JP2011504582A - エーリキア・カニス(Ehrlichiacanis)のDIVA(ワクチン接種した動物から感染した動物を区別する) - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2007年10月31日に出願され、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願第60/984,019号の恩典を請求する。
エーリキア(Ehrlichia)は、哺乳動物宿主において循環中の白血球に感染する偏性細胞内病原体である。エーリキア・カニス(Ehrlichia canis)は、イヌおよびヒトに感染し得、それぞれ、イヌ単球エーリキア症(CME)およびヒト単球エーリキア症(HME)を生じ得る。このイヌの疾患は、発熱、リンパ節腫脹、体重減少および汎血球減少によって特徴付けられる。ヒトではこの疾患は、発熱、頭痛、筋肉痛および白血球減少によって特徴付けられる。初期の検出および治療はイヌおよびヒトの両方のエーリキア症を治療するために重要である。
一実施形態では、本発明は、(a)エーリキア・カニスに感染した動物と;(b)エーリキア・カニス(E.canis)に感染していない動物とを、この動物がE.canisに関してワクチン接種されているか否かにかかわらず識別する方法を提供する。この方法は、
(a)動物由来の生物学的サンプルと、E.canisワクチンに対するこの動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合しない1つ以上の第一の精製されたポリペプチドとを接触させる工程であって;ここでこの1つ以上の第一の精製されたポリペプチドが配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有しており、かつここでこの1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドがE.canisに特異的である抗体に特異的に結合する;および
(b)この生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程、を包含する。
生物学的サンプル中の抗体が、1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物はE.canisに感染している。この1つ以上の第一の精製されたポリペプチドは約15〜約75アミノ酸長であってもよい。この1つ以上の第一の精製されたポリペプチドは、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合され得る。この方法はさらに、E.canisワクチンの要素である1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに対して、上記生物学的サンプル中の抗体が特異的に結合するか否かを決定する工程をさらに包含し得る。もし、この生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合し、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物はE.canisに感染しており、かつE.canisに関するワクチン接種状態が不明である。もし、このサンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、E.canisに感染しておらず、かつE.canisについてワクチン接種されている。もし、このサンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合しないならば、この動物はE.canisについてワクチン接種されておらず、かつE.canisに感染していない。
(a)動物由来の生物学的サンプルと、E.canisワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合しない1つ以上の第一の精製されたポリペプチドであって、配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有しており、E.canisに特異的である抗体に特異的に結合する、1つ以上の第一の精製されたポリペプチド、ならびにE.canisワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合する1つ以上の第二の精製されたポリペプチドとを接触させる工程と;
(b)この生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに対して、および1つ以上の第二の精製されたポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程と;を包含する。
この生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合し、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、E.canisに感染しており、かつE.canisについてワクチン接種状態が不明である。もしこのサンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、E.canisに感染しておらず、かつE.canisについてワクチン接種されている。もしこのサンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合しないならば、この動物はE.canisについてワクチン接種されておらず、かつE.canisに感染していない。上記1つ以上の第一の精製されたポリペプチドは約15〜約75アミノ酸長であってもよい。この1つ以上の第一の精製されたポリペプチドは、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合されてもよい。
(a)1つ以上の精製されたポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するのに適した条件下で、試験サンプルを、配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有する1つ以上の精製されたポリペプチドと接触させる工程であって、ここで、1つ以上の精製されたポリペプチドは約15〜約75アミノ酸長であり、1つ以上の第一の精製されたポリペプチドは、E.canisに特異的である抗体に特異的に結合する;および
(b)該1つ以上の精製されたポリペプチドの、該抗体またはその抗原結合フラグメントへの特異的な結合の存在を検出する工程;
を包含する。
この1つ以上の精製されたポリペプチドの該抗体または抗原結合フラグメントへの特異的な結合の存在は、この試験サンプル中のE.canisに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を示す。上記1つ以上の精製されたポリペプチドは、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合され得る。この方法はさらに、特異的な結合の量を検出する工程を包含し得る。この1つ以上の精製ポリペプチドは固相支持体に固定されてもよい。
