KR20100094984A - 비항응고성 다당류 조성물 - Google Patents

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KR20100094984A
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모멘타 파머슈티컬스 인코포레이티드
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Abstract

실제적인 항응고 활성이 부족한 다당류 제제가 제공된다. 이러한 제제의 제조 및 사용 방법이 제공된다.

Description

비항응고성 다당류 조성물{Non-anticoagulant polysaccharide compositions}
본 발명은 비항응고성 다당류 조성물과, 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
비만 세포에 의해 생성되고 자연 발생원으로부터 분리되는 고도로 황산화된 헤파린-유사 글리코사미노글리칸(HLGAG)인 헤파린이 임상용 항응고제로 널리 사용되고 있다. 그러나, 자연적, 즉 고분자량(표준) 헤파린(unfractionated heparin)의 효과는 예측하기 어려울 수 있으며, 과다하거나 부족한 항응고 활성을 방지하기 위해 환자들을 밀착감시해야 한다. 중합체 헤파린을 분할하거나 해중합시키는 등의 다양한 방법에 의해 얻어지는 저분자량 헤파린(LMWHs)은, 항응고제로서 보다 예측가능한 약리활성과, 적은 부작용, 지속적인 항혈전활성, 및 고분자량 헤파린(UFH)보다 나은 생체이용률을 가지고 있다. 몇몇 LMWHs는 혈전 상태의 외래환자 치료용으로 승인되었다.
암환자 관리에 있어서 항혈전제가 갖는 잠재적인 역할에 대한 관심이 증가하고 있다. 최근의 몇몇 임상시험 결과는, LWMHs로 치료된 특정 유형의 암환자를 위한 연명효과를 제시하였다(Lemoine에서 평가, 2005, Journal of Clinical Oncology, 23: 2119-20).
본 발명은, 부분적으로, 다당류 제제, 예컨대 헤파린에서 유도되고, 실제적인 항응고 활성은 부족(예컨대, 실제적인 항응고 활성의 부재)하지만 기타 비응고, 매개성 생물학적 과정에서 활성을 유지하는 다당류 제제의 개발과, 이의 제조 방법에 기초를 둔다. 이들 화합물은, 1) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성(트롬빈 생성의 억제)과 anti-IIa 활성(트롬빈 활성의 억제); 및 2) 항전이 활성, 항혈관생성 활성, 항섬유화 활성 및/또는 항염증 활성 중 하나 이상의 특징을 가질 수 있다. 본원에 개시되는 다당류는 또한 기타 다당류(예컨대, 상업적으로 입수가능한 헤파린)와 구별되는 구조적 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 다당류 제제는, 50% 미만의 글리콜 분할된 우론산 잔기; 탈황산화(desulfation) 정도가 40% 미만; 다당류 사슬 당 3개 이하의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG); 40% 초과의 U2SHNS ,6S 이당류 잔기; 제제 중 하나 이상의 다당류 사슬의 비환원말단 우론산 잔기가 4,5-불포화기(unsaturation)를 가짐; 제제 내 하나 이상의 다당류 사슬이 환원말단에 2,5-안히드로만니톨(anhydromannitol) 잔기를 가짐; 3,500 내지 7,000 Da의 중량평균분자량 중에서 하나 이상의 특징을 가질 수 있다. 본 개시에는, 전술한 성질과 특징들 중 하나 이상을 갖는 제제 뿐만 아니라 이러한 제제의 제조 및 사용 방법이 포함된다. 또한 본 개시는 이러한 제제의 사용 방법을 특징으로 한다.
따라서, 제1양상에서, 본 발명은 (a) 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량과, (b) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과 anti-IIa 활성(예컨대, 약 40 IU/mg, 30 IU/mg, 20 IU/mg, 15 IU/mg 또는 10 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과, 약 40 IU/mg, 30 IU/mg, 20 IU/mg, 10 IU/mg, 5 IU/mg, 4 IU/mg 또는 3 IU/mg 미만의 anti-IIa 활성)과, (c) 제제 내 50% 미만의 글리콜 분할된 우론산 잔기(예컨대, 40%, 30%, 25% 또는 20%의 글리콜 분할된 우론산 잔기)로 특징지어지는 다당류 제제(예컨대, 헤파린에서 유도된 제제)를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 제제는 5% 내지 50%의 글리콜 분할된 우론산 잔기(예컨대, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40% 또는 10% 내지 30%의 글리콜 분할된 우론산 잔기)를 함유한다.
제2양상에서, 본 발명은 (a) 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량과, (b) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과 anti-IIa 활성(예컨대, 약 40 IU/mg, 30 IU/mg, 20 IU/mg, 15 IU/mg 또는 10 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과, 약 40 IU/mg, 30 IU/mg, 20 IU/mg, 10 IU/mg, 5 IU/mg, 4 IU/mg 또는 3 IU/mg 미만의 anti-IIa 활성)과, (c) 제제의 다당류 사슬 당 3개 이하의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG)(예컨대, 각 다당류 사슬이 2개 이하 또는 1개 이하의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG)를 가짐)로 특징지어지는 다당류 제제(예컨대, 헤파린에서 유도된 제제)를 특징으로 한다.
제3양상에서, 본 발명은 (a) 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량과, (b) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과 anti-IIa 활성(예컨대, 약 40 IU/mg, 30 IU/mg, 20 IU/mg, 15 IU/mg 또는 10 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과, 약 40 IU/mg, 30 IU/mg, 20 IU/mg, 10 IU/mg, 5 IU/mg, 4 IU/mg 또는 3 IU/mg 미만의 anti-IIa 활성)과, (c) 제제의 다당류 사슬 당 평균 3개 이하의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG)(예컨대, 다당류 사슬 당 평균 2.5개 이하, 2개 이하, 1.5개 이하 또는 1개 이하의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG))로 특징지어지는 다당류 제제(예컨대, 헤파린에서 유도된 제제)를 특징으로 한다.
제4양상에서, 본 발명은 (a) 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량과, (b) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과 anti-IIa 활성(예컨대, 약 40 IU/mg, 30 IU/mg, 20 IU/mg, 15 IU/mg 또는 10 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과, 약 40 IU/mg, 30 IU/mg, 20 IU/mg, 10 IU/mg, 5 IU/mg, 4 IU/mg 또는 3 IU/mg 미만의 anti-IIa 활성)과, (c) 40% 초과의 U2SHNS ,6S 이당류 잔기(예컨대, 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과의 U2SHNS ,6S 이당류 잔기)로 특징지어지는 다당류 제제(예컨대, 헤파린에서 유도된 제제)를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 제제의 탈황산화 정도는 40% 미만(예컨대, 30%, 20% 또는 10% 미만)이다.
제5양상에서, 본 발명은, 실제적인 항응고 활성이 부족(예컨대, 실제적인 항응고 활성의 부재)한 다당류 제제(예컨대, 헤파린에서 유도된 제제)를 특징으로 하며, 여기서 제제는 하기 화학식 I의 다당류를 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서, U는 우론산 잔기를 가리키고, H는 헥소사민 잔기를 가리키며; m과 n은 정수로서,
m = 4-16 (예컨대, 4-8, 4-9, 4-10, 4-11, 4-12, 4-13, 4-14 또는 4-15)이고,
n = 1-4 (예컨대, 1-2 또는 1-3)이고;
w = -2OS 또는 -2OH 이고;
x = -NS 또는 -NAc 이고;
y = -3OS 또는 -3OH 이고;
z = -6OS 또는 -6OH 이고;
UG =
Figure pct00002
이고;
기호 "∼"는 m과 n으로 표시된 단위들이 다당류 사슬을 따라 분포되되 반드시 순차적인 것은 아님을 가리키며, w, x, y 및 z 각각은 m으로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하고, x, y 및 z 각각은 n으로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하다.
제6양상에서, 본 발명은, 실제적인 항응고 활성은 부족(예컨대, 실제적 항응고 활성의 부재)하되 항전이 활성을 갖는 다당류 제제(예컨대, 헤파린에서 유도된 제제)를 특징으로 하며, 여기서 제제는 하기 화학식 II의 다당류를 포함한다:
[화학식 II]
Figure pct00003
상기 화학식 II에서, U는 우론산 잔기를 가리키고, H는 헥소사민 잔기를 가리키며;
m-r은 정수로서:
m = 0-10; n= 0- 3; o = 0-10; p = 0-3; q = 0-10 이고;
w = -2OS 또는 -2OH 이고;
x = -NS 또는 -NAc 이고;
y = -3OS 또는 -3OH 이고;
z = -6OS 또는 -6OH 이고;
UG =
Figure pct00004
이고;
w, x, y 및 z 각각은 m, n, o, p 또는 q로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하다.
일부 구현예에서, (n+p)가 4 이하(예컨대, 3, 2, 1 또는 0)이다. 일부 구현예에서, 제제의 중량 평균사슬분자량은 3,500 내지 7,000 Da이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된(예컨대, 전술된) 임의 제제의 약학적으로 허용가능한 염과, 본원에 기술된 제제 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 조성물(예컨대, 약학적 조성물)을 포함한다.
본원에 기술된, 예컨대 전술된 임의 제제는 기타 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전술된 제제 또는 전술된 약학적 조성물 중 하나는 하기에 설명되는 기능적 또는 구조적 특성들 중 하나 이상을 추가로 가질 수 있다.
일 구현예에서, 제제 내 하나 이상의 다당류 사슬은 비환원말단에 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00005
상기 식에서, X는 H 또는 Me이고, R은 H 또는 SO3이다.
예를 들어, 제제 또는 약학적 조성물의 비환원말단의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 실제적으로 모두가 이 구조를 가지고 있다.
일 구현예에서, 제제 또는 약학적 조성물 내 하나 이상의 다당류 사슬이 환원말단에 2,5-안히드로만니톨 잔기를 갖는다. 예를 들어, 제제 또는 약학적 조성물 내 다당류 사슬의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 실제적으로 모두가 환원말단에 2,5-안히드로만니톨 잔기를 갖는다.
일 구현예에서, 제제 또는 약학적 조성물은, 제제의 올리고당의 10 내지 50%(예컨대, 10 내지 40%, 10 내지 30%, 15 내지 30% 또는 15 내지 25%)가 3000 Da 미만의 분자량을 갖고; 올리고당의 40 내지 65%(예컨대, 45 내지 65%, 50 내지 65% 또는 55 내지 65%)가 3000 내지 8000 Da의 분자량을 갖고; 올리고당의 5 내지 30%(예컨대, 10 내지 30%, 15 내지 30%, 10 내지 25% 또는 15 내지 25%)가 8000 Da 초과의 분자량을 갖도록 하는 분자량 분포를 갖는다.
