KR20100101121A

KR20100101121A - 개선된 탁산 전달 시스템

Info

Publication number: KR20100101121A
Application number: KR1020107014362A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 엠. 안셀; 샤론 존스톤; 폴 타르디; 로렌스 마이어
Original assignee: 셀라토 파마슈티칼즈, 인코포레이티드
Priority date: 2007-11-28
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2010-09-16
Also published as: EP2222278A1; WO2009070761A1; EP2222278B1; EP2222278A4; KR101563658B1; US8486924B2; JP5537753B2; JP2011504937A; US20100331290A1; CN101878024B; ES2535217T3; CN101878024A

Abstract

글리콜레이트 링커를 통하여 소수성 모이어티에 결합된 탁산으로부터 형성된 탁산 컨쥬게이트 프로드럭을 운반하기 위한 나노 입자형 제제가 기재되어 있다.

Description

개선된 탁산 전달 시스템 {IMPROVED TAXANE DELIVERY SYSTEM}

관련 출원

본 출원은, 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합되는 2007년 11월 28일에 출원된 미국 출원 일련번호 제60/990,907호의 이익을 주장한다.

기술 분야

본 발명은 약 운반 분야, 구체적으로는 조절된 약물 동력학을 갖는 탁산을 성공적으로 운반하는 분야에 관한 것이다.

파클리탁셀은 암종 (carcinomas)을 치료하기 위한 항암제로 널리 사용되고 있다. 임상 물질은 크레모포 (Cremophor^®) EL/에탄올로 제형화하고, 투여하기 전에 버퍼로 희석하였다. 마이셀, 리포솜 또는 에멀션¹ ^{, 15, 16, 17}을 사용하여 파클리탁셀의 제형을 개선하기 위한 시도를 기술하는 문헌 내에 많은 보고가 있다. 그러나, 거의 대부분의 경우, 이러한 전달 비히클들이 파클리탁셀을 제형화하는 동안 보고된 약물 동력학 데이터로부터 상기 약제는 대략 몇 분의 반감기를 갖는 케리어 밖에서 급격히 분할되기 때문에 생체 내에서 진정한 전달 비히클로서 작용하지 않는다는 것이 명백하다. 하나의 예외가 NK105²로 알려진 제형에서 나타난다. NK105는 4-페닐부탄올로 덮힌 카복실기 내에서 폴리(에틸렌글리콜)-폴리(아스파르트산)으로 구성된 마이셀에서 제형화된 파클리탁셀이다.

또한, 파클리탁셀의 성능을 개선시키거나 약제와 관련된 제형 문제를 다루기 위한 기능적 친유성 파클리탁셀 프로드럭을 생산하기 위한 많은 시도가 있어왔다. 이들은 포스포리피드³ ^{, 4}, 콜레스테롤⁵, α-브로모 지방산⁶ ^{, 7}, 올렌산⁸ ^{, 9}, 플러린¹⁰, 그리고 도코사헥사노익산¹¹을 갖는 컨쥬게이트를 포함한다. 이들 프로드럭은 리포솜³ ^{, 7, 10}, 오일 에멀젼⁸ ^{, 9} 또는 마이셀⁵ ^{, 6, 11} 등과 같은 지질 운반체로 제형화되었다. 또한, WO2006/014626은 파클리탁셀과 입자 형태에서 존재할 수 있는 소수성 모이어티를 갖는 기타 약제들의 컨쥬게이트를 개시한다. 이들의 대부분은 생체 내 (in vivo) 모델에서의 파클리탁셀에 대한 개선된 효능을 주장하고 있지만, 대부분의 경우, 그들은 혈장 약제 제거에 대한 정보를 제공하지 않거나 초기 분배 단계 대신에 말기 약제 제거 단계에 초점을 맞추는 데이터를 제시한다. 투여 후, 초기 24시간 동안의 약제 제거 정보는 마이셀과 나노 입자를 포함하는 입자 운반체에서 관찰된 개선된 투과성과 정체 (EPR; enhanced permeability and retention) 현상 때문에 종양 운반 관점에서는 가장 의미있는 기간이다.

본 발명은 일련의 친유성 파클리탁셀 프로드럭 및 관련된 마이셀/나노 입자 제형을 예로 든다. 연장된 순환 반감기를 갖는 입자 운반체는, 지질 앵커 소수성의 정도와 프로드럭 가교제의 불안정도를 조정함으로써 약제의 해리가 조절되는 장소를 기술하였다. 생체 내에서의 상기 프로드럭의 효능은 결합 특성과 지질 앵커의 상대적인 분배 속도에 좌우되는 것이 나타났다.

많은 화학 치료 요법은 다양한 약제를 포함한다. 다양한 약제 조합은 적절한 비율로 사용되면 상승적으로 작용하지만, 세포 기반 연구에서 다른 비율로 사용되면 길항적으로 작용한다. 이러한 발견은 투여 비율을 달리하여 종래의 수용성 칵테일 내로 투여될 때, 생체 내에서의 각 약제의 서로 다른 약물 동력학 행동에 적용되었다. 이러한 문제는 PCT 공개 문헌 WO 03/028696에 개시된 바와 같은 약제 운반과 방출을 조절하기 위하여 고안된 미립자 운반 수단을 사용함으로써 해결되었다. 본 발명은 파클리탁셀과 그의 유사체, 탁산 조성의 약물 동력학을 모방하기 위하여 제형화될 수 있는 1개 이상의 추가의 항종양제를 포함하는 조성의 조절을 가능하게하는 개선을 제공한다.

본 발명의 내용

본 발명은 약물 동력학의 조절을 가능하게 하기 위하여 탁산과 미셀라 또는 나노 입자 운반 수단의 프로드럭을 사용한다. 더욱 소수성이어서 결과적으로 지질 기반 시스템과 더욱 양립 가능한 탁산을 제조함으로써, 탁산 조성물의 약물 동력학이 조절될 수 있다. 또한, 생체 내에서의 그들의 효과적인 방출율이 탁산과 일치하는 추가적인 항종양제를 함유하는 제형의 특성을 조절하는 것이 가능하다. 미셀라 또는 지질 나노 입자 케리어는 이들 프로드럭과 다른 약제가 수용성 환경에서 부유하도록 하는데 사용될 수 있다.

하기에서 나타낸 바와 같이, 긴 순환 디글리콜레이트 프로드럭 나노 입자는 최대 내약 용량으로 종래의 제형화된 파클리탁셀에 비하여 상당히 개선된 치료 활성을 제공한다; 따라서 이들 제형의 종류는 그 자체로 유리하다.

따라서, 하나의 측면으로, 본 발명은 글리콜레이트 링커를 통하여 소수성 모이어티에 결합된 탁산의 컨쥬게이트이고, 지질 및/또는 양친매성 안정화제와 결합된, 탁산의 프로드럭으로부터 형성된 나노 입자 또는 마이셀을 포함하는 약학 조성물을 개시한다.

다른 측면으로, 본 발명은 본 발명의 조성을 사용하여 탁산을 투여하는 방법, 본 발명의 조성과 추가적인 항종양제의 제형을 결합하는 방법, 이들을 투여하는 방법, 그리고 이들 조성과 제형을 제조하는 방법을 개시한다.

도면의 간단한 설명

도 1A와 도 1B는 HPLC (도 1A) 또는 관련 약제 정체 (도 1B)로 측정된 시험 프로드럭 1과 프로드럭 2의 제거를 나타내는 그래프이다.

도 2는 POPC/2kPS3k로 제형화된 프로드럭 1 내지 9의 제거를 보여준다.

도 3은 유사 제형의 프로드럭 1 내지 7의 상대 효능을 보여준다.

도 4는 탁솔^TM과 비교한 다양한 농도의 프로드럭 7의 효능을 보여준다.

도 5는 탁솔^TM과 동등해지기 위하여 필요한 프로드럭 7의 파클리탁셀 당량의 계산을 보여준다.

발명의 수행 방법

본 발명은 글리콜레이트을 통하여 소수성 모이어티에 결합되는 프로드럭으로 제형화된 탁산의 개선된 전달 특성을 나타내는 조성을 제공한다. 상기 제형의 약물 동력학은 소수성 모이어티의 특성을 조절함으로써, 또한 마이셀이나 나노 입자의 성분을 조정함으로써 조절할 수 있기 때문에, 목적하는 약물 전달 특성을 얻을 수 있다. 이들 약물 동력학은 다른 항암제를 함유하는 제형의 약물 동력학과 일치시키기 위하여 제조될 수 있는데, 항종양제와 탁산 약물의 비율을 종양으로 전달하는 조절된 약물 전달의 개선된 시스템이 투여된 곳에 실질적으로 잔여하게 하는 기회를 제공한다. 따라서, 시험관 내 (in vitro)에서 측정된 상승적 비율은 1개 이상의 추가적인 항암제의 양립 가능한 제형과 결합된 개선된 탁산 제형을 사용하여 1.5 또는 2와 같은 작은 인자 내에서 유지되도록 할 수 있다. 물론, 이들 제형은 암과 기타 과증식 징후의 치료에도 유용하다. 이들 비율의 유지는 시간에 따라 혈액이나 혈장 내의 약제 농도를 결정함으로써 손쉽게 측정할 수 있다. 조절된 조성은 최소 1시간 또는 4시간 또는 심지어 24시간에 걸쳐서 앞서 말한 제한 내에서 혈액 또는 혈장 내에서 측정된 바와 같은 투여된 비율을 유지할 것이다.