(a)配列番号22〜33からなる1つ以上の精製されたポリペプチド;あるいは
(b)配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有しており、約15〜約75アミノ酸長であり、E.canisに特異的である抗体に特異的に結合する、1つ以上の精製されたポリペプチド;
(c)1位のXが存在しないかまたはCであり、4位のXがHまたはQであり、25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGである、配列番号33;
(d)1位のXがCであり、4位のXがHであり、25位のXがDまたはGである、配列番号33のアミノ酸1〜27;
(e)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり;かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(f)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(g)1位のXがCであるかまたは存在せず、かつここで25位のXがDまたはGである、配列番号33のアミノ酸1〜27;
(h)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(i)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(j)25位のXがDまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜27;
(k)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している配列番号33のアミノ酸24〜41;
(l)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(m)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(n)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜41;あるいは
(o)(a)〜(n)の組み合わせ、
を含んでいる、組成物を提供する。
上記1つ以上の精製されたポリペプチドは多量体型であってもよい。この1つ以上の精製されたポリペプチドは、異種のタンパク質、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合されてもよい。
(a)配列番号22〜33に対して少なくとも95%の配列同一性を有している1つ以上の精製されたポリペプチド、またはそれらの組み合わせ;あるいは
(b)配列番号22〜33を含んでいる1つ以上の精製されたポリペプチドをコードする1つ以上の核酸、またはそれらの組み合わせ;あるいは
(c)配列番号22〜33を含んでいる1つ以上の精製されたポリペプチドに特異的に結合する1つ以上の抗体、またはそれらの組み合わせ;
を投与する工程を包含し、これによってE.canis感染が予防、回復または治療される。
エーリキア・カニス抗原であって、これを用いて、E.canisに対してワクチン接種されている動物からE.canisに自然感染した動物を識別することができる抗原が開示されている。「ワクチン接種された」とは、病原体に対する免疫を確立または恒常させることによってこの病原体による感染の影響を予防または回復し得るワクチン組成物の投与を意味する。ワクチン組成物は死んだ、不活性化されたもしくは減弱された病原体、またはその病原体の精製された産物もしくは部分を含んでもよい。ワクチン接種は100%有効性である必要はない。
E.canisに対してワクチン接種されている動物由来の生物学的サンプルは、ワクチンに対する応答において産生された抗体の存在に起因して、E.canisの感染についての試験で陽性の結果を生じる能力を有する。一態様では、本発明は、E.canisについて動物がワクチン接種されているか否かにかかわらず、E.canisに感染している動物とE.canisに感染していない動物とを識別する方法を提供する。この方法は、動物由来の生物学的サンプルと、特定のE.canisワクチンに対するこの動物の抗体応答の成分である抗体に特異的に結合しないが、E.canisの感染に対する応答で生成される抗体に特異的に結合する、E.canis由来の抗原とを接触させる工程を包含する。
(a)動物由来の生物学的サンプルと、E.canisワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に実質的に特異的に結合しない第一の精製されたポリペプチドであって、配列番号22〜33またはその組み合わせを含んでいるポリペプチド、ならびにE.canisワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合する第二のポリペプチドとを接触させる工程と;
(b)このサンプル中の抗体が第一および第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合するか否かを検出する工程と;を包含し、
ここでこの生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合し、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、E.canisに感染しており、かつE.canisについてワクチン接種状態が不明であり;ここでこのサンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、この動物は、E.canisに感染しておらず、かつE.canisについてワクチン接種されており;もしこのサンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合しないならば、この動物はE.canisについてワクチン接種されておらず、かつE.canisに感染していない。