일 구현예에서, 제제는 약 1.2 내지 1.7(예컨대, 약 1.3 내지 1.7, 1.2 내지 1.6 또는 1.3 내지 1.6)의 다분산도(polydispersity)를 갖는다.
일 구현예에서, 제제 또는 조성물은 항전이 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 제제 또는 조성물은, VEGF, FGF, SDF-1-α 및 P-셀렉틴 중 1종 이상과 특이적으로 결합하거나, 이의 활성을 저해한다.
일 구현예에서, 제제 또는 조성물의 나트륨 함량이 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이다. 일 구현예에서, 제제 또는 조성물은 20ppm, 15ppm, 10ppm, 또는 5ppm 미만의 요오드와; 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만의 황과; 50ppm, 40ppm, 30ppm, 20ppm 또는 15ppm 미만의 붕소를 함유한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 제제의 제조 방법을 특징으로 한다. 이 방법은: UFH와 아질산(HONO)을 혼합하여 다당류 제제를 생성하는 단계와; 아질산 처리에 이어서, 제제 내 우론산 잔기의 적어도 일부분을 글리콜 분할시키는 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 제제의 제조 방법은: UFH를 해중합(예컨대, 화학적 가수분해 또는 효소적 해중합에 의함)시키는 단계와; 해중합 반응 이후, 제제 내 우론산 잔기의 적어도 일부분을 글리콜 분할시키는 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 제제 내 우론산 잔기의 적어도 일부분을 글리콜 분할시키는 반응은 다당류 제제를 과요오드산염(periodate)으로 산화시키는 단계와; 산화된 다당류 제제를 수소화붕소 나트륨으로 환원시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은: 약 0 내지 10℃의 온도에서 약 10 내지 20 시간 동안 다당류 제제를 과요오드산염으로 산화시키는 단계와; 산화반응에 이어서, 약 0 내지 10℃의 온도와 약 5.0 내지 8.0의 pH에서 약 1시간 동안 시료를 수소화붕소 나트륨으로 환원시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 제제의 제조 방법을 특징으로 한다. 이 방법은: (1) 고분자량 헤파린(UFH)을 해중합(예컨대, 아질산 해중합, 가수분해적 해중합 또는 효소적 해중합에 의함)시켜 다당류 제제를 수득하는 단계와; (2) 다당류 제제를 과요오드산염으로 산화시키는 단계와; (3) 산화된 다당류 제제를 수소화붕소 나트륨으로 환원시키는 단계와; (4) 다당류 제제를 분리(예컨대, 염과 극성 유기용매로 침전시키거나, 크로마토그래피 분리 또는 정제에 의함)하여 제제를 제조하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 해중합 단계는 약 10 내지 30℃의 온도와 약 2 내지 4의 pH에서 약 1 내지 5 시간 동안 UFH를 약 0.01 내지 0.05M(예컨대, 약 0.02 내지 0.04M) 아질산으로 처리하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 산화 단계는 약 0 내지 10℃의 온도에서 약 10 내지 20 시간 동안 다당류 제제를 약 0.05 내지 0.2M 과요오드산염으로 처리하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 환원 단계는, 산화된 다당류 제제를 약 0 내지 10℃의 온도와 약 6.0 내지 7.0의 pH에서 약 0.5 내지 3 시간 동안 약 0.5 내지 2.0%(w/v)의 수소화붕소 나트륨으로 처리하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 다당류 제제의 제조 방법은 제제 내의 붕소 함량을 감소시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서는, 제제의 생물학적 활성, 예컨대 항전이 활성; VEGF, FGF, SDF-1α 및 P-셀렉틴 중 임의의 것과 결합; 또는 VEGF, FGF, SDF-1α 및 P-셀렉틴 중 임의의 것의 활성 억제를 평가한다.
본원에 사용된 바와 같이, 실제적인 항응고 활성이 부족한 다당류 제제는 각각 100 IU/mg 미만(예컨대, 80 IU/mg, 70 IU/mg 또는 60 IU/mg)의 anti-Xa 활성과 anti-IIa 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 다당류 제제는 실제적인 항응고 활성이 없으며, 다시 말해, 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과 anti-IIa 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 다당류 제제는 각각 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과 anti-IIa 활성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 탈황 정도는 고분자량 헤파린에 비해 이당류 단위 1몰 당 황산염 몰수의 감소된 비율로 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 탈황 정도는 이당류 단위 1몰 당 황산염의 평균 몰수로 정의된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 제조되는 다당류 제제를 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 다당류 제제를 제조하거나 분석하는 방법들 중 임의의 것으로부터의 중간생성물 또는 반응혼합물을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 다당류 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 환자를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 이는 본원에 개시된 다당류 제제를 치료에 효과적인 양으로 환자에 투여하는 단계를 포함한다. "치료하는", "치료" 및 이와 유사한 용어는 본 제제를 환자 또는 환자의 세포나 조직(tissue)에 투여하여 원하는 약리적, 생리적 또는 임상적 효과를 얻도록 하는 것을 의미한다. 본원에 기술된 다당류 제제를 이용한 치료는 기존의 원하지 않는 상태 또는 이러한 상태의 발현이나 증상을 적게하거나, 감소시키거나, 완화시키거나, 개선하거나, 지연시키거나, 또는 예방할 수 있다. "치료에 효과적인 양(therapeutically effective amount)"은 원하는 약리학적, 생리적 또는 임상적 효과를 환자에서 달성하기 위해 효과적인 양, 요구되는 투여용량 및 시간을 가리킨다.
본 발명은 전이성 장애(예컨대, 암종 또는 기타 고형의 혈액학적 암과 같은 암)를 가지고 있거나 가질 위험에 처한 환자의 치료 방법을 포함한다. 이들 환자에서의 치료는, 종양 성장의 억제, 종양(혹) 감소, 전이성 병변의 크기나 숫자 감소, 새로운 전이성 병변 발전 억제, 생존율 연장, 무진행 생존율 연장, 진행시간 연장 및/또는 향상된 삶의 질이 있되, 이에 한정되지는 않는다. 다른 구현예에서, 환자는, 염증성 장애, 자가면역질환, 섬유성 또는 섬유증식성 장애 및 아토피성 장애로 구성된 군에서 선택되는 장애 또는 상태를 가질 수 있다. 염증성 장애의 예로는 만성폐쇄성 폐질환, 천식, 류마티스 관절염, 염증성 장질환(크론병 및 궤양성 대장염을 포함함), 다발성 경화증, 건선, 허혈재관류 상해, 패혈성 쇼크, 노화성 황반변성, 죽상경화증, 알츠하이머병, 심혈관계 질환, 혈관염, 제1 및 제2형 당뇨, 대사증후군, 당뇨성 망막증, 재협착증이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 자가면역질환의 예로는 천식, 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 건선, 제1형 당뇨, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 자가면역성 감염 및 중증 근무력증이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 섬유성 장애의 예로는 공피증(scleroderma), 만성폐쇄성 폐질환, 당뇨성 신변증, 유육종증(sarcoidosis), 특발성 폐섬유화증, 경화증, 낭포성 섬유증, 신경섬유종증, 자궁내막증, 수술후 섬유종 및 재협착증이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 아토피성 질환의 예로는 아토피 피부염, 아토피성 천식 및 알레르기성 비염이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 조성물은, 이들 질환 중 하나 이상을 가지고 있거나 발전할 위험이 있는 환자에게 그 장애나 상태를 치료하기에 효과적인 양으로 투여된다.
바람직한 구현예에서, 환자는 암이나 전이성 장애(예컨대, 암종)를 가지고 있거나, 가질 위험에 처해 있다. 예를 들어, 환자는 원발 종양을 가지고 있으며, 그 원발 종양이 전이되고 있거나 전이될 위험에 처해 있다.
일 구현예에서, 다당류 제제는 정맥내 투여되거나, 피하내 투여되거나, 흡입된다.
일 구현예에서, 다당류 제제는 다른 치료, 예컨대 세포독성 치료제 또는 성장억제제(cytostatic agent) 및 이들의 조합과 같은 다른 치료제와 병용하여 투여된다.
일 구현예에서, 다당류 제제는 장기적으로, 예컨대, 6개월 동안 2회 이상과 같이 특정 기간에 걸쳐 2회 이상 투여된다. 일 구현예에서, 다당류 제제는 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년 또는 심지어 더 긴 기간에 걸쳐 2회 투여된다. 다당류 제제는 매일(예컨대, 매일 1회, 2회, 3회 또는 4회), 이틀에 한 번씩, 주 단위로(예컨대, 주 1회, 주 2회 또는 주 3회), 2주에 한 번씩, 월 단위로 또는 기타 다른 장기 투여 스케쥴에 따라 투여될 수 있다.
본원에 기술된 범위, 예컨대 소정의 구조나 활성의 경우, 본원에 개시된 범위는 물론 기타 범위일 수 있다. 예를 들어, 어떤 범위(예컨대, 소정의 구성 단위 또는 활성)의 하한점으로부터 다른 범위(예컨대, 상기 소정의 구성 단위 또는 활성)의 상한점을 조합하여 하나의 범위를 제공하게 된다.
"분리된" 또는 "정제된" 다당류 제제에는, 다당류가 유도된 세포나 조직으로부터의 세포성 물질이나 기타 오염 단백질이 실제적으로 없거나, 화학적으로 합성된 경우 화학 전구체나 기타 화학물질이 실제적으로 없다. "실제적으로 없다"는 제제가 적어도 50%(중량/중량) 정제되었다는 의미이다. 바람직한 구현예에서, 제제는, 예를 들어 제조과정으로부터 생성되는, 헤파린에서 유도되지 않은 다당류, 단백질이나 화학 전구체 또는 기타 화학물질을 약 30%, 20%, 10% 미만, 보다 바람직하게는 5%(건중량) 미만으로 가지고 있다. 이들 또한 본원에서는 "오염물질"로 지칭된다. 본원에 제공되는 다당류 제제에 존재할 수 있는 오염물질의 예로는 나트륨, 황, 붕소, 효소(예컨대, 헤파린분해 효소), 메탄올, 에탄올, 요오드 및 염소가 포함되되, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 기타 목적과 이점들은 하기의 상세한 설명과 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 본원에 기술된 다당류 제제의 murine melanoma 실험전이(B16F10 i.v.)모델에 있어서의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. 2x105 B16F10 세포를 i.v. 주사받고, 주사 직전에는 MONC402(batch R-1-5), dalteparin(FragminR), 또는 MONC202(음성대조, N-탈황산화 다당류)를 1회 용량(10mg/kg)으로 미리 치료받은 암컷 C57BL/6 mice(9 내지 10 주)에 대해, 폐 종양적하(tumor burden), 즉 (폐의 무게) - (정상 폐의 무게)를 구하였다.