앞서 언급한 바와 같이, 탁산 프로드럭을 운반하는 본 발명의 조성 내의 나노 입자 또는 미셀라 성분은 지질 및/또는 양친매성 안정화제로 구성된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은, "탁산"은 파클리탁셀과 그의 유사체로 구성된 프로드럭 종류를 말한다. 파클리탁셀은 원래 주목 나무에서 유래되었으며, 그의 유사체로는 도세탁셀 (docetaxel)과 기타 유사한 구조의 화합물이 포함된다. 탁솔^TM은 크레모퍼^TM로 제형화된 파클리탁셀의 상업적으로 이용가능한 형태이다.

프로드럭의 일부를 형성하는 "소수성 모이어티"는 글리콜레이트 결합을 통하여 탁산에 결합될 수 있는 고분자량 알코올이다. 상기 알코올은 직쇄, 분지쇄, 또는 6개 이상의 탄소, 일반적으로는 6 내지 30개의 탄소, 또는 몇몇 구체예에서는 6 내지 20개의 탄소의 고리 모양 알코올일 수 있다. 또한, 비타민 E 그리고 관련 모이어티 등의 콜레스테롤 또는 토코페롤과 같은 스테로이드일 수 있다.

본 발명의 나노 입자 조성 내의 프로드럭과 관련된 지질은 일반적으로 디스테아로일 포스파티딜콜린 (distearoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린, (distearoyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스포콜린 (디미리스토일 phosphocholine), 그리고 상응하는 포스파티딜 에탄올 (phosphatidyl ethanols), 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositols), 포스파티딜 글리세롤 (phosphatidyl 글리세롤s) 등과 같은 인지질이다. 또한, 사슬 지방산은 불포화된 것일 수 있고 예컨대, 올레산과 리놀레산을 포함할 수 있다. 게다가, 지질 모이어티는 스핑고미엘린 등과 같은 스핑고신, 또는 비타민 E 숙시네이트 또는 비타민 E 아디페이트 등의 토코페롤 에스테르 그 자체일 수 있다.

양친매성 안정화제는 친수성 부분과 소수성 부분을 포함하는 중합 화합물이다. 일반적인 소수성 폴리머는 폴리비닐 유도체뿐 아니라 폴리스티렌과 폴리메타크릴산의 소수성 유도체를 포함한다. 전형적인 친수성 성분은 덱스트란과 덱스트란 유도체와 폴리아미노산뿐 아니라, 폴리에틸렌 글리콜과 소수성 폴리머의 친수성 유도체를 포함한다. 상기 리스트는 예시적인 것을 의미하며 완전한 것이 아니다. 일반적으로, 양친매성 안정화제는 약 500보다 큰 분자량을 가지지만, 1,000 내지 50,000 g/몰의 더 높은 분자량을 가질 수 있다.

하기의 실시예에서, 친유성 나노 입자 제형으로 고안된 일련의 파클리탁셀 프로드럭을 개시한다. 파클리탁셀의 소수성은 숙시네이트 또는 디글리코레이트 가교제를 사용하여 일련의 증가하는 소수성 지질 앵커의 약물에 대한 컨쥬게이팅으로 증가한다. 파클리탁셀 그 자체는 물에서 거의 불용성인 반면, 일반적으로 대략 몇 분의 반감기를 갖는 지질계 운반 시스템으로 급속히 분할할 수 있는 충분한 수성 용해도를 지닌다. 본 발명은 효능이 최대인 생체 내에서 제형화된 약물의 약물 동력학을 조절한다. 상기 프로드럭은 잘 정의된 블록 공중합체가 안정화된 나노 입자로 제형화된다. 이들 나노 입자는 생체 내에서 대략 24시간의 제거 반감기를 가지는 것으로 나타났다. 나노 입자로부터 프로드럭이 방출되는 속도는 지질 앵커의 소수성을 조정함으로써, 1 내지 24시간 범위의 방출 속도로 조절할 수 있다.

나노 입자 제형은 4℃에서 수개월 동안 안정하게 저장될 수 있다.

다양한 파클리탁셀 프로드럭의 치료 활성을 평가하기 위하여, 나노 입자 제형을 HT29 인간 클론 이종이식 종양을 보유한 마우스에 정맥 내 주사로 투여하였다. 증가된 혈장 반감기와 프로드럭의 곡선 하의 면적과 같이, HT29 종양에 대한 활성도 증가하였다. 탁솔^®에 대한 적절한 치료 요법을 사용하여 양 치료를 최대 내약 용량으로 투여할 때, 파클리탁셀 프로드럭 나노 입자는 HT29 종양에 대하여 탁솔^®이 400 mg으로 도달하는데 걸리는 시간의 2배 이상의 시간이 걸렸다.

그런 나노 입자 제형의 종류는 생체 내에서 시간에 따라 입자로 분배되는 단일 폴리머 사슬의 결과로서 아마 제거되었다. 점차적인 안정화 성분의 손실은 상기 입자를 불안정하게 하고, 아직 분할되지 않은 임의의 탑재량의 제거를 야기할 것이다. 높은 약/안정화제 비율을 갖는 입자들은 잠재적인 단백질 상호 작용에 입자 코어를 노출하는 상대적으로 소량의 폴리머의 손실 때문에 급격히 제거된다. 낮은 약물/안정화제 비율을 갖는 입자들은 폴리머의 손실에 대하여 더 큰 내성을 가지고, 생체 내에서의 기타 메커니즘을 통하여 제거되기에 충분히 긴 시간 살아남는다. 따라서, 이상적인 전달 시스템은 상대적으로 낮은 약물/폴리머 비율, 좋기로는, 분할 속도가 낮은 안정화제를 갖는 마이셀의 크기에 근접하여야 한다.

서로 다른 종류의 소수성의 지질 앵커를 갖는 프로드럭은 동일한 입자 조성에서 서로 다른 분할 속도를 나타낸다. 이들 나노 입자에서, 약물의 물리화학적 특성은 케리어 그 차제의 성능 저하보다는 케리어의 약물 방출에 주로 영향을 준다. 이러한 행동은, 예를 들면 나노 입자 내의 탁솔^®과 파클리탁셀 프로드럭 사이에 상당한 차이를 초래한다. 파클리탁셀은 주입된 크레모퍼 마이셀에서 급격히 분할되고, 혈액 구획 내에 접하여 약해지는 친유성에 대하여 넓게 분배된다. 시간 경과에 따라, 제거되기 전, 혈액 구획 내로 약물은 재분배된다. 프로드럭 나노 입자는 이를 초기 분배 단계에서는 나타내지 않지만, 프로드럭 성분의 분배율에 좌우되는 속도로 시간 경과에 따라 계속하여 약을 방출한다. 상기 프로드럭 분배율은 효능과 직접적으로 관련된다는 것을 하기에 나타냈고, 이 속도는 프로드럭의 지질 앵커 (즉, 소수성)를 변화시켜서 손쉽게 조정할 수 있었다.

분배율에 따른 효능의 의존성은 프로드럭의 점진적인 방출에 뒤이은 종양 내의 나노 입자의 축적의 면에서 합리적으로 개선될 수 있다. 그들의 탑재량을 급격히 방출하거나 순환으로부터 급격히 제거하는 나노 입자들은 종양 위치에 약을 덜 전달하게 될 것이고, 결과적으로 감소된 효능을 나타낼 것으로 예상될 수 있다.

본 발명의 조성은 추가적인 항종양제를 더 함유할 수 있다. 탁산 프로드럭의 약물 동력학은 본 발명의 조성 내에서 손쉽게 조절될 수 있는 바와 같이, 유사한 조성 또는 대안 제형의 추가적인 항종양제가 제공될 수 있고, 본 발명의 조성과 혼합하거나 대상체에 동시에 투여하여 제공될 수 있다. 따라서, 추가적인 항종양제는 리포솜, 마이셀, 대안적 나노 입자 또는 탁산의 약물 동력학과 유사하게 고안된 기타 조성으로 제형화될 수 있다. 적절한 항종양제는 기술 분야에서 다방면이고 잘 알려진, 예를 들면 다우노루비신과 독소루비신 등의 안트라사이클린, 카보플라틴과 시스플라틴 등의 백금을 함유하는 약제, 이리노테칸과 그의 유사체를 포함하는 계, 플루오로피리마딘, 그리고 메토트렉세이트 등의 흔히 사용되는 다양한 기타 약제를 포함한다. 탁산 제형의 약물 동력학과 유사하게 고안된 추가의 항종양제 (또는 약제)의 제형은, 상기 기재한 바와 같이 탁산 제형과 혼합될 수 있거나, 별도의 조성으로 주로 동시에 투여될 수 있다.

