CN104208079A - 磷脂酶a2敏感的甘油骨架抗肿瘤前药及其高度分散制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘油骨架抗肿瘤前药，其分子结构是1位长链烷基醚，2位共轭亚油酰，3位磷酰核苷的甘油骨架。因为肿瘤组织高表达磷脂酶A2，所以甘油骨架抗肿瘤前药有肿瘤环境特异性，可在肿瘤部位释放出多个对肿瘤细胞有活性的成分，它们联合发挥药效，能获得高效的抗肿瘤效果。核苷类抗肿瘤药的原药选自阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、氟达拉滨，以及它们的衍生物。甘油骨架抗肿瘤前药可制备成脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米粒、纳米乳或自组装传递系统等高度分散制剂。

Description

磷脂酶A2敏感的甘油骨架抗肿瘤前药及其高度分散制剂

技术领域

本发明涉及生物医药学领域，特别涉及磷脂酶A2敏感的甘油骨架抗肿瘤前药及其高度分散制剂。

背景技术

药物传递系统(drug delivery systems，DDS)是现代药剂学中的一个新概念，主要包括口服缓控释系统、透皮给药系统和靶向药物传递系统。靶向药物传递系统一般是通过血管注射给药，将药物传输至某特定组织或部位的系统，可靶向到肝、脑、肿瘤等，其中研究最多的是肿瘤靶向给药系统。肿瘤组织的微环境具有特殊性，包括一般pH值低(呈弱酸性，pH约为6.5)，周围有过度表达的酶，核心微环境缺氧，细胞表面有特异性表达受体等。分泌型磷脂酶A2(sPLA2)在许多肿瘤中过表达，且sPLA2能够特异性水解磷脂sn-2位酯键。肿瘤靶向给药系统可针对肿瘤特异性设计，包括pH敏感型、酶敏感型、光敏感型及受体介导型等。

脂质体、纳米粒、微乳等纳米给药系统作为肿瘤靶向药物载体是根据肿瘤的增强渗透与滞留效应(enhanced permeation and retention effect，EPR effect)设计的。EPR效应在1986年由前田浩教授提出，主要是指肿瘤细胞分泌的血管渗透因子(vascular permeability factor)比正常细胞多，造成肿瘤附近血管内皮细胞间隙比正常血管大，纳米药物载体更易渗透进入肿瘤组织。另一方面肿瘤组织内淋巴系统被破坏，使其附近淋巴循环受限，造成渗透进入肿瘤内部的纳米载体能长时间滞留在肿瘤组织内。利用EPR效应能够使粒径小于200nm的纳米粒和生物大分子实现肿瘤特异靶向。目前市场上的盐酸多柔比星脂质体注射液、紫杉醇白蛋白纳米粒注射液均发挥出较好的肿瘤靶向作用。

脂质体(Liposomes)是一种由磷脂双分子层构成的囊泡(Vesicles)，是一种可以在水溶液中高度分散制剂，可作为多种药物载体。它的高度分散性使其在体内具有靶向、缓释等效果，口服具有淋巴趋向性，较易携带药物穿越血脑屏障，容易通过融合、内吞等途径进入细胞内。修饰后的磷脂组成的脂质体还可以有体内长循环、温度靶向、pH靶向、磁靶向、主动靶向等功能。脂质体的局部(眼、鼻、皮肤)给药有生物相容性好、促进药物渗透的作用。脂质体囊泡的磷脂双分子层膜将内部包裹的水相和外部水相隔开，双分子层内呈疏水性。药物根据其物理化学性质的不同分别包裹在内水相或膜中。一般地，水溶性药物在内水相中；脂溶性药物在膜层中。脂质体的制备是磷脂分子在水中自组装的过程，内外水相的体积比例不能很大。这些因素决定了大部分水溶性药物的包裹率低(＜50％)，有时还会很低(5％)，并且包裹的药物有渗漏到外水相的可能。如果有合适的脂溶性基团(如脂肪链)，脂溶性药物分子就可插入到磷脂双分子层中，结合比较牢固，药物分子不容易脱掉，所以药物的包裹率较高。因此为了增加某些水溶性药物在脂质体中的包裹率，人们往往采用了制备成带有长脂肪链的脂溶性前体药物的方式。

