KR20100071964A - 균막의 면역 치료 - Google Patents

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스튜어트 제프리 대쉬퍼
에릭 찰스 레이놀즈
파울 데이비드 베쓰
칭 셍 앙
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오럴 헬스 오스트레일리아 피티와이 엘티디
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Abstract

본 발명은 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 면역반응 증진용 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 AAQ65462, AAQ65742, AAQ66991, AAQ65561, AAQ66831, AAQ66797, AAQ66469, AAQ66587, AAQ66654, AAQ66977, AAQ65797, AAQ65867, AAQ65868, AAQ65416, AAQ65449, AAQ66051, AAQ66377, AAQ66444, AAQ66538, AAQ67117 및 AAQ67118로 구성되는 그룹에서 선별되는 등록번호에 상응하는 폴리펩티드 중 어느 하나와 적어도 50개 아미노산이 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 이의 항원성 또는 면역원성 부위를 면역반응을 증가시키는데 유효한 양으로 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 P. 진지발리스 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

Description

균막의 면역 치료{IMMUNOLOGY TREATMENT FOR BIOFILMS}
본 발명은 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)와 같은 박테리아 균막의 형성 및/또는 발달을 예방 또는 변형하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 균막 형성 및/또는 발달을 조절하기 위하여, 균막으로의 또는 헴-제한적인 성장을 조절하는 폴리펩티드의 용도 및 억제에 관한 것이다. 본 발명은 항균성 백신 또는 면역치료/면역예방에 사용할 수 있는 폴리펩티드의 동정에 관한 것이다.
많은 박테리아 치료는 플랑크톤 단계의 박테리아를 대상으로 한다. 그러나 박테리아 병리학은 균막 단계의 박테리아도 포함한다. 예를 들면, 포르피노모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)는 만성 치주질환의 주된 병원체로 간주되었다. 상기 질병과 연관된 조직 손상은 치아 표면에서 복합균 박테리아 균막의 일부로서 성장하는 P. 진지발리스(P. gingivalis)에 대한 숙주의 면역반응의 조절 이상으로부터 야기된다. 박테리아 균막은 자연에서 흔하며, 박테리아 사이 및/또는 표면 또는 접점에 부착된, 매트릭스에 둘러싸인 박테리아 개체군으로서 정의된다(1). 상기 고착성 박테리아 세포는 표면에 부착하여 항균제의 노출, 전단력 및 영양소 부족을 포함할 수 있는 극한환경에서 살아남을 수 있는 성숙한 균막으로 성장한다.
질병통제예방센터는 인간 박테리아 감염의 65%가 균막을 포함하는 것으로 추정한다. 균막은 종종 박테리아를 면역계로부터 방어, 항생제 효능의 감소 및 재감염을 용이하게 하는 플랑크톤 세포의 먼거리 분산을 통해 면역계로부터 박테리아를 방어함으로써 만성 감염의 치료를 어렵게 한다(2,3). 치태는 치아 표면에서 자라는 이종 복합균 균막에서 종 다양성이 높은 박테리아 균막의 전형적인 예시이다. 치아 표면은 인체에서 단단하고, 영구적이며, 털갈이를 하지 않는 유일한 표면으로서 고유한 미생물 서식지이다. 이는 표피세포의 털갈이가 균막의 발달을 제한하는 것과 대조적으로 긴 시간의 기간 동안 박테리아 균막의 단단한 부착을 가능하게 한다. 그러므로 플랑크톤 및 균막 단계 사이에 일어나는 P. 진지발리스 프로테옴의 변화는 우리가 만성 치주질환의 진행을 이해하는데 매우 중요하다.
P. 진지발리스는 동물 모델에서 침습성을 나타내지 않는 것으로 기재된 381 및 ATCC 33277을 포함하는 균주에 반해 침습성을 나타내는 것으로 기재된 W50 및 W83을 포함하는 균주의 두 가지 일반적 균주 그룹으로 분류되었다(4,5). Cutler et al .,(7)이 P. 진지발리스 가 비침습성 균주에 비하여 식세포작용에 대한 저항성을 가지는 것을 밝혔음에도 불구하고, Griffen et al .,(6)은 W83/W50-유사 균주가 381-유사 균주를 포함하는 다른 P. 진지발리스 균주보다 인간 치주질환에 연관된 것을 발견하였다. P. 진지발리스 W83 균주를 ATCC 33277 균주 형태에 순차적으로 비교하였을 때, 33277 균주에서 7%의 유전자가 없거나 서로 다른 것으로 나타났는데, 이는 상기 균주 사이에 상당한 차이가 있음을 가리킨다(8). 흥미롭게도 P. 진지발리스 균주 W50은 33277 균주가 균막을 쉽게 형성하는 것과 대조적으로 대부분에 환경에서 균막을 잘 형성하지 못한다(9). 상기 연관된 몇몇의 연구의 결과로서 P. 진지발리스 W50에 의한 균막 형성을 대상으로 하였다.
정량적인 프로테옴 연구는 겔 염색 세기에 기초하여 단백질 비율을 측정하는 2D 겔 전기영동 접근법을 사용하여 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 같은 인간 박테리아 병원체의 프로테옴 변화를 결정하는데 사용되었다(10-12). 하나의 대안은 ICAT, iTRAQ 또는 중수(H2 18O)와 같은 안정적 동위원소 표지 기술과 MS 정량을 사용하는 것이다(13). H2 18O 표지는 결과물 펩티드의 C-말단에 18O 원자 두 개를 통합하는 것으로 알려진 트립신과 같은 단백질 가수분해 엔도펩티다아제 처리를 전제로 한다(14,15). 또한, 상대적 단백질 풍부량의 결정에서 사용되는 것에 추가로(16-19), 프로테오믹스에서 8O 표지는 단백질의 C-말단의 선별, 글리칸의 효소적 제거 이후 N-결합 글리코실화의 선별, MS/MS 데이터 해석의 단순화 및 가장 최근에는 인산화 부위의 검증에도 사용되었다(20-23). 상기 상대적 단백질 풍부량을 측정하기 위한 16O/18O 단백질 분해성 표지 방법은 H2 16O에 포함된 한 샘플 및 H2 16O에 포함된 다른 샘플을 절단하는 것을 포함한다. 상기 절단물은 LC MS/MS를 통해 분석하기 전에 조합된다. LC 컬럼에서 용출한 펩티드는 MS 방법에서 펩티드 이온쌍의 상대적 신호 세기를 측정함으로써 정량할 수 있다. 두 개의 18O 원자의 트립신에 의해 절단된 펩티드의 C-말단 통합은 동위원소 쌍의 선별을 가능케하는 +4 m/z의 질량 변화를 야기한다.
프로테옴의 복합성 때문에, 분류 단계는 펩티드 및 단백질의 선별의 수를 증가시키는데 유리하다. 대부분의 분류 단계는 용액 내 절단 이후 펩티드 수준에서 2D LC 접근을 포함한다(24,25). 그러나 단백질 용액의 초기 탈수 단계 동안의 샘플 손실로 인해 단백질 수준의 SDS PAGE 분류 이후 겔 절단 동안 16O/18O 표지도 성공적으로 수행되었다(26-29). 상기 16O/18O 단백질 분해성 표지는 매우 특이적이고 보편적인 방법론이지만, 몇몇의 대량 검증 연구에서만 수행되었다(30). 우수한 검증 연구가 Qian et al(18)에 의해 1:1 수행되었다.
혈청 단백질의 두 유사한 분취량을 1:1 비율로 표지하였고, 891 펩티드로부터 1.02±0.23의 평균 비율을 얻었다. Lane et al(26)의 더욱 최근의 연구는 나아가 대조군 및 사이토크롬 P450 유도자를 처리한 인간 종양으로 이종이식된 마우스사이에서 17 사이토크롬 P450 단백질의 상대적 풍부량을 결정하는데 역 표지 전략을 사용하여 16O/18O 방법의 타당성을 증명하였다.
Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., and Lappin- Scott, H. M. (1995) Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745. Cvitkovitch, D. G., Li, Y. H., and Ellen, R. P. (2003) J. Clin. Invest. 112(11 ), 1626- 1632. Cochrane, D. M., Brown, M. R., Anwar, H., Weller, P. H., Lam, K., and Costerton, J. W. (1988) J. Med. Microbiol. 27(4), 255-261. van Steenbergen, T. J., Kastelein, P., Touw, J. J., and de Graaff, J. (1982) J. Periodontal Res. 17(1 ), 41-49. Neiders, M. E., Chen, P. B., Suido, H., Reynolds, H. S., Zambon, J. J., Shlossman, M., and Genco, R. J. (1989) J. Periodontal Res. 24(3), 192-198. Griffen, A. L., Becker, M. R., Lyons, S. R., Moeschberger, M. L., and Leys, E. J. (1998) J. CHn. Microbiol. 36(11 ), 3239-3242. Cutler, C. W., Arnold, R. R., and Schenkein, H. A. (1993) J. Immunol. 151(12), 7016-7029. Chen, T., Hosogi, Y., Nishikawa, K., Abbey, K., Fleischmann, R. D., Walling, J., and Duncan, M. J. (2004) J. Bacteriol. 186(16), 5473-5479. Davey, M. E. (2006) Periodontol. 200042, 27-35. Orme, R., Douglas, C. W., Rimmer, S., and Webb, M. (2006) Proteomics 6(15), 4269-4277. Rathsam, C, Eaton, R. E., Simpson, C. L., Browne, G. V., Valova, V. A., Harty, D. W., and Jacques, N. A. (2005) J Proteome Res 4(6), 2161-2173. Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., and Davies, D. G. (2002) J. Bacteriol. 184(4), 1140-1154. Ong, S. E., and Mann, M. (2005) Nat. Chem. Biol. 1(5), 252-262. Bender, M. L., and Kemp, K. C. (1957) J. Am. Chem. Soc 79, 116. Schnolzer, M., Jedrzejewski, P., and Lehmann, W. D. (1996) Electrophoresis 17(5), 945-953. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., and Fenselau, C. (2001 ) Anal Chem 73(13), 2836-2842. Blonder, J., Hale, M. L., Chan, K. C, Yu, L. R., Lucas, D. A., Conrads, T. P., Zhou, M., Popoff, M. R., Issaq, H. J., Stiles, B. G., and Veenstra, T. D. (2005) J. Proteome Res 4(2), 523-531. Qian, W. J., Monroe, M. E., Liu, T., Jacobs, J. M., Anderson, G. A., Shen, Y., Moore, R. J., Anderson, D. J., Zhang, R., Calvano, S. E., Lowry, S. F., Xiao, W., Moldawer, L. L., Davis, R. W., Tompkins, R. G., Camp, D. G., 2nd, and Smith, R. D. (2005) MoI. Cell Proteomics 4(5), 700-709. Zang, L., Palmer Toy, D., Hancock, W. S., Sgroi, D. C, and Karger, B. L. (2004) J. Proteome Res. 3(3), 604-612. Kuster, B., and Mann, M. (1999) Anal. Chem. 71(7), 1431-1440. Takao, T., Hori, H., Okamoto, K., Harada, A., Kamachi, M., and Shimonishi, Y. (1991 ) Rapid Commun. Mass Spectrom. 5(7), 312-315. Shevchenko, A., Chemushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., WiIm, M., and Mann, M. (1997) Rapid Commun. Mass Spectrom. 11(9), 1015- 1024 . Gevaert, K., Staes, A., Van Damme, J., De Groot, S., Hugelier, K., Demol, H., Martens, L., Goethals, M., and Vandekerckhove, J. (2005) Proteomics 5(14), 3589-3599. Chen, X., Cushman, S. W., Pannell, L. K., and Hess, S. (2005) J. Proteome Res. 4(2), 570-577. Stockwin, L. H., Blonder, J., Bumke, M. A., Lucas, D. A., Chan, K. C, Conrads, T. P., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Newton, D. L., and Rybak, S. M. (2006) J. Proteome Res. 5(11), 2996-3007. Lane, C. S., Wang, Y., Betts, R., Griffiths, W. J., and Patterson, L. H. (2007) MoI. Cell Proteomics. Korbel, S., Schumann, M., Bittorf, T., and Krause, E. (2005) Rapid Comm. Mass Spectrom. 19(16), 2259-2271. Bantscheff, M., Dumpelfeld, B., and Kuster, B. (2004) Rapid Commun. Mass. Spectrom. 18(8), 869-876. Jia, J. Y., Lamer, S., Schumann, M., Schmidt, M. R., Krause, E., and Haucke, V. (2006) MoI. Cell Proteomics 5(11 ), 2060-2071. Miyagi, M., and Rao, K. C. (2007) Mass Spectrom. Rev 26(1), 121-136. Veith, P. D., Talbo, G. H., Slakeski, N., Dashper, S. G., Moore, C, Paolini, R. A., and Reynolds, E. C. (2002) Biochem. J. 363(Pt 1 ), 105-115. Qian, W. J., Liu, T., Monroe, M. E., Strittmatter, E. F., Jacobs, J. M., Kangas, L. J., Petritis, K., Camp, D. G., 2nd, and Smith, R. D. (2005) J. Proteome Res 4(1 ), 53-62. Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M., and Cottrell, J. S. (1999) Electrophoresis 20(18), 3551-3567. Xia, Q., Hendrickson, E. L., Zhang, Y., Wang, T., Taub, F., Moore, B. C, Porat, I., Whitman, W. B., Hackett, M., and Leigh, J. A. (2006) MoI. Cell Proteomics (5), 868-881. Quackenbush, J. (2001 ) Nat. Rev. Genet. 2(6), 418-427. Yu, C. S., Chen, Y. C, Lu, C. H., and Hwang, J. K. (2006) Proteins 64(3), 643- 651. Richardson, A. J., Calder, A. G., and Stewart, C. S. (1989) Letters in Applied Microbiology 9, 5-8. OToole, G. A., and Kolter, R. (1998) MoI Microbiol 28(3), 449-461. Capestany, C. A., Kuboniwa, M., Jung, I. Y., Park, Y., Tribble, G. D., and Lamont, R. J. (2006) Infect. Immun. 74(5), 3002-3005. Lopez-Ferrer, D., Ramos-Fernandez, A., Martinez-Bartolome, S., Garcia-Ruiz, P., and Vazquez, J. (2006) Proteomics 6 Suppl 1 , S4-S11. Staes, A., Demol, H., Van Damme, J., Martens, L., Vandekerckhove, J., and Gevaert, K. (2004) J Proteome Res 3(4), 786-791. Patwardhan, A. J., Strittmatter, E. F., Camp, D. G., 2nd, Smith, R. D., and Pallavicini, M. G. (2006) Proteomics 6(9), 2903-2915. Smalley, J. W., Birss, A. J., McKee, A. S., and Marsh, P. D. (1993) J Gen Microbiol 139(9), 2145-2150. McKee, A. S., McDermid, A. S., Baskerville, A., Dowsett, A. B., Ellwood, D. C, and Marsh, P. D. (1986) Infect. Immun. 52(2), 349-355. Dashper, S. G., Butler, C. A., Lissel, J. P., Paolini, R. A., Hoffmann, B., Veith, P. D., O'Brien-Simpson, N. M., Snelgrove, S. L., Tsiros, J. T., and Reynolds, E. C. (2005) J. Biol. Chem. 280(30), 28095-28102. Li, J., Steen, H., and Gygi, S. P. (2003) MoI. Cell Proteomics 2(11 ), 1198-1204. Dashper, S. G., Brownfield, L., Slakeski, N., ZiIm, P. S., Rogers, A. H., and Reynolds, E. C. (2001 ) J. Bacteriol. 183(14), 4142-4148. Hoskisson, P. A., and Hobbs, G. (2005) Microbiology 151(Pt 10), 3153-3159. Piper, M. D., Daran-Lapujade, P., Bro, C, Regenberg, B., Knudsen, S., Nielsen, J., and Prank, J. T. (2002) J. Biol. Chem. 277(40), 37001-37008. Siroy, A., Cosette, P., Seyer, D., Lemaitre-Guillier, C, Vallenet, D., Van Dorsselaer, A., Boyer-Mariotte, S., Jouenne, T., and De, E. (2006) J.Proteome Res. 5(12), 3385-3398. Hood, B. L., Lucas, D. A., Kim, G., Chan, K. C, Blonder, J., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Conrads, T. P., Pollet, I., and Karsan, A. (2005) J Am Soc Mass Spectrom 16(8), 1221-1230. Yao, X., Afonso, C, and Fenselau, C. (2003) J Proteome Res 2(2), 147-152. Eckel-Passow, J. E., Oberg, A. L., Therneau, T. M., Mason, C. J., Mahoney, D. W., Johnson, K. L., Olson, J. E., and Bergen, H. R., 3rd. (2006) Bioinformatics 22(22), 2739-2745. Storms, H. F., van der Heijden, R., Tjaden, U. R., and van der Greef, J. (2006) Rapid Commun. Mass Spectrom. 20(23), 3491-3497. Zenobi, R., and Knochenmuss, R. (1998) Mass Spectrom. Rev. 17(5), 337-366. Seers, C. A., Siakeski, N., Veith, P. D., Nikolof, T., Chen, Y. Y., Dashper, S. G., and Reynolds, E. C. (2006) J. Bacteriol. 188(17), 6376-6386. Curtis, M. A., Kuramitsu, H. K., Lantz, M., Macrina, F. L., Nakayama, K., Potempa, J., Reynolds, E. C, and Aduse-Opoku, J. (1999) J. Periodontal Res. 34(8), 464-472. O'Brien-Simpson, N. M., Paolini, R. A., Hoffmann, B., Slakeski, N., Dashper, S. G., and Reynolds, E. C. (2001 ) Infect. Immun. 69(12), 7527-7534. O'Brien-Simpson, N. M., Veith, P. D., Dashper, S. G., and Reynolds, E. C. (2003) Curr. Protein Pept. Sci. 4(6), 409-426. Abe, N., Kadowaki, T., Okamoto, K., Nakayama, K., Ohishi, M., and Yamamoto, K. (1998) J. Biochem. (Tokyo) 123(2), 305-312. Potempa, J., Pike, R., and Travis, J. (1995) Infect. Immun. 63(4), 1176-1182. Pathirana, R. D., O'Brien-Simpson, N. M., Brammar, G. C, Slakeski, N., and Reynolds, E. C. (2007) Infect. Immun. 75(3), 1436-1442. Chen, Y. Y., Cross, K. J., Paolini, R. A., Fielding, J. E., Slakeski, N., and Reynolds, E. C. (2002) J. Biol. Chem. 277(26), 23433-23440. Zhang, Y., Wang, T., Chen, W., Yilmaz, O., Park, Y., Jung, I. Y., Hackett, M., and Lamont, R. J. (2005) Proteomics 5(1 ), 198-211. Sato, K., Sakai, E., Veith, P. D., Shoji, M., Kikuchi, Y., Yukitake, H., Ohara, N., Naito, M., Okamoto, K., Reynolds, E. C, and Nakayama, K. (2005) J. Biol. Chem. 280(10), 8668-8677. Nguyen, K. A., Travis, J., and Potempa, J. (2007) J. Bacteriol. 189(3), 833-843. Dashper, S. G., Cross, K. J., Slakeski, N., Lissel, P., Aulakh, P., Moore, C, and Reynolds, E. C. (2004) Oral Microbiol. Immunol. 19(1 ), 50-56. Lewis, J. P., Dawson, J. A., Hannis, J. C, Muddiman, D., and Macrina, F. L. (1999) J. Bacteriol. 181(16), 4905-4913. Shi, Y., Ratnayake, D. B., Okamoto, K., Abe, N., Yamamoto, K., and Nakayama, K. (1999) J. Biol. Chem. 274(25), 17955-17960 . Sroka, A., Sztukowska, M., Potempa, J., Travis, J., and Genco, C. A. (2001) J. Bacteriol. 183(19), 5609-5616. Simpson, W., Olczak, T., and Genco, C. A. (2000) J Bacteriol 182(20), 5737- 5748. Lewis, J. P., Plata, K., Yu, F., Rosato, A., and Anaya, C. (2006) Microbiology 152(Pt 11), 3367-3382. Olczak, T., Siudeja, K., and Olczak, M. (2006) Protein Expr. Purif. 49(2), 299-306. Olczak, T., Simpson, W., Liu, X., and Genco, C. A. (2005) FEMS Microbiol. Rev. 29(1), 119-144. Veith, P. D., Chen, Y. Y., and Reynolds, E. C. (2004) Infect. Immun. 72(6), 3655- 3657. Shibata, Y., Hiratsuka, K., Hayakawa, M., Shiroza, T., Takiguchi, H., Nagatsuka, Y., and Abiko, Y. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300(2), 351-356. Tatusov, R. L., Fedorova, N. D., Jackson, J. D., Jacobs, A. R., Kiryutin, B., Koonin, E. V., Krylov, D. M., Mazumder, R., Mekhedov, S. L., Nikolskaya, A. N., Rao, B. S., Smirnov, S., Sverdlov, A. V., Vasudevan, S., Wolf, Y. I., Yin, J. J., and Natale, D. A. (2003) BMC Bioinformatics 4, 41. Ratnayake, D. B., Wai, S. N., Shi, Y., Amako, K., Nakayama, H., and Nakayama, K. (2000) Microbiology 146 1119-1127. Smalley, J. W., Birss, A. J., McKee, A. S., and Marsh, P. D. (1991 ) FEMS Microbiol. Lett. 69(1 ), 63-67. Dashper, S. G., Hendtlass, A., Slakeski, N., Jackson, C, Cross, K. J., Brownfield, L., Hamilton, R., Barr, L, and Reynolds, E. C. (2000) J Bacteriol 182(22), 6456- 6462. Takahashi, N., Sato, T., and Yamada, T. (2000) J. Bacteriol. 182(17), 4704-4710. Takahashi, N., and Sato, T. (2001 ) J Dent Res 80(5), 1425-1429. Litwin, C. M., and Calderwood, S. B. (1993) Clin Microbiol Rev 6(2), 137-149. Gygi, S. P., Rochon, Y., Franza, B. R., and Aebersold, R. (1999) MoI. Cell Biol. 19(3), 1720-1730. Baughn, A. D., and Malamy, M. H. (2003) Microbiology 149(Pt 6), 1551-1558. Macy, J., Probst, I., and Gottschalk, G. (1975) J Bacteriol 123(2), 436-442. Baughn, A. D., and Malamy, M. H. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99(7), 4662- 4667. Mayrand, D., and McBride, B. C. (1980) Infect Immun 27(1 ), 44-50. Smith, M. A., Mendz, G. L., Jorgensen, M. A., and Hazell, S. L. (1999) lnt J Biochem Cell Biol 31(9), 961-975. Kroger, A., Geisler, V., Lemma, E., Theis, F., and Lenger, R. (1992) Archives of Microbiology 158(5), 311-314. Shah, H., and Williams, R. (1987) Current Microbiology 15, 241-246 Klein, R. A., Linstead, D. J., and Wheeler, M. V. (1975) Parasitology 71(1 ), 93- 107. Turrens, J. F. (1989) Biochem J 259(2), 363-368. Mendz, G. L., Hazell, S. L., and Srinivasan, S. (1995) Arch Biochem Biophys 321(1), 153-159. Mendz, G. L1 Meek, D. J., and Hazell, S. L (1998) J Membr Biol 165(1 ), 65-76. Mileni, M., MacMillan, F., Tziatzios, C, Zwicker, K., Haas, A. H., Mantele, W., Simon, J., and Lancaster, C. R. (2006) Biochem J 395(1 ), 191-201. Nealson, K., and D, S. (1994) Annual review of microbiology 48, 311-343. Sellars, M. J., Hall, S. J., and Kelly, D. J. (2002) J Bacterid 184(15), 4187-4196. OToole, G. A., Gibbs, K. A., Hager, P. W., Phibbs, P. V., Jr., and Kolter, R. (2000) J Bacteriol 182(2), 425-431. Whiteley, M., Bangera, M. G., Bumgamer, R. E., Parsek, M. R., Teitzel, G. M., Lory, S., and Greenberg, E. P. (2001) Nature 413(6858), 860-864. Romeo, T., Gong, M., Liu, M. Y., and Brun-Zinkernagel, A. M. (1993) J Bacteriol 175(15), 4744-4755. Sabnis, N. A., Yang, H., and Romeo, T. (1995) J Biol Chem 270(49), 29096- 29104. Mercante, J., Suzuki, K., Cheng, X., Babitzke, P., and Romeo, T. (2006) J Biol Chem 281(42), 31832-31842. Altier, C, Suyemoto, M., and Lawhon, S. D. (2000) Infect lmmun 68(12), 6790- 6797. Lawhon, S. D., Frye, J. G., Suyemoto, M., Porwollik, S., McClelland, M., and Altier, C. (2003) MoI Microbiol 48(6), 1633-1645. Hefford, M. A., D'Aoust, S., Cyr, T. D., Austin, J. W., Sanders, G., Kheradpir, E., and Kalmokoff, M. L. (2005) Can. J. Microbiol. 51(3), 197-208. Pancholi, V., and Fischetti, V. A. (1992) J. Exp. Med. 176(2), 415-426. Taylor, J. M., and Heinrichs, D. E. (2002) MoI. Microbiol. 43(6), 1603-1614. Maeda, K., Nagata, H., Yamamoto, Y., Tanaka, M., Tanaka, J., Minamino, N., and Shizukuishi, S. (2004) Infect, lmmun. 72(3), 1341-1348. Gustavsson, N., Diez, A., and Nystrom, T. (2002) MoI. Microbiol. 43(1 ), 107-117. Kvint, K., Nachin, L., Diez, A., and Nystrom, T. (2003) Curr. Opin. Microbiol. 6(2), 140-145. Kuramitsu, H. K., Chen, W., and Ikegami, A. (2005) J. Periodontol. 76(11 Suppl), 2047-2051.