하나의 실시 상태에 있어서, 상기 탁산 프로드럭은 주입 후 연장된 시간 동안 혈장 내에 주입된 약물:약물 속도에서 2개의 약제를 유지하는 독소루신과 이중 약 나노 입자 등과 같은 수용성 약제의 소수성 프로드럭 유사체와 공동 제형화될 수 있다. 나노 입자 내에서의 소수성 프로드럭 제형화는 광범위하게 서로 상이한 물리 화학적인 특성을 갖는 공동 운반 항암제에 대한 새로운 접근을 제공하고, 생체 내에서 최적의 약물:약물 비율을 유지한다.

본 발명의 조성은 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있는데, 비경구 투여가 선호된다. 치료되는 대상체로는 인간, 기타의 고등 동물, 그리고 마우스와 랫트 등의 실험실 모델도 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 보여주기 위한 것으로 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예

약어: VES, 비타민 E 숙시네이트; POPC, 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-ㅍ포스포콜린; CVIJ, 한정 용량의 충돌 제트; 2kPS3k, 폴리(에틸렌 글리콜)₂₀₀₀-b-폴리스티렌₃ ₀₀₀; 2.5kPS3k, 폴리(에틸렌 글리콜)₂₅₀₀-b-폴리스티렌₃₀₀₀; ³H-CHE, 3중 콜레스테롤 헥사데실 에테르; TLC, 박층 크로마토그래피; DIPC, 디소프로필카보다이이미드; DMAP, N,N-4-디메틸아미노피리딘.

재료 구체적으로 별도 명시하지 않으면 모든 시약은 Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON에서 구입한 것이다. 용매는 VWR International, Mississauga,　ON에서 얻었다. 파클리탁셀은 Indena S.p.A., Milan, Italy에서 구매하였다. ³H-CHE는 Perkin Elmer Life와 Analytical Sciences, Inc., Waltham, MA에서 얻었다. POPC는 Northern Lipids, Burnaby, BC에서 얻었다. ¹H NMR 스펙트라는 Bruker Advance 400로 CDCl₃에서 기록하였다. HT-29 인간 대장 선암 세포는 ATCC, Manassas, VA에서 얻었다. Foxn1^nu 마우스는 Harlan, Indianapolis, IN에서 얻었다. 한정 용량의 충돌 제트 혼합기는 프린스턴 대학에서 주문 제작한 것이었다. 모든 동물 실험은 브리티시 콜롬비아의 동물 보호 위원회에서 승인받은 프로토콜과 캐나다 동물 보호 위원회에서 확립된 현재의 가이드라인에 따라 수행하였다.

실시예 1

프로드럭의 합성

보통의 구할 수 있는 지질 알코올의 범위가 앵커 요소로 (계획 1), α-토코페롤 (1 및 3), 올레일 알코올 (2 및 4), 옥타데카놀 (5), 코사놀 (6), 도코사놀 (7), 콜레스테롤 (8), 그리고 1,2-디미리스토일--sn-글리세롤 (9)을 포함하여 사용되었다. 이 지질은 N,N-4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)의 존재 하에서 디이소프로필카보디이미드 (diisopropylcarbodiimide; DIPC)를 사용하여 파클리탁셀을 갖는 앵커-링커 산물의 축합에 뒤이은 상응하는 고리형 무수물로의 처리에 의하여 가교제에 컨쥬게이트되었다. 숙시네이트 (1-2)과 디글리콜레이트 (3-9)은 가교제로서 사용하였다. 상기 후자의 3-옥사 모이어티는 숙시네이트 유사체에 비하여 가수분해에 대한 가교제의 2'-아실기의 민감도를 증진시키기 위한 것이었다.

<반응식 1>

친유성 파클리탁셀 프로드럭의 합성

[시놉시스 톡 (SYNOPSIS TOC)]

상기 2'-아실 파클리탁셀 유도체는 파클리탁셀 2'-와 7-하이드록실기 사이의 반응율 차이를 선택적으로 이용하여 제조하였다. 본 명세서에서 사용된 반응 조건 하에서는, TLC에 의하여 모니터된 바와 같이, 상당한 농도의 2',7-디아실 제품이 생산되기 전에 다수의 파클리탁셀이 소비되었다. 컬럼 크로마토그래피는 미반응 파클리탁셀, 조 반응 혼합물 (crude reaction mixture) 내의 2',7-디아실 산물과 기타 불순물을 제거하기 위하여 사용되었다. 최종 산물의 순도와 동정은 각각 HPLC와 NMR 분석에 의하여 확인하였다.

지질 앵커의 분석을 위하여, 피리딘 내의 지질 알코올을 밤새 실온에서, 숙시네이트 무수물 또는 디글리콜린 무수물의 3 등가물로 처리하였다. 상기 용매는 로토-바프 (roto-vap)에서 제거하였고, 염화메틸렌으로 희석한 염산으로 잔여물을 추출하였다. 상기 유기물 분획을 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 상기 용매를 제거하였다. 적절한 산으로의 전환을 TLC로 모니터하였는데, 대부분의 경우 100%였다. 상기 결과 산물을 진공 또는 벤젠으로 감압하에 동결건조하였다. 상기 지방산은 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

파클리탁셀 컨쥬게이트의 합성을 위하여, 파클리탁셀 (1 당량), 지방산 (2 당량), 4-N,N-디메틸아미노피리딘 (3 당량)을 알코올이 없는 클로로포름에 용해시켰다. 이어서, 디이소프로필카보디이미드 (1.3 당량)을 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 교반하였다. 대부분의 파클리탁셀이 소비될 때까지 (보통 2 내지 4시간) 상기 반응을 TLC로 모니터하였다. 이어서, 반응 혼합물을 희석된 염산으로 세척하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조하였다. 용매의 제거 후, 조 산물을 메탄올/염화 메틸렌 구배를 사용한 실리카 겔 컬럼으로 통과시켰다. 정제된 프로드럭을 벤젠으로 감압 하에 동결건조하고, 실온에서 저장하였다.

제조된 화합물은 다음과 같다:

2'-O-(4''-O- 토코페릴숙시노일 )- 파클리탁셀 1. 파클리탁셀과 토코페롤 숙시네이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.83 (1H, d, J = 7.25 Hz); 4.22 (1H, d, J　=　8.60 Hz); 4.33 (1H, d, J = 8.60 Hz); 4.46 (1H, dd, J = 10.88 Hz, J'= 6.58 Hz); 4.99 (1H, d, J　= 9.54 Hz); 5.52 (1H, d; J = 3.22 Hz); 5.70 (1H, d, J = 6.98 Hz); 5.98 (1H, dd, J = 9.13 Hz, J'=　3.22 Hz); 6.27 (1H, t, J = 8.6 Hz); 6.97 (1H, d, J = 8.87 Hz).

2'-O-(4''-O- 올레일숙시노일 )- 파클리탁셀 2. 파클리탁셀과 올레일 숙시네이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.82 (1H, d, J = 7.0 Hz); 3.96 (2H, t, J = 6.81 Hz); 4.21 (1H, d, J = 8.38 Hz); 4.33 (1H, d, J = 8.38 Hz); 4.46 (1H, br. s); 4.98 (1H, d, J = 8.45 Hz); 5.36　(2H, m); 5.50 (1H, d, J = 2.89 Hz); 5.69 (1H, d, J = 7.00 Hz); 6.00 (1H, dd, J = 9.04 Hz, J'=　2.74 Hz); 6.26 (1H, t, J = 8.91 Hz); 7.08 (1H, d, J = 9.06 Hz).

2'-O-(5''-O- 토코페릴디글리코오일 )- 파클리탁셀 3. 파클리탁셀과 토코페롤 디글리콜레이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.84 (1H, d, J = 6.98 Hz); 4.22 (1H, d, J　=　8.3 Hz); 4.34 (1H, d, J = 8.6 Hz); 4.99 (1H, d, J = 7.79 Hz); 5.64 (1H, d, J = 2.96 Hz); 5.70　(1H, d, J = 6.98 Hz); 6.06 (1H, dd, J = 9.27 Hz, J'= 2.82 Hz); 6.30 (1H, t); 6.97 (1H, d, J　=　9.13　Hz).

