를 결정하는 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 에를리히아 카니스에 감염된 동물을 에를리히아 카니스에 감염되지 않았고/거나 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 동물과 구별할 수 있다. 본 발명의 항원, 이들의 면역지배(immunodominant) 영역 및 에피토프가 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 이러한 조성물을 에를리히아 카니스 DIVA(Differentiate Infected from Vaccinated Animals) 항원으로서 언급할 수 있다. 에를리히아 카니스 DIVA 항원은 특정 에를리히아 카니스 백신에 의해 동물에서 유도된 면역 반응과 상이한 면역 반응, 예컨대 특수한 항체의 생성을 동물에서 유도한다.
따라서, 에를리히아 카니스 DIVA 항원과 특정 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소가 아닌 항원간 특이적 결합의 검출은 천연 또는 실험 에를리히아 카니스 감염을 나타낼 수 있다. 이러한 결합의 부재는 에를리히아 카니스 감염의 부재를 나타낼 수 있다. 또한, 특정 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하는 에를리히아 카니스 항원과 같은 제2의 분리된 항원을 이용하여 백신접종에 반응하여 생성된 항체를 검출할 수 있다 (본원에서 "에를리히아 카니스 백신 항원"으로서 언급됨). 에를리히아 카니스 백신 항원은 특정 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라 에를리히아 카니스 감염에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체와도 특이적으로 결합할 수 있다. 에를리히아 카니스 백신 항원에 특이적인 항체가 검출되면, 그 동물은 백신접종되고/거나 감염되었다. 어떤 항체도 검출되지 않으면 감염되지 않고 백신접종되지 않은 것을 나타낸다. 이와 같이, 분리된 포획 시약의 다양한 조합물로 시험 피검체의 백신접종 및/또는 감염 상태를 결정할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 방법은 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 세균의 일부이나 특정 에를리히아 카니스 백신의 엘리먼트는 아닌 항원과 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 세균 및 에를리히아 카니스 백신에 존재하거나 이의 일부인 항원과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 항원에 대한 면역 반응은 (예컨대 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생성) 에를리히아 카니스 세균으로의 감염에는 반응하여 생성되나 에를리히아 카니스 백신의 투여에 반응해서는 생성되지 않는다. 또 다른 측면에서, 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 DIVA 항원에 특이적인 항체의 존재 또는 부재 및 에를리히아 카니스 백신 항원에 특이적인 항체의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 분석한다. 이후 이러한 항체의 부재를 결정함에 의해 동물이 감염되지 않았고 백신접종되지 않았거나 백신접종된 것을 결정한다.
본 발명의 일 측면에서, DIVA 항원은 에를리히아 카니스 백신의 엘리먼트가 아니다. 본 발명의 또 다른 측면에서, DIVA 항원은 에를리히아 카니스 백신의 일부이나 면역 반응 (예컨대 DIVA 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생성)은 에를리히아 카니스 백신의 투여에 반응하여 생성되지 않는다. 동물의 백신접종 또는 감염 상태는 샘플 중 항체가 하나 이상의 에를리히아 카니스 백신 항원에 특이적으로 결합하는지와 샘플 중 항체가 하나 이상의 DIVA 항원에 특이적으로 결합하는지를 검출함에 의해 결정될 수 있다. 샘플 중 항체가 백신 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하고 DIVA 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이고 동물의 백신접종 상태는 알 수 없다. 샘플 중 항체가 에를리히아 카니스 백신 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하고 DIVA 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하지 않으면, 그 동물은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되고 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 것이다. 샘플 중 항체가 에를리히아 카니스 백신 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하지 않고 DIVA 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하지 않으면, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염되지 않았고 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되지 않은 것이다.
본 발명의 일 측면은 에를리히아 카니스 백신 상태와 무관하게 에를리히아 카니스에 감염된 동물 (a) 및 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 동물 (b)을 구별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하지 않는 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드와 접촉시키는 단계로서, 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드가 SEQ ID NO:22-33 또는 이의 조합물을 포함하는 단계, 및 샘플 중의 항체가 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 검출하는 단계를 포함한다. 샘플 중 항체가 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이고; 샘플 중 항체가 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 실제로 특이적으로 결합하지 않는 경우, 동물은 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 것이다.
상기 방법은 샘플 중 항체가 에를리히아 카니스 백신 항원을 포함하는 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 샘플 중 항체가 에를리히아 카니스 백신 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하고 DIVA 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이고 동물의 백신접종 상태는 알 수 없다. 샘플 중 항체가 에를리히아 카니스 백신 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하고 DIVA 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하지 않는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되고 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 것이다. 샘플 중 항체가 에를리히아 카니스 백신 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하지 않고 DIVA 항원 중 하나 이상에 특이적으로 결합하지 않는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염되지 않았고 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되지 않은 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 시험 샘플 중 항체는 DIVA 항원 및/또는 에를리히아 카니스 백신 항원에 실제로 특이적으로 결합하지 않는다. 실질적으로 어떠한 결합도 당업자에 의해 음성 결과로서 고려될 결합의 양이다.
본 발명의 일 측면은 에를리히아 카니스에 대한 동물의 백신접종 및 감염 상태를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(a) 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 실제로 특이적으로 결합하지 않는 제1 정제된 폴리펩티드 (여기서 제1 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:22-33 또는 이들의 조합물을 포함한다) 및 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(b) 샘플 중의 항체가 제1 및 제2 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 검출하는 단계를 포함하고;
여기서 생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이고 에를리히아 카니스에 대한 백신접종 상태는 알 수 없고; 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 동물은 에를리히아 카니스에 감염되지 않았고 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 것이고; 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되지 않았고 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 것이다.
표 1은 에를리히아 카니스 DIVA 항원 및 에를리히아 카니스 백신 항원으로 측정될 수 있는 동물의 감염 및/또는 백신접종 상태를 설명한다. 표 1의 "Not Done"은 특정 시험이 완료되지 않아서 결과를 입수할 수 없음을 의미한다. 예를 들어 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 DIVA 항원으로 시험하였고 그 결과가 양성이고 시험이 에를리히아 카니스 백신 항원으로 완료되지 않은 경우, 동물의 상태는 감염된 것이지만 백신접종 상태는 알 수 없다.
동물의 감염/백신접종 상태 에를리히아 카니스
DIVA 항원으로의 결과		 에를리히아 카니스 백신 항원*으로의 결과
감염됨, 백신접종 상태 알 수 없음 양성 Not Done
감염됨, 백신접종 상태 알 수 없음 양성 양성
백신접종됨, 감염되지 않음 음성 양성
백신접종되고/거나 감염됨 Not Done 양성
감염되지 않음, 백신접종되지 않음 음성 음성
감염되지 않음, 백신접종 상태 알 수 없음 음성 Not Done
백신접종되지 않음, 감염되지 않음 Not Done 음성
*에를리히아 카니스 백신 항원은 특정 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합한다. 에를리히아 카니스 백신 항원은 특정 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라 에를리히아 카니스 감염에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에도 결합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 시험 샘플 중 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공하고, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:10, 22-33 또는 이들의 조합물로 구성된 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 상기 방법은 시험 샘플을 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 정제된 폴리펩티드의 특이적 결합에 적합한 조건하에 SEQ ID NO:10, 22-33 또는 이들의 조합물을 포함하는 정제된 폴리펩티드와 접촉시키고, 특이적 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 특이적 결합의 존재는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재를 나타내고, 특이적 결합의 부재는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 부재를 나타낸다.
백신이 감염을 예방하거나 개선시키는데 완전히 효과적인 것은 아닐 수 있다. 따라서, 백신접종된 동물이 백신접종에도 불구하고 감염되는 지를 결정하는 방법이 있는 것이 바람직할 수 있다. SEQ ID NO:10, 22-33은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되고 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 개에서 항-에를리히아 카니스 항체를 검출하지 않는다. SEQ ID NO:10, 22-33은 에를리히아 카니스 백신을 투여받았거나 투여받지 않은 개에서 에를리히아 카니스 감염을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 동물은 에를리히아 카니스 백신을 투여받은 후에 에를리히아 카니스에 감염되고 에를리히아 카니스의 검출은 여전히 가능하다.
본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO:10, 22-33 또는 이들의 조합물을 포함하거나 이들로 구성된 하나 이상의 정제된 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성된 조성물을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 번역-후 변형될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 세포 물질, 다른 유형의 폴리펩티드, 화학적 전구물질, 폴리펩티드의 합성에 사용된 화학물질, 또는 이들의 조합물이 실제로 없는 폴리펩티드 제조물이다. 세포 물질, 배양 배지, 화학적 전구물질, 폴리펩티드의 합성에 사용된 화학물질 등이 실제로 없는 폴리펩티드 제조물은 약 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 그 보다 작은 비율의 다른 폴리펩티드, 배양 배지. 화학적 전구물질, 및/또는 합성에 사용된 다른 화학물질을 지닌다. 따라서, 정제된 폴리펩티드의 순도는 약 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과이다. 정제된 폴리펩티드는 순도가 70% 이하인, 폴리펩티드들의 미정제되거나 반-정제된 세포 추출물 또는 혼합물을 포함하지 않는다.
본 발명의 일 구체예는 SEQ ID NO:22-33을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 폴리펩티드는 약 50, 45, 40, 35, 30, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6개 (또는 50개 내지 6개 사이의 임의의 범위) 또는 그 미만의 연속적인 천연 에를리히아 카니스 아미노산으로 구성된다 (즉, 정제된 폴리펩티드는 완전한 천연 에를리히아 카니스 폴리펩티드를 포함하지 않는다). 천연 에를리히아 카니스 아미노산은 에를리히아 카니스 생물체에 의해 자연적으로 생성된 임의의 폴리펩티드이다. 본 발명의 일 구체예에서, 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:22-33을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 (또는 약 6개 내지 100개 아미노산 사이의 임의의 범위) 또는 그 초과의 연속적인 천연 에를리히아 카니스 아미노산을 포함한다.
폴리펩티드 SEQ ID NO:22-33이 전장 에를리히아 카니스 폴리펩티드 보다 짭다는 사실은 중요한데, 그 이유는 짧은 폴리펩티드일수록 검출 검정에서 전장 폴리펩티드보다 더 큰 특이성 및/또는 감수성을 지닐 수 있기 때문이다. 추가로, 이러한 짧은 폴리펩티드는 제조하는데 비용이 덜 들고, 전장 폴리펩티드보다 높은 순도로 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 약 50, 45, 40, 35, 30, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6개 미만의 연속적인 천연 에를리히아 카니스 아미노산 및 SEQ ID NO:22-33 중 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개를 초과하는 연속적인 아미노산 (또는 6개 내지 100개 아미노산 사이의 임의의 범위)인 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 약 15개 내지 약 30개; 약 15개 내지 약 50개; 또는 약 15개 내지 약 100개 아미노산의 길이일 수 있다.
변이체 폴리펩티드는 SEQ ID NO:22-33에 도시된 폴리펩티드 서열과 적어도 약 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상 동일하고 이들 또한 본 발명의 폴리펩티드이다. 변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 보존적 아미노산 변이 또는 다른 근소한 변형을 지니고 생물학적 활성을 보유하며, 즉 생물학적으로 작용성인 등가물이다. 생물학적으로 활성인 등가물은 상응하는 야생형 폴리펩티드에 비해 실질적으로 동등한 기능을 지닌다. 본 발명의 일 구체예에서, 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20개 또는 그 미만의 보존적 아미노산 치환을 지닌다.
이러한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:22-33의 것들 외에 추가의 아미노산 잔기를 지닐 수 있다. 즉, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 5' 또는 3'측 말단에 첨가된 추가의 아미노산 잔기를 지닐 수 있는 한편, SEQ ID NO:22-33의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 또는 48개의 연속적인 아미노산에 따른 (특정 서열번호의 길이에 의존함) 서열 동일성은 적어도 약 95%이다. 폴리펩티드의 5' 또는 3'측 말단에 첨가된 추가의 아미노산은 서열 동일성 퍼센티지에 영향을 미치지 않는 것으로 고려된다. 추가의 아미노산은 천연 발생인 것들이거나 비-천연 발생 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들어 약 15개 내지 약 50개 또는 약 75개의 아미노산 길이일 수 있다.
변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 다른 근소한 변형을 지니고 생물학적 활성을 보유하며, 즉 생물학적으로 작용성인 등가물이다. 생물학적으로 활성인 등가물은 상응하는 야생형 폴리펩티드에 비해 실질적으로 동등한 기능을 지닌다.
서열 동일성%는 당 분야에 인지된 효능을 지니고 두 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열간 동일성을 측정하는 다수의 방법이 있다. 참조[예컨대, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing : Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data , Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991). Methods for aligning polynucleotides or polypeptides are codified in computer programs, including the GCG program package (Devereux et al., Nuc . Acids Res . 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J. Molec . Biol. 215:403 (1990)), and Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) which uses the local homology algorithm of Smith and Waterman (Adv . App . Math ., 2:482-489 (1981)). 예를 들어, 갭 오픈 페널티가 -12이고 갭 연장 페널티가 -2인 애핀(affine) 갭 탐색과 함께, FASTA 알고리듬을 적용하는 컴퓨터 프로그램 ALIGN을 이용할 수 있다.
특정 서열이 예를 들어 참조 서열과 약 95% 동일한 지를 측정하기 위해 임의의 서열 정렬 프로그램을 이용할 때, 동일성 퍼센티지가 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 산출되고 참조 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 수의 5% 이하의 동일성에 갭이 허용되도록 파라메터가 설정된다.
변이체 폴리펩티드는 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드 서열 중 하나를 변형시키고 변형된 폴리펩티드가 생물학적 등가물인 지를 결정하기 위해 이의 특성을 평가함에 의해 확인될 수 있다. 변이체가 면역조직화학 검정, 효소-결합된 면역흡수 검정 (ELISA), 방사능면역검정 (RIA), 면역효소 검정 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 검정에서 실제로 본 발명의 폴리펩티드처럼 반응한다면, 예컨대 원래 폴리펩티드 활성의 90-110%를 지닌다면, 이것은 생물학적 등가물이다. 일 구체예에서, 검정은 경쟁 검정이고, 여기서 생물학적으로 동등한 폴리펩티드는 상응하는 반응성 항원 또는 항체에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 약 80, 95, 99, 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다. 상응하는 야생형 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체도 변이체 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
보존적 치환이란 펩티드 화학 분야의 당업자가 폴리펩티드의 이차 구조 및 수치료(hydropathic) 특성이 실제로 변경되지 않았음을 예상할 수 있도록 아미노산을 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시킨 것이다. 일반적으로, 하기 그룹의 아미노산이 보존적 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
본 발명의 폴리펩티드는 단백질의 전달을 동시 번역적으로 또는 후 번역적으로 유도하는 신호(또는 리더(leader)) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드(poly-His)의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하거나 고형 지지체에 대한 폴리펩티드의 결합을 강화시키는 링커 또는 그 밖의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 영역 또는 소 혈청 알부민에 컨쥬게이션될 수 있다.
폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드가 자연 상태에서 정상적으로 결합되지 않는 아미노산 서열, 즉 이종성 아미노산 서열에 공유결합되거나 비공유결합될 수 있다. 이종성 아미노산 서열은 비-에를리히다 카니스 생물체, 합성 서열, 또는 자연 상태에서 본 발명의 폴리펩티드의 카르복시 또는 아미노 말단에 위치하지 않는 에를리히아 카니스 서열로부터 유래될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 지시약과 같이 아미노산이 아닌 화합물 또는 분자에 공유결합 또는 비공유결합될 수 있다. 폴리펩티드는 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 면역 반응을 개선시키는 부분 (즉, 폴리펩티드 또는 다른 화합물일 수 있는 작용기)(예컨대 IL-2와 같은 시토킨), 정제를 촉진시키는 부분 (예컨대 6-히스티딘 태그(tag), trpE, 글루타티온, 말토오스 결합 단백질), 또는 폴리펩티드 안정성을 촉진시키는 부분 (예컨대 폴리에틸렌, 글리콜, 아미노 말단 보호기, 예컨대 아세틸, 프로필, 숙시닐, 벤질, 벤질옥시카르보닐 또는 t-부틸옥시카르보닐; 카르복실 말단 보호기, 예컨대 아미드, 메틸아미드 및 에틸아미드)에 결합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 단백질 정제 리간드는 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 또는 두 말단 모두에서의 하나 이상의 C 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 스페이서는 본 발명의 폴리펩티드와 자연 상태에서 결합되어 있지 않은 아미노산 서열이다. 아미노산 스페이서는 약 1, 5, 10, 20, 100, 또는 1,000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
요망시, 폴리펩티드는 그 밖의 아미노산 서열, 예를 들어, 아미노산 링커, 아미노산 스페이서, 신호 서열, TMR 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 및 단백질 정제에 유용한 리간드, 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 히스티딘 태그, 및 스태필로코쿠스(staphylococcal) 단백질 A, 또는 이들의 조합물을 또한 함유할 수 있는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 본 발명의 하나를 초과하는 폴리펩티드가 융합 단백질에 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편은 본 발명의 융합 단백질에 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 비-에를리히아 카니스 단백질 또는 비-에를리히아 카니스 p16 단백질에 작동가능하게 결합되어 융합 단백질을 형성할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33에 도시된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 자연 상태에서 발생하지 않는다. 용어 "작동가능하게 결합된"은 본 발명의 폴리펩티드 및 기타 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 서로 인-프레임(in-frame) 융합된 것을 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드는 다합체 형태일 수 있다. 즉, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 이의 조합물의 하나 이상의 복사체를 포함할 수 있다. 다합체 폴리펩티드는 다중 항원 펩티드(multiple antigen peptide, MAP)일 수 있다. 참조[예컨대, Tam, J. Immunol. Methods, 196:17-32 (1996)].
본 발명의 폴리펩티드는 에를리히아 카니스에 대해 특이적인 항체에 의해서 인지되는 항원을 포함할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프(즉, 항원성 결정인자)를 포함할 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 연속성 에피토프 또는 형태적(conformational) 에피토프일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 내의 에피토프는 몇 가지 방법에 의해서 확인될 수 있다. (참조예: 미국 특허 번호 제4,554,101호; Jameson & Wolf, CABIOS 4:181-186 (1988)). 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 분리되고 스크리닝될 수 있다. 전체 폴리펩티드 서열을 함께 스패닝(spanning)하는 일련의 짧은 펩티드는 단백질분해 절단에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 30-머(mer) 폴리펩티드 단편(또는 보다 작은 단편)으로 시작함으로써, 각각의 단편은 ELISA에서 인지되는 에피토프의 존재에 대해서 시험될 수 있다. 예를 들어, ELISA 검정에서, 에를리히아 카니스 폴리펩티드, 예를 들어, 30-머 폴리펩티드 단편이 고형 지지체, 예를 들어, 플라스틱 다중-웰 플레이트의 웰에 부착될 수 있다. 항체 집단은 비-특이적 흡수가 차단되는 조건하에서 표지되고, 고형 지지체에 첨가되고, 비표지된 항원에 결합이 허용되며, 어떠한 결합되지 않은 항체 및 그 밖의 단백질은 세척된다. 항체 결합은, 예를 들어, 무색의 기질을 착색된 반응 생성물로 전환시키는 반응에 의해서 검출된다. 점진적으로 더 작으며 중첩되는 단편이 이어서 확인된 30-머로부터 시험되어 관심 에피토프를 맵핑(mapping)한다.
본 발명의 일 구체예에서, DIVA 항원은 면역지배 에피토프 또는 영역을 포함한다. 즉, 다른 에피토프에 비해 집단 중의 항체를 보다 빈번하게 유도하고 이에 결합되는 에피토프 또는 영역이다. 항원은 하나 이상의 면역지배 에피토프를 지닐 수 있다. 면역지배 에피토프는 예를 들어 폴리펩티드를 동물에게 투여한 후나 이러한 투여 이전에 폴리펩티드 상에 맵핑될 수 있다. (참조예: 미국특허 공개 2004/0209324호).
본 발명의 폴리펩티드는 재조합적으로 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당 분야에 널리 공지된 기술을 사용함으로써 적합한 발현숙주 세포 시스템에서 발현될 수 있는 재조합 발현 벡터 내로 도입될 수 있다. 다양한 세균, 효모, 식물, 포유동물 및 곤충 발현 시스템이 당 분야에서 이용될 수 있으며 어떠한 그러한 발현 시스템이 사용될 수 있다. 임의적으로는, 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 무세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 화학적으로 합성되거나 에를리히아 카니스 세포로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33에 도시된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 면역원성 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33을 갖는 폴리펩티드의 에피토프를 인지하는 항체 또는 다른 면역 반응(예를 들어, 면역계의 T-세포 반응)을 유발할 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 또한 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 또는 33에 도시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편일 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 단편은 약 50, 45, 40, 35, 30, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6개 (또는 약 50개 내지 약 6개 사이의 임의의 범위) 또는 그 미만의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 단편은 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 (약 6개 내지 약 100개 아미노산 사이의 임의의 범위) 또는 그 초과의 아미노산 길이일 수 있다.