도 2는 본원에 기술된 다당류 제제의 유방암의 폐전이에 대한 4T1 치료모델에 있어서의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. 내유방(intra mammary) 지방 조직에 8x104 4T1 세포를 주사받고, 지시대로 4일 째부터 치료받은 8주된 암컷 BALB/c mice에 대해, 폐 종양적하, 즉 (폐의 무게) - (정상 폐의 무게)를 32일 째에 구하였다.
최적화된 다당류
많은 임상적 상황에서, 상업적으로 입수가능한 LMWH 제제가 항응고제로서 UFH 제제보다 선호되는데, 그 이유는 LMWH가 보다 예측가능한 약동학을 가지고 있고 피하투여될 수 있기 때문이다. 그러나, 항응고 효과로 인한 출혈 합병증의 가능성 때문에, 현재 입수가능한 LMWH 제제는 비항응고-매개성 장애의 치료 및/또는 고용량이나 장기투여요법이 요구될 수 있는 장애에 덜 적합하다. 본 발명은, 실제적 항응고 활성은 부족하되 임상적으로 유리한 특성은 유지하도록 설계된 다당류 제제를 특징으로 한다. 다당류 제제의 특성은, 예컨대, 실제적인 항응고 활성이 부족(예컨대, 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성과 50 IU/mg 미만의 anti-IIa 활성과 같이 실제적인 항응고 활성의 부재)하다는 것과, 항전이 활성, 항혈관생성 및/또는 항염증 활성을 갖는다는 것이다.
이러한 다당류 제제의 예로는 하기 식들의 사슬을 포함한다:
Figure pct00006
(상기 화학식에서, U는 우론산 잔기를 가리키고, H는 헥소사민 잔기를 가리키며, m과 n은 정수로서, m = 6-18, n = 1-4이고, w = -2OS 또는 -2OH 이고, x = -NS 또는 -NAc 이고, y = -3OS 또는 -3OH 이고, z = -6OS 또는 -6OH 이고,
UG =
Figure pct00007
이고,
기호 "∼"는 m과 n으로 표시된 단위들이 다당류 사슬을 따라 분포되되 반드시 순차적인 것은 아님을 가리키며, w, x, y 및 z 각각은 m으로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하고, x, y 및 z 각각은 n으로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하다.); 및
Figure pct00008
(상기 화학식에서, U는 우론산 잔기를 가리키고, H는 헥소사민 잔기를 가리키며, m-r은 정수로서: m = 0-10, n= 0- 3, o = 0-10, p = 0-3, q = 0-10 이고, w = -2OS 또는 -2OH 이고, x = -NS 또는 -NAc 이고, y = -3OS 또는 -3OH 이고, z = -6OS 또는 -6OH 이고,
UG =
Figure pct00009
이고;
w, x, y 및 z 각각은 m, n, o, p 또는 q로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하다.).
Anti - IIa 활성
본원에는, 실제적으로 감소된 anti-IIa 활성, 예컨대 약 0 내지 50 IU/mg, 약 0 내지 40 IU/mg, 약 0 내지 30 IU/mg, 약 0 내지 25 IU/mg, 약 0 내지 20 IU/mg, 약 0 내지 10 IU/mg, 약 0 내지 5 IU/mg, 약 5 내지 10 IU/mg, 약 5 내지 15 IU/mg, 약 5 내지 20 IU/mg의 anti-IIa 활성을 제공하는 다당류 제제가 개시되어 있다. Anti-IIa 활성은, 평행선 시험(parallel line assay)을 위한 통계학적 방법을 이용하여 밀리그램 당 anti-IIa 활성의 국제단위로 산출한다. 하기의 원리를 이용하여, 본원에 기술된 anti-IIa 활성의 레벨을 측정한다.
다당류(PS) + ATIII → [PS ● ATIII]
IIa
PS ● ATIII → [PS ● ATIII ● IIa] + IIa(과잉량)
IIa(과잉량) + 기질 → 펩타이드 + pNA(분광광도법으로 측정됨)
Anti-factor IIa 활성은, 트롬빈의 억제에 있어서 항트롬빈(ATIII)에 대한 샘플 강화(촉진적)효과에 의해 결정된다. 분광광도법으로 트롬빈 과잉량을 간접적으로 측정할 수 있다. Anti-factor IIa 활성은, 예컨대, 크로모제닉스(S-2238 기질, 트롬빈(53 nkat/vial) 및 항트롬빈)으로부터의 시약을 이용하는 Diagnostica Stago 분석기나 ACL Futura3 응고 시스템에서 측정할 수 있으며, 또는 임의의 동등한 시스템에서 측정할 수 있다. 분석기 응답은, 저분자량 헤파린에 대한 제2 국제표준을 이용하여 조정된다.
Anti - Xa 활성
바람직하게, 본원에 제공된 다당류 제제는 약 0 내지 50 IU/mg, 예컨대, 약 0 내지 40 IU/mg, 약 0 내지 30 IU/mg, 약 0 내지 25 IU/mg, 약 0 내지 20 IU/mg, 약 0 내지 10 IU/mg, 약 0 내지 5 IU/mg, 약 5 내지 10 IU/mg, 약 5 내지 15 IU/mg, 약 5 내지 20 IU/mg의 anti-Xa 활성을 갖는다. 제제의 anti-Xa 활성은, 평행선 시험을 위한 통계학적 방법을 이용하여 밀리그램 당 anti-factor Xa 활성의 국제단위로 산출한다. 하기의 원리를 이용하여, 본원에 기술된 제제의 anti-factor Xa 활성을 측정한다.
PS + ATIII → [PS ● ATIII]
FXa
PS ● ATIII → [PS ● ATIII ● FXa] + FXa(과잉량)
FXa(과잉량) + 기질 → 펩타이드 + pNA(분광광도법으로 측정됨)
Anti-factor Xa 활성은, activated Factor Xa(FXa)의 억제에 있어서 항트롬빈(ATIII)에 대한 샘플 강화(촉진적)효과에 의해 결정된다. 분광광도법으로 Factor Xa의 과잉량을 간접적으로 측정할 수 있다. Anti-factor Xa 활성은, 예컨대, StachromR헤파린 테스트 키트를 이용하는 Diagnostica Stago 분석기에서, 또는 크로모제닉스로부터의 CoatestR헤파린 키트를 이용하는 ACL Futura3 응고 시스템에서, 또는 임의의 동등한 시스템에서 측정할 수 있다. 분석기 응답은, 저분자량 헤파린에 대한 NIBSC 국제표준을 이용하여 조정가능하다.
분자량 및 사슬길이
제제의 중량평균분자량이 결정되는 경우, 약 3500 내지 7000 Da, 약 3500 내지 6300 Da, 바람직하게는 약 4000 내지 6000 Da, 약 4200 내지 5900 또는 약 4300 내지 5800 Da에 해당하는 중량평균분자량은 다당류 제제 내의 상당수 사슬이 충분한 사슬길이임을 가리킨다.
본원에 사용된 바와 같이 "중량평균분자량"은 돌턴(dalton)으로 표시된 우론산/헥소사민 이당류 반복 부위 사슬의 중량 평균을 나타낸다. 비(non)우론산 및/또는 비헥소사민 구성 단위의 존재는 중량평균분자량을 결정함에 있어 포함되지 않는다. 따라서, 제제 내 사슬(들) 내의 비우론산 및 비헥소사민 구성 단위의 분자량은 중량평균분자량을 결정함에 있어 포함되지 말아야 한다. 중량평균분자량(Mw)은 다음 식으로부터 산출된다: Mw=Σ(cimi)/Σci. 변수 ci는 i 부분(slice) 내 고분자의 농도이고, mi는 i 부분 내 고분자의 분자량이다. 데이터의 많은 부분을 포함하는 크로마토그래피 피크에서 합계를 구하였다. 데이터의 일부분은 크로마토그래피 피크 대 시간의 그래프 상에서 수직선으로 표시되어 있다. 따라서 용리 피크를 여러 부분으로 분리할 수 있다. 중량평균분자량은 농도 및 분자량의 모든 부분을 합한 값에 따라 산출되는 평균이다. 중량평균분자량은 예컨대 Wyatt Astra 소프트웨어 또는 임의의 적당한 소프트웨어를 이용하여 측정할 수 있다. 본원에 기술된 중량평균분자량은, 직렬로 배치된 다각광산란 측정기(MALS detector)와 굴절율 측정기(refractometric detector)와 결합되고, 2개의 직렬연결된 칼럼(예컨대, TSK G3000 SWXL과 G2000 SWXL)이 구비된 고속액체 크로마토그래피에 의해 결정된다. 유량이 0.5 mL/분이고 pH가 5.0인 0.2M 황산나트륨을 용리액으로 사용한다.
다당류 제제가 충분한 길이의 사슬을 포함하는 지에 대한 결정은, 예를 들어, 제제 내 사슬의 평균 사슬길이를 측정하고/하거나 제제 내 사슬의 중량평균분자량을 측정함으로써 이루어질 수 있다. 평균 사슬길이가 정해진 경우, 약 5 내지 22, 예컨대 약 7 내지 18, 통상 약 7 내지 14 또는 8 내지 13개의 이당류 반복구조에 해당하는 평균 사슬길이는 제제 내 상당수의 사슬이 충분한 사슬길이임을 가리킨다.
본원에 사용된 바와 같이 "평균 사슬길이"는 하나의 사슬 내에 존재하는 우론산/헥소사민 이당류 반복구조의 평균 사슬길이를 나타낸다. 비우론산 및/또는 비헥소사민 구성 단위(예컨대, 부착된 PEG 잔기)의 존재는 평균 사슬길이 결정에 포함되지 않는다. 평균 사슬길이는 수평균분자량(Mn)을 이당류의 수평균분자량(500 Da)으로 나눔으로써 결정된다. SEC MALS를 이용하여 수평균분자량을 결정하는 방법을 아래에 기술하기로 한다.