본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 개체의 P. 진지발리스에 대한 면역반응을 효과적으로 증진시켜 개체의 P. 진지발리스에 대한 감염을 예방 또는 치료 효과를 나타냄으로써 P. 진지발리스에 의해 유발되는 치주질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1: 특이적 BSA 비율의 16O/18O 정량. 알려진 양의 BSA의 정량을 상기 방법이 실험적 절차의 균막 및 플랑크톤 샘플에 대해서도 평가 할 수 있는지 확인하기 위하여 같은 방법으로 수행하였다. 간략하면, 미리 결정된 양의 BSA를 NuPAGE 겔의 인접한 레인에 로딩한 후, 같은 사이즈의 밴드를 잘라내어 정방향 또는 역방향 단백질 분해성 표지한 다음, nanoHPLC 및 MALDI TOF-MS/MS를 수행하였다. (A) BSA의 트립신에 의해 생긴 펩티드의 MS 스펙트라인, RHPEYAVSVLLR의 알려진 16O:18O 표지 비율인 1:1(i), 2:1(ii), 1:5(iii) 및 10:1(iv)가 보여주는 16O 및 18O 표지된 펩티드의 특이적 이중 동위원소 바탕(S0, S2 및 S4는 상기 동위원소 피크에서 측정된 세기이다) (B) 정량 절차에서 사용된 알려진 BSA 비율의 SDS PAGE 겔.
도 2: P. 진지발리스 샘플의 전형적인 정방향 및 역방향 MS 및 MS/MS 스펙트라. (i, ii) [M+H]+PG2082에 속하는 정방향 및 역방향 표지된 펩티드 GNLQALVGR의 모 전구체 이온을 보여주는 것 및 1:1 비율을 보여주는 것의 질량 스펙트라의 확대 부위 (iii, iv) [M+H]+PG0232에 속하는 정방향 및 역방향 표지된 펩티드 YNANNVDLNR의 모 전구체 이온을 보여주는 것 및 2:1 비율에서 전형적인 4Da 질량 차이를 보여주는 것의 질량 스펙트럼 (v, vi) 모든 Y 이온에서 4 Da 쉬프트의 특징을 보이는 무겁게 표지(+2 18O)된 YNANNVDLNR 및 표지안된 YNANNVDLNR 펩티드의 MS/MS 스펙트럼.
도 3: 정방향/역방향 표지된 기술적 복제물의 상관관계. 각 생물학적 복제에 대한 정방향(Bio18, Plank16) 및 역방향(Plank18, Bio16) 표지의 펩티드 풍부량 비율의 Log10으로 변환된 분산형 그래프 비교. 상기 역방향 표지된 펩티드의 풍부량 비교는 직접적 비교를 위해 역방향으로 바꾸었다. (A) 생물학적 복제물 1 (B) 생물학적 복제물 2.
도 4: 생물학적 복제의 단백질 풍부량의 분포 및 상관관계. (A) 가우시안-유사 분포로 나타낸 각 생물학적 복제 모두에서 선별된 81개의 수량화 할 수 있는 단백질의 평준화된 평균 배수 차이. 각 단백질의 풍부량 비율은 나아가 0값(R 1) 및 1 보다 작은 비율로 평준화시킨 다음, 역방향으로 바꾸고 (1(1/R))로 측정하였다(18). 각 생물학적 복제물의 모든 81개의 수량화할 수 있는 단백질은 증가하는 비율(균막/플랑크톤)으로 분류되었고, 단백질의 같은 수로 6개 그룹으로 똑같이 나누었다. 그룹 C 및 D는 유의하게 조절되지 않는 단백질을 나타낸다(1.0에서 < 3 SD).(B)랭킹에 기초한 단백질의 분포. 삽입: 생물학적 복제 사이의 유사도의 결정에 대한 랭킹 표. 단백질은 둘 다의 생물학적 복제가 같은 그룹에 묶일 때 1개가 가장 높은 유사성을 가지고, 적어도 유사성을 가지는 6개를 감소하는 순에 따라 순위를 매겼다.
도 5: 하나 또는 둘 다의 생물학적 복제에서의 선별에 기초한 본 발명에서 선별된 116개 단백질의 분해. 둘 다의 생물학적 복제에서 선별된 단백질(81)은 표 2에 나타내었다. 범례는 단백질 당 선별된 고유한 펩티드의 번호를 보여준다.
발명의 요약
본 발명은 연속배양으로 증식하는 P. 진지발리스 W50 및 시간의 늘어난 기간 동안 연속배양장치 용기의 수직표면에서 발달된 성숙된 균막의 예시적 시스템의 참조로서 나타내었다. 최종 균막은 질병 진행의 조건 하에서 보여질 수 있는 균막과 유사하여, 균막 및 플랑크톤 세포 사이의 직접적인 비교가 가능하다. 역표지 전략을 이용한 16O/18O 단백질 분해성 표지는 P. 진지발리스 세포로 감싸진 분획의 SDS-PAGE 분류 후 선별 및 정량을 위한 오프-라인 LC MALDI TOF-MS/MS를 통해 수행되었다. 선별된 116개 단백질 중에서, 81개가 두 개의 독립적인 계속된 배양 연구로부터 일치되게 발견되었다. 다양한 기능의 47 단백질이 균막 조절 전략의 잠재적 표적을 제공하는 균막 세포에서의 풍부량이 일치하게 증가하거나 감소되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 상기 47개 단백질 중 24개 단백질을 P. 진지발리스 감염의 치료 및/또는 예방의 표적으로서 특히 유용한 것으로 선별하였다.
따라서, 본 발명의 첫번 째 측면은 균막 형성을 조절하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 하나의 형태에서, 상기 균막의 미생물은 박테리아이다. 하나의 형태에서, 상기 박테리아는 포르피노모나스 속으로부터 유래한다. 하나의 구체적인 실시예에서, 상기 박테리아는 P. 진지발리스이고, 상기 폴리펩티드는 표 4에 나열된 등록번호(accession number)에 상응하는 서열로 구성되는 그룹으로부터 선별된 어느 하나의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명은 상기 서열과 적어도 80% 동일한 서열, 바람직하게는 상기 서열과 85% , 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 등록번호 AAQ65742(version 0.1)에 상응하는 폴리펩티드 및 그와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 적어도 표 4에 나열된 등록번호에 상응하는 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
본 발명의 한 측면은 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 직접적 면역반응을 증진시키기 위한 조성물이고, 상기 조성물은 본 발명의 첫번 째 측면의 폴리펩티드 중 적어도 하나, 또는 그의 항원성 또는 면역원성 부위의 유효량을 포함하는 조성물이다. 상기 조성물은 보조제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 선택적으로 포함할 수 있다. 그래서 상기 조성물은 전장 폴리펩티드 대신에 폴리펩티드의 항원성 부위를 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 부위는 표 4에 나열된 서열에 상응하고 면역학적 반응을 일으키는 폴리펩티드와 적어도 10개, 보다 일반적으로 20개 내지 50개 아미노산이 동일할 것이다. 바람직한 형태로써, 상기 조성물은 백신이다.
또한, 본 발명은 AAQ65462, AAQ65742, AAQ66991, AAQ65561, AAQ66831, AAQ66797, AAQ66469, AAQ66587, AAQ66654, AAQ66977, AAQ65797, AAQ65867, AAQ65868, AAQ65416, AAQ65449, AAQ66051, AAQ66377, AAQ66444, AAQ66538, AAQ67117 및 AAQ67118로 구성되는 군으로부터 선택되는 등록번호에 상응하는 폴리펩티드들 중 적어도 어느 하나의 항원성 또는 면역원성 부위의 면역반응을 증가시키는데 유효한 양을 포함하는 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 면역반응을 증진시키는 조성물을 제공한다.
다른 구체적인 실시예에서, AAQ65462, AAQ66991, AAQ65561 및 AAQ66831로 구성되는 군으로부터 선택되는 등록번호에 상응하는 폴리펩티드들 중 적어도 어느 하나를 유효한 양으로 포함하는 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 직접적 면역반응 증진용 조성물을 제공한다.
다른 구체적인 실시예에서, 등록번호 AAQ65742에 상응하는 폴리펩티드를 유효량으로 하는 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 직접적 면역반응 증진용 조성물을 제공한다.
다른 구체적인 실시예에서, P. 진지발리스에 의해 발현되는 폴리펩티드와 적어도 50개 아미노산이 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며 CELLO 프로그램을 통해 세포외의 것으로 예측되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 면역반응을 증진시키는데 유효한 양으로 포함하는, 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 면역반응 증진용 조성물을 제공한다.
다른 구체적인 실시예에서, 마우스 또는 토끼에서 면역반응을 유발하는 폴리펩티드의 적어도 50개 아미노산과 실질적으로 동일하게 선별된 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 폴리펩티드를 면역반응을 증가시키는데 유효한 양으로 포함하는 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 면역반응 증진용 조성물을 제공한다.
하나의 구체적인 실시예에서, 표 4에 나열된 등록번호에 상응하는 서열 중 하나의 인접한 아미노산 서열과 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산이 실질적으로 동일한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 선별된 항원성 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구체적인 실시예에서 유효한 양의 본 발명의 첫번 째 측면의 적어도 하나의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 치주질환 치료용 조성물이다.
다른 구체적인 실시예에서 유효한 양의 본 발명의 첫번 째 측면의 적어도 하나의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 P. 진지발리스 감염의 치료용 조성물이다.
본 발명의 다른 측면에서 본 발명에서 상술한 바에 따라 상기 조성물을 개체로 투여하는 단계를 포함하는 개체의 치주질환 예방 또는 치료 방법이다.
본 발명의 다른 측면에서 본 발명에서 상술한 바에 따라 상기 조성물을 개체로 투여하는 단계를 포함하는 개체의 P. 진지발리스 감염의 예방 또는 치료 방법이다.
본 발명의 다른 측면에서 P. 진지발리스 감염의 치료를 위한 약제의 제조에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 용도이다.
본 발명의 다른 측면에서 치주질환의 치료를 위한 약제의 제조에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 용도이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 첫번 째 측면의 폴리펩티드에 의해 증진된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체는 표 4에 나열된 등록번호에 상응하는 폴리펩티드 중 어느 하나에 대하여 특이적으로 표적된다. 상기 항체는 상술한 면역반응을 증진시키는 조성물로 사용될 수 있다.
하나의 구체적인 실시예에서, AAQ65462, AAQ66991, AAQ65561 및 AAQ66831로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 등록번호에 상응하는 폴리펩티드에 대하여 증진된 항체를 제공한다.
하나의 구체적인 실시예에서, 등록번호 AAQ65742에 상응하는 폴리펩티드에 대하여 증진된 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 첫번 째 측면의 P. 진지발리스의 감염을 억제하는 P. 진지발리스 폴리펩티드의 길항제 또는 길항제들의 조합 및, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물이다. 상기 길항제는 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 치주질환의 예방 또는 치료에 유용한 약제의 제조에서 길항제 또는, 길항제들의 조합의 용도를 포함한다.
본 발명의 나아간 측면에서 상술한 바와 같이 균막 형성을 조절하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 부위에 상보적인 이중 나선 부위의 가닥 중 하나인 각 가닥에서 적어도 19개의 염기쌍의 이중 나선 부위를 포함하는 간섭 RNA 분자를 제공한다. 하나의 구체적인 실시예에서, 상기 가닥 중 하나는 표 4에 나열된 서열의 폴리펩티드 전사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 부위에 상보적이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 치주질환의 예방적 치료를 포함하는 개체의 치료 방법을 제공한다. 간단한 잇몸 염증으로부터 심각한 질병에 이르는 치주질환 범위는 치아를 지지하는 연조직 및 뼈에서 주된 손상을 야기한다. 치주질환은 치은염 및 치주염을 포함한다. 잇몸 가장자리에서 구강 박테리아의 축적은 '치은염'이라고 불리는 잇몸의 염증을 유발한다. 치은염에서, 잇몸이 붉게 부어오르게 되고, 쉽게 피가 날 수 있다. 치은염을 치료하지 않았을 때, '치주염'('치아 주변의 염증'을 의미)으로 발달될 수 있다. 치주염에서, 잇몸은 치아에서 떨어져나와 감염된 '포켓s'을 형성한다. 치주염은 주된 병인체로서 P. 진지발리스에 특이적인 박테리아 병인학을 가진다. 신체의 면역계는 박테리아의 치태 확산 및 잇몸선 아래의 성장과 싸운다. 치료되지 않는다면, 치아를 지지하는 뼈, 잇몸 및 결합 조직이 파괴된다. 결과적으로 치아가 손실되거나 제거해야만 하게 될 것이다.
본 발명자들은 프로테오믹스 전략을 사용하여 균막 및 플랑크톤 단계 사이에 풍부량이 변하는 P. 진지발리스 116개의 세포막 단백질을 주된 단백질의 다중 펩티드 히트를 선별함으로써 선별 및 정량하였다. 본 발명자들은 RgpA, HagA, CPG70 및 PG99을 포함하는 세포-표면에 위치하는 C-말단 도메인 패밀리 단백질의 다량의 그룹의 증가된 발현을 입증하였다. 수송 관련 단백질(HmuY 및 IhtB), 대사효소(FrdA 및 FrdB), 면역원성 단백질 및 아직 기능이 알려지지 않은 다수의 단백질을 포함하는 다른 단백질의 풍부량의 유의한 변화가 존재했다.
당업자라면 균막 및 플랑크톤 단계 사이에서의 풍부량의 변화를 가지는 것으로서 분리된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 만들기 위한 변경을 잘 이해할 것이다. 상기 변경은 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다. 상기 변경된 폴리펩티드는 자연발생된 것(이는 천연 소스로부터 정제되거나 분리된 것을 말한다)이거나 합성된 것(예를 들면, 암호화하는 DNA에서 부위-특이적 돌연변이를 통해서)일 수 있다. 서열 목록의 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 변경된 폴리펩티드가 본 발명의 범주에 속할 것이다. 또한, 상기 변경된 폴리펩티드에 의해 증진된 항체는 표 4에 나열된 접근 번호에 대한 서열 중 하나를 가지는 폴리펩티드에 결합할 것이다.
반면 통상적 치환의 개념은 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이나, 확실한 이해를 위해 보존적 치환을 하기에 설정하였다.
Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met;
Asp, Glu, Ser;
Asn, Gln;
Ser, Thr;
Lys, Arg, His;
Phe, Tyr, Trp, His; 및,
Pro, Nα-알킬아미노산.