에를리히아 카니스에 특이적인 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생물학적 유체 또는 조직에서 검출될 수 있다. 가장 간단한 방법은 일반적으로 면역검정 방법이다. 이러한 한 방법은 경쟁-기재 방법이며 여기서 혈청 샘플을 에를리히아 카니스 백신의 엘리먼트가 아닌 에를리히아 항원 (예컨대 에를리히아 카니스 DIVA 항원)과 미리 인큐베이션한 다음, 미세역가(microtiter) 플레이트와 같이 에를리히아 카니스 DIVA 항원에 특이적인 고정된 모노클로날 항체를 지니는 고체상에 첨가한다. 샘플 중 에를리히아 카니스 DIVA 항원에 특이적인 항체는 에를리히아 카니스 DIVA 항원이 고정된 항체에 결합하지 못하게 할 것이다. 고정된 항체에 대한 에를리히아 카니스 DIVA 항원의 임의의 결합은, 직접 표지되거나 표지를 지니는 또 다른 결합 파트너와의 결합을 통해 표지될 수 있는, 에를리히아 카니스 항원에 대한 제2 결합 파트너를 첨가함에 의해 검출될 수 있다. 양성 샘플, 즉 에를리히아 카니스 DIVA 항원에 특이적인 항체를 지니는 샘플은 표지로부터의 신호의 감소와 연관된다.
특정한 일 구체예에서, 생물학적 샘플 중 에를리히아 카니스 DIVA 항원에 대한 항체는, 샘플을 에를리히아 카니스 DIVA 항원과 접촉시키고 샘플을 항-DIVA 항원 모노클로날 항체로 코팅된 미세역가 플레이트에 첨가함에 의해 검출될 수 있다. 미세역가 플레이트로의 DIVA 항원의 결합은 DIVA 항원에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 첨가하고 HRP-컨쥬게이션된 당나귀 항-토끼 폴리클로날 항체를 첨가함에 의해 검출될 수 있다. 샘플 중 항체는 DIVA 항원이 고정된 항체에 결합하는 것을 방해함으로써 신호의 감소를 야기할 것이다.
에를리히아 카니스 DIVA 항원에 특이적인 항체를 검출하는 또 다른 방법은 에를리히아 카니스 DIVA 항원에 특이적인 항체를 함유할 것으로 여겨지는 생물학적 샘플을 고정된 에를리히아 카니스 DIVA 항원과 접촉시켜 면역학적 복합체를 형성하는 샌드위치 검정이다. 에를리히아 카니스 DIVA 항원에 특이적인 항체의 존재는 제2 항체와 같은 에를리히아 카니스 항체에 대한 표지된 파트너의 결합을 검출함에 의해 결정된다.
본 발명의 일 측면에서 에를리히아 카니스 DIVA 항원은 적합한 고체 지지체에 고정될 수 있다. 생물학적 샘플은 에를리히아 카니스 DIVA 항원과 접촉하게 되는데, 항-에를리히아 카니스 항체가 샘플에 존재하는 경우, 이러한 항체는 상기 항원에 결합된다. 결합은, 예컨대 효소, 방사선핵종, 미립자 또는 형광 표지와 같은 임의의 적합한 수단에 의해 검출될 수 있다. 적합한 구체예에서, 검출 시약은 (존재하는 경우) 항-에를리히아 카니스 항체를 포획하기 위해 사용된 것과 동일하거나 유사한 단백질에 결합될 수 있다. 특정한 일 구체예에서, 에를리히아 카니스에 대한 항체는 에를리히아 카니스 항원을 고체 지지체 상에 고정시킴에 의해 검출될 수 있다. 생물학적 샘플은 고체 지지체와 접촉할 수 있고, 결합되지 않은 샘플을 제거한 후에, 항원에 대한 에를리히아 카니스 항체의 결합이 예를 들어 표지된 IgG 항체로 달성될 수 있다.
본 발명의 DIVA 항원은 또한 본 발명의 DIVA 항원의 미미토프(mimitope)를 포함할 수 있다. 미미토프는 에피토프 제시 동안 천연 항원성 에피토프를 흉내낼 수 있는 랜덤 펩티드 에피토프이다. 랜덤 펩티드 에피토프는 랜덤 펩티드 에피토프의 라이브러리를 생성하거나 선택함에 의해 동정될 수 있다. 라이브러리를 항체와 접촉시킨다. 항체와 특이적으로 면역반응성인 미미토프가 동정된다. 랜덤 펩티드 라이브러리는 예를 들어 파지 상에 디스플레이되거나 조합 라이브러리로서 생성될 수 있다.
에를리히아 카니스 DIVA 항원, 예컨대 폴리펩티드는 천연발생, 즉 천연원으로부터 분리될 수 있거나 합성일 수 있다 (즉, 화학적으로 합성되거나 유전자 공학처리 기술을 이용하여 재조합적으로 생성됨). 천연 단백질은 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 기술에 의해 전체 세균으로부터 분리될 수 있다. 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 이용하여 널리 공지된 기술에 의해 적합한 친화성 컬럼을 제조할 수 있다.
면역학적으로 천연 에를리히아 카니스 단백질과 교차-반응성인 단백질을 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 약 100개 미만의 아미노산, 보다 일반적으로 약 80개 미만의 아미노산, 및 통상적으로 약 50개 미만의 아미노산을 지니는 폴리펩티드가 널리 공지된 메리필드(Merrifield) 고체상 합성 방법에 의해 합성될 수 있고 여기서 아미노산은 증량되는 사슬에 연속하여 첨가된다. (문헌 Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2156). 재조합 단백질도 이용될 수 있다. 이러한 단백질은 에를리히아 카니스 유전체의 요망되는 부분을 엔코딩하는 재조합 DNA 분자의 배양된 세포에서의 발현에 의해 생성될 수 있다. 에를리히아 카니스 유전체의 부분 자체는 통상적인 기술에 의해 분리된 세균으로부터 수득될 수 있는 천연 유전자를 지니며 천연이거나 합성일 수 있다.
에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 완전하지 않은 미생물 유전체를 함유하고, 단일가닥 또는 이중가닥 핵산일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, cDNA, 유전체 DNA, 화학적으로 합성된 RNA 또는 DNA이거나 이들의 조합물일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 다른 성분, 예를 들어 단백질, 지질 및 다른 폴리뉴클레오티드가 없는 상태로 정제될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 정제될 수 있다. 예를 들어 cDNA 또는 유전체 라이브러리, 또는 유전체 DNA 제한 분해물을 함유하는 겔 슬라이스내에 들어있는, 수 백개 내지 수 백만개의 다른 핵산 분자들 중에 존재하는 핵산 분자는 분리된 폴리뉴클레오티드로 간주되지 않아야 한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 설명된 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩한다. 본 발명의 일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33으로 제시되는 폴리펩티드, 이의 단편 또는 이들의 조합물을 엔코딩한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 약 200, 120, 100, 90, 75, 60, 57, 54, 45개 (또는 200개 내지 45개 사이의 임의의 범위) 미만의 연속적인 천연 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 약 45, 54, 57, 60, 75, 90, 100, 120, 150, 200개 (또는 45개 내지 200개 사이의 임의의 범위), 또는 그 초과의 연속적인 천연 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 정제된 폴리뉴클레오티드는 추가의 이종 뉴클레오티드 (즉, 에를리히아 카니스로부터 유래되지 않은 뉴클레오티드)와 추가의 에를리히아 카니스 아미노산을 포함할 수 있는데, 단, 추가의 서열들은 자연 상태에서 에를리히아 카니스 p16 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 다른 폴리뉴클레오티드와 연속적으로 존재하지 않아야 한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다른 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 링커, 신호 서열, TMR 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 히스티딘 태그 및 스태필로코커스 단백질 A와 같은 단백질 정제에 유용한 리간드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리될 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 자연 상태에서 이것이 결합되어 있는 5' 및 3' 플랭킹 유전체 서열 중 하나 또는 둘 모두와 바로 연속된 상태로 존재하지 않는 천연 폴리뉴클레오티드이다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 임의의 길이를 지닌 재조합 DNA 분자일 수 있는데, 단, 천연 유전체내에서 그러한 재조합 DNA 분자를 바로 플랭킹하는 자연 상태에서 발견되는 핵산 서열은 제거되거나 존재하지 않는다. 또한, 분리된 폴리뉴클레오티드는 비(非)-천연 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어 cDNA 또는 유전체 라이브러리, 또는 유전체 DNA 제한 분해물을 함유하는 겔 슬라이스내에 들어있는, 수 백개 내지 수 백만개의 다른 핵산 분자들 중에 존재하는 핵산 분자는 분리된 폴리뉴클레오티드로 간주되지 않아야 한다. 에를리히아 카니스에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열은 예컨대 젠뱅크로부터 수탁번호 NCBI: NZ_AAEJ01000001로서 입수할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전장 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 및 폴리펩티드 변이체 또는 융합 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 축퇴성(degenerate) 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 상보서열(complement)과 적어도 약 80%, 또는 약 90%, 96%, 98%, 또는 99% 동일한 상동 뉴클레오티드 서열이 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드이다. 서열 동일성 비율은 "폴리펩티드" 단락에 설명된 바와 같이 계산될 수 있다. 축퇴성 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 엔코딩하지만 유전 암호의 축퇴(degeneracy)로 인해 야생형 폴리뉴클레오티드 서열과 핵산 서열이 상이한 폴리뉴클레오티드이다. 생물학적으로 작용성인 에를리히아 카니스 폴리펩티드를 엔코딩하는 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드의 상보적 DNA(cDNA) 분자, 종 동족체(species homolog) 및 변이체가 또한 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 감염된 개체로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청, 타액 또는 조직에 존재하는 핵산 서열로부터 분리될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 자동 합성기를 사용하여 실험실에서 합성될 수 있다. 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전체 DNA 또는 cDNA로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위해 PCR과 같은 증폭 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나 자연 상태에서는 존재하지 않는 변경된 서열을 엔코딩할 수 있다. 요망되는 경우, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 인핸서, 또는 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 다른 조절 요소를 포함하는 발현 제어 요소를 포함하는 발현 벡터내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어 발현 벡터는 플라스미드, 예를 들어 pBR322, pUC 또는 ColE1, 또는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 타입 2 벡터 또는 타입 5 벡터일 수 있다. 임의로, 다른 벡터가 사용될 수 있는데, 이의 예로는 비제한적으로 신드비스(Sindbis) 바이러스, 시미안(simian) 바이러스 40, 알파바이러스(alphavirus) 벡터, 폭스바이러스(poxvirus) 벡터, 및 사이토메갈로바이러스 및 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 뮤린(murine) 육종 바이러스, 마우스 유선 종양 바이러스, 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스, 및 루(Rous) 육종 바이러스가 있다. 미니크로모솜(minichromosome), 예를 들어 MC 및 MCl, 박테리오파지, 파지미드, 효모 인공 염색체, 세균 인공 염색체, 바이러스 입자, 바이러스-유사(virus-like) 입자, 코스미드(cosmid) (파지 람다 cos 부위가 삽입된 플라스미드) 및 레플리콘(replicon) (세포에서 자체 제어를 받으며 복제할 수 있는 유전 요소)이 또한 사용될 수 있다.
발현 제어 서열에 작동적으로 결합된 폴리뉴클레오티드를 제조하고 이러한 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에서 발현시키는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (참조: 미국 특허 번호 4,366,246). 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 유도하는 하나 이상의 발현 제어 요소와 인접한 곳에 위치하거나 그 근처에 위치하는 경우 작동적으로 결합된 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 생물학적 샘플과 같은 시험 샘플에서 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 예를 들어 프로브로서 또는 PCR 프라이머와 같은 프라이머로서 사용될 수 있다. 프로브는 예를 들어 하이브리드화를 통해 전형적으로 서열 특이적 방식으로 표적 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 프라이머는, 효소 조작을 지원할 수 있고 그러한 효소 조작이 일어나도록 표적 핵산과 하이브리드화할 수 있는 프로브의 서브셋(subset)이다. 프라이머는 당 분야에서 이용가능한, 효소 조작을 간섭하지 않는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합물로부터 제조될 수 있다.
프로브 또는 프라이머는 SEQ ID NO:22-33으로 제시된 폴리펩티드를 엔코딩하는 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드일 수 있다.
핵산의 하이브리드화는 당 분야에서 잘 이해되어 있다. 전형적으로, 프로브는 당 분야에서 이용가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 임의의 조합물로부터 제조될 수 있다. 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 이러한 프로브와 프라이머의 능력은 소정의 시험 샘플에 상보적 서열이 존재하는 지를 검출하는 데에 상기 프로브와 프라이머가 사용될 수 있게 할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브와 프라이머는, 타액, 가래(sputum), 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 뇌척수액, 양막액, 창상 삼출액(wound exudate) 또는 조직을 포함하는 생물학적 샘플과 같은 시험 샘플내의, 상보적 서열에 하이브리드화될 수 있다. 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 겔 전기영동 또는 다른 크기별 분리(size separation) 기술에 적용될 수 있거나 크기별 분리없이 고정화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 표지될 수 있다. 적절한 표지 및 프로브와 프라이머를 표지하는 방법은 당 분야에 공지되어 있는데, 그 예로는 닉 번역(nick translation) 또는 키나아제에 의해 혼입되는 방사성 표지, 바이오틴 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 생체발광(bioluminescent) 표지, 금속 킬레이터 표지 및 효소 표지가 있다. 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드는 적절히 엄격한 하이브리드화 조건하에서 프로브 또는 프라이머와 접촉된다.
적용 용도에 따라, 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 다양한 선택도를 달성하기 위해 다양한 하이브리드화 조건이 사용될 수 있다. 높은 선택도를 필요로 하는 적용 용도의 경우, 비교적 엄격한 조건이 사용될 수 있는데, 예를 들어 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.15 M 염의 염 농도에 의해 제공되는 바와 같은 저염 및/또는 고온 조건이 사용될 수 있다. 더 낮은 선택도를 필요로 하는 적용 용도의 경우, 덜 엄격한 하이브리드화 조건이 사용될 수 있다. 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.14 M 내지 약 0.9 M 염의 염 농도가 사용된다. 시험 샘플로부터 상보적 폴리뉴클레오티드와 프로브 또는 프라이머를 포함하는 하이브리드화된 복합체가 검출된다는 것은 샘플내에 에를리히아 카니스 또는 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드가 존재함을 나타낸다.
항체
본 발명의 항체는 본 발명의 에를리히아 카니스 폴리펩티드, 본 발명의 폴리펩티드 변이체, 또는 이들의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 분자이다. 본 발명의 항체는 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 대해 특이적일 수 있는데, 예를 들어 SEQ ID NO:22-33 중 하나 이상에 대해 특이적인 항체이다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단일 사슬 항체(scFv), 또는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체의 항원-결합성 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 항원-결합 부분이며, 여기서 그러한 부분은 상기 온전한 항체의 Fc 영역의 중쇄 불변 도메인이 없다. 항원-결합성 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편이 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 항체 부류일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프에 결합한다. 항체는, 재조합 DNA 기술을 사용하여, 시험관내에서 제조되거나 적절한 실험 동물로 생체내에서 제조될 수 있다. 항체를 제조하고 이를 특성화하는 수단은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (참조: Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992)). 예를 들어, 폴리클로날 항체는, 본 발명의 폴리펩티드를 사람 또는 다른 영장류, 마우스, 랫트(rat), 토끼, 기니피그, 염소, 돼지, 개, 소, 양, 당나귀 또는 말과 같은 동물에게 투여함으로써 생성될 수 있다. 면역화시킨 동물로부터의 혈청을 수집하고, 예를 들어 암모늄 설페이트에 의한 침전에 이은 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피에 의해, 항체를 혈장으로부터 정제한다. 폴리클로날 항체를 생성시키고 이를 가공하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다.
"특이적으로 결합" 또는 "에 대해 특이적인"이라는 것은 제1 항원, 예를 들어 에를리히아 카니스 폴리펩티드가 다른 비특이적인 분자에 결합하는 것보다 더 높은 친화성을 나타내며 본 발명의 항체를 인지하고 이에 결합한다는 것을 의미한다. 또한, "특이적으로 결합" 또는 "에 대해 특이적인"이라는 것은 제1 항체, 예를 들어 SEQ ID NO:22-33에 대해 생성시킨 항체가 다른 비특이적 분자에 결합하는 것 보다 더 높은 친화성을 나타내며 SEQ ID NO:22-33을 인지하고 이에 결합한다는 것을 의미한다. 비특이적 분자는 상기 제1 항원과 에피토프를 공유하지 않는 항원이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 비특이적 분자는 에를리히아 종(Ehrlichia sp.)으로부터 유래되지 않은 것이고, 구체적으로는 에를리히아 샤핀시스 또는 에를리히아 카니스로부터 유래되지 않은 것이다. "에를리히아 종"은 에를리히아 속(genus)의 모든 종을 지칭한다. 예를 들어, 비특이적 항원에 결합하는 것 보다 더 효율적으로 제1 항원(예를 들어, 폴리펩티드)에 결합하는, 상기 제1 항원에 대해 생성시킨 항체는 상기 제1 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 설명될 수 있다. 일 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합성 부분은 이것이 107 l/mol 또는 그 초과의 결합 친화도 Ka를 나타내며 결합하는 경우 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29의 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합은, 예를 들어 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 효소결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 시험될 수 있다.
본 발명의 항체는, (a) SEQ ID NO:22-33 또는 이의 항원 결합 단편에 결합함에 있어서 기준 항체와 경합하고/거나, (b) 기준 항체와 동일한 에피토프인, SEQ ID NO:22-33 또는 이의 항원 결합 단편의 에피토프에 결합하고/거나, (c) 기준 항체와 실질적으로 동일한 Kd를 나타내며 SEQ ID NO:22-33 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하고/거나, (d) 기준 항체와 실질적으로 동일한 오프 레이트(off rate)를 나타내며 SEQ ID NO:22-33 또는 이의 단편에 결합하는, 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 여기서 상기 기준 항체는 107 l/mol 또는 그 초과의 결합 친화도 Ka를 나타내며 SEQ ID NO:22-22의 폴리펩티드 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합성 단편이다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 에피토프에 대해 생성시킨 모노클로날 항체가 또한 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드로 면역화시킨 마우스와 같은 포유동물로부터의 정상 B 세포를 예를 들어 HAT-감수성 마우스 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 에를리히아 카니스 특이적 항체를 생성시키는 하이브리도마는 RIA 또는 ELISA를 이용하여 확인될 수 있고, 반고형 한천에서의 클로닝 또는 한계 희석법(limiting dilution)에 의해 분리될 수 있다. 에를리히아 카니스 특이적 항체를 생성시키는 클론은 추가의 스크리닝 작업에 의해 분리된다. 모노클로날 항체는 표준 기술을 사용하여 특이성에 대해 스크리닝될 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 미세역가 플레이트에 결합시키고 ELISA 검정에 의해 모노클로날 항체가 결합하는 지를 측정함으로써 이루어진다. 모노클로날 항체를 생성시키고 이를 가공하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다 (참조: Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)). 모노클로날 항체의 특정 이소타입(isotype)은, 최초 융합체로부터 선택함으로써 직접 제조될 수 있거나, 클래스-스위치(class-switch) 변이체를 분리하기 위해 sib 선택 기술을 사용함으로써 이소타입이 상이한 모노클로날 항체를 분비하는 모체 하이브리도마(parental hybridoma)로부터 2차적으로 제조될 수 있다 (참조: Steplewski et al, P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spria et al, J. Immunolog. Meth. 74:307, 1984). 또한, 본 발명의 모노클로날 항체는 재조합 모노클로날 항체일 수 있다 (참조: 미국 특허 번호 4,474,893; 미국 특허 번호 4,816,567). 또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 만들어질 수 있다 (참조: 미국 특허 번호 4,676,980).
본 발명의 항체는 키메라 항체 (참조: 미국 특허 번호 5,482,856), 사람화된 항체 (참조: Jones et al, Nature 321 :522 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)), 또는 사람 항체일 수 있다. 사람 항체는 예를 들어 직접 고정화(direct immortilization), 파지 디스플레이, 트랜스제닉 마우스(transgenic mice), 또는 트리메라(Trimera) 방법에 의해 제조될 수 있다 (참조: Reisener et al, Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998)).