非离子表面活性剂囊泡(Niosomes)是指某些非离子表面活性剂(如司盘60)在一定条件下在水中自组装成囊泡结构，类似脂质体。它同样可以作为药物载体，具有类似脂质体的一些体内外特征。纳米粒(Nanoparticles)一般指是纳米级分散的固体粒子，由于其高度分散性，可作为药物载体，有提高药物生物利用度、增强靶向性等特点。固体脂质纳米粒(SLN)采用人体相容的脂质材料作为主要辅料形成纳米粒，具有普通纳米粒的特点和生物相容性好的特点。纳米乳(Nanoemulsions)是指粒径在200nm以下的乳滴组成的体系，可以将脂溶性药物包裹在乳滴中。由于其高度分散性，它作为药物载体同样有提高药物生物利用度、增强靶向性等特点。

发明内容

本发明公开了一种甘油骨架抗肿瘤前药，其结构为：

其中Nu是核苷类抗肿瘤药，并且Nu和磷酸基团链接的位置是Nu的5’位羟基。

因为肿瘤组织高表达磷脂酶A2(PLA2)，而磷脂酶A2可解离甘油磷脂2位的酯键，所以本发明中的甘油骨架抗肿瘤前药处于肿瘤组织中时，可被酶解离生产1位长链烷基醚取代的甘油磷酰核苷(见下面分子结构式)和共轭亚油酸。已知1位长链烷基醚取代的甘油磷脂有很强的细胞毒性，共轭亚油酸也有较强抗肿瘤活性。

由甘油骨架抗肿瘤前药解离生成的1位长链烷基醚取代的甘油磷脂会在肿瘤组织或肿瘤细胞内继续解离生成单磷酰化核苷(见下面分子结构式)和1位长链烷基醚取代的甘油。

核苷类抗肿瘤药需在体内转化为三磷酸酯，才能产生抗肿瘤活性。由甘油骨架抗肿瘤前药解离生成的单磷酰化核苷只需要二步磷酰化，就可产生核苷药物的三磷酸酯，具有比原核苷药物的活性更强，不易产生肿瘤耐药性。

因此本发明提供的甘油骨架抗肿瘤前药在肿瘤部位可产生多个对肿瘤细胞有活性的成分，它们联合发挥药效，能获得高效的抗肿瘤效果。

本发明中的核苷类抗肿瘤药，不限制分子结构，优选自阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、氟达拉滨，以及它们的衍生物，具体包括阿糖胞苷衍生物、吉西他滨衍生物、卡培他滨衍生物、氟达拉滨衍生物。

本发明中的甘油骨架抗肿瘤前药的合成步骤一般分为三个阶段：首先将1位醚型甘油的3位羟基保护后，通过酯化反应将共轭亚油酸与1位醚型甘油磷脂的2位羟基连接，然后脱保护；将1位醚型2位共轭亚油酸甘油酯的3位磷酰化得到甘油磷脂；甘油磷脂和核苷类抗肿瘤药或核苷类抗肿瘤药的衍生物反应得到甘油骨架抗肿瘤前药。合成过程中，有些保护基可以除去，有些保护基可以不除去，但都基于不影响甚至增强药效的情况下，例如采用N-苯甲酰-3’-O-乙酰核苷类似物时，可以不除去核苷类似物上的保护基，同样起到抗肿瘤作用。采用上述步骤，通过参考相关文献方法和利用一般专业技术就可以得到高纯度的甘油骨架抗肿瘤前药。

得到本发明中的甘油骨架抗肿瘤前药后，还可以根据使用要求将其制备成盐。成盐位置一般在磷酰基团上游离羟基位置。甘油骨架抗肿瘤前药的盐可选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、氨盐、有机胺盐。核苷基团也可以成盐，包括碱盐和酸盐。碱盐可以选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、氨盐、有机胺盐。酸盐中的酸可以选自马来酸、富马酸、琥珀酸、苯甲酸、苯磺酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、氨基酸、柠檬酸、酒石酸、硝酸、磷酸、盐酸、硫酸，优选的是乙酸、柠檬酸、酒石酸、苯甲酸、盐酸、硫酸。制备甘油骨架抗肿瘤前药的盐的方法一般可以先将甘油骨架抗肿瘤前药和相应的酸或碱分别溶于相同或不同有机溶剂，再将它们的有机溶剂溶液按照它们分子摩尔数相当比例混合，经过适当处理，最后将混合溶液挥干，进行适当的纯化和分离，得到甘油骨架抗肿瘤前药的盐；也可在制备时直接加入过量的酸或碱成盐。