2'-O-(5''-O- 올레일디글리코오일 )- 파클리탁셀 4. 파클리탁셀과 올레일 디글리콜레이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.83 (1H, d, J = 7.0 Hz); 4.46 (1H, t, J = 7.96 Hz); 4.99 (1H, d, J = 8.45 Hz); 5.35 (2H, m); 5.60 (1H, d, J = 2.74 Hz); 5.70 (1H, d, J = 7.08 Hz); 6.05 (1H, dd, J = 9.25 Hz, J'= 2.55 Hz); 6.28 (1H, t, J = 8.9 Hz); 7.04 (1H, d, J = 9.29 Hz).

2'-O-(5''-O- 옥타데실디글리코오일 )- 파클리탁셀 5. 파클리탁셀과 옥타데실 디글리콜레이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.83 (1H, d, J = 7.0 Hz); 4.46 (1H, dd, J　=　10.74 Hz, J'= 6.70 Hz); 4.99 (1H, d, J = 8.45 Hz); 5.60 (1H, d, J = 2.82 Hz); 5.70 (1H, d, J　=　7.00 Hz); 6.05 (1H, dd, J = 9.25 Hz, J'= 2.55 Hz); 6.28 (1H, t, J = 8.9 Hz); 7.05 (1H, d, J　=　9.29 Hz).

2'-O-(5''-O- 코사닐디글리코오일 )- 파클리탁셀 6. 파클리탁셀과 코사닐 디글리콜레이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.83 (1H, d, J = 6.98 Hz); 4.0-4.4 (5H, m); 4.46 (1H, dd, J = 10.75 Hz, J'= 6.72); 4.99 (1H, d, J = 9.40 Hz); 5.60 (1H, d, J = 2.96 Hz); 5.70 (1H, d, J = 7.25 Hz); 6.05 (1H, dd, J = 9.27 Hz, J'= 2.82); 6.29 (1H, t, J = 8.3 Hz); 7.05 (1H, d, J　=　9.13 Hz).

2'-O-(5''-O- 도코사닐디글리코오일 )- 파클리탁셀 7. 파클리탁셀과 도코사닐 디글리콜레이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.83 (1H, d, J = 6.98 Hz); 4.0-4.4 (5H, m); 4.46 (1H, dd, J = 10.75 Hz, J'= 6.72 Hz); 4.99 (1H, dd, J = 9.40 Hz, J'= 1.61 Hz); 5.60 (1H, d, J = 2.96 Hz); 5.70 (1H, d, J = 6.98 Hz); 6.05 (1H, dd, J = 9.40 Hz, J'= 2.95 Hz); 6.28 (1H, t, J　=　8.3 Hz); 7.05 (1H, d, J = 9.40 Hz).

2'-O-(5''-O- 콜레스테릴디글리코오일 )- 파클리탁셀 8. 파클리탁셀과 콜레스테릴 디글리콜레이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.83 (1H, d, J = x Hz); 4.0-4.4 (5H, m); 4.47 (1H, dd, J = 10.6 Hz, J'= 6.8 Hz); 4.63 (1H, m); 4.99 (1H, d, J = 7.79 Hz); 5.38 (1H, d, J　=　3.76 Hz); 5.61 (1H, d, J = 2.69 Hz); 5.70 (1H, d, J = 7.25 Hz); 6.06 (1H, dd, J = 9.13 Hz, J'=　2.69 Hz); 6.28 (1H, t, J = 8.3 Hz); 7.09 (1H, d, J = 9.40 Hz).

2'-O-(5''-O-(1''',2'''- 디미리스토일 - sn - 글리세로 ) 디글리코오일 )- 파클리탁셀 9. 파클리탁셀과 3-(1,2-디미리스토일-sn-글리세롤) 디글리콜레이트로부터 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) d 3.84 (1H, d, J = 6.98 Hz); 4.47 (1H, dd, J = 10.6 Hz, J'= 6.8 Hz); 4.99 (1H, dd, J = 9.54 Hz, J'=　1.75 Hz); 5.20 (1H, m); 5.61 (1H, d, J = 2.96 Hz); 5.71 (1H, d, J = 7.25 Hz); 6.07 (1H, d, J　= 9.27 Hz, J'= 2.82 Hz); 6.31 (1H, t); 7.11 (1H, d, J = 9.40 Hz).

실시예 2

나노 입자 제형

프로드럭, 보조 지질 (co-lipid)과 폴리머 안정제 (보통 1:1:2 w/w 기준)을 40 mg/ml 농도의 에탄올/THF (4:1)에 용해시켰다. 상기 용매를 12/12/53/53 ml/분 (용매/물/물/물)로 유량을 맞춘 포 포트 (four port) CVIJ 혼합기¹³ ^,　¹⁴ 를 사용하여 물로 빠르게 희석시켰다. 유량은 하바드 장치 PHD2000 (Harvard Apparatus PHD2000) 시린지 펌프를 사용하여 조절하였다. 이어서, 잔여 용매를 제거하기 위하여 결과 용액을 물에 대하여 투석시켰다. 최종 약 농도는 보통 약 0.7 mg/ml이었다. 더 높은 농도가 요구될 때, 투석 용액을 600 mM 수크로오스와 동 부피로 투석하고, 이어서 연동 펌프가 구비된 100　kD, 0.5　mm 루멘, 60 cm 경로 길이 미드지 후프 카트리지 (MidGee hoop cartridge) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) 를 사용하여 농축시켰다. 입도를 말번 제타시커 나노 ZS 입도 분석기를 사용하여 측정하였고, 용적중(容積重) 데이터를 보고하였다.

제형은 각각 용매의 mL당 40 mg 농도인 프로드럭, 보조 지질 및 양친매성 안정제가 1:1:2의 중량 비율로 구성되었다. 더 높은 초기 농도 (>40　mg/mL)에서의 사용은 제조의 후속 공정 처리로 나온 큰 입자의 생산을 자주 야기시켰다. 보조 지질은 α-토코페롤-숙시네이트 (VES) 또는 가공을 용이하게 하는 POPC이다. VES는 4℃에서의 장기간 저장에서는 침전되기 때문에, 후 제형에서 VES는 POPC로 대체하였다. 폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리스티렌 (2kPS3k 또는 2.5kPS3k)는 양친매성 안정제로 사용하였다. 그 외, 기타 안정제도 사용할 수 있다. 플래쉬 침전 절차 (flash precipitation procedure)를 사용하여, 평균 입경은 프로드럭/VES/2kPS3k 나노 입자는 10 내지 20 nm, 프로드럭/POPC/2kPS3k 나노 입자는 20 내지 30 nm의 범위였다.

나노 입자 제형의 안정성은 4℃에서의 장기간 보관 후 HPLC로 모니터하였다.

나노 입자를 함유하는 시료 (50 mL)를 10분 동안 10000 x g에서 원심분리에 뒤이어 격렬히 교반하여 150 mL의 희석액 (메탄올:아세토니트릴, 2:1 v/v)과 혼합하였다. 상청액 (20 mL)을 227 nm에서 UV 탐지로 모니터되는 페노메넥스 시너지퓨젼 (Phenomenex SynergiFusion) 역상 분석 컬럼을 사용하여 수량화를 위해 워터 HPLC로 주입하였다. 크로마토그래피를 초기 용매 혼합이 각각 70:30 내지 100:0에서 메탄올과 10 mM 나트륨 아세테이트 버퍼 (pH 5.6)의 1 mL/분 기울기 용리로 수행하였다. 컬럼 온도는 30℃로 설정하였다. 시료는 HPLC 분석 전, 4℃의 오토샘플러 구획 (autosampler compartment)에 보관하였다.

완충되지 않은 300 mM 수크로오스 내에서 POPC/2kPS3k (1:1:2)로 제형화된 4, 5 및 6의 분석은 11주 저장 후, 유리 파클리탁셀이 5% 덜 존재함을 나타냈다. 그 농도에서의 유리 약물은 대조군 효능 실험에서 항암 활성이 없는 것으로 나타났다 (데이터는 나타내지 않았음). 따라서, 이 조사에서 수행되는 생체 내 실험을 위하여 안정성을 충분히 고려하였다.

수크로오스 용액 또는 4℃의 물에 저장한 나노 입자 제형은 외관 검사에 의하면 저장 1~2주 후 몇몇의 제형 조성물 내에 침전물이 형성된 8개는 제외하고, 3개월 동안 물리적으로 안정하다는 것이 발견되었다. 보조 지질로 VES를 사용한 제형도 차후 나노 입자 바깥쪽의 침전에 뒤이어 수상에서 VES 분할 때문인 것 같은 콜로이드 또는 결정 침전물의 느린 형성을 초래하였다. 따라서, VES 제형은 단기간의 연구에만 적합하며, 효능 평가 등의 장기 실험에는 적합하지 않다.