본 발명의 실시에서 달리 설명되지 않은 한, 당업자에게 자명한 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적 기술이 사용될 것이다. 상기 기술은 J. Perbal, 분자 클로닝의 실시 가이드, John Wiley 및 Sons(1984), J. Sambrook et 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989), T. A. Brown(편집자), 필수 분자 생물학: 실시적 접근, Volumes 1 및 2, IRL Press(1991), D. M. Glover 및 B. D. Hames(편집자), DNA 클로닝: 실시적 접근, Volumes 1-4, IRL Press(1995 및 1996), 및 F. M. Ausubel et al .,(편집자), 분자 생물학의 최신 프로토콜, Greene Pub. Associates 및 Wiley-Interscience(1988, 최근의 모든 개정판을 포함함)과 같은 근원의 문헌을 통해 기술 및 설명되었다. 상기 문헌의 내용은 본 발명에 참조로서 통합된다.
본 발명에서 사용된 '분리된 폴리펩티드'는 자연적으로 생겨난 다른 단백질, 지질 및 핵산으로부터 분리되거나 인공적으로 합성된 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 또한, 바람직하게는 상기 펩티드는 이를 정제하기 위해 사용된 예를 들면, 항체 또는 겔 매트릭스, 예를 들면, 폴리아크릴아마이드의 물질로부터 분리될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 정제된 표본의 건조 중량의 적어도 10%, 20%, 50%, 70%, 및 80%를 구성한다. 바람직하게는 상기 표본은 단백질 서열분석에 필요한 폴리펩티드의 충분한 양을 포함한다(예를 들어, 적어도 1,10, 또는 100 mg).
본 발명에서 서술한 분리된 폴리펩티드는 컬럼 크로마토그래피(이온 교환 마트리스, 소수성 마트리스 등과 같은 단백질 산물과 결합하는 다양한 마트리스를 사용한), 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 상기 단백질에 결합하는 다른 리간드를 사용한 친화성 크로마토그래피와 같은 표준 기술을 통해 정제될 수 있다.
상기 용어 '펩티드, 단백질, 및 폴리펩티드'는 본 명세서에서 서로 교체가능하게 쓰인다. 본 발명의 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법은 당업자에게 자명하다.
본 명세서에서 사용된 '항원성 폴리펩티드'는 탐지가능한 항원-항체 복합체를 형성하기 위하여 충분히 높은 친화성을 가지고 결합하는 특이적 항체에 결합하는 능력을 가지는 폴리펩티드, 이의 유사체 또는 절편과 같은 모이어티이다. 바람직하게는, 상기 항원성 폴리펩티드는 숙주 동물의 체액성 및/또는 세포성 면역반응을 회피할 수 있는 능력을 가지는 면역원성 구성 성분을 포함한다.
폴리펩티드 서열을 비교하는 것에 있어서, '실질적으로 동일한'은 95% 또는 그 이상으로 그의 길이가 동일하거나 모든 10개의 인접한 아미노산이 동일한 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 '인접한 아미노산 서열'은 아미노산이 연속하여 연장된 것을 지칭한다.
'재조합 폴리펩티드'는 재조합 DNA 기술의 이용을 포함하는 단계에 의해 생성된 폴리펩티드이다.
치주질환을 '예방하는 것'은 질병 조건의 발달을 억제하는 것을 의미하지만, 상기 질병의 영구적이고 완벽한 예방을 필요로하지는 않는다.
두 개의 아미노산 서열이 특이적 백분율 제한에 포함되는지 여부를 결정하는 데 있어서, 당업자라면 나란히 비교 또는 서열의 멀티플 배열을 처리하는 것의 필요성을 알아챌 것이다. 비교 또는 배열에서, 차이는 비-동일한 잔기의 위치, 상기 배열을 수행하는데 사용한 알고리즘에 따라 증가할 것이다. 본 발명의 내용에서, 두 개 또는 그 이상의 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 유사성의 백분율은 모든 표준 알고리즘을 사용하여 결정한 상기 서열 사이의 동일한 및 유사한 수를 각각 지칭하는데 쓰일 것이고, 이는 당업자에게 자명하다. 예를 들면, 아미노산 서열의 정체성 또는 유사성은 GAP 프로그램을 사용하여 측정될 수 있고 및/또는 Computer Genetics Groups, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America(Devereaux et al ., 1984)의 PILEUP 프로그램을 사용하여 배열될 수 있다. 상기 GAP 프로그램은 동일한/유사한 잔기의 수를 최대화하고, 배열에서 서열 갭의 숫자 및 길이를 최소화하기 위해 Needleman 및 Wunsch(1970)의 알고리즘을 사용한다. 대안적으로 또는 추가로, 두 개 이상의 아미노산 서열이 비교될 때 Thompson et al,(1994)의 Clustal W 프로그램이 사용되었다.
또한, 본 발명은 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 직접적인 면역반응을 증진시키기 위한 용도의 백신 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 본 발명의 첫번 째 측면의 적어도 하나의 폴리펩티드의 면역학적으로 유효한 양 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 P. 진지발리스에 대한 방어 반응을 부여하기 위하여 사용될 수 있는 적어도 하나의 항원을 포함하는 항원성 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 치료의 대상이 되는 개체는 인간, 양, 소, 말, 소과, 돼지, 가금류, 개 및 고양이로부터 선별될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. P. 진지발리스에 대한 직접적 면역반응은 특이적 항원성 폴리펩티드에 대한 숙주의 세포성 및/또는 항체-매개 반응의 발달에 있어서 상기 반응이 완전히 방어적인지 여부에 따라 개체 내에서 달성된다.
상기 백신 조성물은 바람직하게는 P. 진지발리스에 대한 면역을 유도하여 치주질환의 심각성을 예방, 억제 또는 감소시키기 위하여 개체 내로 투여된다. 또한, 상기 백신 조성물은 적어도 일부에서 P. 진지발리스에 의해 야기된 치주질환을 치료하기 위하여 개체로 투여된다. 본 명세서에서 사용한 상기 용어 '유효한 양'은 P. 진지발리스에 대한 면역반응을 끌어내기에 충분한 투여량을 의미한다. 이는 개체 및 P. 진지발리스 감염의 수준에 따라 매우 의존적이며, 과학자, 의사 또는 수의사에 의해 궁극적으로 결정될 것이다.
본 발명의 조성물은 인간 또는 동물에 투여하기에 적합한 희석제 및/또는 보조제와 같은 약학적으로 허용가능한 적절한 담체를 포함한다. 면역반응을 증진시키기 위한 조성물은 바람직하게는 구강 또는 비강 스프레이 또는, 주입에 의한 전달에 적합한 보조제를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 적절한 벡터에 통합되고 상기 벡터를 포함하는 적합한 형질전환된 숙주(eg. E. coli , Bacillus subtilis , Saccharomyces cerevisiae, COS 세포, CHO 세포 및 HeLa 세포)에서 발현되는 본 발명의 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산 서열에 기초한 것일 수 있다. 상기 조성물은 본 발명에서 나타난 바와 같은 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있고 또는 본 발명에서 기술된 아미노산 서열로 화학적으로 합성될 수 있다. 추가로, 본 발명에 따라 상기 항원성 폴리펩티드는 P. 진지발리스에 의해 야기되는 치주질환 및 감염에 대한 수동적 면역요법에 유용한 P. 진지발리스 항혈청을 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
다양한 보조제가 백신 제형 및 면역반응을 증진시키는 제형과 함께 일반적으로 사용되는 것은 당업자에게 자명하다. 상기 보조제는 백신 항원의 소량 또는 상기 백신 항원을 혼자 투여한 경우보다 더 적은 양을 사용하여 면역반응을 조절하고 더욱 지속적이고 높은 수준의 면역을 얻기 위한 목적이다. 보조제의 예시는 불완전 프런드 보조제(IFA), 보조제 65(피넛 오일, 만니드 모노올레산 및 알루미늄 모노스테르산을 포함하는), 오일 유화제, 리비 보조제, 플로토닉 폴리올, 폴리아민(polyamine), 아브기딘(Avridine), 퀼 A(Quil A), 사포닌(saponin), MPL, Qs21 및 알루미늄 염과 같은 미네랄 겔을 포함한다. 다른 예시는 SAF-1, SAF-0, MF59, Seppic ISA720과 같은 수중유(Oil in 물) 에멀젼 및, 다른 ISCOMs 및 ISCOM 매트릭스와 같은 특별한 보조제를 포함한다. 보조제의 다른 예시의 광범위하지만 완전한 목록은 Cox 및 Coulter 1992에 나열되어 있다[In: Wong WK(ed.) Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press et al ., 1992; 49-112]. 상기 보조제에 추가로 상기 백신은 통상적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 충전제, 완충액 또는 희석제를 적절하게 포함할 수 있다. 보조제를 함유하는 조성물의 하나 또는 그이상의 투여량은 치주질환을 예방하기 위하여 예방적으로 또는 이미 존재하는 치주질환을 치료하기 위하여 치료적으로 투여될 수 있다.
다른 바람직한 조성물의 표본은 점막 보조제와 조합되어 구강 또는 비강 루트를 통해 투여되는 것이다. 점막 보조제의 예시는 콜레라 톡신 및 이열성(heat labile) E. coli 독소, 상기 독소의 비독성 B 서브유니트, 독성이 감소된 상기 독소의 유전학적 돌연변이이다. 상기 항원성 폴리펩티드를 구강 또는 비강으로 투여하는데 사용할 수 있는 다른 방법은 상기 폴리펩티드를 장내 또는 비강에서 마이크로스피어의 흡수를 돕기 위하여 미세-캡슐화생분해성 중합체(아크릴산 또는 폴리에스테르와 같은) 입자로 결합시켜 상기 단백질의 분해를 방어하는 방법일 수 있다. 리포좀, ISCOMs, 하이드로겔은 나아가 점막 면역계에서 상기 항원성 폴리펩티드의 전달에서 LTB, CTB 또는 렉틴[만난(mannan), 키틴(chitin), 및 키토산(chitosan)]과 같은 표적하는 분자의 결합을 촉진하는 잠재적인 방법의 예시일 수 있다. 상기 조성물 및 상기 점막 보조제 또는 상기 조성물의 전달 시스템에 추가로 통상적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 충전재, 코팅제, 분산매, 항균성 및 항곰팡이성 제제, 완충액 또는 희석제를 적절하게 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시예의 다른 방법은 P. 진지발리스에 의해 야기되는 감염을 예방하기 위하여 사용될 살아있는 재조합 바이러스 백신, 재조합 박테리아 백신, 재조합 약화된 박테리아 백신, 또는 불활성화된 재조합 바이러스 백신을 제공한다. 인두종 바이러스는 다른 생물체로부터 유래한 백신 항원을 발현하기 위하여 조작되는 감염성 바이러스 중 당업계에서 가장 잘 알려진 예시이다. 약화되거나 그 자신에 의해 질병이 야기되지 않도록 다른 방법으로 처리된 상기 살아있는 재조합 인두종 바이러스는 숙주를 면역요법하기 위하여 사용되었다. 숙주 내의 재조합 바이러스의 추후의 복제는 항원성 폴리펩티드와 같은 백신 항원으로 면역계에 계속적인 자극을 제공함으로써 장기간의 면역을 제공한다. 이러한 맥락 및 하기에서 '백신'은 보호 반응을 증진시키는 조성물뿐만 아니라 모든 면역반응을 증진시키는 조성물을 포함한다.
다른 살아있는 백신 벡터는 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스, 및 바람직하게는 인두종(Paoletti 및 Panicali, 미국 특허 제4,603,112호) 및 약화된 살모넬라 균주(Stocker et al ., 미국특허 제5,210.035호; 제4,837,151호; 및 제4,735,801호; 및 Curtis et al ., et al ., 1988, Vaccin 6: 155-160)와 같은 폭스바이러스를 포함한다. 살아있는 백신은 상당히 장기간의 면역을 부여할 수 있어 면역계를 계속적으로 자극시키기 때문에 특히 유리하다. 면역반응이 추후의 P. 진지발리스 감염을 방어하였을 때, 상기 살아있는 백신 자신은 P. 진지발리스에 대한 예방 백신으로 사용될 수 있다. 특히, 상기 살아있는 백신은 구강의 공생 서식자인 박테리움에 기초할 수 있다. 이러한 박테리움은 불활성화된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 벡터로 형질전환될 수 있으며, 이후 구강, 특히 구강 점막에서 대량서식하기 위해 사용된다. 구강 점막에서 한번 대량서식되면, 재조합 단백질의 발현은 중화 항체를 생산하기 위해 림프 조직과 연관된 점막을 자극할 것이다. 예를 들면, 분자 생물학적 기술을 이용하여, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상기 유전자는 인두종 바이러스의 게놈 DNA 내에 에피토프의 발현에 적당하지만, 인두종 바이러스 벡터의 성장 또는 복제에 부정적인 영향을 미치지 않는 부위에 삽입될 수 있다. 상기 결과적인 재조합 바이러스는 백신 제형에서 면역원으로서 사용될 수 있다. 상기와 같은 방법이 상기 재조합 바이러스가 면역원으로서 사용되기 전에 및 발현되는 면역원의 면원원성의 상당한 영향이 없이 당업계에 알려진 화학적인 방법을 통해서와 같이 불활성화되는 것을 제외하고는 불활성화된 재조합 바이러스 백신의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
능동적 면역요법의 대안으로서, 면역요법은 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 정제된 면역글로불린을 투여하는 단계를 포함하는 면역요법과 같이 수동적일 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에서 사용된 항원성 폴리펩티드는 유화제, 계면활성제, 안정화제, 염색제, 흡수 증강제, 항산화제, 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 스테르산 마그네슘 및 실리크산와 같은 적당한 부형제와 조합될 수 있다. 상기 항원성 폴리펩티드는 바람직하게는 멸균 수용성 용액으로서 제형화되었다. 본 발명의 백신 조성물은 치주질환의 완전한 치료를 위해 사용된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 개체로 투여하는 단계를 포함하는 개체의 치주질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하고 또한 본 발명의 첫번 째 측면의 폴리펩티드에 대하여 증가되는 항체를 제공한다. 바람직하게는 상기 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 표적한다.
본 명세서에서 용어 '항체'는 일반적 상식 및 특이적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체), 키메라 항체, 이량체 항체, 삼량체 항체 및 항체 절편을 아우르는 것으로 사용되었다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 다른 폴리펩티드에 대한 항원과 교차-반응하지 않는 본 명세서에서 기술한 항원성 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것일 것이다.
본 명세서에서 사용된 '~에 특이적으로 결합하는'이란 용어는, 예를 들면 a BIAcore™ 표면 플라즈몬 공명 시스템 및 BIAcore™ 키네틱 평가 소프트웨어(eg. version 2.1)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 분석을 통하여 측정하였을 때 1 또는 그 이하의 해리 상수(Kd)로 항체의 면역글로불린 가변 부위에 항원이 결합하는 것을 지칭한다. 특이적 결합 상호작용의 상기 친화성 또는 해리 상수(Kd)는 바람직하게는 대략 500 nM 내지 대략 50 pM, 더욱 바람직하게는 대략 500 nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 대략 300 nM 또는 그 이하 및 바람직하게는 적어도 대략 300 nM 내지 대략 50 pM, 대략 200 nM 내지 대략 50 pM, 및 더욱 바람직하게는 적어도 대략 100 nM 내지 대략 50 pM, 대략 75 nM 내지 대략 50 pM, 대략 10 nM 내지 대략 50 pM이다.
항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 절편을 통해 수행될 수 있음을 보여주었다. 항체의 결합 절편의 예시는 (I) Fab 절편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인로 구성되는 단량체 절편;(ii) F(ab')2 절편, 경첩 부위에서 이황화 결합을 통해 연결된 두 개의 Fab 절편으로 구성된 이량체 절편;(iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 절편;(iv) 항체의 한쪽 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 절편;(v) VH 도메인, 또는 VL 도메인으로 구성되는 dAb 절편; 및, (vi) 분리된 상보성결정부위(CDR)를 포함한다. 나아가, 분리된 유전자로 암호화된 VL 및 VH의 Fv 절편의 두 도메인을 단량체 분자를 형성하기 위하여 합성 링커를 사용하여 그들을 VL 및 VH 부위의 쌍인 단일 단백질 사슬[단일 사슬 Fv(scFv)로 알려져 있음]로 제조하는 것과 같은 재조합 방법을 이용하여 그들을 결합시킬 수 있다. 또한, 이량체 항체 또는 삼량체 항체와 같은 단일 사슬 항체의 다른 형태들도 망라된다. 이량체 항체는 VH 및 VL 도메인이 하나의 폴리펩티드 사슬에서 발현되지만, 같은 사슬 내에서 두 도메인 사이를 묶기 위해 매우 짧은 링커를 사용하여, 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루게 되고, 두 개의 항원 결합부위를 생성하는 이중 특이성 항체인 이량체이다.
또한, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩티드에 결합 할 수 있는 다양한 재조합 및 합성 항체의 제조에 사용되는 다양한 절차가 당업계에 공지이다. 게다가 당업자는 숙주의 종에 따라 면역 반응을 증가시키기 위하여 프런즈(완전 및 불완전), 수산화 암모늄과 같은 미네랄 겔, 리소렉틴, 플로로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 유화제, 디니트로페놀과 같은 표면 활성 물질 및 바실러스 칼메테[Bacillus Calmette -Guerin(BCG)] 및 코리네박테리움 파르붐(Coryne박테리움 parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 보조제를 사용하는 것에 익숙할 것이다. 항체 및 항체 절편은 표준 기술(예를 들면 발효조를 사용한 조직 또는 무혈청 배양) 및 단백질 A(예를 들면 마우스의 Mab), 단백질 G(예를 들면, 래트의 Mab) 또는 MEP HYPERCEL(예를 들면 IgM 및 IgG Mab)과 같은 친화성 컬럼을 사용한 정제를 통해 대량으로 생산될 수 있다.
모노클로날 항체의 재조합 인간 또는 인간화 버전은 인간 치료 접근을 위한 바람직한 실시예이다. 인간화 항체는 문헌의 절차에 따라 제조할 수 있다(예를 들어 Jones et al ., 1986, Nature 321: 522-25; Reichman et al ., 1988 Nature 332: 323-27; et al ., 1988, Science 1534-36). 또한, 최근에 기술된 인간화 모노클로날 항체의 생산을 위한 '유전자 변환 진정세대교번(metagenesis)' 전략은 인간화 항체의 생산에 사용될 수 있다(Carter et al ., 1992 Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A. 89: 4285-89). 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 부위의 무작위 조합의 재조합 단계 라이브러리를 생성하기위한 기술을 재조합 항체를 제조하기 위하여 상요할 수 있다(예를 들어 Huse et al ., 1989 Science 246: 1275-81).
본 발명에서 사용된, 용어 '길항제'는 관심있는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 핵산, 펩티드, 항체, 리간드 또는 다른 화학적 물질을 지칭한다. 당업자는 결합 분석을 포함하는 기술과 같은, 특이적 단백질에 적합한 길항제를 실험하고 선별하는 기술에 익숙할 것이다.
본 발명의 항체 및 길항제는 다양한 적용이 가능한데, 예를 들면, 치태 및 치아 충치 및 치주질환에 연관된 병원체의 감소를 조절하는 구강 관리 제품(치약 및 구강 세정제)에서 항미생물 방부제로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 및 길항제는 약학적 표본으로서 사용될 수 있다(예를 들여, 국소 및 전신 항-감염 약).
또한, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 표적하는 간섭 RNA 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 일곱 번 째 측면은 본 발명의 첫 번째 측면의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 분자에 상보적인 이중 나선 부위의 가닥 중 하나인 각 가닥에서 적어도 19개의 염기쌍의 이중 나선 부위를 포함하는 분자인, 간섭 RNA 분자를 제공한다.
RNA 간섭 또는 RNAi라고 불리는 것으로 알려져 있고, 나아가 RNAi에 대한 정보는 그 내용이 본 발명에 참조로서 통합되는 Hannon(2002) Nature 418: 244-251, 및 McManus & Sharp(2002) Nature Reviews : Genetics 3(10): 737-747에서 제공된다.