本发明人出乎意料地发现由上述甘油骨架抗肿瘤前药可以方便地制备得到高度分散制剂。因此本发明提供了一种高度分散制剂，含有本发明中的甘油骨架抗肿瘤前药，并且选自脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米粒、纳米乳或自组装传递系统。这些高度分散制剂可以以水性混悬液的形式存在并给药，也可以采用适当方式干燥后以固体形式存在，临使用前加水分散得到。

含有甘油骨架抗肿瘤前药的高度分散制剂的粒子直径一般小于1微米，优选的是小于0.5微米，更优选的是小于0.2微米。

在高度分散制剂的粒子表面上插入长循环材料，可获得静脉注射后在血液中长时间循环的效果，有更多机会到达肿瘤组织。长循环材料是具有两亲性的连接长亲水链的脂肪基团，其中脂肪基团可选自磷脂、胆固醇、硬脂酸基团，长亲水链可选自聚乙二醇、聚氨基酸、聚糖。长亲水链的分子量范围可从500到2000。长循环材料具体可选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇、胆固醇琥珀酰聚乙二醇。

含有甘油骨架抗肿瘤前药的高度分散制剂可通过参考相关文献方法和利用一般专业技术就可以制备得到。

一般地，如果采用薄膜分散法制备脂质体，可以将甘油骨架抗肿瘤前药与磷脂等膜材共同溶于有机溶剂，盛入烧瓶中，减压旋转蒸发，得到一层薄膜，然后加入水或适当缓冲液，进行振荡和超声，直至形成均匀的混悬液。如果超声时间延长，还可能得到纳米级分散系统。脂质体混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到脂质体混悬液。运用同样的技术可以获得含有甘油骨架抗肿瘤前药的非离子表面活性剂囊泡。

纳米粒制剂中的固体脂质纳米粒较适合于本发明中的甘油骨架抗肿瘤前药。一般地，将甘油骨架抗肿瘤前药与常温下为固态的脂质，如磷脂、脂肪酸、甘油酯，共同加热熔融，然后加入水或适当缓冲液，在加热情况下在高压乳匀机上循环乳化多次，形成纳米分散的乳滴，迅速冷却，使之固化，即得到甘油骨架抗肿瘤前药固体脂质纳米粒。用微乳法也可制得甘油骨架抗肿瘤前药固体脂质纳米粒。甘油骨架抗肿瘤前药纳米粒混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到纳米粒混悬液。

甘油骨架抗肿瘤前药纳米乳的制备可以参考常见的处方，一般包括乳化剂、助乳化剂、助溶剂、油相、水相。一般在选择合适的处方后，即可容易地形成纳米乳。如果选择合适的处方，一般包括乳化剂、助乳化剂、助溶剂、油相，还可以组成自纳米乳化系统，在加入适量水溶液后，系统可以自行分散成纳米乳。

除了上述可以方便地得到的甘油骨架抗肿瘤前药的高度分散制剂外，本发明人还出乎意料地发现由于本发明中的甘油骨架抗肿瘤前药具有特殊的物理化学性质，特别是两亲性，由它自身或加入适量添加剂后在水溶液中可以自组装，形成高度分散制剂。甘油骨架抗肿瘤前药分子中含有脂溶性强的长链基团和极性较大的核苷基团，因此具有两亲性，这种物理化学性质类似于磷脂和某些表面活性剂。如果两亲性分子的分子结构满足一定条件，由它本身可以在水中自组装成高度分散的有序聚集体，例如双分子层、双分子层弯曲得到的囊泡和双分子层叠加得到的纳米粒。本发明中的甘油骨架抗肿瘤前药具有较长的并且脂溶性较强的脂肪长链基团和亲水性核苷基团，较容易形成双分子层，并进一步得到囊泡或纳米粒，不过某些条件下需加入一定量的添加剂。因此本发明首次设计并制备了由本发明中的甘油骨架抗肿瘤前药组成或加入适量添加剂的高度分散自组装传递系统。

本发明中的由甘油骨架抗肿瘤前药组成的高度分散自组装传递系统的制备方法和脂质体等高度分散制剂的制备方法类似。通常是将甘油骨架抗肿瘤前药溶于某种有机溶剂，根据需要可以将适当添加剂加入甘油骨架抗肿瘤前药的有机溶剂溶液中或待分散介质(一般是水或水溶液)中，然后进行分散。方法包括薄膜分散法、反相蒸发法、注入法、复乳法等。在某些情况下，添加剂不是必需的，此时传递系统全部由甘油骨架抗肿瘤前药组成。在某些情况下，单独用甘油骨架抗肿瘤前药不能形成很好的高度分散粒子，此时需要加入适当添加剂，帮助其形成有序结构。是否需要加入添加剂根据甘油骨架抗肿瘤前药的物理化学性质决定，一般可以通过预实验来推断。