本発明のポリヌクレオチドは、完全な微生物のゲノムより少なく、一本鎖または二本鎖の核酸であってもよい。ポリヌクレオチドは、RNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、化学的に合成したRNAもしくはDNA、またはそれらの組み合わせであってもよい。ポリヌクレオチドは、タンパク質、脂質、他のポリヌクレオチドなどの他の成分を含まないほどに精製することができる。例えば、ポリヌクレオチドは50%、75%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%精製することができる。例えば、cDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリー内の数百から数百万の他の核酸分子、またはゲノムDNAの制限酵素消化物を含んでいるゲルスライスの中に存在する核酸分子は、単離されたポリヌクレオチドとみなすべきではない。本発明のポリヌクレオチドは、上記の本発明のポリペプチドをコードする。本発明の一実施形態では、このポリヌクレオチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33に示されるポリペプチド、そのフラグメントまたはそれらの組み合わせをコードする。本発明のポリヌクレオチドは、約200、120、100、90、75、60、57、54、45未満(または200〜45の間の任意の範囲)連続の、天然に存在するエーリキア・カニスのポリヌクレオチドからなってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、約45、54、57、60、75、90、100、120、150、200より大きい、(または45〜200の間の任意の範囲)、またはさらに多い連続の、天然に存在するエーリキア・カニスのポリヌクレオチドから構成され得る。この精製されたポリヌクレオチドは、追加の異種ヌクレオチド(すなわち、エーリキア・カニス由来ではないヌクレオチド)、さらに追加のエーリキア・カニスのアミノ酸を、それらが本発明のエーリキア・カニスのp16ポリヌクレオチドまたは本発明の他のポリヌクレオチドと天然には連続して存在しない限り含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドは、他のヌクレオチド配列、例えば、リンカー、シグナル配列、TMR輸送停止配列、膜貫通ドメイン、またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインAなどのタンパク質精製に有用なリガンドをコードする配列を含んでもよい。
本発明の抗体は、本発明のE.canisポリペプチドに特異的に結合する抗体分子、本発明の変異体ポリペプチド、またはそのフラグメントである。本発明の抗体は、エーリキア・カニスポリペプチドに特異的、例えば、配列番号10、22〜33の1つ以上に特異的な抗体であり得る。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体(scFV)、または抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の抗原結合フラグメントは、インタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含んでいる、インタクトな抗体の抗原結合部分であって、この部分はインタクトな抗体のFc領域の定常重鎖ドメインを含まない。抗原結合フラグメントの例としては、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、およびFvフラグメントが挙げられる。
本発明の方法は、生物学的サンプル、環境的サンプル、または実験室サンプルなどの試験サンプル中のエーリキア・カニスの抗原またはエーリキア・カニスのポリヌクレオチドに特異的な抗体または抗原結合する抗体フラグメントを検出するために用いられ得る。試験サンプルは可能性として、Ehrlichia sp.のポリヌクレオチド、エーリキア・カニスのポリヌクレオチド、Ehrlichia sp.のポリペプチド、エーリキア・カニスのポリペプチド、Ehrlichia sp.に特異的な抗体および/またはエーリキア・カニスに特異的な抗体、無関係のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、それらの組み合わせを含んでもよいし、上記を何も含まなくてもよい。生物学的サンプルは、例えばウマ、ネコ、イヌ、またはヒトなどの哺乳類由来の血清、血液、細胞、血漿、唾液、尿、糞便または組織を含んでもよい。試験サンプルは未処理であっても、沈殿させても、分画しても、分離しても、希釈しても、濃縮しても、または精製してもよい。
本発明の一実施形態では、本発明のDIVAポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体は、E.canisにより引き起こされる疾患の治療、回復、または予防のために用いられ得る。しかし、DIVAポリペプチドがE.canisにより引き起こされる疾患の治療、回復、または予防のために用いられるならば、その後には、これを感染動物、非ワクチン接種動物およびワクチン接種した動物の検出および識別のためのDIVAポリペプチドとして用いることはできない。なぜなら、ワクチン接種された動物の免疫系は、ワクチン接種のために用いられたDIVA抗原を認識し得るからである。しかし、E.canisにより引き起こされる疾患の治療、回復、または予防のために用いられるDIVAポリペプチドに対する抗体と交差反応しないDIVAポリペプチドは、E.canisのDIVA抗原としてやはり用いられ得る。
E.canisは、文献中に記載される方法を用いてイヌ細胞培養中で増殖した。例えば、Breitschwerdt,Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1998,Vol 42:362〜368を参照のこと。光学顕微鏡を用いて、030細胞はE.canisによる感染が80%より大きいと見積もられた。E.canis感染した細胞培養物を2リットル収集して、遠心分離して、そのペレットを保持して、7.31グラムの物質(湿重量)を得た。1.462グラム(その物質の重量の20%)という推定の乾燥重量によって、水が物質の重量の80%までを構成していると推定される。その細胞ペレットを、73mlの総容積についてPBS中で20mg/ml(乾燥重量)に再懸濁した。
水酸化アルミニウムアジュバントを用いる抗原の調製は、当業者に周知の技術である。例えば、「Antibodies,A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbor Press,1988,pp 99を参照のこと。
DNA単離およびウエスタンブロット分析のために、E.canisを、PERCOLL(登録商標)密度勾配を用いて細胞培養物から濃縮した。Ehrlichiaなどの細胞培養物から細胞内病原体を単離するプロセスは、当業者に周知の技術である。例えば、Akira et al.(1982)Purification of Rickettsia tsutsugamushi by PERCOLL(登録商標)density gradient centrifugation,Microbiol.Immunol.,26:321〜328を参照のこと。
1次元のSDS−PAGEゲル分析および2次元のゲル分析(1次元の等電点電気泳動、2次元のSDS−PAGE)の使用は、当業者に周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology,eds.F.M.Ausubel et al.,John Wiley & Sons Inc.,1997,10.2.2−10.3.11頁を参照のこと。これらの方法を用いて分離したタンパク質を分析するためのウエスタンブロットの使用は、当業者に周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology,eds.F.M.Ausubel et al.,John Wiley & Sons Inc.,1997,10.8.1−10.8.116頁を参照のこと。
