KR20100096101A - 박테리아 독성을 억제하는 방법 및 이에 대한 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박테리아 감염의 치료를 위한 화합물 및 방법에 관한 것이다. 이들의 작용 기작이 박테리아의 사멸 또는 이들의 성장의 억제를 포함하지 않기 때문에, 박테리아 내 약 내성을 유발하는 화합물들에 대한 잠재성은 최소화된다. 박테리아 독성을 억제함을 통해, 본 발명은 박테리아 감염을 치료하는 새로운 수단을 제공한다.
Description
본 발명은 2007년 10월 19일에 출원된 미국 가출원 제 60/999,637호의 이익을 청구하며, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합되어 있다.
본 발명은 National Institutes of Health (NIH)에 의해 수여된 등록 번호 1-RO3-NS053582-01 및 RO1 GM31278 하에서 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 가진다.
1. 기술 분야
본 발명은 일반적으로 세균학 및 전염병 분야에 관한 것이다. 더욱 특이적으로는, 본 발명은 특정 박테리아 신호 기작의 억제제 및 이 억제제를 사용하는 박테리아성 감염 치료에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 기재
박테리아성 감염의 치료는 전형적으로 하나 또는 그 초과의 항생제의 투여를 포함한다. 이 제제는 종종 초기에 효과적이지만, 하나 또는 그 초과 타입의 항생제에 대한 박테리아 내성의 발달을 초래할 수 있다. 실제로, 다약제 내성 박테리아 감염은 전세계적으로 큰 건강 문제이다. 박테리아 내성을 포함하지 않는, 효과적으로 박테리아 감염을 제거하는 치료 방법은 그래서 필요하다.
쿼럼 센싱(쿼럼 센싱: QS)은 자기유도물질(AI)로 불리는 호르몬 유사 분자에 박테리아가 반응하도록 하는 기작이고, 여러 박테리아성 병원체 내 과도한독성 유전자를 제어하는 책임이 있다. QS는 박테리아의 성장과 같은 본질적 과정에 직접적으로 포함되지 않는다, QS의 억제는 저항의 발달에 대한 선택적 압력을 만들지 말아야 한다(Rasmussen and Givskov, 2006).
본 발명자들은, 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic 대장균) O157:H7(EHEC)에서의 신호 연쇄 반응(신호 cascade)은 자기유도물질-3 (AI-3)로 신호함에 의해 QS와 관련되어 있음을 이전에 보고하였다(Clarke et al., 2006). AI-3/에피네프린(epi)/노르에피네프린(NE) 인터-킹덤 신호 연쇄 반응은 플라젤라 레굴론(flagella regulon)(무쿠스 층을 통해 박테리아가 수영하고 상피 배리어에 도달할 필요가 있음, LEE 유전자(특수화된 분비 경로를 엔코딩함, 이 경로를 통해 박테리아는 포유류 세포로 분비한다, 이 포유류 세포는 설사를 일으킨다) 및 EHEC 내 Shiga 독성 유전자(요혈성 요독 증후군 (HUS)에 책임 있음)의 발현을 활성화시킨다(Sperandio et al., 2003; Clarke et al., 2006; Walters et al., 2006). AI-3 및 에피네프린/NE은 효능적 신호(agonistic signal)이고, 두 신호에 대한 반응은 아드레날린 길항제(adrenergic antagonists) 예컨대 펜톨아민 또는 프로프라놀롤에 의해 차단될 수 있다(Sperandio et al., 2003; Clarke et al., 2006; Walters et al., 2006; Walter and Sperandio, 2006). 이 신호는 EHEC의 막에 있는 센서 키나제에 의해 감지된다, EHEC는 이 정보를 복합 제어 연쇄 반응을 통해 릴레이시킨다, 이 연쇄반응은 플라젤라 레굴론, LEE 유전자 및 Shiga 독성의 발현을 활성화시킨다. QseC(쿼럼 센싱 대장균 조정자 C)는 센서 키나아제 중 하나이다. QseC는 특이적으로 AI-3/에피네프린 및 NE를 감지하여 이의 인산화 상태를 증강시키고, QseC는 NE와 직접적으로 결합한다(Clarke et al., 2006). 이 신호들의 QseC의 인식은 α-아드레날린 길항제 펜톨아민으로 블록킹될 수 있다(Clarke et al., 2006). QseC 레굴론은 매우 복잡하고 모든 알려진 그리고 잠재적으로 여러 알려지지 않은 EHEC 독성 유전자의 제어와 본질적으로 관련된다.
QseC 및/또는 the AI-3/epi/NE 신호 cascade의 조작은 박테리아 독성 및 그 결과의 박테리아 감염을 제어하는 수단을 제공할 수 있다. 이러한 수단은 통상적 항생제에 비해 박테리아 내성을 유도할 개연성을 최소화할 수 있다. 그래서 이러한 시스템을 조절하는 작용제는 연구될만하다.
발명의 요약
본 발명은, 특정 화합물이 박테리아 호스트 소통을 방해함에 의해 박테리아 독성을 억제한다는 발견에 기초한다. 일반적으로, 이 화합물들은 박테리아 성장을 억제하거나 죽이지 않지만, 대신에 이의 독성 유전자를 활성화시키는 신호를 인식하는 박테리아의 능력을 방해한다. 박테리아 세포를 "공격"하는 대신에, 이는 박테리아 감염과 싸우는 신규한 전략이다, 이 화합물들은 소통을 "혼란"시켜 세포가 호스트에 대해 "장님(blind)"이 되도록 한다. 통상적 항생제의 방식과 같이 이 전략이 박테리아를 그 자체로 공격하지 않기 때문에, 치료 타입에 대한, 박테리아가 내성 기작을 진화시키는 진화 압력은 낮다. 이 시도는 특정 포유류 박테리아성 병원체뿐만 아니라 특정 식물 박테리아성 병원체, 예컨대 Erwinia 및 Ralstonia에 유용한 것처럼, 넓은 이용가능성을 가진다. 실제로, 본 발명의 화합물은 임의의 수의 의학적(예를 들어, 감염 치료 치료), 농업적(예를 들어, 식물 병 근절), 또는 환경적(예를 들어, 환경적 파계 종의 제거) 목적으로 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물은, 특정 구체예에서, 달리 병인 또는 독성을 이끌 수 있는, 쿼럼 센싱의 억제자일 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은, 특정 구체예에서, 독성을 억제한다. 본 발명의 화합물은, 특정 구체예에서, AI-3/에피네프린/NE 신호, 예컨대 EHEC에서, Salmonella 및 F. tularensis 병인의 억제자이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 Shiga 독소 생산을 억제한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 QseC(쿼럼 센싱 대장균 조정자 C), 히스티딘 센서 키나제를 억제한다. 본 발명의 화합물은 식물의 감염을 치료하기 위해 또한 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 독성을 억제하지만 박테리아를 죽이지 않는다(즉, 이들은 박테리아 사멸성은 아니다)뿐만 아니라 이들은 박테리아 발용저지성(bacteriostatic)도 아니다. 본 발명의 다른 방법은 아래에 기재되어 있다.
본 발명의 임의의 방법에서 사용될 수 있는 본 발명의 화합물은 본원에 기재되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 비제한적 화합물은 아래 표에 의해 제시된 카테고리에 속하는 것이다.
표 1의 화합물의 특정 구체예에서, 단지 오르토 B/D 치환체가 고려된다. 특정 구체예에서, 단지 메타 B/D 치환체가 고려된다. 특정 구체예에서, 단지 파라 B/D 치환체가 고려된다.
아래의 화학식 (V)의 화합물은 본원에서 기재된 임의의 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 화학식(V)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 고려한다:
상기 식에서, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 아릴 또는 아랄킬, 예컨대:
여기서 X1은 산소 또는 알킬아미노이다. 특정 구체예에서, R8-R16이 각각 독립적으로 H, 비치환된 알킬, 비치환된 알킬아미노, 비치환된 디알킬아미노, 비치환된 트리알킬암모늄, 또는 비치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, R8-R16이 각각 독립적으로, H, 치환된 알킬, 치환된 알킬아미노, 치환된 디알킬아미노, 또는 치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, 치환된 알킬, 치환된 알킬아미노, 치환된 디알킬아미노, 또는 치환된 알콕시의 각 치환체가 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3, -CF3, -NH2, 또는 모르폴린일이거나, 상기 기재된 임의의 다른 치환체이다. 특정 구체예에서, R8-R16이 각각 독립적으로 저급 알킬, 저급 알킬아미노, 저급 디알킬아미노, 저급 트리알킬암모늄, 또는 저급 알콕시이다. 특정 구체예에서, R5이 저급 알킬 또는 비치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, R1-R4이 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다. 특정 구체예에서, X1이 치환된 저급 알킬아미노이다. -SO2NH-아릴, 알킬, 아릴, 아르알킬, 알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모늄 및 알콕시 기 및 이의 저급 버전의 치환체 및 화학식(V)의 화합물의 언급된 이 기들을 포함하는 치환체의 비제한적 예는 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 및 -NH2를 포함한다. 화학식 (V)의 화합물의 비제한적 예는
아래의 화학식 (VI)의 화합물은 본원에 기재된 임의의 q아법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 하기 식(VI)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 고려한다:
상기 식에서, R1 및 R2은 각각 독립적으로 아릴 또는 아랄킬, 예컨대
여기서 A, B, D, E, F 및 G는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이고; R8-R12은 각각 독립적으로 H, 알킬, 알콕시; -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 또는 -NH2이며; n은 0-3이고; R3-R6은 각각 독립적으로 H이며; R7은 수소 또는 알킬이고; X는 -C(O)NR13- 또는 -NR13C(O)-이며, 여기서 R13은 H 또는 알킬이며; p는 0-3이다. 특정 구체예에서, R8-R12이 각각 H, 비치환된 알킬, 또는 비치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, R8-R12이 각각 독립적으로 H, 치환된 알킬, 또는 치환된 알콕시이다. 치환된 알킬, 또는 치환된 알콕시의 각 치환체가 예를 들어 독립적으로 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, -NH2, 또는 모르폴린일 또는 본원에 기재된 임의의 치환체일 수 있다. 특정 구체예에서, R8-R12이 각각 독립적으로 H, 저급 알킬, or 저급 알콕시이다. 특정 구체예에서, R7 및 R13이 각각 독립적으로 저급 비치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, R3-R6가 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬이다. 알킬, 아릴, 아르알킬, 알콕시, 이 기들의 저급 버전의 치환체 및 화학식 (VI)의 화합물의 언급된 이 기들을 포함하는 치환체의 비제한적 예는 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 및 -NH2를 포함한다. 화학식 (VI)의 화합물의 비제한적 예는:
아래의 화학식 (VII)의 화합물은 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 화학식 (VII)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 고려한다:
상기 식에서, -NHC(X1)NHRa를 포함하는 부분은 -XRb에 대해 오르토, 메타, 또는 파라일 수 있고, Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 아랄킬 또는 아릴 예컨대
여기서 A, B, D, E, F 및 G는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이며; R1-R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 또는 알콕시; -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, 또는 -NH2이며; X는 -NR7-, -SO2NR7-, -NR7SO2-, 또는 -S(O)2-이고, 여기서 R7는 H 또는 알킬이고; X1은 O 또는 S이다. 특정 구체예에서, 화학식(VII)의 화합물에 관해서, 화학식(VII)의 페닐 고리 상의 치환체가 파라이면, X는 -NH-, -S(O)2- 또는 -NHSO2이다라는 단서가 있다. 특정 구체예에서, R1-R5이 각각 독립적으로 H, 비치환된 알킬 또는 비치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, R1-R5이 각각 독립적으로 H, 치환된 알킬 또는 치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, 치환된 알킬 또는 치환된 알콕시의 각 치환체가 독립적으로 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, -NH2, 또는 모르폴린일 또는 본원에 기재된 임의의 다른 치환체이다. 특정 구체예에서, R1-R5이 각각 독립적으로 H, -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, 또는 -NH2 또는 저급 알킬, 또는 저급 알콕시이다, 여기서 저급 알킬 또는 저급 알콕시는 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 또는 -NH2를 임의로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, R7이 H 또는 저급 비치환된 알킬이다. 알킬, 아릴, 아르알킬 및 알콕시 및 이 기들의 저급 버전의 치환체, 및 화학식(VII)의 화합물의 언급된 이 기들을 포함하는 치환체의 비제한적 예는, -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 및 -NH2를 포함한다. 화학식 (VII)의 화합물의 비제한적 예는:
아래의 화학식 (VIII)의 화합물은 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 화학식 (VIII)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 고려한다:
상기 식에서, Ra 및 Rb가 각각 독립적으로 아랄킬 또는 아릴, 예컨대
여기서 A, B, D, E, F 및 G는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이며; R5-R9 각각은 독립적으로 H, 알킬, 또는 알콕시이고; R1-R4 각각은 독립적으로 H 또는 알킬이며; X1은 O 또는 S이다. 특정 구체예에서, R5-R9가 각각 독립적으로 H, 비치환된 알킬, 또는 비치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, R5-R9가 각각 독립적으로 H, 치환된 알킬, 또는 치환된 알콕시이다. 특정 구체예에서, 치환된 알킬 또는 치환된 알콕시의 치환체가 할로, 치환된 알킬, -CH3, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, 및 -NH2로 구성되는 군으로부터 선택되거나 본원에 기재된 임의의 다른 치환체이다. 특정 구체예에서, R5-R9가 각각 독립적으로 저급 알킬 또는 저급 알콕시이다. R1-R4가 각각 독립적으로 예를 들어 H 또는 저급 알킬일 수 있다. 알킬, 아릴, 아르알킬 및 알콕시 기 및 이의 저급 버전의 치환체 및 화학식 (VIII)의 화합물의 언급된 이 기들을 포함하는 치환체는 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 및 -NH2를 포함한다. 화학식 (VIII)의 화합물의 비제한적 예는:
아래의 화학식 (IX)의 화합물은 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 화학식 (IX)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 고려한다:
상기 식에서
R1 및 R2은 각각 H이거나, R1 및 R2은 함께 1,3-디옥솔란일 기를 형성하며;
R3는 H, -OH, -SO2NH2, -SO2NH-알킬, 또는 디알킬아미노이고;
X1는 O 또는 S이다. 특정 구체예에서, -SO2NH-알킬의 알킬 기가 치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, 치환된 알킬의 치환체가 -OH이다. 특정 구체예에서, R3의 디알킬아미노 기의 각 알킬 기가 독립적으로 비치환된 저급 알킬이다. 알킬, -SO2NH-알킬, 디알킬아미노 및 이의 저급 버전의 치환체 및 화학식 (IX)의 화합물의 언급된 이 기들을 포함하는 치환체의 비제한적 예는, -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 및 -NH2를 포함한다. 화학식 (IX)의 화합물의 비제한적 예는:
또한, 본 발명에 의해 고려된 것은 화합물은 하기 화학식의 화합물 및 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이다:
본원의 임의의 방법에서 사용될 수 있는 본 발명의 화합물은 또한 화학식(X)의 화합물을 고려한다:
여기서, A, B, D, E, F 및 G는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이고; R1은 H, -NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 또는 -CO2H이며; R2-R6은 각각 독립적으로 H 또는 알킬이고; X는 -NR7-, -SO2NR7-, -NR7SO2-, -S(O)2-, -C(O)NR7-, 또는 -NR7C(O)-이며, 여기서 R7은 H 또는 알킬이다. 특정 구체예에서, R1은 비치환된 알킬아미노 또는 비치환된 디알킬아미노이다. 특정 구체예에서, R1은 저급 알킬아미노 또는 저급 디알킬아미노이다. 특정 구체예에서, R2-R7은 각각 독립적으로 비치환된 알킬이다. R2-R7은 특정 구체예에서 각각 독립적으로 저급 알킬일 수 있다. 화학식 (X)의 화합물의 비제한적 예는:
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 (I)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 고려한다:
여기서, A, C, D 및 F 각각 독립적으로 H, 저급 알킬, -OH, -NH2, 저급 알콕시, 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본이고; B는 H, -SO2NH2, -SO2(NR1)알킬, 또는 -SO2(NR1)아릴이며, 여기서 R1은 H, 저급 알킬, 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본이고; E는 -NH2 또는 -NH-C(O)R2이다, 여기서 R2=저급 알킬 또는 아릴, 또는 E는 화학식 (II)를 가지는 치환체이다:
여기서 G 및 L은 각각 독립적으로 N 또는 O이지만 카르보네이트를 형성하지 않는다; J 및 M은 각각 독립적으로 H, 저급 알킬, -NH2, -OH, 저급 알콕시, 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본이고; K는 -CH2, O 또는 S이며; P는 H, 저급 알킬, 또는 아릴이다. 본 발명의 이 또는 임의의 다른 구체예에서의 피검체는 동물, 예컨대 포유류(예를 들어, 마우스, 래빗 또는 인간)일 수 있다. 본 발명의 이 또는 임의의 다른 구체예의 피검체는 식물일 수 있다.
특정 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (III)의 화합물이다:
여기서, Q, R, C, D, T 및 U는 각각 독립적으로 H, 알킬, -NH2, -CH2NH2, -CH2NH- (저급 알킬), 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본이고; K는 C, S, 또는 O이다. 특정 구체예에서 Q, R, C, D, T 및 U 관해서, 알킬은 비치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, 알킬은 치환된 알킬이다. 특정 구체예에서, 치환된 알킬의 치환체는 히드록시이다. 특정 구체예에서, 치환된 알킬은 저급 치환된 알킬이고, 여기서 치환체는 히드록시이다.
특정 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IV)의 화합물이다:
여기서, X1은 O 또는 S이고; Y1 및 Y2는 H, 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본이고; Z는 H,
여기서, X1 및 X2는 각각 독립적으로 H, 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본이다. 특정 구체예에서, X1은 S이다. 특정 구체예에서, A, C, D, F, J 및 M의 저급 알킬은 각각 독립적으로 -CH2NH2 또는 -CH2NHCH3이다. 특정 구체예에서, B는 -SO2(NH)아릴이다. 특정 구체예에서, 아릴 기는 페닐이다. 아릴 기는 6-원 고리일 수 있으며, 여기서 고리 원자 중 2개는 질소이고 고리 원자 중 4개는 탄소이다. 특정 구체예에서, 아릴 기는 이-치환된 아릴 기이다. 특정 구체예에서, 아릴 기는 아래 기재된 바와 같이, 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본으로 치환된다. 특정 구체예에서, E는 -NH2 또는 -NHAc이다. 특정 구체예에서, E는 화학식 (II)을 가지는 치환체이다. 상기 구체예에서, G 및 L은 각각 N이고 J 및 M은 각각 H이다. 화학식 (II)를 가진 치환체를 포함하는 화합물에 관한 특정 구체예에서, K는 S이고 임의로, 화학식 (II)의 아릴 기는 페닐 기이고, 이는 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본으로 치환되거나 되지 않을 수 있다.
특정 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 아래 중 임의의 하나 또는 그 초과로 추가 정의된다:
본 발명의 임의의 화합물, 예컨대 화학식 (I), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), 또는 (X)의 화합물은 당업자에 알려진 임의의 방법을 통해 피검체에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 구강으로 투여된다. 용량은 본 출원에 기재되어 있지만, 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 약 0.1 내지 약 50mg/kg 체중의 양으로 투여된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 약 10 내지 약 30mg/kg 체중의 양으로 투여된다. 본 발명의 화합물은 또한 흡입을 통해, 복막내, 정맥내, 근육내, 직장내, 볼내, 경피내, 질내, 또는 눈을 통해 또는 귀 점액을 통해 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 1 mg/mL 미만의 계산된 물 용해도를 보여주는 생물학적 이용가능한 본 발명의 화합물이 바람직하다. 상기 값은 인실리코( in silico ) 방법(예를 들어, BenchwareTM HTS Dat아민r, Tripos, Inc.) 방법으로 알려진 것에 의해 계산될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물이 흡수될 수 없는 조성물, 예컨대 약제학적으로 허용가능한 조성물에 포함되는 것이 바람직하다. 흡수될 수 없는 조성물은 신체 또는 신체의 임의의 특정 부분에 의해, 대부분 흡수되지 않는 것을 의미한다. 즉, 상기 조성물은 임의의 의미 있는 방식으로 또는 임의의 의미 있는 정도로 신체에 의해 흡수되거나 대사되지 않는다. 특정 구체예에서, 화합물은 소화관, GI 관의 루멘, 비로, 구강, 피부, 이도, 및/또는 질로부터 흡수될 수 없다. 상기 조성물은 소화관의 감염, 예를 들어 (예를 들어, 특정 단계의 Salmonella 또는 EHEC 감염), 귀의 감염(예를 들어, Haemophilus influenzae), 또는 질의 감염(예를 들어, Staphylococcus aureus(Staphylococcus epidermiditis, S. aureus의 가까운 동족체는 노르에피네프린의 존재에서 바이오필름 형성을 유도한다)을 표적하는데 유용할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 흡수될 수 없는 캐리어에 컨쥬게이트될 수 있고, 그 다음에 피검체에 투여될 수 있다. 흡수될 수 있는 화합물은 또한 생물학적 이용가능한 화합물이다.
상기 캐리어는, 캡슐화된 약을 방출시키거나 컨쥬게이트된 것에 노출시키기 위해, 장의 pH(pH>6.5)에서 쉽게 용해되지만 위의 낮은 pH(pH 1-2)에서는 용해되지 않는 불용해성 특정 폴리머를 포함한다. 일 특이적 분류는 아래에 기재된 EudragitsTM이다. EudragitsTM는 환전히 불용성이다. 구강 섭취시, 이들은 대변에서 볼 수 있다.
불용성 캐리어 예컨대 EudragitTM 또는 시클로덱스트린에 본 발명의 화합물의 컨쥬게이션은 완전히 불용성인 본 발명의 화합물을 제조하는 한 방법이다. 화합물의 구조적 디자인은 또한 이 목적을 달성시킬 수 있다. 본 발명의 화합물, LED209(또한 화합물 5로 불림)이 불용성 캐리어에 컨쥬게이트될 수 있는 방법의 예는 아래에 기재되어 있다.
사이트 A-F에서의 유도체는, 예를 들어, -CH2NH-CH3로 쉽게 제조될 수 있고, 이는 그 다음에 이의 -CO2H 기의 일부를 통해 캐리어에 커플링되기 위해 사용될 수 있다. 그 결과의 N-메틸 '펩티드' 결합은 효소에 안정한 3차 아미드이다. 캐리어에 커플링하는 다른 방법은 본원에 기재된 당업 자들에게 알려져 있다.
본원의 임의의 구체예에서, 본 발명의 화합물의 폴리머 꼬리는 아래와 같을 수 있다:
여기서, R, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고; R2는 폴리머 꼬리의 반대편에서 발견된 동일한 부분이며; R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 저급 알킬, CH2OH, 히드록실화된 저급 알킬, -NH2, -CH2NH2, -CH2NHCH3, -OH, 또는 저급 알콕시이고; n, m 및 p는 각각 독립적으로 2-200의 정수이거나 이로부터 추론가능한 임의의 범위이다. 또한 특이적으로 고려되는 것은, 상기 부분에서 보이는 -NR10C(O) 또는 -NRC(O)- 연결은 에테르 연결, 우레아 연결, 카르바메이트 연결 또는 카르복사미드 연결일 수 있고, 이 연결들은 본원에 기재되어 있다.
본원의 임의의 구체예에서, 본 발명의 화합물의 폴리머 백본 또는 링커-폴리머 백본은 임의의 하기 공중합체를 포함할 수 있다:
또는 
여기서, a, a', b, c 및 d는 각각 독립적으로, 폴리머의 분자량이 약 125kDa 또는 그 이상이 되도록 선택된다. 예를 들어, 폴리머의 분자량은 약 500 또는 그 이상일 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리머의 분자량은 약 500 내지 약 2500이다. 공중합체의 각 타입에서의 서브유닛의 순서는 랜덤이다. 특정 구체예에서, a:b의 비율은 약 1:2이다. 특정 구체예에서, c:d의 비율은 약 9:1이다. 특정 구체예에서, a:b의 비율은 약 1:2이고, c:d의 비율은 약 9:1이다. 특정 구체예에서, (a+a')/b=0.25 내지 2.0, 또는 이의 임의의 분획이다. 특정 구체예에서, d/c의 비율은 0.01-0.25이거나, 이의 임의의 분획이다. 특정 구체예에서, d+c=약 70 내지 약 700이다. 상기 공중합체의 말단기는 당업자에 알려진 임의의 말단기일 수 있다. 예를 들어, 말단기는 알콕시 또는 히드록실(예를 들어, 라우렐 퍼옥시드, 벤조일 퍼옥시드, 또는 퍼술페이트로부터) 또는 디알킬 시아노 기를 포함할 수 있다. 말단 기는, 당업자에 알려진 바와 같이, 반응에 존재하는 개시제, 모노머, 용매 및 라디칼 사슬 전달제 또는 종결제의 타입에 따라 다양할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 기판 또는 의학 장치에 고정될 수 있고, 이는 그 다음에 피검체에 삽입된다. 본 발명의 화합물은, 기판 또는 의학 장치 상에 화합물을 고정시키는 것이 용이하도록 화학적으로 변경될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하나 또는 그 초과의 폴리머 백본, 예컨대 링커-폴리머 백본, 및/또는 폴리머 꼬리를 포함한다, 이는 그 다음에 고정 목적을 위해 사용될 수 있다. 상기 장치 상의 생체활성 분자를 고정시키는 방법은 당업에 알려져 있다: 참조, 예를 들어, 미국 특허 제 5,811,151, 5,281,170, 6,024,918 및 7,256,259호, 이의 각각은 본원에 그대로 참조로서 통합되어 있다. 본 발명의 화합물이 고정될 수 있는 기판은, 특정 구체예에서, 체액에서 실질적으로 불용성일 수 있고, 이는 일반적으로 디자인되고 구조되어 바디 내 또는 상에 놓이거나 바디의 유체와 접촉한다. 의학적 장치의 비제한적 예는 보철, 스텐트, 이식물 및 포트를 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 임의의 화합물, 예컨대, 화학식 (I), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), 또는 (X)의 화합물은 아드레날린 수용체 활성에 최소로 영향을 미친다. 아드레날린 수용체 활성을 측정하는 방법은 당업자에 잘 알려져 있다(참조, 예를 들어, Azzi et al., 2001; Sen et al., 2002; Zimmerman et al, 1998) 및 하나 이상의 방법은 아래 실시예에 기재되어 있다. 구 "아드레날린 수용체 활성에 최소로 영향을 미침"은 약 1% 또는 그 미만 만큼 아드레날린 수용체 활성을 증가시키거나 감소시킴을 의미한다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 박테리아 감염은 QseC 키나제 또는 QseC 키나제 동족체를 가지는 박테리아에 의해 기인될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 박테리아 감염은 AI-3/에피네프린/NE을 감지하는 박테리아에 의해 기인될 수 있다. 박테리아가 QseC 키나제를 함유하고/거나 AI-3/에피네프린/NE를 감지하는지를 측정하는 방법은 당업자에 잘 알려져 있다. 참조, 예를 들어, Clarke et al., 2006. QseC 키나제를 함유하고 AI-3/에피네프린/NE를 감지하는 특정 박테리아는 EHEC , EPEC , UPEC , K-12, Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter baumannii , Shigela flexneri , Salmonella enterica typhi and typhimurium , Yersinia pestis , Yersinia enterocolitica , Yersinia . pseudotuberculosis , Erwinia carotovora , Pasteurella multocida , Haemophilus influenzae , Actinobacillus pleuroneumoniae, Chromobacterium violaceum , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas fluorescens , Burkholderia cepacia , Coxiella burnetti , Ralstonia solanacenarum 및 Francisella tularensis를 포함한다.
도 2에 리스트된 임의의 QseC 동족체는 또한 본 발명에 의해 고려된다. 특정 박테리아는 QseC을 함유하고 AI-3/에피네프린/NE를 탐지하고, 특정 박테리아는 QseC를 함유하거나 AI-3/에피네프린/NE를 탐지하는 것으로 고려된다.
박테리아를 논의하는 임의의 구체예에서, 병원성 박테리아는 특이적으로 고려된다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 박테리아 감염은 포유류 박테리아성 병원체에 의해 기인될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 박테리아 감염은 식물 박테리아성 병원체에 기인될 수 있다. 이러한 병원의 비제한적 예는 본원에 기재되어 있다.
본원에 기재되어 있는 임의의 방법에서, 박테리아 감염은 하기 유기체 중 하나 이상에 의해 기인될 수 있다: Actinobacillus pleuropneumoniae , Burkholderia cepacia, Chromobacter violaceum , Coxiella burnetti , 대장균, Erwinia carotovora, Francisella tularensis , Haemophilus influenzae , Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas fluorescens , Ralstonia solanacearum, Shigella flexneri , Salmonella typhi , Salmonella typhimurium , Staphylococcus aureus , Vibrio cholerae , Vibrio parahaemoliticus , Vibrio vulnificus, Yersinia pestis , 또는 Yersinia pseudotuberculosis. 다른 유기체는 본원에 기재되어 있다. 특정 구체예에서, 이 유기체는 병원성 대장균, 예컨대 장출혈성 대장균 또는 요로병원성 대장균이다. 다른 대장균 유기체는 본원에 기재되어 있다. 특정 구체예에서, 유기체는 Francisella tularensis이다. 특정 구체예에서, 이 유기체는 Salmonella typhimurium이다. 특정 구체예에서, 이 유기체는 Salmonella typhi이다. 특정 구체예에서, 이 유기체는 Pseudomonas aeruginosa이다. 특정 구체예에서, 이 유기체는 Staphylococcus aureus이다. 특정 구체예에서, 이 유기체는 Haemophilus influenza이다. 후자 유기체에 관해서, 귀 감염 및 수막염은 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 Haemophilus influenza 감염의 비제한적 두 예이다.
더구나, 박테리아 감염은 아래 유기체 중 하나 이상에 의해 기인될 수 있다: 장병원성 대장균 (EPEC), 독소원성 대장균 (ETEC), 장흡착성 E. coil (EAEC), 장침습성 대장균 (EIEC), 확산 부착성 대장균 (DAEC), 요로병원성 E. coil (UPEC), 대장균 K1, Acinetobacter , Bordetella parapertussis , Burkolderia phymatum , Citrobacter, Enterobacter , Klebsiella pseumonia , Legionella pneumophila , Ralstonia euthropha , Salmonella enterica typhimurium , Salmonella enterica typhi, Yersinia enterocolitica , 또는 Yersinia mollareti. 특정 구체예에서, Acinetobacter 유기체는 Acinetobacter baumannii이다.
본원의 임의의 방법에서, 박테리아 감염은 다중-약 내성 박테리아에 기인될 수 있다. 이러한 박테리아의 비제한적 예는 Salmonella 및 Staphylococci를 포함하고, 다른 것들은 당업자에 잘 알려져 있다. 또한 미래에 발달되는 다중 약 내성 박테리아가 또한 예상된다. 더구나, 본원에 기재된 임의의 방법에서, 감염은 본원에서 논의된 임의의 유기체로 기인될 수 있다.