本发明中的高度分散的自组装传递系统中甘油骨架抗肿瘤前药的量占全部组成成分的分子摩尔比例在50％～100％之间，优选的是70％～100％，更优选的是85％～100％，其余为添加剂。添加剂可选自脂质分子、表面活性剂。脂质分子可选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪胺、胆固醇，脂肪胺如硬脂胺。表面活性剂可选自胆酸盐、去氧胆酸盐、磷脂、多元醇酯类表面活性剂、聚氧乙烯类表面活性剂、聚乙二醇脂质衍生物、多糖脂质衍生物、聚氨基酸脂质衍生物、双十六烷基磷脂酸。磷脂包括合成磷脂、半合成磷脂、天然磷脂。其中合成磷脂又包括修饰的磷脂如聚乙二醇化磷脂、连接单克隆抗体的磷脂。多元醇酯类表面活性剂优选的是失水山梨醇脂肪酸酯，具体如司盘60、司盘40、司盘20。聚氧乙烯类表面活性剂优选的是聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物(也称泊洛沙姆)，聚山梨酯、聚氧乙烯脂肪醇醚和聚氧乙烯脂肪醇酯，具体如泊洛沙姆P188、吐温80、吐温60、吐温40、吐温20、苄泽35。添加剂还可选自胆固醇的某些衍生物如胆固醇脂肪酸酯、聚乙二醇化胆固醇，前者如胆固醇琥珀酸单酯，后者如聚乙二醇1500胆固醇琥珀酸酯。

上述制备甘油骨架抗肿瘤前药的高度分散制剂的方法不经改变或经过稍微调整后，都可适用于甘油骨架抗肿瘤前药的盐。

附图说明：

图1.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯的合成路线

图2.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯Langmuir单分子膜的π-A曲线

图3.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯自组装体透射电镜照片

图4.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯长循环自组装体透射电镜照片

图5.药物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用。图中Gem为吉西他滨溶液，OLGPG为1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯自组装体。

图6.经甘油骨架抗肿瘤前药自组装体和对照药物治疗后荷H₂₂瘤的外观照片。相应标识和说明见实验例2。

具体实施方式

实施例1.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯(OLGPG)

1.合成N-苯甲酰-3’-O-乙酰吉西他滨(BAG)

取吉西他滨(0.2638g，1mmol)溶于50ml乙醇，80℃回流，加入苯甲酸酐(0.2728g，1.2mmol)继续反应1小时，以后每小时加入1份苯甲酸酐(1.2mmol)，持续加3次，共计3小时，最后1份苯甲酸酐加入后，继续回流反应1小时，减压除溶剂，得无色透明粘稠液体。用含4％甲醇的氯仿溶解后在硅胶柱上分离，收集二氯甲烷∶甲醇＝15∶1洗脱液冲出的相应组分，减压除溶剂，得白色粉末状N-苯甲酰吉西他滨(BG)。

取BG(0.3683g，1.00mmol)、咪唑(0.2238g，3.29mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF，6ml)，加TBDMS-Cl(0.2760g，1.83mmol)，迅速加上干燥管(内装无水CaCl₂)后，室温搅拌60小时。加入6ml甲苯共沸除去高沸点的DMF，减压除溶剂，得黄色透明粘稠液。用含2％甲醇的氯仿溶解后在硅胶柱上分离，收集二氯甲烷∶甲醇＝20∶1洗脱液冲出的相应组分，减压除溶剂，得白色粉末状N-苯甲酰-4’-O-叔丁基二甲基硅烷吉西他滨(BTG)。

取BTG(0.2065g，0.42mmol)溶于12ml吡啶，加入乙酸酐(5.3ml)室温搅拌24小时，减压除溶剂，得黄色透明粘稠液。用含2％甲醇的氯仿溶解后在硅胶柱上分离，收集二氯甲烷∶甲醇＝50∶1相应组分，减压除溶剂，得淡黄色糊状N-苯甲-3’-O-乙酰-4’-O-叔丁基二甲基硅烷吉西他滨(BATG)。