λ発現ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知の技術である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology,eds.F.M.Ausubel et al.,John Wiley & Sons Inc.,1997,第5.1頁〜5.8.6頁を参照のこと。発現ライブラリーの構築のために、ゲノムDNAを、PERCOLL(登録商標)勾配遠心分離(上記を参照のこと)によって細胞培地から単離されたE.canisから精製した。DNAは、Qiagen Sciences(Germantown,MD)から市販されているゲノムDNA精製キットを用いて精製した。λZAP(登録商標)IIプレ消化EcoRI/CIAPベクターキット(Stratagene Corp.,La Jolla,CA 92037)をライブラリーの構築について製造業者によって特定されたとおり用いた。E.canisのゲノムDNAをTSP509で部分的に消化して、2〜6kbにおよぶフラグメントを、アガロースゲル電気泳動を用いて単離し、λベクター中に連結した。ファージは、製造業者によって特定されたとおりパッケージして増殖させた。
23個の全てのクローンを個々のSDS−PAGEゲルで分析した。各々のゲルをニトロセルロースに移して、ELISA/SNAP(登録商標)試験によってE.canis感染についてのみ陽性であったイヌ由来のイヌ血清の個々のサンプルを用いてウエスタンブロットに供した。イヌ血清は、E.coliの溶解液を含有している実施例4に記載の同じ希釈液で1:500に希釈して、標準的な比色定量ホースラディッシュペルオキシダーゼ技術(Opti−4CN,Bio−Rad)を用いて反応性を検出した。全部で13個の個々のイヌ血清サンプルを評価した。ブロットはサンプルにまたがって比較して、優勢なバンドまたは1クローンあたりのバンドのセットに対する反応性を示しているイヌの番号を決定した。その結果を表3および図6にまとめる(太字で挙げたクローンを図に示す)。
a.120kDaの抗原
この抗原は以前に、Yuらによって記載されており(J Clin Microbiol.2000 Jan;38(1):369〜74;また、McBrideら、2000 Infec.Immun.68:13)、イヌでのE.canis感染の診断に有用であることが示されている。この抗原は、「p120」および「p140」の両方のE.canis抗原として記載されている。同書を参照のこと。Yuらは、p120遺伝子によって発現される組み換えタンパク質がドデシル硫酸ナトリウムゲルで、予想されるタンパク質の分子量よりも大きい140kDaの分子サイズを有することを説明している。Yuらの第373頁を参照のこと。Walkerのグループ(Yuら、およびMcBrideら)は、タンパク質をE.canis p120およびp140の両方と言っている。従って、この開示は、p120およびp140の両方を交換可能に用いてこのタンパク質を記載する。E.canisのp120/140遺伝子についてのアクセッション番号は、AF112369であり、かつ関連のタンパク質はAAD34330である。また、アクセッション番号YP302666も参照のこと。クローン2、10、17および33は120kDaの抗原遺伝子の全長セグメントを含む。クローン35は、この遺伝子の短縮(trancation)を含む場合がある(配列番号1および2を参照のこと)。
KEEX1TPEVX2AEDLQPAVDX3SX4EHSSSEVGX5KVSX6TS(配列番号17)。
ここでX1=SまたはN
X2=KまたはR
X3=G、D、またはS
X4=VまたはI
X5=EまたはK
X6=EまたはKである。
本発明の別の実施形態は、配列番号17が2回以上繰り返される多量体ポリペプチドを提供する。この多量体ポリペプチドはまた、1つ以上の異種ポリペプチドを含んでもよい。
この抗原は以前にMcBrideら(J Clin Microbiol.2001 Jan;39(1):315〜22)によって記載されており、エーリキア症の診断に有用であることが示された。この遺伝子のアクセッション番号はAF252298であり、関連のタンパク質はAAK01145である。このタンパク質配列の一部は、公開された特許と関連している(米国特許第6,355,777号の配列番号2、アクセッション番号AAE96254)。本発明者らは、エーリキア症の診断抗原およびDIVA試薬として機能するこのタンパク質の異なる領域を同定した。この遺伝子のこの部分は、AF252298のヌクレオチド1081から終わりのヌクレオチド4266にまたがる(配列番号3および4を参照のこと)。
この遺伝子(Locusタグ「Ecan02000699」)は、E.canisのショットガンゲノム配列の自動化コンピューター分析によって予測された。これは、4000個を超えるアミノ酸のタンパク質をコードする(ZP_00210575)。このE.canisのDIVAスクリーニングによって、この遺伝子の2つの別の領域およびその関連するタンパク質を、潜在的な免疫優性抗原およびDIVA試薬として同定した。クローン84および7において同定されるタンパク質のセグメントは、アクセッション番号46308382のそれぞれアミノ酸1984〜2774および2980〜3740である(配列番号5、6、7、8を参照のこと)。
このクローンは熱ショックタンパク質の遺伝子GrpEを含むが、免疫優性抗原をコードする遺伝子配列は、このゲノムの自動的なコンピューター分析によって予測される仮定的なタンパク質配列から生じる。タンパク質の分子量およびpIに基づいて、クローン9中の目的の遺伝子は、遺伝子座番号「Ecan02000495」であって、その関連するタンパク質は46308954である。
この遺伝子は、E.canisのゲノムから遺伝子座タグ「Ecan02000476」によって同定される。この関連のタンパク質は、アクセッション番号ZP_00211130を有する(配列番号11および12を参照のこと)。このタンパク質の同定は、このゲノムの自動化コンピューター分析に基づいて推測される。このタンパク質のBLAST分析は、この配列が、E.chaffeensisの表面タンパク質(アクセッション番号4894576)と約70%同一であることを明らかにする。E.chaffeensisタンパク質の免疫応答性は、Yuらによって以前に報告されている(J Clin Microbiol.1999 Aug;37(8):2568〜75)。E.chaffeensisのタンパク質(アクセッション番号4894576)は106kDaのタンパク質前駆体と呼ばれる。
120kDaの抗原の遺伝子を含んでいるゲノムフラグメント内に、免疫優性であってかつDIVA試薬でもあり得る他の遺伝子が存在する。例えば、クローン10は、120kDaの抗原のみを含んでいるクローンに比較して、感染された血清でプローブされたウエスタンブロット上に異なるバンドパターンを生じる。クローン10は、IV型分泌経路のVirD4成分の遺伝子情報を含み、この遺伝子配列は、遺伝子座タグ「Ecan02000624」で同定される。この遺伝子は、723個のアミノ酸のタンパク質(ZP_00211244)をコードするが、ゲル上で同定したタンパク質の分子量によって判定すると合、このタンパク質の一部のみがクローン10によって発現されるものと考えられる(配列番号13および14を参照のこと)。