본 발명의 임의의 화합물, 예컨대 화학식 (I), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), 또는 (X)의 화합물은 약제학적으로 허용가능한 조성물에 포함될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 조성물은 본원에 기재된 임의의 방법으로 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 약제학적으로 허용가능한 조성물은 흡수될 수 있다. 특정 구체예에서, 약제학적으로 허용가능한 조성물은 흡수되지 않을 수 있다. 특정 구체예에서, 약제학적으로 허용가능한 조성물은 장용 코팅을 포함한다. 상기 코팅은은 당업자에 잘 알려져 있고, 본원에 아래서 추가로 기재되어 있다.
또한 본 발명에 의해 고려되는 것은 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체에 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법이다, 여기서 상기 피검체가 동물 또는 식물이다.
본 발명의 다른 측면은, 화학식 (I)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 요혈성 요독 증후군을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다:
여기서, A, C, D 및 F는 상기 기재되어 있다. 특정 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (III)의 화합물이다:
여기서, K, Q, R, C, D, T 및 U는 상기 기재되어 있다. 화학식 (III)의 화합물에 관한 특정 구체예에서, C, D, Q, R, T 및 U는 각각 수소이고, K는 아래와 같이 S이다:
특정 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IV)의 화합물이다:
여기서 Y1, Y2 및 Z는 상기 기재된 바와 같다. 특정 구체예에서, 화학식 (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), 또는 (X)의 화합물은 또한 상기 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 화학식 (IV)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다:
상기 식에서, Y1, Y2 및 Z는 상기 기재된 바와 같다.
본원에서 논의된 방법에서 사용될 수 있는 본 발명의 다른 화합물은 아래 것 중 임의의 하나 또는 그 초과를 포함한다:
특이적으로 고려되는 것은 본원에서 논의된 임의의 특이적 화합물은, 특정 구체예에서, 본원에서 논의된 일반적인 화합물로부터 배제될 수 있다. 추가 고려되는 것은, 아래 참조에서 논의된 임의의 화합물은 본원에서 논의된 일반적 화합물로부터 배제될 수 있다는 것이다: WO 2002/070467, WO 2003/028762, WO 2005/016873 및 Shehata et al., 1986, 이의 각각은 본원에 참조로서 그대로 통합되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 (I), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), 또는 (X)과 같은 본 발명의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 치주 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다, 본원에서 사용되는, "치주 질환"은 치주조직과 관련된 콜라겐 퇴화의 정상 이상의 속도를 의미하며, 이는 잇몸, 치주인대, 백악질, 및 치조골의 콜라겐 퇴화를 포함할 수 있다. 치주 질환은 예를 들어, 치은염, 만성 염증성 치주 질환, 치주염, 유년성 치주염, 및 빠른 진행 치주염을 포함한다. 치주 질환과 관련된 바이오필름은 또한 특이적으로 고려된다. 바이오필름은 예를 들어, 치주 질환, 충치, 전립선 감염, 신장결석, 결핵, 재향군인병 및 중이의 일부 감염에 관련되어 있다. 이 징후의 각각은 또한 본 발명의 화합물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있다.
특이적으로 고려되는 것은, C(O)NR 또는 SO2NR를 포함하는 기를 포함하는 본원에 공개된 모든 일반적 또는 특이적 화합물을 위해, 기(예를 들어, NRC(O) 또는 NRSO2)의 가역 연결은 또한 본 발명의의 구체예를 구성한다는 것이다(여기서, R은 H이거나 달리 본원에 도시된 바이다) 더구나, 오르토, 메타, 또는 파라 치환체를 포함하는 본 발명의 일반적 또는 특이적 화합물에 포함된 임의의 아릴 고릴 위해, 특이적으로 고려되는 것은, 오르토, 메타, 또는 파라 치환체는 고리 주위에 움직일 수 있고, 하나 초과의 상기 치환체가 고리 주위에서 움직일 수 있다는 것이다(예를 들어, 오르토 기가 파라 위치로 이동될 수 있고/거나 파라 기가 메타 위치로 이동될 수 있음). 특정 구체예에서, 예를 들어, NHSO2 부분은 SO2NH를 위해 교환될 수 있고, 그 다음에 NHSO2 부분은 아릴 고리 위의 대체 위치(alternate position)로 이동될 수 있다.
용어 "효과적"은 그 용어로서 명세서 및/또는 청구범위에서 사용되는 바와 같이(예를 들어, "유효량"), 요구되거나 기대되거나 의도된 결과를 달성하기에 적당함을 의미한다.
"치료" 및 "치료하는"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 피검체에 치료제의 투여 또는 적용 또는 병 또는 건강 관련된 질환의 치료적 이점을 얻기 위한 목적을 위해 피검체에 시술 또는 양상(modality)의 수행을 의미한다. 예를 들어, 박테리아 감염을 지닌 피검체(예를 들어, 포유류, 예컨대 인간)는 본 발명의 화합물의 투여를 포함하는 치료를 받을 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 피검체는 식물일 수 있다, 이로써 식물은 본 발명의 화합물로 치료되어 이로운 결과를 얻을 수 있다(예를 들어, 감염의 감소).
용어 "치료적 이점" 또는 "치료적 효과"는 본 출원을 통해 사용되는 바와 같이, 질환의 의학적 치료의 관점에서 피검체의 웰빙을 증진하거나 높이는 것을 의미한다. 그러나 제한됨 없이 이는, 질병의 징조 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물의 치료적 유효량은 박테리아 감염을 지닌 피검체에 투여될 수 있고, 이로써 상기 감염이 완화 또는 제거될 수 있다.
용어 "피검체"는 본원에 사용된 바와 같이, 동물 또는 식물을 지칭하며, 예컨대, 감염된 동물 또는 식물 또는 감염 의심 또는 감염이 쉬운 동물 또는 식물을 지칭한다. 동물은 예를 들어, 포유류, 새, 물고기, 파충류, 양서류, 및 임의의 다른 척추 동물 또는 무척추동물, 예컨대 경제적, 환경적 및/또는 다른 중요한 것을 포함한다. 포유류는, 제한됨 없이, 인간, 가축, 및 애완동물을 포함한다. 제한 없이, "가축"은 경제적으로 중요한 동물, 예컨대 소, 양, 염소, 토끼 및 말을 포함한다. 새는 제한 없이 닭, 칠면조, 오리 또는 거위를 포함한다. 용어 "식물"은 제한 없이 예를 들어, 과실, 채소, 곡식, 괴경, 콩과 식물, 꽃 및 잎, 예컨대 시금치 또는 담배 잎을 만드는 식물 또는 임의의 다른 경제적으로 또는 환경적으로 중요한 식물을 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "독성"은 감염을 위한 치료의 억제 또는 호스트의 감염을 가능케 하는 특정 특성의 발휘, 유전자 또는 단백질의 발현 제어와 관련된 것이다. 이는 제한 없이, 독성의 생산; 피검체의 세포 또는 조직의 침습 또는 피검체의 세포에 병변의 형성을 가능케하는 다른 인자 또는 단백질의 생산; 치료를 저항하는 바이오필름의 형성; 치주 질환을 이끄는 충치 내 플라그의 형성; 및/또는 건강한 피검체에서 일반적으로 발견된 공생 또는 프로바이오틱 유기체의 억제 또는 변위를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "살균"은 박테리아를 죽이는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "정균(bacteriostatic)"은 박테리아의 성장 또는 번식을 억제하는 것을 말한다.
본 발명의 구체예에 대해 논의된 임의의 제한이 본 발명의 임의의 다른 구체예에 적용될 수 있음을 특이적으로 고려된다. 더구나, 본 발명의 임의의 조성물은 본 발명의 임의의 방법에서 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 방법은 본 발명의 임의의 조성물을 활용하거나 생산하는데 사용될 수 있다.
비록, 본원은 단지 택일적 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하지만, 청구 범위 내 용어 "또는"의 사용은, 단지 택일만을 지칭하거나 상기 택일이 상호 배타적인 것으로 달리 명백히 지시하지 않는다면 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다.
본원을 통해, 용어 "약"은 값이 상기 값을 측정하기 위해 사용되는 장치 및/또는 방법에 대한 에러의 표준 편차를 포함함을 가리키도록 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "하나" 또는 "일"의 단수는 달리 명백히 지지되지 않는다면 하나 또는 그 초과를 의미할 수 있다. 청구범위에서 사용된 바와 같이, "포함하는"과 함께 사용되는 경우에, 단어 "하나" 또는 "일"의 단수는 하나 또는 그 초과를 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "또 다른"은 적어도 제 2 또는 그 초과를 의미할 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범위 내 여러 변화 및 변경이 이 상세한 설명으로부터 당업자에 명백할 것이기 때문에, 본 발명의 바람직한 구체예를 예시하면서, 상세한 설명 및 특이적 실시예는 단지 예시적으로 제공된 것이다.
아래의 도면들은 본 상세한 설명의 일부를 구성하며 본 발명의 어떤 양태를 추가적으로 증명하기 위해 포함된다. 본 발명은 하나 이상의 이들 도면 및 여기에 주어진 특정 구체예들의 상세한 설명의 조합을 참조로 하여 더욱 잘 이해될 수 있다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 하나 이상의 도면을 포함한다. 이 컬러 도면(들)을 갖는 특허 또는 특허 출원 공보는 관련 기관에 청구하고 필요한 요금을 지불함으로써 제공될 수 있을 것이다.
도 1. 신호에 반응하고 QseB로 인전이되는(phosphotransfer) QseC의 자가인산화(autophosphorylation)의 개략도이다.
도 2. EHEC QseC와 비교한 다른 박테리아에서의 QseC 동족의 목록
도 3. WT EHEC, qseC 및 qseB 뮤턴트에 의한 어린 토끼의 결장의 전이 증식(집락형성단위/조직 그램).
도 4. WT EHEC, qseC 및 qseB 뮤턴트에 의한 어린 토끼의 회장 및 맹장의 전이 증식(결과는 집락형성단위/조직 그램으로 표현된다).
도 5. AI-3 길항제에 대한 고속처리 검색. (위) 스크리닝을 도시한 플로우 차트. (아래) DMSO 플레이트(대조군) 및 외부 컬럼에서 양성 및 음성 대조군과 함께 UT 사우스웨스턴 메디컬 센터(달라스, 텍사스) HTS 화합물 파일로부터의 320개 화합물을 함유한 384-웰 플레이트(히트)를 상술한 HTS 검정으로 스크리닝하였다. 각 화합물의 웰 값은 수평의 파란선에서 그래프에 도시하였다. 그래프 상의 수평선은 화합물 또는 DMSO 수단으로부터의 + 및 -3 표준편차를 나타낸다. 양성 대조군은 조절된 적응용 배지로 처리된 샘플이다. 음성 대조군은 무조건 DMEM로 처리된 샘플이다.
도 6A-6B. LED209(1 μM)는 인간 아드레날린성 수용체를 통한 신호화를 방해하지 않는다. 도 6A: HEK293 세포에서의 기초 cAMP 수준 도 6B: HEK293 세포에서 β2-아드레날린성-자극된 cAMP 수준.
도 7A 및 7B. 도 7A. 삼중수소의 노르에피네프린 5 μM (NE); 5 μM 타이로신(타이로신은 음성 대조군이며, QseC에 대한 신호가 아니다)의 QseC에 대한 바인딩; QseC에 대한 NE의 바인딩은 펜톨아민(PE)에 의해 억제하지만 프로프라놀롤(PO)에 의해서는 아니다; 5 pM의 LED209는 QseC에 대한 5 μM NE의 바인딩을 억제하지만, 5 fM LED209는 그렇지 않다. 도 7B. 신호의 부재(NT 비처리), 50 μM 에피네프린(Epi) 및 50 μM 에피네프린 및 5 pM LED209에서의 QseC 자가인산화.
도 8A-8F. 도 8A. 자가 생성된 AI-3를 갖는 WT EHEC(검정색 막대) 및 AI-3 더하기 50 μM 에피네프린(흰색 막대), 자가 생성된 AI-3를 갖는 qseC 뮤턴트(진한 회색 막대) 및 AI-3 더하기 50 μM 에피네프린(밝은 회색 막대)에서 LEE1 유전자 ler, fliC 및 stx2A의 qRT-PCR. 도 8B. 신호의 부재(NT 비처리)(흰색 막대), 50 μM 에피네프린(검정색 막대), 및 50 μM 에피네프린 더하기 5 pM LED209에서 ler의 qRT-PCR. 도 8C. 자가 생성된 AI-3를 갖는 WT(검정색 막대) 및 AI-3 더하기 5 pM of LED209(흰색 막대)에서 LEE 유전자 ler 및 eae, 플라젤라 유전자 flhDC 및 stx2A의 qRT-PCR. 도 8D. 50 μM 에피네프린, 50 μM 에피네프린 더하기 5 nM LED209 및 50 μM 에피네프린 더하기 5 pM LED209(로딩 대조군으로서 횡단-반응성 밴드)과 EHEC의 분비된 단백질의 웨스턴 블롯. 도 8E. LED209(5 μM 및 5 pM)에 의한 AE 병변의 억제. 세포핵 및 박테리아 세포는 적색으로 착색하였고(프로피듐 아이오다이드), 세포뼈대는 녹색으로 착색하였다(FITC-팔로이딘). EHEC는 녹색으로 착색된 받침대(pedestal) 위에 AE 병변을 형성시킨다. LED209로 된 받침대는 없다. * p< 0.05; ** p< 0.001; ***p< 0.0001. 도 8F. LED209는 살모넬라 티피뮤리움, EHEC 및 F. 툴라렌시스의 성장을 억제하지 않는다. (위) 1 μM의 LED209(209), 50 μM 에피네프린(EPI), 및 50 μM 에피네프린 더하기 1 μM LED209(209+EPI)의 부재 및 존재하에 LB 배지에서 살모넬라 티피뮤리움 스트레인 SL1344(SAL)의 성장 곡선. (위) 1 μM의 ED209(209), 50 μM 에피네프린 (EPI), 및 50 μM 에피네프린 더하기 1 μM LED209(209+EPI)의 부재 및 존재하에 DMEM에서 EHEC 스트레인 8624(EC-WT)의 성장 곡선. (아래) 1 μM of LED209 (209), 50 μM 에피네프린 (EPI), 또는 50 μM 에피네프린 더하기 1 μM LED209 (209+EPI)의 부재 및 존재하에 뮬러 힌톤(Mueller Hinton)에서 F. 툴라렌시스 스트레인 LVS의 성장 곡선(이 약화된 스트레인으로 인해 LVS가 성장 곡선에 사용되고, 이들 실험은 BSL-2 실험실에서 수행될 수 있다; SCHU S4로의 모든 실험은 BSL-3 억제에서 수행되었다)
도 9. 버퍼(5% DMSO, 23% PEG400, 70% 소듐 비카보네이트 pH 9, 2% Tween 80), 또는 버퍼에서 20 mg/kg의 LED209로 처리된 EHEC에 의한 어린 토끼의 전이 증식. LED209 치료제는 EHEC 감염 3시간 전, 동시, 감염 후 3시간 및 24시간에 투여되었다. 회장 및 맹장에서 치료되거나 치료되지 않은 동물 간의 차이는 없었다. 약물로 치료된 동물의 결장에서만 비-통계학적으로 의미있는 차이가 있었다.
도 10A-10C. LED209는 포유류의 아드레날린성 신호화를 방해하며, 경구성 생체이용이 가능하며, 마우스에 비독성이다. 도 10A. β 아드레날린성 수용체-조절 cAMP 생성을 방해하는 LED209의 능력은 β2(내인성)(검정색 막대) 또는 외인성 발현된 β1(흰색 막대) 또는 β3(회색 막대) 아드레날린성 수용체를 발현하는 HEK293 세포에서 평가된다. LED209는 임의의 3 계열의 β 아드레날린성 수용체를 활성화시키지 않으며 β-아드레날린성-특정 작용제(β1:dob=도부타민, β2:terb=터불라린, 또는 β3: BRL=BRL37344)에 의한 활성을 차단하지도 않는다. 도 10B. CD-1 암컷 마우스에 IV 볼루스로서 또는 경구 급식에 의해 20 mg/kg LED209를 투여하였다. 투여 후 여러 시간에서, 각 3마리 동물의 군들을 배뇨끝머리 출혈시켰다. 혈장을 분리하고 후에 분석하기 위해 -80℃에서 냉동시켰다. 20 ng의 내부 표준물질을 함유한 200 μl의 아세토니트릴과 함께 100 μl의 혈장으로부터 단백질을 침전시켰다. 샘플을 마이크로원심분리기에서 회전시켜 자유 화합물을 분리하고 문헌(Materials and Methods)에 기재된 바와 같이 전자분사 LC/MS/MS 분석을 수행하였다. 샘플을 블랭크 혈장에서 상술한 바와 같이 만들어진 표준 곡선을 사용하여 정량하였다. 데이터는 WinNonLin(Pharsight)에서 비구분된 모델을 사용하여 평가하였다. 생체이용률은 AUCoral/AUCIV X DoseIV/Doseoral로서 계산되었다. 도 10C. LED209에 대한 기본적 독성 평가: 화합물을 3마리의 암컷 CD-1 마우스에서 20 mg/kg에서 경구 급식에 의해 5일간 매일 투여하고 급식에 의해 단지 버퍼만을 투여받은 3마리의 마우스와 비교하였다. 소정의 이들 마우스의 장기 무게에서 눈에 띄는 차이는 없었다.
도 11A-11B. 도 11A. 50 μM NE의 부재 및 존재하에 S. 티피뮤리움의 WT 및 qseC 뮤턴트(ΔqseC)에서 시험관내 sifA의 qRT PCR. 도 11B. 108 cfu의 와일드-타입(WT) S. 티피뮤리움 스트레인 SL1344, 또는 qseC 동종동계의 뮤턴트로의 복막내(intraperitonial) 감염, 또는 LED209 (20 mg/kg) 단독으로의 경구성 치료, 및 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염 더하기 LED209(20 mg/kg)의 마우스(129x1/SvJ) 생존 플롯.
도 12. LED209는 생체내에서 S. 티피뮤리움 발병력을 억제한다. LED209(20 mg/kg) 단독으로의 경구 치료, 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염, 및 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염 더하기 LED209(20 mg/kg)의 마우스(129x1/SvJ) 생존 플롯. 감염 후 24시간에 치료되지 않고 감염된 마우스의 단지 40%만이 생존하였으며, 치료되고 감염된 마우스의 80%가 생존하였다. 중요한 점은, 그들이 희생된 12일 동안 감염되고 치료되지 않은 감염된 마우스는 100% 사망하였지만, 치료되고 감염된 마우스의 20%는 생존하였다는 점이다.
도 13A-13B. 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염된 마우스, 및 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염 후 48시간 LED209(20 mg/kg)이 더해진 마우스의 간 및 비장으로부터 수확된 S. 티피뮤리움의 cfus 도 13B. LED209(흰색 막대)의 부재(검정색 막대) 및 존재(5 pM)하에 시험관내에서 플라젤라 조절자(flhDC) 및 sifA의 발현의 qRT PCR
도 14A-14E. 도 14A. 대장균 fliC :: lacZ 퓨전을 LED209의 부재 및 5 pM의 존재하에 F. 툴라렌시스 qseC(qseC pFTQseC)으로 보완된 WT 대장균, qseC 대장균 뮤턴트, 및 qseC 대장균 뮤턴트에 도입하였다. F. 툴라렌시스 QseC를 His-Tag으로 표지하였고 입구(inlet)는 F. 툴라렌시스 QseC가 대장균 qseC 뮤턴트에서 발현됨을 보여준다. 도 14B. LED209의 부재 및 존재(5 nM)하에 F. 툴라렌시스 SCHU S4로의 J774 뮤린 마이크로파지의 감염. 도 14C. LED209의 부재(회색 막대) 및 존재(5 pM)(흰색 막대)하에 F. 툴라렌시스 발병 유전자의 qRT PCR. 도 14D. 시험관내 및 생체내(비장, 간 및 폐)에서 성장하는 동안 SCHU S4에서 qseC의 발현을 측정한 qRT-PCR. 이들 데이터는 30 cfu의 SCHU S4로 비강내 감염된 5 C3H HeN 마우스로부터 수집되었다. qseC의 qRT-PCR은 rpoA에 대해 표준화된다. Y-axis: 폴드-변화. 도 14E. LED209 (20 mg/kg) 단독으로 경구 치료, 30 cfu의 SCHU S4로 비강내 감염, 및 30 cfu의 SCHU S4로 비강내 감염 더하기 LED209(20 mg/kg)의 마우스(C3H HeN) 생존 플롯. *p< 0.01; **p< 0.001; ***p< 0.0001.
도 15. LED209에 의한 프란시셀라 툴라렌시스의 생체내 억제.
도 16. 독성실험에서 비히클 단독 또는 LED209로 치료된 마우스의 중량.
도 17. LED209의 약동력학은 선형이다. CD-1 암컷 마우스에 IV 볼루스로서 20 mg/kg, 10 mg/kg, 및 5 mg/kg LED209를 투여하였다. 투여 후 여러 시간에서, 각 3마리 동물의 군들을 배뇨끝머리 출혈시켰다. 혈장을 분리하고 후에 분석하기 위해 -80℃에서 냉동시켰다. 20 ng의 내부 표준물질을 함유한 200 μl의 아세토니트릴과 함께 100 μl의 혈장으로부터 단백질을 침전시켰다. 샘플을 마이크로원심분리기에서 회전시켜 자유 화합물을 분리하고 문헌(Materials and Methods)에 기재된 바와 같이 전자분사 LC/MS/MS 분석을 수행하였다. 샘플을 블랭크 혈장에서 상술한 바와 같이 만들어진 표준 곡선을 사용하여 정량하였다. 데이터는 WinNonLin(Pharsight)에서 비구분된 모델을 사용하여 평가하였다. AUC는 투여량에 비례하여 증가하였다.
도 18. 비히클 또는 LED209로 치료된 마우스의 혈액 화학 및 완전한 혈액 카운트.
도 19. QseC 동족의 네이버-조이닝 트리. 공통 네이버-조이닝 트리는 1000 부트스트렙으로 쥬크스 칸터 제네틱 디스턴스 모델(Jukes Cantor genetic distance model)을 사용하여 확립하였다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 하나 이상의 도면을 포함한다. 이 컬러 도면(들)을 갖는 특허 또는 특허 출원 공보는 관련 기관에 청구하고 필요한 요금을 지불함으로써 제공될 수 있을 것이다.
도 1. 신호에 반응하고 QseB로 인전이되는(phosphotransfer) QseC의 자가인산화(autophosphorylation)의 개략도이다.
도 2. EHEC QseC와 비교한 다른 박테리아에서의 QseC 동족의 목록
도 3. WT EHEC, qseC 및 qseB 뮤턴트에 의한 어린 토끼의 결장의 전이 증식(집락형성단위/조직 그램).
도 4. WT EHEC, qseC 및 qseB 뮤턴트에 의한 어린 토끼의 회장 및 맹장의 전이 증식(결과는 집락형성단위/조직 그램으로 표현된다).
도 5. AI-3 길항제에 대한 고속처리 검색. (위) 스크리닝을 도시한 플로우 차트. (아래) DMSO 플레이트(대조군) 및 외부 컬럼에서 양성 및 음성 대조군과 함께 UT 사우스웨스턴 메디컬 센터(달라스, 텍사스) HTS 화합물 파일로부터의 320개 화합물을 함유한 384-웰 플레이트(히트)를 상술한 HTS 검정으로 스크리닝하였다. 각 화합물의 웰 값은 수평의 파란선에서 그래프에 도시하였다. 그래프 상의 수평선은 화합물 또는 DMSO 수단으로부터의 + 및 -3 표준편차를 나타낸다. 양성 대조군은 조절된 적응용 배지로 처리된 샘플이다. 음성 대조군은 무조건 DMEM로 처리된 샘플이다.
도 6A-6B. LED209(1 μM)는 인간 아드레날린성 수용체를 통한 신호화를 방해하지 않는다. 도 6A: HEK293 세포에서의 기초 cAMP 수준 도 6B: HEK293 세포에서 β2-아드레날린성-자극된 cAMP 수준.
도 7A 및 7B. 도 7A. 삼중수소의 노르에피네프린 5 μM (NE); 5 μM 타이로신(타이로신은 음성 대조군이며, QseC에 대한 신호가 아니다)의 QseC에 대한 바인딩; QseC에 대한 NE의 바인딩은 펜톨아민(PE)에 의해 억제하지만 프로프라놀롤(PO)에 의해서는 아니다; 5 pM의 LED209는 QseC에 대한 5 μM NE의 바인딩을 억제하지만, 5 fM LED209는 그렇지 않다. 도 7B. 신호의 부재(NT 비처리), 50 μM 에피네프린(Epi) 및 50 μM 에피네프린 및 5 pM LED209에서의 QseC 자가인산화.
도 8A-8F. 도 8A. 자가 생성된 AI-3를 갖는 WT EHEC(검정색 막대) 및 AI-3 더하기 50 μM 에피네프린(흰색 막대), 자가 생성된 AI-3를 갖는 qseC 뮤턴트(진한 회색 막대) 및 AI-3 더하기 50 μM 에피네프린(밝은 회색 막대)에서 LEE1 유전자 ler, fliC 및 stx2A의 qRT-PCR. 도 8B. 신호의 부재(NT 비처리)(흰색 막대), 50 μM 에피네프린(검정색 막대), 및 50 μM 에피네프린 더하기 5 pM LED209에서 ler의 qRT-PCR. 도 8C. 자가 생성된 AI-3를 갖는 WT(검정색 막대) 및 AI-3 더하기 5 pM of LED209(흰색 막대)에서 LEE 유전자 ler 및 eae, 플라젤라 유전자 flhDC 및 stx2A의 qRT-PCR. 도 8D. 50 μM 에피네프린, 50 μM 에피네프린 더하기 5 nM LED209 및 50 μM 에피네프린 더하기 5 pM LED209(로딩 대조군으로서 횡단-반응성 밴드)과 EHEC의 분비된 단백질의 웨스턴 블롯. 도 8E. LED209(5 μM 및 5 pM)에 의한 AE 병변의 억제. 세포핵 및 박테리아 세포는 적색으로 착색하였고(프로피듐 아이오다이드), 세포뼈대는 녹색으로 착색하였다(FITC-팔로이딘). EHEC는 녹색으로 착색된 받침대(pedestal) 위에 AE 병변을 형성시킨다. LED209로 된 받침대는 없다. * p< 0.05; ** p< 0.001; ***p< 0.0001. 도 8F. LED209는 살모넬라 티피뮤리움, EHEC 및 F. 툴라렌시스의 성장을 억제하지 않는다. (위) 1 μM의 LED209(209), 50 μM 에피네프린(EPI), 및 50 μM 에피네프린 더하기 1 μM LED209(209+EPI)의 부재 및 존재하에 LB 배지에서 살모넬라 티피뮤리움 스트레인 SL1344(SAL)의 성장 곡선. (위) 1 μM의 ED209(209), 50 μM 에피네프린 (EPI), 및 50 μM 에피네프린 더하기 1 μM LED209(209+EPI)의 부재 및 존재하에 DMEM에서 EHEC 스트레인 8624(EC-WT)의 성장 곡선. (아래) 1 μM of LED209 (209), 50 μM 에피네프린 (EPI), 또는 50 μM 에피네프린 더하기 1 μM LED209 (209+EPI)의 부재 및 존재하에 뮬러 힌톤(Mueller Hinton)에서 F. 툴라렌시스 스트레인 LVS의 성장 곡선(이 약화된 스트레인으로 인해 LVS가 성장 곡선에 사용되고, 이들 실험은 BSL-2 실험실에서 수행될 수 있다; SCHU S4로의 모든 실험은 BSL-3 억제에서 수행되었다)
도 9. 버퍼(5% DMSO, 23% PEG400, 70% 소듐 비카보네이트 pH 9, 2% Tween 80), 또는 버퍼에서 20 mg/kg의 LED209로 처리된 EHEC에 의한 어린 토끼의 전이 증식. LED209 치료제는 EHEC 감염 3시간 전, 동시, 감염 후 3시간 및 24시간에 투여되었다. 회장 및 맹장에서 치료되거나 치료되지 않은 동물 간의 차이는 없었다. 약물로 치료된 동물의 결장에서만 비-통계학적으로 의미있는 차이가 있었다.
도 10A-10C. LED209는 포유류의 아드레날린성 신호화를 방해하며, 경구성 생체이용이 가능하며, 마우스에 비독성이다. 도 10A. β 아드레날린성 수용체-조절 cAMP 생성을 방해하는 LED209의 능력은 β2(내인성)(검정색 막대) 또는 외인성 발현된 β1(흰색 막대) 또는 β3(회색 막대) 아드레날린성 수용체를 발현하는 HEK293 세포에서 평가된다. LED209는 임의의 3 계열의 β 아드레날린성 수용체를 활성화시키지 않으며 β-아드레날린성-특정 작용제(β1:dob=도부타민, β2:terb=터불라린, 또는 β3: BRL=BRL37344)에 의한 활성을 차단하지도 않는다. 도 10B. CD-1 암컷 마우스에 IV 볼루스로서 또는 경구 급식에 의해 20 mg/kg LED209를 투여하였다. 투여 후 여러 시간에서, 각 3마리 동물의 군들을 배뇨끝머리 출혈시켰다. 혈장을 분리하고 후에 분석하기 위해 -80℃에서 냉동시켰다. 20 ng의 내부 표준물질을 함유한 200 μl의 아세토니트릴과 함께 100 μl의 혈장으로부터 단백질을 침전시켰다. 샘플을 마이크로원심분리기에서 회전시켜 자유 화합물을 분리하고 문헌(Materials and Methods)에 기재된 바와 같이 전자분사 LC/MS/MS 분석을 수행하였다. 샘플을 블랭크 혈장에서 상술한 바와 같이 만들어진 표준 곡선을 사용하여 정량하였다. 데이터는 WinNonLin(Pharsight)에서 비구분된 모델을 사용하여 평가하였다. 생체이용률은 AUCoral/AUCIV X DoseIV/Doseoral로서 계산되었다. 도 10C. LED209에 대한 기본적 독성 평가: 화합물을 3마리의 암컷 CD-1 마우스에서 20 mg/kg에서 경구 급식에 의해 5일간 매일 투여하고 급식에 의해 단지 버퍼만을 투여받은 3마리의 마우스와 비교하였다. 소정의 이들 마우스의 장기 무게에서 눈에 띄는 차이는 없었다.
도 11A-11B. 도 11A. 50 μM NE의 부재 및 존재하에 S. 티피뮤리움의 WT 및 qseC 뮤턴트(ΔqseC)에서 시험관내 sifA의 qRT PCR. 도 11B. 108 cfu의 와일드-타입(WT) S. 티피뮤리움 스트레인 SL1344, 또는 qseC 동종동계의 뮤턴트로의 복막내(intraperitonial) 감염, 또는 LED209 (20 mg/kg) 단독으로의 경구성 치료, 및 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염 더하기 LED209(20 mg/kg)의 마우스(129x1/SvJ) 생존 플롯.