取TBAF·3H₂O(1.5775g，5mmol)溶于5ml四氢呋喃液，即成1mol/L的TBAF溶液。取BTAG(0.1511g，0.28mmol)溶于预配的1mol/L的TBAF溶液中，加入0.1ml乙酸，室温搅拌2小时。减压除溶剂，得淡黄色黏稠物。用含2％甲醇的氯仿液溶解后在硅胶柱上分离，收集二氯甲烷∶甲醇＝20∶1洗脱液冲出的相应组分，减压除溶剂，得淡黄色粉末状N-苯甲酰-3’-O-乙酰吉西他滨(BAG)。

2.合成1-十八烷基-2-共轭亚油酰甘油(OCG)

取1-十八烷基甘油(0.3446g，1mmol)、三苯基氯甲烷(Trcl，0.3342g，1.2mmol)超声溶于8ml二氯甲烷溶液中，加入4-N，N’-二甲基氨基吡啶(DMAP，0.0136g，0.11mmol)和2ml吡啶后，室温搅拌过夜。减压除去溶剂后，用0.05mol/L柠檬酸溶液洗3次，去离子水洗3次，萃取收集有机相后，无水硫酸钠干燥过夜；抽滤，滤液旋去溶剂后得白色粘稠液体。用少量二氯甲烷溶解后在硅胶柱上分离，收集乙酸乙酯：石油醚＝1：15洗脱液冲出的相应组分，减压除溶剂，得白色蜡状1-十八烷基-3-三苯甲基甘油(OTG)。

取二环己基碳二亚胺(DCC，0.4121g，2.00mmol)和共轭亚油酸(CLA，1.0322g，3.58mmol)溶于15ml二氯甲烷中，氮气保护下室温搅拌30min；向反应液内加入OTG(1.2793g，2.00mol)、4-N，N’-二甲基氨基吡啶(DMAP，0.0245g，0.2mmol)和5ml二氯甲烷，室温搅拌过夜。抽滤，收集滤液；减压除溶剂，得无色透明油状物。用少量二氯甲烷溶解后在硅胶柱上分离，收集乙酸乙酯：石油醚＝1：20洗脱液冲出的相应组分，减压除溶剂，得无色透明油状物1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-三苯甲基甘油(OCTG)。

将2mmol OCTG(约2mmol)溶于氯仿-甲醇(CHCl₃：MeOH＝10：3，v/v，18.2ml)，氮气保护下加p-TSA(0.1472g，0.67mmol)，室温搅拌24h。减压除溶剂，得无色透明油状物。少量二氯甲烷溶解后在硅胶柱上分离，收集二氯甲烷：甲醇＝15：1洗脱液冲出的相应馏分，旋蒸，得无色透明油状物1-十八烷基-2-共轭亚油酰甘油(OCG)。

3.合成1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯

取20μl POCl₃溶于1ml二氯甲烷，通N₂，冰浴下搅拌，混合液无色透明；取OCG(约0.15mmol)溶于1ml吡啶逐滴加入上述混合液，反应液渐变淡黄色，冰浴下搅拌30min；取BAG(0.1874g，0.45mmol)溶于1ml吡啶，加入上述反应液，此时反应液为淡黄色透明液，室温搅拌48小时；加130μl去离子水，搅拌1.5小时(OCG：POCl₃：BAG＝1：1.45：3，mol/mol/mol)。去离子水洗3次，无水硫酸钠干燥过夜；减压除溶剂，得淡黄色粘稠液。收集洗脱液为二氯甲烷：甲醇(100：3，v/v)时含相应产物点的组分，减压除溶剂，得淡黄色粉末1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯(OLGPG，C₅₇H₉₀F₂N₃O₁₂P)。

OLGPG结构鉴定结果如下。¹H NMR，400MHz，dimethyl sulfoxide(DMSO)-d₆)δppm：3.037-4.214(-CH，glycerol-)，0.858(s，6H，-CH₃)，1.174(m，42H，-(CH₂)₂₁-)，2.169(m，2H，-CH₂-)，5.339，6.196(t，4H，-CH＝CH-)，7.792(t，1H，-NH-)，11.627(s，1H，-OH).FT-IR(KBr，cm^-1)，3169.1，3120.4，1626.1(CH＝CH，phenyl，-COO-)，1766.7(O-P-O)，1720.1(-CO-NH-)，1473.0，1396.6(-CH₂-CH₂-).ESI，MS(+)m/z：1099.72(M+Na)⁺；ESI，MS(-)m/z：1076.87(M-H)⁺.UV(MeOH)，λ_max，257nm.TLC：chloroform/methanol(9:1，v/v)，R_f＝0.512.