에를리히아 카니스 항원 (예컨대 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33에 도시된 에를리히아 카니스 폴리펩티드)과 특이적으로 결합하는 항체는, 사람 또는 개와 같은 에를리히아 카니스-감염된 동물로부터의 혈청, 혈액, 혈장, 대변, 세포, 조직, 소변 또는 타액 샘플과 같은 샘플 중에 에를리히아 카니스 또는 에를리히아 카니스 항원이 존재하는 지를 검출하는 데에 특히 유용하다. 에를리히아 카니스 또는 에를리히아 카니스 항원을 위한 면역검정은 1개의 항체 또는 수 개의 항체를 사용할 수 있다. 에를리히아 카니스 또는 에를리히아 카니스 항원을 위한 면역검정은 예를 들어 하나의 에를리히아 카니스 에피토프에 대해 특이적인 모노클로날 항체, 하나의 에를리히아 카니스 폴리펩티드의 에피토프들에 대해 특이적인 모노클로날 항체들의 조합물, 다양한 에를리히아 카니스 폴리펩티드의 에피토프들에 대해 특이적인 모노클로날 항체들, 동일한 에를리히아 카니스 항원에 대해 특이적인 폴리클로날 항체들, 다양한 에를리히아 카니스 항원에 대해 특이적인 폴리클로날 항체들, 또는 모노클로날 항체들과 폴리클로날 항체들의 조합물을 사용할 수 있다. 면역검정 프로토콜은 예를 들어, 경합, 직접 반응, 또는 예를 들어 표지된 항체를 사용하는 샌드위치 타입 검정을 기초로 할 수 있다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 형광 표지, 화학발광 표지, 방사성 표지, 효소 표지, 콜로이드성 금속 표지, 방사성동위원소 표지 및 생체발광 표지를 포함하는, 당 분야에 공지된 임의의 유형의 표지로 표지될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합성 단편은 지지체에 결합되어 에를리히아 카니스 또는 에를리히아 카니스 항원, 예컨대 에를리히아 카니스 DIVA 항원 또는 에를리히아 카니스 백신 항원의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 지지체로는 예를 들어 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 셀룰로스 및 개질된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 마글레타이트가 있다.
또한, 본 발명의 항체는 면역친화성 컬럼에 의해 에를리히아 카니스 생물체 또는 에를리히아 카니스 항원을 분리하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 이러한 항체는, 이의 면역선택적 활성을 보유하도록, 예를 들어 흡착에 의해 또는 공유결합에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 임의로, 항체의 항원 결합 부위가 접근가능한 상태로 유지되도록 스페이서 그룹(spacer group)이 포함될 수 있다. 그 후, 상기 고정된 항체는, 타액, 혈청, 가래, 혈액, 소변, 대변, 뇌척수액, 양막액, 창상 삼출액 또는 조직을 포함하는 생물학적 샘플과 같은 샘플로부터의 에를리히아 카니스 생물체 또는 에를리히아 카니스 항원과 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 결합된 에를리히아 카니스 생물체 또는 에를리히아 카니스 항원은, 예를 들어 pH를 변화시킴으로써 컬럼 매트릭스로부터 회수된다.
또한, 본 발명의 항체는 다양한 세포 사건 또는 생리적 조건 동안의 본 발명의 폴리펩티드의 존재 및 분포를 분석하기 위한 면역국재화(immunolocalization) 연구에서 사용될 수 있다. 또한, 항체는 수동 면역화에 관여하는 분자를 확인하기 위해 그리고 비(非)-단백질 항원의 생합성에 관여하는 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 분자를 확인하는 것은 백신을 개발하는 데에 유용할 수 있다. 예를 들어 모노클로날 항체 및 단일 사슬 항체를 포함하는 본 발명의 항체는 에를리히아 카니스에 의해 초래된 질병의 개선 과정을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 동물로부터의 시험 샘플에서 에를리히아 카니스 항원에 대해 특이적인 항체의 증가 또는 감소를 측정함으로써, 질병을 개선시키고자 하는 특정 치료 요법이 효과적인 지의 여부가 결정될 수 있다. 항체는, 예를 들어 RIA, ELISA 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 직접 결합 검정을 사용하여 검출되고/되거나 정량될 수 있다.
검출 방법
본 발명의 방법은 생물학적 샘플, 환경 샘플 또는 실험실 샘플과 같은 시험 샘플에서 에를리히아 카니스 항원 또는 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 항체 또는 항원-결합성 항체 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 시험 샘플은 잠재적으로 에를리히아 종 폴리뉴클레오티드, 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드, 에를리히아 종 폴리펩티드, 에를리히아 카니스 폴리펩티드, 에를리히아 종에 대해 특이적인 항체, 및/또는 에를리히아 카니스에 대해 특이적인 항체, 관련없는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물을 포함하거나, 상기 언급된 것들 중 어느 것도 포함하지 않을 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어 말, 고양이, 개 또는 사람과 같은 포유동물로부터의 혈청, 혈액, 세포, 혈장, 타액, 소변, 대변 또는 조직을 포함할 수 있다. 시험 샘플은 처리되지 않거나, 침전되거나, 분별(fractionated)되거나, 분리되거나, 희석되거나, 농축되거나 정제될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 폴리펩티드/항체 복합체, 즉, 면역복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 시험 샘플과 접촉시키는 단계를 포함한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 샘플내의 에를리히아 카니스 항원에 대해 특이적인 항체에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 일 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드는 에를리히아 카니스 항원에 대해 특이적인 항체에 특이적으로 결합하고, 에를리히아 샤핀시스 항원과 같은 다른 병원체로부터의 항원에는 특이적으로 결합하지 않는다. 항체/폴리펩티드 복합체 결합을 검출하기 위해 사용되는 검정 및 조건은 당업자에게 익숙한 것이다. 샘플에서 폴리펩티드와 항체 사이의 복합체가 형성되는 것이 검출된다. 항체/폴리펩티드 복합체가 형성된다는 것은 에를리히아 카니스 폴리펩티드가 샘플에 존재함을 나타낸다. 그러한 폴리펩티드/항체 복합체가 검출되지 않는다는 것은 에를리히아 카니스 폴리펩티드가 샘플에 존재하지 않음을 나타낸다.
본 발명의 항체는, 에를리히아 카니스에 감염된 것으로 의심되는 예를 들어 사람 또는 동물로부터의 시험 샘플을 수득함으로써 에를리히아 카니스 항원을 검출하는 방법에서 사용될 수 있다. 그러한 시험 샘플은 항체-항원 복합체 (즉, 면역복합체)의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 본 발명의 항체와 접촉된다. 항원/항체 복합체의 형성을 가능하게 하며 이를 위해 적절한 조건은 당업자에게 알려져 있다. 항체-항원 복합체의 양은 당 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 음성 대조 샘플에서 형성된 수준 보다 높은 수준은 에를리히아 카니스 항원의 존재를 나타낸다. 음성 대조 샘플은 임의의 에를리히아 카니스 폴리펩티드를 전혀 포함하지 않는 샘플이다. 본 발명의 일 구체예에서, 음성 대조군은 에를리히아 종 폴리펩티드를 전혀 함유하지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서, 항체는 에를리히아 카니스 항원에 대해 특이적이고, 예컨대 에를리히아 샤핀시스 항원과 같은 다른 병원체로부터의 항원에 대해 특이적이지 않다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 시험 샘플과 접촉될 수 있다. 양성 시험 샘플내의 에를리히아 카니스에 특이적인 항체는 적절한 조건하에서 항원-항체 복합체를 형성할 것이다. 항체-항원 복합체의 양은 당 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 에를리히아 카니스 감염이 피검체에서 검출될 수 있다. 생물학적 샘플은 피검체로부터 수득된다. SEQ ID NO:22-33을 포함하는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드 또는 본 발명의 다른 폴리펩티드는 폴리펩티드/항체 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 생물학적 샘플과 접촉된다. 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다. 폴리펩티드/항체 복합체가 검출된다는 것은 특이적인 항체가 존재함을 나타낸다. 폴리펩티드/항체 복합체가 검출되지 않는다는 것은 포유동물이 에를리히아 카니스에 특이적인 항체를 지니지 않음을 나타낸다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 면역검정에 의해 검출된 에를리히아 카니스 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 에를리히아 카니스 항원을 검출하기 위해 사용된 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE이다.
본 발명의 일 구체예에서, 에를리히아 카니스 감염은 피검체가 에를리히아 카니스에 감염된 후 약 5일째, 6일째, 7일째, 8일째, 9일째, 10일째, 11일째, 12일째, 13일째, 14일째, 15일째, 16일째, 17일째, 18일째, 19일째, 20일째, 21일째 또는 그 초과 일수까지 피검체에서 검출될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 에를리히아 카니스 감염은 피검체가 에를리히아 카니스에 감염된 후 약 21일째, 20일째, 19일째, 18일째, 17일째, 16일째, 15일째, 14일째, 13일째, 12일째, 11일째, 10일째, 9일째, 8일째, 7일째, 6일째, 5일째 또는 그 미만 일수까지 검출될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 폴리펩티드/항체 복합체는, 항체에 결합되어 있는 지시약, 예를 들어 효소 컨쥬게이트가 검출가능한 반응을 촉매하는 경우에 검출된다. 임의로, 폴리펩티드/항체/지시약 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건하에서 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약이 폴리펩티드/항체 복합체에 적용될 수 있다. 폴리펩티드/항체/지시약 복합체가 검출된다. 임의로, 폴리펩티드 또는 항체는 폴리펩티드/항체 복합체가 형성되기 전에 지시약으로 표지될 수 있다. 이러한 방법은 임의로 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 항체가 고체상 또는 기질에 부착된다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 잠재적으로 포함하는 시험 샘플이 기질에 첨가된다. 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체가 첨가된다. 그러한 항체는 고체상에서 사용되는 동일한 항체일 수 있거나 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 것일 수 있고, 효소 컨쥬게이트와 같은 지시약에 결합될 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계가 수행될 수 있다. 발색단 또는 효소 기질이 첨가되고, 발색 반응이 전개된다. 이러한 발색 반응이 정지되고, 예를 들어 분광계를 사용하여 발색이 정량될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 항체가 고체상 또는 기질에 부착된다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 잠재적으로 포함하는 시험 샘플이 기질에 첨가된다. 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 제 2의 항종(anti-species) 항체가 첨가된다. 이러한 제 2의 항체는 고체상 항체와 상이한 종으로부터 유래된다. 제 2의 항체와 특이적으로 결합하고 고체상 항체와는 특이적으로 결합하지 않는 제 3의 항종 항체가 첨가된다. 제 3의 항체는 효소 컨쥬게이트와 같은 지시약을 포함할 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계가 수행될 수 있다. 발색단 또는 효소 기질이 첨가되고, 발색 반응이 전개된다. 이러한 발색 반응이 정지되고, 예를 들어 분광계를 사용하여 발색이 정량될 수 있다.
본 발명의 검정은 비제한적으로 경합, 직접 반응 또는 샌드위치-타입 검정을 기초로 하는 검정을 포함하고, 그 예로는 비제한적으로 효소결합 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯, IFA, 방사면역검정(RIA), 혈구응집(hemagglutination, HA), 형광 편광 면역검정(FPIA), 및 미세역가 플레이트 검정 (미세역가 플레이트의 하나 이상의 웰에서 수행되는 임의의 검정)이 있다. 본 발명의 한 가지 검정은 가역성 흐름 크로마토그래피 결합 검정, 예를 들어 SNAP® 검정을 포함한다 (참조: 미국 특허 번호 5,726,010).
검정은 고체상 또는 기질을 사용할 수 있거나, 면역침전법에 의해 또는 고체상을 사용하지 않는 임의의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 고체상 또는 기질이 사용되는 경우, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드는 고체상 또는 기질, 예를 들어 미세역가 웰, 마그네틱 비드(magnetic bead), 비(非)-마그네틱 비드, 컬럼, 매트릭스, 막, 합성 또는 천연 섬유 (예를 들어, 유리 또는 셀룰로스 기반 물질 또는 열가소성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에스테르)로 구성된 섬유 매트(fibrous mat), 미립자 물질 (예를 들어, 유리 또는 다양한 열경화성 중합체)로 구성된 소결 구조물, 또는 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리설폰 등 (성질상 대체로 합성물질임)으로 구성된 캐스트 멤브레인 필름(cast membrane film)에 직접 부착되거나 간접 부착된다. 본 발명의 일 구체예에서, 기질은 일반적으로 다공성 폴리에틸렌으로서 알려져 있는 폴리에틸렌의 소결된 미세 입자이며, 예를 들어 크로멕스 코포레이션(Chromex Corporation, Albuquerque, NM)으로부터의 10-15 마이크론 다공성 폴리에틸렌이다. 이러한 모든 기질 물질은 적절한 형태, 예를 들어 필름, 시트(sheet) 또는 플레이트(plate) 형태로 사용될 수 있거나, 적절한 비활성 캐리어(carrier), 예를 들어 종이, 유리, 플라스틱 필름 또는 직물(fabric) 위로 코팅되거나 이에 결합되거나 적층(laminated)될 수 있다. 펩티드를 고체상 위에 고정시키기 위한 적절한 방법은 이온성, 소수성, 공유성 상호작용 등을 포함한다. 장치 또는 고형 지지체 상에 에를리히나 카니스 폴리펩티드와 같은 하나 이상의 분석물 포획 시약의 고정은, 분석물 포획 시약이 샘플, 희석제 및/또는 세척 절차에 의해 씻겨 버리지 않도록 수행된다. 하나 이상의 분석물 포획 시약은 물리적 흡착이나 (즉 화학적 링커를 사용하지 않고) 화학적 결합 (즉 화학적 링커를 사용하여)에 의해 표면에 부착될 수 있다. 화학적 결합은 표면 상에 포획 시약의 보다 강력을 부착을 생성하여 표면-결합된 분자의 규정된 배향 및 형태를 제공할 수 있다.
한 가지 유형의 검정 포맷(format)에서, 하나 이상의 폴리펩티드가 고체상 또는 기질 위에 코팅될 수 있다. 항-에를리히아 카니스 항체 또는 이의 항원-결합성 단편을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플은, 시험 샘플의 항체와 고체상의 폴리펩티드의 항원/항체 복합체 또는 에를리히아 카니스에 대해 특이적인 항체에 컨쥬게이션된 지시약 화합물과 고체상의 폴리펩티드의 항원/항체 복합체를 형성하기에 충분한 조건하에서 그렇게 되게 하는 시간 동안, 에를리히아 카니스에 특이적인 항체 또는 항체 단편에 컨쥬게이션된 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약과 함께 인큐베이션된다. 항-에를리히아 카니스 항체에 컨쥬게이션된 지시약이 고체상에 결합하는 정도의 감소가 정량적으로 측정될 수 있다. 예를 들어 확립된 음성 에를리히아 카니스 시험 샘플로부터 발생된 신호와 비교하여 신호가 측정가능하게 감소된다는 것은 시험 샘플에 항-에를리히아 카니스 항체가 존재함을 나타낸다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플에서 항-에를리히아 카니스 항체의 양을 정량할 수 있다.
또 다른 유형의 검정 포맷에서, 하나 이상의 본 발명의 항체가 지지체 또는 기질 위로 코팅된다. 본 발명의 폴리펩티드는 지시약에 컨쥬게이션되어 시험 샘플에 첨가된다. 이러한 혼합물은 지지체 또는 기질에 적용된다. 에를리히아 카니스에 대해 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재하는 경우, 이러한 항체는 지시약에 컨쥬게이션된 하나 이상의 폴리펩티드 그리고 지지체 위에 고정된 하나 이상의 폴리펩티드에 결합할 것이다. 그 후, 폴리펩티드/항체/지시약 복합체가 검출될 수 있다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플에서 항-에를리히아 카니스 항체의 양을 정량할 수 있다.
또 다른 유형의 검정 포맷에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드가 지지체 또는 기질 위로 코팅된다. 시험 샘플은 지지체 또는 기질에 적용되고, 인큐베이션된다. 고체 지지체를 세척 용액으로 세척함으로써 샘플로부터의 결합되지 않은 성분이 세척된다. 에를리히아 카니스 특이적 항체가 시험 샘플에 존재하는 경우, 이러한 항체는 고체상 위에 코팅된 폴리펩티드에 결합할 것이다. 이러한 폴리펩티드/항체 복합체는 지시약에 컨쥬게이션된 제 2의 종-특이적(species-specific) 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 그 후, 폴리펩티드/항체/항종 항체 지시약 복합체가 검출될 수 있다. 이러한 유형의 검정은 시험 샘플내의 항-에를리히아 카니스 항체의 양을 정량할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 측면 흐름 검정에 적합한 장치를 제공한다. 예를 들어, 시험 샘플을 제1 영역에서 (샘플 적용 구역) 유량 매트릭스에 첨가한다. 시험 샘플은 모세관 작용에 의해 유체 흐름 경로에서 유량 매트릭스의 제2 영역으로 운반되고 여기서 표지는 시험 샘플 중 분석물에 결합하여 제1 복합체를 형성할 수 있다. 제1 복합체는 유량 매트릭스의 제3 영역으로 운반되고 여기서 에를리히아 카니스 폴리펩티드는 별개의 위치에 고정된다. 제2 복합체가 고정된 폴리펩티드와 샘플로부터의 항체를 포함하는 제1 복합체 사이에 형성된다. 예를 들어, 금색 졸(sol) 입자와 에를리히아 카니스 항체에 결합된 에를리히아 카니스 폴리펩티드를 포함하는 제1 복합체는 고정된 제2 에를리히아 카니스 폴리펩티드 또는 에를리히아 카니스 항체로 유도된 제2 항체와 특이적으로 결합하여 제2 복합체를 형성할 것이다. 제2 복합체의 일부인 표지가 직접 가시화될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 장치에 적용하기 전에 시험 샘플과 혼합될 수 있는 하나 이상의 표지된 특이적 결합 시약을 포함한다. 이 경우 장치 내의 특이적 결합 시약 패드 상에 침착되고 건조된 표지된 특이적 결합 시약을 지닐 필요가 없다. 표지된 특이적 결합 시약은 시험 샘플에 첨가되거나 장치 상에 미리-침착되든지 간에, 예를 들어 에를리히아 카니스에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체일 수 있다.
에를리히아 카니스 DIVA 항원 또는 에를리히아 카니스 백신 항원, 예컨대 폴리펩티드는 반응 구역 (고체상)에 고정된 분석물 포획 시약일 수 있다. 표지에 컨쥬게이션된 제2 분석물 포획 시약, 예컨대 항-IgG 또는 항-IgM 항체는 샘플을 장치에 첨가하기 전에 샘플에 첨가될 수 있거나, 제2 분석물 포획 시약은 장치에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 표지된 특이적 결합 시약은 샘플 적용 구역과 고체상 사이에 유체 소통을 제공하는 유체 흐름 경로 상에 침착되고 건조될 수 있다. 표지된 특이적 결합 시약과 유체 샘플의 접촉은 표지된 특이적 결합 시약의 용해를 초래한다.
장치는 또한 결합되지 않은 물질 (예컨대 미반응된 유체 샘플 및 결합되지 않은 특이적 결합 시약)을 반응 구역(고체상)으로부터 멀리 운반하는 액체 시약을 포함할 수 있다. 액체 시약은 세척 시약일 수 있고 결합되지 않은 물질을 반응 구역으로부터 제거하는 역할만을 하거나, 이것은 검출 시약을 포함할 수 있어서 결합되지 않은 물질을 제거하고 분석물 검출을 촉진하는 두 가지 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 효소에 컨쥬게이션된 특이적 결합 시약의 경우에, 검출 시약은 반응 구역에서 효소-항체 컨쥬게이트와 반응시 검출가능한 신호를 제공하는 기질을 포함한다. 방사성, 형광 또는 광-흡수 분자에 컨쥬게이션된 표지된 특이적 결합 시약의 경우, 검출 시약은 단지 결합되지 않은 표지된 시약을 세척함에 의해 반응 구역에서 복합체 형성의 검출을 촉진하는 세척액으로서 작용한다.
둘 이상의 액체가 장치에 존재할 수 있고, 예를 들어 장치는 세척 시약으로서 작용하는 액체 시약 및 검출 시약으로서 작용하는 액체 시약을 포함하여 분석물 검출을 촉진시킬 수 있다.
액체 시약은 제한된 양의 "억제제", 즉 검출가능한 최종 생성물의 발생을 차단하는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 제한된 양이란 검출가능한 최종 생성물이 생성되는 어떠한 시점에 제2 영역으로부터 대부분의 또는 모든 과량의 미결합된 물질이 운반될 때까지 최종 생성물 발생을 차단하기에 충분한 억제제의 양이다.