또한, 본 발명은 siRNA의 안정성을 증가시키고 그들의 in vivo에서의 사용을 지원하는 siRNA의 화학적 변이를 고려한다(예를 들면, Shen et al .,(2006) Gene Therapy 13: 225-234 참조). 상기 변이는 센스 가닥 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에 역상의 염기 모이어티 및 안티센스 가닥의 3' 말단의 마지막 두 핵산 사이에 하나의 포스포르티오산(phosphorthioate) 연결부를 포함할 수 있다.
간섭 RNA의 이중 나선 부위는 이중 나선 부위의 각 가닥에서 적어도 20, 바람직하게는 25, 및 가장 바람직하게는 적어도 30개의 염기쌍을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 본 발명의 간섭 RNA 분자 중 적어도 하나를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 치주질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 조성물은 예를 들어 바람직하게는 통상적 가소제 또는 유연제, 당 또는 글루코오스, 소르비톨 등과 같은 다른 감미료를 따뜻한 껌 베이스를 교반함으로써 또는 껌베이스 바깥 표면을 코팅함으로써 캔디로, 또는 츄잉검으로, 또는 다른 산물로 통합될 수 있다.
나아간 측면에서, 본 발명은 (a)폴리펩티드 억제 제제의 조성물 및 (b)약학적으로 허용가능한 담체의 부분을 포함하는 키트를 제공한다. 바람직하게는 상기 키트는 나아가 이러한 치료를 필요로하는 환자에서 균막형성을 억제하는 것을 위한 용도를 위한 장치를 포함한다.
구강 사용을 대상으로 한 조성물은 약학적 조성물의 제조를 위한 당업계의 모든 방법에 따라 제조할 수 있고, 약학적으로 격식에 맞고 먹기 좋은 표본을 제공하기 위하여 감미료, 향미료, 색소 및 보존제로 구성되는 그룹으로부터 선별되는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적합한 비독성의 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합한 상기 유효성분을 포함한다. 상기 부형제는 예를 들면, 탄산 칼슘, 탄산 나트륨, 락토오스, 인산 칼슘 또는 인산 나트륨과 같은 내부 희석제; 예를 들면, 옥수수 녹말 또는 알긴산의 과립제 및 붕해제; 예를 들면, 녹말, 젤라틴 또는 아카시아인 결합제 및 예를 들면, 마그네슘 스테아르산, 스테아르산 또는 탈크인 윤활제일 수 있다. 상기 정제는 위장관에서의 분해 및 흡수를 지연시킴으로써 장기간 지속되는 활성을 제공하기 위하여 알려진 기술을 통해 코팅하지 않거나 코팅할 수 있다. 예를 들면, 글리세릴 모노스테아르산 또는 글리세릴 디스테아르산과 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다.
또한, 구강 사용을 위한 제형은 상기 유효성분이 예를 들면, 탄산 칼슘, 인산 칼슘 또는 카올린(kaolin)과 같은 내부의 고형 희석제와 섞인 고형 젤라틴 캡슐 또는, 상기 유효성분이 물 또는 예를 들면 피넛 오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일과 같은 오일 배양액과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제조될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 '포함하다', 또는 이의 변형인 '포함하는'은 모든 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는, 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않고, 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이다
본 명세서에서 언급된 모든 출판물은 본 발명에 참조로서 통합될 것이다. 문서, 행동, 재료, 자료, 논문 또는 본 명세서에서 포함된 이와 같은 것들의 모든 의제는 본 발명에 문서의 모든 의제는 오로지 본 발명의 맥락에서 제공하는 목적에 대한 것이다. 본 출원의 각 청구항의 우선일 전에 호주 또는 다른 곳에서 존재하는 본 발명과 관련된 선행 기술 분야의 내용의 일부 또는 모두, 또는 당업계의 통상적 지식을 인정하는 것으로 받아들여지지 않을 것이다.
광범위하게 서술된 바와 같은 본 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않는 특이적 실시예에서 보여준 바와 같이 다양한 변이 및/또는 변이가 본 발명에 따라 만들어질 수 있을 것은 당업자에게 자명할 것이다. 그러므로 하기 실시예는 모든 측면의 제한없는 실례로서 고려될 것이다. 본 발명은 특이적으로 본 명세서에서 서술한 특징의 모든 조합을 포함한다.
본 발명의 특성을 더욱 명확히 이해시키기 위하여 참조와 함께 그들의 바람직한 형태를 하기 실시예를 통해 기술할 것이다.
균막 및 플랑크톤 연구를 위한 P. 진지발리스의 성장 및 회수
포르피노모나스 진지발리스 W50(ATCC 53978)은 400 mL의 최종 부피에서 C-30 BioFlo 연속배양장치 모델(New Brunswick Scientific)을 사용한 연속배양으로 성장시켰다. 배양관 및 배양액 급수지 모두에서 10% CO2 및 90% N2를 계속 넣어주었다. 상기의 성장 온도는 37℃이고, 두뇌 심장 접목 성장 배양액(Oxoid)은 pH 7.5로 유지시켰다. 전체 성장 동안, 산화환원은 잠재적으로 -300 mV로 유지시켰다. 희석율은 0.1 h-1, 주어진 평균 세대 기간(MGT)은 6.9일이었다. 멸균한 시스테인-HCl(0.5 g/L) 및 헤민(heamin)(5 mg/L)을 첨가하였다. 상기 배양이 접종 후 대략 10이 지났을 때 안정된 단계에 도달하였고, 관의 수직 표면에 균막이의 얇은 층이 발달할 때까지 30일 더 유지시켰다.
모든 박테리아 세포 조작은 얼음 또는 4℃에서 수행되었다. 회수 동안, 상기 플랑크톤 세포는 깨끗한 콘테이너로 옮겨졌고, 상기 균막은 PGA 완충액으로 부드럽게 2회 세척된 후(10.0 mM NaH2 PO4, 10.0 mM KCl, 2.0 mM, 시트르산, 1.25 mM MgCl2, 20.0 mM CaCl2, 25.0 mM ZnCl2, 50.0 mM MnCl2, 5.0 mM CuCl2, 10.0 mM CoCl2, 5.0 mMH3 BO3, 0.1 mM Na2 MoO4, 37℃에서 5 M NaOH로 7.5로 맞춰진 pH의 10 mM 시스테인-HCl), 50 mL 원심분리 튜브로 상기 균막을 회수하였다.
이후, 플랑크톤 및 균막 세포는 PGA 완충액으로 3회 세척(7000 g)하였고, 각 샘플을 최종 부피 30 mL의 세척 완충액(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 8.0, 프로테나아제 억제제 억제제(Sigma))에 혼탁하고 138 MPa의 French Press Pressure Cell(SLM, AMINCO)을 통해 3개의 관을 용해하였다. 상기 용해된 세포를 모든 깨지지 않은 세포를 제거하기 위하여 2000 g에서 30분 동안 원심분리하였다. 깨진 세포에서 그들의 수용성 및 불용성(세포 막) 분획을 분리하기 위해 상기 상청액을 100000 g에서 1시간 동안 더 원심분리하였다. 상기 세포 막 분획은 모든 수용성 오염을 제거하기 위하여 세척 완충액으로 100000 g에서 각 20분 동안 3회 더 세척하였다. 이후, 모든 샘플은 얼려서 -80℃에서 보관하였다.
헴-제한적 및 과잉 연구를 위한 P. 진지발리스의 성장 및 회수
P. 진지발리스 W50을 최종 부피 400 mL에서 Bioflo 110 발효조/생물 반응 장치(New Brunswick Scientific)를 이용하여 연속배양으로 성장시켰다. 상기 성장 배양액은 5 mg/mL 필터 멸균한 시스테인 염산염, 5.0 μg/mL 헤민(헴-과잉) 또는 0.1 μg/mL 헤민(헴-제한적)을 포함하는 37 g/L의 두뇌 심장 접목 배양액(Oxoid)이었다. 성장은 상기와 같은 배양액(헴-과잉)에서 24시간 배치 배양(100 mL)으로 성장한 P. 진지발리스를 배양 관에 접종함으로서 시작되었다. 배치 배양 성장한지 24시간이 지난 후, 상기 배양액 급수지 펌프를 틀고, 배양액 흐름을 0.1 h-1(6.9시간의 평균 세대 시간(MGT))의 희석율로 맞췄다. 상기 관의 온도는 37℃ 및 7.4±0.1의 pH로 유지시켰다. 배양하는 동안 5% CO2 및 95% N2를 계속 넣어주었다. 세포는 성장이 안정된 단계에서 회수하였고, 5000 g에서 30분 동안 세척 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2)으로 3회 세척하고, 138 MPa의 French Press Pressure Cell(SLM, AMINCO)을 통해 3개의 관을 분쇄하였다. 이후, 상기 깨지지 않은 세포를 제거하기 위하여 세포를 2000 g에서 30분 동안 원심분리한 후, 수용성(상청액) 및 막 분획을 생성하는 100000 g의 초원심분리를 수행하였다. 모든 분획은 얼음 조건에서 수행되었다.
18 O 단백질 분해성 표지된 균막 및 플랑크톤 세포 막 분획의 표본 및 분석
세포 막 분획은 먼저 2% SDS를 포함하는 1 mL의 차가운 세척 완충액에 재혼탁하였고, 이후 고형물(pellet)의 재혼탁에 도움을 주기 위하여 초음파 분해 및 보텍스(vortexing)를 수행하였다. 재탁의 최종 단계는 입자물을 부수는 것을 돕기 위해 29-게이지-인슐린 바늘의 사용을 포함하였다. 이후, 상기 혼합물은 불용성 입자를 제거하기 위하여 40000 g에서 원심분리하였고, 제조사의 설명에 따라 BCA 시약(Pierce)을 사용하여 상기 상청액의 단백질의 농도를 결정하였다.
상기 재혼탁된 샘플은 모든 단백질 분해성 활성을 불활성화시키기 위하여 5배 부피의 차가운 아세톤을 사용하여 -20℃에서 밤새두어 침전시켰다. 아세톤 침전 후, 두 샘플을 최종 농도 3 mg/mL의 25 mM Tris pH 8.0 및 1% SDS에 간헐적인 초음파 분해, 보텍스(vortexing) 및 29-게이지-인슐린 주사바늘의 사용으로 보조하면서 재혼탁시켰다. 이후, 최종 단백질량을 표준화시키기 위하여 이차 BCA 단백질 분석을 수행하였다.
상기 균막 및 플랑크톤 샘플(각각 30 ㎍)을 겔의 인접한 레인에 로딩하였다. 이후, SDS-PAGE를 126 V, 4℃에서 겔의 밑에서 대략 1 cm까지 다이(dye)가 내려올 때 까지 수행하였다. 생물학적 복제물에 대하여, 두 분획에서 분리되는 단백질 밴드의 잠재적인 변형을 극복하기 위한, 유사하지만 정확하지는 않은 분리 패턴을 얻기 위해 상기에서 사용된 겔은 러닝 완충액으로서 MOPs를 이용한 4-12% NUPAGE 구배 겔이었다. 염색은 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250(31)로 밤새 수행되었고, 이후 초순수 H2O로 밤새 탈색하였다.
상기 두 겔 레인은 주문 제작한 스텐실을 사용하여 같은 사이즈의 10개 겔 밴드로 나뉘어졌고, 각 섹션은 대략 1 mm3 큐브로 잘랐다. 탈색은 50 mM NH4HCO3/ACN(1:1)의 용액에서 3회 수행되었다. 탈색 후, 상기 겔 큐브들을 100% ACN을 탈수시킨 후, 10 mM 다이티오트레이톨(dithiothreitol)을 포함하는 ABC 완충액(50 mM NH4HCO3)으로 56℃에서 30분 동안 재수화/환원을 수행하였다. 상기에서 남는 용액은 55 mM 아이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 포함하는 ABC 완충액으로 상온에서 60분 동안 어둠조건에서 첨가하기 전에 제거하였다. 상기 알킬화 반응 후, 상기 겔 큐브들을 ABC 완충액으로 3회 세척한 다음, 100% ACN으로 10분 동안 2회 탈수하였다. 나아가 상기 겔 큐브들을 speedvac을 이용하여 90분 동안 원심분리하여 건조시켰다. 절단은 2 ㎍의 Sequence grade modified 트립신(Promega) 및 H2 16O 또는 H2 18O로 만든 ½ 세기(strength) ABC 완충액(H2 18O, >97 % 순도, Marshall Isotopes)을 포함하는 겔 섹션당 60 용액으로 37℃에서 20시간 동안 수행하였다. 절단 후, 상기 펩티드는 초음파 분해의 목적으로 그들 각자의 물(H2 16O/H2 18O)에서 50% ACN/0.1% TFA 용액 및 0.1% TFA을 사용하여 겔로부터 각 5분 동안 2회 추출되었다. 상기 풀링된(pooled) 추출물은 99℃에서 5분 동안 트립신을 비활성화시키기 위하여 끓인 다음, 48시간 동안 동결건조하였다.
상기 동결-건조된 펩티드는 nanoHPLC 및 MALDI TOF-MS/MS 분석을 사용한 분석 전에 그들 각자의 물(H2 16O/H2 18O)에 5% ACN/0.1% TFA을 포함하는 용액에 재혼탁되었다. 이후, 상기 펩티드 용액(20 )을 FAMOS autosampler(LC Packings)을 사용한 Ultimate Nano LC system(LC Packings)에 고급 μl 픽업 모드로 로딩하였다. 상기 샘플을 먼저 200 /min로 5분 동안 trapping 컬럼(300 internal diameter x 5 mm)에 로딩하였다. 분리는 역상 컬럼(LC Packings, C18 PepMap100, 75 i.d. x 15 cm, 3 , 100)에서 300 nL/min의 유속으로 이루어졌으며, 0-5분(0%), 5-10분(0-16%), 10-90분(16-80%), 90-100분(80-0%)의 ACN 구배를 포함하는 0.1% 엽산에 용출하였다.
용출물은 Proteineer Fc robot(Bruker Daltonics)를 사용하여 30초 간격으로 pre-spotted anchorchip plates(Bruker Daltonics)에 나란히 점찍었다. 점찍기 전에, 상기 매트릭스와의 결정화 과정 중 아세토니트릴(acetonitrile)의 농도를 줄이기 위하여 각 점의 위치는 0.2 의 초순수 H2O로 미리 점찍었다. 상기 플레이트는 10 mM 인산암모늄 및 0.1% TFA로 세척하였으며, MALDI-TOF/TOF(Ultraflex with LIFT II upgrade, Bruker Daltonics)를 사용한 자동화된 분석 전에 공기 건조 시켰다. 상기 절단물의 MS 분석은 먼저 25 kV의 촉매 전압을 사용하여 800 내지 3500 Da을 측정하는 리플렉트론(reflectron) 방식으로 수행되었다. 모든 MS 스펙트라는 30개 레이져 샷의 각 세트는 노이즈에 대한 신호를 얻는 것을 필요로 하는 8개 세트로부터 생성되었고, S/N >6, 해상도 >3000이 포함될 것이다. 상기 기구의 보정은 미리 점찍어둔 네 가지 샘플의 각 그룹에 대한 내부 표준(Angiotensin II, Angiotensin I, Neurotensin, Renin_substrate 및 ACTH_Clip)의 [M+H]+ 이온으로 외부에서 수행되었다. MALDI-TOF/TOF의 LIFT 방법은 Flexcontrol 및 WarpLC software(Bruker Daltonics)을 상요하여 완전히 자동화된 방법으로 수행되었다. TOF1 단계에서, 모든 이온은 8 kV로 촉진되었고 이후 LIFT Cell에서 19 kV로 해제되었고, 모든 MS/MS 스펙트라는 550 연속 레이져 샷을 축적하여 생성되었다.
모 전구체의 선별은 LC MALDI SILE(Stable Isotope Labelling Experiment)의 작업 흐름으로 WarpLC software(ver 1.0)을 사용하여 수행되었다. 4 Da에 의해 구분된 각각의 무거운 또는 가벼운 쌍에서 가장 풍부한 피크만을 선별하였고, 제공된 그의 S/N은 >50이었다. 6개 LC MALDI 분획보다 적게 분리된 요소는 동일하다고 생각되어 오직 한번만 선별하였다.
피크 목록은 Apex peak finder 알고리즘으로 Flexanalysis 2.4 Build 11(Bruker Daltonics)을 사용하여 S/N>6으로 생성되었다. 상기 MS 스캔은 0.2 m/z 너비 및 바셀린 감법을 사용한 Savitzky Golay 알고리즘으로 한번 매만진 다음, 0.8 평탄도의 Median 알고리즘을 사용하여 성취되었다.
단백질 동정은 The Institute for Genomic Research(TIGR) website(www.tigr.org)로부터 얻은 P. 진지발리스 데이터베이스에 대한 MS/MS 데이터 질문에서 MASCOT 조사 엔진(MASCOT version 2.1.02, Matrix Science)을 사용하여 성취하였다. MASCOT 조사 파라미터는 흥분 단계 1+, 하나의 누락된 절단을 허락하는 프로테아제로서 트립신 및 MS의 250 ppm의 관용 및 MS/MS 피크의 0.8 m/z였다. 고정된 변이는 시스테인의 카바미도메틸(carbamidomethyl) 및 C-말단 18O 표지된 라이신 및 알기닌 잔기의 가변적 변이였다.
전술된 바와 같은(32) 역방향 데이터베이스 전략은 단일 펩티드 선별에서 거짓 양성을 누락시키기 위해 요구되는 최소 펩티드 MASCOT 점수를 결정하기 위하여 사용되었다. 간략하면, 그의 정상적 방향에서 예측된 모든 P. 진지발리스 단백질의 서열 및 그들과 동일한 서열을 가지는 단백질 모두로 구성되는 데이터베이스를 뒤집었다(3880 서열). 이후, 상기 전체 MS/MS 데이터 세트는 0%의 거짓 양성을 얻기 위한 가장 낮은 Mascot 점수를 결정하기 위하여 조합된 데이터베이스에 대하여 조사하였다. 거짓 양성은 역방향 서열에 대하여 양성 매치가 되는 것으로 정의되었다(붉은 볼드체 및 상기 펩티드 역치 점수). 단일 히트 펩티드에 대한 거짓 양성률은 >역치 및 <25의 Mascot 펩티드 이온 점수가 0.5%가 되도록 정의되었다. 상기 Mascot 펩티드 이온 점수가 >30일 때, 역방향 데이터베이스와 일치하지 않는 것이다. 단일 히트 펩티드에 대한 선별의 신뢰를 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 만약 점수가 30으로 사용되었을 때, Mascot 점수화 알고리즘에 따른 것 보다 부정확한 선별의 규모가 낮도록 하기 위해서 >50의 최소 Mascot 펩티드 이온 점수를 사용하였다.
상기 매치된 펩티드는 하기의 기준을 이용하여 측정하는데, ⅰ) p-값 <0.05에 상응하는 점수에 기초한 확률을 가진 적어도 2개의 고유한 펩티드는 명확하게 선별된 것으로 여겨지고(붉은 볼드체 매치가 요구됨) 상기 점수는 log X 10log(P)이며 P는 관찰된 매치가 무작위로 일어나는 확률이고(33), ⅱ) 여기에서 오직 하나의 고유한 펩티드는 특이적 단백질(무겁거나 또는 가볍게 표지된 펩티드의 선별은 하나로서 여겨짐)의 선별에 이용되었다. 상기 MASCOT 펩티드는 이온 점수는 50 이상이어야만 하거나 또는 상기 펩티드는 4회의 독립적인 실험 중 1회 이상에서 선별된다(2회의 생물학적 복제 및 2회의 기술적 복제).