OLGPG的合成路线见图1。

其余甘油骨架抗肿瘤前药的合成步骤与OLGPG相近，特别是甘油骨架连接共轭亚油酸和磷酰化的步骤完全一致，分别得到1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰阿糖胞苷甘油酯、1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰卡培他滨甘油酯、1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰氟达拉滨甘油酯。

4.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯(OLGPG)的理化性质

OLGPG甲醇液在257nm处有最大吸收，与吉西他滨最大吸收波长268nm和共轭亚油酸最大吸收波长233nm不同，并确定可以采用257nm作为HPLC检测波长测定OLGPG含量。

吉西他滨脂质前药OLGPG的π-A等温曲线上升平缓，崩溃压在34mN/m左右，说明该前药呈现两亲性，分子柔韧性较好，易在水面上形成有序的单分子膜(图2)，有利于发生分子自组装。

实施例2.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯钠盐的制备

分子式C₅₇H₈₉F₂N₃O₁₂PNa。取1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯1.078g，相对于0.001mol，溶于10ml氯仿，加入含0.001mol NaOH的甲醇溶液，振摇超声，减压挥干溶剂，甲醇重结晶，得到1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯钠盐白色晶体。薄层层析显示一个斑点。其它碱盐如钾盐、钙盐、镁盐、氨盐、有机胺盐等制备方法相近。

实施例3.1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰氟达拉滨甘油酯脂质体的制备

取1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰氟达拉滨甘油酯25mg、大豆磷脂0.1g于250ml烧瓶中，用20ml二氯甲烷溶解，减压旋转蒸发，得到一层有机脂溶性膜，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液10ml，振荡，大部分膜脱落，在50℃超声，直至得到均匀混悬液，显微镜下观察，大部分粒子直径小于1微米，即为1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰氟达拉滨甘油酯脂质体。

实施例4.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰氟达拉滨甘油酯固体脂质纳米粒的制备

取1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰氟达拉滨甘油酯50mg、单硬脂酸甘油酯0.7g、吐温800.03g于烧杯中加热至80℃，逐渐加入含十二烷基硫酸钠10mg的80℃水10ml，保持温度不变，呈透明液体，将其用注入到高速搅拌的0℃水中，即得1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰氟达拉滨甘油酯固体脂质纳米粒。

实施例5.1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰阿糖胞苷甘油酯非离子表面活性剂囊泡的制备

取1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰阿糖胞苷甘油酯30mg、0.08g司盘60于250ml烧瓶中，用20ml二氯甲烷溶解，减压旋转蒸发，得到一层有机脂溶性膜，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液10ml，振荡，大部分膜脱落，在50℃超声，直至得到1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰阿糖胞苷甘油酯非离子表面活性剂囊泡的均匀混悬液，激光散射粒度分析仪检测，平均粒径为256纳米。

实施例6.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰阿糖胞苷甘油酯长循环脂质体的制备

取1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰阿糖胞苷甘油酯30mg、大豆磷脂0.2g、PEG化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺PEG-DSPE 0.05g于烧瓶中，用1∶1体积比的20ml氯仿∶异丙醚溶解，加入适量蒸馏水，超声使其成为乳剂，减压旋转蒸发，得到凝胶态物质，加入少量水，继续减压旋转蒸发，凝胶态物质脱落并分散成均匀混悬液，即为1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰阿糖胞苷长循环脂质体。

实施例7.1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰卡培他滨甘油酯长循环脂质体的制备

取1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰卡培他滨甘油酯50mg、大豆磷脂0.1g、PEG化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺PEG-DSPE 0.02g于烧瓶中，用20ml 1∶1体积比的氯仿∶异丙醚溶解，加入适量蒸馏水，超声使其成为乳剂，减压旋转蒸发，得到凝胶态物质，加入少量水，继续减压旋转蒸发，凝胶态物质脱落并分散成均匀混悬液，显微镜下观察，大部分粒子直径小于1微米，即为1-十八烷基醚-2-共轭亚油酰-3-磷酰卡培他滨甘油酯长循环脂质体。