폴리펩티드/항체 복합체 또는 폴리펩티드/항체/지시약 복합체의 형성은, 예를 들어 방사능측정(radiometric), 비색, 형광측정, 크기별 분리 또는 침전 방법에 의해 검출될 수 있다. 임의로, 폴리펩티드/항체 복합체의 검출은 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약에 커플링된 제2 항체를 첨가함으로써 이루어진다. 폴리펩티드/항체 복합체와 결합된 신호 발생 화합물(표지)을 포함하는 지시약은 상기 설명된 방법을 사용하여 검출될 수 있고, 색소제(chromogenic agent), 촉매, 예를 들어 효소 컨쥬게이트, 형광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 화학발광 화합물, 예를 들어 디옥세탄, 아크리디늄, 페난트리디늄, 루테늄, 및 루미놀, 방사성 원소, 직접적 시각 표지 뿐만 아니라 보조인자, 억제제, 자성 입자 등을 포함한다. 효소 컨쥬게이트의 예로는 알칼리 포스파타아제, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제 등이 있다. 특정 표지를 선택하는 것은 중요한 것이 아니지만, 이는 그 자체로 또는 하나 이상의 추가 물질과 함께 신호를 생성시킬 수 있을 것이다.
복합체가 형성된다는 것은 시험 샘플에 항-에를리히아 카니스 항체가 존재함을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법은 동물에서 에를리히아 카니스 감염을 진단하는 데에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 시험 샘플내의 항-에를리히아 카니스 항체의 양을 나타낼 수 있다. 효소 컨쥬게이트와 같은 다수의 지시약을 사용하는 경우, 존재하는 항체량은 생성된 신호에 비례한다. 시험 샘플의 유형에 따라, 이러한 샘플이 적절한 완충 시약에 의해 희석될 수 있거나, 농축될 수 있거나, 아무런 조작없이 고체상과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 항체의 존재 여부 및/또는 존재하는 항체량을 측정하기 위해, 미리 희석시킨 혈청 또는 혈장 샘플, 또는 소변과 같은 농축된 표본을 시험하는 것이 일반적으로 바람직하다.
또한, 본 발명은 샘플내의 항-에를리히아 카니스 항체 또는 항원-결합성 항체 단편, 또는 에를리히아 카니스 폴리펩티드를 검출하기 위한 검정 키트(assay kit) (예를 들어, 제품)를 포함한다. 키트는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드와, 이러한 폴리펩티드가 샘플내의 항-에를리히아 카니스 항체 또는 항체 단편에 결합하는 지를 측정하기 위한 수단을 포함한다. 키트 또는 제품은 하나 이상의 본 발명의 항체 또는 항체 단편과, 이러한 항체 또는 항체 단편이 샘플내의 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 결합하는 지를 측정하기 위한 수단을 또한 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 함유하는 장치와, 이러한 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체를, 예를 들어 포유동물이 에를리히아 카니스에 감염되었는 지를 확인하기 위해 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는, 그러한 키트의 하나 이상의 폴리펩티드 또는 항체가 에를리히아 카니스 감염을 확인하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 표지를 포함하는 포장 재료를 포함할 수 있다. 당 분야에 알려져 있는 다른 구성요소, 예를 들어 완충액, 안정화제, 양성 대조군, 음성 대조군, 검출 시약 등이 그러한 시험 키트에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 검정 및 키트는, 예를 들어 환자에서 에를리히아 카니스 감염의 개별 사건을 진단하는 데에 유용할 뿐만 아니라 에를리히아 카니스 발생을 역학 조사하는 데에도 유용하다. 검정의 민감성을 실제로 최적화하는 시약 용액에서의 농도를 제공하기 위해 다양한 시약들의 상대적인 양은 다양할 수 있다. 특히, 시약은 일반적으로 냉동건조된 건조 분말로서 제공될 수 있는데, 이는 용해시 샘플과의 조합에 적합한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 및 검정은 다른 생물체와 더불어 에를리히아 카니스의 존재를 검출하기 위해 다른 폴리펩티드 또는 검정과 병용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 및 검정은 심장사상충(heartworm) 및/또는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 및/또는 에를리히아 샤핀시스 및/또는 아나플라스마 플라티스(Anaplasma platys) 및/또는 아나플라스마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophilum)을 검출하는 시약과 병용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 샘플내의 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 간단한 하이브리드화 반응에서 샘플내의 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 실시간 PCR 반응과 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법과 조성물은 에를리히아 샤핀시스와 같은 다른 에를리히아 종으로부터 에를리히아 카니스의 존재를 차별적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다.
PCR 검정은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,683,195, 미국 특허 번호 4,683,202 및 미국 특허 번호 4,965,188에 기재되어 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산의 변성된 가닥에 대해 어닐링된다(annealed). 프라이머 신장 생성물은 중합효소에 의한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합반응에 의해 형성된다. 그 후, PCR은 주형 핵산을 변성시키고, 프라이머를 어닐링하고, 열경화성 중합효소의 작용에 의해 어닐링된 프라이머를 신장시키는 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 이러한 공정에 의해 시험 샘플내의 표적 에를리히아 카니스 핵산이 지수적으로 증폭되는데, 이는 샘플내에 매우 낮은 농도로 존재하는 표적 폴리뉴클레오티드의 검출을 가능하게 한다.
실시간 PCR 검정은 신호, 예를 들어 형광 리포터 신호를 검출하는 것을 기반으로 한다. 이러한 신호는 반응에서 PCR 생성물의 양에 정비례하여 증가한다. 실시간 PCR은 진행중인 증폭 반응의 전개과정을 모니터링하는 것을 가능하게 하는 임의의 증폭 기술이다 (참조: Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection, Perkin Elmer Applied Biosystems (1999); PCR Protocols (Academic Press New York, 1989)). 각각의 사이클에서 형광 방출량을 기록함으로써, 지수기 동안 PCR 반응을 모니터링하는 것이 가능한데, 여기서 PCR 생성물의 양이 최초로 유의할 만하게 증가하는 것은 표적 주형의 최초량에 상응한다. 핵산 표적의 출발 복사체 개수가 많을수록, 형광의 유의할 만한 증가가 더욱 신속히 관찰된다.
본 발명의 일 구체예는 시험 샘플내의 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드를 검출하고/거나 정량하는 방법을 제공한다. 센스 프라이머와 안티센스 프라이머가 중합효소 연쇄 반응에 적절한 조건하에서 시험 샘플에 첨가될 수 있다. 이러한 프라이머는, 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드가 시험 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물이 형성되도록, 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화한다. 증폭 생성물이 검출되고, 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드의 존재 및/또는 양이 측정된다. 증폭 생성물은, 중합효소 연쇄 반응에 적절한 조건하에서 에를리히아 카니스 폴리뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 검출될 수 있다. 증폭 생성물은 프로브로부터의 검출 신호를 측정하고 그러한 검출 신호를 정량 표준으로부터의 제 2의 프로브 검출 신호와 비교함으로써 정량될 수 있다. 상기 정량 표준은 시험 샘플과 병렬적으로 추출될 수 있다.
에를리히아 카니스에 의해 야기된 질병을 치료하거나, 개선시키거나 , 예방하는 방법
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 DIVA 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체는 에를리히아 카니스에 의해 야기된 질병을 치료하거나, 개선시키거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, DIVA 폴리펩티드를 에를리히아 카니스에 의해 야기된 질병을 치료하거나, 개선시키거나, 예방하기 위해 사용하는 경우, 이것은 그 이후에 감염된 백신접종되지 않은 동물 및 백신접종된 동물의 검출 및 구별을 위한 DIVA 폴리펩티드로서 사용될 수 없었는데, 그 이유는 백신접종된 동물의 면역 시스템이 백신접종에 사용된 DIVA 항원을 인지할 수 있었기 때문이다. 그러나, 에를리히아 카니스에 의해 야기된 질병을 치료하거나, 개선시키거나, 예방하는데 사용된 DIVA 폴리펩티드에 대해 항체와 교차 반응하지 않는 DIVA 폴리펩티드는 에를리히아 카니스 DIVA 항원으로서 여전히 사용될 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO:2 또는 이의 단편을 백신으로서 이용하면, SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 이들의 조합물을 DIVA 폴리펩티드로서 이용할 수 있는데, 단, 이들은 SEQ ID NO:2에 특이적인 항체와 교차 반응하지 않는다. 현재, SEQ ID NO:10, 22-33 중 어떤 것도 상업적인 서브유닛 에를리히아 카니스 백신에 사용되지 않고 SEQ ID NO:10, 22-33은 모든 불활성화된 에를리히아 카니스 세포로 백신접종된 동물에서 에를리히아 카니스-특이적인 항체를 검출하지 않는다. 따라서, DIVA 폴리펩티드 선택은 현재 논쟁의 여지가 없다. 그러나, 당업자는 에를리히아 카니스 백신의 조성물을 의식하고 있다. 상업적인 에를리히아 카니스 서브유닛 백신이 SEQ ID NO:10, 22-33을 포함하게 된다면, 당업자는 백신접종 상태를 구별하기 위해 SEQ ID NO:10, 22-33의 사용을 회피하고 (필요한 경우 SEQ ID NO:10, 22-33에 특이적인 에를리히아 카니스 항체의 생성으로 인해) 대신 다른 에를리히아 카니스 DIVA 항원을 사용할 것이다.
따라서, DIVA 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 항체는 (1) 에를리히아 카니스에 의해 야기된 질병을 예방하거나, 치료하거나, 개선시키기 위한 조성물로서; 및 (2) 에를리히아 카니스로 백신접종되거나; 백신접종되지 않거나; 감염되거나 감염되지 않은 동물의 검출 및 구별을 위한 에를리히아 카니스 DIVA 항원으로서의 두 상이한 방식으로 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 항체는 에를리히아 카니스에 의해 야기된 질병을 치료하거나, 개선시키거나, 예방하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체와 같은 항체 또는 이의 단편이 사람과 같은 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 항체 또는 이의 단편이 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물로 동물에게 투여된다. 약제 조성물은 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 치료적 유효량은 피검체에서 에를리히아 카니스 감염의 증상을 완환시키거나 에를리히아 카니스 생물체의 양을 감소시키는 데에 효과적인 양이다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 면역원성 조성물로 존재할 수 있고, 숙주에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 면역원성 조성물은 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는, 한 가지 결과로서 에를리히아 카니스 감염의 효과를 개선시키거나 예방하는 면역 반응이 생성되도록 동물의 면역계를 감작(sensitizing)시키는 데에 특히 유용하다. 동물 모델에서 면역 반응을 유도하는 것은 예를 들어 최적 투여량 또는 투여 경로를 결정하기 위해 유용할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하는 것은 에를리히아 카니스에 의해 야기된 질병 또는 감염을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 면역 반응은 체액성 면역 반응 또는 세포 매개성 면역 반응, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또한, 면역 반응은, 예를 들어 디펜신(defensin)의 생성을 촉진함으로써 전신(generalized) 숙주 반응을 촉진시키는 것을 포함할 수 있다.
에를리히아 카니스에 대해 동물에 의해 항체 역가가 발생한다는 것은 감염을 방어하고 감염을 제거하는 데에 중요할 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 전달 후에 항체 역가를 검출하고/하거나 정량하는 것이 항체 역가를 유도하는 데에 있어서 특히 효과적인 에피토프를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 에를리히아 카니스에 대한 강력한 항체 반응을 담당하는 에피토프는 다양한 길이를 지닌 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 대해 항체를 생성시킴으로써 확인될 수 있다. 그 후, 특정 폴리펩티드 에피토프에 의해 유도된 항체는, 어느 폴리펩티드가 강력한 반응을 생성시키는 데에 있어서 가장 효과적인 에피토프를 함유하는 지를 결정하기 위해 예를 들어 ELISA 검정을 사용하여 시험될 수 있다. 상기 에피토프를 함유하는 폴리펩티드 또는 융합 단백질 또는 이러한 에피토프를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 구성될 수 있고, 강력한 항체 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체는, 생체내에서 항체를 유도하기 위해, 마우스, 토끼, 기니피그, 짧은꼬리 원숭이(macaque), 비비(baboon), 침팬지, 사람, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이와 같은 포유동물에게 투여되거나 닭 또는 오리와 같은 동물에게 투여될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 주입하는 것은 구성 및 변형이 간단하다는 실용적인 이점을 지닌다. 또한, 폴리뉴크레오티드가 주입되면 숙주에서 폴리펩티드의 합성이 일어난다. 따라서, 폴리펩티드는 본래의 번역후 변형, 구조 및 입체형태를 지닌 채로 숙주 면역계에 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 피검체에게 "나출(naked) DNA"로서 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체를 투여하는 것은, 생물학적 탄도총(ballistic gun) ("유전자총(gene gun))"을 사용하는 주입을 포함하는, 근내, 정맥내, 폐내, 근내, 피내, 복강내, 또는 피하 주사, 에어로졸, 비내, 주입 펌프(infusion pump), 좌약, 점막, 국소 및 경구 투여를 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체는 경구 투여를 위해 단백질 담체를 수반할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하기 위해 투여 방법들을 병용하여 사용할 수 있다. 항체는 약 0.5 mg 내지 약 200 mg의 1일 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 항체는 약 20 내지 약 100 mg의 1일 투여량으로 투여된다.
치료 용도를 위한 약제학적으로 허용되는 담체와 희석제는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985))]에 기재되어 있다. 담체는 그 자체가 숙주에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 한다. 이러한 담체로는 비제한적으로 느리게 대사되는 커다란 거대분자(macromolecule), 예를 들어 단백질, 다당류, 예를 들어 라텍스 작용기화된 SEPHAROSE®, 아가로오스, 셀룰로스, 셀룰로스 비드 등, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 예를 들어 폴리글루탐산, 폴리리신 등, 아미노산 공중합체, 펩토이드(peptoid), 리피토이드(lipitoid), 및 비활성이고 비독성인 바이러스 입자 또는 세균 세포가 있다. 또한, 리포솜, 하이드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 및 생체부착제(bioadhesive)가 본 발명의 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다.
또한, 약제학적으로 허용되는 염이 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는데, 이의 예로는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 또는 설폐이트와 같은 무기염 뿐만 아니라 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 또는 벤조에이트와 같은 유기산염이 있다. 특히 유용한 단백질 기질은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 면역글로불린 분자, 티로글로불린(thyroglobulin), 오발부민, 파상풍 톡소이드, 및 당업자에게 널리 공지된 다른 단백질이다. 또한, 본 발명의 조성물은 액체 또는 부형제, 예를 들어 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액(Ringer's solution), 행크 용액(Hank's solution), 글루코오스, 글리세롤, 덱스트로오스, 말로덱스트린, 에탄올 등을 단독으로 함유하거나 습윤제, 에멀션화제, 긴장도(tonicity) 조정제, 세정제 또는 pH 완충제와 같은 물질과 함께 함유할 수 있다. 살균제와 같은 추가의 활성 성분이 또한 사용될 수 있다.
요망되는 경우, 림프구에 면역원을 제공하는 것을 향상시키는 보조자극 분자, 예를 들어 B7-1 또는 B7-2, 또는 MIPIα, GM-CSF, IL-2 및 IL-12와 같은 시토킨이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 임의로, 애쥬번트가 조성물에 또한 포함될 수 있다. 애쥬번트는 특정한 면역 반응을 비특이적으로 증강시키기 위해 사용될 수 있는 물질이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드와 애쥬번트는 면역계에 제공되기 전에 혼합되거나 개별적으로 제공되지만, 동물의 동일한 부위내로 제공된다. 애쥬번트로는, 예를 들어 오일 애쥬번트 (예를 들어, 프로인트 완전 애쥬번트 및 불완전 애쥬번트), 무기염 (예를 들어, Alk(SO4)2; AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), 실리카(Silica), 알룸(Alum), Al(OH)3, 및 Ca3(PO4)2), 폴리뉴클레오티드 (즉, Poly IC 및 Poly AU 산), 및 특정 천연 물질 (예를 들어, 미코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 왁스 D 뿐만 아니라 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 및 브루셀라(Brucella) 속의 일원들에서 발견되는 물질)이 있을 수 있다. 사용될 수 있는 애쥬번트로는 비제한적으로 MF59-0, 알루미늄 하이드록사이드, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, 노르-MDP로 일컬어짐), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835 A, MTP-PE로 일컬어짐), 및 2% 스쿠알렌/TWEEN® 80 (폴리소르베이트) 에멀젼 중에 세균으로부터 추출된 3가지 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로오스 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는, RIBI가 있다.
본 발명의 조성물은 섭취가능한 정제, 구강정(buccal tablet), 트로키(troche), 캡슐, 엘릭서(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer), 주사용 제형, 구강세척액(mouthwash), 치마분(dentifrice) 등으로 제형화될 수 있다. 그러한 조성물 및 제제내의 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체의 비율은 유닛의 0.1 내지 60 중량%로 달라질 수 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체의 투여는 적어도 1주일, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 또는 그 초과의 기간 동안 지속되는 면역 반응을 동물에서 유도할 수 있다. 임의로, 면역 반응은, 최초 주입 후 1개월째, 3개월째, 6개월째, 1년째 또는 그 초과의 기간째에 1회 이상의 부스터(booster) 주입을 제공함으로써 동물에서 유지될 수 있다. 요망되는 경우, 본 발명의 조성물의 투여 전에, 혹은 투여 후에 혹은 투여와 함께, 보조자극 분자 또는 애쥬번트가 또한 제공될 수 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 이들의 조합물을 포함하는 본 발명의 조성물은, 사용되는 특정 조성물과 양립할 수 있는 방식으로 그리고 예를 들어 ELISA에 의해 검출되는 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 투여된다. 폴리뉴클레오티드는 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 1000 ng/kg, 0.001 mg/kg, 0.1 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 투여량으로 비비, 침팬지, 개 또는 사람과 같은 포유동물에게 근내 주입될 수 있다. 폴리펩티드 또는 항체는 0.01, 0.05, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5 또는 10 mg/kg의 투여량으로 포유동물에게 근내 주입될 수 있다.
폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체, 또는 이들의 조합물은 에를리히아 카니스에 감염되지 않는 동물에게 투여되거나, 에를리히아 카니스에 감염된 동물에게 투여될 수 있다. 조성물내의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체의 특정 투여량은 비제한적으로 종, 연령, 성별, 동반 약물투여, 그러한 조성물이 투여되는 포유동물의 전반적 상태, 및 그러한 조성물의 투여 방식을 포함하는 다수의 인자에 좌우된다. 본 발명의 조성물의 유효량은 정례적 실험만을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
환자에서 에를리히아 카니스 감염을 모니터링하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 에를리히아 카니스에 감염되었거나 감염될 위험이 있는 환자로부터의 생물학적 유체 샘플에서 제1 시점에 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 항-에를리히아 카니스 항체의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 항-에를리히아 카니스 항체의 수준은 하나 이상의 다양한 시점에 환자로부터의 생물학적 유체의 하나 이상의 샘플에서 결정된다. 항-에를리히아 카니스 항체의 수준은 에를리히아 카니스 감염을 모니터링하도록 다양한 시점에 결정된다. 항-에를리히아 카니스 항체의 수준 또는 양은 치료 또는 요법의 성공 또는 감염의 진행을 표시한다.
본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 다른 학술 또는 기술 문헌은 그 전문에 참조로 포함된다. 본 명세서에 예시적으로 설명된 본 발명은 적절하게는, 본 명세서에 구체적으로 기재되어 있지 않은 임의의 요소(들), 제한(들)없이 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 명세서에서 각각의 경우, "포함하는", "필수 성분으로 하는" 및 "구성된"이라는 용어는 그 통상의 의미를 유지하며 나머지 두 용어 중 어느 하나에 의해 대체될 수 있다. 사용된 용어와 표현은 제한이 아닌 설명을 위한 용어로서 사용된 것이고, 그러한 용어와 표현을 사용함에 있어서 제시되고 설명된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 일부를 제외시킬 의도가 없지만, 다양한 변형이 특허청구된 본 발명의 범위내에서 가능한 것으로 인지된다. 따라서, 본 발명이 구체예에 의해 상세히 설명되었지만, 본 명세서에 기재된 개념의 임의의 특징, 변형 및 변화가 당업자에 의해 이루어질 수 있고, 그러한 변형 및 변화가 상기 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위에 의해 규정된 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다고 이해되어야 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹(Markush group) 또는 그 밖의 택일적 기재에 의하여 기술된 경우, 당업자는 본 발명이 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 개개의 구성원에 의해 또는 그러한 그룹의 구성원들의 하위그룹(subgroup)에 의해 또한 기술된다는 것을 인지할 것이다.
실시예
실시예 1 개를 면역시키기 위한 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스의 제조
문헌에 개시된 방법을 이용하여 에를리히아 카니스를 개과동물 세포 배양으로 성장시켰다. [참조예: Breitschwerdt, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, Vol 42:362-368]. 광 현미경을 이용하여 030 세포가 에를리히아 카니스에 의해 80% 넘게 감염된 것으로 판단되었다. 2 리터의 에를리히아 카니스 감염된 세포 배양액을 수집하고, 원심분리하고, 펠렛을 유지시켜 7.31 그램의 물질 (습윤 중량)을 수득하였다. 물은 물질의 80 중량%를 구성하는 것으로 추정되며, 산정된 건조 중량은 1.462 그램이다 (물질의 20 중량%). 세포 펠렛을 73 ml의 총 부피를 위해 PBS에서 20 mg/ml로 재현탁시켰다 (건조 중량).