도 12. LED209는 생체내에서 S. 티피뮤리움 발병력을 억제한다. LED209(20 mg/kg) 단독으로의 경구 치료, 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염, 및 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염 더하기 LED209(20 mg/kg)의 마우스(129x1/SvJ) 생존 플롯. 감염 후 24시간에 치료되지 않고 감염된 마우스의 단지 40%만이 생존하였으며, 치료되고 감염된 마우스의 80%가 생존하였다. 중요한 점은, 그들이 희생된 12일 동안 감염되고 치료되지 않은 감염된 마우스는 100% 사망하였지만, 치료되고 감염된 마우스의 20%는 생존하였다는 점이다.
도 13A-13B. 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염된 마우스, 및 108 cfu의 S. 티피뮤리움 스트레인 SL1433으로의 복막내 감염 후 48시간 LED209(20 mg/kg)이 더해진 마우스의 간 및 비장으로부터 수확된 S. 티피뮤리움의 cfus 도 13B. LED209(흰색 막대)의 부재(검정색 막대) 및 존재(5 pM)하에 시험관내에서 플라젤라 조절자(flhDC) 및 sifA의 발현의 qRT PCR
도 14A-14E. 도 14A. 대장균 fliC :: lacZ 퓨전을 LED209의 부재 및 5 pM의 존재하에 F. 툴라렌시스 qseC(qseC pFTQseC)으로 보완된 WT 대장균, qseC 대장균 뮤턴트, 및 qseC 대장균 뮤턴트에 도입하였다. F. 툴라렌시스 QseC를 His-Tag으로 표지하였고 입구(inlet)는 F. 툴라렌시스 QseC가 대장균 qseC 뮤턴트에서 발현됨을 보여준다. 도 14B. LED209의 부재 및 존재(5 nM)하에 F. 툴라렌시스 SCHU S4로의 J774 뮤린 마이크로파지의 감염. 도 14C. LED209의 부재(회색 막대) 및 존재(5 pM)(흰색 막대)하에 F. 툴라렌시스 발병 유전자의 qRT PCR. 도 14D. 시험관내 및 생체내(비장, 간 및 폐)에서 성장하는 동안 SCHU S4에서 qseC의 발현을 측정한 qRT-PCR. 이들 데이터는 30 cfu의 SCHU S4로 비강내 감염된 5 C3H HeN 마우스로부터 수집되었다. qseC의 qRT-PCR은 rpoA에 대해 표준화된다. Y-axis: 폴드-변화. 도 14E. LED209 (20 mg/kg) 단독으로 경구 치료, 30 cfu의 SCHU S4로 비강내 감염, 및 30 cfu의 SCHU S4로 비강내 감염 더하기 LED209(20 mg/kg)의 마우스(C3H HeN) 생존 플롯. *p< 0.01; **p< 0.001; ***p< 0.0001.
도 15. LED209에 의한 프란시셀라 툴라렌시스의 생체내 억제.
도 16. 독성실험에서 비히클 단독 또는 LED209로 치료된 마우스의 중량.
도 17. LED209의 약동력학은 선형이다. CD-1 암컷 마우스에 IV 볼루스로서 20 mg/kg, 10 mg/kg, 및 5 mg/kg LED209를 투여하였다. 투여 후 여러 시간에서, 각 3마리 동물의 군들을 배뇨끝머리 출혈시켰다. 혈장을 분리하고 후에 분석하기 위해 -80℃에서 냉동시켰다. 20 ng의 내부 표준물질을 함유한 200 μl의 아세토니트릴과 함께 100 μl의 혈장으로부터 단백질을 침전시켰다. 샘플을 마이크로원심분리기에서 회전시켜 자유 화합물을 분리하고 문헌(Materials and Methods)에 기재된 바와 같이 전자분사 LC/MS/MS 분석을 수행하였다. 샘플을 블랭크 혈장에서 상술한 바와 같이 만들어진 표준 곡선을 사용하여 정량하였다. 데이터는 WinNonLin(Pharsight)에서 비구분된 모델을 사용하여 평가하였다. AUC는 투여량에 비례하여 증가하였다.
도 18. 비히클 또는 LED209로 치료된 마우스의 혈액 화학 및 완전한 혈액 카운트.
도 19. QseC 동족의 네이버-조이닝 트리. 공통 네이버-조이닝 트리는 1000 부트스트렙으로 쥬크스 칸터 제네틱 디스턴스 모델(Jukes Cantor genetic distance model)을 사용하여 확립하였다.
본 발명은 항생제와 달리, 박테리아를 죽이거나 성장을 방해하지는 않지만 박테리아 감염을 치료하는데 사용될 수 있는 화합물을 제공함에 의해 종래 기술의 단점을 극복한 것이다. 이들 화합물들은 박테리아의 내성을 쉽게 유도하지 않으며 따라서 박테리아 감염 치료를 위한 새로운 방법을 제시한다.
A. 박테리아 및 박테리아 감염
1.
장출혈성
대장균 (
EHEC
) 혈청형
O157
:
H7
카테고리 B 생체위협제(biothreat agent), EHEC는 전세계적으로 혈변성 설사 및 용혈요독증후군(HUS), 일종의 신장 이상을 일으키는 음식물에 기원하는 병원체이다. 미국에서 매년, EHEC는 약 73,000명의 질환자, 1,800-3,600명의 입원자 및 61-541명의 사망자와 함께 4억 달러를 초과하는 경제적 비용을 초래한다(월드와이드웹.cdc.gov)(Kapper and O'Brien, 1998). 아르헨티나, 칠레 및 우루과이에서, EHEC는 혈변성 설사의 경우의 40%에 관련성이 있다. U.K.에서, EHEC 발생률은 2.7/100,000으로 해마다 증가하고 있다. 1996년 일본 사카이에서는 7,500 케이스가 넘게 발병하였다(CDC 웹페이지).
EHEC는 매우 낮은 감염량을 가지며(50 집락형성단위(cfu)만큼 낮음), 이는 EHEC 발병의 주요인자 중 하나이다. EHEC는 창자 상피 세포상에 부착 및 제거(AE) 병변을 초래하는 곳인 대장에서 전이 증식한다. AE 병변은 결장 상피의 미세융모의 파괴 및 받침대-유사(pedestal-like) 구조를 형성하기 위한 세포뼈대의 재배열을 특징으로 하며, 이는 개별적으로 세균을 받친다. AE 병변의 형성에 참여하는 유전자는 엔테로사이트 이페이스먼트의 로쿠스(LEE)로 명명된 염색체 병원성 아일랜드 내에 엔코딩된다. 사망률은 이들 박테리아에 의해 시가 독소(Stx)로 명명되는 강한 독성을 제조 및 방출하는 EHEC 감염 줄기세포와 관련된다. 이 단백질 합성의 강력한 억제제는 계로 흡수되어 신장 및 중추신경계(CNS)에 발견되는 수용체와 결합함으로써 HUS, 발작, 뇌부종, 및/또는 혼수를 일으킬 수 있고, 시가 독소는 식물 독소 리신과 동일한 효능 및 작용 메커니즘을 갖는다: 이는 상피 세포, 일차적으로 HUS를 유도하는 요로에서 세포 사멸을 일으키며, 대부분 사망으로 이어진다. 시가 독소 엔코딩 유전자는 λ-형 박테리오파지의 만기 유전자 내에 위치하며, 상기 파지가 이의 용해 주기로 들어갈 때 전사된다. 박테리아 외피, DNA 복제, 또는 단백질 합성(이는 일반적인 항생제의 목표임)에서의 혼란은 박테리오파지를 용해 주기로 들어가도록 신호를 주는 박테리아성 EHEC 세포에서 SOS 반응을 촉발한다. 파지가 복제되고, 시가 독소가 생성되고, 파지는 박테리아를 용해시키고, 이에 의해 숙주에 시가 독소가 방출된다. 결과적으로, 일반적인 항박테리아제로의 EHEC 감염의 치료는 매우 논란의 소지가 있으며, 장점보다는 단점이 많을 수 있다. 사실, 항생제는 시가 독소의 발현 및 방출을 촉진하며, 이에 의해 HUS 및 CNS 관련 질병의 발생 및 중증도를 증가시킨다 (Kimmitt et al., 1999; Kimmitt et al., 2000). 현재, 이 독소의 혈장영동법(plasmaphoresis)을 제외한 HUS에 대한 치료 방법이 없다. 결론적으로, 이러한 중요한 미충족 의료에 대한 창조적이고, 비용 효율적인 EHEC 치료 방법이 시급히 요구된다.
2. 살모넬라
다른 카테고리 B 생체위협제, 살모넬라 엔테리카는 식중독 및 창자 또는 장티푸스 열을 일으키는 중요한 인간 병원체를 포함한다(Boyle et al., 2007). 비장티푸스성(Nontyphoidal) 살모넬라 감염(즉, '식중독' 또는 살모넬라증)은 통상적으로 4-7일간 치료없이도 회복되는 중등도 설사, 열, 구역, 및 동통의 경증상을 나타낸다. 그럼에도, 비장티푸스성 감염은 매년 미국에서 약 ~1.4 백만명의 감염자, 16,000명의 입원자, 및 400-600명의 사망자로서 커다란 의료 영향력을 갖는다. 경제적 측면에서, 이러한 영향력은 2005년에 24억 달러로 추산되었다(Frenzen, P., 2006). 살모넬라 명명법 및 종들 확인은 복잡하다. 대부분의 식중독은 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리움(S. 티피뮤리움) 또는 살모넬라 엔테리카 세로바 엔테리티디스(S. 엔테리티디스)에 의해 초래된다. 후자는 종종 달걀 및 가금류와 관련된다. 대조적으로, 장티푸스 열은 살모넬라 엔테리카 세로바 타이피(S. 타이피)에 의해 초래되지만 미국에서 흔하지는 않다. 2600개가 넘는 살모넬라 엔테리카 세로바가 확인되었다(Todar, K. 2005). 전세계적인 연구는 많은 항생제에 대해 살모넬라의 내성이 증가하고 있음을 보여준다(Crump et al., 2003; Davis et al., 1999; Plant et al., 1982; Nakaya et al., 2003; Samrakandi et al., 2004; Weill et al., 2006). 현재 살모넬라 감염에 대한 명확하고 새로운 치료법이 요구된다. 이상적인, 임의의 신규 약물은 새로운 메커니즘을 목표로 하고 내성을 피하여야 할 것이다.
3.
프란시셀라
툴라렌시스(
Francisella
tularensis
)
프란시셀라 툴라렌시스는 생물학적 안전 수준 3(Biosafety Level 3 (BSL-3))내에서 처리되어야 하는 카테고리 A 생물위협 작용제이며 오염물이다. 야토병(Tularemia)는 분류상 인수공통의 질환(zoonotic disease)으로 여겨지며, 사람 감염의 발병율은 낮다. 프란시셀라 툴라렌시스는 고도의 감염 병원체이며, 10 마리만큼 적은 유기체로도 인간에게서 질환을 유발시킬 수 있다(Golovliov et al., 1997). 그러한 질환은 여러 임상 증상을 나타낼 수 있다(Prior et al ., 2001; Pullen and Stuart, 1945; Stuart and Pullen, 1945; Syrjala et al ., 1986). 인간에서의 이의 높은 감염성 및 치사율로 인해서, 프란시셀라 툴라렌시스는 고위험 생물테러 작용제로 분류되었다. 추가로, 프란시셀라 툴라렌시스 병인에 대한 정보는 아주 적으며, 유일한 백신인 프란시셀라 툴라렌시스 생백신 균주(live vaccine strain (LVS))는 용이하게 구입할 수 없고 거의 특성화되지 않았다(Sandstrom, 1994). 프란시셀라 툴라렌시스에 의한 자연 감염은 항생제에 의해서 용이하게 처리될 수 있지만, 이는 무기화된 다중-항생제 내성 균주에 의한 경우는 아닐 수 있으며, 따라서, 대안적인 치료제가 요구되고 있다(Checroun et al., 2006; Clemens et al., 2005; Clemens et al., 2004; Fortier et al., 1995; Lee et al., 2006; Tarnvik, 1999).
4. 식물 병원체
이하 더욱 상세히 기재된 쿼럼 센싱(Quorum sensing)은 특정의 식물 병원성 박테리아의 활성에서 역할을 한다. 박테리아성 식물 병원체는 숙주 세포 성분을 공격하는 일련의 효소를 생성시키며, 이들 효소는 숙주 방어 반응의 억제 및 감염의 확립에 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 감염된 식물 또는 예비-처리된 식물에 사용되어 그러한 감염을 억제할 수 있다.
박테리아성 병원체, 예컨대, 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora)는 병독 인자(virulence factor), 예컨대, 식물 세포에 진입하고 식물 조직을 분해하는데 있어서의 박테리아를 보조하는 분해 효소(degradative enzyme)를 생성시킨다. 이들 인자의 생성은 쿼럼 센싱에 의해서 조절된다. 참조[Pirhonen et al., 1993; von Bodman et al., 2003]. 몇 가지 신호분자 그룹이 상이한 미생물 쿼럼 센싱 시스템에 관련되어 있다. 참조[Fuqua et al., 1996; Robson et al., 1997]. 이들 중에, 최상으로 특성화된 것은 오토인듀서(autoinducer (AI))(본원 전체에 걸친 용어)로도 알려진 N-아실 호모세린 락톤(AHL)이다. AHL은 많은 그램 음성 박테리아의 쿼럼 센싱 시스템에서 사용되는 광범위하게 보존된 신호 분자 패밀리의 구성원이다. 이들은 또한 박테리아성 병원체, 예컨대, 에르위니아 카로토보라 , 에르위니아 크리산테미 ( Erwinia chrysanthemi ) 및 에르위니아 스테와르티( Erwinia stewartii)의 병독 유전자의 발현을 포함한 다양한 생물학적 활성 범위의 조절에 연루되어 있다.
특정의 그램-양성 박테리아가 또한 쿼럼 센싱에 의해서 영향을 받는다. 본 발명의 화합물에 의해서 처리 가능한 식물 질환을 유발시킬 수 있는 쿼럼 센싱 병원성 박테리아의 비-제한 예는 아그로박테리움 투메파키엔스( Agrobacterium tumefaciens), 판토에아 스테와르티 ( Pantoea stewartii ), 에르위니아 카로토보라( Erwinia carotovora ), 에르위니아 크리산테미 ( Erwinia chrysanthemi ), 에르위니아 스테바르티 ( Erwinia stewartii ), 랄스토니아 솔라나세룸( Ralstonia solanacearum), 슈도모나스 시링게 ( Pseudomonas syringae ), 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa ) 및 잔토모나스 캠페스트리스(Xanthomonas campestris)를 포함한다.
i.
에르위니아(
Erwinia
)
에르위니아는 대부분의 식물 병원성 종을 함유하는 장내 박테리아 속(genus)에 속한다. 이는 대장균(대장균), 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella) 및 예르시니아(Yersinia)와 관련된 그램-음성 박테리아이다. 이러한 속의 공지된 구성원은 에르위니아 아밀로보라 ( Erwinia amylovora ) 종이 있으며, 이는 사과, 배, 및 그 밖의 장미과 작물에 대해서 화상병(fireblight)을 유발시킨다. 에르위니아 카로토보라는 또 다른 식물 병원체이다. QseC 센서를 지닌 이러한 병원체는 숙주 범위가 광범위하며(당근, 감자, 토마토, 녹색 채소, 호박 및 그 밖의 호리병박, 양파, 피망 등), 이러한 병원체가 침습하는 대부분의 어떠한 식물 조직에서 질환을 유발시킬 수 있다. 이는 수확후 손실, 및 저장된 과일 및 채소에서의 공통된 부패 원인 면에서 경제적으로 아주 중요한 병원체이다. 에르위니아 카로토보라에 의해서 야기된 부패는 종종 박테리아성 무름병(bacterial soft rot (BSR))으로 일컬어진다. 대부분의 식물 또는 식물 부분은, 일정한 유형의 상처가 존재하지 않은 한, 박테리아에 의한 침습에 저항할 수 있다. 높은 습도 및 30℃ 정도의 온도는 부패의 전개에 좋은 환경이다. 덜 병독성인 돌연변이체가 생산될 수 있다. 병독 인자는 펙티나제(pectinase), 셀룰라제(이는 식물 세포벽을 분해시킨다), 및 프로테아제, 리파아제, 자일라나제(xylanase) 및 누클레아제(nuclease)를 포함한다. 다른 병원성 에르위니아 종은 에르위니아 크리산테미(야생 및 저장시에 옥수수의 BSR을 유발시킴) 및 에르위니아 스테와르티(옥수수에서 스테와르트 시들음병(Stewart's wilt)을 유발시킴)를 포함한다.
ii
.
랄스토니아(
Ralstonia
)
랄스토니아는 슈도모나스 속에 앞서 포함된 프로테오박테리아의 속에 속한다. 한 가지 주목할 만한 종은 박테리아성 시들음병의 원인제인 랄스토니아 솔라나세룸( Ralstonia solanacearum)이다. 랄스토니아 솔라나세룸은 100종의 식물종, 예컨대, 토마토, 가지 나무, 피망, 담배, 왜무(Japanese radish) 및 딸기를 감염시킨다(Kelman, 1953). 생강, 오디, 바나나 뿐만 아니라 관상식물(예, 제라늄(geranium))이 또한 민감할 수 있다(Daughtrey, 2003). 이들 종은 적어도 5 가지의 레이스(race) 및 5 가지의 생태형(biovar)으로 더 분류된다. 각각의 레이스는 상이한 식물 서브셋에 영향을 준다.
랄스토니아 솔라나세룸 레이스 3 bv 2는 온대기후에 적응된 균주이다(Haywood et al ., 1998; Stead et al ., 1996). 랄스토니아 솔라나세룸의 다른 생태형은 감자를 감염시킬 수 있지만; bv 2이 단연 온대 지역에서 가장 파괴적인 생태형이다. 유기체는 일차적으로 감자를 감염시키는 좁은 숙주 범위를 지니고 있다(Hayward, 2000). 잿빛무늬병(Brown rot)은 서유럽에서 감자의 심각한 질병으로 최근 출현하고 있으며(Stead et al ., 1996), 랄스토니아 솔라나세룸 bv 2는 유럽 연합(EU)에서 무관용 검역 유기체로서 등재되어 있다((Official J. Eur. Communities, 1998). 잿빛무늬병에 영향을 받은 이들 국가에서, 질환 감시 및 근절 비용이 상당하게 되었다. 병원체는 터키에서의 감자에서 보고되었지만, 현재 감자에서의 규제가 없는 미국 대륙에서 감자에서는 아직까지 관찰되지 않았다. 그러나, 위스콘신에서의 제라늄에서 bv 2를 발견한 보고(Williamson et al ., 2001; Kim et al ., 2002)는 병원체가 감자로 이동했음을 예상할 수 있다. 본 발명에 의해서 고려되는 다른 랄스토니아 종은 랄스토니아 유트로파 ( Ralstonia eutropha ) 및 랄스토니아 메탈리두란스(Ralstonia metallidurans)를 포함한다.
5. 바이오필름(
Biofilm
)
본원에서 사용된 용어 "바이로필름(biofilm)"은 병원체가, 이로 한정되는 것은 아니지만, 돌(stone), 금속, 플라스틱, 유리(glass) 및 목재를 포함한 재료로 제조된 지지체에 결합하는 경우에 자연적으로 생성되는 물질을 나타낸다. "바이오필름"은 또한 세포외 폴리사카라이드와 단백질성 물질을 생성하며, 그러한 물질은 세포를 고정하는 천연 접착제(natural glue)로서 작용한다. 자연에서, 비필라멘트-형성 미생물이 pH, 용존 산소, 및 영양분과 관련하여 최적의 성장 환경을 제공하는 바이오필름의 영역내에 있는 바이오필름 표면에 점착한다. 영양분이 다공성 표면 및 습윤, 건조 표면을 포함한 고형 표면상에 농축되는 경향이 있기 때문에, 미생물은 비부착 성장에 의해서 보다는 고형 표면에 세포 부착을 통해서 에너지를 구한다.
단세포 유기체는 일반적으로는 두 가지의 독특한 거동 방식을 나타낸다. 첫 번째는 가족성 떠돌이(familiar free floating), 또는 플랑크톤성 형태이며, 단일 세포들이 일부 액체 매질 중에서 독립적으로 떠돌아다니거나 유영한다. 두 번째는 고착 상태인 것들로, 이들 세포는 서로 및 일반적으로는 고형 표면에 조밀하게 팩킹되고 단단히 고정된다. 거동에서의 변화는 쿼럼 센싱(이하 기재됨) 뿐만 아니라 종들간에 상이한 다른 메카니즘을 포함한 많은 인자에 의해서 촉발된다. 세포가 거동 방식을 바꾸는 경우에, 세포는 큰 유전자 조(large suites of genes)가 상향- 및 하향-조절되는 거동에서의 표현형 변화를 진행한다.
바이오필름은, 모든 감염의 80% 만큼 높게, 체내의 광범위하게 다양한 미생물 감염에 관계되는 것으로 밝혀졌다. 산업화된 사회에서의 메디컬 케어의 달성은 면역 저하된 환자 및 노인군에서 점증적으로 자명하게 된 만성 기회 감염(chronic opportunistic infection)으로 인해서 현저하게 손상되고 있다. 만성 감염은 의학 전문직을 위한 주된 도전으로 남아있으며, 큰 경제적 관련성이 있는데, 그 이유는 통상의 항생 치료법이 일반적으로 이들 감염증을 근절시키는데 충분하지 않기 때문이다. 한 가지 주된 만성의 이유는 역 환경 인자로부터 박테리아를 보호하는 바이오필름내에서 성장하는 박테리아의 능력인 듯하다. 슈도모나스 아에루기노사는, 예를 들어, 병원내 감염을 출현시키는 중요한 기회 변원성 및 원인성 작용제일 뿐만 아니라, 박테리아 지속성에 기여하는 다양한 박테리아 메카니즘의 연구를 위한 모델 유기체로 여겨질 수 있다. 슈도모나스 아에루기노사는 또한 낭성 섬유증(cystic fibrosis) 환자에서 형성된 바이오필름에 원인이 된다.
바이오필름이 연루되는 다른 감염 과정은 통상의 문제, 예컨대, 요로 감염, 카테테르 감염, 중이 감염, 치면세균막(dental plaque)의 형성, 치은염, 코팅 콘택트 랜즈, 및 덜 통상적이지만 치명적인 과정, 예컨대, 심장내막염, 낭성 섬유증에서의 감염, 및 영구적 내재 장치, 예컨대, 관절 보철 및 심판막(heart valve)의 감염을 포함한다. 바이오필름이 만성 굴염(sinusitis)에 대해 수술 받은 환자의 90%의 제거된 조직에 존재함이 최근 밝혀졌다. 바이오필름은 또한 대부분의 동물의 치아상에 치면세균막으로서 존재하며, 그러한 바이오필름은 충치의 원인이 될 수 있다. 본 발명의 화합물은 쿼럼 센싱 박테리아에 의해서 형성된 바이오필름과 연관된 어떠한 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
B. 박테리아
시그널링
미생물 및 포유동물은 일련의 호르몬 및 호르몬 유사 화학적 화합물을 통해서 서로 소통한다. 이들 "신호"는 그러나 박테리아 병원체, 예컨대, 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic 대장균 (EHEC)) O157:H7에 의해서 강탈되어 그의 병독성 유전자를 활성화시킨다. EHEC는 세 개의 신호를 감지하여 그 병독성 유전자를 활성화시키는데, 하나는 정상의 사람 위장관(GI) 미생물 무리(microbial flora)에 의해서 생성된 박테리아성 방향족 오토인듀서(autoinducer (AI-3))이고, 다른 두 개는 숙주에 의해서 생성된 숙주 호르몬 에피네프린/노르에피네프린(NE)이다(Sperandio et al ., 2003). 이들 세 개의 신호의 인식은, 본 발명자 중 한 사람의 실험에 의해서 측정된바, 두 가지의 상이한 동물 모델에서 병독성에 필수적이다(Clarke et al ., 2006)).
AI-3은 공생 대장균(대장균)을 포함한 몇 가지 박테리아 종뿐만 아니라, 몇 가지 다른 장내 박테리아 종(EPEC E2348/69, EHEC O26:H11, EPEC O111:H9, 클렙시엘라 뉴모니애 ( Klebsiella pneumoniae ), 시겔라 에스피 .( Shigella sp .), 살모넬라 에스피.( Salmonella sp .), 락토바실러스 류테리 ( Lactobacillus reuteri ), 및 엔테로박터 클로아케( Enterobacter cloacae )에 의해서 생성된 쿼럼 센싱(QS) 신호이다(Walters et al ., 2006; Tannock et al ., 2005). AI-3을 생성시킬 수 있는 광범위하게 다양한 박테리아가 일반적인 종간 QS 신호로서 작용할 수 있음을 제안하고 있다. 박테리아성 QS AI-3 신호는 숙주 호르몬 에피네프린 및 노르에피네프린(NE)와 교차 신호한다. 에피네프린과 NE 둘 모두 GI 관에 존재한다. 두 호르몬 모두 장내 평활근 수축, 점막하 혈류, 및 장에서의 클로라이드 및 칼륨 분비를 조절한다. 에피네프린 및 NE는 포유동물 세포내의 아드레날린 수용체에 의해서 인식된다.
AI-3/에피네프린/NE 인터-킹돔 시그널링 캐스캐이드(inter-kingdom signaling cascade)가 동물 및 식물의 몇 가지 중요한 박테리아성 병원체(예, 장출혈성 대장균 (EHEC), 요로병원성 대장균 (UPEC), 시겔라 플렉스네리( Shigella flexneri), 살모넬라 타이피 ( Salmonella typhi ) 및 타이피무륨 ( typhimurium ), 에르위니아 카로토보라 ( Erwinia carotovora ), 파스테렐라 멀토시다( Pasteurella multocida), 헤모필루스 인플루엔자( Haemophilus influenzae ), 악티노바실러스 플루로뉴모니아( Actinobacillus pleuropneumoniae ), 크로모박터 바이올라세움( Chromobacter violaceum ), 슈도모나스 아에루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 플루오레슨스( Pseudomonas fluorescens ), 버크홀데리아 세파시아( Burkholderia cepacia ), 콕시엘라 베르네티 ( Coxiella burnetii ), 예르시니아 슈도투베르쿨로시스( Yersinia pseudotuberculosis ), 예르시니아 페스티스( Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스 ( Francisella tularensis ) 및 랄스토니아 솔라세룸( Ralstonia solacearum )에 존재하여 그러한 인터-킹돔 시그널링이 대장균로 제한되지 않음을 제시하고 있다. 항균 내성의 성장하는 도전 및 신규 항생제의 부족과 조합된, 특정 상황에서의 통상의 항생제의 투여에 의해서 나타나는 논쟁으로 인한, 이들 병원체에 의해서 유발된 다양한 박테리아성 감염에 대한 효율적인 치료의 부재는 새로운 종류의 항균제를 설계하고 생성시키기 위해서 이러한 시그널링 캐스캐이드를 이해해야 하는 중요성을 강조하고 있다.
C.
QseC
수용체
QseC는 막 결합된 히스티딘 센서 키나아제(참조, 도 1)이다. 전형적으로는, 이들 센서 키나아제는 2-성분 시스템을 구성하여 반응 조절자와 함께 작용한다. 환경 신호에 대한 반응으로, 센서는 그 자신의 보존된 히스티딘 잔기를 자가포스포릴화시킨다. 후속하여, 센서 키나아제의 히스티딘-결합된 포스포릴 기가 활성화를 위한 동족 반응 조절자(cognate response regulator)상의 특이적 아스파르테이트 잔기상에 전달된다. 활성화된 반응 조절자는 이어서 이의 표적 유전자의 전사를 직접적으로 조절한다. 박테리아에서, 2-성분 시스템이 신호 변환의 주요 시스템이다(Igo et al ., 1989). 중요하게는, 포유동물은 히스티딘 센서 키나아제를 지니지 않아서, 박테리아성 히스티딘 키나아제의 억제제가 이들의 선택적 독성으로 인해서 매력적인 잠재적 신규 치료제가 되게 한다(Lyon and Muir, 2003; Roychoudhury et al., 1993).
QseC는 AI-3/Epi/NE 신호를 위한 수용체이며, 특정의 박테리아, 예컨대, EHEC, 살로넬라 및 프란시셀라 툴라렌시스의 발병기전에 중심이다. QseC는 이들 신호와 직접적으로 결합할 것이며, 반응으로, 그의 오토포스포릴화를 증대시킬 것이다(Clarke et al ., 2006). 후속하여, QseC는 이러한 포스페이트를 그의 동족 반응 조절자 QseB(전사인자)에 전달하고, 이는 이어서 유전자 발현을 조절한다.
QseC 동족체가 EHEC, EPEC, UPEC, K-12, 클렙시엘라 뉴모니애( Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 바우만니 ( Acinetobacter baumannii ), 시겔라 플렉스네리( Shigela flexneri ), 살모넬라 엔테리아 타이피 ( Salmonella enterica typhi ) 및 타이피무륨( typhimurium ), 예르시니아 페스티스 ( Yersinia pestis ), 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica ), 와이. 슈도투베르쿨로시스 (Y. pseudotuberculosis ), 에르위니아 카로토보라 ( Erwinia carotovora ), 파스테렐라 멀토시다( Pasteurella multocida), 헤모필루스 인플루엔자( Haemophilus influenzae ), 악티노바실러스 플레우로뉴모니애( Actinobacillus pleuroneumoniae ), 크로모박터 바이올라세움( Chromobacter violaceum ), 슈도모나스 아에루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 플루오레슨스( Pseudomonas fluorescens ), 버크홀데리아 세파시아( Burkholderia cepacia ), 콕시엘라 부르네티 ( Coxiella burnetii ), 랄스토니아 솔라세나룸( Ralstonia solacenarum ) 및 프란시셀라 툴라렌시스( Francisella tularensis)를 포함한 몇 가지 박테리아성 병원체에 존재한다. 참조 도 2 및 도 19. 장출혈성 대장균(EHEC)((Clarke et al ., 2006, 및 도 3 및 도 4), 살모넬라 타이피무림( Salmonella typhimurim )(Bearson and Bearson, 2007, 및 도 11B), 및 프란시셀라 툴라렌시스(Weiss et al., 2007)의 qseC 돌연변이는 동물 감염 모델에서 감쇄된다. 마지막으로, QseC는 쿼럼 센싱(QS) 시그널링과 연관되어 있으며, 그러한 시그널링은 박테리아 성장에 필수적인 과정에 직접적으로 관련되어 있지 않다. 따라서, 이론상으로는, QS 시그널링의 억제제는 박테리아 내성의 발전을 촉진하는 선택적 전구체를 유도하지 않을 것이다.