제형의 물리적 안정성은 프로드럭/보조 지질/2.5kPS3k (1:1:2) 나노 입자를 물, 150 mM 식염수 또는 300 mM 수크로오스에서 섞은 후, 입도의 변화를 조사하였다 (표 1). 이들 제형은 주로 20 내지 30 nm 나노 입자로 구성되었다. 이들 조건을 수행할 때, 물리적 압박을 받는 응집 또는 상 분리에 민감한 입자들은 그 결과 시료 내 더 큰 입자의 형성을 야기한다. 입도의 증가는 강하게 시료를 섞기 전 또는 후 동안, 평균 Z 값 (입자 분포의 강도 중량 평균 크기)을 측정하기 위하여 동적 광산란(Dynamic Light Scattering) 를 사용하여 모니터하였다. 덩어리 또는 침전에서 더 높은 농도를 나타내는 DZ_ave값이 더 높은 곳에서는, Z_ave값은 물리적 불안정에 의한 덩어리 또는 침전 형성에 대한 대리 정보로 사용되었다 (표 1). 보조 지질이 POPC인 나노 입자는 VES로 조제되거나 보조 지질이 없는 것 보다 염의 존재 하여서 상당히 더 안정적인 것을 발견하였다 (DZ_ave = 24, 5의 제형에 대하여 각각 372와 774　nm). 대개의 경우, 물리적 안정성은 물에 비하여 300 mM 수크로오스가 존재하는 곳에서 상당히 개선되었다. DZ_ave가 0 내지 40 nm인 수크로오스 시료는 마이크론 크기의 물질이 거의 없거나 없다 (시료의 <2%). 이러한 조건 (DZ_ave　=　100-200　nm) 하에서 물과 식염수 내에서 더 높은 덩어리를 생산하는 몇몇의 프로드럭 제형 (3과 9)는 수크로오스 (DZ_ave　=　0-40　nm)에서 안정적이었다. 상기 연구의 결과는, 최고의 안정성은 300 mM 수크로오스 내에서 제형화된 나노 입자 내에서 POPC를 보조 지질로 사용하여 얻을 수 있다는 것이다.

프로드럭 제형의 물리적 안정성. 모든 제형은 물 내에서 프로드럭/보조 지질/2.5kPS3k (1:1:2) 나노 입자로 제조되었다. 입도는 Malvern Nano-ZS 입도 분석기로 측정한 가중 평균 (volume weighted average)이다. 안정성은 30초 동안 섞은 후, 동량의 물, 300 mM 식염수 또는 600 mM 수크로오스로 희석된 시료의 Z_ave (Z_ave)의 변화를 측정함으로써 평가하였다.

프로드럭	보조 지지질	입도 (nm)	DZ_ave (nm) 물	DZ_ave (nm) 150　mM 식염수	DZ_ave (nm) 300　mM 수크로오스
2	POPC	26	20	43	10
3	POPC	24	125	55	42
4	POPC	22	15	25	5
5	POPC	21	20	24	7
6	POPC	23	21	26	36
7	POPC	23	18	24	0
8	POPC	23	47	42	41
9	POPC	23	167	171	0
5	VES	7	3	372	10
5		28	109	774	71

시료들로 큰 시료 제조를 위하여 필요한 정상적인 공정 단계를 수행할 때, 유사한 결과가 얻어졌다. 물 내에서 또는 VES 를 갖거나 보조 지질이 없도록 제형화된 나노 입자는 정용 여과를 사용하는 농축 단계 동안, 물리적 압박에 노출되고 상당한 침전물 형성을 보일 때 안정적이지 않았다. 농축 전, 300 mM 의 최종 농도를 위하여 수크로오스를 갖는 나노 입자 용액을 희석함으로써 제형을 농축하는 동안의 안정성이 개선될 수 있다. 더 이른 안정성 연구의 결과와 일치하게도, 보조 지질로서의 POPC 사용은 보관과 가공 후 형성 동안의 물리적 안정성의 추가 개선을 제공하였다. 이 연구에서 연속적으로 사용된 농축된 시료 모두는 보조 지질로서는 POPC 를 기반으로 하였고, 300 mM 수크로오스 내에서 제조되었다. 이러한 조건들 하에서, 침전 형성은 8 mg / mL 의 약 농도까지는 무시해도 될 정도였다.

에스테르 결합의 상대적인 불안 정도에 기반하여 예측될 수 있는 바와 같이, 디글리콜레이트 결합은 숙시네이트 결합보다 가수분해에 더욱 민감하다는 것을 발견하였다. 디글리콜레이트 결합의 증가된 반응성은 생물학 시료 내의 프로드럭의 정확한 분석에 있어서의 추가적인 어려움을 제기하였다. 메탄올: 아세토니트릴 1:4 (v:v)는 거의 완전한 혈장 단백질의 침전과 나노 입자로부터의 프로드럭의 유리에 효과적이었다. 그러나 시간에 따른 유리 파클리탁셀의 점진적인 증가가 혈장 시료의 가공 후, 매트릭스 정밀검사와 HPLC 분석 동안의 가수분해를 나타내는 것으로 관찰되었다. 68시간 후 대략 25%까지 숙시네이트 프로드럭 2가 소비되는 동안, 디글리콜레이트 프로드럭 6은 9시간 후 완전히 가수분해되었다. 가수분해는 상기 시료가 pH4 인 아세테이트로 완충되었을때 관찰되지 않았다. 혈장이 없는 6/POPC/2kPS3k의 완충되지 않은 시료는 이러한 가수분해를 나타내지 않고, 이들 제형의 프로드럭의 시간 의존 가수분해는 아마 침전되지 않는 혈장 성분의 존재 때문임을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 프로드럭이 입자 내에 있을 때 안정적이고, 생물학적 매체 내의 가수분해는 프로드럭의 해리 후에 일어난다는 것을 제시한다.

실시예 3

시험관 내 활성

MCF-7 인간 암 세포주를 American Type culture Collection (매나사스, VA)에서 구입하였다. A2780 인간 암 세포주는 European Collection of Cell culture (UK)에서 구매하였다.

16 농도에서 72시간 동안 세포를 프로드럭/POPC/2.5kPS3k (1:1:2) 나노 입자 제형의 단계별 희석에 3차례 노출시켰다. 생존 가능한 세포를 DMSO 첨가 후 570 nm에서 표준 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT) 검출 장치를 사용하여 정량하였다. 처리 후 생준율을 미처리 대조군 웰에 대한 평균 퍼센트로 표현하였다.

프로드럭 세포독성의 평가는 A2780과 증류수에서 제조된 프로드럭/POPC/2.5kPS3k (1:1:2) 제형으로 처리한 MCF-7 인간 암 세포를 사용하여 수행하였다 (표 2). 프로드럭을 함유하지 않는 대조군 제형은 다른 나노 입자 성분이 세포의 생장의 억제에 공헌하지 않는다는 것을 분명히 하였다. 또한, 1은 관찰된 활성이 사용된 제형의 종류와는 독립적이었음을 보여주기 위하여 다수의 서로 다른 나노 입자 제형 (1/VES/2kPS3k; 1/2kPS3k 및 1/크레모퍼)을 사용하여 평가하였다.

프로드럭/POPC/2kPS3k (1:1:2) 제형들을 사용한 인간 암 세포주의 억제

	IC₅₀ 값 (nM ±SD)
화합물	A2780	MCF-7
파클리탁셀	2.4 ±0.3	3.8 ±0.6
1	192 ±18	158 ±72
2	75.1 ±3.9	67.0 ±5.9
3	25.3 ±1.3	13.4 ±2.4
4	8.4 ±1.4	15.9 ±0.7
5	20.9 ±10.9	1.1 ±1.5
6	29.0 ±1.3	16.6 ±4.5
7	29.5 ±5.2	23.5 ±1.3
8	27.0 ±1.1	24.1 ±0.6
9	34.7 ±1.3	32.2 ±1.3

숙시네이트로 결합된 프로드럭 (1과 2)은 A2780과 MCF-7 세포에 대한 유리 파클리탁셀 보다 중요도의 순서가 ~1-2로 덜 강하다는 것을 알았다. 이러한 경향은 대부분의 시험된 세포 주에서 관찰되었다. 관찰된 활성의 감소는 가수분해에 대한 숙시네이트군의 저항 결과와 비슷한 것 같았다. 차후 프로드럭 (3-9)은 3-옥사기의 존재 때문에 가수분해에 더욱 민감할 것으로 예상되는 디글리콜레이트 링커 모이어티로 제조하였다. 디글리콜레이트 프로드럭들 모두는 생장 억제 분석 (~20 nM)에서 유사한 효능을 나타냈고, 파클리탁셀 양성 대조군에 비하여 한 자릿수가 덜 강하였다. 숙시네이트 유사체는 항상 상응하는 디글리콜레이트 프로드럭보다 효능이 약했다. 예를 들면, A2780 세포주에서 숙시네이트 프로드럭 1과 디글리콜레이트 프로드럭 3의 IC₅₀값은 파클리탁셀에 대한 값이 2.4 nM인 것에 비하여 각각 192 nM과 25.3　nM이었다. 숙시네이트 2와 디글리콜레이트 4가 각각 75.1과 28.4 nM의 IC₅₀ 값을 가지는 것과 비슷하다. 이들 결과는, 파클리탁셀, 2'-O-헥사데카노일파클리탁셀과 2'-(2''-브로모헥사데카노일)파클리탁셀에 대한 MCF-7 유방암 세포주에서의 IC₅₀값이 각각 <1,8600과 70 nm 이라고 보고된 관련 화합물의 문헌 보고와 일치한다.