상기 펩티드내로 한 개 또는 두 개의 18O 원자의 혼합된 도입, 상기 18O 동위원소 및 상기 H2 18O 순도(a=0.97)의 자연적인 풍부량의 기여 때문에, 상기 펩티드의 비율인 R은 수학식을 사용하여 수학적으로 보정하였다:
Figure pct00001
(1)
I0, I1 및 I2는 하기의 수학식에 따라 계산되었고(27),
Figure pct00002
(2)
Figure pct00003
(3)
Figure pct00004
(4)
여기에서 S0, S2 및 S4는 각각 18O 표지가 없는 펩티드에 대한 단일동위원소 피크의 측정된 강도, 상기 단일동위원소 피크보다 2 Da 더 높은 피크, 및 상기 단일동위원소 피크보다 4 Da 더 높은 피크이다(도 1A). J0, J2 및 J4는 MS-동위원소(http://prospector.ucsf.edu)로부터 계산된 상기 펩티드의 동위원소 외피의 상응하는 이론상의 상대적 강도이다. 그러나 두 번째 동위원소 피크(S1 및 S5)의 강도가 첫 번째 동위원소 피크(S0 및 S4)보다 더욱 강했을 경우, 상기 비율은 S5에 의해 나눠진 S1으로써 간단히 계산되었다. 이는 특별히 2000 m/z 이상의 큰 펩티드에 대해 정확하였고 여기에서 16O 표지된 펩티드의 다섯번째 동위원소 피크의 상기 S4 피크에 대한 기여의 중요성이 부각되었다. 혼합된 16O18O 도입의 계산은 실험적 S2 및 실험적 S4의 백분율로서 이론적 S2(J2)의 차이에 의해 결정된다.
동일한 단백질이 하나 이상의 겔 구간에서 선별된 경우, 단백질 풍부량 비율은 상기 동일한 단백질의 모든 선별된 펩티드를 평균함으로써 결정되었다. 각각의 '정상'복제로부터의 데이터는 각각의 생물학적 복제에서 각각의 단백질에 대한 평균비율 및 표준오차를 제공하는 그것의 각각의 '역'복제로부터 역으로된 비율과 결합된다. 상기 두 생물학적 복제의 표준화는 이전에 보고된 것(34,35)과 유사하게 실시하였다. 간략하면, 각각의 생물학적 복제에 대한 상기 평균비율은 하나의 인자에 의해 증가되어 상기 비율의 기하평균은 1과 같았다.
ICAT 표지된 헴( heam )-제한적 및 과잉 세포의 제조 및 분석
단백질 표지 및 분리는 cleavable ICAT reagent(Applied Biosystems)를 사용한 geLC-MS/MS 접근법(Li et al ., 2003)에 기초하였다. 또 다른 프로테오믹 접근법은 PCT/AU2007/000890에 나타나있고 본 명세서에 참조로서 통합된다. 먼저 단백질을 TCA(16%)를 사용하여 침전시켰고 6 M 유레아, 5 mM EDTA, 0.05% SDS 및 50 mM Tris-HCl pH 8.3에 용해하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 시약을 사용하여 측정하였고 1 ㎎/㎖로 조정하였다. 각 성장 조건에서의 100 ㎍의 단백질을 2 ㎕의 50 mM 트리스(2-카복시-에틸)포스핀 하이드로클로라이드{Tris(2-carboxy-ethyl)phosphine hydrochloride}를 사용하여 1시간 동안 37 ℃에서 각각 환원시켰다. 그런 다음 헴-제한적 성장 조건의 환원된 단백질을 ICATheavy 시약으로 알킬화하였고 헴-과잉 성장 조건의 단백질을 ICATlight 시약으로 알킬화 하였다. 그런 다음 상기 두 시료를 혼합하여 미리 만들어진 Novex 10% NUPAGE gel(Invitrogen) 상에서 SDS-PAGE를 실시하였다. 상기 겔을 SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen)을 사용하여 5분간 염색한 후 물로 탈염색하였다. 그리고 나서 상기 겔 레인을 겔의 위쪽에서부터 염료 앞까지 20개의 구간으로 잘랐다.
상기 잘려진 구간을 추가적으로 1 ㎣ 큐브로 주사위꼴로 잘라 밤새 겔을 분해하였고 상기 절차에 따라 2회 추출하였다. 상층액을 약 50 ㎕의 감압 진공 하에서 건조시킨 후 친화성 컬럼 상에 로딩하기 전에 제조사의 지시(Applied Biosystems)에 따라 500 ㎕의 친화성 로드버퍼에 혼합하였다. 용출된 펩티드를 건조시키고 아무것도 타지 않은 TFA로 37℃에서 2시간 동안 비오틴 태그를 떨어뜨린 후 감압 진공 하에서 건조하였다. 건조된 시료를 0.1% TFA에 포함된 5% 아세토니트릴의 35 ㎕에 현탁하였다.
MS를 UltiMate Nano LC 시스템(LC Packings Dionex)과 연결된 Esquire HCT ion trap mass spectrometer(Bruker Daltonics)를 사용하여 실시하였다. 분리는 LC 패킹 역상 컬럼(C18 PepMap100, 75 ㎛ i.d.×15 ㎝, 3 ㎛, 100)을 사용하여 수행하였고 하기의 아세토니트릴 농도구배에 따라 0.1% 엽산에서 용출하였다: 0~5 분(0%), 5~10 분(0~10%), 10~100 분(10~50%), 100~120 분(50~80%), 120~130 분(80~100%).
상기 LC 결과는 즉시 나노스프레이 이온 소스로 접속되었다. MS 수집은 100 ㎳의 최대 누적시간으로 300~1500 범위의 m/z에서 100000의 이온 전하 조절 하에서 실시하였다. GPF를 사용한 경우 세 가지의 추가적인 m/z 범위(300~800, 700~1200 및 1100~1500)를 전구체 이온의 선택을 위해 사용하였고 각각의 m/z 범위는 선별된 펩티드의 수적 증가를 위해 2회 실시되었다. MS/MS 수집은 100~3000 m/z의 광범위에서 획득하였고 초기 완벽한 프로테옴 분석을 위한 10개까지의 전구체 및 2분의 활성 배제 시간으로 가장 강력하게 증가한 전하된 이온에 대해 3회의 ICAT 분석을 실시하였다.
피크 목록은 화합물 검출 역치 10000 및 5의 노이즈 역치에 대한 신호로 Apex peak finder algorithm을 사용한 DataAnalysis 3.2(Bruker Daltonics)를 사용하여 생성하였다. +2 및 +3의 전반적인 전하 제한은 나타난 데이터로 설정되었다. 단백질 선별은 The Institute for Genomic Research(TIGR) 웹사이트(www.tigr.org)로부터 수득한 P. 진지발리스(P. gingivalis) 데이터베이스에 대하여 의문을 제기한 MS/MS 데이터에 MASCOT 검색 엔진(MASCOT 2.1.02, Martix Science)을 사용하여 달성하였다. 상기 매치된 펩티드는 추가적으로 하기 기준을 이용하여 측정하는데, ⅰ) 최대 0.05의 p-값에 상응하는 Mowse 점수에 기초한 확률을 가진 펩티드는 명확하게 선별된 것으로 여겨지고, 여기에서 상기 점수는 log X 10(log(P))이며 P는 관찰된 매치가 무작위로 일어나는 확률이고 ⅱ) 오직 하나의 고유한 펩티드는 특이적 단백질의 선별에 이용되었고 상기 MASCOT 점수는 30 이하이었으며, 스펙트라의 수동의 검증을 실시하였다. ICAT 표지된 단백질 특히 단일 펩티드 히트를 가진 것에 대한 선별에 신뢰도를 향상시키기 위해, 추가적인 필터를 하기와 같이 실시하였다: ⅰ) ICAT 쌍의 무서운 및 가벼운 펩티드는 그들의 추출된 이온 크로마토그램으로부터 측정됨으로써 용출 피크에 근접하게 나타내야만 하고 ⅱ) 하나의 단일 고유한 펩티드를 갖는 단백질을 위해, 이러한 펩티드는 한번 이상(예를 들어 다른 SDS-PAGE 분획에서 또는 가벼운 및 무거운 ICAT 형태 모두에서) 선별되어야만 하며, ⅲ) 만약 하나의 단일 펩티드가 (ⅱ)의 기준을 만족하지 못하면, 상기 MASCOT 점수는 ≥25이어야 하고, 기댓값≤0.01 및 상기 MS/MS 스펙트럼은 간주되는 강력한 이온을 갖는 ‘b' 또는 'y'-형태의 인접한 연속으로 나타내져야 한다. 거짓 양성(false positives)의 측정은 상기와 같았다.
동위원소적으로 무거운 13C와 가벼운 12C ICAT 표지된 펩티드의 비율을 DataAnalysis(Bruker Daltonics)에서의 스크립터를 사용하여 측정하였고 단일 MS 스펙트럼에서 단일동위원소의 피크 강도(신호 강도 및 피크 영역)의 측정에 기초하여 수동으로 증명하였다. 비록 무거운 및 가벼운 전구체 두 이온의 >96%가 >10000이었지만 정량을 위해 사용된 모체 이온의 최소 이온 총수는 2000이었다. 저조하게 분석된 스펙트라의 경우에, 상기 비율은 상기 모체 이온의 복원된 추출된 이온 크로마도그램(extracted ion chromatogram, EIC)의 영역으로부터 측정되었다. 평균은 단일 모체 단백질로부터 유래한 다중 펩티드에 적합하고 그 외의 것들은 α=0.05를 이용한 그럽스 검정(Grubb's test)을 사용하여 제거하였다.
P. 진지발리스 단백질의 세포의 로컬화(localization)는 CELLO(http://CELLO.life.nctu.edu.tw(36))를 사용하여 예측하였다. 세포외, 외막, 내막 및 주변세포질 예측은 외피 분획으로부터 할 수 있다고 여겨졌다.
무세포 배양 상층액(접종되지 않은, 헴-과잉 및 헴-제한적)에서 짧은-사슬 지방산(short-chain fatty acids, SCFA)의 농도는 Richardson et al .,(37)의 유도체화 방법에 기초한 모세관 가스 크로마토그래피에 의해 측정되었다.
두 생물학적 복제 사이의 상관계수(r)는 마이크로소프트 엑셀의 이변량 상관계수 기능을 사용하여 평가하였다. 변이계수(coefficient of variance, CV)는 평균값으로 나눠진 펩티드 풍부량 비율의 표준편차에 의해 계산하였고 백분율로서 나타냈다.
전사체 분석을 위한 핵산의 추출
연속배양장치(chemostat)로부터 직접적으로 회수한 5 ㎖의 P. 진지발리스 세포 시료로부터 RNA를 추출하였다. 각각의 시료에 0.2 부피의 RNA 안정화 완충용액(무수에탄올에 5% v/v의 페놀)을 첨가하였다. 세포를 원심분리(9000 g, 5 분, 25℃)하여 가라앉혔고, 즉시 액체질소에 동결시키고 추후 과정을 위하여 -70℃에 보관하였다. 동결된 세포를 1 ×1010 세포수 당 1 ㎖의 TRIzol 시약(Invitrogen)에 현탁한 다음 Lysing Matrix B glass beads(MP Biomedicals) 및 Precellys 24 homogeniser(Bertin Technologies, France)를 사용하여 파쇄하였다. 상기 유리 비드는 원심분리하여 제거하였고 상기 RNA 분획물을 이소프로판올 보다 에탄올(35%의 최종농도에서)을 RNA 침전 단계에서 첨가하는 것을 제외하고 TRIzol 제조사(Invitrogen)의 프로토콜에 따라 정제하였고 시료들을 Illustra RNAspin Mini RNA Isolation 키트(GE Healthcare)의 스핀-컬럼으로 옮겼다. RNA를 임의의 잔여 DNA를 제거하기 위해 컬럼 상에서 DNA분해효소(DNAse) 처리를 포함하여, 결합 단계부터 계속 제조사의 지시에 따라 정제하였다. RNA 완전성(integrity)은 Experion automated electrophoresis station(Bio-Rad)을 사용하여 측정하였다.
게놈 DNA는 제조사의 지시에 따라 DNeasy Blood & Tissue 키트(Qiagen)를 사용하여 연속배양에서 성장한 P. 진지발리스 세포로부터 추출하였다.
마이크로어레이 설계, 혼성화 및 분석
마이크로어레이 슬라이드는 오스트레일리아의 게놈 연구시설(Australian Genome Research Facility)에 의해 인화하였고 Los Alamos National Laboratory Oralgen 프로젝트에 의해 예측된 추가적인 단백질 코딩 부위를 포함하는 상기 P. 진지발리스 W83 게놈의 예측되는 단백질 코딩 부위에 대한 1997개의 맞춤 설계된 60-머(mer)의 올리고뉴클레오티드 탐침으로 구성되었다. 마이크로어레이 시료 풀(Microarray Sample Pool, MSP) 대조군 탐침은 강도-의존적인 표준화를 돕기 위해 포함되었다. 탐침의 총 보체는 마이크로어레이 슬라이드 당 3회 Corning UltraGAPS 코팅된 슬라이드 상에서 인화되었다.
슬라이드는 Cy5(GE Lifesciences)로 표지된 전반적인 게놈 DNA 참조와 결합된, Cy3으로 표지된 헴-과잉 또는 헴-제한적 시료를 사용하여 혼성화하였다. cDNA 합성 반응의 점화를 위한 5 ㎍의 랜덤 헥사머(Invitrogen)와, SuperScript plus indirect cDNA labelling system(Invitrogen)을 사용하여 10 ㎍의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. cDNA는 Amersham CyDye post-labelling reactive dye pack(GE Lifesciences)을 사용하여 Cy3으로 표지하였고 Invitrogen 표지 시스템의 정제 모듈을 사용하여 정제하였다. Cy5dUTP가 표지된 게놈 cDNA는 BioPrime Plus Array CGH Indirect Genomic labelling System(Invitrogen)을 사용하여 400 ng의 DNA로부터 유사한 방법으로 합성하였다.
혼성화하기 전에, 마이크로어레이 슬라이드를 블로킹 용액(35% 포름아미드, 1% BSA, 0.1% SDS, 5×SSPE [1×SSPE는 150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA])에 42℃에서 1 시간 동안 담갔다. 블로킹 슬라이드를 물에 잠시 세척한 후 99% 에탄올로 세척한 다음 원심분리를 통해 건조하였다. 표지된 cDNA는 55 ㎕의 혼성화 완충용액(35% 포름아미드, 50×0.1% SDS, 0.1 ㎎㎖-1 연어정자 DNA)에 현탁하여 95℃에서 5 분간 변성시킨 다음 슬라이드에 올려놓고 LifterSlips(Erie Scientific)으로 덮어주었다. 혼성화는 42℃에서 16 시간 동안 실시하였다. 혼성화한 다음 슬라이드를 2×SSC[1×SSC는 150 mM NaCl 15 mM sodium citrate]가 첨가된 0.1% SDS(42℃에서 5분, 모든 추가적인 세척은 실온에서 실시), 0.1×SSC가 첨가된 0.1% SDS(10분), 0.1×SSC(4회 세척, 각각 1분씩)에 계속적으로 세척하였고, 그런 다음 0.01×SSC, 다음에는 99% 에탄올에 담가 원심분리를 통해 슬라이드를 건조하였다.
슬라이드를 GenePix 4000B 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 스캔하였고 GenePix Pro 6.0 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 이미지를 분석하였다. 세 개의 생물학적 복제를 나타내는 각각의 처리(헴-제한 또는 헴-과잉)에 대해 세 개의 슬라이드를 사용하였다.
이미지 분석은 상기 GenePix Pro 6.0 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 실시하였고, 'morph" 기저값은 추가적인 분석에서 추정 기저값으로서 사용되었다. 상이하게 발현되는 유전자를 선별하기 위하여 LIMMA 소프트웨어 패키지를 P <0.005의 중단과 함께 사용되었다. 어레이 표준화는 MSP 대조군 지점을 통한 전반적인 loess curve를 맞추고 다른 모든 지점에 곡선을 적용하여 실시하였다. Benjamini Hochberg 방법은 다중 시험 정정에 대한 오류발견률을 조절하기 위해 사용되었다.
유전자 예측은 The Institute for Genomic Research(TIGR, www.tigr.org)의 P. 진지발리스 W83 게놈 주석에 기초하였다. 오페론 예측은 Microbesonline 웹사이트(http://microbesonline.org)로부터 수행하였다.
DNA 마이크로어레이 분석을 사용하여 측정된 것에 따른 헴-제한에 대한 P. 진지발리스 의 반응
P. 진지발리스 전반적인 유전자 발현에 대한 헴-제한적 성장의 효과의 DNA 마이크로어레이 분석은 프로테오믹 분석에 적용한 동일한 성장 조건 하에서 수행하였다. 세 개의 생물학적 복제의 데이터 분석은 헴-과잉 및 헴-제한 사이의 통계학적으로 유의적인 상이한 조절을 나타내고, 헴-제한의 조건 하에서 발현이 증가된 수준으로 나타난 대부분의 유전자 및 감소하는 오직 8개의 유전자와 함께, 총 160개의 유전자를 선별하였다. 상기 증가된 유전자의 다수는 오페론에 있는 것으로 예측되었고 이들의 대부분은 전사체 수준(표 3 및 5)에서 유사한 변화를 나타냈다. 헴-제한에 대한 상이한 조절이 발견된 두 데이터 세트 사이의 유의적인 상관관계를 갖는 전사체 및 프로테오믹 데이터간의 폭넓은 합의가 있었다[Spearman’s correlation 0.6364, p < 0.05]. 그러나 상기 프로테오믹 분석으로부터 풍부량에 차이를 나타낸 몇몇의 상기 단백질에 대해, 상응하는 유전자의 전사체 분석에서는 mRNA의 풍부량에 있어서 어떠한 통계학적으로 유의적인 차이도 확인되지 않았다. 상기 마이크로어레이 분석은 프로테오믹 분석을 통한 측정에 따라 풍부량에 큰 변화를 갖는 단백질을 암호화하는 오직 그러한 유전자를 선별하는 경향이 있었다(표 3 및 5). 동일한 유전자로부터의 단백질 및 전사체는 헴-제한에 의해 현저하게 조절되는 것으로 발견되었고 대부분은 조절의 동일한 방향성을 나타냈다. 예외는 두 가지 유전자 산물, PG0026 CTD 패밀리로 추정되는 세포 표면 단백질분해효소 및 PG2132 핌브릴린(fimbrillin, FimA)이었다. 이러한 단백질은 헴-제한 하에서 프로테오믹 분석에서 풍부량이 감소되었지만 전사체 분석에 의해서는 증가되는 것으로 예측되었다. 이러한 두 단백질은 세포 표면에 위치하고 세포 표면으로부터 또는 프로테오믹 분석에서 증가됨으로써 선별되는 것을 불가능하게 하는 번역 후 변형된 것으로부터 방출될 상당한 가능성이 있다.
유전자 산물에 추가로 하기에 더욱 상세하게 설명하였다 PG1874 및 PG1875의 두 유전자의 예측된 오페론, 헤모리신 A(heamolysin A)를 암호화하는 것 중 하나; 예측된 티오레독신을 암호화하는 PG1638의 PG1634-PG1641의 8개의 연결된(concatenated) 유전자 및 망간 수송자인 FeoB2를 암호화하는 PG1043을 포함하여 흥미있는 몇몇 유전자의 전사가 상당히 상향 조절되어 있었다. 플라보독신(flavodixin)을 암호화하는 PG1858은 15.29배로 가장 많이 상향 조절된 유전자였다. 152개의 유의하게 상향 조절된 유전자 중에서 ~55개가 기능이 알려져있지 않았다.
연속배양 및 균막 형성
P. 진지발리스 W50을 생물학적 복제 1 및 2에 대해 각각 2.69± 0.21 및 2.80± 0.52의 OD650가 되는 최초 10일 후에 배양물의 세포 밀도가 일정하게 남아있는 40일 동안 연속배양으로 배양하였다. 이는 3 ㎎ 세포 건조중량/㎖의 세포밀도와 같다. 이 기간 동안 P. 진지발리스 세포의 균막은 발효기 용기의 수직 유리벽에서 생성되었다. 이 균막은 회수하는 시점에서 2 ㎜의 두께였다.