ホルマリン不活性化E.canis(ワクチンサンプル)で免疫したビーグル犬由来の血清を、E.canisのp140タンパク質(p120としても公知、実施例7を参照のこと)由来の合成ペプチドを用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。
サンプルを、合成ペプチド(配列番号18、配列番号19および配列番号20)を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。個々のペプチドを直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。試験サンプルの希釈(1:100)をこのマイクロタイターウェルに添加して、洗浄することによって未結合の抗体を取り除いた。固定されたペプチドに結合した抗体を、抗−種、この場合イヌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)コンジュゲート(1:2000希釈)との反応、洗浄およびHRPO基質の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度(A650)を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
個々のペプチド(配列番号18、配列番号19および配列番号20)をウシ血清アルブミンにコンジュゲートして、直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。合成ペプチド(配列番号18、配列番号19および配列番号20)を、指示薬であるホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)にコンジュゲートした。試験サンプルおよびイムノアッセイ・ペプチド/指標を、対応するペプチドでコーティングされたマイクロタイターウェルに加えて、これをインキュベートして洗浄した。固定されたペプチドに結合した抗体およびペプチド/指示薬を、HRPO基質試薬の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度(A650)を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
サンプルは、合成ペプチド(配列番号18、配列番号19および配列番号20)を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。個々のペプチドを直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。試験サンプルの希釈(1:100)を、マイクロタイターウェルに添加して、未結合の抗体を洗浄によって除去した。固定されたペプチドに結合された抗体を、抗−種、この場合イヌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)コンジュゲート(1:2000希釈)との反応、洗浄およびHRPO基質の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度(A650)を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
個々のペプチド(配列番号18、配列番号19および配列番号20)をウシ血清アルブミンにコンジュゲートして、直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。合成ペプチド(配列番号18、配列番号19および配列番号20)を、指示薬であるホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)にコンジュゲートした。試験サンプルおよびイムノアッセイ・ペプチド/指標を、対応するペプチドでコーティングされたマイクロタイターウェルに加えて、これをインキュベートして洗浄した。固定されたペプチドに結合した抗体およびペプチド/指示薬を、HRPO基質試薬の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度(A650)を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
6匹のE.canis−抗体陽性および3匹のE.canis−抗体陰性のイヌ由来の血清をSinclair Research(Columbia,MO)から入手した。血清サンプルは、E.canis抗体について、ライセンスを受けた可逆性のフロー・クロマトグラフィック結合アッセイIDEXX SNAP(登録商標)4Dx(登録商標)試験を用いて試験することによって、陽性または陰性であることを見出した。可逆性のフロー・クロマトグラフィックSNAP(登録商標)アッセイの結果を表7に示す。
陽性および陰性のサンプルについての結果を表7に示す。陽性のサンプルHP−319、HP−322、HP−326、HP−342、HP−354、HP−358は、配列番号22、配列番号23および配列番号24に示されるペプチド配列と反応性であった。陰性のサンプルHP−302、HP−303およびHP−306は、配列番号22、配列番号23および配列番号24に示されるペプチド配列に対して反応性ではなかった。
この結果、自然感染の結果として誘導された抗体は、上記の間接的なアッセイ形式でE.canisのp16タンパク質(配列番号22、配列番号23および配列番号24)由来の合成ペプチドと反応性であったことが示される。
7匹のE.canis−抗体陽性および3匹のE.canis−抗体陰性のイヌ由来の血清を野外のイヌから得た。血清サンプルは、E.canis抗体について、ライセンスを受けた可逆性のフロー・クロマトグラフィックIDEXX SNAP(登録商標)3Dx(登録商標)試験を用いて試験することによって、陽性または陰性であることを見出した。アッセイの結果を表8に示す。
陽性および陰性のサンプルについての結果を表8に示す。陽性のサンプル813:91I、1049:16A、1049:16U、1061:03I、1177:21G、1177:21Kおよび1177:63Oは、配列番号22、配列番号23および配列番号24に示されるペプチド配列と反応性であった。陰性のサンプル3818:57A、3818:57Cおよび3818:57Dは、配列番号22、配列番号23および配列番号24に示されるペプチド配列に対して反応性ではなかった。
この結果、自然感染の結果として誘導された抗体は、上記の直接アッセイ形式で、E.canisのp16タンパク質(配列番号22、配列番号23および配列番号24)由来の合成ペプチドと反応性であったことが示される。