이렇게 재현탁된 세포 펠렛에 0.04%의 최종 포름알데히드 농도를 위해 0.73 ml의 포르말린 용액을 첨가하였다 (Sigma Catalog HT50-1-2 포르말린 용액 10%, 중성 완충됨). 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 불활성회된 혼합물을 원심분리하고 세포 펠렛을 유지시켰다. 펠렛을 250 ml의 PBS로 재현탁시킴에 의해 세척하였다. 원심분리에 의해 물질을 수집하고 세척을 한번 더 반복하였다.
세척된 세포 펠렛을 73 ml의 PBS에 재현탁시켰다. 샘플을 73개의 스크류 캡 바이알로 분취시키고 -80℃에서 동결시켰다. 각 바이알은 동물을 면역시키기에 적절한 애쥬번트와의 조합에 적합한 20 mg (건조 중량)의 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 세포 배양액을 함유한다.
실시예 2 두 상이한 애쥬번트를 지니는 포르말린 불활성화된 에를리히아 카 니스의 제조, 에를리히아 카니스 항원으로 비글을 면역화시키기 위한 프로토콜, 및 SNAP® 3 Dx ®을 이용한 면역화된 비글로부터의 혈청 시험
수산화알루미늄 애쥬번트를 지니는 항원의 제조는 당업자에게 널리 공지된 기술이다. 예를 들어, 문헌["Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, 1988, pp 99]를 참조한다.
개 (실험실 비글)를 면역시키기 위해, 두 세트의 투여량을 상기 개시된 대로 제조된 수산화알루미늄 애쥬번트로 제조하였고 두 세트의 투여량을 제조자에 의해 개시된 프로토콜을 이용하여 Ribi 애쥬번트 (Corixa Corp., Seattle WA)로 제조하였다. 각 투여량은 약 20 mg의 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 세포 배양액 (건조 중량)을 함유하였다.
개집에 있는 실험실 비글을 에를리히아 카니스 불활성화된 항원으로의 면역화를 위해 선택하였다. 두 마리 개로 구성된 두 그룹 (각 그룹에 상이한 애쥬번트를 이용함)에 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 제조물 (산화알루미늄 또는 Ribi)을 투여하였다. 0일째에 네 마리의 개 모두는 SNAP® 3Dx® 진단뿐만 아니라 에를리히아 카니스 생물체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 둘 모두를 이용할 때 혈청-음성이었다.
코반스 리서치 프로덕츠 인크의 IACUC 위원회는 실험실 비글을 면역시키기 위한 프로토콜을 승인하였다. 0, 28일 및 56일에 개를 백신접종하고 매주 1 ml를 채혈하여 SNAP® 3Dx®를 이용하여 모니터링하였다. 모든 개에게 적합한 시험 제품을 등쪽어깨 영역에서 피하 투여하였다. 4마리 동물 모두는 42일까지 SNAP® 3Dx® 에를리히아 카니스에 대해 양성 시험으로 혈청전환되었다. 생산혈을 42일과 70일에 수득하였다 (대략 25 ml의 혈청을 산출하는 약 50 ml의 혈액).
도 1은 실험실 비글의 SNAP® 3Dx® 검정 평가를 도시한다. SANP® 장치를 제조자가 개시한 대로 이용하였다. "Pre" 샘플은 0일에 얻은 것이다. "Post" 샘플을 42일에 얻은 것이다. 에를리히아 카니스 양성 스폿은 4마리 개 모두의 42일차 샘플에서 양성이 되었다. 유사한 결과가 70일차 샘플에 대해 관찰되었다.
제3 애쥬번트, BCG (Calbiochem of EMD Biosciences, Inc. San Diego, CA)를 포함하는 제3 백신을 이용한 실험이 유사한 결과를 나타내었다. 제3 백신의 제조는 1) 포르말린 불활성화가 4℃에서 24시간 동안이었고 2) 1 mg의 BCG를 첨가한 것을 제외하고는 상기 개시된 Ribi 애쥬번트 백신에 대해 개시된 제조방법과 동일하였다. 백신접종 스케쥴은 0일, 14일이었고, 매주 채혈하여 에를리히아 카니스 단백질과의 반응성에 대해 검정하였다.
실시예 3 PERCOLL ® 구배를 이용하여 세포 배양액으로부터 에를리히아 카니스의 부화( enrichment )
DNA 분리 및 웨스턴 블롯 분석을 위해, 에를리히아 카니스를 PERCOLL® 밀도 구배를 이용하여 세포 배양액으로부터 부화시켰다. 세포 배양액으로부터 세포내 병원체, 예컨대 에를리히아를 분리시키는 공정은 당업자에게 널리 공지된 기술이다. 예를 들어, 문헌[Akira et al. (1982) Purification of Rickettsia tsutsugamushi by PERCOLL® density gradient centrifugation, Microbiol. Immunol., 26:321-328]을 참조한다.
전형적인 에를리히아 카니스 부화는 1.5 리터의 감염된 세포 배양액으로부터 시작된다 (상기 참조). 세포를 6,000 x g로 원심분리시키고, 세포 펠렛을 유지시키고, 상청액을 폐기하였다. 세포 펠렛을 20 ml의 PBS에 재현탁한 후 제2 원심분리시켰다. 상청액을 폐기하고 상청액을 유지시켰다. 이후 펠렛을 20 ml의 PBS에 재현탁시키고, 브란손(Branson) 소니케이터를 이용하여 5초 동안 20 kHz, 동력 설정 1.5에서 초음파분해하였다. 이어서 샘플을 500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 큰 파편을 펠렛화하였다.
PERCOLL®를 32%의 최종 농도로 상청액에 첨가하였다 (10 ml의 샘플에 4.5 ml의 PERCOLL®). 샘플을 70.1 Ti 초원심분리 로터와 상용가능한 오크 리지(Oak Ridge) 튜브에 로딩하고, 30분 동안 63,000 x g에서 원심분리하였다. 불투명한 밴드를 파스퇴르(Pasteur) 피펫을 이용하여 수집하였다. 불투명한 밴드에는 에를리히아가 고도로 부화되어 있다 (수집된 샘플의 광 현미경을 이용하여 확인됨). PBS와 1:4 희석 후에, 샘플을 분취시키고 12,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 에를리히아 펠렛을 -80℃에 저장하였다.
실시예 4 웨스턴 블롯에 의해 백신접종된 개와 감염된 개로부터의 혈청 또는 혈장의 시험
1차원 SDS-PAGE 겔 분석 및 2차원 겔 분석 (첫 번째 차원 등전압 포커싱, 두 번째 차원 SDS-PAGE)의 이용은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel et al ., John Wiley & Sons Inc., 1997, pages 10.2.2-10.3.11]을 참조한다. 이러한 방법을 이용하여 분리된 단백질을 분석하기 위한 웨스턴 블롯의 이용은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel et al., John Wiley & Sons Inc., 1997, pages 10.8.1-10.8.116]을 참조한다.
1D 겔로 분리된 단백질의 웨스턴 분석 이후에 (데이터는 도시되지 않음) 2D 겔을 이용하여 분리된 단백질의 웨스턴 분석을 이용하여 초기 작업을 수행하였다. 세포 배양액으로부터 회수된 전체 에를리히아 카니스로부터의 단백질을 2D 겔 전기영동을 이용하여 분석하였다 (물질 및 시약은 제조자에 의해 개시된 대로 사용됨; Bio-Rad Life Sciences Research, Hercules, CA 94547). 겔 당 로딩되는 샘플의 양은 경험적으로 결정하였다 (도 2 참조). 단백질을 니트로셀룰로스로 블롯팅하고 0일째 실험실 비글, 즉 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 항원으로 백신접종된 개 (상기 참조)로부터의 개과동물 혈청, 또는 에를리히아 카니스에 감염된 동물로부터의 혈청을 이용하여 프로빙하였다 (도 3, 4 & 5 참조).
양성 개과동물 혈청 및 혈장을 에를리히아 카니스에 감염된 개로부터 분리하였다. 에를리히아 카니스 감염을 이러한 개로부터의 전체 혈액에서 회수된 림프구의 웨스턴 분석에 의해 증명하고, 개과동물 혈청 또는 혈장을 이용한 IDEXX SNAP® 3Dx® 검정을 이용하여 확인하였다 (IDEXX Laboratories Inc.로부터 시판됨, 제조자가 개시한 대로 이용함).
웨스턴 블롯 분석을 위해, 단백질을 1D SDS-PAGE 또는 2D 등전압 포커싱/SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리한 후 단백질을 겔에서 니트로셀룰로스로 전기-블롯팅시켰다. 니트로셀룰로스 블롯을 트리스 완충된 염수 (pH 7.5), 0.05% 트윈® 20으로 용해된 2.5%의 무지방 분유의 차단 용액에서 인큐베이션하였다. 개과동물 혈청 또는 혈장을 개시된 역가로 대장균(E. coli) 용해물을 함유하는 완충액으로 희석시켜 30% 정상 송아지 혈청과의 비-특이적 결합을 차단하고 실온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. TBS-TWEEN®(0.05%)에서 3회 세척 후에, 블롯을 50% 우태아 혈청, 50% TBS-TWEEN®-Kathon (각각 0.05% & 0.5%)을 함유하는 완충액으로 옮겨 호스래디쉬 퍼옥시다아제에 컨쥬게이션된 토끼 항-개과동물 Fc 폴리클로날 항체의 비특이적 결합을 막았다 (Jackson Immuno Research, West Grove, PA 19390). 토끼 항-개과동물 Fc 폴리클로날 항체 컨쥬게이트를 1:5,000 희석시켰다. 겔을 TBS TWEEN® (0.05%)으로 3회, TBS로 1회 세척하고, HRP의 존재를 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855-1327)을 이용하여 제조자가 개시한 대로 이용하여 검출하였다. 노출된 X-선 필름의 디지탈 영상을 GelDoc 2000 (Bio-Rad Inc.)을 이용하여 캡쳐하였다.
실시예 5 에를리히아 카니스로부터 DNA 의 분리 및 람다 발현 라이브러리의 구성 및 DIVA 활성을 지니는 클론에 대해 에를리히아 카니스 람다 발현 라이브러리의 스크리닝
람다 발현 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 널리 공지된 기술이다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, eds. F.M. Ausubel et al., John Wiley & Sons Inc., 1997, pages 5.1 through 5.8.6]을 참조한다. 발현 라이브러리를 구성하기 위해, 유전체 DNA를 PERCOLL® 구배 원심분리에 의해 세포 배양액으로부터 분리된 에를리히아 카니스로부터 정제하였다 (상기 참조). DNA를 Qiagen Sciences (Germantown, MD)로부터의 유전체 DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 람다 ZAP® II 선분해된 EcoRI/CIAP 벡터 키트 (Stratagene Corp., La Jolla, CA 92037)를 라이브러리의 구성을 위해 제조자가 상술한 대로 이용하였다. 에를리히아 카니스 유전체 DNA가 TSP509로 일부 분해되었고 2-6 kb 범위의 단편을 아가로오스 겔 전기영동을 이용하여 분리하고 람다 벡터로 라이게이션하였다. 파지를 패키징하고 제조자가 상술한 대로 성장시켰다.
약 120,000개의 개개 람다 플라크를, 에를리히아 카니스의 감염에 대해서는 양성이나 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스로 백신접종된 동물로부터의 혈청과의 반응성에 대해서는 음성인 것으로 확인된 개로부터 분리된 혈청과의 결합에 대해 스크리닝하였다 (상기 참조). 초기 스크린으로부터, 84개의 개개 플라크가 이러한 활성을 지니는 것으로 확인되었다.
람다 플라크를 2 라운드의 플라크 정제시켰고, 백신접종된 동물로부터의 혈청으로 스크리닝할 때 음성 반응성, 에를리히아 카니스 감염된 동물로부터의 혈청과 양성 반응성을 입증하기 위해 재시험하였다.
분리된 람다 플라크를 아나플라스마 파고사이토필리아(Anaplasma phagocytophilia), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)(라임병의 원인제), 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii)(록키산 발진열의 원인제), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans) 및 디로필라리아 이미티스(Dirofilaria immitis)(개과동물 심장사상충의 원인제)에 대해 혈청양성인 것으로 확인된 동물로부터의 혈청과의 교차 반응성에 대해 스크리닝하였다.
스크리닝 공정 끝에, 43개의 람다 플라크가 백신접종된 개로부터의 혈청 또는 다른 개과동물 병원체로 감염된 개로부터의 혈청과 반응하지 않는 에를리히아 카니스에 감염된 동물로부터의 혈청과 반응하는 것으로 나타났다 (상기 참조).
제조자의 지시에 따라서 클로닝 벡터의 ZAP® 특징을 이용하여, 람다 벡터로의 삽입물을 플라스미드로 전환시켰다. 플라스미드를 단백질 발현 및 웨스턴 블롯에 의한 엔코딩된 단백질의 분석을 위해 대장균(E. coli) 균주 XL-1 블루로 형질전환시켰다. 에를리히아 카니스 DNA 삽입물의 말단을 T7 및 T3 서열화 프라이머를 이용하여 DNA 서열 분석하였다.
43개 클론 모두에 대한 T7 및 T3 반응 둘 모두로부터의 서열 정보를 BLAST 분석을 위해 NCBI 웹사이트에 제공하였다. 결과를 엑셀 포맷으로 표로 작성하였다. 클론과 에를리히아 카니스에 대한 이용가능한 샷건(shotgun) 유전체 서열 (NCBI: NZ_AAEJ01000001)간 서열 동일성에 기초하여, 각 클론에 대한 유전체 DNA의 세그먼트를 동정하였다. 공통 유전자를 공유하는 개개 클론을 감염되고 백신접종된 개과동물 혈청의 풀을 이용한 웨스턴 블롯에 의한 추가의 분석을 위해 분류하였다. 유사한 밴드 패턴에 기초하여, 이중 클론을 제거하였다. 혈청의 두 세트 모두와 반응성을 나타내는 임의의 클론을 제거하였다. 분석 결과, 23개 클론을 추가의 평가를 위해 선택하였다. 그룹 당 클론과 공통 항원의 그룹이 표 2에 도시된다.
표 2
Figure pct00001
실시예 6 개개 에를리히아 카니스 양성 개과동물 혈청 샘플을 이용한 웨스턴 블롯 분석
23개 클론 모두를 개개 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다. 각각의 겔을 니트로셀룰로스로 옮기고 ELISA/SNAP® 시험에 의해 에를리히아 카니스 감염에만 양성인 개로부터의 개과동물 혈청의 개개 샘플을 이용하여 웨스턴 블롯팅하였다. 개과동물 혈청을 대장균(E. coli) 용해물을 함유하는 실시예 4에 개시된 동일한 희석제로 1:500 희석하고 반응성을 표준 비색 호스래디쉬 퍼옥시다아제 기법 (Opti-4CN, Bio-Rad)으로 검출하였다. 총 13개의 개개 개과동물 혈청 샘플을 평가하였다. 블롯을 샘플과 비교하여 클론 당 현저한 밴드 또는 밴드의 세트에 대해 반응성을 나타내는 개의 수를 측정하였다. 결과를 표 3 및 도 6에 요약한다 (굵게 표시한 클론을 도면에 도시한다).
표 3
Figure pct00002
23개 클론 모두를 또한 다른 벡터-매개 감염성 질병에 대해 양성으로 시험된 풀링된 개과동물 혈청을 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 하기 단일 감염에 대해 ELISA 또는 SNAP®에 의해 시험 양성인 샘플을 평가하였다: 심장사상충, 라임, 아나플라스마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophilum) 또는 에를리히아 어윈지이(E. ewingii). 클론 중 어떤 것도 상기 표에서 이러한 기타 벡터-매개 감염에 대해 양성인 개과동물 혈청과 교차-반응성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 7 에를리히아 카니스 DIVA 항원을 엔코딩하는 관련 유전자 세그먼트의 동정
a. 120 kDa 항원
상기 항원은 이미 문헌[Yu et al. (J Clin Microbiol. 2000 Jan;38(1):369-74; see also, McBride et al ., 2000 Infec. Immun. 68:13)]에 개시되어 있고 개의 에를리히아 카니스 감염을 진단하는데 유용한 것으로 나타났다. 상기 항원은 "p120" 및 "p140" 에를리히아 카니스 항원 둘 모두로서 개시되었다. 상기 문헌 참조. 유 등(Yu et al.)은 p120 유전자에 의해 발현된 재조합 단백질이 소듐 도데실 설페이트 겔 상에서 140kDa의 분자 크기를 지니며, 이것은 단백질의 예측 분자 질량보다 큰 것이라고 설명한다. 참조 [Yu et al., page 373]. 워커 그룹(Walker group) (Yu et al ., and McBride et al .)은 단백질을 에를리히아 카니스 p120 및 p140 둘 모두로서 언급한다. 따라서, 본 설명은 이 단백질을 기술하기 위해 p120 및 p140 둘 모두를 상호교환적으로 이용한다. 에를리히아 카니스 p120/140 유전자에 대한 수탁 번호는 AF112369이고 관련 단백질은 AAD34330이다. 또한 수탁 번호 YP302666을 참조한다. 클론 2, 10, 17, 및 33은 120kDa 항원 유전자의 전장 세그먼트를 함유한다. 클론 35는 상기 유전자의 트렁케이션(truncation)을 함유할 수 있다 (참조, SEQ ID NO:1 및 2).
상기 유전자는 에를리히아 카니스 유전체 DNA로부터 증폭되고 6-His 태그를 이용하여 제조자의 지시(Invitrogen)에 따라 pET 발현 시스템으로 서브클로닝되었다. 이 플라스미드의 서열화 결과는 아미노산 58-589로부터, SEQ NO:ID 2에 도시된 단백질을 엔코딩하는 유전자 서열과 정확히 매칭된다. 이 단백질을 발현하도록 유도된 BL21 세균으로부터의 단백질 용해물을 감염된 개과동물 혈청으로의 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 세포로 백신접종된 동물로부터의 혈청으로 프로빙된 웨스턴 블롯과 비교하였다. 종전의 발견과 일관되게, 감염된 개로부터의 혈청만이 예상된 분자량의 이 단백질을 인지하였다 (데이터는 도시되지 않음).
P120은 14회 반복되는 36개의 아미노산 모티프를 지닌다. SEQ ID NO:15 참조. 반복된 부분 (SEQ ID NO:15에서 밑줄친 영역은 60 kD 펩티드이다). SEQ ID NO:16은 정렬된 14개 반복부를 나타낸다. SEQ ID NO:17은 14개 반복부의 공통(consensus) 서열을 나타낸다.
본 발명의 일 구체예는 하기를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다:
KEEX1TPEVX2AEDLQPAVDX3SX4EHSSSEVGX5KVSX6TS (SEQ ID NO:17).
여기에서 X1 = S 또는 N이고
X2 = K 또는 R이고
X3 = G, D, 또는 S이고
X4 = V 또는 I이고
X5 = E 또는 K이고
X6 = E 또는 K이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 다합체 폴리펩티드를 제공하고 여기서 SEQ ID NO:17은 2회 이상 반복된다. 다합체 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 이종 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:21, XPEVKAEDLQPAVDGSVEHX의 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 각각의 X들은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 아미노산이다.
b. 200 kDa 항원
상기 항원은 문헌[McBride et al . (J Clin Microbiol. 2001 Jan;39(1):315-22)]에 이미 개시되어 있고 에를리히아증의 진단하는데 유용한 것으로 나타났다. 이 유전자의 수탁 번호는 AF252298이고 관련 단백질은 AAK01145이다. 이 단백질 서열의 일부는 공개된 특허와 관련된다 (미국특허 6,355,777호의 SEQ ID NO:2, 수탁 번호 AAE96254). 본 발명자들은 에를리히아증의 진단 항원 및 DIVA 시약으로서 기능하는 상기 단백질의 상이한 영역을 동정하였다. 이 유전자의 일부는 AF252298의 뉴클레오티드 1081로부터 말단의 뉴클레오티드 4266까지 이른다 (SEQ ID NO:3 및 4 참조).