BSA 를 사용한 16 O/ 18 O 정량 방법의 검증
16O/18O 정량 방법의 정확도 및 재현성을 확인하기 위하여, BSA의 공지된 양을 1:1, 1:2, 1:5 및 10:1(도 1B)의 비율을 제공하기 위해 인접한 겔 레인 상에 로딩하였다. 밴드를 H2 16O 또는 H2 18O가 존재하는 In-Gel Tryptic Digestion에 진행시켰고, 혼합한 다음 LC MALDI-MS/MS로 분석하였다. 상기 네 개의 비율에 걸친 단일 BSA 트립틱 펩티드에 대한 스펙트라의 전형적인 세트는 두 개의 18O 원자의 우선의 도입을 나타내고, 이는 상기 10:1 BSA 비율에서 +4 Da 피크의 우위, 및 상기 1:1 스펙트럼에서 거의 대칭적인 더블릿에 의해, 정량 및 선별을 모두 간소화하여 가장 분명히 나타난다(도 1A). 단일 18O 원자의 평균 도입은 상기 1:1 표지(Supplementary Table)에 기초하여 <7%로 추정되었다. 모든 선별된 BSA 펩티드에 대한 계산된 평균 비율은 각각 좋은 역동적인 범위, 2~11%의 높은 정확도 및 11.75% 내지 18.95%까지의 낮은 CV 범위를 나타내는, 1:1(3회 반복), 2:1(및 1:2), 1:5 및 10:1의 비율에 대해 0.98± 0.12, 2.22± 0.26, 4.90± 0.75 및 10.74± 2.04이었다(표 1). 상기 1:1 혼합물(3회 반복하여 실시된)의 재현성 있는 정확도는 표지 편향이 매우 낮은 것을 의미한다. 이는 추가적으로 오직 두 실험에서 선별된 펩티드를 사용하여, 2:1 비율에서 정상 및 반전으로 표지된 BSA의 비교로 인해 확인되었다. 상기 반전은 2.30± 0.20이었던 반면에 상기 정상 비율은 2.11± 0.33로 측정되었다(표 1).
균막 및 플랑크톤 시료의 정량적 분석을 위한 실험적 설계
두 생물학적 복제의 사용에 관련된 본 연구의 설계는, 두 개의 독립된 연속배양, 용개 벽으로부터 수득한 균막 시료로 각각 하나씩 분할, 및 상기 용기의 액상 내용물로부터 수득한 플랑크톤 시료이다. 각각의 생물학적 복제에 대한 두 기술적 복제를 실시하였고, 비록 BSA로 유의적인 표지 편향이 없는 것을 확립하였으나, 복합 생물학적 시료에 행해지는 16O/18O 표지 검증 연구의 부재로, 본 발명자들은 역 표지 전략을 이용하기로 결정하였다(30). 그러므로 총 네 번의 실험이 있고, 10 LC-MALDI MS/MS로 구성된 각각은 2 × 10 겔 조각으로부터 기인하여 진행된다.
도 2는 전형적인 역 표지 패턴을 나타내는 상기 균막/플랑크톤 시료로부터 두 개의 정상 및 역 표지 펩티드의 전형적인 MS 및 MS/MS 스펙트라를 나타낸다. BSA 데이터에 따라, 모든 펩티드에 대해 <15%로 계산된 평균 혼합된 도입으로 이중(double) 18O 도입의 높은 수준이 확인되었고, 16O/18O 단백질분해성 표지 방법도 복합 시료에 효과적인 것을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음). 이중으로 표지된 펩티드의 우위는 추가적으로 +2 Da 종에 대한 비교적 약간의 Mascot hit에 의해 확인하였다. 무겁게 표지된 펩티드의 MS/MS 스펙트라는 추가적으로 Y 이온에서 예상되는 +4 Da 이동을 나타냈다(도 2).
P. 진지발리스 세포의 플랑크톤 및 성숙한 균막의 세포막 프로테옴
본 발명자들은 실험적 절차 부문에서 기술한 선별 기준에 기초하여 1582개의 펩티드 중에서 116개 단백질의 상대적 풍부량을 선별하고 결정하였다. 선별된 단백질 중에서, 2개 이상의 고유한 펩티드를 통해 73.3%, 1개의 고유한 펩티드를 통해 12.9%가 선별되었으나, 둘다의 생물학적 복제에서 >50의 Mascot 펩티드 이온 스코어로 13.8%만이 1개의 고유한 펩티드로 선별되었다(Fig 5). CELLO(36)는 상기 단백질 중 77.6%가 세포막에서 유래할 것으로 예측하여 상기 세포막의 축적 방법의 유효성을 보여주었다. TIGR(www.tigr.org) 및 ORALGEN 구강 병원체 데이터베이스(www.oralgen.lanl.gov)를 통한 생물정보학 분류는 상기 선별된 단백질의 많은 백분율이 수송에 포함되어 있거나, 단백질 분해 활성을 가지거나 세포 대사 기능을 할 것으로 예상하였다. 흥미롭게도 모든 선별된 단백질의 55%는 기능이 알려져 있지 않았다.
기술적 복제간의 상관관계
생물학적 데이터의 기술적 복제를 비교하기 위하여, 정상 및 역 표지된 실험의 각각의 쌍의 Log10 변환된 단백질 풍부량 비율을 서로에 대하여 그래프로 나타냈다(도 3). 이러한 그래프의 선형회귀는 각각의 쌍이 생물학적 복제 1 및 2에 대해 각각 0.92 및 0.82의 R2 값과 매우 연관성이 있는 것을 나타냈다. 또한 각 선의 기울기는 상기 기술적 복제간의 표지 편향이 없는 것을 나타내는, 생물학적 복제 1 및 2에 대해 각각 0.97 및 0.93에서 0.1의 예상되는 값과 유사하였다(도 3). 상기 기술적 복제에서의 단백질 풍부량 배율은각각의 생물학적 복제에 대한 단일 비율을 제공하기 위하여 평균화되었다.
생물학적 복제의 상관관계
두 생물학적 복제에 대한 평균 데이터를 비교하기 전에, 1.0의 평균 비율을 제공하기 위해 각각의 생물학적 복제의 상기 단백질 풍부량 비율을 표준화하였다. 상기 두 생물학적 복제에서의 상기 표준화된 단백질 풍부량 비율의 그래프는 다른 연구자들에 의해 알려진 것과 유사하게(40,41) 0에 중심에 근접한 가우시안 유사 분포를 나타낸다. 상기 두 생물학적 복제간의 유의적인 양성 상관관계(이변량 상관계수 r=0.701, p<0.0001)는 균막/플랑크톤 배양의 성장 및 상기 시료의 하부 과정이 충분한 수준으로 재생산될 수 있음을 나타낸다. 어떠한 단백질이 상기 두 생물학적 복제에서 지속적으로 조절되는지 확인하기 위하여, 단백질의 풍부량 비율에 따라 6개의 군(A~F)으로 나뉘는 단백질에서 단순등급차트를 수행하였고 그런 다음 두 생물학적 활성에서의 단백질이 동일한 군에 포함될 경우 가장 높은 유사성을 갖는 1로 등급화된 것과 함께, 상관관계에 기초한 군을 1~6으로 등급화 하였다(도 4B). 등급차트를 사용하여, 본 발명자들은 두 복제로부터 선별된 81개의 단백질 중에서 34개(42%)가 1번으로 등급화 되었고, 17%(또는 1/6)일 수 있는 무작위적인 상관관계로 예상되는 값보다 상당히 더 높은 것으로 확인할 수 있었다. 남아있는 단백질의 대부분은 2번으로 등급화되었고, 따라서 총, 70개의 단백질(86.4%)이 상기 두 실험 사이에서 유사하게 조절되는 것으로 여겨졌다(1 또는 2로 등급화; 표 2).
상기 2:1 BSA 표지 실험의 측정된 표준편차(0.26)에 기초하여, 단백질 풍부량 변화는 >3 표준편차(>1.78 또는 <0.56)에 의해 1.0과 다른 경우에 생물학적으로 유의적인 것으로 여겨진다(18,42). 이러한 기준을 사용하여, 두 복제에서 선별된 81개의 단백질 중에서 47개의 풍부량은 현저히 변화되고(평균 비율에 기초), 이러한 것 중, 42개는 1 또는 2로 등급화 되었다(표 2). 1 및 2로 등급화된 42개의 단백질 중에서, 24개는 풍부량이 현저하게 증가되었고 18개는 풍부량이 감소되었다.
통합된 조절을 나타내는 대사 경로의 효소
글루타메이트/아스파테이트 이화작용에 관련된 20개의 단백질은 ICAT 표지 전략을 사용하여 헴-제한적 및 헴-과잉 연구에서 선별되었다(표 3). 이들 중, 글루타메이트에서 부틸레이트의 이화작용에 직접적으로 관련된 8가지 단계 중 6가지를 촉매작용하는 효소가 선별되었고 헴-제한 하에서 1.8 내지 4배 증가된 것으로 나타났다(도 6 및 표 3). 비록 다른 두 개의 촉매 효소(PG0690, 4-하이드록시부틸레이트 CoA-트랜스퍼라제 및 PG1066, 부틸레이트-아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼라제)는 ICAT를 사용하여 확인되지 않았으나, 표 3에 나타낸 단백질에 대해 독립된 질적연구에서 비교적 높은 이온 강도로 존재하고 증가되는 것으로 나타난 오페론에 속하는 것으로 확인되었다. 반면에, 상기 아스파테이트 이화작용 경로의 효소의 풍부량에 대한 헴-제한의 영향은, 변하지 않는 산화 분해 경로에서 아스파테이트에서 옥살로아세테이트로의 분해를 촉매작용하는 효소 및 2 내지 4.4 배 증가하는 것으로 나타나는 피루베이트에서 아세테이트의 전환에 관련된 효소와 혼합된다.
두 개의 철을 함유하는 푸마레이트 환원효소의 풍부량은, 아스파테이트로부터 환원 경로를 통해 푸마레이트에서 숙신산으로의 전환을 함께 촉매작용하는 FrdA(PG1615) 및 FrdB(PG1614)이 헴-제한으로 배양된 세포에서 현저하게 감소하였다(도 6, 표 3). 오페론에 암호화된(Baughn et al ., 2003), 이러한 두 단백질은, 헴-제한에 반응하는 풍부량에 있어서 유사한 변화를 나타낸다(FrdA L/E=0.35; FrdB L/E=0.25).
유기산 최종산물의 분석
헴-제한 하에서 자란 P. 진지발리스의 소비된 배양 배지에서의 아세트테이트, 부틸레이트 및 프로피오네이트의 양은 각각 13.09± 1.82, 7.77± 0.40 및 0.71± 0.05 mmole/세포의 건조중량 g 이었다. 헴-과잉 하에서 자란 P. 진지발리스의 소비된 배양 배지에서의 아세테이트, 부틸레이트 및 프로피오네이트의 수준은 각각 6.00± 0.36, 6.51± 0.04 및 0.66± 0.07 mmole/세포의 건조중량 g 이었다.
상기 결과는 플랑크톤 P. 진지발리스 세포가 고체 표면에 부착하여 원숙한 단일종 균막의 부분으로서 성장하는 경우 발생하는 단백질 풍부량에 변화를 나타낸다. 2D 겔 전기영동에 기초한 방법(10~12)이 사용되어온 시기에 발표된 모든 다른 이러한 연구와 같이 단백질 풍부량에 있어서의 변화를 확인하기 위한 Gygi 그룹의 geLC MS 접근법(46) 또는 상기 16O/18O 단백질분해성 표지 방법을 이용하기 위한 박테리아 균막 및 플랑크톤 성장의 최초의 비교 연구이다. 두 기술적 복제 및 두 생물학적 복제의 16O/18O 역 표지 접근법은 단백질 풍부량에 변화를 정량하고 검증하기 위해 성공적으로 이용되었다.
P. 진지발리스의 연속배양
본 발명에서 P. 진지발리스 W50은 회분배양의 더욱 전형적인 방법론과 대조적으로 연속배양으로 배양되었다. 회분배양은 다른 인자들 사이에서의, 접종의 양 및 생존, 회수 시의 박테리아의 정확한 성장 단계, 배지에서 사용가능한 영양분의 수준 및 배지의 산화환원반응 전위와 같은 회분간의 변수 때문에 박테리아 분석에서의 변화의 큰 범위 및 정도를 도입한다. 연속 배양에서 상기 박테리아는 성장률, 세포 밀도, 영양소 농도, 온도, pH 및 산화환원반응 전위를 포함하는 엄격하게 조절되는 조건 하에서 많은 계대수를 위해 성장하게 된다(44,47,48). 이전 연구에서는 다른 연구실에서 완전혼합 연속배양장치에서 연속적으로 배양된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 전사체 분석의 재현성의 높은 수준으로 나타났다(49). 게다가 본 발명에서는 균막 및 플랑크톤 세포의 성장을 단일 발효 용기에서 실시하였고, 독립된 배양에 비해 생존이 감소되었다. 본 발명에 나타낸 상기 선별된 단백질(1 및 2로 등급화)의 86.4%의 생물학적 복제 사이에 P. 진지발리스 세포 외피 단백질 풍부량에 일관된 변화는 상기 연속 배양 시스템의 적용가능성 및 P. 진지발리스 프로테옴에 대한 균막 성장의 영향의 분석에 대한 16O/18O 단백질분해성 표지 전략을 나타낸다.
18 O 표지의 효율
SDS-PAGE 방법을 할 수 있는 막단백질의 높은 분해도 및 용해도로 인해 본 발명에서 사용된 기본적인 프로테오믹 방법은 geLC MS 방법(46,50)이었다. 이 방법은 다른 연구자들에 의해 발표된 것(26-29)과 유사한 in-gel digestion 과정 동안의 단일 18O 표지 반응과 결합되었다. 효율적인 표지는 각각의 펩티드의 C-말단으로 두 개의 18O 원자의 도입을 야기하고 16O로 백-교환(back-exchange)에 저항적이다. 이는 단일 18O 원자 도입의 수준이 <7%로 측정되고 다양한 BSA 실험에 대해서 얻어진 평균 비율이 현저하게 보통 물로 백 교환이 문제가 되지 않는 것으로 여겨지는 16O를 현저히 유리하게 하지 않는 것으로 나타난 BSA를 통해 본 발명의 경우로 나타났다. 또한 생물학적 시료에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다. 18O 표지의 효율에 대한 결정적인 단계는 '단일-분해'방법을 사용한 트립틱 분해 전에 H2 18O에서 단백질의 용해가 후에 따르는 자연적인 H2 16O의 완전한 제거를 위해 요구되었다. 비록 많은 연구들에서는 '이중 분해' 방법(51,52)이 사용되어 왔으나, 이중 분해 방법에 있어서 몇몇의 트립틱 펩티드들이 초기 분해 후에 8O 원자에 대한 그들의 C-말단의 6O 원자의 교환을 할 수 없으므로 상기 단일-분해 방법은 18O 표지의 더 높은 효율을 제공하는 이점을 가진다(53). 본 발명자들은 상기 단백질이 임의의 표준 in-gel digestion 프로토콜에 따라 유기용매를 사용한 초기 탈수 단계 동안 겔 매트릭스에서 유지되는 in-gel digestion 방법을 추가적으로 사용하였다. 자연적인 H2 16O의 어떠한 흔적의 완전한 제거는 상기 단백질이 여전히 겔 매트릭스에 있는 동안 초기 동결건조 단계 동안 추가적인 흡착 손실을 막기 위해 진공 하에서 원심분리에 의해 동결건조를 통하여 수행되었다. 재수화작용 및 in-gel digestion은 역시 H2 18O에 녹인 트립신이 과량으로 포함된 H2 18O에서 실시하였다. 분해 과정 동안, 최초의 18O 원자의 도입 후 상기 겔로부터 유리된 트립틱 펩티드는 상기 과잉 트립신에 의해 매개되는 두 번째 카보닐 산소 교환 과정을 겪을 수 있다. 이는 유리된 펩티드가 단백질보다 더 높은 용해도를 가지므로 따라서 이중으로 18O 표지된 트립틱 펩티드의 더 높은 수준을 야기하기 때문에 상기 두 번째 카보닐 산소의 치환을 증진시킬 수 있다(도 1 및 2;(54)). 보통 물을 통한 백 교환을 방지하기 위하여, 이전에 효율적인 것으로 나타났던 가열을 통해 트립신을 비활성화시켰다(51,54). 또한, 상기 건조된, 비활성화된 혼합물을 오직 재현탁하였고 비록 자발적인 교환이 낮은 것으로 나타났으나(15,40), 자발적인 교환을 최소화하기 위해 nanoLC 상에 주입하기 전에 즉시 혼합하였다.
역 표지
MS를 사용한 안정적 동위원소 표지 및 정량의 경우, 상기 표지 및 이온화 과정 동안 오차가 잠재적으로 삽입된다. 이러한 오차는 MALDI 과정 동안에 상기 표지의 강력히 다른 친화도 및 무겁거나 또는 가볍게 표지된 펩티드의 가능한 억제 효과를 포함한다(13,55). 동일한 표지의 반복과 관련되는 전통적인 기술적 복제는 피크를 오염시키기 때문에 특정 표지에 대한 부정확한 편향 또는 특정 펩티드의 무작위적인 오차를 증가시킬 수 있다. 본 발명자들의 정상 또는 반전 표지된 기술적 복제는 생물학적 복제 1 및 2에 대해 각각 표지하지 않은 편향에 대해 1.0의 예상 비율에 가까운 0.97 (R2 = 0.92) 및 0.93 (R2 = 0.82)의 산점도 변화도와 상관관계의 높은 정도를 나타냈다. 또한 이러한 변화도는 상기 방법이 단백질 측정, 겔 로딩, 겔 절단 및 in-gel digestion에 관하여 재현성이 있는 것을 나타낸다. 편향의 결여는 마이크로어레이 실험에서 일상적으로 사용되는 dye swap 또는 LOWESS 데이터 표준화와 같은 표준화 관례들을 불필요할 것이라고 제시한다(35). 그러나 본 연구에서 사용된 박테리아 세포 외피 보다 더욱더 복합적인 시료들은 하나가 18O/16O 비율의 측정에 대해 미량 오염된 펩티드의 영향 및 극도의 변화를 갖는 펩티드를 확인하기 위한 필요를 고려함에 따라 여전히 역 표지 검증을 필요로 할 것이다. 조직적인 오차의 정정을 위한 평가 및 방법의 제공과 더불어 상기 역-표지 설계는 MS/MS 획득 방법이 단편에 대한 각각의 무거운/가벼운 쌍에서 오직 가장 강력한 펩티드를 선택하기 때문에 빠르게 선별되는 상기 두 무겁고 가볍게 표지된 펩티드를 허용하는 추가적인 이점을 갖는다. 이러한 방법에 있어서 부정확한 지시의 가능성이 감소된다. 틀림없이, 이는 최근 17개의 시토크롬 P450 단백질의 정량검사(26,30) 중에서 복잡적인 생물학적 시료의 역 16O/18O 표지에 대한 가장 최초의 보고이다.
균막 및 플랑크톤 배양
본 발명자들은 균막 형성 및 발달에서 재현성이 있는 것으로 나타난 상기 생물학적 복제(r = 0.701, p < 0.0001)들의 강력한 양성 상관관계를 나타냈다. 또한 이는 81개의 정량한 단백질 중 70개가 두 생물학적 복제에서 유사한 비율을 나타내는 것으로 확인된 것을 발견함으로써 나타낸다(표 2, 1 또는 2 등급). 본 발명에서 선별된 상기 P. 진지발리스 단백질의 4분의 3 이상이 >2의 고유한 펩티드에 의해 선별되었고, 또한 이러한 표지 과정의 선별 및 정량의 확실성이 증가하였다. 두 생물학적 복제로부터 일관적으로 션별된 81개의 단백질 중에서, 플랑크톤에서 균막 상태까지 풍부량에 있어서 47개가 현저하게 변화되었다. 특히 세포 외피에 있어서, 상기 발견된 프로테옴의 백분율의 풍부량에 변화는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)와 같은 균막 형성 박테리아에 대한 다른 연구들과 일치하고, 여기서 상기 발견된 프로테옴의 50% 이상이 플랑크톤 및 원숙한 균막 성장 상태 사이의 풍부량에 유의적인 변화를 보이는 것으로 나타났다(12). 또한 본 발명자들은 균막으로서 성장하기 위한 P. 진지발리스의 세포 외피 프로테옴에서의 넓은 범위의 반응을 관찰하였다. 균막 배양에 대한 반응에서의 풍부량이 바뀌는 것으로 이전에 나타났던 수많은 단백질은 또한 본 발명에서 풍부량에 있어서의 변화되는 것으로 발견되었다. 놀랍게도 어떠한 단백질은 균막 배양에 대한 반응에서 상기 프로테옴에서의 어떠한 주된 이동을 제시하는 5배까지 풍부량이 변화되는 것으로 관찰되었다(표 2).