글리콜 분할된 우론산 잔기
본원에 기술된 다당류 제제는, 통상 환원-산화(RO) 유도체라 일컬어지는 개환된 글리코사이드를 포함할 수 있다. 이들 제제에서는, 인접 디올을 함유하는 하나 이상의 글리코사이드 고리가 산화작용 및 후속의 환원작용을 통해, 예컨대 C2와 C3 사이의 결합에서 개환된다. 본원에 언급되는 이들 화합물을 또한 "글리콜 분할된" 유도체로 부르기로 한다.
본원에 기술된 본 발명의 또 다른 구현예에서는, 글리콜 분할된 잔기를 후속으로 기능화시킨다. 따라서 이들 화합물은, 글리콜 분할로부터 유도되는 일차 히드록시기의 위치에, 동일하거나 상이한 기(group), 예를 들어, 알데하이드기, 메톡시기, 또는 단당류나 아미노산 내지 둘 이상의 단위(예컨대, 2 또는 3개의 단위)길이를 갖는 범위의 올리고당기 또는 펩티드기를 또한 가질 수 있다.
일부 구현예에서는, 우론산 잔기 중 50% 미만이 글리콜 분할된 우론산 잔기에 해당된다(예컨대, 우론산 잔기 중 40%, 30%, 25% 또는 20% 미만이 글리콜 분할된 우론산 잔기에 해당됨).
환원말단 구조
일부 예에서는, 본원에 기술된 다당류 제제 내 사슬의 약 50% 이상이, 2,5-안히드로만노즈(anhydromannose) 잔기 또는 알콜을 형성하기 위해 환원된 2,5-안히드로만노즈와 같은 변성 환원말단 구조를 가지고 있다. 일부 구현예에서는, 제제 내 사슬의 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 변성 환원말단 구조를 가짐에 따라, 환원말단에는 2,5-안히드로만노즈 잔기 또는 알콜을 형성하기 위해 환원된 2,5-안히드로만노즈가 포함된다.
다분산도
본원에 제공된 다당류 제제의 다분산도는 약 2 이하로, 예컨대 1.7 이하(예를 들면, 약 1.7 또는 1.6 내지 1.2, 약 1.4 내지 1.5 및 그 사이의 값들)이다.
"다분산" 또는 "다분산도"란 용어는 조성물의 중량평균분자량(Mw)을 수평균분자량(Mn)으로 나눈 값을 나타낸다. 수평균분자량(Mn)은 다음 식으로부터 산출된다: Mn=Σci/(Σci/mi). 변수 ci는 i 부분(slice) 내 다당류의 농도이고, mi는 i 부분 내 다당류의 분자량이다. 데이터의 많은 부분을 포함하는 크로마토그래피 피크에서 합계를 구하였다. 데이터의 일부분은 크로마토그래피 피크 대 시간의 그래프 상에서 수직선으로 표시되어 있다. 따라서 용리 피크를 여러 부분으로 분리할 수 있다. 수평균분자량은 데이터의 각 부분에서의 분자량과 농도에 따라 산출된다. 전술한 중량평균분자량 결정 방법을 다분산도의 결정에 또한 이용하였다.
다당류 제제의 제조 방법
본원에 기술된 제제와 같은 다당류 제제를 제조하는 다양한 방법을 또한 고려해보기로 한다. 이들 중 한 방법은, 7000 Da를 초과하는 중량평균분자량 또는 7개를 초과하고 18개까지의 이당류 사슬의 길이를 갖는 헤파린 제제를 전구체로서 제공하는 단계와, 전구체 헤파린 제제를 처리하여(예컨대, 아질산 해중합과 같은 효소적 또는 화학적 해중합에 의함) 약 3000 내지 7000 Da의 중량평균분자량 또는 약 7 내지 18개 이당류에 해당하는 평균 사슬길이를 갖는 다당류 제제를 얻는 단계를 포함한다. 예를 들어, 전구체 헤파린 제제는 고분자량 헤파린일 수 있다.
전구체 헤파린 제제는, 해중합(예컨대, 아질산 처리, 가수분해 또는 효소적 해중합에 의함) 단계와, 후속으로 글리콜 분할 반응을 포함하는 방법에 의해 처리될 수 있다. 아질산 해중합은, 예컨대 (UFH와 같은)전구체 헤파린 제제를 약 2 내지 4의 pH와 약 10 내지 30℃의 온도에서 특정 시간동안(예컨대, 약 1 내지 5 시간) 아질산(예컨대, 약 0.02 내지 0.04M 아질산)으로 처리함으로써 실현될 수 있다. 글리콜 분할반응은, 약 0 내지 10℃의 온도에서 약 10 내지 20 시간 동안 과요오드산염(예컨대, 약 0.05M 내지 0.2M 과요오드산나트륨)를 이용하여 수행되는 과요오드산염 산화 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 염 또는 디에틸렌글리콜(DEG)과 같은 잔류 불순물은 나중에 크로마토그래피 방법(예컨대, 겔 여과 크로마토그래피)에 의해 제거될 수 있다. 선택적으로는, 이렇게 산화된 제제를 약 6.0 내지 7.0의 pH와 약 0 내지 10℃의 온도에서 약 0.5 내지 3 시간 동안 환원제(예컨대, 약 0.5 내지 2.0%(w/v) 보로수소화나트륨)를 이용한 처리에 의해 환원시킨다.
전구체 헤파린 제제는 효소적 소화(enzymatic digestion), 화학적 소화 또는 이들의 조합을 이용하여 처리될 수 있다. 화학적 소화의 예로는 산화성 해중합(예컨대, H2O2 또는 Cu+와 H2O2를 이용함), 탈아민 분열(deaminative cleavage)(예컨대, 이소아밀아질산 또는 아질산을 이용함), b-제거 분열(예컨대, 벤질 에스테르를 이용함) 및/또는 알칼리 처리가 포함된다. 효소적 소화로는 하나 이상의 헤파린 분해효소(heparin degrading enzyme)를 사용하는 것이 포함된다. 예를 들어, 헤파린 분해효소는, 예컨대 헤파리나제, 헤파린 리아제, 헤파린 설페이트 글리코아미노글리칸(HSGAG) 리아제, 헤파린을 또한 분해할 수 있는 글리코아미노글리칸(GAG) 리아제로 기술된 리아제 중 1종 이상일 수 있다. 바람직하게, 황산화되지 않은 우론산의 하나 이상의 글리코사이드 결합에서 효소적 절단이 일어난다.
생물학적 활성
본원에 기술된 제제는, C57/BL mice의 꼬리정맥에 주사된 B16F10 melanoma 세포가 폐에서 정지되며 개별적 pulmonary foci로서 증식되는 전이 동물모델에서 분석된 바와 같이 항전이 활성을 가지고 있다. 이 분석은 문헌[참조: Gabri et al., 2006, Clin. Cancer Res., 12:7092-98]에 개괄적으로 기재되어 있다. 제제는, C170HM2 human colorectal cancer line cells을 전이의 원발부위가 있는 복강 내의 간으로 주사하여 수행된 C170HM2 분석을 포함하는, 기타 전이 실험모델에서 추가적인 활성을 가질 수 있다. 또한 본원에 기술된 제제는, AP5LV human colorectal cancer cells이 복강벽 내에 주입되어 폐로 자발적 전이되는 현상을 보여주는 AP5LV 모델 또는 4T1 murine mammary carcinoma cells이 포유류 지방 조직 내에 주입되어 폐와 기타 기관으로 자발적 전이되는 현상을 보여주는 4T1 모델과 같이, 여러 자발적 전이 모델에서 항전이 활성을 또한 나타낼 수 있다.
본원에 기술된 제제는 VEGF, FGF, SDF-1α 및 P-셀렉틴 중 1종 이상에 결합되고/되거나 이들의 활성을 조절(예컨대, 억제)할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 제제와 타겟 단백질(예컨대, VEGF, FGF, SDF-1α 또는 P-셀렉틴)과의 상호반응(예컨대, 결합됨)은 당해 기술분야에 공지된 방법과 같은, 예컨대 생체외에서 분석할 수 있다. 결합 또는 활성 조절(예컨대, 억제)을 검출하기 위한 다수의 방법과 기술이 공지되어 있으며, 그 예로는 표준 수용체 경쟁 분석, 형광 에너지 전이(FET)를 이용한 분석, 형광공명 에너지 전이(FRET)(예를 들어, 미국특허 제5,631,169호; 미국특허 제4,868,103호 참조)를 이용한 분석 및 형광 편광(FP)을 이용한 분석이 있다. 일부 구현예에서, 다당류 제제와 타겟 단백질의 결합에 대한 평가에는 생체물질간 상호반응 분석(BIA) (예를 들어, Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem., 63:2338-2345와 Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol., 5:699-705 참조)을 활용한 결합 상호반응의 실시간 감시가 포함될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명 또는 "BIA"는, 반응물(interactants)(예컨대, BIAcore) 중 어느 것도 표지(labeling)하지 않고, 생특이적 상호반응을 실시간으로 검출한다.
생체내 및 생체외에서 VEGF, FGF 및 P-셀렉틴의 세포에 대한 활성은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다. VEGF, FGF 또는 P-셀렉틴의 활성을 조절(예컨대, 억제)하는 다당류 제제의 능력은 생체외에서, 또는 세포기반 분석에서, 또는 기관 내인 생체내에서 분석될 수 있다. 예를 들어, VEGF, FGF 또는 P-셀렉틴의 활성을 조절(예컨대, 억제)하여 인간 제대정맥 내피세포와 같은 혈관내피세포의 증식을 조정(예컨대, 촉진)시키는 다당류 제제의 능력이 분석될 수 있다. FGF 활성의 조절을 결정하는 바람직한 방법은 미국특허 제5,733,893호에서 찾아볼 수 있다. 세포기반 분석은 단일 세포, 또는 둘 이상의 세포로 된 집합체를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 세포는 효모 세포(예컨대, Saccharomyces cerevisiae) 또는 세포주과 같은 포유동물 세포일 수 있다.
약제학적 조성물
본원에 기술된 제제를 포함하며, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 조제된 조성물, 예컨대 약제학적으로 허용가능한 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 비경구적 투여와 생리학적으로 양립할 수 있는 임의의 모든 용매, 분산매, 등장화제(isotonic agent) 및 흡수지연제제(absorption delaying agent) 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 안구내, 직장내, 흡입 또는 척수 투여(예컨대, 주사나 주입에 의함)같은 모든 비경구 투여용으로 적합할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이들은 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 조제물들, 예컨대, (주사 및 주입 가능한 용액과 같은)액체 용액, 분산액 또는 현탁액 및 리포좀을 포함한다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식과 치료 용도에 따라 결정된다. 전형적으로 바람직한 조성물은 주사 또는 주입 가능한 용액의 형태로 존재한다. 바람직한 투여방식은 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 안구내, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 구현예에서는, 정맥내 주입 또는 주사에 의해 제제를 투여한다. 다른 바람직한 구현예에서는, 근육내 또는 피하 주사에 의해 제제를 투여한다.