QseC 폴리펩티드의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 하기 데이터베이스 수납 번호: YP_169166, YP_514393, YP_899230, YP_001121274, YP_764109.1, YP_001891028, YP_001677727, YP_123578, YP_095321, YP_126604, YP_286016, NP_820223, YP_001115442, ZP_02062557, YP_981771, YP_001862321, YP_001140960, YP_02843268, NP_439849, YP_001341184, YP_249422, YP_001898056, ZP_00943152, YP_001291883, ZP_01787351, ZP_02007463, ZP_01791137, ZP_02478656, YP_001857419, YP_002258797, ZP_00203211, YP_432917, YP_857714, YP_932480, NP_518670, ZP_01793303, YP_157647, YP_786825, YP_002232952, YP_002256398, ZP_01518082, YP_114371, ZP_01308375, YP_001862413, ZP_02885351, NP_884854, NP_881175, YP_001898159, YP_160589, YP_088436, YP_283657, ZP_03268795, YP_001790728, ZP_03267145, YP_001816214, NP_880853, YP_102133, ZP_00439965, ZP_02446165, YP_002107737, ZP_02884581, NP_885061, NP_889719, YP_582619, NP_840430, YP_725059, YP_558955, ZP_03268804, ZP_00349512, YP_001856676, YP_001100931, YP_001895813, YP_001795885, YP_560317, YP_294751, CAL62240, YP_001100363, YP_284407, YP_984175, YP_001896912, YP_265358, ZP_01915254, YP_001354611, YP_285095, YP_001895822, ZP_01999348, YP_284799, ZP_01224171, YP_367461, YP_001630663, ZP_02842897, YP_001171444, ZP_02886774, NP_253465, YP_545417, YP_001985138, YP_001860133, ZP_02843728, ZP_02906088, YP_690440, YP_542429, NP_417498, YP_001881794, ZP_03069017, YP_001723674, ZP_03034105, ZP_03003495, YP_001745294, ZP_03063918, YP_409231, YP_001464488, YP_001791653, ZP_02885393, YP_001767156, YP_001862321, ZP_02886774, YP_001816214, 및 ZP_01308375로 제공된 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 포함하며; 이들 각각은 본원에서 본원의 출원일 현재로 참조로서 통합된다. 특정의 특징에서, 본 발명의 폴리펩티드 표적은 HisKA 및/또는 HARPase_c 도메인을 포함한다.
본 발명의 구체예는 QseC 키나아제 동족체(homolog) 조성물을 포함하며, 이러한 조성물은, QseC 키나아제 자체인 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하거나, 히스티딘 키나아제 및 트랜스멤브레인 영역들과 같은 핵심 영역들이 보존되는 한은 QseC 키나아제와 적어도 40%, 50%, 60% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% (모든 수치들과 그러한 수치들 사이의 범위들을 포함함) 동일하거나 유사한 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 서열 동일성 및/또는 유사성은 당 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 결정될 수 있는 있는데, 그러한 기술의 예로는 1000개의 부트스트랩(bootstrap)을 사용하는 쥬크스 캔터 지네틱 디스턴스 모델(Jukes Cantor genetic distance model)이 있다 (참조: Yang and Zhang Nucleic Acids Res. 2008 Mar;36(5), Cantor and Jukes, Biochem Biophys Res Commun. 1966 May 3;23(3):319-23). 동일성 퍼센트와 유사성 퍼센트는 당업자에게 공지되어 있고 당업자가 용이하게 확인할 수 있는 정렬 도구를 사용함으로써 계산될 수 있다.
D. 다중약물-내성(multidrug-resistant) 세균
적어도 초기 1980년대 이래로, 세계 도처로부터의 연구는 살모넬라(Salmonella)가 많은 항생제에 대해 점점 내성을 지니게 되었음을 나타낸다 (Davis et al., 1999). 80년대 초반에는 분리주들 중 적은 비율이 내성을 지녔지만, 90년대 중반까지 거의 20%가 내성을 지녔다 (Glynn et al., 1998). 이는 비-장티푸스성(non-typhoidal) 살모넬라에 대한 1차 병원보유체(reservoir)인 가축에서 성장촉진제(growth agent)로서 항생제를 광범위하게 사용하는 것에 크게 기인한다. 90년대 후반에는, 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium)의 DT104 균주가 암피실린, 클로르암페니콜, 스트렙토마이신, 설폰아미드 및 테트라사이클린을 포함하는 5개 약물에 대해 내성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 날리딕산(nalidixic acid)이 90년대 초반까지 특효약이었지만, 내성 균주들의 유행으로 인해 좀처럼 사용되지 않는다 (Crump et al., 2003). 더욱 최근에는, 수 가지의 시프로플락신과 세프트리악손 내성 균주가 또한 출현하였다 (Nakaya et al., 2003; Samrakandi et al., 2004; Weill et al., 2006). 다른 세균들이 다양한 항생제에 대해 또한 내성을 갖게 되었는데, 그러한 세균들의 예로는 스태필로코쿠스(Staphylococcus), 엔테로코코스(Enterococcus) 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus)가 있다.
전세계적으로 증가하는 항미생물 내성 문제와 신규 항생제의 부족은 혁신적인 치료제가 시급히 필요함을 강하게 나타낸다. 세균 병인론과 세포간 소통(inter-cellular communication)의 이해 증대는, 현대의 약물 발견 도구 및 기술과 결합된 경우, 세균 감염에 대항하기 위해 그러한 기초 과학을 치료적 적용방법으로 전환시키기 위한 강력한 기반을 제공한다. 쿼럼-센싱(quorum-sensing, QS) 경로를 통한 세균 세포에서 세포로의 신호전달을 간섭하는 것은 특히 강력하고 신규한 방법을 구성하는데, 이는 이것이 세균 내성의 발달을 또한 제거하기 때문이다. QS는 세균이 오토인듀서(autoinducer)라고 일컬어지는 호르몬-유사 분자에 반응할 수 있게 하고, 수 가지 세균 병원체에서 독성 유전자의 과잉을 제어하는 것을 담당한다. QS는 세균의 성장과 같은 필수적인 과정에는 직접 관여하지 않으므로, QS를 억제하는 것은 내성의 발달을 위한 선택적 압력(selective pressure)을 생성시킬 수 없다. QS 길항제는 세균 사이의 신호전달을 혼란스럽게 하거나 어지럽히고, 항생제와는 달리 세균의 치사 또는 세균 성장의 방해를 일으키지 않는다. 이와 같이, QS 길항제는 항미생물제라기 보다는 병원성의 차단제로서 간주될 수 있다.
본 발명자들에 의해 발견된 혁식적인 방법은 장출혈성 대장균인 O157:H7 (EHEC), 살모넬라 (클래스 B 생물위협인자(class B biothreat agents)) 및 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) (클래스 A 생물위협인자(class A biothreat agent))의 병원성 기전에 대한 최근 획득된 통찰력을 기초로 한다. 본 발명자들에 의해 결정된 바와 같이, 이러한 다양한 병원체는 모두 이들의 독성 유전자들의 전사를 활성화시키기 위해 임의의 하나 이상의 3개의 신호를 감지한다 (Clarke et al., 2006). 상기 신호는 이러한 병원체들과 통상적인 위장내 균총 (장 병원체(enteric pathogen)인 경우)에 의해 생성된 세균 오토인듀서 (오토인듀서-3, AI-3) 뿐만 아니라 숙주에 의해 생성된 에피네프린/노르에피네프린(epi/NE) 호르몬을 포함한다. 중요하게는, 이러한 모든 신호전달 분자는 상기 3개의 병원체 (그리고 15개 이상의 다른 중요한 인간과 식물 병원체)에 존재하는 QseC 막 결합된 센서 키나아제를 자극함으로써, 이러한 화학적 신호의 존재를 복잡한 조절 캐스케이드로 중계(relay)하여 핵심적인 독성 유전자들의 전사를 초래할 수 있다. 이러한 전사 사건은 상기 3개의 병원체가 숙주를 감염시킬 수 있게 한다. 세균 병인론에서의 AI-3/epi/NE 수용체와 이의 신호전달 시스템의 중추적 역할 및 광범위한 일련의 중요한 동물과 식물 병원체들내의 이러한 시스템의 존재로 인해, 이러한 수용체 시스템의 억제제로서 작용하는 본 발명의 화합물은 약물 개발을 위한 매력적인 수단을 제공한다.
E. 화학적 정의
용어 "알킬"은 직쇄 알킬, 분지쇄 알킬, 시클로알킬(알리시클릭(alicyclic)), 시클릭 알킬, 헤테로원자로 치환되지 않은 알킬, 헤테로원자로 치환된 알킬, 헤테로원자로 치환되지 않은 Cn-알킬 및 헤테로원자로 치환된 Cn-알킬을 포함한다. 특정 구체예에서, 저급 알킬이 고려된다. 용어 "저급 알킬"은 탄소수가 1개 내지 6개 (즉, 탄소 원자가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개임)인 알킬을 의미한다. 용어 "헤테로원자로 치환되지 않은 Cn-알킬"은, 선형 또는 분지형, 시클릭 또는 아시클릭(acyclic) 구조를 지니고, 추가로 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 지니지 않고, 추가로 모두 비방향족인 총 n개의 탄소 원자를 지니고 3개 또는 그 초과의 수소 원자를 지니며 헤테로원자를 지니지 않는, 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 헤테로원자로 치환되지 않은 C1-C10-알킬은 1개 내지 10개의 탄소 원자를 지닌다. -CH3 (Me), -CH2CH3 (Et), -CH2CH2CH3 (n-Pr), -CH(CH3)2 (iso-Pr), -CH(CH2)2 (시클로프로필), -CH2CH2CH2CH3 (n-Bu), -CH(CH3)CH2CH3 (sec-부틸), -CH2CH(CH3)2 (iso-부틸), -C(CH3)3 (tert-부틸), -CH2C(CH3)3 (neo-펜틸), 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실 기는 모두 헤테로원자로 치환되지 않은 알킬기의 비제한적인 예이다. 용어 "헤테로원자로 치환된 Cn-알킬"은, 결합 지점으로서 하나의 포화 탄소 원자를 지니고, 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 지니지 않고, 추가로 선형 또는 분지형, 시클릭 또는 아시클릭 구조를 지니고, 추가로 모두 비방향족인 총 n개의 탄소 원자를 지니고, 0개, 1개 또는 1개를 초과한 수소 원자를 지니고 하나 이상의 헤테로 원자를 지니며 각각의 헤테로원자가 N, O, F, Cl, Br, I, Si, P 및 S로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 헤테로원자로 치환된 C1-C10-알킬은 1개 내지 10개의 탄소 원자를 지닌다. 하기 열거된 기들은 모두 헤테로원자로 치환된 알킬기의 비제한적인 예이다: 트리플루오로메틸, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2OCH2CF3, -CH2OC(O)CH3, -CH2NH2, -CH2NH-(저급 알킬), 예를 들어 -CH2NHCH3 및 -CH2N(CH3)2, -CH2CH2Cl, -CH2CH2OH, CH2CH2OC(O)CH3, -CH2CH2NHCO2C(CH3)3, -CH2Si(CH3)3, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 모르폴리닐, 피페라지닐 및 티오모르폴리닐. 특정 구체예에서, 저급 알킬은 -CH2NH2 또는 -CH2NH-(저급알킬), 예를 들어 -CH2NHCH3 및 -CH2N(CH3)2를 의미한다.
일반적으로, 용어 "저급"은 알킬 함유 치환기에 적용되는 경우에 1개 내지 6개, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개, 또는 여기서 유도될 수 있는 임의의 범위인, 탄소 원자의 개수를 의미한다. 이러한 용어는 본원에 기재된 임의의 알킬 함유 치환기에 적용될 수 있다 (예를 들어, 알킬, 알킬티오, 알칸디일, 아르알킬, 알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모늄 등).
용어 "알킬티오"는 알킬이 상기 정의한 바와 같은, -S-알킬을 의미한다. 저급 알킬티오가 임의의 구체예에 대해 고려되는데, 여기서 상기 알킬 부분은 1개 내지 6개의 탄소 원자 (즉, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 탄소 원자)를 포함한다.
용어 "알칸디일"은 치환된 알칸디일과 치환되지 않은 알칸디일 둘 모두를 의미한다. "치환된"이라는 수식어가 없이 사용되는 경우, 알칸디일은 비방향족(non-aromatic) 2가 기를 의미하는데, 여기서 이러한 알칸디일기는 2개의 σ-결합에 의해 결합되고, 결합 지점(들)로서 1개 이상의 포화 탄소 원자(들)을 지니고, 선형 또는 분지형, 시클로, 시클릭 또는 아시클릭 구조를 지니고, 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 지니지 않으며 탄소와 수소 이외의 원자를 지니지 않는다. -CH2- (메틸렌), -CH2CH2-, -CH2C(CH3)2CH2-, -CH2CH2CH2- 및 
은 알칸디일기의 비제한적인 예이다. 용어 "치환된 알칸디일"은 비방향족 1가 기를 의미하는데, 여기서 이러한 알칸디일기는 2개의 σ-결합에 의해 결합되고, 결합 지점(들)로서 1개 또는 2개의 포화 탄소 원자(들)을 지니고, 선형 또는 분지형, 시클로, 시클릭 또는 아시클릭 구조를 지니고, 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 지니지 않으며, N, O, F, Cl, Br, I, Si, P 및 S로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 원자를 지닌다. 하기 기들이 치환된 알칸디일기의 비제한적인 예이다: -CH(F)-, -CF2-, -CH(Cl)-, -CH(OH)-, -CH(OCH3)- 및 -CH2CH(Cl)-.
용어 "아릴"은 헤테로원자로 치환되지 않은 아릴, 헤테로원자로 치환된 아릴, 헤테로원자로 치환되지 않은 Cn-아릴, 헤테로원자로 치환된 Cn-아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릭 아릴기, 카르보시클릭 아릴기, 바이아릴(biaryl)기, 및 폴리시클릭 접합 탄화수소(polycyclic fused hydrocarbons, PAHs)로부터 유래되는 1가 라디칼을 포함한다. 용어 "헤테로원자로 치환되지 않은 Cn-아릴"은, 결합 지점으로서 하나의 탄소 원자를 지니며, 여기서 상기 탄소 원자는 탄소 원자들만을 함유하는 방향족 고리 구조의 일부이고, 추가로 총 n개의 탄소 원자를 지니고, 5개 이상의 수소 원자를 지니며, 헤테로원자를 지니지 않는, 라디칼이다. 예를 들어, 헤테로원자로 치환되지 않은 C6-10-아릴은 6개 내지 10개의 탄소 원자를 지닌다. 헤테로원자로 치환되지 않은 아릴기의 비제한적인 예로는 페닐(Ph), 메틸페닐, (디메틸)페닐, -C6H4CH2CH3, -C6H4CH2CH2CH3, -C6H4CH(CH3)2, -C6H4CH(CH2)2, -C6H3(CH3)CH2CH3, -C6H4CH=CH2, -C6H4CH=CHCH3, -C6H4C≡CH, -C6H4C≡CCH3, 나프틸, 및 바이페닐로부터 유래되는 라디칼이 있다. 용어 "헤테로원자로 치환된 Cn-아릴"은, 결합 지점으로서 하나의 방향족 탄소 원자 또는 하나의 방향족 헤테로원자를 지니고, 추가로 총 n개의 탄소 원자, 하나 이상의 수소 원자 및 하나 이상의 헤테로원자를 지니고, 추가로 각각의 헤테로원자가 N, O, F, Cl, Br, I, Si, P 및 S로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 헤테로원자로 치환되지 않은 C1-C10-헤테로아릴은 1개 내지 10개의 탄소 원자를 지닌다. 헤테로원자로 치환된 아릴기의 비제한적인 예로는 하기 기들이 있다: -C6H4F, -C6H4Cl, -C6H4Br, -C6H4I, -C6H4OH, -C6H4OCH3, -C6H4OCH2CH3, -C6H4OC(O)CH3, -C6H4NH2, -C6H4NHCH3, -C6H4N(CH3)2, -C6H4CH2OH, -C6H4CH2OC(O)CH3, -C6H4CH2NH2, -C6H4CF3, -C6H4CN, -C6H4CHO, -C6H4CHO, -C6H4C(O)CH3, -C6H4C(O)C6H5, -C6H4CO2H, -C6H4CO2CH3, -C6H4CONH2, -C6H4CONHCH3, -C6H4CON(CH3)2, 퓨라닐, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, 피리미딜, 피라지닐, 퀴놀릴, 인돌릴 및 이미다졸릴. "이중치환된 아릴기"는 2개의 치환기에 의해 치환된 아릴기를 의미하는데, 상기 치환기는 헤테로원자로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 추가의 아릴기로는 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피라졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 이소인돌리닐, 인돌리닐, 벤족사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 카르바졸릴, 디벤조퓨라닐, 디벤조티에닐, 플루오레닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 테트라지닐, 펜타지닐, 이소퀴놀리닐, 퀴놀리지뉴밀, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 아데니닐, 구아니닐, 아크리디닐, 페나지닐, 안티리디닐, 페난트롤리닐, 페난트리디닐, 페노티에닐, 페녹사지닐, 안트라세닐, 나프티리디닐, 아제피닐, 옥세피닐, 티에피닐, 디아제피닐, 디옥세피닐, 디티에피닐, 트리아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 티아디아제피닐, 테트라제피닐, 티아트리아제피닐, 아조시닐, 옥소시닐, 티오시닐, 디아조시닐, 옥사조시닐 및 트리아조시닐이 있다.
단일치환되거나, 이중치환되거나, 삼중치환되거나, 사중치환되거나 오중치환되거나, 치환되지 않은 아릴기 (아르알킬기에 포함된 아릴기를 포함함)가 본 명세서 전반에 걸쳐 논의되고, 아릴기를 포함하는 본 발명의 각각의 특정 화합물 또는 일반 화합물은, 단일치환되거나, 이중치환되거나, 삼중치환되거나, 사중치환되거나 오중치환되거나, 치환되지 않는 것으로 구체적으로 고려된다. 치환기는 본원에 열거되거나 제시된 임의의 아릴 치환기를 포함할 수 있다. 치환기의 비제한적인 예로는 할로, -OH, -CO2H, -C(O)NH2, -CN, 트리할로메틸, 트리할로메톡시, -NH2, -NO2, 알킬 (예를 들어, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬), 알콕시 (예를 들어, 치환되거나 치환되지 않은 저급 알콕시), 알킬아미노 (알킬-N-), 디알킬아미노 ((알킬)2N-) 및 트리알킬암모늄 ((알킬)3-N(+))이 있는데, 여기서 상기 알킬기는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 치환된 알킬기 및 치환된 알콕시기는 상기 치환기들 중 1개, 2개, 3개 또는 그 초과의 치환기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그 밖의 치환기들이 본원에 기재되어 있다.
용어 "아르알킬"은 치환된 아르알킬과 치환되지 않은 아르알킬을 의미한다. "치환된"이란 수식어가 없이 사용되는 경우, 아르알킬은 -알칸디일-아릴인 1가 기를 의미하는데, 여기서 알칸디일과 아릴이란 용어는 각각 본원에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 사용된다. 아르알킬의 비제한적인 예로는 페닐메틸 (벤질, Bn), 1-페닐-에틸, 2-페닐-에틸, 인데닐 및 2,3-디히드로-인데닐이 있는데, 단, 인데닐과 2,3-디히드로-인데닐은 결합 지점이 각각의 경우 포화 탄소 원자들 중 하나인 한에서의 아르알킬의 예일 뿐이다. 용어 "아르알킬"이 "치환된"이란 수식어와 함께 사용되는 경우, 알칸디일과 아릴 중 어느 하나 또는 둘 모두가 치환된다. 치환된 아르알킬의 비제한적인 예는 (3-클로로페닐)-메틸, 2-옥소-2-페닐-에틸 (페닐카르보닐-메틸), 2-클로로-2-페닐-에틸, 크로마닐 (결합 지점이 포화 탄소 원자들 중 하나인 경우), 및 테트라히드로퀴놀리닐 (결합 지점이 포화 원자들 중 하나인 경우)이다.
용어 "알콕시"는 직쇄 알콕시, 분지쇄 알콕시, 시클로알콕시, 시클릭 알콕시, 헤테로원자로 치환되지 않은 알콕시, 헤테로원자로 치환된 알콕시, 헤테로원자로 치환되지 않은 Cn-알콕시 및 헤테로원자로 치환된 Cn-알콕시를 포함한다. 특정 구체예에서, 저급 알콕시가 고려된다. 용어 "저급 알콕시"는 탄소 원자가 1개 내지 6개 (즉, 탄소 원자가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)인 알콕시를 의미한다. 용어 "헤테로원자로 치환되지 않은 Cn-알콕시"는, R이 헤테로원자로 치환되지 않은 Cn-알킬인, -OR 구조를 지닌 기를 의미하는데, 그러한 용어는 상기 정의되어 있다. 헤테로원자로 치환되지 않은 알콕시기는 -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -OCH(CH3)2 및 -OCH(CH2)2를 포함한다. 용어 "헤테로원자로 치환된 Cn-알콕시"는, R이 헤테로원자로 치환된 Cn-알킬인, -OR 구조를 지닌 기를 의미하는데, 그러한 용어는 상기 정의되어 있다. 예를 들어, -OCH2CF3가 헤테로원자로 치환된 알콕시기이다.
용어 "아실"은 치환된 아실과 치환되지 않은 아실 둘 모두를 포함한다. "치환된"이란 수식어가 없이 사용되는 경우, 아실은, 결합 지점으로서 카르보닐기의 탄소 원자를 지니고, 추가로 선형 또는 분지형, 시클로, 시클릭 또는 아시클릭 구조를 지니고, 추가로 카르보닐기의 산소 원자를 지나서 탄소 또는 수소가 아닌 추가의 원자들을 지니지 않는, 1가 기를 의미한다. -CHO, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)CH2CH2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)CH(CH2)2, -C(O)C6H5, -C(O)C6H4CH3, -C(O)C6H4CH2CH3, -COC6H3(CH3)2 및 -C(O)CH2C6H5 기가 아실기의 비제한적인 예이다. 따라서, 용어 "아실"은 때때로 "알킬 카르보닐" 및 "아실 카르보닐" 기를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 용어 "치환된 아실"은, 결합 지점으로서 카르보닐기의 탄소 원자를 지니고, 추가로 선형 또는 분지형, 시클로, 시클릭 또는 아시클릭 구조를 지니고, 추가로 카르보닐기의 산소에 더하여 N, O, F, Cl, Br, I, Si, P 및 S로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 원자를 지니는, 1가 기를 의미한다. -C(O)CH2CF3, -CO2H, -CO2CH3, -CO2CH2CH3, -CO2CH2CH2CH3, -CO2C6H5, -CO2CH(CH3)2, -CO2CH(CH2)2, -C(O)NH2 (카르바모일), -C(O)NHCH3, -C(O)NHCH2CH3, -CONHCH(CH3)2, -CONHCH(CH2)2, -CON(CH3)2, -CONHCH2CF3, -CO-피리딜, -CO-이미다조일 및 -C(O)N3 기가 치환된 아실기의 비제한적인 예이다. 용어 "치환된 아실"은 "헤테로아릴 (예를 들어, 피리디닐) 카르보닐"기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있으며 이에 따라 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 부분입체이성질체 혼합물 및 개별 부분입체이성질체로 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 단일 부분입체이성질체가 존재한다. 본 발명의 거대분자의 모든 가능한 입체이성질체가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고찰된다. 그러나, 특정 양태에서, 특정 부분입체이성질체가 고찰된다. 본 발명의 거대분자의 키랄 중심은 S- 또는 R-배위를 지닐 수 있으며, 이는 IUPAC 1974 권고에 의해 정의된다. 특정 양태에서, 본 발명의 특정 화합물은 특정의 탄소 중심에서 S- 또는 R-배위를 포함할 수 있다.
링커는 본 발명의 화합물 내에서 2개의 부분을 연결시킨다. 예를 들어, 링커는 중합체 주쇄와 분자의 나머지를 연결시켜 링커-중합체 주쇄를 형성시킬 수 있다. 그러한 용도로 사용될 수 있는 링커는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, -CH2NHCH3 부분의 아미노 부분은 이용가능한 카르복실산과 반응하여 하기 도시된 3차 아미드를 형성하는데, 여기서 억제제가 본 발명의 화합물이다:
다른 링커는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 에틸렌디아민, 아미노 프로판올, 디에틸렌트리아민, 폴리펩티드, 예컨대 글리실글리신 또는 GlyPheLeuGly, 아스파르트산, 폴리아스파르트산, 글루탐산, 폴리글루탐산, 폴리에틸렌 글리콜, 디아미노 폴리에틸렌 글리콜, 또는 리신을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,737,247호는 본 발명에 사용될 수 있는 다수의 링커를 개시하고 있으며, 이 특허 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 하나 초과의 링커가 본 발명의 화합물 내에서 사용될 수 있으며, 하나 초과 유형의 링커가 사용될 수 있다. 성질이 동일하거나 상이한 2개의 링커가 함께 연결되어 더 긴 링커를 또한 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 단일 링커가 중합체 주쇄를 분자의 나머지에 연결시킨다.
본 명세서 전체를 통해 개시된 화합물, 제제 및 활성 성분의 변형물 또는 유도체가 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 유용한 것으로 고찰된다. 유도체는 제조될 수 있고, 이러한 유도체의 특성은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 이들의 원하는 특성에 대해 검정될 수 있다.
특정 양태에서, "유도체"는 화학적 개질 전의 화합물("모 화합물")의 원하는 효과를 계속하여 유지하는 화학적으로 개질된 화합물을 의미한다. 상기 효과는 모 화합물에 대해 향상되거나(예를 들어, 약간 더 효과적인, 2배 효과적인, 등) 또는 감소될 수 있지만(예를 들어 약간 덜 효과적인, 2배 덜 효과적인, 등), 그렇더라도 여전히 유도체인 것으로 간주될 수 있다. 상기 유도체는 모 분자 상에 하나 이상의 화학적 부분의 첨가, 제거 또는 치환부를 지닐 수 있다. 본원에 개시된 화합물 및 구조로 제조될 수 있는 개질체 유형에 대한 비제한적인 예는 저급의 비치환된 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 또는 치환된 저급 알킬, 예컨대 히드록시메틸 또는 아미노메틸 기; 카르복실 기 및 카르보닐 기; 히드록실; 니트로, 아미노, 아미드, 이미드 및 아조 기; 설페이트, 설포네이트, 설포노, 설프히드릴, 설페닐, 설포닐, 설폭시도, 설폰아미도, 포스페이트, 포스포노, 포스포릴 기, 및 할라이드 치환기의 첨가 또는 제거를 포함한다. 추가 개질은 방향족 프레임워크의 하나 이상의 원자의 첨가 또는 결실, 예를 들어 프로필에 의한 에틸의 치환; 더 크거나 더 작은 방향족 기에 의한 페닐의 치환을 포함할 수 있다. 대안적으로, 고리형 또는 이중고리형 구조에서, N,S 또는 O와 같은 헤테로원자가 탄소 원자 대신 구조 내로 치환될 수 있다.
연결부를 하기한 것 중 하나로서 포함하는 임의의 특정의 또는 일반적인 화합물에 있어서, 이러한 동일한 기로부터의 대안적인 연결기가 치환될 수 있음이 구체적으로 고찰된다: -SO2NR-, -NRSO2-, -S(O)2-, -S(O)-, -N(R)R-, -RN(R)-, -C(O)NR-, 및 -NRC(O)- (여기서, R은 H이거나 본원에 기재된 다른 것이다).
본원에서의 일반적이거나 구체적인 화합물에 표시된 임의의 요소 연결기(-NRC(O)NR-)에 있어서, 티오우레아, 옥사미드(-NRC(O)C(O)-NR-), 또는 카르바메이트(-ROC(O)NR- 또는 -RN(R)C(O)O-) 연결기가 사용될 수 있음이 구체적으로 고찰되며, 여기서 R은 H 또는 본원에 기재된 다른 것이다.
본원에서 논의된 바대로, 다양한 화학적 기들은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 그러한 임의의 치환된 기, 예컨대 치환된 알킬 또는 치환된 아릴, 또는 알킬 또는 아릴 기를 포함하는 임의의 기(예를 들어, 알콕시, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알킬티오, 또는 아르알킬 기)에 있어서, 치환기는 당업자에게 공지된 그러한 임의의 치환기일 수 있다. 치환기의 비제한적인 예는 할로, 알킬, 아릴, 아르알킬, 아실, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 중합체 테일, 중합체 주쇄, 또는 링커-중합체 주쇄를 포함하는데, 여기서 알킬 또는 아릴 부분의 2개의 연속적인 R 기는 함께 아릴 기 또는 1,3-디옥솔라닐 기를 형성한다. 치환기의 부가적인 비제한적인 예는 -CH3, -F, -Cl, -Br, -I, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, -NH2-N3, -CN, -NHOH, =NH, -SiH3, -SO2NH2, -SO2NH-알킬, -SO2NH-아릴, 모르폴리닐(치환되거나 치환되지 않은), 
을 포함하고, 여기서 A, B, D, E, F, G, J, K, L, M, P 및 Q는 각각 탄소 또는 질소이고, R1 내지 R9는 각각 독립적으로 H 또는 치환기, 예컨대 이 단락에 기재된 것들이며, m은 1 또는 2이고, n은 0 내지 3이다. 특정 구체예에서, -SO2NH2는 치환기로 제외된다.
본 발명의 화합물의 프로드러그 및 용매화물이 또한 본원에서 고찰된다. 본원에 사용된 용어 "프로드러그"는 포유동물과 같은 피검체로의 투여 시, 대사 또는 화학 과정에 의한 화학적 전환을 거쳐 본원에 기재된 임의의 화학식의 화합물, 또는 이의 염 및/또는 용매화물을 생성하는 화합물인 것으로 이해된다[참조: Bundgaard, 1991; Bundgaard, 1985]. 본 발명의 화합물의 용매화물은 바람직하게는 수화물이다.
본 발명의 화합물은 상업적인 공급처(예를 들어, 캘리포니아 샌디아고에 소재한 켐브리지 코포레이션(Chembridge, Corp.))로부터 입수될 수 있거나, 통상적인 유기 화학 방법(예를 들어, 실시예 2 참조)을 이용하여 합성될 수 있다. 본 발명의 화합물의 제조 방법에 대한 용매 선택은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 용매 선택은 예를 들어, 모든 시약의 용해를 촉진하거나 예를 들어 원하는 반응을 최선으로 촉진(특히 반응 메커니즘이 알려진 경우에)하는 지에 의존할 수 있다. 용매는 예를 들어, 극성 용매 및 비-극성 용매를 포함할 수 있다. 선택 용매는 이들로 제한되는 것은 아니나, 테트라히드로푸란, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 디옥산, 메탄올, 에탄올, 헥산, 메틸렌 클로라이드 및 아세토니트릴을 포함한다. 하나 초과의 용매가 임의의 특정 반응 또는 정제 과정을 위해 선택될 수 있다. 물이 또한 임의의 선택 용매 내로 혼합될 수 있다. 추가로, 물, 예컨대 증류수가 용매 대신 반응 매체를 구성할 수 있다.