C-말단 도메인 패밀리
P. 진지발리스는 최근 대략 80개 잔기의 보존된 C-말단 도메인(CTD)를 제외하고는 유의한 서열 상동성을 가지지 않는 34개의 세포 표면-위치 외막 단백질의 신규 패밀리를 소유하는 것으로 나타났다(31,56). 상기 The P. 진지발리스 단백질의 CTD 패밀리는 진지페인(gingipain)(RgpA [PG2024], RgpB [PG0506], Kgp [PG1844]); 세포 표면에서 비-공유 복합체를 형성하기 위하여 분비되고 프로세싱되고 상기 박테리움의 주된 발병 인자인 것으로 고려되는 Lys- 및 Arg-특이적 프로테아제 및 어드세신(adhesin)을 포함한다. 진지페인은 숙주의 구조 및 방어 단백질을 분해하는 능력 및 마우스 치주 모델에서 치경음(alveolar) 골 손실을 야기하는 기능적 Kgp 또는 RgpB가 부재된 돌연변이의 무능(62)으로 말미암아 질병의 발병에 직접적으로 결합되어 있다. 상기 CTD 패밀리 단백질은 알려져 있는 다양한 기능을 가지고 있고, 상기 CTD 단백질의 예측된 기능이 접착 및 단백질 분해 활성에 강력히 초점이 맞춰져 있으며, 또한 다른 것들 사이에서 CPG70 카복시펩티다아제(63), PrtT 티올 펩티다아제, HagA 헤마글루티닌, S. gordonii 결합 단백질(PG0350,(64)) 예측된 헤마글루티닌, 예측된 티올 환원효소, 예측된 피브로넥틴 결합 단백질, 예측된 Lys-특이적 펩티다아제(PG0553) 및 예측된 폰 빌레브란드(von Willebrand)인자 도메인 단백질을 포함한다. 상기 단백질의 대부분은 그들이 세포외 단백질 분해 활성, 응집, 헴/철 포획 및 저장, 균막 형성 및 유지, 병원성 및 산화 스트레스에 대한 내성에 포함됨으로서 상기 박테리움의 병원성에서 중요한 역할을 맡고 있다. 상기 CTD는 외막을 가로질러 단백질의 분비 및 아마도 글리코실화를 통한 세포 표면의 부착의 기능을 할 것으로 제안된다(56,65,66). 본 발명에서 본 발명자들은 9개의 CTD 패밀리 단백질이 둘 다의 복제에서 일치하게 조절되는 것을 정량할 수 있었고(표 2) PG2216 및 PG1844(Kgp)을 제외하고는 모두 균막 단계에서 풍부량이 증가되었다. 상기 많은 단백질 그룹의 풍부량이 유의하게 증가되었으므로 이들이 균막 단계에서의 중요한 기능적 역할을 수행하는 것을 제시한다.
P. 진지발리스의 주된 세포 표면 프로테아제인 RgpA, Kgp은 특히 헤모글로빈에서 펩티드 및 헴의 습득 및 세포 표면의 헴 방출에 활발히 포함된 것으로 알려져 있다(67,68). 균막 단계 동안, RgpA의 풍부량운 평균 2.7배 증가하였다. 어드헤신 도메인을 포함하고 또한 P. 진지발리스에서 헤마글루티네이션 및 헤모글리빈 결합을 담당하는 RgpA 및 Kgp에서 발견되는 HagA(69)는 균막 단계에서 풍부량이 높았다.
대조적으로 Kgp는 P. 진지발리스의 균막 세포에서 풍부량이 유의하게 낮은 것으로 관찰되었다. 이는 Kgp 풍부량이 감소된 것에서 야기되었거나 균막 배양 동안 P. 진지발리스 세포 표면을 통해 K헤가 분비도었기 때문일 수 있다. Kgp는 P. 진지발리스에서 헵티드 및 헴의 분비 및 흡수를 유도하는 표면-노출된 Lys 잔기에서 헤모글로빈의 수화하는데 중요하다(67,70). Kgp의 부착 도메인은 헤모글로빈 결합에 포함되고, Genco et al(70)은 Kgp가 사이드로포어(siderophore)와 같은 주위환경으로부터 헴을 절단하기 위하여 세포 표면에서 분비되는 헤모포어(hemophore)로서 활동하는 것을 제시하였다. 헴과 결합한 Kgp는 이후 헤모글로빈 및 헴의 활용 및 헴의 세포로의 전달 모두에 요구되는 것으로 보고된 외막 TonB-결합 수용체인 HmuR에 결합하는 것을 제안하였다(71). 또한, 흥미롭게도 HmuR과 오페론으로 암호화되는 단백질인 HmuY는 배양된 세포의 균막에서 더욱 풍부했다. 상기 hmu 위치는 6개의 유전자(hmuYRSTUV)를 포함하고 Iht 및 Htr 시스템과 유사한 헴 습득 경로에 포함되는 단백질을 암호화하는 다중생성 클러스터(multigenic cluster)에 속하는 것으로 제안되었다(72). HmuY는 헤모글로빈 및 헴 활용 모두에서 요구되고, 철 유용성에 의해 조절되는 것으로 나타났다(72,73). HmuR이 본 발명에서 선별되지 않았음에도 불구하고, 상기 hmuR 및 hmuY 및 다른 증거들의 오페론 특성이 그들의 발현이 유사하게 조절되고 그들이 헴 활용에서 동일하게 행동하는 것을 제안한다(71,74). 그러므로 Kgp 풍부량의 감소 및 HmuY 풍부량의 증가는 헤모포어 및 균막 성장에서의 헴 제한으로서의 그들의 제안된 역할과 일치한다(하기 참조).
또한, 진지페인 프로세싱에 포함되는 것으로 알려진 CTD 패밀리 프로테아제인 CPG70(PG0232)는 균막 배양에서의 풍부량이 일치하게 높은 것에서, 균막 성장 동안 세포 표면 단백질을 리모델링하는 역할을 담당하는 것을 암시한다(63,75). 또한, 예측된 티오레독신(PG0616)인 CTD 패밀리도 균막 단계에서 풍부량이 유의하게 높았다. PG0616은 함께 응집되는 특성을 가지는 헴 결합 단백질인 HBP35로서 특징되었다(76). 주목할 만한 것은 면역활성 46 kDa 항원인 PG99의 증가된 풍부량이 균막 세포에서 5.0의 평균 인자였다(표 2). 이는 본 발명에서 단백질 풍부량에서 가장 높게 증가된 측정치였고, PG99가 면역원성 및 CTD 패밀리 멤버 모두이므로 세포 표면에 위치할 가능성이 매우 높고, 상기 단백질은 균막 붕해제의 좋은 잠재적 표적임을 나타낸다.
수송 단백질
또한 두 개의 예측된 TonB 의존성 수용체 패밀리 단백질(PG1414 및 PG2008) 및 예측된 헴 수용체 단백질(PG1626)도 풍부량의 유의한 증가를 보여준다. 상기 단백질의 정확한 기능은 알려져 있지 않으나, NCBI COG 데이터베이스에서 COG 검색은 대부분 Fe 수송에 포함되는 외막 수송체 단백질의 P 기능적 클래스에 속하는 것으로 나왔다(77). 또한, 흥미롭게도 본 발명자들은 세포내 철 저장 단백질인 페리틴(PG1286)의 증가된 풍부량을 관찰하였다. 상기 철/헴 수송 및 저장 단백질의 풍부량에서 일치하는 증가는 특히 철-의존 조건에서 P. 진지발리스가 생존하는 것에 페리틴이 중요한 것으로부터 균막의 깊은 막에서 헴/철 제한을 가리키는 것일 수 있다(78).
P. 진지발리스의 높은 단백질 분해 활성, 높은 헤모글로빈 및 헴 결합 및 저장 용량으로 말미암아 헤모글로빈 및 헴 모두가 균막에서 그리 멀리 분산되지 않는 것으로 보인다. 또한, 헴 같은 철의 세포 표면 저장의 적은 기회 때문에 페리틴의 증가를 설명할 수 있는 균막의 깊은 막에서 상기 종의 철 대사의 더욱 중요한 역할을 하는 FeoB1을 통해 철 수송을 하 담당하는 것이 가능하다(45,79). P. 진지발리스는 세포내 철의 증가를 나타내는 헴 제한의 조건 하에서 자라는데, 이는 PPIX가 성장 제한 인자이고, 철이 FeoB1 수송자를 통해 축적되는 것을 가리킨다(45).
IhtB(PG0669) 및 예측된 TonB 의존성 수용체(PG0707) 모두는 균막 단계에서 풍부량이 감소되는 것을 보여주었다(표 2). IhtB는 헴 결합 지질단백질이고 또한 P. 진지발리스를 통해 헴이 흡수되기 전에 철을 제거하는 말단 외막 킬라테아제(chelatase)로서 기능하는 것이 제안되었다(80). 두 단백질의 풍부량의 유사한 감소는 많은 다른 단백질의 풍부량의 증가와 일치하는, 흡수를 위해 사용될 수용체의 타입 또는 더욱 유사하게는 사용되는 물질의 변화에서 변화를 나타내는 균막 단계 동안의 헴/철 흡수에 포함된다. 상기 관찰과 함께, 균막에서 자라는 P. 진지발리스는 헴이 결핍된 것으로 나타났다. 그러므로 상기 몇몇의 수송 및 결합 단백질의 높은 풍부량은 그들이 균막 단계 동안에 더욱 중요하게 될 것이고, 따라서 잠재적 항생재 표적이 될 것으로 제안한다.
상기 플랑크톤에 비해 상기 균막 단계 동안 해당 효소 글리세르알데히드 3-인산 탈수산화효소(glyceraldehyde 3-phosphate 탈수산화효소, GAPDH)의 풍부량은 더 높고 이는 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대해 수득한 이전의 결과와 일치한다(12,106). 비록 GAPDH가 해당작용 및 글루코네오제네시스와 관련된 테트라머릭 NAD-결합 효소로서 분류되지만, 이러한 다기능적인 단백질의 수많은 보고가 있었고 그램-양성 박테리아의 세포 표면에서 발현되는 경우에, 플라스민, 플라스미노겐 및 트랜스페린의 결합에 관련되는 것으로 나타났다(107,108). 흥미롭게도, 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis) 및 P. 진지발리스 33277 사이의 응집반응은 P. 진지발리스 핌브리애 (fimbriae) 및 S. oralis GAPDH의 상호작용에 의해 매개되는 것으로 나타났다(109). P. 진지발리스에서 기질 결합에 있어서 GAPDH의 정확한 역할이 만약에 있다면, 해결되어야 할 것으로 남아있다.
균막 형성
상기 균막 세포에 비해 상기 플랑크톤 세포에서 전반적인 스트레스 단백질(UspA)의 풍부량이 현저하게 더 높다. 다양한 박테리아에서 Usp의 생산은 정지 상태로의 도입, 어떠한 영양분의 절식, 산화제 및 다른 자극제와 같은, 다양한 조건에 의해 자극되는 것을 발견하였다(110,111). 플랑크톤 상태 세포에서 증가된 풍부량은 P. 진지발리스가 균막의 부분으로서 성장에 관련되고 플랑크톤 상태가 더욱 스트레스가 많기 쉽다는 사실과 일치한다. UspA의 비활성화가 플랑크톤 세포에 의한 초기 균막 형성의 감쇠를 야기함에 따라 P. 진지발리스에서 UspA의 발현은 균막 형성과 관련되는 것으로 여겨진다(112). 본 발명에서 상기 균막이 확립되었고 돌연변이 되었으며, 따라서 자유롭게 부유하는 플랑크톤 세포에 비해 UspA에 대해 더 적은 필요성을 갖는 것으로 나타났다.
상기 인터날린 패밀리 단백질 InlJ(PG0350)의 상동체는 상기 균막 단계 동안 풍부량이 더 높은 것으로 관찰되었다. 유전자 비활성화가 감소된 균막 형성을 야기함에 따라 PG0350은 P. 진지발리스 33277에서 균막 형성에 중요한 것으로 나타났다(39). 상기 균막에서 더 높은 수준의 PG0350은 이 단백질이 초기 균막 형성에 필요하지 않지만 P. 진지발리스 서로에 대해 또는 균막 내에서 세포 밖의 기질들을 결합하는 부착인자로 작용하는 것으로 제시할 수 있다.
기능이 알려지지 않은 단백질들
본 발명에서 선별된 단백질의 가장 큰 군은 본 발명에서 최초로 선별된 4개의 단백질을 포함하는 41개의 기능이 알려지지 않은 단백질이었다(표 2). 선별된 상기 41개의 단백질 중, 37개는 세포 외피로부터 예측되었고 이 군 내에서 17개의 단백질은 균막 및 플랑크톤 세포간의 유의적인 변화를 나타냈다. 이러한 단백질의 다수는 정의된 이름은 있으나 잘 정의된 기능은 없는 유전자은행 단백질들과 상동적이었다. 특히 흥미로운 것 중에는 균막 단계에서 풍부량에 있어서 상당히 증가하는 것으로 일관적으로 발견되는 몇몇의 단백질, 즉 PG0181, PG0613, PG1304, PG2167 및 PG2168이 있다.
상기 결과는 복합체 혼합물에 적용됨으로써 상기 16O/18O 단백질분해성 표지 방법의 대규모 검증을 나타내고, 박테리아 균막 및 플랑크톤 성장 단계의 비료를 위한 이러한 접근법으로 최초로 사용된 것이다. 다양한 기능을 갖는 수많은 단백질이 상기 균막 세포에서 풍부량에 있어서 일관적인 증가 또는 감소를 나타냈고, 상기 세포가 균막 조건에 어떻게 적응하는지 나타내며 또한 균막 조절 전략에 대한 잠재적인 표적을 제공한다.
16O/18O 단백질 분해성 표지를 사용한 예측된 BSA 비율의 정량
예측된 비율 1:1a) 3반복 분석 평균 비율
(±SD)
CCTESLVNR 0.83 0.84 0.88 0.85 ± 0.03
DLGEEHFK 0.95 1.06 0.85 0.95 ± 0.10
EACFKVEGPK 1.09 1.12 1.09 1.10 ± 0.02
ECCDKPLLEK 1.01 0.96 0.87 0.94 ± 0.07
EYEATLEECCAK 1.05 1.01 1.05 1.04 ± 0.02
LVTDLTKVHK 0.86 0.91 1.02 0.93 ± 0.08
RHPEYAVSVLLR 1.07 0.96 0.94 0.99 ± 0.07
YICDNQDTISSK 1.00 1.15 1.03 1.06 ± 0.08
평균 0.98 ± 0.10 1.00 ± 0.10 0.97 ± 0.09 0.98 ± 0.08
모든 펩티드 ID**의 평균 0.98 ± 0.12
모든 펩티드 ID의 CV 13.1%
예측된 비율 2:1 b)
(18O/16O)		 예측된 비율 1:2 b)
(18O/16O)
QTALVELLK 1.92 0.44 (2.27) 2.10
LVNELTEFAK 2.45 0.46 (2.17) 2.31
RHPEYAVSVLLR 1.82 0.42 (2.36) 2.09
LGEYGFQNALIVR 2.21 0.43 (2.31) 2.26
MPCTEDYLSLILNR 2.59 0.40 (2.50) 2.55
KVPQVSTPTLVEVSR 2.35 0.39 (2.57) 2.46
LFTFHADICTLPDTEK 1.72 0.44 (2.27) 2.00
RPCFSALTPDETYVPK 1.82 0.52 (1.92) 1.87
평균 2.11 ± 0.33 2.30 ± 0.20 2.24 ± 0.24
모든 펩티드 ID***의 평균 2.22 ± 0.26
모든 펩티드 ID의 CV 11.75%
예측된 비율 1:5 예측된 비율 10:1
(18O/16O) (18O/16O)
AEFVEVTK 0.232 (4.32) AEFVEVTK 12.38
CCTESLVNR 0.184 (5.42) QTALVELLK 10.40
SHCIAEVEK 0.176 (5.67) LVNELTEFAK 14.17
ECCDKPLLEK 0.169 (5.91) FKDLGEEHFK 9.41
HPEYAVSVLLR 0.218 (4.58) HPEYAVSVLLR 11.76
YICDNQDTISSK 0.187 (5.36) YICDNQDTISSK 10.16
LKECCDKPLLEK 0.252 (3.97) RHPEYAVSVLLR 10.14
SLHTLFGDELCK 0.183 (5.45) SLHTLFGDELCK 7.58
RHPEYAVSVLLR 0.201 (4.97) EYEATLEECCAK 14.07
VPQVSTPTLVEVSR 0.206 (4.86) ETYGDMADCCEK 12.67
ECCHGDLLECADDR 0.298 (3.35) LGEYGFQNALIVR 9.36
LFTFHADICTLPDTEK 0.210 (4.76) VPQVSTPTLVEVSR 8.34
KVPQVSTPTLVEVSR 8.86
LFTFHADICTLPDTEK 11.08
RPCFSALTPDETYVPK 10.26
평균 0.210 ± 0.04 (4.90 ± 0.75) 10.74 ± 2.04
모든 펩티드 ID의 CV 15.26% 18.95%
a) 1:1의 예측된 비율에 대해, 모든 이러한 독립된 실험에서 선별된 펩티드들만 이 표에 포함
b) 2:1 및 1:2의 예측된 비율에 대해, 두 실험에서 선별된 펩티드들만 이 표에 포함
** n=55
*** n=24
상기 P. 진지발리스 세포 외피 분획의 두 생물학적 복제로부터 선별된 상기 81개의 단백질의 목록. >1의 존재비는 플랑크톤 단계에 대한 상기 균막에 있어서 상기 단백질의 더 높은 풍부량를 나타낸다. 만약 비율이 상기 예측된 BSA 비율(>1.78 또는 <0.56)로부터 3배 이상의 SD(0.26)를 갖는 것과 다르다면, 상기 단백질은 현저하게 변화하는 것으로 여겨졌다. 그들의 평균 비율을 기초로, 굵은 글씨로 강조된 단백질은 유의적인 변화를 나타낸 것이다.