실시예 4

생체 내 나노 입자 혈장 제거

무흉선 누드 마우스 (athyic nude mice) (n=3/시점)에 테스트 시료 (10 ml/체중g, 최대250 ml까지)를 생체 내로 주입하였다. 심장천자로 지정된 시점에서 혈액을 수집하고, 마이크로테이너 (microtainer) 튜브 (BD 바이오사이언스)로 코팅된 EDTA 내에 두었다. 상기 튜브는 10분 동안 2800 rpm에서 원심분리하였다. 혈장을 회수하고, 50 ml의 분취액을 약물 함량을 위하여 HPLC로 분석하였다. ³H-CHE (50 ml)를 함유하는 시료를 PicoFluor40^TM 신틸레이션 계수기 (Packard)로 희석하고, Beckman-Coulter LS　6500 다목적의 신틸레이션 계수기로 계수하였다. 혈액 구획 내의 마우스 당 총 약 (계수)을 체중의 그람당 0.04125mL의 혈장 부피로 추정하여 계산하였다.

지질계 입자 제형의 지질 약제의 분할 속도는 일반적으로 벌크 수상에 대한 약제 케리어계의 투석으로 검출하였다. 이러한 환경 하의 약제의 낮은 수성 용해성은 투석막을 통한 용출보다 케리어 시스템으로 되돌아가는 제약 분할의 높은 개연성을 야기하고, 인위적으로 낮은 분명한 불할 속도를 야기한다. 그러한 실험 투여량은 생체 내의 소수성 약제에서 관찰된 행동을 정밀하게 반영하지는 않는다. 유리 약제는 운반 베히클로 돌아가기 보다는 큰 소수성 비축이 존재하는 장소 (예를 들면, 세포막 또는 지질 단백질)로 급격히 분할될 수 있다. 따라서, 투석 실험은 이러한 제형들의 진정한 운반 가능성을 왜곡한다. 생체 내에서의 진정한 분할율의 가장 정확한 측정 수단은 나노로 교환 가능한 마커를 사용하여 약제와 입자를 모두 추적하는 것이다. 결과적으로, 그러한 마커를 동정하고, 그것입자 약물 동력학을 반영하는지 확인할 것이 요구되었다.

약제와 입자 둘 다를 추적하는 제거 연구는 생체 내에서의 프로드럭의 분할 행동의 더욱 정확히 설명을 얻기 위하여 수행되었다 (도 1). HPLC에 뒤이어 프로드럭을 제거하고, 입자 제거율은 3중 콜레스테릴헥사데실 에테르(³H-CHE)로 라벨링한 나노 입자로 결정하였다. 이 라벨은 그러한 시스템 내에서는 교환가능하지 않고, 대사될 수 없는 지질 마커로 간주되기 때문에, 생체 내 리포솜을 추적하기 위하여 광범위하게 사용되었다. 이분자의 소수성과 낮은 농도의 수화(水和)는 이 연구에서 사용된 나노 입자의 낮은 분할율을 야기하고, 따라서 입자 순도가 유지되도록 제공되는 입자 분해과정의 평가를 제공할 수 있다.

다수의 실험을 상기 추정의 유효함과 거의 정확한 입자 혈장 제거율을 측정하기 위하여 수행하였다. 1/VES/2kPS3k (1:1:2)와 2/VES/2kPS3k (1:1:2) 으로 구성된 제형들을 소량의 ³H-CHE으로 라벨화하고 상기 라벨과 프로드럭의 혈장 농도를 Foxn1^nu 마우스에서 모니터하였다 (도 1, 패널 A). 두 그룹에서 동일한 속도, 대략 24시간의 반감기로 ³H-CHE 라벨을 제거하였다. 2를 상당히 빨리 제거하는 동안, 이 시스템 내에서 ³H-CHE과 거의 동일한 속도로 프로드럭 1을 제거하였다. 프로드럭/³H-CHE 비율 (도 1, 패널 B)의 비교는 분할 반감기는 실험 기간보다 확연히 길었음을 제시하며, 실험 과정 동안 입자 라벨에 대한 1의 비율이 사실상 변하지 않는다는 것을 보여주었다. ³H-CHE에 대한 프로드럭 2는 대략 4시간의 분할 반감기와 일치한 속도로 감소하였다. 상기 실험에서의 데이터는 아마도 각 입자의 분할된 약제로서 일부 환경 변화에 따라 분할 속도가 시간에 따라 일정하게 변하는 것을 의미하는 4개의 매개 변수 이중 지수형 붕괴에 들어맞을 수 있다.

제거에 있어서 제형 조성물의 효과를 생체 내에서 1/2kPS3k, 1/POPC/2kPS3k 및 ³H-CHE 로 라벨화된 1/VES/2kPS3k (1:1:2) 제형들을 사용하여 1과 ³H CHE의 혈장 제거를 비교함으로써 측정하였다 (데이터는 나타내지 않았다). 3개의 제형 모두에 대하여, 라벨과 프로드럭 제거율은, 이러한 제형들 내의 1의 제거율에서의 보조 지질의 역할이 거의 없거나 없는 것으로 나타나는 도 1의 1에서 관찰된 바와 비슷한 것으로 발견되었다. 추가적인 제거 연구를 프로드럭을 함유하지 않는 ³H-CHE로 라벨화된 2kPS3k 마이셀과 POPC/2kPS3k (1:2) 을 사용하여 수행하였다 (데이터는 나타내지 않았다). 두 경우에서, ³H-CHE 라벨은 도 1의 1에서 관찰된 바와 대략 동일한 속도로 제거하였다. 마지막으로, 1/VES/3kPS3k와 1/VES/2.5kPS1.6k 제형을 사용한 연구는 폴리 안정화제 (에틸렌 글리콜)/폴리스티렌 비율에서 보통의 변화가 도 1에서 나타난 것에 비하여 1의 제거에 거의 효과가 없음을 나타냈다 (데이터는 나타내지 않았다).

이러한 제형에서의 1의 제거는 보조 지질과 안정제 조성물과 독립적인 것으로 발견되었고, 시간에 따른 ³H-CHE 마커의 손실과 상응하였다. 이들 결과는 ³H-CHE 라벨이 약물 동력학 실험에 걸쳐 입자에 잔여하며, 입자의 조성 내 변화에 독립적이라는 것을 제시한다. 이러한 입자들에 대한 순환 반감기는 특히 길고 (대략 24시간), 이들 농도에서의 기타 폴리머를 사용하여 제조된 마이셀에 대하여 10배 길고, 긴 순환 리포솜으로 관찰된 것과 비슷하다는 것이 보고되었다.

혈장 약제 제거에서의 프로드럭 분할 효과를 측정하였다. 서로 다른 프로드럭 컨쥬게이트에 대한 제거율을 측정하기 위하여, 상기 프로드럭 패널을 Foxn1^nu 마우스 내에서 프로드럭/POPC/2kPS3k (1:1:2) 나노 입자를 사용하여 스크린하였다 (도 2). 프로드럭 순환 농도는 초기 프로드럭 분할율에 의존하는 것으로 나타났고, 결과적으로 속도를 간접적으로 반영하는데, 상기 입자들이 실험 과정 동안 온전하게 유지되도록 충분히 안정적이기 때문이다. 컨쥬게이트는 0.7　mg/mL의 농도에서 제형화되었다. 농도 변화는 입자 제거율에 영향을 미치는 것으로 나타나지는 않았는데, 1/VES/2.5kPS1.6k (1:1:2)의 혈장 제거가 3-25 mg/kg 범위에 걸친 복용량과 크게 독립적이었기 때문이다 (데이터는 나타내지 않았음).