당업자는 본 발명의 화합물의 정제 방법을 익히 알고 있을 것이다. 당업자는 본 발명의 화합물이 중간체 정제 및 최종 생성물의 정제를 포함하는 임의의 단계에서 일반적으로 정제될 수 있음을 이해할 것이다. 바람직한 하나의 구체예에서, 정제는 결합된 정지 상을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피, TLC, 또는 HPLC를 통해 실시된다.
용어 "작용기"는 일반적으로 당업자가 반응기를 화학적으로 분류하는 방법을 의미한다. 작용기의 예는 히드록시, 아민, 설프히드릴, 아미드, 카르복실, 카르보닐 등을 포함한다.
본원에 사용된 "보호기"는 그 작용기의 다른 원치않는 반응을 방지하기 위해 작용기에 부착된 부분을 의미한다. 보호기는 당업자에게 공지되어 있다. 비-제한적인 예시적인 보호기는 히드록시 보호기, 아미노 보호기, 설프히드릴 보호기 및 카르보닐 보호기와 같은 범주에 포함된다. 그러한 보호기는 문헌(Greene and Wuts, 1999)에서 확인될 수 있다. 하나 이상의 작용기가 보호기로 보호되는 본 발명의 화합물이 구체적으로 고찰된다.
F. 약제학적 제조물
본원에 개시된 특정 방법은, 세균 감염을 치료하기 위한 예방학적 및/또는 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물의 투여를 포함하는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 세균과 활성 성분의 접촉을 허용하는 임의의 방법에 의해 세균 독성을 억제하도록 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 약제와 함께, 개별의 치료학적 활성 성분으로써 또는 치료적으로 활성인 성분의 조합물로 사용하는데 이용가능한 임의의 종래의 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로는 선택된 투여 경로 및 표준 약제학적 실시를 기초로 선택된 약제학적으로 허용된 담체와 함께 투여될 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 종래 항생제에는 반응하지 않았거나 이에 대해 부정적으로 반응한 피검체에게 제공될 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 화합물은 다중약물 내성 세균을 갖거나 다중 약물 내성 세균에 노출된 것으로 의심되는 피검체에게 투여된다. 본 발명의 화합물은 특정 구체예에서 다중약물 내성 세균에 노출될 우려가 있을 수 있는 피검체에게 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 QseC 센서를 갖는 세균을 보유하거나 QseC 센서를 갖는 세균에 노출된 것으로 의심되는 피검체에게 투여된다. 본 발명의 화합물은 특정 구체예에서, Qsec 센서를 갖는 세균에 노출될 우려가 있을 수 있는 피검체에게 투여된다.
본 발명의 화합물은 원치않는 작은 분자량의 분자를 제거하도록 광범위하게 정제되고/되거나 투석되고/되거나, 필요한 경우 목적하는 비히클로의 더욱 용이한 제형화를 위해 동결건조될 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 활성 화합물은 그 후 일반적으로 임의의 공지된 루트, 예컨대 경구 또는 비경구 투여에 의해 투여를 위해 제형화될 것이다. 투여 방법은 이하에서 더욱 상세하게 논의할 것이다.
본 발명의 수성 조성물은 전형적으로 세균 독성을 억제하기 위한 유효량의 본 발명의 화합물을 지닐 것이다.
또한, 본 발명의 화합물은 상기 논의된 바대로 프로드러그 형태로 제공될 수 있음이 일반적으로 이해될 것인데, 이는 본 발명의 화합물이 노출되는 환경이 프로드러그를 활성, 또는 더욱 활성인 형태로 변경됨을 의미한다. 용어 "전구체"는 "프로드러그"로 간주되는 화합물을 포함하는 것으로 고찰된다.
1.
피검체로의
투여를 위한 약제 제형 및 루트
본원에서 논의된 임의의 화합물은 약제 조성물에 포함되는 것으로 고찰된다. 본 발명의 약제 조성물은 유효량의 하나 이상의 후보 물질(예를 들어, 본 발명의 화합물) 또는 약제학적으로 허용된 담체 중에 용해되거나 분산된 추가 제제를 포함한다. 상기 표현 "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용된"은, 필요에 따라, 예를 들어 사람과 같은 동물에게 투여되는 경우 유해한, 알레르기 또는 다른 원치 않는 반응을 나타내지 않는 분자 실재물 및 조성물을 의미한다. 하나 이상의 후보 물질 또는 추가적인 활성 성분을 함유하는 약제 조성물의 제조는 본 발명의 개시 내용의 측면에서 당업자에게 공지되어 있을 것이다[예를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990) 참조; 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨]. 또한, 동물(예를 들어, 사람) 투여를 위해서는, 제조물이 약물 평가 및 연구에 대한 FDA 센터(FDA's Center of Drug Evaluation and Research)에 의해 요구되는 무균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 함이 이해될 것이다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용된 담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항세균제, 항곰팡이제), 등장성 제제, 흡수 지여제, 염, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 상기와 유사 물질 및 이의 조합물을 포함하며, 이들은 당업자에게 공지되어 있을 것이다[예를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, pp 1289-1329, 1990) 참조]. 활성 성분과 친화성이 없는 임의의 통상적인 담체를 제외하고는, 치료 또는 예방 조성물에서 이의 사용이 고찰된다.
후보 물질은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는 지 그리고 주사로서의 그러한 투여 경로에 대해서는 무균성이어야 하는지에 의존할 수 있는 다양한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명은 정맥내, 피부내, 동맥내, 복막내, 병소내, 두개내, 관절내, 전립샘내, 흉막내, 기관내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소적으로, 근육내, 피하, 결막아래, 소포내, 점막으로, 협측으로, 경피로, 심막내로, 제대내로, 안구내로, 경구적으로, 국부적으로, 흡입을 통해(예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사를 통해, 주입을 통해, 연속 주입을 통해, 직접적으로 국소화된 관류 배씽(perfusion bathing) 표적 세포를 통해, 카테터를 통해, 눈 또는 점안액을 통해, 세척을 통해, 크림으로, 지질 조성물로(예를 들어, 리포좀으로), 또는 당업자에게 공지된 다른 방법 또는 상기 방법의 임의 조합으로 투여될 수 있다[예를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990) 참조].
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 국소 투여를 위해, 예를 들어 언급된 크림으로, 연고, 고약, 스프레이, 겔, 로션 또는 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 경점막, 경상피, 경내피, 또는 경피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 경피 제형의 일 예가 패치이다. 상기 조성물은 화학적 침투 증강제, 막 투과성 제제, 막 수송제(membrane transport agent), 보존제, 계면활성제, 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 용어는 당업자에게 공지되어 있다.
하나의 국소적인 구체예에서, 본 발명은 패치를 사용할 수 있다. 경피 또는 "피부" 패치는 피부에 놓여 시간 방출된 용량의 의약을 피부를 통해 그리고 혈류 내로 전달하는 약용(medicated) 접착 패치이다. 광범위한 약제가 경피 패치에 의해 전달될 수 있다. 제 1 상업적으로 입수가능한 처방 패치는, 동요병을 위한 스코폴라민을 처방한, 1979년 12월에 미국 식약청에 의해 승인되었다.
경피 패치의 주요 구성요소는 (a) 저장 동안 패치를 보호하기 위한 라이너 (사용전에 제거됨); (b) 활성제; (c) 피부에 패치를 접착시킴과 함께 패치 구성요소를 접착시키기 위해 제공되는 접착제; (d) 저장소 및 다층 패치로부터 약물의 방출을 조절하기 위한 막; 및 (e) 외부 환경으로부터 패치를 보호하는 후면이다.
4가지 주요 타입의 경피 패치가 존재한다. 단일층 약물-인-접착제(Single-layer Drug-in-Adhesive) 패치는 또한 이러한 제제를 함유하는 하나의 접착제 층을 갖는다. 이러한 패치 타입에서, 접착제 층은 피부에 전체 시스템과 함께, 여러 층을 함께 접착시키기 위해 제공될 뿐만 아니라 약물의 방출을 초래한다. 접착제 층은 임시 라이너 및 후면으로 둘러싸여진다. 두개의 접착제 층이 또한 약물의 방출을 초래하는 다층 약물-인-접착제(multi-layer Drug-in-Adhesive) 패치는 단일층 시스템과 유사하다. 그러나, 다층 시스템은 대개 막에 의해 분리되는 (그러나, 모든 경우에서는 아님), 약물-인-접착제의 다른 층을 부가하는 것이 다르다. 이러한 패치는 또한 임시 라이너-층 및 영구적인 후면을 갖는다. 단일층 및 다층 약물-인-접착제 시스템과는 달리, 저장소 패치는 저장소 경피 시스템이 별도의 약물층을 갖는다. 약물층은 접착제 층에 의해 분리된 약물 용액 또는 현탁액을 함유한 액체 구획이다. 이러한 패치는 또한 후면층에 의해 후면이 제공된다. 이러한 타입의 시스템에서, 방출 속도는 0차이다. 매트릭스 패치는 약물 용액 또는 현탁액을 함유한 반고형 매트릭스의 약물층을 갖는다. 이러한 패치에서 접착제 층은 약물층을 둘러싸서 이를 부분적으로 중첩시킨다.
다른 치료 형태에서, 본 발명의 화합물의 국소 적용은 자연적인 신체 공동, 예를 들어, 구강, 인두, 식도, 후두, 기관, 늑막강, 복막강, 또는 방광, 결장 또는 다른 내장 기관을 포함한 중공 기관 공동에서 타겟화된다. 이러한 내장 기관 또는 공동 표면으로의 국소 적용에 영향을 미치게 하기 위해 여러 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인두는 본 발명의 화합물을 포함한 용액으로 간단히 구강 스위싱(swishing) 및 가글링(gargling)함으로써 영향을 미칠 수 있다.
특정 구체예에서, 본 조성물은 약물전달장치를 이용하여 피검체에 투여된다. 임의의 약물전달장치는 약제학적 유효량의 본 발명의 화합물을 전달하는데 사용하기 위해 고려된다.
동물 피검체에 투여되는 본 발명의 조성물의 실제 투약량은 물리적 및 생리학적 인자, 예를 들어 체중, 병태의 중증도, 치료될 질환의 타입, 이전 또는 동시 치료학적 개입, 피검체의 특발증, 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여를 책임지는 전문d의는 임의의 경우에, 조성물 중 활성 성분(들)의 농도 및 개개 피검체에 대한 적절한 용량(들)을 결정할 것이다.
투약은 필요에 따라 당업자에 의해 결정되는 바와 같이 반복될 수 있다. 이에 따라, 본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 단일 용량이 고려된다. 다른 구체예에서, 2 이상의 용량이 고려된다. 1회 초과의 용량이 피검체에 투여되는 경우, 투약 간의 시간 간격은 당업자에게 결정된 임의의 시간 간격일 수 있다. 예를 들어, 투약 간의 시간 간격은 약 1 시간 내지 약 2 시간, 약 2 시간 내지 약 6 시간, 약 6 시간 내지 약 10 시간, 약 10 시간 내지 약 24 시간, 약 1 일 내지 약 2 일, 약 1 주 내지 약 2 주, 또는 그 이상, 또는 임의의 이러한 인용된 범위 내에서 유도될 수 있는 임의의 시간 간격일 수 있다.
특정 구체예에서, 환자에게 약제 조성물의 연속적인 공급을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 카테터 삽입(catheterization) 이후, 치료제의 연속적 투여에 의해 달성될 수 있다. 투여는 수술중 또는 수술후에 이루어질 수 있다.
특정 구체예에서, 약제 조성물은 예를 들어 적어도 약 0.1%의 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 약 2 중량% 내지 약 75 중량%의 단위, 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 이러한 범위에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 다른 비-제한적인 예에서, 용량은 또한 투여 당 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg 체중, 약 50 밀리그램/kg 체중, 약 100 밀리그램/kg 체중, 약 200 밀리그램/kg 체중, 약 350 밀리그램/kg 체중, 약 500 밀리그램/kg 체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg 체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 20 밀리그램/kg 체중, 약 50 밀리그램/kg 체중, 약 100 밀리그램/kg 체중, 약 200 밀리그램/kg 체중, 약 350 밀리그램/kg 체중, 약 500 밀리그램/kg 체중, 내지 약 1000 mg/kg 체중, 또는 그 이상, 및 이러한 범위에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 비-제한적인 예에서, 상술된 숫자를 기초로 하여 약 5 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg 체중 등의 범위가 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 투여되는 투약량은, 정균제 또는 살균제가 대신에 투여되었을 경우, 이러한 제제가 투여되는 양 보다 적다. 예를 들어, 수많은 타입의 실험에서, 정균제 또는 살균제는 mM 범위로 투여되지만, 본 발명의 화합물은, 특정 구체예에서, 박테리아를 사멸시키지 않으면서 이러한 것들이 본원에 기술된 본 발명의 방법 (예를 들어, 박테리아 감염증을 치료하거나 예방하는 방법)을 달성하도록 약 nM 범위 또는 그 이하 (예를 들어, 약 100 nM 또는 그 이하)로 투여된다. 이에 따라, 본 발명의 방법은 본 발명의 화합물을 살균제 또는 정균제 양이 아닌, 독성 또는 병인을 예방하는데 효과적인 양으로 투여함을 고려한다.
임의의 경우에, 본 조성물은 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 여러 항산화제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 미생물의 활동의 예방은 보존제, 예를 들어 파라벤 (예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 항박테리아제 및 항균제에 의해 이루어질 수 있다.
후보 물질은 자유 염기, 중성, 또는 염 형태로 조성물에 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염, 예를 들어 단백질성 조성물의 자유 아미노기와 함께 형성되거나 무기염, 예를 들어 염화수소산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 글리콜산, 락트산, 타르타르산, 또는 만델산과 함께 형성된 산부가염을 포함한다. 자유 카르복실기와 함께 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 소듐, 칼륨, 암모늄, 칼륨 또는 페릭(ferric) 히드록사이드; 또는 유기 염기, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, TRIS, 또는 프로카인으로부터 유도될 수 있다.
조성물이 액체 형태인 구체예에서, 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 액체 (예를 들어, 트리글리세라이드, 식물성 오일, 리포솜), 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해; 담체, 예를 들어 액체 폴리올 또는 지질 중에서의 분산에 의해 요망되는 입자 크기의 유지에 의해; 계면활성제, 예를 들어 히드록시프로필셀룰로즈의 사용에 의해; 또는 이러한 방법들의 조합에 의해 유지될 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 소듐 클로라이드, 또는 이들의 조합을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 본 발명에서 안약 또는 귀약, 비강 용액 또는 분무약, 에어로졸 또는 흡입제로 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 타겟 조직 타입과 양립가능하도록 디자인된다. 비-제한적인 예에서, 비강 용액은 대개 비강 통로에 방울 또는 분무로 투여되도록 디자인된 수용액이다. 비강 용액은 이러한 것들이 여러 측면에서 비강 분비물과 유사하도록 제조되며, 이에 일반적인 모양체 활동이 유지되도록 한다. 이에 따라, 특정 구체예에서, 비강 수용액은 대개 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 유지시키기 위해 등장성이거나 약간 완충액처리된다. 또한, 안과 제조물, 약물, 또는 적절한 약물 안정화제에서 사용되는 것과 유사한 항균성 보존제는 요망되는 경우, 제형에 포함될 수 있다. 예를 들어, 여러 상업적 비강 제조물이 공지되어 있고 항생제 또는 항히스타민제와 같은 약물을 포함한다.
특정 구체예에서, 후보 물질은 경구 섭취와 같은 경로에 의해 투여하기 위해 제조되며, 이러한 구체예에서, 고형 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀젼제, 정제, 환제, 캡슐 (예를 들어, 경질 또는 연질 껍질의 젤라틴 캡슐), 지속 방출 제형, 협측 조성물, 트로치, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 경구 조성물은 식이요법의 식품과 함께 직접 도입될 수 있으며, 특정 구체예에서, 경구 투여용 담체는 불활성 희석제, 동화가능한 식용 담체 또는 이들으 조합을 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 경구 조성물은 시럽 또는 엘릭시르로서 제조될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 예를 들어 적어도 하나의 활성제, 감미제, 보존제, 착향제, 염료, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 약제 조성물의 투약 제형은 당업계에 너리 공지된 바와 같이 속방출 또는 서방출 제형을 제조하기 위해, 이러한 것들과 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 서방출제를 조합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어 치주 질환 또는 다른 구강 치료 징후의 치료에서 사용될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 옥수수전분, 락토즈, 수크로즈, 땅콩유, 올리브유, 참기름, 프로필렌 글리콜 및 물과 같은 형태의 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 담체가 사용되는 경우, 본 약제 조성물의 투약 제형은 예를 들어, 분말, 트로치, 또는 로젠지 형태일 수 있다. 액체 담체가 사용되는 경우, 본 약제 조성물의 투약 제형은 예를 들어 연질 젤라틴 캡슐, 시럽 액상 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액 형태일 수 있다. 투약 제형은 또한 어쥬번트, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 용액 촉진제를 함유할 수 있다. 속방출 및 서방출 제형은 당업계에서 널리 알려진 것으로서, 예를 들어 미국특허 4,764,377호 (이의 기술내용은 본원에서 참고문헌으로 포함됨)에 기술되어 있으며, 이러한 특허문헌에는 치료제의 방출이 질환 과정의 바로 부근에서 일어나도록 치주 포켓내에 배치된 전달장치에 의해 치주 질환을 치료하는 방법이 기재되어 있다. 치주 질환을 치료하는 다른 수단은 미국특허 5,324,756호에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
특정 구체예에서, 경구 조성물은 하나 이상의 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 착향제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 조성물은 하기 화합물 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들어 검 트래거캔스, 아카시아, 옥수수전분, 젤라틴 또는 이들의 조합; 부형제, 예를 들어, 디칼슘 포스페이트, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 마그네슘 카르보네이트 또는 이들의 조합; 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 이들의 조합; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 감미제, 예를 들어, 수크로즈, 락토즈, 사카린 또는 이들의 조합; 착향제, 예를 들어 페퍼민트, 윈터그린 오일(oil of wintergreen), 체리 착향제, 오렌지 착향제 등; 또는 상기 화합물들의 조합. 투약 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 타입의 물질 이외에, 담체, 예를 들어 액체 담체를 함유할 수 있다. 여러 다른 물질들은 코팅으로서 또는 그 밖에 투약 단위의 물리적 형태를 개질시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제, 또는 캡슐제는 셀락(shellac), 당, 또는 이들 둘 모두로 코팅될 수 있다.
특정 코팅 물질은 약 5 또는 그 이상의 pH에서 또는 적어도 이러한 pH에서, 예를 들어 약 pH 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0 또는 그 이상, 예를 들어 약 6.5 또는 그 이상의 pH에서 용해하는 물질이다. 이에 따라, 이러한 코팅은 단지 이러한 것들이 위에 잔류되어 있고 작은창자에 진입할 때 용해되기 시작한다. 따라서, 이러한 코팅은 장용 코팅으로 여겨질 수 있다. 수분 내지 수 시간에 용해되고 이에 따라 말단 회장 또는 결장에 도달할 때에만 캡슐 하부가 파열되게 하는 코팅의 두꺼운 층이 제공된다. 이러한 코팅은 다양한 폴리머, 예를 들어 셀룰로즈 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 히드록시프로필메틸 셀룰로즈 프탈레이트 (HPMCP), 폴리비닐 아세테이트 프타레이트 (PVAP), 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트 (CAP) 및 힐리(Healy, 1989)에 의해 기술된 셀락으로부터 제조될 수 있다. 셀룰로즈 에스테르의 코팅을 위하여, 200 내지 250 ㎛의 두께가 적합할 것이다.
비-제한적 대표적인 코팅 물질은 메틸 메타크릴레이트 또는 메타크릴산과 메틸 메타크릴레이트의 코폴리머이다. 이러한 물질은 EUDRAGIT™ 폴리머 (Rohm Pharma, Darmstadt, Germany)로서 입수가능하다. 에유드라지트(Eudragit)는 메타크릴레산과 메틸 메타크릴레이트의 코폴리머이다. 조성물은 EUDRAGIT™ L1OO 및 Eudragit S1OO을 기초로 할 수 있다. EUDRAGIT™ L1OO은 pH 6 이상에서 용해하고, 건조 물질 1 g 당 48.3% 메타크릴산 단위를 포함하며; EUDRAGIT™ S1OO은 pH 7 이상에서 용해하고, 건조 물질 1 g 당 29.2% 메타크릴산 단위를 포함한다. 특정 코팅 조성물은 100 부 L100:0 부 S1OO 내지 20 부 L100:80 부 S1OO 범위의 EUDRAGIT™ L1OO 및 EUDRAGIT™ S1OO를 기초로 한다. 비-제한적 대표적인 범위는 70 부 L100:30 부 S1OO 내지 80 부 L100:20 ㅂ부 S1OO이다. EUDRAGIT™ L100:S100의 비가 높은 경우의 제형에 대하여, 150-200 ㎛의 코트 두께가 바람직하다. 이는 사이즈 0 캡슐의 경우 70-110 mg의 코팅에 해당한다. EUDRAGIT™ L100:S100의 비가 낮은 코팅에 대하여, 80-120 ㎛의 코트 두께가 바람직한데, 이는 사이즈 0 캡슐의 경우에 30 내지 60 mg 코팅에 해당한다.
상세하게는, 본 발명의 화합물은 비흡수성인 담체로서 작용하는 폴리머에 도입될 수 있다는 것이 예상된다. 본 발명의 화합물은 예를 들어 이러한 폴리머에 공유결합될 수 있다. 이러한 폴리머는 예를 들어, 상술된 폴리머 및/또는 본원에서 논의된 폴리머 테일(tail) 및 폴리머 골격일 수 있다.
다른 투여 모드에 대해 적합한 추가 제형은 좌제를 포함한다. 좌제는 직장, 질, 또는 요도에 삽입하기 위해 일반적으로 약물을 섞은, 여러 중량 및 모양의 고체 투약형이다. 삽입 후에, 좌제는 공동 유체 중에서 연화되거나, 용융되거나, 용해된다. 일반적으로, 좌제의 경우에, 통상적안 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜, 트리글리세라이드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 좌제는 예를 들어 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10%, 및 바람직하게 약 1% 내지 약 2%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 활성 화합물을 요망되는 양으로 요망되는 경우 상기와 같이 나열된 여러 다른 성분들을 지닌 적절한 용매 중에 도입한 후에 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액, 현탁제 또는 에멀젼제의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 특정한 제조 방법은 활성 성분과 이전의 이의 멸균-여과된 액체 매질로부터 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말을 수득하는 진공-건조 또는 동결-건조 기술을 포함할 수 있다. 액체 매질은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코즈를 주입하기 전에 등장성을 제공한다. 직접 주사를 위한 고도로 농축된 조성물의 제조가 또한 고려되며, 여기서, 용매로서 DMSO의 사용은 고농도의 활성제를 작은 영역으로 전달하는, 매우 빠른 투과를 초래할 것으로 예상된다.
조성물은 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 내독소 오염이 최소한적으로 안전한 수준, 예를 들어, 0.5 ng/mg의 단백질로 유지되어야 함이 인지될 것이다.
특정 구체예에서, 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에서의 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이의 조합물의 사용에 의해 발생될 수 있다.
2. 조합 요법
본 발명의 화합물의 효과를 증가시키기 위해, 본 발명의 화합물은 전통적인 약제와 조합될 수 있다. 예를 들어, 항균제, 지사제 및/또는 아드레날린 길항제가 본 발명의 화합물과 함께 투여될 수 있다. 이러한 유형의 조합 요법이 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있는 것이 예상된다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 정족수 신호전달(quorum signaling)을 억제함으로써 세균 독성을 억제하는 유효량의 제 2 (또는 이 이상)의 제제를 갖는 조합량으로 제공될 수 있다. 이러한 방법은 동시에, 또는 물질의 별도의 투여가 요망되는 치료 이점을 발생시키는 시간 내에서 작용제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이는 세포, 조직, 균막 또는 유기체를 단일 조성물 또는 2개 이상의 제제를 포함하는 약리학적 제형과 접촉시키거나, 세포를 2개 이상의 별개의 조성물 또는 제형과 접촉시킴으로써 달성될 수 있고, 여기서 하나의 조성물은 하나의 제제를 포함하고, 다른 조성물은 또 다른 제제를 포함한다.
본 발명의 화합물은 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 제제에 선행하고/하거나, 다른 제제와 동시 행해지고/지거나, 다른 제제에 후속될 수 있다. 제제가 세포, 조직, 균막 또는 유기체에 별도로 적용되는 구체예에서, 각각의 전달 시간 사이에 현저한 기간이 종료되지 않도록 하여, 제제가 세포, 조직 또는 유기체에 대해 유리하게 조합된 영향을 발휘할 수 있도록 하는 것이 일반적으로 보장된다. 예를 들어, 이러한 예에서, 세포, 조직 또는 유기체를 후보 물질로서 2, 3, 4 또는 이 이상의 양식(modality)을 실질적으로 동시(즉, 약 1분 이내)에 접촉시키는 것이 고려된다. 다른 양태에서, 하나 이상의 제제는 후보 물질의 투여 전 및/또는 후에 실질적으로 동시, 약 1 분, 약 5 분, 약 10 분, 약 20 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 60 분, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 17 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 25 시간, 약 26 시간, 약 27 시간, 약 28 시간, 약 29 시간, 약 30 시간, 약 31 시간, 약 32 시간, 약 33 시간, 약 34 시간, 약 35 시간, 약 36 시간, 약 37 시간, 약 38 시간, 약 39 시간, 약 40 시간, 약 41 시간, 약 42 시간, 약 43 시간, 약 44 시간, 약 45 시간, 약 46 시간, 약 47 시간, 약 48 시간, 약 1 일, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 약 14 일, 약 15 일, 약 16 일, 약 17 일, 약 18 일, 약 19 일, 약 20 일, 약 21 일, 약 1 주, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주 또는 약 8 주 또는 이 이상, 및 이로부터 유래가능한 임의의 범위 내에 투여될 수 있다.
제제의 다양한 조합 요법이 이용될 수 있다. 이러한 조합의 비제한적인 예가 하기 제시되며, 여기서 본 발명의 화합물은 "A"이고, 항균제, 지사제 및/또는 아드레날린 길항제(예를 들어, 펜톨라민(phentolamine), 프로파놀론(propranolol), 또는 욤바인(yombine))와 같은 제 2 제제는 "B"이다:
G. 식물 적용
본 발명의 화합물은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 통해 식물에 투여될 수 있다. 예를 들어, 식물 세균 감염을 치료하기 위해 본 발명의 조성물을 이용하는 방법에서, 조성물은 적절한 부피의 물에 희석되어 이후에 요망되는 효과(예를 들어, 세균 감염의 감소)를 발생시키기에 충분한 적용 속도로 식물 또는 식물들의 잎에 적용되는 적용 용액이 생성될 수 있다. 수용성인 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 분무에 특히 적합하다. 수용성이 아니거나 제한된 수 용해성을 지니는 화합물은, 예를 들어, 에멀젼 또는 마이크로에멀젼(microemulsion)으로 적용될 수 있다.
에멀젼 안정성을 향상시키기 위해 용매 및 유기산과 같은 화합물이 본 발명의 에멀젼에 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 일반적으로 수성 담체상에서의 계면활성제의 가용성 또는 분산성을 증가시킴으로써 향상된 열 및 pH 안정성, 감소된 점성 및 높은 활성제 적하(loading)를 나타내는 확고한 에멀젼의 형성을 가능하게 하는 기능을 한다. 수성 담체상에서의 계면활성제의 가용성 또는 분산성을 증가시킴으로써 에멀젼의 적절한 안정성을 달성시키기 위해 용매가 조성물에 첨가될 수 있다. 수성 담체상에서의 친수성 부분을 갖는 계면활성제의 가용성을 증가시키기 위해 수용성 용매가 첨가될 수 있다. 수용성 용매의 비제한적인 예는 아세테이트, C1-6 알칸올, C1 -6 디올, 알킬렌 글리콜 및 폴리알킬렌 글리콜의 C1 -6 알킬 에테르, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 알칸올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 헥산올의 다양한 위치 이성질체, 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 상기 알칸올에 더하거나, 상기 알칸올을 대신하여, 디올, 예를 들어, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물, 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜을 사용하는 것이 또한 가능하다. 소수성 및 친수성 용매의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 에멀젼의 안정성을 향상시키기 위해 유기산, 예를 들어, 아세트산, 디클로로아세트산, 시트르산, 말산, 옥살산, 살리실산, 또는 타르타르산이 조성물에 첨가될 수 있다. 무기산 및 산화제를 포함하는 기타 첨가제가 에멀젼 안정성을 향상시키기 위해 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있다. 비제한적 예는 붕산, 과염소산, 인산, 황산, 과산화수소, 과염소산리튬, 인산나트륨, 염화나트륨 및 요오드화나트륨을 포함한다.
식물 치료 조성물은 바람직하게는 표준 농업 분무 장비를 이용하여 용이하게 분무되도록 충분히 희석된다. 본 발명의 조성물에 효과적인 적용 속도의 선택은 통상적인 숙련자의 기술 범위 내이다. 당업자는 또한 개별적 식물 상태, 기후 및 성장 조건, 뿐만 아니라 조성물 내의 특정 활성 성분 및 이의 중량비가 본 발명을 실시함으로써 달성되는 식물 세균 감염의 치료의 효과의 정도에 영향을 미치는 것을 인지할 수 있을 것이다.
1. 잎 적용
용어 "잎 적용"은 식물의 잎, 또는 땅 위에 존재하는 부분으로의 물질의 적용, 특히 식물의 잎으로의 적용을 의미한다. 잎 적용에 사용되는 물질의 부수적인 양은 토양으로 침투되거나 토양과 접촉할 수 있으나, 토양에 침투하고, 잎 및 다른 땅 위에 존재하는 구조와 접촉하는 양에 비해 식물의 뿌리에 유의하게 접촉하는 양이 아님이 해당 분야에서 이해된다.
잎 적용은 수십년 동안 농장, 온실, 화초, 및 다른 농업 환경에서 수행되었고, 이는 해당 분야에 공지된 다양한 방법중 임의의 방법으로 수행된다. 예를 들어, 농장주는 분무기가 장착된 트랙터, 농약 살포, 가압된 스프링클러, 및 포도덩굴에 분무하기 위해 사용되는 상승된 호스와 같은 시스템을 통해 통상적으로 농약 및 다른 제제를 적용한다.
통상적으로, 본 발명의 화합물은 사용 전에 적절한 경우 물에 용해되거나 물로 희석된다. 농부는 여러 해 동안 논밭에 사용하기 위한 농약, 비료 및 기타 농업용 화학제품을 혼합하는 것에 익숙하므로, 본 발명의 화합물의 혼합 및 적용은 농부의 기술 범위 내에 속한다.