본원에 사용된 바와 같이 "비경구적 투여" 및 "비경구적으로 투여"란 어구는 소화관내 투여와 국소 투여를 제외한 투여방식으로 보통 주사에 의해 이루어지며, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 피하, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 유리체강내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 흡입, 표피하, 관절내, 피막밑, 거미막밑, 척수강내, 경막외 및 흉골내 주사와 주입을 포함한다.
치료용 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 통상 무균의 안정적인 상태로 있어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 고농축에 적합한 기타 질서 구조로서 조제될 수 있다. 무균의 주입 가능한 용액은, 요구량의 활성 화합물(즉, 다당류 제제)을 위에 열거된 성분 중, 요구되는 대로, 1종 또는 이의 조합물을 갖는 적당한 용매내로 혼입한 후 여과멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로 분산액은, 활성 화합물을 무균의 전달체로 혼입함으로써 제조하며, 이때 전달체는 염기성 분산매와, 위에 열거된 것들 중 요구되는 기타 성분을 함유한다. 무균의 주입 가능한 용액 제조를 위한 무균 분말의 경우, 이를 위한 바람직한 제조 방법으로는 진공건조, 그리고 유효성분과 함께 이의 미리 여과멸균된 용액으로부터의 원하는 임의적 추가 성분으로 된 분말을 생성하는 동결건조가 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅재를 이용하고, 분산액의 경우에는 요구되는 입경을 유지하며, 계면활성제를 이용함으로써 용액의 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 다양한 고분자, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 주사 가능한 조성물에 지속흡수성을 제공할 수 있다.
여러 치료용도에 대해, 바람직한 투여 경로/방식은 정맥내 주사 또는 주입이다. 당해 분야의 숙련자가 인식하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 다양할 것이다.
주사용 제제는 예컨대, 유리병 용기(ampoule), 주사기, 주사기 펜 또는 다회-투여용량 용기(예컨대, 방부제가 첨가됨) 내에 투약단위형태로 존재할 수 있다. 조성물은 유성(oily) 또는 수용성 전달체내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 조제에 필요한 약물을 함유할 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 본 제제는 적합한 추진제(예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체)를 이용하여 가압팩 또는 연무기(nebulizer)로부터 에어로졸 분사제 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예컨대, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 조제할 수 있다. 또한, 흡입요법용 건조분말 조제물도 본 발명의 범주 이내에 속한다. 이러한 건조분말 조제물은 예컨대 WO 02/32406에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.
전술된 조성물 외에도, 본 화합물은 디팟 제조(depot preparation)로 조제될 수 있다. 이러한 장기 작용 조제물(long-acting formulations)은 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용가능한 오일내의 에멀젼으로서) 또는 이온교환수지와 함께 제조가능하거나, 난용성(sparingly soluble) 염과 같은 난용성 유도체로서 제조가능하다.
약제학적 조성물은 또한 적합한 고상 또는 젤상의 담체나 부형제를 포함할 수 있다. 투여 지시사항과 함께 조성물을 용기, 팩 또는 디스펜서에 담을 수 있다.
본 제제는 단기(short term) 또는 장기(long term) 주입장치(예컨대, 스텐트)를 이용하여 투여될 수 있다. 이때 제제는 피하주입될 수 있거나, 조직 또는 기관(예컨대, 관상동맥, 목동맥, 신동맥 및 기타 말초동맥, 정맥, 신장, 심장, 각막, 유리체, 대뇌 등)내로 주입될 수 있거나, 조직과 기관 주변의 생리학적 공간(예컨대, 신장막, 심막, 흉부 또는 복막 공간)내로 주입될 수 있다.
본 제제는 또한 다양한 의학장치를 피복하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 제제는 스텐트나 체외순환회로를 피복하는 데에 이용될 수 있다. 제제의 이러한 조제는, 예컨대 방출제어비드, 겔 또는 미소구체(microspheres)는 물론 PLGA, 셀룰로오스, 알긴산 또는 기타 다당류와 같은 다양한 중합체를 이용하는 단계를 포함할 수 있다.
투약 방법을 조절하여 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 1회 환약(bolus)으로 투여하거나, 시간에 따라 수회로 나누어진 용량으로 투여하거나, 치료상황의 위급사태에 의해 지시된 대로 용량을 비례하여 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여의 용이함과 투약의 균일함을 위해 비경구적 조성물을 투약단위형태로 조제하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투약단위형태는 치료대상 환자를 위한 단일 투여용량으로 적합하도록 물리적으로 분리된 단위를 가리키며; 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 산출된 소정양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투약단위형태의 상세사항은, (a) 활성 화합물의 고유 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과와, (b) 개인의 민감도 치료를 위한 활성 화합물의 배합 기술에서의 내재적 한계점들에 의해 결정되고 직접적으로 영향받는다.
경감되어야 하는 조건의 유형과 심각도에 따라 투여용량이 다양해질 수 있음을 주지해야 한다. 임의의 특정 환자를 위해, 개인의 요구 및 조성물의 투여를 관리하거나 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 구체적인 투여방법이 시간에 따라 조절되어야 함을 또한 이해하여야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료학적으로 효과적인 양의 제제를 함유할 수 있다. 본 제제의 치료학적으로 효과적인 양은, 개인의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인에 따라 다양할 수 있으며, 둘 이상의 단위용량을 포함할 수 있다. 치료학적으로 효과적인 양은 또한 제제의 어떠한 독성 또는 유해효과보다 치료학적으로 유리한 효과가 더 클 때의 양이다. 치료학적으로 효과적인 양은, 측정가능 매개변수(예컨대 VEGF 활성, FGF 활성, P-셀렉틴 활성, 또는 전이병변의 크기나 성장속도)를 치료받지 않은 환자에 비해 예컨대 약 20% 이상, 더 바람직하게 약 25%, 30%, 40% 이상, 심지어 더 바람직하게는 약 50%, 60% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 70%, 80% 이상 만큼 억제할 수 있다. 측정가능한 매개변수, 예컨대 전이성 또는 신생혈관작용을 억제하는 화합물의 능력은 동물 모델 시스템이나 인간(예컨대, 전임상 모델 또는 임상실험)에서 평가될 수 있다. 대안으로, 조성물의 특징은 화합물의 활성을 생체외 분석에서 검사함으로써 평가될 수 있다. 다당류 제제의 정맥내 투여 또는 피하투여를 위한 바람직한 용량은 약 0.03mg/kg 내지 0.45mg/kg, 예컨대 0.03mg/kg, 0.05mg/kg, 0.1mg/kg, 0.15mg/kg, 0.2mg/kg, 0.22mg/kg, 0.25mg/kg, 0.27mg/kg, 0.3mg/kg, 0.35mg/kg, 0.37mg/kg, 0.4mg/kg, 0.44mg/kg, 바람직하게는 약 0.1mg/kg, 0.15mg/kg, 0.2mg/kg, 0.25mg/kg, 0.3mg/kg, 0.35mg/kg, 0.4mg/kg, 0.44mg/kg, 0.47mg/kg, 0.5mg/kg, 0.55mg/kg, 0.60mg/kg, 0.7mg/kg, 바람직하게는 약 0.30mg/kg 내지 0.50mg/kg, 예컨대 0.30mg/kg, 0.35mg/kg, 0.40mg/kg, 0.42mg/kg, 0.44mg/kg, 0.47mg/kg 또는 0.50mg/kg 이다. 일부 구현예에서, 다당류 제제는 1일에 1 내지 80mg/kg 사이, 1 내지 40mg/kg 사이, 1 내지 30mg/kg 사이, 예컨대 5 내지 50mg/kg 사이의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 범주내에는 또한 본원에 제공된 다당류 제제를 포함하는 키트가 있다. 키트에는, 사용 지시사항; 기타 시약(예컨대, 치료용 약물); 투여용 다당류 제제를 제조하기 위한 장치 또는 기타 물질; 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 환자로의 투여를 위한 장치 또는 기타 물질 중 하나 이상의 요소가 포함될 수 있다. 지시사항은, 예컨대 본원에 기술된 질환을 갖는 환자에 있어서 권고된 투여용량 및/또는 투여 방식을 포함하는 치료 용도에 대한 지시사항을 포함할 수 있다. 키트는, 하나 이상의 개별적 약제학적 제제로 적절하게 조제되는 진단용 또는 치료용 약물(예컨대 본원에 기재된 것과 같은 진단용 또는 치료용 약물)과 같은 적어도 하나의 추가적 시약을 더 포함할 수 있다.
용도
다당류 제제는 환자를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 환자는 포유동물, 예컨대 비인간 실험 포유동물, 수의 포유동물 또는 인간이다. 비인간 포유동물에는 유인원, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치동물이 포함된다.
본원에 제공된 제제는, 예를 들어, 전이성 장애(예컨대, 암종 또는 기타 고형의 혈액학적 암과 같은 암)를 치료하거나 예방하는 데에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "암"이란 용어로, 조직병리학적 유형 또는 침입의 단계에 상관없이, 모든 종류의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성 전환된- 세포, 조직 또는 기관을 포함하고자 한다. 본원에 개시된 방법과 조성물은 암과 관련된 전이성 병변의 치료나, 크기, 숫자 또는 성장속도 감소에 특히 유용하다.
암의 예로는 고형 종양, 연조직 종양, 조혈성 종양 및 전이성 병변이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 고형 종양의 예로는, 머리와 목(인두를 포함함), 갑상샘, 폐(소세포성 또는 비소세포성 폐 암종), 유방, 림프구, 위장관(예컨대, 구강, 식도, 위, 간, 췌장, 소장, 결장과 직장, 항문관), 생식기 및 비뇨생식관(예컨대, 신장, 요로상피, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 고환), CNS(예컨대, 신경모세포종 또는 신경아교종과 같은 신경세포 또는 아교세포), 피부(예컨대, 흑색종)에 영향을 미치는 것들과 같은 다양한 기관계통의 악성종양들(예컨대, 육종, 선암 및 암종)이 포함된다. 치료가능한 혈액암의 예로는, 다발골수증, 림프증, 백혈병 및 골수이형성증이 포함된다. 본원에 개시된 방법과 조성물은 앞서 언급된 암들과 관련된 전이성 병변의 치료(예컨대, 감소 또는 지연)를 위해 특히 유용하다. 일부 구현예에서 따르면, 환자는 조직제거술, 화학요법 및 기타 항암치료 중 한 가지 이상을 받게 되며, 이때의 주된 또는 유일한 타겟은 전이성 병변들, 예컨대, 뼈, 림프절, 폐, 간, 복막강, CNS 또는 기타 기관 내의 전이가 될 것이다.