각 프로드럭의 분할 반감기를 측정하기 위하여, 상기 기술한 결과물에 근거하여 1은 입자 제거율을 추적하였다. 이어서, 모든 기타의 프로드럭의 제거를 4개의 매개변수 이중 지수형 붕괴 커브에 맞추고 1에 대하여 정상화하였다. 제형 내의 프로드럭의 존재 또는 부재는 약제가 분할되는 시간 경과 따른 조성물 내의 변화는 입자 제거율에는 영향을 나타내지 않아 입자의 제거 행동에 상당한 영향은 없었다. 따라서, 1로 정상화된 프로드럭 제거는 이러한 제형 내의 프로드럭의 상대적인 분할 반감기의 상당히 비슷하게 산출되었다.

이 조성물 내에서 2가 대략 1.7 시간의 반감기로 분할된 사실이 있으므로, 프로드럭 1은 24시간에 걸쳐 무시해도 될 정도의 분할 속도를 가진다. 이러한 둘 다의 프로드럭은 숙시네이트 가교제로 사용되고 시험관 내에서 파클리탁셀보다 상당히 덜 활동적이다. 이러한 화합물들 (3과 4 각각)의 디글리콜레이트 버젼은 각각 대략 13시간과 1시간의 분할 반감기로, 그들의 숙시네이트 모체에 비하여 가속화된 제거를 나타낸다. 이는 디글리콜레이트 결합의 3-옥사기의 존재 때문에 수상 내로의 분할에서 증가된 수화 농도와 이ㅊ치한다.

지질 앵커의 크기에 대한 작은 변화의 효과는 각각 올레일 (DC18), 스테아릴 (C18), 코사닐 (C20), 그리고 도코사닐　(C22) 모이어티를 갖는 시리즈 4, 5, 6, 그리고 7을 사용하여 측정하였다. 도 2의 결과물에 근거하여, 우리는 이들 프로드럭에 대한 분할 반감기가 각각 1시간, 1.7시간, 6.5시간, 그리고 10시간임을 측정하였다. 이들 결과는 나노 입자로부터의 프로드럭 방출이 사용된 알킬 앵커의 길이를 조정함으로써 조절될 수 있음을 나타낸다.

분할 운동에 있어서의 기타 일반적인 지질 종류의 효과를 또한 조사하였다. 콜레스테릴 디글리콜레이트 컨쥬게이트 (8)를 직쇄 지방족 화합물 종류보다 상당히 더 길게, 대략 21시간으로 측정된 분할 반감기로 유지하였다. 유감스럽게도, 8은 저장에서 나노 입자로부터 상 분리가 쉽고, 이 작업에 있어서 이후의 효능 연구에서 충분히 측정되지 않았다. 1,2-디미리시스토일-sn-글리세로-3-숙시네이트 유도체 (9) 는 2개의 C14 앵커를 가지기 때문에 7보다 더 잘 유지될 것으로 예측 평가되었지만, 8.5 시간의 반감기로 더 빨리 분할되었다. 더 높은 분할율은 나노 입자의 교환 동안 글리세롤 백본의 증가된 수화 농도 때문인 것 같다.

실시예 5

생체 내 효능

암컷 무흉선 누드 마우스 (7 내지 8주)를 26 게이지 바늘 (gauge needle)을 사용하여 100 ml HT29 인간 클론 암 세포 (2x 10⁶ 세포)에 접종하였다. 첫 번째 처리 전, 80과 120 mg 사이의 평균 종양 크기를 갖는 마우스를 무작위로 그룹화하였다 (n=6/그룹). (200mg보다 크고, 30 mg보다 작은 종양은 제외하였다.) 시험 시료를 10ml 약/체중g의 부피로 최대 250 ml으로 주입하였다. 정해진 스케쥴에 따라 순차적인 주입을 수행하였다. 종양 길이와 폭을 측정, 체중과 생활 관찰을 1주에 2 내지 3회 기록하였다. 종양 무게는 식　(L　x　W²)/2에 따라 계산하였다. 1, 2, 4, 5, 6 과 7의 나노 입자 제형의 상대적인 효능을 Q4Dx6 스케줄에 따라 36 μmol/kg 복용량을 사용하여 HT29 모델에서 측정하였다 (도 3). 식염수를 음성 대조군으로 사용하였다. 최대하 복용량으로 수행한 이른 실험들은 이들 복용량이 양성 대조군과 음성 대조군의 반응 분할 범위를 야기하고, 이러한 방법은 개별 프로드럭 종의 상대적인 치료 효능의 안목을 허락할 것이다. 프로드럭 8은 저장 동안 제형의 약제 침전 때문에 이 연구에 포함시키지 않았다. 프로드럭 3과 9는 6 및 7과 유사한 분할 반감기 때문에 생략하였다.

2개의 숙시네이트로 결합된 프로드럭 1과 2는 34 μmol/kg에서 임의의 치료 활성의 증가를 나타내지 않았다. 상기 결과는 이들 프로드럭이 시험관 내 세포 성장 억제 분석에서 파클리탁셀보다 10 내지 20배 효능이 덜하였음이 관찰된 것과 연관된다 (표 2). 2와 1의 분할 반감기는, 2는 1.7 시간에서 1은 실험적 시간에서 효과적으로 교환가능하지 않는 것까지 폭넓게는 상이하다. 이들 결과는 비록 숙시네이트로 결합된 종 2는 세포에 이용할 수는 있지만, 더 낮은 가수분해율과 파클리탁셀의 수반 방출이 의미있는 치료 반응을 제공하기에는 불충분하다는 것을 나타낸다.

예비의 생체 내 입자 분포 연구는 , 처음 8시간 내에 발생한 축적의 대부분이 종양 조직의 그람당 주입된 복용량이 ~3%에서 종양 축적 농도가 유지된다는 것을 나타낸다. 유사한 결과가 문헌에서 보고된 바 있다. 분할 반감기가 각각 대략 1시간과 1.7시간인 4와 5 등의 프로드럭의 경우에 있어서, 종양으로 전달되는 약 농도가 상당히 더 낮을 것으로 예상되는데, 이는 이들 종에서 관찰된 감소된 효능의 이유인 것 같다. 프로드럭 6과 7은 각각 대략 6.5 시간과 10시간이라는 분할 반감기인 더 늦은 속도에서 약을 방출한다. 종양 내에서의 입자 축적이 모든 경우에서 유사한 것으로 기대되기 때문에, 이들 프로드럭을 갖는 제형들은 종양으로 더 많은 약제를 전달할 수 있다.

4개의 디글리콜레이트가 연결된 종인 4, 5, 6 그리고 7은, 모두 다양한 종양 생장 저해 정도를 야기하였다. 시험관 내의 이들 프로드럭의 생장 저해 연구들은 그들의 숙시네이트 유사체보다 글리콜레이트로 연결된 프로드록의 세포 독성이 더 크다는 것을 증명하였다 (표 2). 이들 제형에 대한 제거 데이터는 지방족 사슬 길이가, 각각 1시간, 1.7시간, 6.5시간, 그리고 10시간이라는 프로드럭의 분할 반감기와 관련된다는 것을 나타냈다. 이는 관찰된 효능 경향과 연관성이 있는데, 가장 큰 항종양 반응은 가장 긴 분할 반감기를 갖는 프로드럭, 즉 도코사닐 컨쥬게이트 7에서 나타났다. 상대적 효능은 평균 종양 크기가 500 mm³에 도달하도록 지연을 유도한 치료를 사용하여 측정하였는데, 각 산출값은 3, 4, 15 그리고 17일이었다. 이들 결과물에 기초하여, 제형 7이 나노 입자를 사용하여 복용량과 일정을 최적화하기 위한 추가 조사 연구를 수행하였다.

실시예 6

7의 효능의 복용량 효과

파클리탁셀에 대한 POPC/2.5kPS3k 나노 입자 제형에서의 7의 활성을 HT29 종양 모델 내에서 파클리탁셀과 동량의 0.25 내지 3 몰 범위의 복용량의 효능을 비교함으로써 측정하였다 (도 4). Q2Dx5 스케줄에 따라 23 mmol/kg으로 복용한 Taxol^®을 양성 대조군으로 사용하였다. Q2D 스케줄에서 7이 가장 큰 효능이 있는 것으로 관찰되었기 때문에, 상기 복용 계획이 선택되었고, 또한 Taxol^®에 최적이었고, 이 Taxol^®복용에서 최대 관용 치료 코스는 5 주입이었다. 이 스케줄에서의 7의 최대 관용 복용은 대략 3 파클리탁셀 동량 (69μmol/kg)이었다.