상기 유전자는 에를리히아 카니스 유전체 DNA로부터 증폭되고 6-His 태그를 이용하여 제조자의 지시(Invitrogen)에 따라 pET 발현 시스템으로 서브클로닝되었다. 이 플라스미드의 서열화 결과는 아미노산 1 내지 1061로부터, SEQ NO:ID 4에 도시된 단백질을 엔코딩하는 유전자 서열과 정확히 매칭된다. 이 단백질을 발현하도록 유도된 BL21 세균으로부터의 단백질 용해물을 감염된 개과동물 혈청으로의 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스로 백신접종된 동물로부터의 혈청으로 프로빙된 웨스턴 블롯과 비교하였다. 종전의 발견과 일관되게, 감염된 개로부터의 혈청만이 예상된 분자량의 상기 단백질을 인지하였다 (데이터는 도시되지 않음).
c. ATPase
이 유전자는 (유전자좌 태그 "Ecan02000699") 에를리히아 카니스의 샷건 유전체 서열의 자동화된 컴퓨터 분석에 의해 예상되었다. 이것은 4000개를 초과하는 아미노산의 단백질을 코딩한다 (ZP_00210575). 에를리히아 카니스 DIVA 스크린은 이 유전자의 두 분리된 영역과 잠재적인 면역지배 항원 및 DIVA 시약으로서 관련 단백질을 확인하였다. 클론 84 및 7에서 확인된 단백질의 세그먼트는 각각 수탁 번호 46308382의 아미노산 1984-2774 및 2980-3740이다 (SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 참조).
이 유전자의 두 단편 모두를 에를리히아 카니스 유전체 DNA로부터 증폭시키고 6-His 태그를 이용하여 제조자의 지시(Invitrogen)에 따라 pET 발현 시스템으로 별도로 서브클로닝하였다. 이 플라스미드의 서열화 결과는 각각 아미노산 1 내지 782 및 1 내지 746로부터, SEQ NO:ID 6 및 8에 도시된 단백질과 관련된 유전자 서열과 정확히 매칭된다. 이 단백질을 발현하도록 유도된 BL21 세균으로부터의 단백질 용해물을 감염된 개과동물 혈청으로의 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 세포로 백신접종된 동물로부터의 혈청으로 프로빙된 웨스턴 블롯과 비교하였다. 종전의 발견과 일관되게, 감염된 개로부터의 혈청만이 예상된 분자량의 이 단백질을 인지하였다 (데이터는 도시되지 않음).
d. 열 쇼크 단백질
이 클론이 열 쇼크 단백질 GrpE에 대한 유전자를 함유하였으나, 면역지배 항원을 코딩하는 유전자 서열이 유전체의 자동화된 컴퓨터 분석에 의해 예상된 가상 단백질 서열로부터 발생한다. 단백질의 분자량 및 pI에 기초하여, 클론 9에서 관심있는 유전자는 유전자좌 번호 "Ean02000495"이고 관련 단백질은 46308954이다.
이 단백질이 유전체의 컴퓨터 주석(annotation)으로부터만 예상되고 에를리히아 카니스 생물체로부터 면역지배 단백질로서 이전에 확인된 바는 없지만, 이 유전자가 에를리히아 카니스로부터 발현되고 감염된 개과동물 숙주에서 면역 반응을 자극한다는 것이 첫 번째 증거이다. 이 단백질은 p16 항원으로서 동정될 것이다 (SEQ ID NO: 9 및 10 참조).
이 유전자를 관심있는 유전체 DNA를 함유하는 pBlueScript 벡터로부터 증폭시키고 6-His 태그를 이용하여 제조자의 지시(Invitrogen)에 따라 pET 발현 시스템으로 서브클로닝하였다. 이 플라스미드의 서열화 결과는 유전자좌 번호 "Ecan02000495"와 관련된 유전자 서열과 정확히 매칭된다. 이 단백질을 발현하도록 유도된 BL21 세균으로부터의 단백질 용해물을 감염된 개과동물 혈청으로의 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스로 백신접종된 동물로부터의 혈청으로 프로빙된 웨스턴 블롯과 비교하였다. 종전의 발견과 일관되게, 감염된 개로부터의 혈청만이 예상된 분자량의 이 단백질을 인지하였다 (도 7 참조).
e. 리보솜 단백질 L1
이 유전자는 에를리히아 카니스 유전체로부터 유전자좌 태그 "Ecan02000476"에 의해 확인된다. 관련 단백질은 수탁 번호 ZP_00211130을 지닌다 (SEQ ID NO:11 및 12 참조). 이 단백질의 동정은 유전체의 자동화 컴퓨터 분석에 기초하여 예상되었다. 이 단백질의 BLAST 분석은 서열이 에를리히아 샤핀시스의 표면 단백질 (수탁 번호 4894576)과 약 70% 동일함을 나타낸다. 에를리히아 샤핀시스 단백질에 대한 면역반응성은 유 등 [Yu et al ., (J Clin Microbiol. 1999 Aug;37(8):2568-75)]에 의해 이미 보고되었다. 에를리히아 샤핀시스 단백질 (수탁 번호 4894576)은 106kDa 단백질 전구물질로서 언급된다.
f. 가능한 비-120 kDa 항원
120kDa 항원에 대한 유전자를 함유하는 유전체 단편 내에 또한 면역지배성이고 DIVA 시약일 수 있는 다른 유전자가 존재한다. 예를 들어, 클론 10은 120kDa 항원만을 함유하는 클론에 비해 감염된 혈청으로 프로빙된 웨스턴 블롯 상에서 상이한 밴드 패턴을 제공한다. 클론 10은 타입 IV 분비 경로의 VirD4 구성요소에 대한 유전자 정보를 함유하고 이 유전자 서열은 유전자좌 태그 "Ecan02000624"에 의해 확인된다. 이 유전자는 723개 아미노산의 단백질을 코딩하나 (ZP_00211244), 겔 상에서 확인된 단백질의 분자량에 의해 측정된 대로 이 단백질의 일부만이 클론 10에 의해 발현되는 것으로 여겨진다 (SEQ ID NO:13 및 14 참조).
실시예 8
에를리히아 카니스 P140 펩티드의 평가
포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스로 면역된 비글로부터의 혈청 (백신 샘플)을 에를리히아 카니스 p140 단백질로부터 유래된 합성 펩티드(p120으로서도 공지됨, 실시예 7 참조)를 이용하여 제조된 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다.
포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스의 제조 및 비글의 면역화는 실시예 1 및 2에 기재되어 있다. 면역된 비글로부터의 샘플을 합성 펩티드(SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)를 이용하여 간접 및 직접 검정 포맷으로 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다.
간접 검정 포맷
샘플을 합성 펩티드(SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)를 이용하여 제조된 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다. 개개 펩티드를 직접 흡착에 의해 미세역가 웰 상에 고정시켰다. 시험 샘플의 희석액 (1:100)을 미세역가 웰에 첨가하고 미결합된 항체를 세척에 의해 제거하였다. 고정된 펩티드에 결합된 항체를 항종, 이 경우 개과동물, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRPO) 컨쥬게이트 (1:2000 희석액)와 반응시키고, 세척하고, HRPO 기질을 첨가함에 의해 검출하였다. 개개 미세역가 웰의 흡광도 (A650)를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
직접 검정 포맷
개개 펩티드 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)를 소 혈청 알부민에 컨쥬게이션하고 직접 흡착에 의해 미세역가 웰 상에 고정하였다. 합성 펩티드 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)를 지시약, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRPO)에 컨쥬게이션하였다. 시험 샘플 및 면역검정 펩티드/지시약을 상응하는 펩티드로 코팅된 미세역가 웰에 첨가하였고, 이것을 인큐베이션하고 세척하였다. 고정된 펩티드에 결합된 항체 및 펩티드/지시약을 HRPO 기질 시약의 첨가에 의해 검출하였다. 개개 미세역가 웰의 흡광도 (A650)를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
검정 결과를 표 4에 도시한다. 양성 대조군 (PC, ID 1049:16E) 및 음성 대조군 (NC, 3818:57B)은 각각 에를리히아 카니스 양성 및 음성 혈청 샘플로 공지되어 있다. 모든 샘플을 시판되는 SNAP® 4Dx® 시험을 이용하여 에를리히아 항체에 대해 시험하였다. 상이한 애쥬번트를 이용하여 제형화된 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 항원을 투여받은 6마리 개 (CVYDEH, CWMBDC, CVXCSM, CWMAXK, CVSCVA 및 CVXCAP)로부터의 연속된 일시적인 샘플에 대한 결과를 0일 내지 면역 후 42일에 대해 도시한다. SNAP® 4Dx® 시험 결과는 항체 반응이 백신접종된 동물에서 유도되었음을 입증한다. 백신접종된 동물로부터의 어떤 혈청 샘플도 직접 검정 포맷에서 반응성이 아니었다. 여러 샘플 (예를 들어 개 CWMAXK로부터 비롯됨)은 간접 검정 포맷에서 높은 배경 반응을 지녔다.
이 결과는 포르말린 불활성화된 백신을 이용한 면역화의 결과로서 유도된 항체가 에를리히아 카니스 p140 단백질로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)에 대해 상당히 비-반응성이었음을 입증한다.
표 4. 에를리히아 카니스 p140 단백질로부터 유래된 펩티드( SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19 및 SEQ ID NO :20)를 이용하여 제조된 미세역가 검정을 이용하여 측정된 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 항원으로 면역된 개로부터의 혈청의 반응.
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 9
공지된 에를리히아 카니스 양성 및 음성 개로부터의 혈청을 에를리히아 카니스 단백질 p140 단백질로부터 수득된 합성 펩티드 (p120으로서도 공지됨, 실시예 7 참조)를 이용하여 제조된 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다.
에를리히아 카니스 양성 및 음성 필드(field) 샘플을 수득하고 에를리히아 카니스에 대한 항체에 대해 SNAP® 4Dx® 시험을 이용하여 시험하였다. 이어서 샘플을 에를리히아 카니스 p140 단백질로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)를 이용하여 제조된 간접 및 직접 미세역가 플레이트 포맷 검정을 이용하여 시험하였다.
간접 검정 포맷
샘플을 합성 펩티드(SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)를 이용하여 제조된 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다. 개개 펩티드를 직접 흡착에 의해 미세역가 웰 상에 고정시켰다. 시험 샘플의 희석액 (1:100)을 미세역가 웰에 첨가하고 미결합된 항체를 세척에 의해 제거하였다. 고정된 펩티드에 결합된 항체를 항종, 이 경우 개과동물, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRPO) 컨쥬게이트 (1:2000 희석액)와 반응시키고, 세척하고, HRPO 기질을 첨가함에 의해 검출하였다. 개개 미세역가 웰의 흡광도 (A650)를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
직접 검정 포맷
개개 펩티드 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)를 소 혈청 알부민에 컨쥬게이션하고 직접 흡착에 의해 미세역가 웰 상에 고정하였다. 합성 펩티드 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)를 지시약, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRPO)에 컨쥬게이션하였다. 시험 샘플 및 면역검정 펩티드/지시약을 상응하는 펩티드로 코팅된 미세역가 웰에 첨가하였고, 이것을 인큐베이션하고 세척하였다. 고정된 펩티드에 결합된 항체 및 펩티드/지시약을 HRPO 기질 시약의 첨가에 의해 검출하였다. 개개 미세역가 웰의 흡광도 (A650)를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
표 4는 간접 검정 포맷을 이용하여 시험된 에를리히아 카니스 양성 및 음성 필드 샘플에 대한 결과를 도시한다. 양성 대조군 (PC, ID 1049:16E) 및 음성 대조군 (NC, 3818:57B)은 각각 에를리히아 카니스 양성 및 음성 혈청 샘플로 공지되어 있다. 샘플을 SNAP® 4Dx® 시험을 이용하여 에를리히아 항체 양성 또는 음성으로 결정하였다. 검정 결과는 펩티드 시약 (SEQ ID:18, SEQ ID:19 및 SEQ ID:20)을 이용하여 제조된 미세역가 플레이트 포맷 검정에 대해 도시된다.
표 5는 직접 검정 포맷을 이용하여 시험된 에를리히아 카니스 양성 및 음성 필드 샘플에 대한 결과를 도시한다. 양성 대조군 (PC, ID 1049:16E) 및 음성 대조군 (NC, 3818:57B)은 각각 공지된 에를리히아 카니스 양성 및 음성 혈청 샘플이었다. 샘플은 SNAP® 4Dx® 시험을 이용하여 에를리히아 카니스 항체 양성 또는 음성인 것으로 결정되었다. 검정 결과는 펩티드 시약 (SEQ ID:18, SEQ ID:19 및 SEQ ID:20)을 이용하여 제조된 미세역가 플레이트 포맷 검정에 대해 도시된다
표 5. P140 펩티드 ( SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19 및 SEQ ID NO :20)를 이용하여 구성된 간접 미세역가 플레이트 포맷 검정을 이용하여 시험된 에를리히아 카니 스 양성 및 음성 필드 샘플.
Figure pct00005
표 6. P140 펩티드 ( SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19 및 SEQ ID NO :20)를 이용하여 구성된 직접 미세역가 플레이트 포맷 검정을 이용하여 시험된 에를리히아 카니 스 양성 및 음성 필드 샘플.
Figure pct00006
이 결과는 천연 감염의 결과로서 유도된 항체가 에를리히아 카니스 p140 단백질 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:20)로부터 유래된 합성 펩티드와 반응성임을 입증한다.
실시예 10 에를리히아 카니스 단백질 p16 단백질로부터 수득된 합성 펩티드 (SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23 및 SEQ ID NO :24)를 이용하여 제조된 미세역가 -플레이트 기재 면역검정을 이용한 공지된 에를리히아 카니스 양성 및 음성 개로부터의 혈청의 시험. 검정은 지시약으로서 항- 개과동물 HRPO 컨쥬게이트를 사용하는 간접 검정 포맷을 이용하여 수행되었다.
6개의 에를리히아 카니스-항체 양성 및 3개의 에를리히아 카니스-항체 음성 개과동물로부터의 혈청을 싱클레어 리서치 (Columbia, MO)로부터 입수하였다. 혈청 샘플은 에를리히아 카니스 항체에 대한 허가된 가역성 흐름 크로마토그래피 결합 검정 IDEXX SNAP® 4Dx® 시험을 이용한 시험에 의해 양성 또는 음성인 것으로 나타났다. 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP® 검정 결과는 표 7에 도시된다.
샘플을 에를리히아 카니스 p16 표면 단백질로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ　ID　NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24)를 이용하여 제조된 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다. 합성 펩티드를 이뮬론(Immulon) 미세역가 웰에 0.25 ug/ml (SEQ ID NO: 22 및 23), 또는 0.5 ug/ml (SEQ ID NO: 24)로 고정하였다. 시험 샘플의 희석액을 (1:100) 미세역가 웰에 첨가하고 결합되지 않은 항체를 세척에 의해 제거하였다. 고정된 펩티드에 결합된 항체를, 항종, 이 경우에 개과동물 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRPO) 컨쥬게이트 (1:2000 희석액)와의 반응에 의해 검출하고, 세척하고, HRPO 기질을 첨가하였다. 개개 미세역가 웰에서 650 nm (A650)에서 유체의 흡광도를 미세역가-플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
결과:
양성 및 음성 샘플에 대한 결과를 표 7에 도시한다. 양성 샘플 HP-319, HP-322, HP-326, HP-342, HP-354, HP-358은 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24에 도시된 펩티드 서열과 반응성이었다. 음성 샘플 HP-302, HP-303 및 HP-306은 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24에 도시된 펩티드 서열과 비반응성이었다.
결론:
이 결과는 천연 감염의 결과로서 유도된 항체가 상기 개시된 간접 검정 포맷에서 에를리히아 카니스 p16 단백질로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ　ID　NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ NO:24)와 반응성이었음을 입증한다.
표 7. 에를리히아 카니스 합성 펩티드 ( SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23 및 SEQ ID NO :24) 코팅된 미세역가 웰과 지시약으로서 항종 컨쥬게이트를 이용한 양성 및 음성 개과동물 샘플에 대한 검정 결과. A650은 650 nm 에서의 흡광도이다. "4 Dx SNAP" 컬럼은 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP ® 4 Dx ® 검정으로부터의 결과를 제시한다.
Figure pct00007
실시예 11 에를리히아 카니스 p16 단백질 서열로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23 및 SEQ ID NO :24)를 이용하여 제조된 미세역가 -플레이트 기재 면역검정을 이용한 공지된 에를리히아 카니스 양성 및 음성 개로부터의 혈청의 시험. 검정은 HRPO - 표지된 펩티드를 지시약으로서 이용한 직접 검정 포맷을 사용하여 수행되었다.
7개의 에를리히아 카니스-항체 양성 및 3개의 에를리히아 카니스-항체 음성 개과동물로부터의 혈청을 필드 개로부터 수득하였다. 혈청 샘플은 에를리히아 카니스 항체에 대한 허가된 가역성 흐름 크로마토그래피 결합 검정 IDEXX SNAP® 3Dx®를 이용한 시험에 의해 양성 또는 음성인 것으로 나타났다. 검정 결과를 표 8에 도시한다.
샘플을 에를리히아 카니스 p16 표면 단백질로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ　ID　NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24)를 이용하여 제조된 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다. 합성 펩티드를 미세역가 웰에 1 ug/ml로 고정하였다. 합성 펩티드의 분리된 양을 지시약 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRPO)에 컨쥬게이션하였다. 시험 샘플 및 펩티드:HRPO 컨쥬게이트 (1 ug/ml)를 펩티드-코팅된 미세역가 웰에 첨가하였고, 이것을 인큐베이션하고, 세척하였다. 고정된 펩티드 및 펩티드:HRPO 컨쥬게이트에 결합된 항체를 미세역가 웰에서 고정하였다. HRPO 기질 시약을 첨가시켜 이 복합체를 검출하였다. 개개 미세역가 웰의 광학 밀도를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
결과:
양성 및 음성 샘플에 대한 결과를 표 8에 도시한다. 양성 샘플 813:91I, 1049:16A, 1049:16U, 1061:03I, 1177:21G, 1177:21K 및 1177:63O은 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24에 도시된 펩티드 서열과 반응성이었다. 음성 샘플 3818:57A, 3818:57C 및 3818:57D은 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24에 도시된 펩티드 서열과 비반응성이었다.
결론:
이 결과는 천연 감염의 결과로서 유도된 항체가 상기 개시된 직접 검정 포맷에서 에를리히아 카니스 p16 단백질로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ　ID　NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ NO:24)와 반응성이었음을 입증한다.
표 8. 에를리히아 카니스 합성 펩티드-코팅된 미세역가 웰 ( SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23 및 SEQ ID NO :24)과 에를리히아 카니스 합성 펩티드- 컨쥬게이트 ( SEQ ID NO:22, SEQ ID NO :23 및 SEQ ID NO :24)를 지시약으로서 이용한 양성 및 음성 개 과동물 필드 샘플에 대한 검정 결과. A650은 650 nm 에서의 흡광도이다. "3 Dx SNAP " 컬럼은 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP ® 3 Dx ® 검정으로부터의 결과를 제시한다.
Figure pct00008
실시예 12 합성 펩티드 ( SEQ ID NO :23) 코팅된 미세역가 플레이트 및 항- 개 과동물 컨쥬게이트를 지시약으로서 이용한 에를리히아 카니스에 실험 감염된 6마리 개로부터의 혈청에 대한 검정 결과
6마리 나이브 개를 에를리히아 카니스의 루이지애나 분리물로 실험 감염시켰다. 혈청 샘플을 감염후 3, 7, 10, 13, 17, 21, 24, 28 및 35일에 수득하였다. 샘플을 에를리히아 카니스 p16 표면 단백질로부터 유래된 p16-2 합성 펩티드 (SEQ ID NO:23)를 이용하여 제조된 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다. 합성 펩티드를 미세역가 웰에 고정시키고, 시험 샘플의 희석액 (1:100)을 미세역가 웰에 첨가하고 결합되지 않은 항체를 세척에 의해 제거하였다. 고정된 펩티드에 결합된 항체를, 항-개과동물, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRPO) 컨쥬게이트 (1:2000 희석액)와의 반응에 의해 검출하고, 세척하고, HRPO 기질을 첨가하였다. 개개 미세역가 웰의 광학 밀도를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
결과:
검정 결과를 표 9에 도시한다. 6마리 개 모두는 실험 감염 이후에 음성 상태에서 양성 상태로 전환되었고, 이는 시판되는 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP® 4Dx® 검정으로 측정되었다. 모든 개로부터의 혈청을 감염 후 다양한 시점에 SEQ ID NO:23에 도시된 에를리히아 카니스 p16-펩티드와 반응시켰다. 실험 감염과 SEQ ID NO:23 펩티드에 대한 초기 반응 사이의 시간은 다음과 같았다: Dog 108532, 감염 17일 후; Dog 115853, 감염 13일 후; Dog 265006, 감염 17일 후; Dog 268830, 감염 13일 후; Dog 285307, 감염 13일 후 및 Dog 533573, 감염 13일 후.
결론:
이 결과는 실험 감염의 결과로서 유도된 항체가 에를리히아 카니스 p16 단백질로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ ID NO:23)와 반응성이었음을 입증한다.