본 발명의 방법(예컨대, 치료 방법)은, 환자에서, 종양의 크기; 암환자의 경우, 암표지자 레벨; 새로운 병변의 크기 또는 발현속도(rate of appearance)(예컨대 스캔에서 관찰됨); 새로운 질환과 관련된 증상의 발현; 연조직량의 크기(예컨대, 감소되거나 안정화됨); 삶의 질(예컨대, 뼈의 통증과 같은, 질환과 관련된 통증의 양); 및 임상적 결과에 연관된 기타 매개변수 중 한가지 이상에서의 변화(예컨대, 증가 또는 감소)를 감시하는 단계를 더 포함할 수 있다. 환자를 감시하는 일은, 치료를 시작하기 전; 치료 도중; 및 치료법 중 하나 이상의 구성요소가 시행된 후 중에서 하나 이상의 기간에 행해질 수 있다. 감시작업은, 동일한 제제를 이용한 추가 치료 또는 추가적 약물을 이용한 추가 치료의 필요성을 평가하는 데에 이용된다. 일반적으로, 전술된 매개변수 중 하나 이상에서의 감소현상은 환자의 상태가 호전되었음을 가리킨다.
본원에 기술된 제제는, 전이성 또는 암성 장애(예컨대, 본원에 기술된 암성 장애)를 치료하거나 예방하도록 환자에게 일회 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
본원에 기술된 제제는 또한 염증성, 자가면역성, 섬유성, 섬유증식성, 아토피성 또는 혈관생성 장애를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 염증성 장애의 예로는 만성폐쇄성 폐질환, 천식, 류마티스 관절염, 염증성 장질환(크론병 및 궤양성 대장염을 포함함), 다발성 경화증, 건선, 허혈재관류 상해, 패혈성 쇼크, 노화성 황반변성, 죽상경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 심혈관계 질환, 혈관염, 제1 및 제2형 당뇨, 대사증후군, 당뇨성 망막증, 재협착증이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 자가면역질환의 예로는 천식, 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 건선, 제1형 당뇨, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 자가면역성 감염 및 중증 근무력증이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 섬유성 장애의 예로는 공피증, 만성폐쇄성 폐질환, 당뇨성 신변증, 유육종증, 특발성 폐섬유화증, 경화증, 낭포성 섬유증, 신경섬유종증, 자궁내막증, 수술후 섬유종 및 재협착증이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 아토피성 질환의 예로는 아토피 피부염, 아토피성 천식 및 알레르기성 비염이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다.
섬유증식성 장애의 예로는 전신성 또는 국소적 공피증, 켈로이드 및 비대 흉터, 죽상경화증, 재협착증, 섬유육종, 신경섬유종증 및 류마티스 관절염이 포함된다. 외상과 관련된 흉터형성의 예로는 수술에 기인한 흉터형성, 화학요법으로 유도된 섬유증, 방사선으로 유도된 섬유증, 상해 또는 화상과 관련된 흉터형성이 포함된다.
일 구현예에서, 다당류 제제는 혈관생성의 억제(예컨대, 혈관생성 장애를 치료)용으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이 혈관생성은 신생 혈관의 부적절한 형성이다. 혈관생성 장애로는 종양, 눈의 혈관신생장애, 자궁내막증, 근육퇴행, 골다공증, 건선, 관절염, 암 및 심혈관계 장애가 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 일부 장애는 본원에 기술된 질환의 둘 이상의 범주에 속하게 된다.
본원에 기술된 제제는 또한 말라리아 같은 전염성 장애를 치료하거나 예방하는 데에 사용될 수 있다.
병용치료
본 발명의 방법과 조성물은 기타 종류의 요법과 병용하여 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "병용하여" 투여한다는 것은 환자가 장애로 고통받는 동안에 환자에게 두가지(이상) 상이한 치료를 전달함으로써 환자에 대한 치료효과가 어느 시점에서 겹치게 되도록 하는 것을 의미한다. 일부 구현예에 따르면, 두번째 치료의 전달이 시행될 때 첫번째 치료가 여전히 전달되게 함으로써 투여면에서 겹치게 된다. 이는 본원에서 때로는 "동시(simultaneous)"또는 "동시 전달(concurrent delivery)"로 언급된다. 다른 구현예에서는, 한가지 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시행되기 전에 종료된다. 어느 경우에서든 일부 구현예에 따르면, 병용 투여로 인해 치료가 보다 효과적이 된다. 예를 들어, 첫번째 치료 없이 두번째 치료가 행하여진 경우에 보이는 효과보다, 두번째 치료가 보다 효과적이거나(예컨대, 두번째 치료를 덜 받는데도 동등한 효과가 나타난다거나, 두번째 치료로 증상이 상당히 감소됨), 유사한 상황이 첫번째 치료로 나타난다. 일부 구현예에서는, 증상이 감소되거나, 다른 치료 없이 한가지 치료가 행하여졌을때 관찰되는 것보다 기타 장애 관련 매개변수가 더 커지도록 치료 전달이 행해진다. 두가지 치료의 효과는 일부 부가적이거나, 전체적으로 부가적이거나, 부가적인 면보다 클 수 있다. 두번째 치료가 전달될 때 앞서 전달된 첫번째 치료의 효과가 여전히 검출가능하도록 치료 전달이 행해질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기술된 제제를 하나 이상의 추가 요법(예컨대, 수술, 방사선요법 또는 다른 치료제제의 투여)과 병용하여 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 추가 요법에는 화학요법(예컨대, 세포독성제)이 포함될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 추가 요법에는 표적치료(예컨대, 타이로신키나제 억제제, 프로테아좀 억제제, 단백질분해효소(protease) 억제제)가 포함될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 추가 요법에는 항염증성-, 항혈관생성-, 항섬유화- 또는 항증식성 화합물(예컨대, 스테로이드, 생물학적 면역조절제, 단일클론항체, 항체단편, 압타머, siRNA, 안티센스 분자, 퓨전 단백질, 시토킨, 시토킨 수용체, 기관지확장제, 스타틴, (메토트렉세이트 같은)항염증제, NSAID)이 포함될 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 추가 요법에는 상이한 등급의 병용치료가 포함될 수 있다. 다당류 제제 투여와 추가 요법은 동시에 또는 순차적으로 행하여질 수 있다.
다당류 제제와 병용하여 투여될 수 있는 바람직한 세포독성제로는, 항미세관제(antimicrotubule agents), 토포아이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitors), 항대사물질(antimetabolites), 단백질 합성 및 분해 억제제, 유사분열 억제제(mitotic inhibitors), 알킬화제, 백금화제, 핵산합성 억제제(inhibitors of nucleic acid synthesis), 히스톤 탈아세틸화효소와 DNA 메틸전이효소 억제제(histone deacetylase and DNA methyltransferase inhibitors), 질소 머스터드, 나이트로소요소(nitrosoureas), 에틸레니민(ethylenimines), 알킬설포네이트, 트리아젠(triazenes), 폴산 유사체(folate analogs), 핵산 유사체, 리브뉴클레오티드 환원효소 억제제, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 탁산(taxanes), 에포싸일론(epothilones), 층간삽입제(intercalating agents), 신호전달경로를 방해할 수 있는 약물(agents capable of interfering with a signal transduction pathway), 세포자멸사와 방사를 촉진하는 약물(agents that promote apoptosis and radiation), 표면단백질을 결합하여 독극물을 전달하는 항체 결합체가 포함된다. 일 구현예에 따르면, 본원에 기술된 제제와 함께 투여될 수 있는 세포독성제는 백금, 싸이톡산(cyclophosphamide), 다카바진(dacarbazine), 메토트렉세이트(methotrexate), 플루오로유러실(fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitabine), 수산화요소(hydroxyurea), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 아자시티딘(azacytidine), 보리노스타트(vorinostat), 익사베필론(ixabepilone), 보르테조밉(bortezomib), 탁산(팍클리탁셀, 도세탁셀), 시토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D, 에티듐브롬화물, 에머틴(emetine), 마이토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 콜히친(colchicin), 안트라사이클린(anthracyclines) (독소루비신 및 에피루비신) 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 액티노마이신 D(actinomycin D), 아드리아마이신(adriamycin), 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol), 푸로마이신(puromycin), 리신(ricin) 및 메이탄시노이드(maytansinoids)이다.
병용요법은 1종 이상의 추가 치료제와 공-조제 및/또는 공-투여되는 본 발명의 조성물을 또한 포함할 수 있으며, 예로는 1종 이상의 항암제, 세포독성제/세포증식억제제, 호르몬 치료, 수용체 타이로신키나제와 기타 타이로신키나제의 소분자 억제제(HER-2, EGFR, VEGFR, BCR-ABL, c-KIT(예를 들어, 게피티닙, 얼로티닙, 라파티닙, 소라페닙, 수니티닙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙) 또는 mTOR(예를 들어, 템시롤리무스, 에버롤리무스, 라파마이신)를 포함), 시토킨/키모킨, 백신, 세포막 수용체 경로에 대한 항체(EGF-EGFR, VEGF-VEGFR, CD19, CD20, CD3, CTLA-4(예를 들어, 트라츠주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 토시투모맙)를 포함) 및/또는 기타 면역요법이 있다.
기타 구현예
이하 실시예를 통해 본 발명을 더 상세히 설명하나, 이들이 발명을 제한하는 것으로 여겨서는 안된다. 본 출원을 통해 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 참조로써 본원에 통합된다.
실시예
실시예 1: 다당류 제제의 제조
본 실시예는 본원에 기술된 다당류 제제의 제조에 대해 설명한다.