实施例8.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯固体脂质纳米粒的制备

取1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯50mg、单硬脂酸甘油酯0.7g、吐温800.03g于烧杯中加热至80℃，逐渐加入含十二烷基硫酸钠10mg的80℃水10ml，保持温度不变，呈透明液体；将其用注射器注入到搅拌的0℃水中，呈透明液体，即为1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯固体脂质纳米粒。在原子力显微镜下观察，多为100纳米以下的粒子。该1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯固体脂质纳米粒混悬液可常温放置7天未见沉淀析出。该固体脂质纳米粒混悬液添加适当保护剂后冻干成固体粉末，临用前加入水，即成1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯固体脂质纳米粒混悬液。

实施例9.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯纳米乳的制备

取1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯50mg溶于5ml油酸乙酯/四氢呋喃混合溶剂中，加入适量聚氧乙烯蓖麻油和单甘酯，加热搅拌成溶液，在高速搅拌条件下，加入约4ml水，持续搅拌，得到半透明状分散液体。粒度测定结果表明大部分粒子在120nm以下，即为含1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯的纳米乳。

实施例10.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯自组装体的制备

取1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯溶于无水乙醇，浓度约为6mg/ml，在搅拌下注入到水中，水浴蒸发除去有机溶剂，得到高度分散的1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯自组装体。透射电镜下观察1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯自组装体呈圆球形(图3)。

实施例11.1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯长循环自组装体的制备

取胆固醇基琥珀酰聚乙二醇1500，即CHS-PEG1500，与1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯按质量比1∶4溶解在四氢呋喃中后，在搅拌下注入到水中，水浴蒸发除去有机溶剂，得到高度分散的1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯长循环自组装体。透射电镜下观察1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯长循环自组装体呈圆球形(图4)。自组装体的粒径为50nm左右，表面荷负电，Zeta电位约-16mV。该自组装体在离心、高热及长时间室温放置后均较稳定。

实验例1.甘油骨架脂质前药自组装体的体外药效学评价

材料：吉西他滨水溶液、实验例10制备的1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯(OLGPG)自组装体。

方法：用MTT法测定吉西他滨、1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯自组装体对人肝癌细胞HpG2的抑制作用。

结果：吉西他滨对HepG2细胞的IC₅₀≤2μmol/L，OLGPG自组装体的IC₅₀在10μmol/L左右。这是因为OLGPG需要一个解离过程，产生各活性中间体后才能发挥药效。另外，吉西他滨对HepG2的抑制易产生耐受性，提高吉西他滨浓度并不能增加抑制率；而OLGPG自组装体对HepG2的抑制率随药物浓度增加不断增大。OLGPG自组装体在20μmol/L及以上时对HepG2的抑制作用明显超过吉西他滨。

实验例2.甘油骨架脂质前药自组装体的体内药效学评价

材料：生理盐水、吉西他滨生理盐水溶液、实验例10制备的1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯(OLGPG)自组装体、实验例11制备的1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯(OLGPG)长循环自组装体。

抽取荷小鼠肝癌细胞H₂₂的小鼠腹水，生理盐水稀释至2×10⁷个细胞/ml。取25-30g雄性昆明小鼠，皮下接种H₂₂细胞(0.2ml)于右前侧腋下，7天后，腋下有隆起肿瘤硬块即为建模成功。

取肿瘤大小均匀的昆明小鼠36只，随机分为6组，每组6只。

A：阴性对照组(静脉注射与B组等体积的生理盐水)；

B：阳性对照组(吉西他滨生理盐水溶液，25mg/kg)；

C：低剂量制剂组(OLGPG自组装体，10.24mg/kg，同B组1/10当量)；

D：低剂量长循环制剂组(OLGPG长循环自组装体，10.24mg/kg，同B组1/10当量)

E：高剂量制剂组(OLGPG自组装体，20.48mg/kg，同B组1/5当量)；

F：高剂量长循环制剂组(OLGPG长循环自组装体，20.48mg/kg，同B组1/5当量)

各组均尾静脉注射给药，隔天给药一次，共三次，每次给药均称小鼠体重，用游标卡尺测量肿瘤长径(a)及短径(b)，换算成体积V(mm³)。末次给药后第二天处死，取出肿瘤。称瘤湿重，计算抑瘤率。