6匹のナイーブなイヌを、E.canisのルイジアナ分離株を用いて実験的に感染させた。血清サンプルは、感染後3、7、10、13、17、21、24、28および35日で入手した。サンプルは、E.canis p16表面タンパク質由来のp16−2合成ペプチド(配列番号23)を用いて調製したマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。合成ペプチドは、マイクロタイターウェル中に固定し、試験サンプルの希釈物(1:100)をこのマイクロタイターウェルに添加して、洗浄することによって未結合の抗体を取り除いた。固定されたペプチドに結合した抗体を、抗−イヌ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)コンジュゲート(1:2000希釈)との反応、洗浄およびHRPO基質の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェル中の吸光度を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。
アッセイの結果を表9に示す。6匹のイヌ全ては、市販の可逆性フロー・クロマトグラフィックSNAP(登録商標)4Dx(登録商標)アッセイによって測定した場合、実験的感染後に、陰性の状態から陽性の状態に変化した。全てのイヌ由来の血清が、感染後種々の時点で配列番号23に示されるE.canisのp16ペプチドと反応した。実験的感染と配列番号23のペプチドに対する最初の反応との間の時間は以下のとおりであった:Dog 108532、感染後17日;Dog 115853,感染後13日;Dog 265006、感染後17日;Dog 268830、感染後13日;Dog 285307、感染後13日、およびDog 533573、感染後13日。
この結果、実験的な感染の結果として誘導された抗体は、E.canisのp16タンパク質(配列番号23)由来の合成ペプチドと反応性であったことが示される。
E.canisは文献に記載されている方法を用いてイヌ細胞培養物中で増殖させた。Breitschwerdt,Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1998,Vol 42:362〜368を参照のこと。光学顕微鏡を用いて、030細胞は、E.canisに80%より多くが感染していると見積もられた。2リットルのE.canisに感染した細胞培養物を収集し、遠心分離して、保持されたペレットで7.31グラムの物質(湿重量)を得た。1.462グラム(その物質の重量のうち20%)という推定の乾燥重量とすれば、水がその物質の重量のうち80%を構成すると推定される。その細胞ペレットを総容積73mlとしてPBS中に20mg/ml(乾燥重量)まで再懸濁した。
犬小屋で飼育しているイヌ(実験用ビーグル犬)への免疫のため、ホルマリン不活性化E.canis抗原を、3つの異なるアジュバントを用いて処方した。ホルマリン不活性化E.canis抗原を、製造業者に記載されるプロトコールを用いてRibiアジュバント(Corixa Corp.,Seattle WA)で調製した。各々の用量は、約20mgのホルマリン不活性化E.canis細胞培養物(乾燥重量)を含んだ。免疫原の追加の調製物を、Ribiアジュバント(上記)およびアジュバントBCG(1用量あたり1mg)(Calbiochem of EMD Biosciences,Inc.,San Diego,CA)の組み合わせを用いて調製した。各々3匹のイヌからなる2つの群を、Ribiアジュバント単独、またはRibiアジュバントとBCGアジュバントとを組み合わせて含んでいる不活性化E.canisのいずれかを用いて170日にわたって4回(0日、14日、156日、170日)投与した。ワクチン誘導性の高度免疫状態を生成する目的で、全てのイヌは、アジュバント TiterMax(登録商標)(CytRx Corp.,Norcross,GA)を用いるか、またはアジュバント TiterMax(登録商標)とアジュバントBCGとを組み合わせて製造業者の指示を用いて処方したホルマリン不活性化E.canisの単回用量を投与された(247日)。イヌには、以下のスケジュールに従ってワクチンを投与した:
ホルマリン不活性化E.canisの調製およびビーグル犬の免疫は、実施例13および14に記載された。免疫したビーグル犬由来のサンプルを、合成ペプチド(配列番号22、配列番号23および配列番号24)を用いて調製した直接のマイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。
サンプルは、合成ペプチド(配列番号22、配列番号23および配列番号24)を用いて調製した、マイクロタイタープレートに基づくイムノアッセイを用いて試験した。合成ペプチドは、マイクロタイターウェル上に1.0μg/mlで固定した。別々の量の合成ペプチドを、指示薬ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)にコンジュゲートした。その試験サンプルおよびイムノアッセイ・ペプチド/指標を、ペプチドでコーティングしたマイクロタイターウェルに加えて、これをインキュベートして洗浄した。固定されたペプチドおよびペプチド/指示薬に結合した抗体をマイクロタイターウェル中に固定した。この複合体をHRPO基質試薬の添加によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて判定した。
アッセイの結果を表10に示す。陽性コントロール(PC,ID 1049:16E)および陰性コントロール(NC,3818:57B)は、それぞれ、E.canis陽性および陰性が既知の血清サンプルであった。全てのサンプルを、E.canis抗体について市販の可逆性フロー・クロマトグラフィックSNAP(登録商標)4Dx(登録商標)試験を用いて試験した。異なるアジュバントを用いて処方したホルマリン不活性化E.canis抗原を投与された6匹のイヌ(CVYDEH、CWMBDC、CVXCSM、CWMAXK、CVSCVAおよびCVXCAP)由来の連続的な時間的なサンプルの結果を、免疫後226日、261日、268日および282日について示す。可逆性のフロー・クロマトグラフィックSNAP(登録商標)4Dx(登録商標)試験の結果、ワクチン接種した動物では抗体応答が誘導されたことが実証される。ワクチン接種した動物由来の血清サンプルのうち、ペプチド(配列番号22、配列番号23および配列番号24)マイクロタイタープレート形式のアッセイで反応性のものはなかった。
この結果によって、ホルマリン不活性化E.canis抗原を用いる免疫の結果として誘導された抗体が可逆性のフロー・クロマトグラフィックSNAP(登録商標)4Dx(登録商標)試験で反応性であり、抗E.canis抗体応答が開始されたことが示される。これらの同じサンプルは、E.canis P16タンパク質(配列番号22、配列番号23、配列番号24)由来の合成ペプチドに対して非反応性であった。