개요: 고분자량 헤파린(UFH)을 제어된 아질산 해중합에 이어서 산화적 글리콜 분할하고 후속으로는 알콜로 환원시키는 단계에 의해 글리콜 분할된 저분자량 헤파린 알콜(GS-LMWH-CH2-OH)을 생성하였다. 제1단계에서는, UFH를 해중합하여, 다당류의 환원 말단에 안히드로만노즈 잔기를 갖는 해중합된 헤파린(DPH-CHO)을 얻었다. 이어서 제2단계에서는, 해중합된 헤파린에 존재하는 2,3-디올을 과요오드산나트륨으로 산화분열시켜 헤파린 사슬을 따라 개환된 글리콜 분할 잔기(GS-DPH-CHO)를 생성하였다. 제3단계는 환원단계로, 여기서는 보로수소화나트륨을 사용하여 알데하이드 잔기를 알콜로 변환시켜 글리콜 분할된 저분자량 헤파린 알콜을 생성하였다.
방법 개요:
이하 내용은 본원에 기술된 다당류 제제의 제조와 특성에 대해 설명한다.
1. 해중합
실온에서 평형화된(equilibrated) 탈이온수 100mL에 고분자량 헤파린(10g)을 용해하였다. 그 결과로서 용액의 pH가 3.1로 낮추어졌고, 다음으로는 아질산나트륨(0.03M)을 첨가하였다. 이 반응용액을 3시간 동안 교반한 후, 염화나트륨(10g)을 첨가하기 전에 pH를 중성화시켰다. 염이 완전히 용해된 후에, 일정한 교반 하에 메탄올(200mL)을 용액에 첨가하였다. 그런 후에 수득된 침전물을 2시간 동안 6℃에서 숙성시켰다. 그 후 침전물을 여과 및 건조시켜 하기의 특징을 갖는 DPH를 80 내지 85% 수율로 수득하였다.
Mw: 5300-6100
Mw 분포: (i) <3000 Daltons: 23-30%
(ii) 3000-8000 Daltons: 50-55%
(iii) >8000 Daltons: 15-22%
Anti-Xa 활성: 80-120 IU/mg
Anti-IIa 활성: 40-70 IU/mg
2. 과요오드산염 산화
5℃에서 평형화된(equilibrated) 물 50mL에 제1단계로부터 수득한 알데하이드(5g)를 용해하였다. 이 용액에 냉각된 NaIO4 용액(0.1 M, 50 mL)을 첨가하고, 이렇게 얻은 반응 혼합물을 빛이 없는 상태에서 16시간 동안 교반하였다. 교반이 완료되면, 디에틸렌글리콜(10mL)을 첨가하여 반응을 급냉시켰으며, 이어서 온도를 실온으로 다시 상승시켰다. 다음으로는 이 용액에 5g의 염화나트륨을 첨가하였고, 이어서 150mL의 메탄올을 첨가하여 헤파린을 침전시켰다. 수득된 침전물을 2시간 동안 6℃에서 숙성시킨 후에, 여과 및 건조시켜 하기의 특징을 갖는 글리콜 분할된 다당류를 95 내지 98% 수율로 수득하였다.
Mw: 5000-5800
Mw 분포: (i) <3000 Daltons: 25-30%
(ii) 3000-8000 Daltons: 55-60%
(iii) >8000 Daltons: 15-20%
3. 환원
5℃에 유지된 물 40mL에 상기 제2단계로부터 수득한 글리콜 분할된 다당류(4g)를 용해하였다. 이 용액에 보로수소화나트륨(0.4g)을 첨가하고, 그 후 이 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. 1시간 후에, 반응 혼합물의 온도를 실온으로 상승시키고, 그 후 염화나트륨(4g)을 첨가하였다. 염이 용해된 후에, 일정한 교반 하에 메탄올(80mL)을 이 용액에 첨가하였다. 이렇게 얻은 침전물을 2시간 동안 6℃에서 숙성시킨 후에, 여과 및 건조시켜 원하는 생성물을 수득하였다. 하기의 특징을 갖는 다당류 제제를 55 내지 60% 수율로 수득하였다.
Mw: 5500-6200
Mw 분포: (i) <3000 Daltons: 17-23%
(ii) 3000-8000 Daltons: 56-62%
(iii) >8000 Daltons: 17-22%
Anti-Xa 활성: 5-20 IU/mg
Anti-IIa 활성: 1-10 IU/mg
실시예 2: 다당류 제제의 항전이 특성
본 실시예는 다당류 제제가 여러 전이모델에서 항암 및 항전이 활성을 가짐을 보여준다.
모델 A: Murine melanoma 실험전이(B16F10 iv) 모델
실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 다당류 제제(이하 "MONC402"로 지칭됨)는 murine melanoma 실험전이모델에서 항전이 활성을 나타내었다.
암컷 C57BL/6 mice(9 내지 10주의 연령)에 2x105B16F10 세포를 i.v. 주사하기 직전에 MONC402, dalteparin/FragminR(LMWH가 전이를 감소시키는 것으로 보고되었음), 또는 MONC202(음성대조, N-탈황산화 다당류)를 1회 용량(10mg/kg)으로 한 번 치료하였다. 이들 쥐를 21일째 희생시키고, 종양적하(tumor burden)를 (폐의 무게) - (정상 폐의 무게)로 산출하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, MONC402는 폐의 B16F10 전이증식(colonization)을 혼주(비처리) 대조군에 비해 상당히 억제하였다.
모델 B: 대장암의 간전이
MONC402는 동소 간전이에 있어서 예방적 항전이 활성을 나타내었다.
간전이는, C170HM2 인간 결장직장 종양세포가 수컷 MF1 nude(nu/nu) athymic mice에 복강내 주사됨으로써 시작되었다. 5FU/leucovorin을 양성대조로 사용하였다.
37℃, 5% CO2 및 가습조건에서, C170HM2 세포를 10%(v/v) 열비활성화된 fetal bovine serum과 2mM L-글루타민을 함유한 RPMI 배지(Sigma 사)에서 in vitro 배양하였다. 아유착(sub-confluent) 단일층으로부터의 세포를 0.025% EDTA로 수확하고 배지에서 수세한 다음 in vivo 투여를 위해 pH 7.4의 멸균 인산완충액(PBS)에 재현탁하였다. 1ml 부피의 1.5x106 세포를 65마리의 쥐들에게 복강내 주사하고, 아래와 같이 여러 치료그룹에 할당하였다.
그룹 1: n=10 전달체 대조군
그룹 2: n=10 25 mg/kg 5FU/leucovorin i.v. 1, 3, 5, 7일 째에 순환시킴
그룹 3: n=10 5 mg/kg 화합물 1 (Dalteparin) s.c. 1일 1회
그룹 4: n=10 5 mg/kg 화합물 2 (MONC402) s.c. 1일 1회
그룹 5: n=10 15 mg/kg 화합물 2 s.c. 1일 1회
그룹 6: n=10 30 mg/kg 화합물 2 s.c. 1일 1회
그룹 7: n=5 비처리군
세포 주사에 이어 1일 째 치료를 시작하여 35일 째까지 또는 동물의 임상적 조건으로 인해 치료중단이 요구될 때까지 지속하였다. 그룹 5와 그룹 6에는 5일 째에 1회 용량을 투여하지 않았다. 종양을 가지고 있는 쥐들에서 시험 화합물의 아무런 부작용도 관찰되지 않았다.
35일 째에 연구를 종결하고, 간에 있는 종양을 절개하여 무게를 재었다. 또한 폐 결절의 수를 세었다. 간 종양의 평균 무게와 평균 횡단면적을 표 1에 정리하였다.
Figure pct00010
MONC402는 종양의 이식율(tumor take rate)에 상당한 영향을 미쳤다. 15mg/kg 및 30 mg/kg의 MONC402 모두가 간의 종양 크기를 각각 90%(p=0.007) 및 97%(p=0.004)씩 현저하게 감소시켰으며, 또한 5FU/leucovorin(각각 p=0.041 및 p=0.011)보다 상당히 효과적이었다. 전달체 대조군과 비교하였을 때, dalteparin(그룹 3)은 간의 종양 무게를 약 81%(p=0.017) 감소시켰다. 유사하게, dalteparin (p=0.027)과 15mg/kg 및 30 mg/kg의 MONC402(각각 p=0.016 및 p=0.004) 덕분에 종양의 횡단면적도 상당히 감소되었다.
연구기간 동안 쥐의 체중을 감시하였다. 연구 내내 각 그룹의 쥐의 체중은 모든 그룹에 대해 허용가능한 범위 이내에 유지되었다.
모델 C: 유방암의 폐전이
MONC402는 또한 유방암 전이(4T1)의 유전적동계 동소모델(syngeneic orthotopic model)에서 항전이 활성을 나타내었다.
8주된 암컷 BALB/c mice(WOA)의 내유방(intra mammary) 지방 조직에 8x104 4T1 세포를 주사하였다. 주간 시스플라틴(cisplatin) 치료와 함께 또는 병용없이, Saline 또는 MONC402를 이용한 매일 치료를 5일 째부터 시작하였다. 원발성 종양을 9일 째 제거하여 무게를 재었다.
표 2에 보여진 바와 같이, MONC402(10, 20, 30 mg/kg)와 병용된 시스플라틴은, 폐의 무게와 종양결절의 개수에 의해 결정하였을 경우, saline 대조군에 비해 폐전이면에서 통계학적으로 상당한 감소를 나타내었다(p<0.05, 일원분산분석(One way ANOVA)). 병용치료 그룹들(시스플라틴+MONC402 10/20/30mg/kg) 또한 유방 종양의 재증식의 발현빈도가 낮았고, 흉강 종양전이도 낮았으며, 실험이 종결되기 전 마지막 3일 동안에 좀더 적은 체중감소(>2g)를 보였다. 병용치료 그룹들이 수술 다음 주에 일시적인 체중감소(>2g)면에서 더 높은 발현빈도를 보였으나 일주일 내에 회복되었다.
Figure pct00011
두번 째 4T1 실험에서, 암컷 BALB/c mice 8 WOA의 내유방 지방 조직에 8x104 4T1 세포를 주사하였다. Saline 또는 시스플라틴 주간치료를 병용하여, 4일 째부터 saline 또는 MONC402를 지속적으로 삼투압 펌프로 전달하였다. 원발성 종양을 9일 째 제거하였다. 원발성 종양의 무게면에서 그룹간의 유의한 차이점은 없었다. 그러나, 면역조직학 분석은 시스플라틴과 MONC402로 병용치료된 쥐들의 종양 내 미세혈관밀도가 상당히 감소되었음을 보여주었다. 32일 째에 실험을 종결하고 여러 시료를 채취하였다. 여섯마리의 쥐가 죽었거나, 전체적으로 악화된 상태로 인해 이들에 대한 실험이 조기에 종결된 것으로 밝혀졌다.