논밭에 적용되는 혼합물의 양은 여러 변수에 좌우될 것이다. 잎 적용에서, 목표는 잎을 습화시키는 것이다. 상기를 달성하기 위해 얼마나 많은 양의 물이 필요한지는 포함되는 잎의 양, 및 주위 영역도 습화시키지 않고 잎에 혼합물을 유도하는 적용 방법에 크게 좌우될 것이다. 잎의 양은, 예를 들어, 식물의 연령의 양(어린 식물은 통상적으로 성숙한 식물보다 적은 잎을 가짐), 식물의 유형(다양한 유형의 식물은 잎의 양 및 밀도가 다양함), 및 식물의 건강에 좌우될 것이다. 물론, 농부는 여러 해 동안 작물에 다양한 화학제품을 적용하며, 다양한 연령 및 유형의 작물에 대한 잎 적용에 필요한 액체의 양을 판단하는데 매우 친숙하다. 사용되는 액체의 양이 결정된 후, 백만분율(parts per million, ppm)의 임의의 요망되는 농도를 달성하기 위해 첨가되는 본 발명의 조성물의 양이 용이하게 결정된다. 적용 속도가 잎을 습화시키기에 충분한지의 여부의 결정이 또한 용이하게 이루어지며, 만족스러운 속도가 달성될때까지 양이 용이하게 조정된다.
스프링클러 시스템과 같은 일부 시스템은 토양에 물을 공급하면서 전체 식물에 물을 분무하는 것이 인지되어야 한다. 해당 분야에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 상기 방법은 토양 적용을 고려하며, 이는 이러한 토양 적용의 목적이 땅을 적시는 것이며, 단지 잎 또는 땅 위의 기타 부분을 습화시키는 것이 아니기 때문이다.
2. 토양 적용
용어 "토양 적용"은 식물 주위의 토양으로의 물질의 적용을 의미하며, 이의 목적은 토양에 직접 영향을 미치게 하거나, 식물의 뿌리가 물질과 접촉하도록 하기 위한 것이다. 일반적으로, 토양 적용을 통해 적용되는 물질은 잎과 접촉하지 않고, 토양 적용에 사용되는 물질의 부수적인 양이 뿌리 및 다른 땅 아래의 구조와 접촉하는 양에 비해 현저하지 않은 양으로 잎과 접촉하는 것이 가능하다. 예를 들어, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 감염은 감염 경로가 통상적으로 뿌리를 통하므로 토양 적용을 통해 치료될 수 있다(Daughtery, 2003).
토양 적용에서, 토양은 바람직하게는 먼저 본 발명의 조성물이 토양 내에서 자유롭게 이동하고 식물의 뿌리에 도달할 수 있도록 하기 위해 토양의 입자를 습화시키도록 포화된다. 따라서, 바람직하게는 토양은 제제 적용 전에 통상적인 물로 70-80%의 농포 용수량으로 포화된다. 선택되는 특정 농도는 주로 적용 방법에 의해 허용되는 물의 유속에 따라 다양하다. 보다 높은 유속을 갖는 방법은 일반적으로 본 발명의 화합물의 보다 낮은 농도를 요하는데, 이는 더욱 많은 물을 함유하는 혼합물이 식물의 뿌리에 도달하기 때문일 것이다. 역으로, 보다 낮은 유속은 일반적으로 본 발명의 화합물의 보다 높은 농도를 요한다. 대안적으로, 혼합물의 적용 시간은 변경될 수 있다. 따라서, 혼합물의 낮은 유속 및 낮은 농도의 사용은 물을 함유하는 혼합물이 적용되는 시간을 증가시킴으로써 균형이 이루어질 수 있다. 따라서, 혼합물의 유속 또는 농도를 반감은 물-혼합 용액의 적용 시간을 2배로 함으로써 벌충될 수 있다. 유속은 특히 중요한 변수이며, 혼합물이 적용되는 작물이 또한 적용되는 혼합물의 농도를 결정하는 것을 도울 수 있다. 통상적으로, 다년생 식물은 일년생 식물보다 높은 농도를 갖는다.
농부는 보통 관개(irrigation) 에이커 당 유속 또는 농부의 농장의 적절한 기타 토양 적용 시스템, 뿐만 아니라 관리되는 에이커 수를 잘 인지함이 인식되어야 한다. 농부는 임의의 특정 기간 동안 토지에 급수하는데 사용되는 물의 양(예를 들어, 30분 동안 50에이커에서의 분당 300 갤런은 450,000 갤런의 물임)을 계산할 수 있다. 이후, 농부는 요망되는 농도의 혼합물의 적용을 발생시키는데 얼마나 많은 본 발명의 조성물이 필요한지 계산할 수 있다.
본 발명의 조성물은 수분 내지 수시간 내지 수일과 같은 기간 동안 적용된다. 몇몇 경우에, 개업자는 밤새 또는 수일과 같은 장기간 동안 낮은 농도로 혼합물을 적용시키는 것을 원할 수 있다. 이러한 적용은 세균 감염 또는 이의 증상을 감소시키는 한 본 발명의 범위 내에 속한다. 적용 시간은 또한 사용되는 특정 방법에 따라 다양할 것이다.
개업자는 다양한 적용 시스템이 다양한 유속을 갖는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 오버헤드 스프링클러는 일반적으로 적하(drip) 시스템보다 비교적 높은 유속을 갖는다. Fan Jet™와 같은 마이크로스프링클러 시스템은 통상적으로 적하 시스템의 유속과 스프링클러의 유속 사이의 유속을 갖고, 따라서 스프링클러의 적용 시간보다 다소 높은 적용 시간을 갖는다.
본 발명의 조성물은 호스, 파이프, 적하, 스프링클러, 관개 채널 또는 기타 메커니즘을 통해 이동되어 토양에 적용될 수 있다. 실제로, 사용되는 장치는 반드시 정밀한 장비인 것은 아니다. 따라서, 물 유동이 중단되는 경우, 물은 통상적으로 약간의 시간 동안 호스로부터 또는 관개 채널 또는 기타 적용장치를 통해 지속적으로 적하되거나 이동될 것이다. 따라서, 적용 시간은 일반적으로 근사치이고, 혼합물의 일부가 적용장치로부터 지속적으로 적하되거나 이동되거나 그렇지 않은지 간에 혼합물의 유동 시작으로부터 혼합물의 유동이 중단되는 경우까지 측정될 것이다.
본 발명의 조성물의 적용 후, 혼합물은 통상적으로 토양의 상부 몇 인치 내에 존재할 것이다. 많은 식물에서, 뿌리 시스템은 토양 내에 보다 깊이 존재한다. 따라서, 능동 흡수와 관련된 뿌리 구조에 도달시키기 위해 혼합물을 토양 내로 6 내지 12인치 이동하도록 돕는 것이 요망된다. 이를 달성하기 위해, 제제의 적용 후의 농도 구배를 생성시키기 위한 "워터 푸쉬(water push)"를 사용하기는 것이 요망될 수 있다. 이는 물의 적용과 함께 제제의 적용에 따라 달성된다. 물 적용은 수분만큼 짧거나, 수시간 만큼 길 수 있다. 농도 구배를 생성시키는 이러한 "워터 푸쉬"는 농업 화학제품의 적용에서 농부에 의해 통상적으로 사용되고, 따라서 해당 분야에 널리 공지되어 있다.
3. 수확된 식물로의 적용
본 발명의 조성물은 식물체가 수확된 후 식물체의 세균 감염을 감소시키거나 예방함으로써 수확된 식물체의 저장 수명을 연장시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물을 포함하는 용액 또는 에멀젼이 상기 목적에 사용될 수 있다.
수확된 식물체로 본 발명의 조성물을 적용시키는 것은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 수초 내지 수분, 및 가능하게는 수시간의 기간 동안 수확된 식물체가 적용되는 조성물에 제공되거나 노출되는 동안 실온에서 수행되는 침지 또는 분무 과정을 이용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 상기 적용에 적합한 솔을 이용하여 수확된 식물체 상에서 솔질될 수 있다.
H. 실시예
아래 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 증명하기 위해 포함되어 있다. 하기 실시예에 공개된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능 하는 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내는 것이고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하도록 여겨질 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나 당업자는, 본 발명의 견지에서, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어남 없이, 많은 변화가 기재되고 여전히 유사하거나 동일한 결과를 얻는 특이적 구체예에서 이뤄질 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1
박테리아 독성의
억제자의
스크리닝
개관
UT Southwestern Medical Center(Dallas, Tex.)로부터의 150,000 작은 유기 분자의 라이브러리를 높은 처리 분석으로 5μM 스크리닝하여, EHEC의 QseC-dependent 독성 유전자 activation의 억제자를 확인하였다(도 5). 다양한 범위의 분자 구조를 나타내는 첫번째 라운드의 양성 "히트(적중)"를 추가 라운드의 스크리닝에 적용시킨 후, 시험관 내 박테리아성 세포에 대한한 독성에 대한 예비 평가에 적용시켰다. 이는 10-5M 또는 그 미만의 IC50 값을 가진 75 잠재적 억제자의 풀(pool)을 생성하였다. 하나의 화합물을 다른 리드 분자에 비한 이의 능력, 박테리아를 향한 이의 최소 독성 및 인간 세포 라인 및 화학적 개조를 위한 잠재성에 기초하여 선택하였다. 이 분자의 구조-활성 연구를 수행하여 이의 능력을 개선하는 방법을 확인하였다. 그 결과는, LED209(화합물 5)(N-페닐-4-[[(페닐아미노)티옥소메틸]아미노]-벤젠술폰아미드)를 3 단계로 제조하였다(실시예 2 참조).
실험
EHEC에서, AE 병변의 형성과 관련된 유전자를 LEE(Locus of Enterocyte Effacement)로 명명된 염색체 병원성 섬 내에서 엔코팅하였다. LEE 영역은 5개의 주된 오페론을 함유한다: LEE1, LEE2, LEE3, LEE4 및 LEE5, 이들은 타입 III 분비 시스템(TTSS), 부착소(인티민), 및 이 부착소의 수용자(Tir)를 엔코딩하고, 이는 박테리아 TTSS을 통해 상피 세포로 전위된다. LEE 유전자는 LEE-엔코딩된 수용자(Ler)에 의해 직접 활성되며, 이는, LEE1 오페론 내 제 1 유전자이다(Kaper et al., 2004). LEE1의 전사 활성은, AI-3를 생산하는 박테리아 종으로부터 소비된 상청액(AI-3을 생성하는 박테리아는 대수 증식단계에서 OD600 1.0로 성장한다; 박테리아 세포는 원심 분리에 의해 펠렛화 된다, 상청액은 0.22μM 필터를 통해 여과되어 박테리아 세포가 없게 된다; 이는 현재의 소비된 상청액이다)을 사용하여 달성될 수 있다(Sperandio et al., 2003; Walters et al., 2006).
AI-3에 의한 LEE1 전사 활성의 억제자의 분석을 평가하기 위해, 조건을 확인했다, 여기서 염색체 LEE1::lacZ 리포터를 함유하는 TEVS232 박테리아 종 (Sperandio et al., 1999)은 EHEC 8624 cultures(AI-3 함유)로부터의 조건화된 매질의 첨가에 반응할 것이다. 밤새 배양의 포기를 변화시키는 것을 포함하는, 다수의 상이한 성장 조건을 시험한 후에, 성공적 프로토콜을 개발하였다, 여기서 신선한 TEVS232를 1.1-1.3 O.D. 유닛을 가지는 농도로 Luria 브로스(broth)에서 성장시켰고, Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)로 희석하였고, 37℃에서 교반 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 아침에, 0.2 내지 0.3의 광학 밀도를 가진 배양물을 DMEM(음성 대조군) 또는 DMEM(10% EHEC 예조된 매질을 함유)로 희석시켰다. 이 박테리아를 384 웰 플레이트의 웰에 40μl 부피만큼 분배하였다, 음성 대조군 박테리아를 칼럼 24의 웰에 첨가하였다. 칼럼 2 및 23의 웰은 컨디셔닝된 매질 및 DMSO 내 박테리아를 받았고, 칼럼 3-22의 웰은 컨디셔닝된 매질 및 UT Southwestern 150,000 화합물 파일로부터의 화합물 내 박테리아를 받았다. 화합물을, Biomek FX 액체 핸들러를 사용하여 최종 농도 5 μM 및 1% DMSO로 첨가하였다.
박테리아의 플레이트를 5% CO2 대기에서 37℃에서 5시간 배양하였다. 배양 말기에, 세포를 15분 동안 32℃에서 최종 농도 0.3mg/ml의 리소자임으로 배양하였다. Beta-GloTM 시약(Promega)을 첨가하였다, 이는 루시페라아제 반응에 대한 LEE1::LacZ 융합 유전자에 의해 생성된 β-갈락토시다제를 커플링 한다, 실온에서 4분 배양 후 발광에 의해 가독될 수 있는 분석을 생산한다. 화합물(플레이트 1) 대신에 DMSO로 처리된 플레이트 및 화합물로 처리된 또 다른 플레이트(플레이트 2)의 결과는 도 5에 있다. 각 웰이 발광 값을, 각 칼럼의 웰의 수로, 플롯하였다. 이 초기 스크린을 위한 히트 율은 7,000이었다, 20%의 오류 율을 가진다, 이는 재스크린 시, 5,600 화합물의 히트 율을 생성하였다, 이는 LEE1 전사의 AI-3 활성화를 억제하는 화합물, 박테리아 전사의 일반적 억제자 및 간단한 독성인 화합물을 포함한다. 독성 화합물, 뿐만 아니라 관심있는 화합물을 컬렉션으로부터 전사의 일반적 억제자인 화합물을 제거하기 위해, LEE1::lacZ와 동일한 유전적 배경에서 β-락타마제 bla::lacZ 염색체 리포터를 활용하여, 제 2 스크린을 수행하였다(strain MCAmp (Sperandio et al., 1999)). 이 제 2 스크린은 specific AI-3 억제자로서 75 화합물을 입증하였고, 이로부터 LED209 (화합물 5)을 이의 효능, 박테리아 세포에 대한 비독성 및 의미있는 화학적 개조에 대한 잠재성의 이유로 선택하였다.
실시예 2
특정 본 발명의 화합물의 제조
N-아세틸술파닐일 클로라이드 1 (55 g, 236 mmol)를 일부, 에탄올(300 mL) 내 소듐 아세테이트(48.4 g, 590 mmol) 및 아닐린 2 (22 mL, 236 mmol)의 교반 0℃ 현탁액에 첨가하였다. 실온에서 밤새 반응 혼합물을 교반하였고, 그 다음에 강한 교반과 함께 얼음 냉각 수(1.5L)에 부었다. 1시간 동안 교반 후, 점차 침전된 흰색 고체를 여과에 의해 수집하였다. 필터 케이크를 얼음 냉각 수로 세척하였고, 진공 건조하였고, 뜨거운 에탄올로 재결정하여 N-[4-[(페닐아미노)술폰일]페닐]acet아미드 (3) (also called 137-19 or LED137) (41 g, 60%)를 흰색 고체로서 제공하였다, mp 209-210℃. 1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 7.64 (br s, 4H), 7.18 (t, J=7.6 Hz, 2H), 7.06-7.00 (m, 3H), 2.10 (s, 3H).
HCl (40 mL)의 6N 수용액을 교반하면서 에탄올 (80 mL) 내 용액 3(20 g, 68 mmol)에 조심히 첨가하였다. 3시간 동안 환류 하에서 가열 후, 반응 혼합물을 진공 증발 건조하였고, 이 잔여물을 물에서 용해시켰다. 용액의 pH를 1N aq. NH4OH를 사용하여 8-9로 조절하였다. 1시간 동안 교반 후, 점차 침전된 흰색 고체를 필터에 의해 수집하였다. 이 필터 케이크를 얼음 냉각 수로 세척하였고, 진공 건조하였고, 뜨거운 에탄올로 재결정하여 4-아미노-N-페닐-벤젠술폰아미드(4)(또한, 207-33 또는 LED207로 불림)(10.9 g, 65%)를 흰색 고체로 제공하였다, mp 194-195℃. 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.64 (br s, 1H), 7.50-7.45 (m, 2H), 7.25-7.18 (m, 4H), 7.04-6.98 (m, 1H), 6.67-6.62 (m, 2H), 5.44 (br s, 2H); 13C NMR (CD3COCD3, 75 MHz) δ 152.9, 138.8, 129.3 (2C), 129.1 (2C), 126.3, 124.0, 120.5 (2C), 113.1 (2C).
트리에틸아민(0.07 mL, 0.5 mmol) 및 페닐 이소티오시아네이트(2.1 mL, 11 mmol)를 순차적으로 건조 THF(10 mL) 내 용액 4(2.48 g, 10 mmol)에 첨가하였다. 48시간 동안 환류 하에서 가열 후, 모든 휘발물을 진공 하에서 제거하였고, 그 결고 남은 미정제물을 플래시 크로마토그래피에 의해 실리카 젤(헥산/아세톤, 3:1) 위에서 정제하여, N-페닐-4-[[(페닐아미노)티옥소메틸]아미노]벤젠술폰아미드 (5, also called LED209) (1.34 g, 35%)를 흰색 고체로 제공하였다, mp 160-162℃. 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 9.35 (br s, 1H), 9.30 (br s, 1H), 8.98 (br s, 1H), 7.80-7.72 (m, 4H), 7.51-7.47 (m, 2H), 7.38-7.33 (m, 2H), 7.28-7.16 (m, 5H), 7.08-7.04 (m, 1H); 13C NMR (CD3COCD3, 75 MHz) δ 180.2, 143.9, 138.9, 138.2, 135.2, 129.3 (2C), 129.1 (2C), 127.9 (2C), 125.8, 124.6 (3C), 122.8 (2C), 120.8 (2C).
화합물 27을 90% 수율로 화합물 3과 같은 방식으로 제조하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 9.63 (br s, 1H), 7.80-7.77 (m, 2H), 7.46-7.42 (m, 2H), 7.35-7.27 (m, 3H), 7.15-7.12 (m, 2H), 3.17 (s, 3H), 2.14 (s, 3H).
화합물 8을 65% 수율로 화합물 4와 같은 방식으로 제조하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) 67.32-7.13 (m, 7H), 6.68-6.65 (m, 2H), 5.53 (br s, 2H), 3.10 (s, 3H).
THF(3ml) 내 8(150mg, 0.572mmol)의 용액에, 페닐 이소시아네이트(0.082ml, 0.687mmol) 및 트리에틸아민(0.16ml, 1.14mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 주위 온도에서 48시간 동안 교반하였고, 증발 건조시켰다. 그 결과의 미정제물을 실리카 젤 상 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH 97:3)에 의해 정제하였고,에탄올로부터 재결정하여 화합물 9을 35% 수율로 제공하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ 8.55 (br s, 1H), 8.25 (br s, 1H), 7.69-7.67 (m, 2H), 7.54-7.52 (m, 2H), 7.43-7.41 (m, 2H), 7.34-7.25 (m, 5H), 7.16-7.13 (m, 2H), 7.03-6.99 (m, 1H), 3.17 (s, 3H).
화합물 9b을 EtOAc/아세톤으로부터 재결정 후 52% 수율로 화합물 9와 유사한 방식으로 제조하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.92 (br s, 1H), 8.54 (br s, 1H), 8.27 (br s, 1H), 7.71-7.63 (m, 4H), 7.53-7.50 (m, 2H), 7.31-7.22 (m, 6H), 7.08-6.98 (m, 2H).
화합물 11을 30% 수율로 화합물 9와 유사한 방식으로 제조하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ 8.84 (br s, 1H), 8.32 (br s, 1H), 7.85 (br s, 1H), 7.63 (q, J=9.2 Hz, 4H), 7.31-7.28 (m, 2H), 7.23-7.19 (m, 4H), 7.06-7.02 (m, 1H), 6.70 (d, 2H, J=9.2 Hz), 2.88 (s, 6H).
화합물 13을 20% 수율로 화합물 9와 유사한 방식으로 제조하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ 8.86 (br s, 1H), 8.42 (br s, 1H), 8.13 (br s, 1H), 7.68-7.60 (m, 4H), 7.25-7.19 (m, 5H), 7.06-7.02 (m, 1H), 6.79 (dd, 1H, J=8.8 Hz, 2.0 Hz,), 6.73 (d, 1H, J=8.8 Hz), 5.94 (s, 2H).
아세톤(1 ml) 내 11(10 mg, 0.0244 mmol)의 용액에 MeI(0.015 ml, 10 equiv)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 40시간 동안 주변 온도에서 교반하였고, 헥산(10 ml)으로 희석하였다. 옅은 노란색 침전물을 여과하였고 진공 하에서 건조하여 생성물 14을 제공하였다, 9 mg, 67% 수율. 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 9.86 (br s, 1H), 9.74 (br s, 1H), 8.86 (br s, 1H), 7.93 (d, 2H, J=9.6 Hz), 7.85-7.81 (m, 2H), 7.76-7.68 (m, 4H), 7.26-7.22 (m, 4H), 7.07-7.02 (m, 1H), 3.88 (s, 9H).
THF(3 ml) 내 2(0.087 ml, 1.15 mmol)의 용액에, 이소시아네이트 10(156 mg, 0.96 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 48시간 동안 주변 온도에서 교반하였고, 증발 건조시켰다. 얻어진 미정제물을 실리카 젤 (헥산/아세톤 2:1) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였고, 에탄올로 부터 재결정하여 40% 수율의 화합물 15를 제공하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 7.93 (br s, 1H), 7.72 (br s, 1H), 7.53-7.49 (m, 2H), 7.34-7.30 (m, 2H), 7.27-7.21 (m, 2H), 6.97-6.91 (m, 1H), 6.73-6.68 (m, 2H), 2.87 (s, 6H).
화합물 16를 30% 수율로 화합물 15와 유사한 방식으로 제조하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.01 (br s, 1H), 7.98 (br s, 1H), 7.52-7.49 (m, 2H), 7.30-7.22 (m, 3H), 6.99-6.94 (m, 1H), 6.80 (dd, 1H, J=8.4 Hz, 2.1 Hz), 6.73 (d, 1H, J=8.4 Hz), 5.94 (s, 2H), 3.17 (s, 3H).
화합물 18을 40% 수율로 화합물 15와 유사한 방식으로 제조하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.01 (br s, 1H), 7.92 (br s, 1H), 7.55-7.51 (m, 2H), 7.45-7.40 (m, 2H), 7.29-7.16 (m, 4H), 7.11-7.69 (m, 5H), 6.77 (tt, 1H, J=7.5 Hz, 1.2 Hz).
화합물 20을 40% 수율로 화합물 15와 유사한 방식으로 제조하였다; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.01 (br s, 1H), 7.85 (br s, 1H), 7.54-7.50 (m, 2H), 7.36-7.22 (m, 4H), 6.98-6.92 (m, 1H), 6.79-6.74 (m, 2H).
디옥산 (2 ml) 내 페닐이소시아네이트(1 ml, 8.4 mmol)의 용액에, 트리에틸아민(8.25 ml, 58.8 mmol) 주위 온도에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 주변 온도에서 밤새 교반하였고, 그 당므에 얼음 냉각수(200 ml)로 교반하면서 부었다. 흰 침전물은 점차 나왔고 혼합물을 1시간 동안 교반하였고 그 다음에 여과시켰다. 필터 케이크를 얼음 냉각 수로 세척하였고, 진공 건조하였고, 뜨거운 에탄올로부터 재결정하여 21를 흰색 고체로 30% 수율로 제공하였다; (Perveen et al., 2007); 1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ 8.07 (br s, 2H), 7.52 (d, 4H, J=7.6 Hz), 7.26 (t, 4H, J=6.0 Hz), 6.99-6.95 (m, 2H).
EtOAc(10 ml) 내 22(300 mg, 1.29 mmol)의 용액에, 트리포스젠(382 mg, 1.29 mmol)를 첨가하였다. Knaggs, et al., 2005. 이 반응 혼합물을 77℃에서 6시간 동안 교반하였고, 헥산/EtOAc(14/1)로 용리하는, 실리카 젤에 직접 로딩하여, 무색 오일로서 생성물 23(193 mg, 58% 수율)을 제공하였다, 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 6.94 (d, 2H, J=8.7 Hz), 6.75 (d, 2H, J=8.7 Hz,), 0.96 (s, 9H), 0.18 (s, 6H); IR (thin film) v cm-1 2267 s (NCO).
무수 THF(1.5 ml) 내 24 (52 mg, 0.1 mmol) 용액에, TBAF (0.12 ml, 1.0M in THF)를 첨가하였다. 이 반응을 밤새 교반하였고, PTLC에 의해 정제하여 핑크색 고체로서 생성물 25를 제공하였다, 24 mg, 62% 수율, 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.65-7.61 (m, 2H), 7.51-7.46 (m, 2H), 7.20-7.15 (m, 4H), 7.08-6.97 (m, 3H), 6.75-6.69 (m, 2H).
무수 THF (3 ml) 내 25 (30 mg, 0.078 mmol) 용액을 PPh3 (25 mg, 0.094 mmol), 트리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 (13 mg, 0.078 mmol) 및 DIAD (0.019 ml, 0.094 mmol)에 첨가하였다. 이 반응을 밤새 아르곤 하에서 교반하였고 prep-TLC(Si-gel)에 의해 정제하여 생성물 26을 무색 오일로서 제공하였다, 10 mg, 24% 수율, 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) δ 7.57 (d, 2H, J=8.5 Hz), 7.50 (d, 2H, J=9.0 Hz), 7.34-7.32 (m, 3H), 7.19 (d, 2H, J=8.5 Hz), 7.11-7.10 (m, 2H), 6.73 (d, 2H, J=8.5 Hz), 3.78 (t, 2H, J=6.0 Hz), 3.58-3.56 (m, 2H), 3.52-3.48 (m, 8H), 3.34 (s, 3H).
화합물 27을 화합물 9와 유사한 방식으로 제조하였다: 고체, TLC: EtOAc/헥산 4:6, Rf~0.3; 1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ 8.86 (br s, 1H), 8.46 (br s, 1H), 8.08 (br s, 1H), 7.65(q, 4H, J=18.4, 8.8 Hz), 7.4(d, 2H, J=8.8 Hz), 7.26-7.20(m, 5H), 7.07-7.03(m, 1H), 6.85(d, 2H, J=8.8 Hz), 3.75(s, 3H).
화합물 28을 화합물 9와 유사한 방식으로 제조하였다: 고체, TLC: EtOAc/헥산 4:6, Rf~0.44; 1H NMR (CD3COCD3, 400 MHz) δ 8.87 (br s, 1H), 8.52 (br s, 1H), 8.41(br s, 1H), 7.70-7.62(m, 6H), 7.26-7.21(m, 6H), 7.06-7.03(m,1H).
화합물 29을 화합물 9와 유사한 방식으로 제조하였다: 고체, Solid, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.46; 1HNMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.89 (br s, 1H), 8.67 (br s, 2H), 7.75-7.60(m, 7H), 7.27-7.20(m, 4H), 7.18-7.03(m,2H).
화합물 30의 제조: 5mL 건조 THF 내 아닐린의 41.8 μL (0.46 mmol)의 용액에, 100 mg (0.46 mmol)의 4-(클로로술폰일)페닐 이소시아네이트를 0℃에서 첨가하였다. 1.5시간 동안 교반 후, 이 혼합물을 물에 부었고 EtOAc (3×15 mL)로 추출하였다. 통합된 유기 추출물을 염수로 세척하였고, 건조(Na2SO4)하였고, 농축하였다. 잔여물을 헥산으로부터 결정하여 핑크빛 흰색 고체를 제공하였다, 108 mg, 74% 수율.
30으로부터 술폰아미드의 합성을 위한 일반 방법: 0℃에서 건조 THF(3 mL) 내 술폰일 클로라이드 30 (0.14 mmol) 용액에, 아민 2(0.14 mmol) 및 피리딘(0.16 mmol)을 순차적으로 첨가였고, 이 반응 혼합물을 6-10 시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 반응 혼합물을 물로 퀀칭하였고, EtOAc로 추출하였고, 염수로 세척하였으며, 건조 및 농축하였다. 이 잔여물을 칼럼 크로마토그래피 또는 PTLC에 의해 정제하여 우수한 수율의 술폰아미드 유도체를 제공하였다.
화합물 31: 24 mg, 49% 수율. 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.38; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 9.01 (br s, 1H), 8.64 (br s, 1H), 7.97-7.69 (m, 4H), 7.56-7.53 (m, 2H), 7.31-7.24 (m,7H), 6.99 (t, 1H, J=8.7 Hz), 4.11 (d, 2H, J=5.7 Hz).
화합물 32을 26% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: CH3OH/CH2Cl2 5:95, Rf~0.2; 1H NMR(CD3COCD3, 300 MHz) δ 10.27 (br s, 1H), 10.13 (br s, 1H), 8.07 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.98-7.72 (m, 6H), 7.62 (d, 2H, J=7.8 Hz), 7.36 (t, 1H, J=7.5 Hz), 7.21 (t, 2H, J=7.5 Hz), 6.98-6.89 (m, 2H).
화합물 33을 55% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: CH3OH/CH2Cl2 5:95, Rf~0.4; 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.12 (br s, 1H), 8.81 (br s, 1H), 8.40 (br s, 1H), 7.70-7.58 (m, 5H), 7.47-7.44 (m, 2H), 7.31-7.26 (m, 3H), 6.98 (t, 1H, J=7.2 Hz), 4.03 (d, 2H, J=7.5 Hz).
화합물 34을 62% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 4:6, Rf~0.42; 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.21 (br s, 1H), 8.82 (br s, 1H), 7.71-7.61 (m, 4H), 7.47-7.49 (m, 2H), 7.29 (t, 2H, J=8.7 Hz), 7.02-6.96 (m, 1H), 모르폴린 nmr 값은 간과되었다.
화합물 35을 28.3% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.42; 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.13 (br s, 1H), 8.82 (br s, 1H), 8.12 (t, 1H, NH, J=6.3 Hz), 7.69-7.58 (m, 4H), 7.48-7.44 (m, 3H), 7.31-7.26 (m, 5H), 7.01-6.96 (m, 1H), 4.08 (d, 2H, J=5.7 Hz), 3.75 (s, 3H).
화합물 36을 52% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.38; 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 9.13 (br s, 1H), 8.82 (br s, 1H), 8.12 (t, 1H, NH, J=6.3 Hz), 7.69-7.58 (m, 4H), 7.48-7.44 (m, 3H), 7.31-7.26 (m, 6H), 7.01-6.96 (m, 1H), 4.08 (d, 2H, J=5.7 Hz).
화합물 37을 19% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: CH3OH/CH2Cl2 5:95, Rf~0.27; 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 8.73 (br s, 1H), 8.67 (br s, 1H), 8.17 (br s, 1H), 7.84 (d, 2H, J=8.2 Hz), 7.60 (d, 2H, J=8.2 Hz), 7.49-7.34 (m, 5H), 7.26 (t, 2H, J=7.5 Hz), 6.95 (t, 2H, J=7.2 Hz), 4.1 (d, 2H, J=5.7 Hz).