6匹のイヌを実験的にE.canisに感染させた。ドキシサイクリンを感染後28日で投与した。E.canisに特異的な抗体を、間接的アッセイプロトコールを用いて配列番号23を用いて検出した。配列番号23に示されるポリペプチドを直接吸着によってマイクロタイターウェル上に固定した。試験サンプルの希釈物(1:100)をこのマイクロタイターウェルに添加して、洗浄することによって未結合の抗体を取り除いた。固定されたペプチドに結合した抗体を、抗−種、この場合ウサギ抗−イヌホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)コンジュゲート(1:1000希釈)との反応によって検出した。個々のマイクロタイターウェルの吸光度(A650)を、マイクロタイター・プレート・リーダーを用いて測定した。陰性のカットフは2xの陰性のコントロールO.D.値であった。
ワクチンは、感染予防に完全に有効ではない場合もある。従って、ワクチン接種した動物がワクチン接種にかかわらず感染したか否かを決定する方法があることが望ましい。検出因子としてp16を用いるイムノアッセイでは、E.canisに関してワクチン接種されており、E.canisに感染していないイヌにおける抗E.canis抗体を検出しない。ここで、E.canisのp16タンパク質(配列番号10)がE.canisワクチンを投与されたイヌでのE.canis感染を検出するために用いることができることが発見された。
(a)1位のXが存在しないかまたはCであり、4位のXがHまたはQであり、25位のXがDまたはGであり、かつ36位のXがEまたはGである、配列番号33;
(b)1位のXがCであり、4位のXがHであり、25位のXがDまたはGである、配列番号33のアミノ酸1〜27;
(c)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり;かつCが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(d)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(e)1位のXがCであるかまたは存在せず、かつ25位のXがDまたはGである、配列番号33のアミノ酸1〜27;
(f)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(g)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(h)25位のXがDまたはGであり、かつCが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜27;
(i)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜41;
(j)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(k)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが必要に応じてアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(l)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが必要に応じてアミノ末端に存在する、配列番号33のアミノ酸24〜41。
Claims (20)
- (a)エーリキア・カニスに感染した動物と;(b)E.canisに感染していない動物とを、該動物がE.canisに関してワクチン接種されているか否かにかかわらず識別する方法であって:
(a)動物由来の生物学的サンプルと、E.canisワクチンに対する該動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合しない1つ以上の第一の精製されたポリペプチドとを接触させる工程であって;ここで該1つ以上の第一の精製されたポリペプチドが配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有する工程と;
(b)該生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程と;
を包含し、
ここで該生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合するならば、該動物はE.canisに感染している、方法。 - 前記1つ以上の第一の精製されたポリペプチドが約15〜約75アミノ酸長である、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の第一の精製されたポリペプチドが、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、E.canisワクチン抗原である1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに対して、前記生物学的サンプル中の抗体が特異的に結合するか否かを判定する工程をさらに包含し、
ここで該生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合し、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、該動物はE.canisに感染しており、かつE.canisに関するワクチン接種状態が不明であり;
該サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、該動物は、E.canisに感染しておらず、かつE.canisについてワクチン接種されており;そして
該サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合しないならば、該動物はE.canisについてワクチン接種されておらず、かつE.canisに感染していない、方法。 - E.canisについて動物のワクチン接種および感染状態を判定する方法であって:
(a)動物由来の生物学的サンプルを、E.canisワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合しない1つ以上の第一の精製されたポリペプチドであって、該1つ以上の精製されたポリペプチドが配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有しているポリペプチドと、およびE.canisワクチンに対する動物の免疫応答の成分である抗体に特異的に結合する1つ以上の第二の精製されたポリペプチドと接触させる工程と;
(b)該生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに対して、および1つ以上の第二の精製されたポリペプチドに対して特異的に結合するか否かを検出する工程と;
を包含し、
ここで該生物学的サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合し、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、該動物は、E.canisに感染しており、かつE.canisについてワクチン接種状態が不明であり;ここで該サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたE.canisポリペプチドに特異的に結合するならば、該動物は、E.canisに感染しておらず、かつE.canisについてワクチン接種されており;そしてここで該サンプル中の抗体が1つ以上の第一の精製されたポリペプチドに特異的に結合せず、かつ1つ以上の第二の精製されたポリペプチドに特異的に結合しないならば、該動物はE.canisについてワクチン接種されておらず、かつE.canisに感染していない、方法。 - 前記1つ以上の第一の精製されたポリペプチドが約15〜約75アミノ酸長である、請求項5に記載の方法。