표 9. 에를리히아 카니스 합성 펩티드 ( SEQ ID NO :23) 코팅된 미세역가 플레이트 및 항종 컨쥬게이트를 지시약으로서 이용한 실험 감염된 동물로부터의 혈청을 이용한 검정 결과. A650은 650 nm 에서의 흡광도이다. "4 Dx SNAP " 컬럼은 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP ® 4 Dx ® 검정으로부터의 결과를 제시한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 13: 개를 면역시키기 위한 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스의 제조
문헌에 개시된 방법을 이용하여 에를리히아 카니스를 개과동물 세포 배양으로 성장시켰다. [참조예: Breitschwerdt, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, Vol 42:362-368]. 광 현미경을 이용하여 030 세포가 에를리히아 카니스에 의해 80% 넘게 감염된 것으로 판단되었다. 2 리터의 에를리히아 카니스 감염된 세포 배양액을 수집하고, 원심분리하고, 펠렛을 유지시켜 7.31 그램의 물질 (습윤 중량)을 수득하였다. 물은 물질의 80 중량%를 구성하는 것으로 추정되며, 산정된 건조 중량은 1.462 그램이다 (물질의 20 중량%). 세포 펠렛을 73 ml의 총 부피를 위해 PBS에서 20 mg/ml로 재현탁시켰다 (건조 중량).
이렇게 재현탁된 세포 펠렛에 0.04%의 최종 포름알데히드 농도를 위해 0.73 ml의 포르말린 용액을 첨가하였다 (Sigma Catalog HT50-1-2 포르말린 용액 10%, 중성 완충됨). 용액을 4℃에서 12 내지 24시간 동안 교반하였다. 불활성회된 혼합물을 원심분리하고 세포 펠렛을 유지시켰다. 펠렛을 250 ml의 PBS로 재현탁시킴에 의해 세척하였다. 원심분리에 의해 물질을 수집하고 세척을 한번 더 반복하였다.
샘플을 73개의 스크류 캡 바이알로 분취시키고 -80℃에서 동결시켰다. 각 바이알은 동물을 면역시키기에 적절한 애쥬번트와의 조합에 적합한 20 mg (건조 중량)의 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 세포 배양액을 함유한다.
실시예 14 두 상이한 애쥬번트를 지니는 포르말린 불활성화된 에를리히아 카 니스의 제조 및 에를리히아 카니스 항원으로 비글을 면역화시키기 위한 프로토콜
개집-사육된 개 (실험실 비글)를 면역시키기 위해, 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 항원을 세 개의 상이한 애쥬번트를 이용하여 제형화하였다. 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 항원을 제조자에 의해 개시된 프로토콜을 이용하여 Ribi 애쥬번트 (Corixa Corp., Seattle WA)로 제조하였다. 각 투여량은 약 20 mg의 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 세포 배양액 (건조 중량)을 함유하였다. 면역원의 추가 제형을 Ribi 애쥬번트 (상기 개시됨)와 애쥬번트 BCG (투여량 당 1 mg) (Calbiochem of EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA)의 조합물을 이용하여 제조하였다. 3마리 개로 구성된 두 그룹에 Ribi 애쥬번트를 단독으로 함유하거나 Ribi 애쥬번트와 BCG 애쥬번트를 조합하여 함유하는 불활성회된 에를리히아 카니스를 이용하여 170일 (0일, 14일, 156일, 170일)의 기간에 걸쳐 4회 투여하였다. 백신-유도된 과면역 상태를 제공하기 위한 노력으로, 모든 개는 제조자의 지시에 따라 애쥬번트 TiterMax® (CytRx Corp., Norcross, GA) 또는 애쥬번트 TiterMax®와 애쥬번트 BCG를 조합 이용하여 제형화된 단일 용량 (247일)의 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스를 투여받았다. 개에게 하기 스케쥴에 따라 백신을 투여하였다.
Figure pct00011
Figure pct00012
코반스 리서치 프로덕츠 인크의 IACUC 위원회는 실험실 비글을 면역시키기 위한 프로토콜을 승인하였다. 모든 개에게 적합한 시험 제품을 등쪽어깨 영역에서 피하 투여하였다. 0일에 6마리 개 모두는 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP® 3Dx® 진단뿐만 아니라 에를리히아 카니스 생물체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 둘 모두 이용시 혈청-음성인 것으로 나타났다. 6마리 동물 모두는 42일까지 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP® 3Dx® 에를리히아 카니스 검정 상에서 양성 시험으로 혈청전환되었다. 생산혈을 226일, 261일, 268일 및 282일에 수득하였다 (대략 25 ml의 혈청을 산출하는 약 50 ml의 혈액).
실시에 15 에를리히아 카니스 단백질 p16 단백질로부터 수득된 합성 펩티드 (SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24)를 이용하여 제조된 미세역가 -플레이트 기재 면역검정을 이용하여 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 (백신 샘플)로 면역된 비글로부터의 혈청의 시험
포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스의 제조 및 비글의 면역화는 실시예 13 및 14에 개시되어 있다. 면역된 비글로부터의 샘플을 합성 펩티드 (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24)를 이용하여 제조된 직접 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다.
직접 검정 포맷
샘플을 합성 펩티드 (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24)를 이용하여 제조된 미세역가-플레이트 기재 면역검정을 이용하여 시험하였다. 합성 펩티드를 미세역가 플레이트 웰 상에 1.0 ug/ml으로 고정하였다. 합성 펩티드의 분리된 양을 지시약 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRPO)에 컨쥬게이션하였다. 시험 샘플 및 면역검정 펩티드/지시약을 펩티드-코팅된 미세역가 웰에 첨가하고, 이것을 인큐베이션하고 세척하였다. 고정된 펩티드 및 펩티드/지시약에 결합된 항체를 미세역가 웰에 고정시켰다. 이 복합체는 HRPO 기질 시약을 첨가시켜 검출하였다. 개개 미세역가 웰의 광학 밀도를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
결과
검정 결과를 표 10에 도시한다. 양성 대조군 (PC, ID 1049:16E) 및 음성 대조군 (NC, 3818:57B)은 각각 공지된 에를리히아 카니스 양성 및 음성 혈청 샘플이었다. 모든 샘플을 에를리히아 카니스 항체에 대해 시판되는 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP® 4Dx® 시험을 이용하여 시험하였다. 상이한 애쥬번트를 이용하여 제형화된 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 항원을 투여받은 6마리 개 (CVYDEH, CWMBDC, CVXCSM, CWMAXK, CVSCVA 및 CVXCAP)로부터의 연속된 일시적인 샘플에 대한 결과를 면역 후 226일, 261일, 268일 및 282일에 대해 도시한다. 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP® 4Dx® 시험 결과는 항체 반응이 백신접종된 동물에서 유도되었음을 입증한다. 백신접종된 동물로부터의 어떤 혈청 샘플도 펩티드 (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24) 미세역가 플레이트-포맷 검정에서 반응성이 아니었다.
표 10. 에를리히아 카니스 합성 펩티드 ( SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24) 코팅된 미세역가 플레이트 합성 펩티드- 컨쥬게이트를 지시약으로서 이용 하 여 측정된 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 항원으로 면역된 개로부터의 혈청을 이용한 검정 결과. OD 는 광학 밀도이다. "4 Dx SNAP " 컬럼은 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP ® 4 Dx ® 검정으로부터의 결과를 제시한다.
Figure pct00013
Figure pct00014
결론
이 결과는 포르말린 불활성화된 에를리히아 카니스 항원을 이용한 면역화 결과로서 유도된 항체가 가역성 흐름 크로마토그래피 SNAP® 4Dx® 시험에서 반응성이었음을 입증하고, 이는 항-에를리히아 카니스 항체 반응이 개시되었음을 나타낸다. 이러한 동일한 샘플은 에를리히아 카니스 P16 단백질로부터 유래된 합성 펩티드 (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24)와 비반응성이었다.
포르말란 불활성화된 에를리히아 카니스 항원으로 면역된 개로부터의 혈청은 에를리히아 카니스 P16 단백질로부터 유래된 펩티드 (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24)와 비반응성이었다. 합성 펩티드 (SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24)는 백신접종의 결과로서 유도된 항체에 비반응성이었다.
실시예 15 에를리히아 카니스 감염의 치료 모니터링
6마리의 개를 에를리히아 카니스에 실험 감염시켰다. 감염 28일 후에 독시시클린을 투여하였다. 에를리히아 카니스에 특이적인 항체를 SEQ ID NO:23을 이용하여 간접 검정 프로토콜로 검출하였다. SEQ ID NO:23에 도시된 폴리펩티드를 직접 흡착에 의해 미세역가 웰 상에 고정시켰다. 시험 샘플의 희석액 (1:100)을 미세역가 웰에 첨가하고 결합되지 않은 항체를 세척에 의해 제거하였다. 고정된 펩티드에 결합된 항체를, 항종, 이 경우 토끼 항-개과동물 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRPO) 컨쥬게이트 (1:1000 희석액)와의 반응에 의해 검출하였다. 개개 미세역가 웰의 흡광도 (A650)를 미세역가 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다. 음성 컷오프는 음성 대조군 O.D. 값의 2배였다.
이 결과는 도 8에 도시된다. E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, 및 E-6 개를 에를리히아 카니스로 실험 감염시켰으나 감염을 치료하지 않았다. 도 8은 SEQ ID NO:23에 결합하는 항체 수준이 실험 감염 후 현저하게 증가하였으나 실험 경과 동안 감소하지 않았음을 입증한다. EDTx-1, EDTx-2, EDTx-3, EDTx-4, EDTx-5, 및 EDTx-6 개를 에를리히아 카니스로 실험 감염시킨 후 감염시킨 지 28일 후에 독시시클린으로 처리하였다. 도 8은 SEQ ID NO:23에 결합하는 항체의 수준이 실험 감염 후 현저하게 증가하였으나 독시시클린 투여 후 감소하였음을 입증한다. 따라서, SEQ ID NO:23은 에를리히아 카니스 감염의 진행, 치료에 대한 반응, 또는 치료 효능을 모니터링하는데 이용될 수 있다.
실시예 16 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 개와 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되었으나 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 개의 구별
백신은 감염을 예방하는데 전혀 효과적이지 않을 수 있다. 따라서, 백신접종된 동물이 백신접종에도 불구하고 감염되었는 지를 측정하는 방법을 갖는 것이 요망될 수 있다. p16을 검출제로서 이용한 면역검정은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되었으나 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 개에서 항-에를리히아 카니스 항체를 검출하지 못한다. 이제 에를리히아 카니스 p16 단백질 (SEQ ID NO:10)이 에를리히아 카니스 백신을 투여받은 개에서 에를리히아 카니스 감염을 검출하는데 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 6마리의 개 및 2마리의 백신접종되지 않은 개를 10% DMSO에서 에를리히아 카니스 감염된 K9 세포로 챌린지하였다. 각각의 개를 SEQ ID NO:10을 포함하는 면역검정으로 항-에를리히아 카니스 항체에 대해 경시적으로 시험하였다. 백신접종된 개와 두 마리의 대조군 개 모두가 에를리히아 카니스에 감염되었다. 에를리히아 카니스 감염은 두 개의 독립적인 감염 마커로 확인되었다. 면역검정은 백신접종된 개와 백신접종되지 않은 개에서 에를리히아 카니스 감염을 검출할 수 있다. 모든 면역검정 신호는 배경 신호 위로 현저하였다. 도 9A-B, 10A-C, 및 11A-C 참조.
서열:
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
SEQ ID NO:25
XMLXVQNHVDQHTNHIEHDDYHFTXPT
여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 4번 위치의 X는 H 또는 Q이고 25번 위치의 X는 D 또는 G이다.
SEQ ID NO:26
XTNHIEHDDYHFTXPTSFEVNLSEEEKMEL
여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 14번 위치의 X는 G 또는 D이다.
SEQ ID NO:27
XTXPTSFEVNLSEEEKMELQEVSSIDS
여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 3번 위치의 X는 G 또는 D이다.
SEQ ID NO:28
XTNHIEHDDYHFTXPT
여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 14번 위치의 X는 G 또는 D이다.
SEQ ID NO:29
XTXPTSFEVNLSEEEKMEL
여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 3번 위치의 X는 G 또는 D이다.
SEQ ID NO:30
XTNHIEHDDYHFTXPTSFEVNLSEXEKMEL
여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 14번 위치의 X는 G 또는 D이고, 25번 위치의 X는 E 또는 G이다.
SEQ ID NO:31
XTXPTSFEVNLSEXEKMELQEVSSIDS
여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 3번 위치의 X는 G 또는 D이고, 14번 위치의 X는 E 또는 G이다.
SEQ ID NO:32
XTXPTSFEVNLSEXEKMEL
여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 3번 위치의 X는 G 또는 D이고, 14번 위치의 X는 G 또는 E이다.
SEQ ID NO:33
XMLXVQNHVDQHTNHIEHDDYHFTXPTSFEVNLSEXEKMELQEVSSIDS
여기서 1번 위치의 X는 부재하거나 c이고, 4번 위치의 X는 H 또는 Q이고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이다.
본 발명의 다른 구체예는 하기 폴리펩티드를 제공한다:
(a) SEQ ID NO:33 (여기서 1번 위치의 X는 부재하거나 C이고, 4번 위치의 X는 H 또는 Q이고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이다);
(b) SEQ ID NO:33의 아미노산 1-27 (여기서 1번 위치의 X는 C이고, 4번 위치의 X는 H이고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이다);
(c) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고; C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(d) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(e) SEQ ID NO:33의 아미노산 1-27 (여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이다);
(f) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(g) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(h) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-27 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(i) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(j) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(k) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
(l) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다).
SEQUENCE LISTING <110> Krah, Eugene R O'Connor, Thomas P. Beall, Melissa J Chandrashekar, Ramaswamy <120> Ehrlichia canis DIVA (Differentiate Infected from Vaccinated Animals) <130> 04-947-D-WO <140> PCT/US08/82038 <141> 2008-10-31 <150> 60/984019 <151> 2007-10-31 <160> 33 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2067 <212> DNA <213> Ehrlichia canis <400> 1 atggatattg ataacaataa tgtgactaca tcaagtacgc aagataaaag tgggaattta 60 atggaagtga ttatgcgtat attaaatttt ggtaataatt cagatgagaa agtaagcaat 120 gaagacacta aagttcttgt agagagttta caacctgctg tgaatgacaa tgtaggaaat 180 ccatcaagtg aagttggtaa agaagaaaat gctcctgaag ttaaagcgga agatttgcaa 240 cctgctgtag atggtagtgt agaacattca tcaagtgaag ttgggaaaaa agtatctgaa 300 actagtaaag aggaaagtac tcctgaagtt aaagcagaag atttgcaacc tgctgtagat 360 ggtagtatag aacattcatc aagtgaagtt ggagaaaaag tatctaaaac tagtaaagag 420 gaaagtactc ctgaagttaa agcagaagat ttgcaacctg ctgtagatga tagtgtggaa 480 cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta tctgaaacta gtaaagagga aaatactcct 540 gaagttaaag cagaagattt gcaacctgct gtagatggta gtatagaaca ttcatcaagt 600 gaagttggag aaaaagtatc taaaactagt aaagaggaaa gtactcctga agttaaagca 660 gaagatttgc aacctgctgt agatgatagt gtggaacatt catcaagtga agttggagaa 720 aaagtatctg aaactagtaa agaggaaaat actcctgaag ttaaagcaga agatttgcaa 780 cctgctgtag atggtagtgt ggaacattca tcaagtgaag ttggagaaaa agtatctaaa 840 actagtaaag aggaaagtac tcctgaagtt aaagcagaag atttgcaacc tgctgtagat 900 gatagtgtgg aacattcatc aagtgaagtt ggagaaaaag tatctgaaac tagtaaagag 960 gaaaatactc ctgaagttag agcagaagat ttgcaacctg ctgtagatgg tagtgtagaa 1020 cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta tctgaaacta gtaaagagga aagtactcct 1080 gaagttaaag cagaagattt gcaacctgct gtagatagta gtatagaaca ttcatcaagt 1140 gaagttggga aaaaagtatc tgaaactagt aaagaggaaa gtactcctga agttaaagca 1200 gaagatttgc aacctgctgt agatggtagt gtagaacatt catcaagtga agttggagaa 1260 aaagtatctg aaactagtaa agaggaaaat actcctgaag ttaaagcaga agatttgcaa 1320 cctgctgtag atggtagtgt agaacattca tcaagtgaag ttggagaaaa agtatctgaa 1380 actagtaaag aggaaaatac tcctgaagtt aaagcggaag atttgcaacc tgctgtagat 1440 ggtagtgtag aacattcatc aagtgaagtt ggagaaaaag tatctgaaac tagtaaagaa 1500 gaaagtactc ctgaagttaa agcagaagat ttgcaacctg ctgtagatga tagtgtagaa 1560 cattcatcaa gtgaagttgg agaaaaagta tctgaaacta gtaaagaaga aagtactcct 1620 gaagttaaag cggaagattt gcaacctgct gtagatggta gtgtggaaca ttcatcaagt 1680 gaagttggag aaaaagtatc tgagactagt aaagaggaaa gtactcctga agttaaagcg 1740 gaagtacagc ctgttgcaga tggtaatcct gttcctttaa atcctatgcc ttcaattgat 1800 aatattgata ctaatataat attccattac cataaagact gtaaaaaagg ttcagctgta 1860 ggaacagatg aaatgtgttg tcctgtatca gaattaatgg ctggggaaca tgttcatatg 1920 tatggaattt atgtctatag agttcaatca gtaaaggatt taagtggtgt atttaatata 1980 gatcattcta catgtgattg taatttagat gtttattttg taggatacaa ttcttttact 2040 aacaaagaaa cagttgattt aatataa 2067 <210> 2 <211> 688 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 2 Met Asp Ile Asp Asn Asn Asn Val Thr Thr Ser Ser Thr Gln Asp Lys 1 5 10 15 Ser Gly Asn Leu Met Glu Val Ile Met Arg Ile Leu Asn Phe Gly Asn 20 25 30 Asn Ser Asp Glu Lys Val Ser Asn Glu Asp Thr Lys Val Leu Val Glu 35 40 45 Ser Leu Gln Pro Ala Val Asn Asp Asn Val Gly Asn Pro Ser Ser Glu 50 55 60 Val Gly Lys Glu Glu Asn Ala Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln 65 70 75 80 Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Lys 85 90 95 Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala 100 105 110 Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Ile Glu His Ser Ser Ser 115 120 125 Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Lys Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro 130 135 140 Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Glu 145 150 155 160 His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu 165 170 175 Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp 180 185 190 Gly Ser Ile Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Lys 195 200 205 Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln 210 215 220 Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu 225 230 235 240 Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala 245 250 255 Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser 260 265 270 Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Lys Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro 275 280 285 Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Glu 290 295 300 His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu 305 310 315 320 Glu Asn Thr Pro Glu Val Arg Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp 325 330 335 Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu 340 345 350 Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln 355 360 365 Pro Ala Val Asp Ser Ser Ile Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Lys 370 375 380 Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala 385 390 395 400 Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser 405 410 415 Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro 420 425 430 Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu 435 440 445 His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu 450 455 460 Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp 465 470 475 480 Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu 485 490 495 Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln 500 505 510 Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu 515 520 525 Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala 530 535 540 Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser 545 550 555 560 Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro 565 570 575 Glu Val Lys Ala Glu Val Gln Pro Val Ala Asp Gly Asn Pro Val Pro 580 585 590 Leu Asn Pro Met Pro Ser Ile Asp Asn Ile Asp Thr Asn Ile Ile Phe 595 600 605 His Tyr His Lys Asp Cys Lys Lys Gly Ser Ala Val Gly Thr Asp Glu 610 615 620 Met Cys Cys Pro Val Ser Glu Leu Met Ala Gly Glu His Val His Met 625 630 635 640 Tyr Gly Ile Tyr Val Tyr Arg Val Gln Ser Val Lys Asp Leu Ser Gly 645 650 655 Val Phe Asn Ile Asp His Ser Thr Cys Asp Cys Asn Leu Asp Val Tyr 660 665 670 Phe Val Gly Tyr Asn Ser Phe Thr Asn Lys Glu Thr Val Asp Leu Ile 675 680 685 <210> 3 <211> 3186 <212> DNA <213> Ehrlichia canis <400> 3 aatttagatt ttggacttgt agatggagat ggtaaaaatc ctttacatca tgctgttgaa 60 catttgccac ctgttatact taagggcgta atggaccatg taaaaaatag tagtgagttt 120 caagatttag taaatgatcc tgattatttt ggaaatacta tagctcatta tgcagttaag 180 aataaaaatg ctgatttaac attgtttaac atgctgaaag cttcaggagc tgatttaaat 240 gttaggaatg tagttggtcg agctccaata catgttgctt cttctaatgg taaggctaat 300 gcagtttctg gacttgtatc atgtggtatt gacgttaatt ctcaagatgt gaatggagat 360 acaccacttc atattgctgt tgaaggcggt agtatggaga cggtattagc agtgttaaat 420 cagagaggtg ctgatgttag tgtccagaat aacgatggag ttacacctat gcttagtgct 480 gctaaatatg gagatatagg tgtaataaaa gctttaggtt cagctaaacc aaatattaaa 540 ggtgaagaca ctgttgctaa atcattgctg atggaggatt acaaaggttt tacacccttg 600 cattttgtag ctggtggtgg tagcagagat acattccgtg tcgtaagaaa aaattatgaa 660 aaatgtcatg acttagctac tattagggca gctttaatgc aagatagaag tggtggtgag 720 cttgtaaatt taggggattt tgaaagtgaa aatatattgg gttcgccaaa tgcaaaattc 780 ttgcagcata ttcaatcagc aaattttggt ttttctccag cgcattgtgc tatagtatcg 840 tctaatcaca atgtaatgaa agatatctta aattttgttg gggattcgtt acacctacca 900 agtgagcgtg ggtataatgc aatgcaggtt gctgctttgt ttggtgacaa agaagcagtg 960 aaaatgcttg ctaaaagtgc taagccaagt gatcttaatt ttaagacttc agcaactcct 1020 actccgttaa atcttgcatg tcttagaggt gataatgagg tagtacgtgg gttagtaggt 1080 caacatggta ttgacattaa ccaacgtatg ggaagtgata aaaacactgt attgcattat 1140 gcaatcagca aaggagatag ttttcttgtg caaaagatat tagctcatac tggagttgat 1200 gttaattgtg agaataacct aggtcaaacg cctttacatt tagcagttga gggaggagat 1260 cctaagatag tatcttctct tcttaaagct ggtgcagtag ttaatcgtct ggatgataat 1320 ggtagatctg tactttcttc tgcgatagtt ccaggtagaa aagaaaaggg agtgctgggt 1380 atagttaata aattgctgga tagaggtgca gatattaatt tagatggaga ccacaatata 1440 ctttttgatc agtgtctaag gggtggatat aataatgtat tagataagtt aatacaacaa 1500 ggggttgaag ttaatcgaaa tagtgaaata cgtccaatgg tttatgctgc aatatctggt 1560 aatgagcatg ctatcaaatc attagctaat gctggtggag atgttaatga agtagtaaat 1620 aatccatcta gtaggcattc aggaaatcct ttaattatgg ttgcagtagc agatggtaat 1680 gcaggtcttc ttaaaacatt agtttctgaa ggatgtgatg ttggtaaatc tggaaaagat 1740 ggtaatacag cgttacatta tgctgttagt cattcagata aagagtttgg taataaagct 1800 ataaagatat taatttcacg taatagtgtt gggactaata gagatattct tactcaaaag 1860 aataacgcag gtgatacacc tttacatgaa gctcttaagt caggtaatat taattctgta 1920 cagaatatct taagtgctgt acatccaaga tacgcaaagg agatattaac agccagagac 1980 aaagaagggt acacaccaat gcattatact gttggagtaa ataatgttga tgttggtaga 2040 agtattctag agtctatgct ctctaaaggt gtgaataatc ttggagagat tgttggagca 2100 caggatagta attttcgaac acctctgcat gctgctatta aaatatctga ttatcgtgct 2160 gcggacatga taataggtag cttatcgaaa acagaattgt caaagttatc gcaattaaca 2220 gatattaacg gggatacacc actacatctt tcttgtcagt ctggtaatgt cgagatgaca 2280 