화합물 39의 합성. 건조 THF/CH2Cl2(1/4)(5 mL)의 혼합물 내 4-(클로로술폰일)벤조산(100 mg, 0.45 mmol) 용액에, 아닐린(45.4 μL, 0.49 mmol) 및 py(55 μL, 0.67 mmol)를 0℃에서 첨가하였고, 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 농축하였고, 그 잔여물을 CH2Cl2로 저작(triturating)에 의해 정제하였고, 디캔팅(decanting)하여, 술폰아미드 39를 흰색 고체로 제공하였다, 0.11 g, 88% 수율: TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.39; 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 10.44 (br s, 1H), 8.04 (d, 2H, J=9.0 Hz), 7.83 (d, 2H, J=9.0 Hz), 7.24-7.19 (m, 2H), 7.08-7.02 (m, 3H).
화합물 40: dry CH2Cl2 (5 mL) 내 39 (0.2 g, 0.722 mmol) 용액에, DIC (134 μL, 0.86 mmol) 및 cat. DMAP를 첨가하였고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 반응 혼합물을 물로 희석하였고, CH2Cl2(3×5 mL)로 추출하였다. 통합된 유기 추출물을 건조시켰고, 농축시켰고 실리카 젤 칼럼 상 1:9 EtOAc/헥산으로 용리하여 정제하여, 40 (0.26 g, 92%)를 고체로 제공하였다. 1H NMR 스펙트럼은 이의 구조와 일치하였고 41-46의 합성에서 사용되었다.
화합물 41: dry THF (5 mL) 내 활성 에스테르 40(60 mg, 0.15 mmol) 아민 2(16.8 mg,0.18 mmol), 및 Et3N(18.2 mg, 0.18 mmol)의 용액을 6시간 동안 주변 온도에서 교반하였다. 이 용매를 농축하였고, 그 잔여물을 prep-TLC 로 정제하여 39 mg의 고체(73% 수율)를 제공하였다; TLC: EtOAc/헥산 2:3, Rf~0.46; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.97 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.86 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.67-7.64 (m, 2H), 7.34 (t, 2H, J=6.9 Hz), 7.24-7.03 (m, 6H).
화합물 42을 73% 수율로 화합물 41과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 2:3, Rf~0.4; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.89 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.81 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.31-7.17 (m, 8H), 7.09-7.02 (m, 2H), 4.54 (s, 2H).
화합물 43을 77% 수율로 화합물 41과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 3:2, Rf~0.65; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.87 (d, 2H, J=8.8 Hz), 7.80 (d, 2H, J=8.8 Hz), 7.26-7.17 (m, 4H), 7.08-7.04 (m, 3H), 6.86 (d, 2H, J=7.5 Hz), 4.47 (s, 2H), 3.76 (s, 3H).
화합물 44을 71% 수율로 화합물 41과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 2:3, Rf~0.45; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.91 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.82 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.62 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.51 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.20 (t, 2H, J=8.4 Hz), 7.09-7.05 (m, 3H), 4.60 (s, 2H).
화합물 45을 44% 수율로 화합물 41과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: CH3OH/CH2Cl2 5:95, Rf~0.2; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 8.53 (br s, 1H), 8.42 (br s, 1H), 7.91-7.79 (m, 6H), 7.40-7.36 (m, 1H), 7.22-7.16 (m, 2H), 7.09-7.01 (m, 4H), 4.57 (s, 2H).
화합물 46을 67% 수율로 화합물 41과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 50%, Rf~0.4; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.85-7.78 (m, 4H), 7.22-7.17 (m, 2H), 7.09-7.03 (m, 3H), 4.85-3.78 (m, 1H), 1.94-1.90 (m, 2H), 1.81-1.78 (m, 2H), 1.70-1.65 (m, 1H), 1.42-1.17(m, 5H).
화합물 48을 53% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 4:6, Rf~0.4; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.98 (br s, 1H), 7.59-7.55 (m, 1H), 7.33-7.27 (m, 5H), 7.23-7.17 (m, 2H), 7.11-7.01(m, 3H), 6.88-6.85 (m, 2H), 3.75 (s, 3H).
화합물 49을 49% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 4:6, Rf~0.41 (2 elutions); 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.97 (br s, 1H), 7.64-7.56 (m, 5H), 7.38 (d, 2H, J=6.0 Hz), 7.23-7.18 (m, 3H), 7.11-7.02 (m, 3H).
화합물 51을 28% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 4:6, Rf~0.46; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.93 (dd, 1H, J=8.7, 1.2 Hz), 7.08 (dd, 1H, J=8.1, 1.5 Hz), 7.62-7.48 (m, 5H), 7.16-7.08 (m, 5H), 6.96-6.90 (m, 1H).
화합물 52을 65% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 시럽, TLC: EtOAc/헥산 7:3, Rf~0.36; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.78-7.52 (m, 2H), 7.64-7.61 (m, 2H), 7.45-7.41 (m, 2H), 7.32-7.26 (m, 2H), 7.31-6.98 (m, 1H), 3.56-3.51 (m, 2H), 2.95-2.91 (m, 2H).
화합물 52을 62% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 시럽, TLC: EtOAc/헥산 4:1, Rf~0.2; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.80 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.55 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.23-7.17 (m, 2H), 7.09-7.03 (m, 3H), 3.81 (t, 2H, J=5.4 Hz), 3.67 (t, 2H, J=5.4 Hz), 3.56 (t, 2H, J=5.4 Hz), 3.36 (d, 2H, J=5.4 Hz).
0℃ 피리딘 내 화합물 54 (3.0 g, 21.6 mmol)에 55 (3.32 mL, 26.0 mmol)를 첨가하였다. 4시간 넘게 주변 온도로 가온한 후, 용매를 진공으로 제거하였고, 그 잔여물을 EtOAc 및 1N HCl로 추출하였다. EtOAc 층을 연속적으로 물, NaHCO3, 및 물로 세척하였다. NaSO4로 건조한 후, 용매를 진공으로 제거하였다. 미정제 생성물을 실리카 젤 크로마토그래피에 의해 정제하여 71%의 56를 제공하였다: 고체; TLC: EtOAc/헥산 3:7, Rf~0.3; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 8.35-8.31 (m, 1H), 7.93 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.87 (t, 1H, J=2.1 Hz), 7.76-7.70 (m, 1H), 7.62-7.54 (m, 3H), 7.39-7.36 (m, 1H).
화합물 56 (2.0 g, 7.1 mmol)과 아연 파우더(4.7 g, 72 mmol)를 교반하였고, 추출 작업 및 제조용 크로마토그래피(preparative chromatography)하여 76%의 57를 제공하였다: 고체; TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.4; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.83-7.80 (m, 2H), 7.61-7.47 (m, 3H), 7.39-7.33 (m, 2H), 7.20-7.03 (m, 2H).
화합물 58을 52% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.5; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.99 (br s, 1H), 8.19 (br s, 1H), 8.10 (br s, 1H), 7.85 (d, 2H, J=6.9 Hz), 7.59-7.49 (m, 5H), 7.29-7.21 (m, 3H), 7.12 (t, 1H, J=8.1 Hz), 6.98 (t, 1H, J=7.4 Hz), 6.86-6.82 (m, 2H).
화합물 59을 44% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.42; 1H NMR(CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.97 (br s, 1H), 8.07 (br s, 1H), 7.86-7.83 (m, 3H), 7.62-7.49(m, 3H), 7.44-7.38 (m, 2H), 7.23-7.20 (m, 2H), 7.10 (t, 1H, J=8.1 Hz), 6.88-6.81 (m, 2H).
화합물 60을 46% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 3:7, Rf~0.4; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 9.03 (br s, 1H), 8.46 (br s, 1H), 8.29 (br s, 1H), 7.85 (d, 2H, J=6.9 Hz), 7.67 (d, 2H, J=13.8 Hz), 7.61-7.50 (m, 4H), 7.26-7.21 (m, 2H), 7.14 (t, 1H, J=7.8 Hz), 6.88-6.85 (m, 2H).
화합물 62을 74% 수율로 화합물 56과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 3:7, Rf~0.4; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) 8 8.12 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.91 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.64-7.59 (m, 1H), 7.54-7.49 (m, 2H), 7.26-7.21 (m, 2H).
화합물 63을 71% 수율로 화합물 57과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 7:3, Rf~0.4; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.53 (br s, 1H), 7.70-7.67 (m, 2H), 7.61-7.46 (m, 3H), 6.82 (d, 2H, J=8.4 Hz), 6.52 (d, 2H, J=8.4 Hz), 4.06 (br s, 2H).
화합물 64을 39% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.55; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.78 (br s, 1H), 8.12(br s, 2H), 7.77-7.42 (m, 2H), 7.60-7.49 (m, 5H), 7.42 (d, 2H, J=9.0 Hz), 7.26 (t, 2H, J=7.2 Hz), 7.09 (d, 2H, J=8.7 Hz), 6.99 (t, 1H, J=7.2 Hz).
화합물 65을 32% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.3; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.94 (s, 1H), 7.59-7.55 (m, 1H), 7.35-7.27 (m, 4H), 7.23-7.17 (m, 3H), 7.11-7.01 (m, 2H), 6.88-6.85 (m, 2H), 3.79 (s, 3H).
화합물 66을 45% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 3:7, Rf~0.4; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.97 (s, 1H), 7.64-7.55 (m, 5H), 7.39-7.37 (m, 2H), 7.23-7.18 (m, 2H), 7.11-7.01 (m, 3H).
화합물 68을 64% 수율로 화합물 56과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 3:7, Rf~0.4 (3 elutions); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 8.05-8.03 (m, 1H), 7.98-7.95 (m, 2H), 7.73-7.67 (m, 1H), 7.64-7.53 (m, 4H), 7.16-7.13 (m, 1H).
화합물 69을 57% 수율로 화합물 57과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 3:7, Rf~0.4 (3 elutions); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 8.05-8.03 (m, 1H), 7.98-7.95 (m, 2H), 7.73-7.67 (m, 1H), 7.64-7.53 (m, 4H), 7.16-7.13 (m, 1H).
화합물 70을 44% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.35; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.78 (br s, 1H), 8.70 (br s, 1H), 8.05 (br s, 1H), 7.92 (dd, 1H, J=8.4, 1.2 Hz), 7.71-7.57 (m, 3H), 7.56-7.50 (m, 4H), 7.30 (t, 2H, J=7.2 Hz), 7.21 (dt, 1H, J=8.7, 1.5 Hz),7.01 (dt, 1H, J=8.7, 1.5 Hz), 6.88 (dt, 1H, J=8.7, 1.5 Hz), 6.77 (dd, 1H, J=7.8, 1.2 Hz).
화합물 71을 33% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.2; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.79 (br s, 1H), 8.54 (br s, 1H), 7.96 (br s, 1H), 7.83 (dd, 1H, J=8.1, 1.5 Hz), 7.76-7.62 (m, 3H), 7.55-7.43 (m, 4H), 7.19 (dt, 1H, J=7.2, 1.8 Hz),6.92-6.87 (m,3H), 6.81 (dd, 1H, J=7.8, 1.5 Hz), 3.77 (s, 3H).
화합물 72을 39% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.43; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 9.25 (br s, 1H), 8.58 (br s, 1H), 8.17 (br s, 1H), 8.03 (dd, 1H, J=8.4, 1.2 Hz), 7.78 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.72-7.62 (m, 5H), 7.57 (apparent t, 2H, J=7.5 Hz), 7.24 (dt,1H, J=8.4, 1.5 Hz), 6.88 (dt, 1H, J=7.5, 1.2 Hz), 6.82 (dd, 1H, J=8.1, 1.5 Hz).
DMSO 내 화합물 73 (500 mg, 3.0 mmol)에 PhSO2Na (509 mg, 3.1 mmol)를 첨가하였고 그 혼합물을 주변 온도에서 교반하였다. 50 시간 후, 그 혼합물을 물에 부었고 EtOAc (3×50 mL)로 추출하였다. EtOAc 추출물을 결합하였고, 중탄산염, 물 및 염수로 세척하였고, 그 다음에 Na2SO4로 건조시켰다. 그 화합물을 크로마토그래피 (0.61 g, 78%)로 정제하였다. 스펙트럼 측정은 이의 구조와 일치하였다.
EtOH-물 (9:1) 및 철 파우더(424 mg, 7.6 mmol) 내 74 (200 mg, 0.76 mmol)에, 8 mmol HCl (30%)를 첨가하였고, 밤새 주변 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 스트립핑하였고, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였고, 61% 수율의 75를 제공하였다: 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.89 (d, 2H, J=7.5 Hz), 7.71 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.51-7.46 (m, 3H), 6.66 (d, 2H, J=8.7 Hz).
화합물 76을 36% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 30%, Rf~0.5; 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) δ 7.43-7.39 (m, 4H), 7.31-7.25 (m, 8H), 7.03-6.99 (m, 2H).
화합물 78을 36% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.46 (2 elutions); 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.58 (br s, 1H), 8.28 (br s, 1H), 7.88 (d, 2H, J=9.0 Hz), 7.78(d, 2H, J=9.0 Hz), 7.56 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.30 (t, 2H, J=2.0 Hz), 7.18-7.16 (m, 4H), 7.03-6.96 (m, 1H), 6.74 (d, 2H,NH, J=1.5 Hz), 4.82 (q, 1H, J=10.2 Hz), 2.88-2.62 (m, 2H), 2.29-2.18 (m, 1H), 1.78-1.68 (m, 1H).
화합물 79을 46% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: CH3OH/CH2Cl2 5:95, Rf~0.27; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.64 (br s, 1H), 8.31 (br s, 1H), 7.82-7.78 (m, 2H), 7.70-7.66 (m, 2H), 7.57-7.54 (m, 1H), 7.05-6.97 (m, 4H), 3.54 (br s, 2H), 3.38 (br s, 1H), 2.95-2.28 (br m, 4H), 2.56-2.46 (br m, 6H).
화합물 80을 41% 수율로 화합물 31과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, TLC: EtOAc/헥산 1:1, Rf~0.4; 1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz) δ 8.58 (br s, 1H), 8.24 (br s, 1H), 7.78 (m, 5H), 7.56-7.53 (m, 2H), 7.34-7.26 (m, 2H), 7.15-7.11 (brm, 3H), 7.06-6.98 (m, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.36-3.32 (m, 2H), 2.98-2.78 (m, 2H).
화합물 82을 46% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 10.08 (br s, 1H), 9.01 (br s, 1H), 8.78 (br s, 1H), 7.93-7.89 (m, 2H), 7.77-7.74 (m, 2H), 7.60-7.57 (m, 2H), 7.48-7.45 (m, 2H), 7.36-7.26 (m, 4H), 7.07-6.92 (m, 2H).
화합물 83을 35% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 10.01 (br s, 1H), 8.92 (br s, 1H), 8.58 (br s, 1H), 7.89 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.75 (d, 2H, J=7.8 Hz), 7.56 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.37-7.30 (m, 4H), 7.06 (t, 1H, J=7.2 Hz), 6.87 (d, 2H, J=7.8 Hz).
화합물 84을 36% 수율로 화합물 9과 유사한 방식으로 제조하였다; 고체, 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 10.43 (br s, 1H), 9.59 (br s, 1H), 9.50 (br s, 1H), 8.44 (d, 2H, J=8.7 Hz), 8.31 (d, 2H, J=8.7 Hz), 8.20 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.37-7.30 (m, 5H), 7.77 (t, 1H, J=8.1 Hz), 7.51 (t, 1H, J=8.1 Hz).
실시예 3
LED209
는 아드레날린 신호에 최소 영향을 끼친다
키 독성 유전자의 발현을 조장하는 QseC 맴브레인 수용체에 에피네프린 (epi)이 결합한다는 관찰은, 이 상호작용을 표적하는 임의의 약이 또한 호스트에서 작용하는 아드레날린 신호시스템을 방해할 수 있다는 명백한 우려를 제기한다. 포유류 아드레날린 수용체는 G 단백질-커플링된 수용체의 부류로서, 이는 내인성 리간드, 카테콜아민 에피네프린(epi) 및 노르에피네프린(NE)의 표적이고, 이들에 의해 활성된다. 세 가지 분류의 아드레날린 수용체(α1, α2 및 β)가 있다, 이 각각은 3원을 함유하며, 이 각 분류의 아드레날린 수용체는 교대로 이질성3단위체 G 단백질의 독특한 이소폼을 활성화시키며, 이는 후속하여 세포내 제 2 메신저를 규정하는 키 신호 단백질의 활성을 변조시킨다.
Ross et al., 2007에 기재된 분석에서 시험된 바와 같이, 1 μM 농도로 시험될 때, 화합물 130969 (*) 및 LED208 (*)(그러나 LED209는 아님)은 바살(basal)(도 6A에 도시됨) 및 Iso (β2 아드레날린)-자극된 (도 6B) cAMP 수준을 줄인다. 이 분석에서 사용된 화합물의 구조는 아래와 같다:
실시예 4
QseC 자가인산화 연구
실험
QseC 자가인산화 . QseC 자가인산화 실험을 Clarke et al. (2006)에 기재된 대로 수행하였다. 간단히 말해, 종전 (Clarke and Sperandio, 2005)에 기재된 바와 같이, pVS155 (qseC::MycHis)를 함유하는 대장균 종을 37℃에서 LB에서 0.7의 O.D.600로 성장시켰다, 이 지점에서 아라비노제를 최종 부피 0.2%로 첨가하였고, 3시간 동안 유도되도록 하였다(Clarke and Sperandio, 2005). 제조자의 지시사항(Qiagen)에 따라 니켈 칼럼을 활용하였다. 자가인산화 실험을 리포좀에 엠베드된 QseC로 수행하였다. 리포좀을 Janausch et al (2004)에 의해 기재된 바와 같이 재조작하였다. 간단히 말해, 50mg의 대장균 인지질(클로로포름 내 Avanti Polar Lipids, 20 mg/ml)을 증발시켰고, 그 다음에 80 mg N-옥틸-β-D-글루코피라노시드를 함유하는 5ml 포타슘 포스페이트 버퍼로 용해시켰다. 이 용액을 포타슘 포스페이트 버퍼에 대항하여 밤새 투석하였다. 그 결과의 리포좀 현탁액을 액체 N2에서 동결/해동하였다. 리포좀을 그 다음에 26.1mg 도데실말토시드의 첨가에 의해 불안정화시켰고, 2.5mg의 QseC-MycHis를 첨가하였고, 후속하여 실온에서 10분 동안 교반하였다. 바이오베드(261 mg)를 그 다음에 첨가하여 세정제를 제거하였고, 그 결과의 용액을 4℃에서 밤새 배양하도록 하였다. 상청액을 그 다음에 아침에 1시간 동안 신선한 바이오베드로 배양시켰다. 재조작된 QseC-MycHis를 함유하는 그 결과의 리포좀을 액체 N2에서 동결시켰고, -80℃에서 사용때 까지 저장하였다. 리포좀 시스템 내 HK의 배향은 이전 그룹에 의해 설정되어 있다(Dioum et al., 2002), 그리고 키나제 사이트에 대한 ATP 및 리포좀의 파괴 없이 C-말단 QseC-MycTag에 대한 안티-Myc 항혈창의 접근성으로부터 결정될 수 있다. 20μl의 리포좀(QseC-MycHis 함유)을 10mM MgCl2 및 1mM DTT으로 조절하였고, 신호 없거나 50μM의 에피네프린, 또는 50μM의 에피네프린 및 5pM LED209(화합물 5)을 액체 N2에서 급히 냉동시켰고 해동시켰고, 1시간 동안 실온에서 유지하였다. 0.625μl의 [γ32P] dATP(110 TBq/mmol)을 각 반응에 첨가하였다. 10분 지점에, 20μl의 SDS 로딩 버퍼를 첨가하였다. 표준 과정에 따라 끓음 없이 샘플을 SDS-PAGE 상에서 수행하였고(Sambrook et al, 1989), 포스포리마저(phosphorimager)를 통해 가시화하였다. 밴드를 ImageQuant 버전 5.0 소프트웨어(Amersham)를 사용하여 정량화 하였다.
삼중수소화된 노르에피네프린의 QseC 에 대한 결합. 삼중수소화된 NE의 QseC에 대한 결합을 Clarke et al. (5)에 기재된 바와 같이 개조로 수행하였다. QseC 로딩된 리포좀을 상기 기재된 바와 같이 제조하였고, 신호를 상기 기재된 바와 같이 액체 N2 에서 냉동 해동에 의해 로딩하였다. 그러나, 리포좀을 단지 10분 동안 실온에서 배양하여 지질의 단지 부분적 재조합을 가능케 하여서, 비결합된 시그널은 리포좀으로부터 확산될 수 있었다. 이 리포좀을 그 다음에 5분 동안 12,000 g에서 원심분리하였고(지질을 펠렛화), 이 상청액을 버렸다. 이 리포좀 내 QseC에 결합된 시그널을 신틸레이션 카운터를 사용하고, 트리튬을 위한 리딩으로 측정하였다. 비결합된 트리튬에 대항하는 표준화를 위해, 리딩을 5 μM 티로신으로 로딩된 리포좀에 대항하여 표준화하였다(이는 노르에피네프린에 대한 유사한 분자량을 가지고 QseC에 대한 시그널이 아니다). 대조군으로서, 노르에피네프린의 결합을, QseC에 대한 결합을 억제하는 것을 이전에 보여준 50μM 펜톨아민 및 QseC (5)에 대한 노르에피네프린의 결합을 억제하지 않는 50μM 프로프라놀롤의 존재에서 수행하였다. 5μM 노르에피네프린에 대한 결합을 또한 5pM 및 5fM의 LED209의 존재에서 수행하였다.
결과
리포좀 내 정제된 QseC가 삼중수소화된 노르에피네프린에 결합되어 있고, 펜톨아민(알파-아드레날린 길항제)이 QseC 자가인산화를 차단하도록 이 결합을 반대함은, (Clarke et al., 2006)에 보고되었고, 본 발명자들은 확인했다. 대조적으로, 프로프라놀롤(베타-아드레날린 길항제)은 QseC(도 7A)에 어떠한 효과를 가지지 않는다. 본 발명자들에 의해 도시된 바와 같이, 노르에피네프린 결합은 5 pM의 LED209 (화합물 5)에 의해 직접 반대될 수 있지만, 5 f메서는 아니다. 50 μM 에피네프린에 대한 QseC의 자가인산화는 또한 5 pM of LED209의 존재에서 억제된다(도 7B).
실시예 5
정량 실시간 (
RT
)-
PCR
정량 실시간(RT)-PCR을 다양한 하기 실시예에서 사용하였고, 일반적 프로토콜은 아래와 같다.
중간 대수 성장 단계(OD600 0.5) 또는 후기 대수 성장 단계(OD600 1.0)에 대한 37℃에서 F. tularensis를 위한 Mueller Hinton 및 EHEC (WT 및 qseC mutant (Sperandio et al., 2002))를 위한 Salmonella typhimurium, DMEM를 위한 LB에서 밤새 에어로빅으로 배양 성장하였다. 에피네프린 연구를 위해, 물 내 50 mM의 스톡 에피네프린 용액을 만들었고, 최종 농도 50 μM를 위한 DME메서 1:100로 희석된 배양물에서 10-3로 밤새 희석하였다. 각 종의 세 개의 생물학적 복제 배양물로부터의 RNA를 사용자 가이드라인을 따라 RiboPureTM-Bacteria RNA 분리 키트(Ambion)를 사용하여 추출하였다. Real-Time 분석에서 사용된 프라이머를 Primer Express v1.5(Applied Biosystems)를 사용하여 디자인하였다(표 2). Real-Time RT-PCR를 ABI 7500 서열 탐지 시스템(Applied Biosystems)를 사용하는 일 단계 반응에서 수행하였다.
각 20 μl 반응을 위해, 10μl 2× SYBR 마스터 믹스, 0.1 μl Multi-스크라이브 리버스 전사효소(Applied Biosystems) 및 0.1 μl RNase 억제자(Applied Biosystems)를 첨가하였다. 각 프라이머 쌍의 확장 효능을 알려진 RNA 농도의 표준 곡선을 사용하여 증명하였다. 용융 곡선 분석을 사용하여, 형광을 모니터하면서, 15초 동안 95℃로 생성물을 가열하고 60℃로 냉각하고, 95℃로 가열함 의해 템플레이트 특이성을 보장하였다. 확장 효능 및 템플레이트 특이성을 각 프라이머 쌍에 대해 측정하자마자, 상대적 양화 분석을 사용하여, cDNA 생성 및 확장을 위한 하기 조건을 사용하여 알려지지 않은 샘플을 분석하였다: 30분 동안 48℃에서 1사이클, 10분 동안 95℃에서 1사이이클, 15초 동안 95℃에서 그리고 1분 동안 60℃에서 40사이클. 각 종으로부터의 rpoA(RNA 중합효소 서브유닛 A) 유전자를 내인성 대조군으로서 사용하였다.
ABI Sequence Detection 1.3 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 데이터 수집을 수행하였다. rpoA의 수준으로 데이터를 표준화하였고, 이전에 기재된(Anonymous, 1997) 비교 임계적 역치(CT) 방법을 사용하여 분석하였다. 상대적 양화(quantification) 방법을 사용하여(Anonymous, 1997), 상이한 성장 단계에서 표적 유전자의 발현 수준을 비교하였다. 초기-기하 성장 단계에서 WT 수준에 비해 배수 변화로서 Real-time 데이터를 제시하였다. 에러 바는 ΔΔCT 값(Anonymous, 1997)의 표준 편차를 보여준다. Students t 시험에 의해 통계적 중요성을 결정하였다. A P 값 <0.05은 중요한 것으로 여겼다.
실시예 6
독성 발현 연구
실험
양화 실시간 (RT)-PCR 프로토콜. 참조 실시예 5.
분비된 단백질의 제조. 50μM 에피네프린, 50μM 에피네프린 플러스 5nM LED209(화합물 5), 및 50μM 에피네프린 플러스 5μM LED209로 EHEC 종 8624로부터의 분비된 단백질을 Jarvis et al. (1995)에 이전에 기재된 바와 같이 수확하였다. 간단히 말해, 박테리아를 37℃에서 DME메서 에어로빅 조건에서 성장시켰고, 후기-지수(OD600 1.0) 성장으로 수집하였다. 원심분리 및 여과를 사용하여 박테리아를 제거함에 의해 그리고 다음에 트리클로로아세트산으로 상청액에 존재하는 분비된 단백질을 침전시킴에 의해 배양 상청액으로부터의 총 분비된 단백질을 분리하였다. 샘플을 그 다음에 EspA 및 EspB에 대한 래빗 다클론성 항혈청으로 면역블로팅검사(immunoblotting) 하였고, ECL으로 가시화하였다.
플루오레세인 액틴 염색(FAS) 시험. Knutton et al. (1989)에 의해 종전에 기재된 바와 같이 FAS 분석을 수행하였다. 간단히 말해, 밤새 박테리아 배양물을 37℃에서 LB에서 에어로빅 조건에서 성장시켰고, 1:100로 희석하였고, 5% CO2 및 37℃에서 유리 커버 덮개에서 성장된 HeLa 세포의 컨플루언트 모노레이어를 감염시키기 위해 사용하였다. 5% CO2 및 37℃에서 6시간 동안 세포를 성장시켰다. 커버 덮개를 그 다음에 세척하였고, 0.2% Triton X-100로 삼투여과하였고, FITC-팔로이딘로 처리하여 액틴 축척을 가시화하였고, 프로피디움 이오다이드를 첨가하여 박테리아를 염색하였다. 샘플을 Zeiss Axiovert 현미경을 사용하여 면역형광검사에 의해 가시화하였다. 각 종으로부터 6개 이상의 커버 덮개의 전체 필드를 시험하였고, 이미지를 AE 병변으로 취했다.
결과
장출혈성 대장균(EHEC) 감염을 위해 항균제의 신규한 타입이 필요한데, 왜냐하면 통상적 항생제에 기초한 치료는 더 악화된 임상적 결과(Tarr et al., 2002)에 관련되어 있기 때문이며, 아마도 항생제는 EHEC 독성(Zhang et al, 2000)를 올리는 SOS 반응을 유도하기 때문이다. Shiga-독성은 이 감염의 사망률(mortality) 및 질병률(morbidity)에 책임이 있다. EHEC 독성 유전자의 전사는 AI-3 및 에피네프린에 의해 유도된다. AI-3 및 에피네프린 어느 것도 qseC 변종에 독성을 증진하는 효과를 가지지 않는다(도 8A).
에피네프린 (도 8B) 및 AI-3 (도 8C)에 대한, QseC-의존적 독성 유전자 발현을 5 pM LED209 (화합물 5)의 존재에서 억제하였다. 독성 유전자 발현의 LED209-매개된 억제는 또한 EspA 및 EspB의 분비를 억제하였다, 두 단백질은 호스트 세포로 박테리아 단백질을 이동시키기 위한 EHEC에 요구되는 그리고 AE(attaching-effacing) 병변을 일으키는(도 8D), LEE(locus of enterocyte effacement) 내에 엔코팅된 것이다. 놀랍게도, 5 p메서 LED209는 배양된 상피 세포에서의 EHEC AE 병변 형성을 파괴하였다(도 8E). 통상적 항생제와 달리, LED209는 EHEC 성장을 죽이거나 방해하지 않거나(도 8F), EHEC SOS 반응을 조장하지 않는다. 결과적으로 Shiga-독성 발현을 조장하지 않는다; 실제로 이 독성을 엔코팅하는 stxAB 유전자의 발현을 줄인다(도 8C).
실시예 7
인비보
래빗
연구
실험
접종물을 제조하기 위해, 박테리아를, 적당한 항생제와 함께, 37℃에서 LB 브로스(broth)에서 밤새 성장시켰고, 원심 분리에 의해 수확하였고 살균 PBS(pH 7.2)에서 재현탁시켰고, ~109 cfu ml-1의 세포 밀도로 조절하였다. 이전에 기재된 바와 같이(Ritchie et al, 2003), 새끼 래빗 실험을 수행하였다. 간단히, 사이즈 5 French 카테터를 사용하여 ~5×108 cfu의 8624 또는 이의 일 유도체로 3일된 New Zealand White 래빗을 위내 접종하였다. 병 또는 설사의 조짐을 위해 래빗을 매일 두 번 모니터하였다. 설사는 i) 정상적 펠렛이 없고, 어두운 그린, 단단하게 형성되거나 ii) 순한-설사는 소프트 노란-그린 형성되고 뒷다리의 밝은 얼룩으로 보이는 형성된 펠렛, 또는 iii) 심한 설사는 형성되지 않거나 액체 페세(fece)로 구성되며, 뒷 다리의 심한 얼룩을 보인는 것으로 기재되었다. 래빗을 감염 후 7일에 안락사시켰다. 검시에서, 십이지장으로부터 항문까지의 장 관(intestinal tract)을 제거하였고, 샘플을 조직학 및 미생물학 검사를 위해 수득하였다. 임의의 리터-특이적(litter-specific) 효과를 제한하기 위해, 2 이상의 상이한 리터를 사용하여 각 박테리아 종을 시험하였다.