- 前記1つ以上の第一の精製されたポリペプチドが、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項5に記載の方法。
- 試験サンプル中でE.canisに特異的である抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を判定する方法であって:
(a)1つ以上の精製されたポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するのに適した条件下で、試験サンプルを、配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有する1つ以上の精製されたポリペプチドと接触させる工程であって、ここで、1つ以上の精製されたポリペプチドは約15〜約75アミノ酸長であり、1つ以上の第一の精製されたポリペプチドは、E.canisに特異的である抗体に特異的に結合する;および
(b)該1つ以上の精製されたポリペプチドの、該抗体またはその抗原結合フラグメントへの特異的な結合の存在を検出する工程;
を包含し、
ここで、該1つ以上の精製されたポリペプチドの該抗体または抗原結合フラグメントへの特異的な結合の存在は、該試験サンプル中のE.canisに特異的な該抗体またはその抗原結合フラグメントの存在を示す、方法。 - 前記1つ以上の精製されたポリペプチドが、異種のアミノ酸配列、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項9に記載の方法。
- 前記方法が特異的結合の量を検出する工程をさらに包含する、請求項9に記載の方法。
- 前記1つ以上の精製ポリペプチドが固相支持体に固定される、請求項9に記載の方法。
- 組成物であって:
(a)配列番号22〜33からなる1つ以上の精製されたポリペプチド;あるいは
(b)配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有する1つ以上の精製されたポリペプチドであって、1つ以上の精製されたポリペプチドは約15〜約75アミノ酸長である;
(c)1位のXが存在しないかまたはCであり、4位のXがHまたはQであり、25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGである、配列番号33;
(d)1位のXがCであり、4位のXがHであり、25位のXがDまたはGである、配列番号33のアミノ酸1〜27;
(e)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり;かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(f)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(g)1位のXがCであるかまたは存在せず、かつここで25位のXがDまたはGである、配列番号33のアミノ酸1〜27;
(h)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(i)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(j)25位のXがDまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜27;
(k)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜41;
(l)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸13〜41;
(m)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜49;
(n)25位のXがDまたはGであり、36位のXがEまたはGであり、かつCが任意にアミノ末端に存在している、配列番号33のアミノ酸24〜41;あるいは
(o)(a)〜(n)の組み合わせ、
を含んでいる、組成物。 - 前記1つ以上の精製されたポリペプチドが多量体型である、請求項12に記載の組成物。
- 前記1つ以上の精製されたポリペプチドが、異種のタンパク質、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項12に記載の組成物。
- 動物において免疫応答を生じさせる方法であって:該動物に対して配列番号22〜33に対して少なくとも95%の同一性を有している1つ以上の精製されたポリペプチドまたはそれらの組み合わせを投与する工程を包含し、該1つ以上の精製されたポリペプチドが該動物において免疫応答を生じる方法。
- 前記1つ以上の精製されたポリペプチドが約15〜約75アミノ酸長である、請求項15に記載の方法。
- 前記1つ以上の精製されたポリペプチドが多量体型である、請求項15に記載の方法。
- 前記1つ以上の精製されたポリペプチドが、異種のタンパク質、指示薬、アミノ酸スペーサー、アミノ酸リンカー、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンドまたはそれらの組み合わせに結合される、請求項15に記載の方法。
- 動物におけるエーリキア・カニス感染の予防、治療または回復のための方法であって、該動物に対して:
(a)配列番号22〜33に対して少なくとも95%の配列同一性を有している1つ以上の精製されたポリペプチド、またはそれらの組み合わせ;あるいは
(b)配列番号22〜33を含んでいる1つ以上の精製されたポリペプチドをコードする1つ以上の核酸、またはそれらの組み合わせ;あるいは
(c)配列番号22〜33を含んでいる1つ以上の精製されたポリペプチドに特異的に結合する1つ以上の抗体、またはそれらの組み合わせ;
を投与する工程を包含し、
これによってE.canis感染が予防、回復または治療される、方法。 - 患者においてE.canis感染の治療をモニタリングする方法であって:(a)請求項10の方法によるE.canis感染のための治療の前または初期段階において、患者由来の第一のサンプル中の抗E.canis抗体のレベルを測定する工程と;(b)請求項10の方法によって治療がなされた後の該患者由来の第二のサンプル中の抗E.canis抗体のレベルを測定する工程と;(c)該第一のサンプル中の抗E.canis抗体の量と、該第二のサンプル中の抗E.canis抗体の量とを比較して、変化を評価し、それによって治療をモニタリングする工程と;を包含する、方法。
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