폐의 무게, 폐 종양결절의 정량화(결절 개수, 크기 및 산출된 종양체적)는 물론 조직학적 정량화에 의해 4T1 폐전이를 결정하였다. 도 2에 그 결과가 도시되어 있다. MONC402(20 mg/kg/day) 단독요법 그룹들은 4T1 폐전이를 현저하게 억제하지 않았다. 시스플라틴(1.25mg/kg) 단독요법은 상당한 항-종양효과(p<0.05)를 나타내었다. 시스플라틴(1.25mg/kg)과 MONC402 (20mg/kg/day)의 병용은 폐전이의 감소(p<0.0005) 및 미세혈관밀도의 감소에 효과적임을 보여주었다. 중요하게는, 시스플라틴 단독요법 그룹에 비해 병용요법 그룹이 더 나은 항-종양효과(폐의 무게(p<0.02), 종양결절 개수, 폐종양의 조직학적 커버리지 및 폐종양의 미세혈관밀도(p<0.05, t-검정)에 의해 결정됨)를 나타내었으며, 이는 M0NC402가 시스플라틴의 항-종양효과를 개선하였음을 증명하는 것이다.
모델 D: 인간의 전립선암종 PC-3M 모델: 병용요법
수컷 SCID/Beige mice 8 WOA의 전립선내에 5x105 PC-3M-luciferase 전립선암종 세포를 주사하였다. 주간 시스플라틴 치료와 함께 또는 병용없이 saline 또는 MONC402를 이용한 매일 치료를 3일 째부터 시작하였다. Xenogen 조영장치로 매주 쥐들을 감시하였다. 32일 째에 실험을 종결하였다. 여러 기관(organs)을 분리하고, 무게와 Xenogen 영상에 의해 종양 전이를 분석하였다.
MONC402(30 mg/kg) 단독요법은 복막에서의 PC-3M 전이를 억제하였다. MONC402(30 mg/kg)와 병용된 시스플라틴은 saline 및 MONC402 단독요법 그룹들에 비해 종양 증식(in vivo 영상에 의해 결정됨)을 감소시켰다. 특정 실험조건 하에 원발성 종양의 무게 및 전이면에서 병용요법(시스플라틴 + MONC402 30 mg/kg)과 시스플라틴 단독요법간의 유의한 차이점은 없었다.

Claims (36)

  1. (a) 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량과,
    (b) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성 및 anti-IIa 활성과,
    (c) 5% 초과 50% 미만의 글리콜 분할된 우론산 잔기를 특징으로 하는 다당류 제제.
  2. 제1항에 있어서, 30% 미만의 글리콜 분할된 우론산 잔기를 갖는, 제제.
  3. 제1항에 있어서, 10% 내지 30%의 글리콜 분할된 우론산 잔기를 갖는, 제제.
  4. (a) 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량과,
    (b) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성 및 anti-IIa 활성과,
    (c) 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG)를 갖는 다당류 사슬과,
    (d) 각 3개 이하의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG)를 갖는 다당류 사슬들을 특징으로 하는 다당류 제제.
  5. 제4항에 있어서, 각 다당류 사슬이 2개 이하의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG)를 갖는, 제제.
  6. (a) 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량과,
    (b) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성 및 anti-IIa 활성과,
    (c) 다당류 사슬 당 평균 0.2개 내지 3개의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG)를 갖는 다당류 사슬들을 특징으로 하는 다당류 제제.
  7. 제6항에 있어서, 다당류 사슬 당 평균 1개 이하의 글리콜 분할된 우론산 잔기(UG)를 갖는, 제제.
  8. (a) 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량과,
    (b) 각각 50 IU/mg 미만의 anti-Xa 활성 및 anti-IIa 활성과,
    (c) 40% 초과의 U2SHNS ,6S 이당류 잔기를 갖는 다당류 사슬들을 특징으로 하는 다당류 제제를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 70% 초과의 U2SHNS ,6S 이당류 잔기를 갖는 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 탈황산화(desulfation) 정도가 40% 미만인 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 탈황산화 정도가 30% 미만인 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 탈황산화 정도가 10% 미만인 조성물.
  13. 실제적인 항응고 활성이 부족한 다당류 제제를 포함하는 조성물로서,
    상기 제제는 본질적으로 하기 화학식 I의 다당류로 구성되는, 조성물.
    화학식 I
    Figure pct00012

    상기 화학식 I에서, U는 우론산 잔기를 가리키고, H는 헥소사민 잔기를 가리키며;
    m과 n은 정수로서,
    m = 4-16이고,
    n = 1-4이고;
    w = -2OS 또는 -2OH 이고;
    x = -NS 또는 -NAc 이고;
    y = -3OS 또는 -3OH 이고;
    z = -6OS 또는 -6OH 이고;
    UG =
    Figure pct00013
    이고;
    기호 "∼"는 m과 n으로 표시된 단위들이 다당류 사슬을 따라 분포되되 반드시 순차적인 것은 아님을 가리키며, w, x, y 및 z 각각은 m으로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하고, x, y 및 z 각각은 n으로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하다.
  14. 중량 평균사슬분자량이 3,500 내지 7,000 Da이고 감소된 항응고 활성을 갖는 다당류 제제를 포함하는 조성물로서,
    상기 제제는 하기 화학식 I의 다당류를 포함하는, 조성물.
    화학식 I
    Figure pct00014

    상기 화학식 I에서, U는 우론산 잔기를 가리키고, H는 헥소사민 잔기를 가리키며;
    m과 n은 정수로서,
    m = 4-16이고,
    n = 1-4이고;
    w = -2OS 또는 -2OH 이고;
    x = -NS 또는 -NAc 이고;
    y = -3OS 또는 -3OH 이고;
    z = -6OS 또는 -6OH 이고;
    UG =
    Figure pct00015
    이고;
    기호 "∼"는 m과 n으로 표시된 단위들이 다당류 사슬을 따라 분포되되 반드시 순차적인 것은 아님을 가리키며, w, x, y 및 z 각각은 m으로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하고, x, y 및 z 각각은 n으로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하다.
  15. 다당류 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 제제로서,
    조성물은 실제적인 항응고 활성이 부족하고, 항전이 활성을 가지며, 본질적으로는 하기 화학식 II의 다당류로 구성되는, 제제.
    화학식 II
    Figure pct00016

    상기 화학식 II에서, U는 우론산 잔기를 가리키고, H는 헥소사민 잔기를 가리키며;
    m-r은 정수로서:
    m = 0-10;
    n = 0-3;
    o = 0-10;
    p = 0-3;
    q = 0-10 이고;
    w = -2OS 또는 -2OH 이고;
    x = -NS 또는 -NAc 이고;
    y = -3OS 또는 -3OH 이고;
    z = -6OS 또는 -6OH 이고;
    UG =
    Figure pct00017
    이고;
    w, x, y 및 z 각각은 m, n, o, p 또는 q로 표시된 각 단위에서 동일하거나 상이하다.
  16. 제15항에 있어서, (n+p)가 3 이하인, 제제.
  17. 제15항에 있어서, 3,500 내지 7,000 Da의 중량 평균사슬분자량을 갖는, 제제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 내 다당류 사슬의 비환원말단 우론산이 4,5-불포화기(unsaturation)를 갖는, 조성물 또는 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물 내 비환원 우론산의 약 30%가 4,5-불포화기를 갖는, 조성물 또는 제제.
  20. 제18항에 있어서, 4,5-불포화기는 헤파리나제 분해(heparinase digestion) 또는 벤질의 에스테르화 반응과 잇따르는 베타-제거 반응의 결과인, 조성물 또는 제제.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환원말단이 2,5-안히드로만니톨(anhydromannitol) 잔기를 추가로 포함하는, 조성물 또는 제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 환원말단의 약 50%가 2,5-안히드로만니톨 잔기를 포함하는, 조성물 또는 제제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적 조성물인, 조성물 또는 제제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제의 올리고당의 10 내지 50%가 3000 Da 미만의 분자량을 갖고; 올리고당의 40 내지 65%가 3000 내지 8000 Da의 분자량을 갖고; 올리고당의 5 내지 30%가 8000 Da 초과의 분자량을 갖는, 조성물 또는 제제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다당류는
    UFH를 해중합시켜 해중합된 헤파린을 생성하는 단계와,
    해중합 반응 이후, 해중합된 헤파린에 글리콜 분할 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 조성물 또는 제제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 글리콜 분할 단계는
    해중합된 헤파린을 과요오드산염으로 산화시키는 단계와,
    산화 및 해중합된 헤파린을 수소화붕소 나트륨으로 환원시키는 단계를 포함하는, 조성물 또는 제제.
  27. 전이성 질환, VEGF- FGF-, SDF-1α- 및/또는 셀렉틴-매개 질환; 염증성 질환, 감염성 질환, 자가면역성 질환, 섬유화증 또는 환자에서의 혈관생성에 관련된 질환의 치료 방법으로서,
    제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 조성물 또는 제제를 장기적으로 투여하는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 질환이 암인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 암이 유방암, 결장암 또는 전립선암인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 조성물 또는 제제를 수술, 방사선요법, 화학요법제, 항체 또는 타이로신키나제 억제제와 병용으로 투여하는, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 조성물 또는 제제를 5 내지 50 mg/kg의 용량으로 환자에게 투여하는, 방법.
  33. (1) 고분자량 헤파린(Unfractionated heparin, UFH)을 아질산(HONO)으로 해중합시켜 다당류 제제를 수득하는 단계와,
    (2) 상기 다당류 제제를 과요오드산염으로 산화시키는 단계와,
    (3) 상기 산화된 다당류 제제를 수소화붕소 나트륨으로 환원시키는 단계와,
    (4) 상기 다당류 제제를 분리하여 LMWH 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 제제의 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 해중합 단계는 약 10 내지 30℃의 온도와 약 2 내지 4의 pH에서 약 1 내지 5 시간 동안 상기 UFH를 약 0.02 내지 0.04M 아질산으로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 산화 단계는 약 0 내지 10℃의 온도에서 약 10 내지 20 시간 동안 상기 다당류 제제를 약 0.05 내지 0.2M 과요오드산염으로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 환원 단계는, 상기 산화된 다당류 제제를 약 0 내지 10℃의 온도와 약 6.0 내지 7.0의 pH에서 약 0.5 내지 1.5 시간 동안 약 0.5 내지 2.0%(w/v)의 수소화붕소 나트륨으로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
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