결과
EHEC 전 후 또는 따라 새끼 래빗에 LED209(화합물 5)의 투여는 단지 장의 EHEC 군체형성(colonization)의 많지 않은(modest)(및 통계적으로 크기 않은) 감소를 가져왔다(도 9). 이 동물 모델에서 EHEC 군체형성을 줄이는 LED209의 실패는 위장(GI) 관으로부터의 빠른 흡수에 기여할 수 있다(도. 10A-10C). 흡수가능하지 않은 제형은 EHEC와 같은 비 침습성 인간 병원(pathogen)을 위해 요구될 수 있다.
실시예 8
시험관내
및 생체내의
Salmonella
typhimurium
실험
실험
(Datsenko and Wanner, 2000)에 종전에 기재된 바와 같이, S. typhimurium의 qseC의 돌연변이. 동종 S. typhimurium SL1344 qseC 돌연변이의 구조를 수행하였다. 간단히 말해, pKD46를 함유하는 SL11344 세포를 전기천공법(electroporation)을 위해 제조하였다. 표 2에 묘사된 프라이머 및 템플레이트로서 pKD3를 사용하여 qseC PCR 생성물을 만들었고, 젤을 정제하였다. 이 세포들로 PCR 생성물의 전기천공법을 수행하였고, 셀을 37℃에서 2시간 동안 배양하였으며, 37℃에서 밤새 30 μg ml-1 클로람페니콜를 함유하는 매질에 플레이팅 하였다. 그 결과의 군체를 클로람페니콜 저항 및 암피실린 민감도를 위해 패치하였고, PCR을 유전자 부재를 위해 검증하였다. 클로람페니콜 카세트를 그 다음에 돌이변이로부터 분해(resolve)하여 무극성, 동종 qseC 돌이변이를 만들었다. 레솔바제를 엔코딩하는, 플라스미드 pCP20를 돌연변이 종으로 전기천공하였고, 그 결과의 군체를 클로람페니콜 민감도를 위해 패치하였다.
S. typhimurium으로의 마우스 생존 실험. 마우스(129×1/SvJ 7 내지 9 주된, 암컷)를 LED209(화합물 5)(5% DMSO 내 20 mg/kg, 23% PEG400, 70% 소듐 중탄산염 pH9, 2% Tween 80)으로 구강으로 투여하거나, 108 cfu의 S. typhimurium 종 SL1344으로 복막내 감염시키거나, 또는 LED209(감염 전 및 후 3 시간)으로 구강 투여하고 108 cfu의 S. typhimurium 종 SL1344으로 감염시켰다. 치료 당 10개의 마우스를 사용하였고, 이 실험을 두 번 반복하여 반복성을 확인하였다. 마우스를 이들의 우리로 되돌렸고 병의 조짐(거식증, 빠른 얕은 호흡, 단정치 못한 모피, 감소된 근육 긴장도, 및 무기력) 및 사망 여부를 매일 모니터하였다. 감염 후 12일에, 생존한 동물을 CO2 질식에 의해 안락사시켰다. 간 및 비장을 수확하였고, 균질화하였고 박테리아 세포 샘(cfus)을 위해 LB 아가 플레이트에 플레이팅하였다.
결과
Salmonella typhimurium는 독성 유전자 발현(Merighi et al, 2006)을 또한 조절하는 EHEC QseC(87% 유사도) 센서 키나제의 동족체를 엔코딩한다(도 11A). EHEC 및 S. typhimurium QseC는 기능적으로 상호교환가능하고(Merighi et al., 2006) S. typhimurium qseC 돌연변이는 돼지 GI 관의 군집화에 대해 결함이 있는 것으로 여겨지고, 마우스의 전신 질환에 대해 감쇄된다(도 11B). LED209(화합물 5)(20 mg/kg)을 S. typhimurium의 치사량의 복막내 주입 3시간 전 및 후에 마우스에 구강으로 제공하였다. 감염 24시간 후, 단지 30%의 치료되지 않음 마우스는 살아 남았지만, 80%의 LED209 처리된 마우스는 여전히 살아있었다(도 11B). 모든 S. typhimurium-감염된 마우스는 감염 72시간 내에 죽었고, 20%의 LED209 치료된 마우스는 12일까지 살아있었다(도 11B; 도 12). 비록 LED209가 시험관 내 S. typhimurium 성장에 영향이 미치지 않지만(도 8F), 치료된 동물의 비장 및 간으로부터의 ~10배 더 적은 S. typhimurium cfus가 있었다(도 13A). LED209의 시험관내 배양물에 첨가는 sifA 독성 유전자의 발현을 감소시켰으며(도 13B), 이는 S. typhimuriu메 의한 전신 질환의 발달에 중요하다(Beuzon et al, 2000). 중요하게, sifA의 전사는 QseC-의존적 방식으로 노르에피네프린에 의해 활성화된다(도 11A). 함께, 이 관찰들은 생체내 S. typhimurium 독성 유전자 발현의 LED209 억제가 호스트의 병원의 생존을 손상시키는 것을 제안한다.
실시예 9
시험관내
및
생체내
Francisella
tularensis
실험
실험
β-갈락토시다제 실험. 대장균 fliC::lacZ 융합을 함유하는 플라스미드 pVS175(Weiss et al., 2007)를 WT 대장균 MC4100, 동종 qseC 돌연변이 VS184 (Weiss et al., 2007)에 도입하였고, 이 qseC은 EHEC qseC (strain VS185 (Weiss et al., 2007)), 및 F. tularensis qseC 유전자 (pFTQseC)으로 종을 보완하였다. 배양물을 1:100 희석하였고, 37℃에서 O.D.600 0.8로 0.2% 아라비노제로 보충된 LB 또는 트립톤 매질(1% 트립톤 및 0.25% NaCl)에서 성장시켰다. 이 배양물을 그 다음에 o-니트로페닐-베타-D-글락토피라노시드(ONPG)를 사용하여 β-갈락토시다제 활성도에 대해 분석하였다.
pFTQseC를 pFTQseC_Full42(pET-DEST42(Invitrogen; C-말단 6His tag)으로 복제된 FTT0094c)로부터의 Eco RV/Bgl II 부분(fragment)을 Bam HI/Hinc II 소화된 pACYC184로 복제함에 의해 구조하였다. 플라스미드는 단지 클로람페니콜 저항을 함유한다.
마크로파제 감염. J774 무린(murine) 마크로파제(1×104)를 2시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 106 cfu의 F. tularensis SCHU S4(multiplicity of 감염 1:100)로 감염시켰다. 이들을 세포외 박테리아를 사멸하도록 1시간 동안 40μg/ml의 젠타미신으로 처리하였고 옥토글루코시드로 용리(lyse)하였다. 박테리아를 희석하였고 cfu 샘을 위해 Mueller Hinton 플레이트에 플레이팅하였다.
F. tularensis으로의 마우스 생존 실험. SCHU S4 종으로 수행된 모든 동물 작업을 국가에 의해 허가된(federally-licensed) 작은 동물 봉쇄 수준 3에서 수행하였다. 마우스(C3H HeN, 암컷)를 LED209(화합물 5)(5% DMSO 내 20mg/kg, 23% PEG400, 70% 소듐 중탄산염 pH 9, 2% Tween 80)으로 구강 처리하거나, 30cfu의 F. tularensis 종 SCHU S4으로 복막내 감염시키거나, LED209(단일 용량으로 감염 후 3시간)로 구강 처리 및 30cfu의 F. tularensis 종 SCHU S4으로 감염시켰다. 치료 마다 10개의 마우스를 사용하였고, 이 실험을 두 번 반복하여 반복성을 확인하였다. 마우스를 이들의 우리로 되돌렸고 매일 병의 조짐(거식증, 빠른 얕은 호흡, 단정치 못한 모피, 감소된 근육 긴장도, 및 무기력) 및 사망 여부를 매일 모니터하였다. 감염 9일 후, 생존한 동물을 CO2 질식에 의해 안락사시켰다.
결과
Francisella tularensis는 이의 게놈에 엔코딩된 하나의 히스티딘 센서 키나제, QseC (57% similarity)를 가지고, qseC 돌연변이는 마우스 감염에 대해 감쇄된다(Weiss et al., 2007). F. tularensis 및 EHEC QseC 단백질은 또한 기능적으로 교환가능하고, F. tularensis QseC은 대장균 qseC 돌연 변이 내 QseC-의존적 유전자의 발현을 도울 수 있다(도 14A). LED209(화합물 5)은 10-배, 마크로파지로부터 회수된 F. tularensis 종 SCHU-S4의 수를 줄였다(도 14B). 더구나, LED209는 qseC 그 자체를 포함하는, 시험관 내 여러 F. tularensis 독성 유전자의 발현을 감소시켰다(도 14C).
양적-RT-PCR 분석(참조 실시예 6)은 qseC 발현이 SCHU-S4에 의한 마우스의 감염 중 상향조절됨을 증명하였다(도 14D). LED209는 SCHU-S4 내 감염 후 3시간 단일 용량으로 구강으로 투여되었다. 80%의 LED209 처리된 마우스가 감염 후 9일 생존하였지만, 단지 10%의 처리되지 않은 마우스만이 이 지점까지 생존하였다(도 14E). 따라서, LED209의 단일 구강 용량은 aerosolized F. tularensis에 이미 노출된 마우스를 보호할 수 있다. LED209의 명백한 독성이 없었고, LED209로 처리된 마우스 중 어느 것도 죽지 않았다(도 14E).
별도의 실험에서, 8 마리의 마우스를 Francisella tularensis 타입 A 종 SCHU S4의 30cfu(colony forming units)로 감염시켰다. 그 다음에 마우스를 가염 후 여러 지점에서(1, 3, 6, 9 및 24시간) 20mg/kg의 LED209(화합물 5)로 처리하였다. 감염 후 175 시간 에서, F. tularensis로 감염된 단지 20%의 처리되지 않은 마우스는 생존하였고, 한편 감염 후 6시간에 LED209로 처리된 60%의 마우스는 살았고, 감염 후 LED209로 처리된 75%의 마우스는 생존하였다. 도 15 참조. 이 데이터는 LED209가 생물 위협 작용제 F. tularensis에 의한 감염을 치료할 수 있음을 보여줄 수 있다.
실시예 10
독성 및 생물학적 이용가능성 연구
실험
세포내 cAMP 측정. 살아있는 세포내 cAMP 측정을 Jiang et al. (2007)에 기재된 바와 같이 EPAC-기초한 cAMP BRET 리포터를 사용하여 수행하였다. β2 (내인성) 또는 외인성으로 발현된 β1 또는 β3 아드레날린 수용체를 발현하는 HEK293 세포를 P-안드레날린-특이적 작용제(agonist)(1 nM 도부타민, 100 nM 테르부탈린, 또는 10 nM BRL37344)만으로 또는 5μM LED209 (화합물 5)과 조합하여 처리하였다. 각 세포 라인을 또한 β 아드레날린 수용체 작용제(agonist)의 부재에서 5 μM LED209에 반응하는 이의 능력에 대해 평가하였다. 화합물의 첨가 후, cAMP 측정을 25분의 시간 과정에 걸쳐 100초 간격으로 하였다. Peak 세포내 cAMP 수준은 각 실험 조건에 대해 식별하였고 플롯하였다. 각 값은 3회 측정의 평균값이고, 3개의 실험을 대표한다.
약동학적 분석. 암컷 CD-1 마우스(18-21 g)를 Charles River 실험실로부터 구입하였다. 동물은 사용 약 1주일 전 UT Southwestern Medical Center에서 동물 설비에 순응되도록하였고, 모든 동물 작업은 UT Southwestern에서 Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다. 마우스를 0.2ml의 5% DMSO/23% PEG400/2% Tween 80/70% 0.1 M 소듐 중탄산염 pH 9 내 볼루스로서, 20 mg/kg LED209으로 i.v. 주입하거나 동일 제형으로 구강 급식(0.2 ml)에 의해 화합물을 제공하였다. 지정된 시간 지점에서, 동물에 과량의 CO2의 흡입을 시켰고 혈액을 소듐 시트레이트-코팅된 니들 및 주사기(50μl의 소듐 시트레이트 함유)을 가진 심장 천자(cardiac puncture)에 의해 수확하였다. 플라스마를, 8,0000×g에서 10분 동안 혈액의 원심분리에 의해 분리하였고, -80℃에서 분석때 까지 냉동시켰다. 100 마이크로리터의 플라스마를 20ng의 내부 표준, "K6"(2,4-디히드록시벤즈알데히드 (5-페닐-2-피리미디닐)히드라존)으로 스파이킹하였다. 단백질을 200μl의 아세토니트릴에 의해 침전시켰고, 샘플을 10,000×g에서 스핀하였다. 상청액을 0.1% 포름산을 함유하는 50:50 메탄올:물의 1ml의 최종 부피로 재현탁하였고, 0.45 마이크론 필터를 통해 여과하였다. 샘플을 포지티브 MRM 모드에서 ABI/MDS Sciex 3200-Qtrap LC/MS/MS 상에서 분석하였다. LED209를 위해 모니터된 MRM 전이는 LED209에 대해서 384.0 내지 94.1이었고, K6 내부 표준에 대해서 307.0 내지 171.1였다. 전기분무 이온화를 사용하였다. Shimadzu Prominence LC 시스템을 75×2 mm, 4 마이크론 Phenomenex Synergi Fusion RP 칼럼으로 사용하였다. 유속을 0.5ml/분으로 설정하였다. 45 마이크로리터의 샘플을 주입하였고, 화합물을 물 내 0-100% 메탄올의 단계적 구배로 용리(elute)하였다. 표준 곡선을 블랭크 뮤린 플라스마(blank murine plasma)(Biomeda, Foster City, Calif.)을 사용하여 제조하였고, LED209의 여러 농도로 스파이킹하였다. 블랭크 플라스마에 스파이크된 샘플을 비교할 때 탐지의 하한을 3:1 의 노이즈 비율에 대한 신호로 설정하였다. 표준 곡선을 각 샘플에서 LED209의 농도에 대한 분석물-대-내부 표준 비율 및 데이터에 대한 파워 곡선 피트(power curve fit)를 플롯팅함에 의해 구조하였다. 곡선으로 표시된 농도의 역계산법(Back-calculation)은 1000 내지 10ng/ml로부터 3 로그에 걸쳐 10% 내로 정확하였다. 플라스마에 대한 약동학적 파라미터를 WinNonlin 소프트웨어 패키지(Pharsight, Mountain View, Calif.)에 비구획적 분석 툴을 사용함에 의해 결정하였다.
독물학 연구. 세 마리의 암컷 CD-1 마우스(~22 g)를 0.2 ml의 5% DMSO/23% PEG400/2%Tween 80/70% 0.1 M 소듐 중탄산염, pH 9의 경구 투여에 의해 20 mg/kg LED209로 qdX5 처리하였다. 세 마리의 별도의 암컷 CD-1 마우스(~22 g)를 단지 비히클로만 qdX5 처리하였다. 마우스의 무게를 측량하였고 매일 관찰하였다. 최종 용량 후 3일, 동물의 무게를 측량하였고 희생시켰다. 혈액을 화학 및 완전한 혈액 카운트(Charles River Laboratories, Wilmington, Mass.)를 위해 취하였고 기관(organ)의 무게를 측량하였다.
LED209의 예비적 독물한 평가. LED209(5% DMSO 내, 23% PEG400, 70% 소듐 중탄산염 pH 9, 2% Tween 80)를 3 마리의 암컷 CD-1 마우스에 20 mg/kg 구강 투여에 의해 5일 동안 매일 복용시켰고, 이에 비해 3마리의 마우스에는 비히클(5% DMSO, 23% PEG400, 70% 소듐 중탄산염 pH 9, 2% Tween 80)만을 제공하였다. 마우스 무게(도 16) 및 기관의 무게(도 10C)는, 화학물 처리된 그룹은 비히클 처리된 그룹과 동일한 속도로 무게를 얻는데 실패하였다는 4의 예외 말고는, 처리된 그리고 비처리된 동물 사이의 큰 차이를 보이지 않는다. 십이지장, 결장, 간, 콩팥, 비장, 및 심장로부터의 헤모토실린 및 에오신 착색된 섹션의 수의학 병리학자에 의해 블라인드 리뷰(Blinded review)는 비히클 또는 화합물 처리된 마우스에 관찰가능한 병상을 들어내지 않았다.
결과
LED209(화합물 5)이 독성 유전자 발현의 QseC-매개된 활성화의 에피네프린 및 NE 조장을 차단하기 때문에, 이 화합물이 또한 호스트의 아드레날린 신호 시스템을 방해할 수 있다는 우려가 있었다. 생 세포-기초한 분석(Jiang et al., 2007)을 사용하여, LED209는 인간 β-아드레날린 수용체 이소폼을 통한 신호에 영향을 미치지 않는 것으로 보였다(도 10). 약동학적 연구는 이의 생물학적 이용가능성 또는 생물학적 적합성을 제한할 수 있는 특유의 구조적 특성이 없음을 제안하였고, 마우스에 구강 투여되었을 때 LED209가 약 70% 생물학적 이용가능성이 있음을 보여주었다(도 10). 더구나, 마우스에서의 LED209의 연구는 독성의 임의의 증거를 들어내지 않았다(FIGS. 16-18).
본원에서 공개하고 청구된 모든 방법 및 장치는 본원의 취지 내 과도한 실험 없이 수행되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구체예에 대해 기재되어 있지만, 당업자는 본 발명의 개념, 취지 및 범위에 벗어남 없이 본원에 기재된 방법의 단계의 순서 또는 단계 및 방법 및 장치에 변경이 있을 수 있음을 이해할 것이다. 더욱 특이적으로, 동일 또는 유사한 결과가 달성되면서 화학적 및 생물학적으로 관련된 특정 작용제가 본원에 기재된 작용제를 위해 치환될 수 있음은 명백할 것이다. 당업자에 명백한 모든 상기 유사한 치환체 및 변경은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내인 것으로 여겨진다.
참조
하기 참조는, 이들이 본원에 기재된 것들에 보충적인, 예시적 과정 또는 다른 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참조로서 특이적으로 통합된다.
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Claims (67)
- 하기 식의 화합물(V)의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체 내 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법:
상기 식에서,
Ra 및 Rb는 독립적으로
또는
이며, 여기서, 점선은 단일 또는 이중 결합을 나타내고;
A, B, D, E, F, G, J, K, L, M, P 및 Q는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이며;
R8-R16은 각각 독립적으로 H, 알킬, 알킬아미노, 디알킬아미노, 트리알킬암모늄, 알콕시, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 또는 -NH2이거나, 두 개의 연속적 R기가 함께 1,3-디옥솔란일 기를 형성하며;
m은 1 또는 2이고,
n은 0-3이며;
R1-R5은 독립적으로 각각 H 또는 알킬이고; 또는
R5 및 Rb는 이에 부착되어 있는 질소와 함께 하기 기 중 하나를 형성한다:,
, 또는
여기서 X1은 산소 또는 알킬아미노이다.
- 제 1항에 있어서, R8-R16이 각각 독립적으로 H, 비치환된 알킬, 비치환된 알킬아미노, 비치환된 디알킬아미노, 비치환된 트리알킬암모늄, 또는 비치환된 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, R8-R16이 각각 독립적으로, H, 치환된 알킬, 치환된 알킬아미노, 치환된 디알킬아미노, 또는 치환된 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 3항에 있어서, 치환된 알킬, 치환된 알킬아미노, 치환된 디알킬아미노, 또는 치환된 알콕시의 각 치환체가 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3, -CF3, -NH2, 또는 모르폴린일임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, R8-R16이 각각 독립적으로 저급 알킬, 저급 알킬아미노, 저급 디알킬아미노, 저급 트리알킬암모늄, 또는 저급 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, R5이 저급 알킬 또는 비치환된 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, R1-R4이 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, X1이 치환된 저급 알킬아미노임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 1항에 있어서, 화학식(V)의 화합물이 아래 것들 중 임의의 하나 또는 그 초과로 추가로 정의됨을 특징으로 하는, 방법:
(여기서 r은 3-100)
또는
- 하기 식(VI)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법:
상기 식에서,
R1 및 R2은 각각 독립적으로이며,
여기서 A, B, D, E, F 및 G는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이고;
R8-R12은 각각 독립적으로 H, 알킬, 알콕시; -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -SO2NH-아릴, -C(O)CH3, -OCH3, -OCF3-CF3, 또는 -NH2이며;
n은 0-3이고;
R3-R6은 각각 독립적으로 H이며;
R7은 수소 또는 알킬이고;
X는 -C(O)NR13- 또는 -NR13C(O)-이며, 여기서 R13은 H 또는 알킬이며;
p는 0-3이다. - 제 10항에 있어서, R8-R12이 각각 H, 비치환된 알킬, 또는 비치환된 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 10항에 있어서, R8-R12이 각각 독립적으로 H, 치환된 알킬, 또는 치환된 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 12항에 있어서, 치환된 알킬, 또는 치환된 알콕시의 각 치환체가 독립적으로 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, -NH2, 또는 모르폴린일임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 10항에 있어서, R8-R12이 각각 독립적으로 H, 저급 알킬, 또는 저급 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 10항에 있어서, R7 및 R13이 각각 독립적으로 저급 비치환된 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 10항에 있어서, R3-R6가 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 화학식 (VI)의 화합물이 하기 것 중 임의의 하나 또는 그 초과로 추가로 정의됨을 특징으로 하는, 방법:
또는
.
- 화학식 (VII)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법:
상기 식에서, -NHC(X1)NHRa를 포함하는 부분은 -XRb 치환체에 대해 오르토, 메타, 또는 파라일 수 있고,
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로이며, 여기서
A, B, D, E, F 및 G는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소 이며;
R1-R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 또는 알콕시; -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, 또는 -NH2이며;
X는 -NR7-, -SO2NR7-, -NR7SO2-, 또는 -S(O)2-이고, 여기서 R7는 H 또는 알킬이고;
X1은 O 또는 S이며;
단, 화학식(VII)의 페닐 고리 상의 치환체가 파라이면, X는 -NH-, -S(O)2- 또는 -NHSO2-이다. - 제 18항에 있어서, R1-R5이 각각 독립적으로 H, 비치환된 알킬 또는 비치환된 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 18항에 있어서, R1-R5이 각각 독립적으로 H, 치환된 알킬 또는 치환된 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 20항에 있어서, 치환된 알킬 또는 치환된 알콕시의 각 치환체가 독립적으로 -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, -NH2, 또는 모르폴린일임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 18항에 있어서, R1-R5이 각각 독립적으로 H, 저급 알킬, 또는 저급 알콕시; -CH3, 할로, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, 또는 -NH2임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 18항에 있어서, R7이 H 또는 저급 비치환된 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 18항에 있어서, 화학식 (VII)의 화합물이 하기 것 중 임의의 하나 또는 그 초과로서 추가로 정의됨을 특징으로 하는, 방법:
또는
.
- 화학식 (VIII)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법:
상기 식에서,
Ra 및 Rb가 각각 독립적으로이며, 여기서
A, B, D, E, F 및 G는 각각 독립적으로 탄소 또는 질소이며;
R5-R9 각각은 독립적으로 H, 알킬, 또는 알콕시이고;
R1-R4 각각은 독립적으로 H 또는 알킬이며;
X1은 O 또는 S이다. - 제 25항에 있어서, R5-R9가 각각 독립적으로 H, 비치환된 알킬, 또는 비치환된 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 25항에 있어서, R5-R9가 각각 독립적으로 H, 치환된 알킬, 또는 치환된 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 27항에 있어서, 치환된 알킬 또는 치환된 알콕시의 치환체가 할로, 치환된 알킬, -CH3, 히드록시, 티올, -NO2, -CO2H, -C(O)CH3, -OCH3, -CF3, 및 -NH2로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
- 제 25항에 있어서, R5-R9가 각각 독립적으로 저급 알킬 또는 저급 알콕시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 25항에 있어서, R1-R4가 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 25항에 있어서, 화학식 (VIII)의 화합물이 하기 것 중 하나 또는 그 초과로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법:
또는
.
- 화학식 (IX)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법:
상기 식에서
R1 및 R2은 각각 H이거나, R1 및 R2은 함께 1,3-디옥솔란일 기를 형성하며;
R3는 H, -OH, -SO2NH2, -SO2NH-알킬, 또는 디알킬아미노이고;
X1는 O 또는 S이다. - 제 32항에 있어서, -SO2NH-알킬의 알킬 기가 치환된 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 33항에 있어서, 치환된 알킬의 치환체가 -OH임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 32항에 있어서, R3의 디알킬아미노 기의 각 알킬 기가 독립적으로 비치환된 저급 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 32항에 있어서, 화학식 (IX)의 화합물이 하기 중에 임의의 하나 또는 그 초과로 추가로 정의됨을 특징으로 하는, 방법:
또는
.
- 화학식 (III)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법:
상기 식에서, Q, R, C, D, T 및 U는 각각 독립적으로 H, 알킬, -NH2, -CH2NH2, -CH2NH-(저급 알킬), 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본이며; K는 S 또는 O이다. - 제 37항에 있어서, 알킬이 비치환된 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 37항에 있어서, 알킬이 치환된 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 39항에 있어서, 치환된 알킬의 치환체가 히드록시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 40항에 있어서, 상기 치환된 알킬이 저급 치환된 알킬이며, 여기서 치환체가 히드록시임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 37항에 있어서, Q, R, C, D, T 및 U의 알킬 기가 각각 독립적으로 저급 비치환된 알킬임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 42항에 있어서, 상기 폴리머 꼬리가
,
또는
(여기서, R은 H 또는 저급 알킬이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 저급 알킬, -NH2, -CH2NH2, -CH2NHCH3, -OH, 또는 저급 알콕시이며;
n, m 및 p는 각각 독립적으로 2-200의 정수이다)임을 특징으로 하는, 방법. - 제 42항에 있어서, 링커-폴리머 백본 또는 폴리머 백본이 하기 식을 포함함을 특징으로 하는, 방법:
또는
상기 식에서, a, a', b, c 및 d가 각각 독립적으로 폴리머의 분자량이 약 125kDa 또는 그 이상이 되도록 선택된다. - 제 44항에 있어서, a:b가 약 1:2이고 c:d가 약 9:1임을 특징으로 하는, 방법.
- 화학식 (IV)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법:
상기 식에서,
X1는 산소 또는 황이며;
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 H, 폴리머 꼬리, 폴리머 백본, 또는 링커-폴리머 백본이고;
Z는 H,또는
이고, 여기서 X1 및 X2는 각각 독립적으로 H, 폴리머 꼬리, 또는 폴리머 백본이다.
- 제 46항에 있어서, X1가 S임을 특징으로 하는, 방법.
- 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 피검체가 동물 또는 식물임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 48항에 있어서, 상기 박테리아 감염이 포유류 박테리아 또는 식물 박테리아성 병원체에 의해 기인함을 특징으로 하는, 방법.
- 제 48항에 있어서, 박테리아 감염이 유기체 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae), 버크홀데리아 세파시아 ( Burkholderia cepacia ), 크로모박터 비올라슘(Chromobacter violaceum ), 콕시엘라 부르네티 ( Coxiella burnetti ), 대장균(대장균), 에르위니아 카로토보라 ( Erwinia carotovora ), 프라시셀라 튤라렌시스( Francisella tularensis ), 헤모필루스 인플루엔자( Haemophilus influenzae ), 파스튜렐라 멀토시다 ( Pasteurella multocida ), 녹농균( Pseudomonas aeruginosa ), 슈도모나스 플루오르슨스 ( Pseudomonas fluorescens ), 랄스토니아 솔라나시어룸( Ralstonia solanacearum ), 시겔라 플렉스네리 ( Shigella flexneri ), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi ), 살모넬라 타이피뮤리움 ( Salmonella typhimurium ), 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae ), 비브리오 파라해몰리티쿠스( Vibrio parahaemoliticus), 비브리오 패혈증균 ( Vibrio vulnificus ), 페스트균( Yersinia pestis), 또는 가성결핵균( Yersinia pseudotuberculosis ) 중 하나 이상에 의해 기인됨을 특징으로 하는, 방법.
- 제 50항에 있어서, 대장균(대장균) 유기체가 병원성 대장균(대장균)임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 51항에 있어서, 대장균 유기체가 장출혈성(enterohemorrhagic) 대장균임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 51항에 있어서, 대장균 유기체가 요로병원성 대장균임을 특징으로 하는, 방법.
- 제 48항에 있어서, 상기 박테리아 감염이 유기체 독소원성 대장균, 장병원성 대장균., 장흡착성 대장균, 장침습성 대장균, 확산 부착성 대장균, 대장균 K1, 아시네토박터( Acinetobacter ), 보르데텔라 파라페르투시스( Bordetella parapertussis), 부르콜데리아 피마툼 ( Burkolderia phymatum ), 시트로박 터( Citrobacter ), 엔테로박터( Enterobacter ), 클렙시엘라 슈모니아( Klebsiella pseumonia), 레지오넬라 뉴모필라 ( Legionella pneumophila ), 랄스토니아 유트로파( Ralstonia euthropha ), 에르시니아 엔테로콜리티카 ( Yersinia enterocolitica ), 또는 에르시니아 몰라레티 ( Yersinia mollareti ) 중 하나 이상에 의해 기인됨을 특징으로 하는, 방법.
- 제 54항에 있어서, 아시네토박터 ( Acinetobacter ) 유기체가 아시네노박터 바우만니( Acinetobacter baumannii)임을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 박테리아 감염이 다중 약 내성 박테리아인 박테리아에 의해 기인됨을 특징으로 하는, 방법.
- 제 48항에 있어서, 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물이 약제학적으로 허용가능한 조성물에 포함됨을 특징으로 하는, 방법.
- 제 57항에 있어서, 상기 조성물이 흡수가능함을 특징으로 하는, 방법.
- 제 57항에 있어서, 상기 조성물이 흡수가능하지 않음을 특징으로 하는, 방법.
- 제 57항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 조성물이 장용 코팅을 포함함을 특징으로 하는, 방법.
- 제 48항에 있어서, 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물이, 경구내, 흡입을 통해, 복막내, 정맥내, 근육내, 직장내, 볼내, 경피내, 질내, 또는 눈을 통해 또는 귀 점액을 통해 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 제 61항에 있어서, 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물이 약 0.1 내지 약 50mg/kg 체중의 양으로 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 제 62항에 있어서, 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물이 약 10 내지 약 30mg/kg 체중의 양으로 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 박테리아 감염이 QseC 키나제 또는 QseC 키나제 동족체를 가지는 박테리움에 의해 기인됨을 특징으로 하는, 방법.
- 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 요혈성 요독 증후군을 치료하거나 예방하는 방법.
- 화학식 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX)의 화합물의 유효량을 피검체에 투여하는 것을 포함하는, 피검체의 박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 화합물이 아드레날린 수용체 활성에 최소의 영향을 줌을 특징으로 하는, 방법.
- 하기 화학식의 화합물:
.
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