7의 복용량을 측정하기 위한 2가지 방법에 따라 분석된 종양 성장 데이타는 Taxol^®양성 대조군에 대하여 동량일 수 있다. 첫 번째 방법에서, 종양 퇴행을 야기하는 치료군만 고려하였다. 125 mg의 종양 크기로의 도달 지연이 치료 시작에서 측정되었고, 이어서 Taxol^®군에 대하여 관찰된 지연에 대하여 정상화되었다. 7의 MTD까지 선형 복용 반응을 나타내는 데이터를 산출하는, 7과 동량의 파클리탁셀의 복용에 대한 상대적인 지연을 좌표로 나타냈다. 상기 곡선 접합은 7이 파클리탁셀과 동량의 1.75 복용량에서 Taxol^®과 동등하게 수행하였음을 나타낸다. 상기 두 번째 분석에서, 300 mg의 종양 크기로의 도달 지연은 식염수 음성 대조군에 대하여 측정하였고, 이어서 Taxol^®군에서 관찰된 지연에 대하여 정상화되었다. 7과 동량의 파클리탁셀 복용량에 대한 상대적인 지연 플로팅 (plotting)은 7과 동량의 1.65 파클리탁셀로 달성한 Taxol^®군과 동등함을 나타낸 선형 복용량 반응을 다시 산출하였다. 중요하게도, 7의 나노 입자 제형이 그것의 MTD (69 μmol/kg)과 동량의 2 몰 파클리탁셀 (69 μmol/kg)로 투여될 때, 항종양 활성이 MTD에서 투여된 Taxol^®로 수행된 것보다 상당히 더 컸다. 구체적으로, MTD에서 7의 나노 입자 제형으로 치료된 종양은 60일 동안 50 mg 이하로 유지된 반면, MTD에서 Taxol^®로 치료된 종양은 거의 300mg까지 성장하였다 (도 4).

도 5는 Taxol^TM과 동등하게 도달한 7의 동등한 파클리탁셀의 수의 계산을 나타낸 것이다.

7 나노 입자의 효능에서의 복용량 효과는 Taxol^®에 대하여 평가하였다. 최적의 치료 반응은 HT 29 고체 종양 모델에서 Q2D 투여에서 관찰되었다. 7 그 자체는 약 10시간의 분할 반감기를 가지지만, 7을 제형하기 위하여 사용된 나노 입자들은 대략 24 내지 36시간의 제거 반감기를 가진다. 이들 값은, Q2D 스케줄과 동시에 일어나는 투약 후 대략 2일의 기간에 걸친 종양 부위에서의 프로드럭의 효과적인 방출과 일관된다. MTD에서 Taxol^®에 대한 0.25x 내지 3x 파클리탁셀 동량을 통한 약 복용량의 적정은 7이 대략 1.7 파클리탁셀 동량에서 동등한 효능을 수행하였음을 나타냈다. 7에 대한 상기 복용량 반응이 MTD까지 선형적 증가하기 때문에, 더 높은 복용량의 7을 사용하여 Taxol^®의 최대 관용 복용량에 대한 상당히 효능을 개선하는 것이 가능하다. 나노 입자에서 7보다 더 잘 유지되는 프로드럭은 7에서 나타나는 것보다 심지어 더 적은 복용량으로도 동등하게 성취할 수 있다.

참조문헌

(1) Hennenfent, K.L.; Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?, Ann . Oncol. 2006, 17, 734-749

(2) Hamaguchi, T.; Matsumura, Y.; Suzuki, M.; Shimizu, K.; Goda, R.; Nakamura, I.; Yokoyama, M.; Kataoka, K.; Kakizoe, T. NK105, a paclitaxel-incorporating micellar nanoparticle formulation, can extend in vivo antitumor activity and reduce the neurotoxicity of palitaxel, Br . J. Cancer 2005, 92, 1240-1246

(3) Ansell, S. Lipophilic drug derivatives for use in liposomes. U.S. Patent 5,534,499 1996

(4) Hostetler, K.Y.; Sridhar, N.C. Prodrugs for oral administration containing Taxol covalently bound to a phospholipid. U.S. Patent 5,484,809 1996

(5) Stevens, P.J.; Sekido, M.; Lee, R.J. A folate receptor-targeted lipid nanoparticle formulation for a lipophilic paclitaxel prodrug. Pharm . Res. 2004, 21, 2153-2157

(6) Perkins, W.R.; Ahmad, I.; Li, X.; Hirsh, D.J.; Masters, G.R.; Fecko, C.J.; Lee, J.K.; Ali, S.; Nguyen, J.; Schupsky, J.; Herbert, C.; Janoff, A.S.; Mayhew, E. Novel therapeutic nano-particles (lipocores): trapping poorly water soluble compounds. Int . J. Pharm. 2000, 200, 27-39

(7) Ali, S.; Ahmad, I.; Peters, A.; Masters, G.; Minchey, S.; Janoff, A.S.; Mayhew, E. Hydrolyzable hydrophobic taxanes: synthesis and anti-cancer activities. Anticancer Drugs 2001, 12, 117-128

(8) Lundberg, B.B.; Risovic, V.; Ramaswamy, M.; Wasan, K.M. A lipophilic pacltaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J. Control . Release 1003, 86, 93-100

(9) Rodrigues, D.C.; Maria, D.A.; Fernandes, D.C.; Valduga, C.J.; Couto, R.D.; Ibanez, O.C.M.; Maranhao, R.C. Improvement of paclitaxel therapeutic index by derivatization and association to a cholesterol-rich microemulsion: in vitro and in vivo studies. Cancer Chemother . Pharmacol . 2005, 55, 565-576

(10) Zakharian, T.Y.; Seryshev, A.; Sitharaman, B.; Gilbert, B.E.; Knight, V.; Wilson, L.J. A fullerene-paclitaxel chemotherapeutic: synthesis, characterization and study of biological activity in tissue culture. J. Am . Chem. Soc . 2005, 127, 12508-12509

(11) Bradley, M.O.; Webb, N.L.; Anthony, F.H.; Devanesan, P.; Witman, P.A.; Hemamalini, S.; Chander, M.C.; Baker, S.D.; He, L.; Horwits, S.B.; Swindell, C.S. Tumor targeting by covalent conjugation of a natural fatty acid to paclitaxel. Clin . Cancer Res. 2001, 7, 3229-3238

(12) Deutsch, H.M.; Glinski, J.A.; Hernandez, M.; Haugwitz, R.D.; Narayanan, V.L.; Suffness, M.; Zalkow, L.H. Synthesis of congeners and prodrugs. 3. Water-soluble prodrugs of taxol with potent antitumor activity. J. Med . Chem . 1989, 32, 788-792

(13) Johnson, B.K.; Prud'homme, R.K. Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer. Aust. J. Chem . 2003, 56, 1021-1024

(14) Johnson, B.K.; Prud'homme, R.K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Phys . Rev . Lett . 2003, 91, 118302

(15) Fetterly, G.J.; Straubinger, R.M. Pharmacokinetics of paclitaxel-containing liposomes in rats, AAPS PharmSci 2003, 5, 1-11

(16) Sparreboom, A.; Scripture, C.D.; Trieu, V.; Williams, P.J.; De, T; Yang, A.; Beals, B.; Figg, M. Hawkins, W.D.; Desai, N. Comparative preclinical and clinical pharmacokinetics of a cremophor free, nanoparticle albumin-bound paclitaxel (ABI-007) and paclitaxel formulated in cremophor (Taxol). Clin . Cancer Res. 2005, 11, 4136-4143

(17) Sparreboom, A.; van Zuylen, L.; Brouwer, E.; Loos, W.J.; de Bruijn, P.; Gelderblom, H.; Pillay, M; Nooter, K.; Stoter, G.; Verweij, J. Cremophor EL-mediated alteration of paclitaxel distribution in human blood: Clinical pharmacokinetic implications. Cancer Res. 1999, 59, 1454-1457

Claims

글리콜레이트 링커를 통하여 소수성 모이어티에 결합된 탁산 (taxane)의 컨쥬게이트이고, 지질 및/또는 양친매성 안정화제와 결합된, 탁산의 프로드럭으로부터 형성된 나노 입자 또는 마이셀을 포함하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로드럭은 지질과 양친매성 안정화제와 결합된 것인 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탁산은 파클리탁셀 (paclitaxel)인 것인 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 소수성 모이어티는 장쇄 알코올, 토코페롤 또는 스테로이드에서 유래된 것인 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 지질은 인지질 또는 토코페롤인 것인 약학 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 양친매성 안정화제는 공중합체인 것인 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 공중합체는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리스티렌을 포함하는 것인 약학 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항의 조성물은 탁산 조성물의 약물 동력학을 모방하도록 제제된 추가의 항종양제를 더 함유하는 것인 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에게 탁산을 투여하는 방법.
제9항에 있어서, 탁산 조성물의 약물 동력학을 모방하도록 제제된 추가의 항종양제를 투여하는 것을 더 포함하는 것인 탁산을 투여하는 방법.
조절류를 사용하여 밀폐 공간 내에서 물과 상기 프로드럭, 지질 및/또는 양친매성 안정화제를 함유하는 혼합성 용매를 신속히 혼합하는 것을 포함하는 제1항의 조성물을 제조하는 방법.