caattctttc ttggaggttt ggataaacgt gaattaccta agacattaaa gatagcaaat 2340 aaaaatggag atactccttt acatgatgct ataagaaatg atgatattaa atctgcaaaa 2400 atgatgatta ggaattgtaa caaagaagaa cttgctaatg tattaaaatg taaagatagt 2460 tttggtaata cagtattgca tactattgct gaccaagtta ttgcgaatcc agaatcaaag 2520 aaagaccttg atggtttgat gaatttagca gtgaaaaggc taaagaatca agatctgaaa 2580 gatctagtta atacgcgaaa taactctgac gatactgttg cacattgtgc tcttttatcg 2640 gatatgaaat atgctcaaaa gatacttaaa tcatgtaacc atgatacatt agtgagagga 2700 aatagtaata atcaatcttt atcagagtgt attcgtgatg atagtaaata taaaaaaggt 2760 ggaattttta gtaagtcttt attttcaaaa ttaaagaaac ttgaggcacg agctgccagc 2820 gctagttatg aagaattatc tagtatcagt agtggtagtg atgtttcttc tgtatcaaca 2880 aatagcacag aagtaagtgc agtacctgaa gtggcaagaa gtagtggtgc tgtgtcgttc 2940 aaacatgtgc aagaaacagg agttgacacg tctggtcctt ctgatataga aagtttagag 3000 agattatctg atactagtct tgggtcaaat gattttgatc agcgaatggc agatttagat 3060 caagaaatag caaatattgt tagtggttta ccagaagtta cccaggtagc tgtaagtcaa 3120 caacaagcag catctcctag ttcaggtcaa gctgctggtg tgcaacaaaa agagatgcag 3180 agataa 3186 <210> 4 <211> 1061 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 4 Asn Leu Asp Phe Gly Leu Val Asp Gly Asp Gly Lys Asn Pro Leu His 1 5 10 15 His Ala Val Glu His Leu Pro Pro Val Ile Leu Lys Gly Val Met Asp 20 25 30 His Val Lys Asn Ser Ser Glu Phe Gln Asp Leu Val Asn Asp Pro Asp 35 40 45 Tyr Phe Gly Asn Thr Ile Ala His Tyr Ala Val Lys Asn Lys Asn Ala 50 55 60 Asp Leu Thr Leu Phe Asn Met Leu Lys Ala Ser Gly Ala Asp Leu Asn 65 70 75 80 Val Arg Asn Val Val Gly Arg Ala Pro Ile His Val Ala Ser Ser Asn 85 90 95 Gly Lys Ala Asn Ala Val Ser Gly Leu Val Ser Cys Gly Ile Asp Val 100 105 110 Asn Ser Gln Asp Val Asn Gly Asp Thr Pro Leu His Ile Ala Val Glu 115 120 125 Gly Gly Ser Met Glu Thr Val Leu Ala Val Leu Asn Gln Arg Gly Ala 130 135 140 Asp Val Ser Val Gln Asn Asn Asp Gly Val Thr Pro Met Leu Ser Ala 145 150 155 160 Ala Lys Tyr Gly Asp Ile Gly Val Ile Lys Ala Leu Gly Ser Ala Lys 165 170 175 Pro Asn Ile Lys Gly Glu Asp Thr Val Ala Lys Ser Leu Leu Met Glu 180 185 190 Asp Tyr Lys Gly Phe Thr Pro Leu His Phe Val Ala Gly Gly Gly Ser 195 200 205 Arg Asp Thr Phe Arg Val Val Arg Lys Asn Tyr Glu Lys Cys His Asp 210 215 220 Leu Ala Thr Ile Arg Ala Ala Leu Met Gln Asp Arg Ser Gly Gly Glu 225 230 235 240 Leu Val Asn Leu Gly Asp Phe Glu Ser Glu Asn Ile Leu Gly Ser Pro 245 250 255 Asn Ala Lys Phe Leu Gln His Ile Gln Ser Ala Asn Phe Gly Phe Ser 260 265 270 Pro Ala His Cys Ala Ile Val Ser Ser Asn His Asn Val Met Lys Asp 275 280 285 Ile Leu Asn Phe Val Gly Asp Ser Leu His Leu Pro Ser Glu Arg Gly 290 295 300 Tyr Asn Ala Met Gln Val Ala Ala Leu Phe Gly Asp Lys Glu Ala Val 305 310 315 320 Lys Met Leu Ala Lys Ser Ala Lys Pro Ser Asp Leu Asn Phe Lys Thr 325 330 335 Ser Ala Thr Pro Thr Pro Leu Asn Leu Ala Cys Leu Arg Gly Asp Asn 340 345 350 Glu Val Val Arg Gly Leu Val Gly Gln His Gly Ile Asp Ile Asn Gln 355 360 365 Arg Met Gly Ser Asp Lys Asn Thr Val Leu His Tyr Ala Ile Ser Lys 370 375 380 Gly Asp Ser Phe Leu Val Gln Lys Ile Leu Ala His Thr Gly Val Asp 385 390 395 400 Val Asn Cys Glu Asn Asn Leu Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Val 405 410 415 Glu Gly Gly Asp Pro Lys Ile Val Ser Ser Leu Leu Lys Ala Gly 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agtgttgggt tagtggactt cagtaaatat 2580 aaagaaggat ctatgtttaa attacagcat tattctgatg attatcatat tcataaggat 2640 gaacaaggta atgttattag gcctaataac agatcttacg ttacaaaagt ggatttagta 2700 tatgatgata aagttattgg gatgttgtct gatagtataa atcaatttca gggtgatatt 2760 ttcatttctg caagccttaa ttatagccac aatgattttc tttcatctaa gtactttcag 2820 aaagttaata ttgaggcgtt agaaaatgga atatatagtg gaagatatga tgtaggagat 2880 ggtgaccaaa tagcaggtct taatactgat acaggttata gtgataaagc tattttttac 2940 tttaaaaatg atagcgcatc tactgatatg ccggctagtg atgttactac tattttacct 3000 tatataaatg agctttaa 3018 <210> 12 <211> 1005 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 12 Met Thr Ile Phe Leu Glu Ser Asp Asp Asp Lys Ser Asn Phe Lys Lys 1 5 10 15 Thr Leu Glu Asn Gly Thr Lys Asp Lys Thr Asn Leu Asp Asn Thr Tyr 20 25 30 Tyr Asp Tyr His His Glu Asp Asp Met Gly Asn Thr Glu Tyr His Tyr 35 40 45 Val Ser Leu Asp Arg Val Asp His Val Lys Met Pro Glu Glu Pro Val 50 55 60 Gly Tyr Gly Gly Asp Thr Leu Pro Ile Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser 65 70 75 80 Val Ser 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Ala Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Lys Lys Val 20 25 30 Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp 35 40 45 Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Ile Glu His Ser Ser Ser Glu Val 50 55 60 Gly Glu Lys Val Ser Lys Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val 65 70 75 80 Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser 85 90 95 Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn 100 105 110 Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser 115 120 125 Ile Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Lys Thr Ser 130 135 140 Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala 145 150 155 160 Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val 165 170 175 Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp 180 185 190 Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val 195 200 205 Gly Glu Lys Val Ser Lys Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val 210 215 220 Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser 225 230 235 240 Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn 245 250 255 Thr Pro Glu Val Arg Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser 260 265 270 Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser 275 280 285 Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala 290 295 300 Val Asp Ser Ser Ile Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Lys Lys Val 305 310 315 320 Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp 325 330 335 Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val 340 345 350 Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val 355 360 365 Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser 370 375 380 Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Asn 385 390 395 400 Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser 405 410 415 Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser 420 425 430 Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala 435 440 445 Val Asp Asp Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val 450 455 460 Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp 465 470 475 480 Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val 485 490 495 Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val 500 505 510 Lys Ala Glu 515 <210> 17 <211> 36 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X stands for any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X stands for any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> X stands for any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X stands for any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> X stands for any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> X stands for any amino acid <400> 17 Lys Glu Glu Xaa Thr Pro Glu Val Xaa Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala 1 5 10 15 Val Asp Xaa Ser Xaa Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Xaa Lys Val 20 25 30 Ser Xaa Thr Ser 35 <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 18 Cys Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser 1 5 10 15 Val Glu His <210> 19 <211> 27 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 19 Cys Glu Val Gly Lys Glu Glu Asn Ala Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp 1 5 10 15 Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His 20 25 <210> 20 <211> 37 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 20 Cys Lys Glu Glu Ser Thr Pro Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro 1 5 10 15 Ala Val Asp Gly Ser Val Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys 20 25 30 Val Ser Glu Thr Ser 35 <210> 21 <211> 48 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> X stands for any amino acid or no amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(48) <223> X stands for any amino acid or no amino acid <400> 21 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro 1 5 10 15 Glu Val Lys Ala Glu Asp Leu Gln Pro Ala Val Asp Gly Ser Val Glu 20 25 30 His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 22 Cys Thr Asn His Ile Glu His Asp Asp Tyr His Phe Thr Gly Pro Thr 1 5 10 15 Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu Lys Met Glu Leu 20 25 30 <210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 23 Cys Thr Asn His Ile Glu His Asp Asp Tyr His Phe Thr Gly Pro Thr 1 5 10 15 Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu Lys Met Glu Leu 20 25 30 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <400> 24 Cys Thr Gly Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu Lys 1 5 10 15 Met Glu Leu Gln Glu Val Ser Ser Ile Asp Ser 20 25 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X stands for H or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> X stands for D or G <400> 25 Xaa Met Leu Xaa Val Gln Asn His Val Asp Gln His Thr Asn His Ile 1 5 10 15 Glu His Asp Asp Tyr His Phe Thr Xaa Pro Thr 20 25 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X stands for G or D <400> 26 Xaa Thr Asn His Ile Glu His Asp Asp Tyr His Phe Thr Xaa Pro Thr 1 5 10 15 Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu Lys Met Glu Leu 20 25 30 <210> 27 <211> 27 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X stands for G or D <400> 27 Xaa Thr Xaa Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu Lys 1 5 10 15 Met Glu Leu Gln Glu Val Ser Ser Ile Asp Ser 20 25 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X stands for G or D <400> 28 Xaa Thr Asn His Ile Glu His Asp Asp Tyr His Phe Thr Xaa Pro Thr 1 5 10 15 <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(1) <223> X stands for G or D <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 29 Xaa Thr Xaa Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu Lys 1 5 10 15 Met Glu Leu <210> 30 <211> 29 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X stands for G or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> X stands for E or G <400> 30 Xaa Thr Asn His Ile Glu His Asp Asp Tyr His Phe Thr Xaa Pro Thr 1 5 10 15 Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Xaa Glu Lys Met Glu 20 25 <210> 31 <211> 27 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X stands for G or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X stands for E or G <400> 31 Xaa Thr Xaa Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Xaa Glu Lys 1 5 10 15 Met Glu Leu Gln Glu Val Ser Ser Ile Asp Ser 20 25 <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X stands for G or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X stands for G or E <400> 32 Xaa Thr Xaa Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Xaa Glu Lys 1 5 10 15 Met Glu Leu <210> 33 <211> 49 <212> PRT <213> Ehrlichia canis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for C or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X stands for H or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> X stands for D or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> X stands for E or G <400> 33 Xaa Met Leu Xaa Val Gln Asn His Val Asp Gln His Thr Asn His Ile 1 5 10 15 Glu His Asp Asp Tyr His Phe Thr Xaa Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn 20 25 30 Leu Ser Glu Xaa Glu Lys Met Glu Leu Gln Glu Val Ser Ser Ile Asp 35 40 45 Ser

Claims (20)

  1. 에를리히아 카니스(Ehrlichia canis)에 대해 백신접종 되었는지와 무관하게 에를리히아 카니스에 감염된 동물 (a) 및 에를리히아 카니스에 감염되지 않은 동물 (b)을 구별하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하지 않는 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계로서, 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:22-33에 95% 이상의 동일성을 지니는 단계; 및
    (b) 생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 검출하는 단계를 포함하며;
    여기서 샘플학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것인 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드가 약 15개 내지 약 75개의 아미노산 길이인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드가 이종 아미노산 서열, 지시약(indicator reagent), 아미노산 스페이서(spacer), 아미노산 링커(linker), 신호 서열, 이동 정지 서열(stop transfer sequence), 트랜스멤브레인(transmembrane) 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플 중의 항체가 에를리히아 카니스 백신 항원인 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이고 에를리히아 카니스에 대한 백신접종 상태는 알 수 없으며;
    샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 적이 없고 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 것이며;
    샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되지 않았고 에를리히아 카니스에 감염된 적이 없는 것인 방법.
  5. 에를리히아 카니스에 대한 동물의 백신접종 또는 감염 상태를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 동물로부터의 생물학적 샘플을 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하지 않는 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드 (여기서 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지닌다) 및 에를리히아 카니스 백신에 대한 동물의 면역 반응의 구성요소인 항체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드 및 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 지를 검출하는 단계를 포함하고;
    여기서 생물학적 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 것이고 에를리히아 카니스에 대한 백신접종 상태는 알 수 없으며; 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 에를리히아 카니스 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 감염된 적이 없고 에를리히아 카니스에 대해 백신접종된 것이고; 샘플 중의 항체가 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않고 하나 이상의 제2 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는 경우, 그 동물은 에를리히아 카니스에 대해 백신접종되지 않았고 에를리히아 카니스에 감염된 적이 없는 것인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드가 약 15개 내지 약 75개의 아미노산의 길이인 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드가 이종 아미노산 서열, 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합되는 방법.
  8. 시험 샘플 중 에를리히아 카니스에 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재를 측정하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 시험 샘플을 SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지니는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계로서, 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 약 15개 내지 약 75개의 아미노산의 길이이고, 하나 이상의 제1 정제된 폴리펩티드가 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 하나 이상의 정제된 폴리펩티드의 특이적 결합에 적합한 조건하에 에를리히아 카니스에 특이적인 항체에 특이적으로 결합하는 단계; 및
    (b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 하나 이상의 정제된 폴리펩티드의 특이적 결합의 존재를 검출하는 단계를 포함하고;
    여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 하나 이상의 정제된 폴리펩티드의 특이적 결합의 존재가 시험 샘플 중 에를리히아 카니스에 특이적인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 존재를 나타내는 방법.
  9. 제 9항에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 이종 아미노산 서열, 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합되는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 방법이 특이적 결합의 양을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 고체 지지체에 고정되는 방법.
  12. (a) SEQ ID NO:22-33으로 구성된 하나 이상의 정제된 폴리펩티드; 또는
    (b) SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지니는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드로서, 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 약 15개 내지 약 75개의 아미노산 길이인 폴리펩티드;
    (c) SEQ ID NO:33 (여기서 1번 위치의 X는 부재하거나 C이고, 4번 위치의 X는 H 또는 Q이고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이다);
    (d) SEQ ID NO:33의 아미노산 1-27 (여기서 1번 위치의 X는 C이고, 4번 위치의 X는 H이고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이다);
    (e) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고; C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
    (f) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
    (g) SEQ ID NO:33의 아미노산 1-27 (여기서 1번 위치의 X는 C이거나 부재하고, 25번 위치의 X는 D 또는 G이다);
    (h) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
    (i) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
    (j) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-27 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
    (k) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
    (l) SEQ ID NO:33의 아미노산 13-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
    (m) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-49 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다);
    (n) SEQ ID NO:33의 아미노산 24-41 (여기서 25번 위치의 X는 D 또는 G이고, 36번 위치의 X는 E 또는 G이고, C는 아미노 말단에 존재하거나 존재하지 않는다); 또는
    (o) 상기 (a)-(n)의 조합을 포함하는 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 다합체 형태인 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 이종 단백질, 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합되는 조성물.
  15. SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 동일성을 지니는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드 또는 이의 조합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하여 동물에서 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 여기서 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 동물에서 면역 반응을 일으키는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 약 15개 내지 약 75개의 아미노산의 길이인 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 다합체 형태인 방법.
  18. 제 15항에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 폴리펩티드가 이종 단백질, 지시약, 아미노산 스페이서, 아미노산 링커, 신호 서열, 이동 정지 서열, 트랜스멤브레인 도메인, 단백질 정제 리간드, 또는 이들의 조합물에 결합되는 방법.
  19. (a) SEQ ID NO:22-33과 95% 이상의 서열 동일성을 지니는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드 또는 이의 조합물; 또는
    (b) SEQ ID NO:22-33을 포함하는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 이의 조합물; 또는
    (c) SEQ ID NO:22-33을 포함하는 하나 이상의 정제된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 이의 조합물을 동물에게 투여하여 에를리히아 카니스 감염을 예방, 개선 또는 치료하는 것을 포함하여, 동물에서 에를리히아 카니스 감염을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  20. (a) 에를리히아 카니스 감염에 대한 치료 이전에 또는 치료의 초기 단계에 제 10항의 방법에 의해 환자로부터의 제1 샘플 중 항-에를리히아 카니스 항체의 수준을 측정하는 단계; (b) 치료가 수행된 후 제 10항의 방법에 의해 환자로부터의 제2 샘플 중 항-에를리히아 카니스 항체의 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 제1 샘플 중 항-에를리히아 카니스 항체의 양을 제2 샘플 중 항-에를리히아 카니스 항체의 양과 비교하여 변화를 평가함으로써 치료를 모니터링하는 단계를 포함하여, 환자에서 에를리히아 카니스 감염의 치료를 모니터링하는 방법.
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