抑瘤率＝[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％

建立昆明小鼠肝癌模型后，以肿瘤湿重和体积为主要评价指标，考察OLGPG制剂的体内抑瘤作用。

除OLGPG长循环自组装体(1/5B组当量)外其余各组体积均大于1000mm³，而生理盐水组肿瘤体积生长最快，给药第3天即超过2000mm³。综合两次测量结果，各组肿瘤体积大小排序为：生理盐水＞OLGPG自组装体(1/10)＞吉西他滨＞OLGPG长循环自组装体(1/10)＞OLGPG自组装体(1/5)＞OLGPG长循环自组装体(1/5)(表1)。给药第5天后OLGPG长循环自组装体(1/10)组明显高于OLGPG自组装体(1/10)组(p＜0.05)，说明加上长循环材料CHS-PEG1500后OLGPG自组装体药效明显提高。OLGPG长循环自组装体(1/5)组肿瘤最小，抗肿瘤效果最好，而且剂量是吉西他滨剂量的1/5。各组抑瘤率大小顺序为：OLGPG长循环自组装体(1/5)＞吉西他滨＞OLGPG长循环自组装体(1/10)＞OLGPG自组装体(1/5)＞OLGPG自组装体(1/10)(表2)。

图6是经甘油骨架抗肿瘤前药自组装体和对照药物治疗后荷H₂₂瘤的外观照片。

表1.荷H₂₂昆明小鼠的肿瘤体积变化(n＝6)

表2.各组小鼠瘤湿重及抑瘤率(n＝6)

实验例3.甘油骨架脂质前药自组装体的安全性评价

材料：生理盐水、吉西他滨生理盐水溶液、实验例8制备的1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯(OLGPG)自组装体、实验例9制备的1-十八烷基-2-共轭亚油酰-3-磷酰吉西他滨甘油酯(OLGPG)长循环自组装体。

方法：

实验分组和剂量同实验例2。

精神状态、进食量、毛发光泽、活动量、体重等均能反映小鼠的生理状态，进而反映药物的安全性。本实验采用荷瘤小鼠体重变化作为安全性评价指标。第一次给药当天记录小鼠体重，以后每次给药(第3、5天)均称量小鼠体重，按下式计算小鼠体重变化率。

体重变化率＝[(治疗后平均体重-治疗前平均体重)/治疗后平均体重]×100％

结果：

除吉西他滨组和OLGPG长循环自组装体(1/5)组小鼠体重变化较小以外，其余各组小鼠体重均有不同程度的增加，这主要因为肿瘤增大使小鼠体重增加，而另一方面小鼠精神状态较好会使得进食量增加，这就导致OLGPG自组装体(1/5)组，OLGPG自组装体(1/10)组及OLGPG长循环自组装体组(1/10)小鼠体重稍高于生理盐水组。总体上各组小鼠体重变化是受多方面因素的影响，但各组小鼠体重变化差异并不大，说明药物安全性较高，且消除了体重变化对小鼠抑瘤实验结果判断的影响。

表3.荷H₂₂瘤昆明小鼠的体重变化(n＝6)

Claims (9)

1.一种甘油骨架抗肿瘤前药，其结构为：

其中Nu是核苷类抗肿瘤药，并且Nu和磷酸基团链接的位置是Nu的5’位羟基。

2.如权利要求1所述的甘油骨架抗肿瘤前药，其中核苷类抗肿瘤药选自阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、氟达拉滨，以及它们的衍生物。

3.如权利要求1所述的甘油骨架抗肿瘤前药，其合成步骤分为三个阶段：首先将1位醚型甘油的3位羟基保护后，通过酯化反应将共轭亚油酸与1位醚型甘油磷脂的2位羟基连接，然后脱保护；将1位醚型2位共轭亚油酸甘油酯的3位磷酰化得到甘油磷脂；甘油磷脂和核苷类抗肿瘤药或核苷类抗肿瘤药的衍生物反应得到甘油骨架抗肿瘤前药。

4.一种高度分散制剂，含有权利要求1所述的甘油骨架抗肿瘤前药，并且选自脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米粒、纳米乳或自组装传递系统。

5.如权利要求4的高度分散制剂，其中粒子直径小于1微米。

6.如权利要求4的高度分散制剂，其中自组装传递系统的粒子组成中权利要求1的甘油骨架抗肿瘤前药的量占全部组成成分的分子摩尔比例在50％～100％之间。

7.如权利要求4的高度分散制剂，其中自组装传递系统的粒子全部由权利要求1的甘油骨架抗肿瘤前药。

8.如权利要求4的高度分散制剂，在其粒子表面上插入长循环材料。

9.如权利要求8的高度分散制剂，其中长循环材料选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇、胆固醇琥珀酰聚乙二醇。