생물학적 복제 1 생물학적 복제 2
Tigr # 단백질 Loca 퀀트를 위한 #펩티드 마스코트 점수
b		 표준비율
(B/P)c		 SEd 퀀트를 위한 #펩티드 마스코트 점수 표준비율 (B/P) SE 총 고유한 펩티드 등급
(그룹) e
CTD 패밀리 단백질
단백질분해효소
PG0232 Zinc 카복시펩티다아제, CPG70 OM 13 71/20 1.67 0.08 26 74/21 2.53 0.08 15 3 (DF)
PG0553 세포외 프로테아제, 리실 엔도펩티다아제 전구체 (API) OM/EX 1 65/23 3.33 2 62/19 3.45 2 1 (FF)
PG1424 펩티딜아르기닌 디이미나아제 PP 9 86/22 0.49 0.05 15 89/20 3.16 0.33 10 4 (BF)
PG1837 헤마글루티닌 단백질 HagA OM 3 (15)* 59/20 2.73 0.44 3 (15)* 42/21 4.21 0.36 3 1 (FF)
PG1844 리신-특이적 시스테인 프로테아제 OM 3 (13)* 78/20 0.43 0.04 9 (24)* 77/18 0.40 0.04 10 1 (BB)
PG2024 아르기닌-특이적 프로테아제 ArgI 폴리단백질 (RgpA) OM 3 (12)* 76/22 1.63 0.10 3 (22)* 72/20 3.78 0.61 4 3 (DE)
헴 결합
PG0616 티오레독신, 추정 PP/CY 14 96/20 2.23 0.20 14 96/20 3.69 0.20 6 2 (EF)
균막 관련
PG0350 인테그린-관련 단백질 OM/EX 2 42/21 1.99 2 53/21 4.27 3 2 (EF)
기능이 알려지지 않은 단백질
PG1798 면역활성 46 kDa 항원 PG99 PP/EX 1 36/20 5.94 1 30/21 4.07 1 1 (FF)
PG2216 무명의 단백질 (보존됨) OM/EX 2 36/22 0.72 NA 4 51/21 0.68 0.06 3 1 (CC)
수송
PG0669 헴-결합 단백질 IhtB OM 16 120/21 0.25 0.03 14 69/20 0.16 0.02 6 1 (AA)
PG0707 TonB-의존 단백질, P92 OM 5 110/21 0.14 0.02 30 117/20 0.31 0.04 17 1 (AA)
PG0782 MotA/TolQ/ExbB 양성자 채널 패밀리 단백질 IM 7 80/19 0.86 0.14 4 78/19 0.92 0.12 7 1 (CC)
PG1006 추정 TonB 의존 단백질 OM/EX 6 59/21 1.42 0.12 9 90/20 1.50 0.11 7 1 (DD)
PG1414 TonB 결합 외막 수용체, PG47 OM 11 88/21 3.81 0.43 3 49/19 3.69 NA! 7 1 (FF)
PG1551 HmuY 단백질 UN 4 75/20 2.57 0.71 4 74/20 2.78 0.21 1 1 (DD)
PG1626 후보 외막-연관 단백질 P58 (추정 헴 수용체 단백질) OM 41 113/21 2.37 0.22 37 122/19 3.68 0.26 17 2 (EF)
PG2008 TonB-의존 단백질, P90 OM 24 68/21 2.08 0.17 26 112/20 3.12 0.21 20 2 (EF)
PG0185 RagA 단백질 OM 58 89/21 0.42 0.02 109 126/20 0.79 0.04 24 2 (BC)
PG0186 지질단백질 RagB OM 51 142/22 0.34 0.04 56 142/19 0.26 0.02 24 1 (AA)
PG1010 ABC 수송자, ATP-결합 단백질 IM 1 69/21 1.41 2 60/19 1.26 2 1 (DD)
PG1762 단백질-분비 막 단백질 SecD/단백질-분비 막 단백질 SecF IM 14 91/22 0.76 0.07 4 99/20 0.48 0.09 10 2 (CB)
PG2082 POT 패밀리 단백질 IM 13 75/23 0.80 0.06 6 48/22 0.52 0.10 4 1 (CC)
이온/헴 저장 및 산화적 스트레스 반응
PG0090 Dps 패밀리 단백질 CY 3 72/19 1.37 0.15 1 40/21 1.27 2 1 (DD)
PG1286 페리틴 CY 5 73/22 1.50 0.04 7 124/19 2.42 0.14 3 2 (DE)
균막 및 전이 관련
PG0159 엔도펩티다아제 PepO PP/CY 8 122/20 0.35 0.08 3 60/19 0.18 NA! 3 2 (BA)
PG0245 일반 스트레스 단백질 패밀리 CY 1 67/22 0.41 2 64/20 0.25 1 2 (BA)
PG2132 핌브릴린 EX 1 31/22 1.14 2 66/20 0.85 3 2 (DC)
에너지 대사
PG0249 옥살로아세트산 탈탄산효소, 추정 CY 1 44/22 3.50 1 37/21 2.00 1 2 (FE)
PG0306 전자 수송 복합체, RnfABCDGE 타입, G 서브유니트 PP 2 108/22 1.08 1 61/19 0.72 1 2 (DC)
PG1084 티오레독신 패밀리 단백질 CY 2 87/22 1.07 1 132/20 0.14 1 4 (DA)
PG1612 메틸말로닐-CoA 탈탄산효소, 알파 서브유니트(mmdA) CY 1 65/21 0.73 2 55/21 0.42 1 2 (CB)
PG1614 푸마르산 환원효소, 철-황 단백질 (frdB) UN 2 60/20 0.15 2 53/21 0.19 2 1 (AA)
PG1615 푸마르산 환원효소, 플라보단백질 서브유니트 (frdA) UN 3 58/19 0.06 NA! 1 43/20 NA** 3 NA
PG1704 Thiol:이황화결합 교환 단백질 dsbD, 추정 IM 3 64/23 2.14 3 68/20 0.46 0.08 1 4 (EB)
PG2181 NADH:유비퀴틴 산화환원효소, Na 이동, B 서브유니트 (nqrB) IM 1 91/21 1.32 1 69/20 0.38 1 3 (DB)
PG2124 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 CY 3 105/22 3.39 0.62 2 94/19 2.45 3 2 (FE)
PG2157 글루타민 사이클로트랜스퍼라아제-연관 단백질 PP/EX 2 70/21 0.11 3 53/20 0.45 NA! 3 2 (AB)
리보솜 단백질
PG0167 리보좀 단백질 L25 CY 4 57/20 0.27 0.05 2 50/21 0.30 3 1 (AA)
PG0375 리보좀 단백질 L13 (rplM) CY 2 69/21 0.28 1 116/20 0.18 2 1 (AA)
PG0392 리보좀 단백질 L10 (rplJ) CY 2 97/21 0.33 5 68/22 0.37 0.02 3 2 (AB)
PG0393 리보좀 단백질 L7/L12 CY 6 81/20 0.68 0.03 4 79/21 0.56 0.03 4 2 (CB)
기능이 알려지지 않은 단백질
부착 외막 단백질
PG0027 후보 외막 부착 단백질 P40 OM 11 143/21 0.74 0.06 23 111/20 0.81 0.02 11 1 (CC)
PG0613 후보 외막 연관 단백질 P23 EX 3 55/19 4.41 0.56 1 43/20 3.24 2 1 (FF)
PG0694 외막 단백질 40 OM 37 116/20 3.62 0.37 77 86/20 3.39 0.24 13 1 (FF)
PG0695 외막 단백질 41 OM 100 110/21 2.31 0.21 53 124/19 3.18 0.20 19 2 (EF)
PG1652 후보 외막 부착 단백질 P64 OM 2 53/20 1.04 14 67/20 1.70 0.27 5 2 (CD)
PG1786 후보 외막 부착 단백질 P30 EX/OM 5 56/21 0.99 0.17 5 56/26 1.33 0.08 3 2 (CD)
PG1823 후보 외막 부착 단백질 P20 PP/OM 26 117/21 0.39 0.03 18 91/20 0.98 0.10 7 2 (BC)
PG2106 후보 외막 부착 단백질 P22 IM/OM 15 73/20 0.31 0.04 13 103/17 0.45 0.04 7 2 (AB)
지질단백질
PG0188 지질단백질, 추정 PP/EX 7 72/23 0.92 0.09 4 40/20 1.18 0.11 5 2 (CD)
PG0241 지질단백질, 추정 OM/EX 4 93/20 0.45 0.08 2 44/20 0.16 3 2 (BA)
PG0906 지질단백질, 추정 PP/CY 1 42/22 0.48 5 97/20 0.40 0.05 3 1 (BB)
PG2173 외막 지질단백질 Omp28 PP/OM 8 109/22 0.77 0.1 12 89/18 0.71 0.04 7 1 (CC)
다른 단백질
PG0179 무명의 단백질 (보존됨) PP/EX 1 64/22 1.23 1 61/19 3.55 1 3 (DF)
PG0181 면역활성 32 kDa 항원 PG49 PP/OM 4 46/20 2.08 0.84 1 31/21 3.14 3 2 (EF)
PG0217f 무명의 단백질 OM 4 74/21 1.58 0.34 7 79/18 1.78 0.07 5 2 (DE)
PG0218 무명의 단백질 OM 4 61/20 2.10 0.55 11 55/20 1.59 0.17 4 2 (ED)
PG0287f 무명의 단백질 IM/OM 3 77/21 1.32 0.06 7 53/20 1.90 0.21 5 2 (DE)
PG0409 무명의 단백질 (보존됨) PP 4 82/22 2.20 0.38 2 69/19 2.28 2 1 (EE)
PG0423 무명의 단백질 (보존됨) CY 2 90/23 3.62 1 72/21 0.68 1 4 (FB)
PG0452 무명의 단백질 (보존됨) OM 1 53/20 0.39 3 81/20 0.40 0.11 2 1 (BB)
PG0448 무명의 단백질 (보존됨) OM 11 74/22 1.05 0.11 10 58/20 1.44 0.08 7 1 (DD)
PG0449 TPR 도메인 단백질 PP 2 68/23 1.28 1 64/18 1.19 1 1 (DD)
PG0602 무명의 단백질 (보존됨) OM 3 63/21 0.65 0.07 1 37/21 NA** 2 NA
PG0914 무명의 단백질 OM 1 66/21 2.23 1 27/22 2.91 2 2 (EF)
PG1028 TPR 도메인 단백질 PP 2 78/21 0.37 5 70/19 0.48 0.08 4 1 (BB)
PG1035 무명의 단백질 (보존됨) OM 1 42/21 0.31 5 62/21 1.16 0.16 3 4 (AD)
PG1304 무명의 단백질 (보존됨) OM 3 52/20 2.80 1.00 1 34/20 2.93 1 2 (EF)
PG1356 무명의 단백질 (보존됨) CY 2 60/21 0.31 1 43/21 0.12 2 1 (AA)
PG1382 무명의 단백질 (보존됨) OM 3 63/21 1.89 0.29 1 51/21 4.43 2 2 (EF)
PG1493 무명의 단백질 (보존됨) OM 6 67/22 1.85 0.15 8 79/17 2.20 0.17 13 1 (EE)
PG1621 무명의 단백질 (보존됨) OM 2 51/21 1.10 4 60/21 0.42 0.05 2 2 (CB)
PG1684f 무명의 단백질 EX/IM 1 58/22 1.25 1 73/20 0.79 1 2 (DC)
PG1715 무명의 단백질 (보존됨) OM 4 51/20 1.10 0.04 13 71/20 0.97 0.14 3 2 (DC)
PG1881 무명의 단백질 (보존됨) OM 2 49/22 0.61 4 48/19 0.82 0.16 3 1 (CC)
PG1889f 무명의 단백질 CY 12 99/20 0.16 0.02 8 85/20 0.25 0.03 6 1 (AA)
PG2049 무명의 단백질 IM/CY 3 48/21 0.63 0.06 1 27/21 0.82 1 1 (CC)
PG2167 면역활성 53 kDa 항원 PG123 OM 7 64/20 2.84 0.73 4 45/20 2.26 0.06 3 1 (EE)
PG2168 무명의 단백질 (보존됨) UN 3 47/21 4.90 1.97 4 74/21 2.04 0.14 4 2 (FE)
PG2174 무명의 단백질 OM 5 58/21 0.78 0.06 15 102/21 0.37 0.04 7 2 (CB)
a CELLO 프로그램에 의해 측정된 위치; EX: 세포밖(Extracellular), OM:외막(Outer membrane), IM: 내막(Inner membrane), PP: 원형질막공간(Periplasm), CY: 세포질(Cytoplasm); UN: 알려지지 않음(unknown)
b 최대 마스코트 펩티드 이온 점수 / 선별 한계치
c 표준화된 비율; B = 균막(Biofilm), P= 플랑크톤(Planktonic), 실험 과정에 나타낸 바에 따른 표준화 과정
d SE = 평균의 표준오차(Standard error of the mean)
e 도 4B에 나타낸 바와 같은 등급화 및 그룹화
f 오직 본 발명에서 선별된 단백질
! 3 펩티드 중 하나의 비분해된/겹쳐진 것에 의해 SE 측정이 실시되지 않음
* 이러한 단백질간의 동일한 펩티으의 존재 때문에, 오직 이러한 단백질에 대해 고유한 펩티드로부터 유래. 괄호안의 값은 매치된 펩티드의 합계이다.
** 비분해된/겹쳐진 피크에 의함
헴-과잉과 비교하여 헴-제한에서 성장하는 동안 P. gingivalis에서 글루타메이트/아스파테이트 이화작용과 관련된 유전자 산물의 프로테오믹 및 전사체 분석. 굵은 글씨로 표시한 것은 오페론에 암호화된 것으로 예측되는 단백질을 나타냄.
번호 Tigr Acc# 선별된 단백질 및 펩티드 서열 점수1 N2 n- ICAT3 단백질체 배수 변화4 SD (±) 전사체 배수변화 전사체
P-값
1 PG0329 포름이미노트랜스퍼라아제 - 사이클로디아미나아제 -연관 단백질
. IMEC*VPNFSEGR 		30/14 2 1 2.9 - NS5
2 PG0548 피루브산 페레독신 / 플라보독신 옥시도리덕테아제 패밀리 단백질
. IAGELLPC*VFHVSAR
33/15		 1 1 2.0 - NS
3 PG0687 숙신산- 세미알데하이드 탈수산화효소
.AFDNGIIC*SGEQSIIYNEADK
. C*SAHAVR
. EYQATHNQEAVDNIC*R
. GVGAEDVIC*K
. NHGAYFC*DEAEGDR
. TC*NAIIIAPHPR
37/18
22/16
18/13
43/13
53/14
66/13		 27 6 4.0 1.6 1.77 0.066
4 PG0689 NAD -의존 4- 히드록시부티르산 탈수산화효소
. ELIIVPTTC * GTGSEVTN ISIAEIK
. ILNC * QPEYVYPK
. LDELLGC * LLTK
35/19
41/18
35/14 		12 3 2.8 0.8 1.93 8.892E-05
5 PG0690 6 4- 히드록시부티르산 - CoA 트랜스퍼라아제 3.31 0.03
6 PG0691 6 NifU - like 단백질 1.60 0.0002
7 PG0692 4- 히드록시부틸 - CoA 디하이드라타아제
. AGNYMIDLLLANVC *K
. TASC * FQR
42/15
20/15 		5 2 2.9 0.7 1.65 0.054
8 PG1067 이론적 단백질
. TDISESAADVLDEPIVVC *R
64/14 		2 1 2.4 - NS
9 PG1068 보존된 이론적 단백질
. MIITAAIC * GAEVLK
. AVC * PDVIIQPSTGGAVGMTNDER
40/12
38/15 		3 2 1.7 0.1 NS
10 PG1075 6 부티르산-아세토아세트산 CoA 트랜스퍼라아제 1.4 0.05
11 PG1076 Acyl - CoA 탈수산화효소 , 짧은-사슬 특이적
. LYC * AETAMDMTTK
. SIAQFQNTQFQLADLQC *R
26/14
23/19 		3 2 1.8 0.2 NS
12 PG1078 전자 전이 플라보단백질 , 알파 서으유니트
. VTAILC * GYK
. TGLTADC * TSLEIGDER
22/15
55/15 		5 2 2.0 0.4 NS
13 PG1079 6 에노일 - CoA 1.3 0.04
14 PG1081 아세트산 키나아제
. VLVLNC * GSSSVK
. AC * EILGLDYDK
. VEEC * IPLAPLHNPANLK
42/14
29/15
42/14 		9 3 3.5 0.9 NS
15 PG1082 포스포트랜스아세틸라아제
. AAELVENPLYLGC * LIVK
. GC * SVEDIYR
52/15
45/15 		5 2 4.4 1.6 NS
16 PG1232 글루탐산 탈수산화효소 , NAD -특이적
.C*MLDLR
.LRPESTGFGAVYFVQNMC*K
28/14
54/15		 10 2 2.3 1.2 NS
17 PG1271 오르니틴 아미노전이효소
.AVIIVC*DGNFHGR
.YFDFLSAYSAVNQGHC*HPK
42/19
32/19		 3 2 0.09 - NS
18 PG1417 푸마르산 하이드라타아제 클래스 I, 혐기성
.GQLPFC*QDTGTAIILGK
.HGASC*PVGMGVSC*SADR
57/15
18/16		 3 2 1.0 0.2 NS
19 PG1612 메틸말로닐 - CoA 탈탄산효소 , 알파 서으유니트
.FNGQSVGIVANQPQVMAGC*LDSNASR
.C*TNFGIDK
28/14
21/15		 2 2 2.4 - NS
20 PG1614 푸마르산 환원효소, 철-황 단백질 ( FrdB )
. MDELGFGNC * TNTR
. APVVFDHDC *R
45/15
36/13 		6 2 0.25 0.1 NS
21 PG1615 푸마르산 환원효소, 플라보단백질 서브유니트 ( FrdA )
. LAEVSNAIIDQC * VAQGVPFAR
29/14 		1 1 0.35 - NS
22 PG1741 아스파르트산 암모니아- 리아제
.C*GLHEFNLPAMQPGSSIMPGK
.VNPVIPEVMNQIC*YK
24/14
20/15		 4 2 1.0 0.2 NS
23 PG1810 2- 옥소글루타르산 옥시도리덕테아제 , 베타 서브유니트
.IADMLALLDGTC*LVTR
54/16		 3 1 2.5 0.5 NS
24 PG1949 말레이트 탈수산화효소
.LTPNLC*LYDPFAVGLEGVAEEIR 		35/15 3 1 1.0 0.2 NS
1 가장 높은 점수를 나타낸 펩티드 점수/한계치 점수 (P=0.05)
2 각각의 단백질에 대한 독립된 펩티드 선별 시행의 합계
3 각각의 단백질에 대해 선별된 고유한 ICAT-표지 펩티드의 수
4 배수 변화에 있어서 각각의 단백질에 대한 모든 정량된 펩티드의 평균 비율(헴-제한/과잉)
5 NS 통계학적으로 유의적인 변화가 관찰되지 않음
6 오직 마이크로어레이 분석에서 선별됨
C* ICAT-변형된 시토신을 나타냄
균막 형성의 억제를 위한 표적으로서 선택된 상기 24개의 P. gingivalis 폴리펩티드
Tigr # 단백질 예측된 위치 비율
(B/P)
생물학적 복제 1		 비율
(B/P)
생물학적 복제 2		 등급
(그룹) 		등록번호* 등록번호 버전
CTD 패밀리 단백질
PG0232 Zinc 카복시펩티다아제, CPG70 OM 1.67 2.53 3(DF) AAQ65462 AAQ65462.1
PG0553 세포외 프로테아제, 리실 엔도펩티다아제 전구체 (API) OM/EX 3.33 3.45 1 (FF) AAQ65742 AAQ65742.1
PG2024 아르기닌-특이적 프로테아제 ArgI 폴리단백질 (RgpA) OM 1.63 3.78 3 (DE) AAQ66991 AAQ66991.1
헴 결합
PG0616 티오레독신, 추정 PP/CY 2.23 3.69 2 (EF) AAQ65800 AAQ65800.1
균막 관련
PG0350 인테그린-관련 단백질 OM/EX 1.99 4.27 2 (EF) AAQ65561 AAQ65561.1
부착
PG1837 헤마글루티닌 단백질 HagA OM 2.73 4.21 1 (FF) AAQ66831 AAQ66831.1
기능이 알려지지 않은 단백질
PG1798 면역활성 46 kDa 항원 PG99 PP/EX 5.94 4.07 1 (FF) AAQ66797 AAQ66797.1
수송
PG1414 TonB 결합 외막 수용체, PG47 OM 3.81 3.69 1 (FF) AAQ66469 AAQ66469.1
PG1551 HmuY 단백질 OM 2.57 2.78 1 (DD) AAQ66587 AAQ66587.1
PG1626 후보 외막-연관 단백질 P58 (추정 헴 수용체 단백질) OM 2.37 3.68 2 (EF) AAQ66654 AAQ66654.1
PG2008 TonB-의존 단백질, P90 OM 2.08 3.12 2 (EF) AAQ66977 AAQ66977.1
기능이 알려지지 않은 단백질
내재성 외막 단백질
PG0613 후보 외막 연관 단백질 P23 EX 4.41 3.24 1 (FF) AAQ65797 AAQ65797.1
PG0694 외막 단백질 40 OM 3.62 3.39 1 (FF) AAQ65867 AAQ65867.1
PG0695 외막 단백질 41 OM 2.31 3.18 2 (EF) AAQ65868 AAQ65868.1
다른 단백질
PG0181 면역활성 32 kDa 항원 PG49 PP/OM 2.08 3.14 2 (EF) AAQ65416 AAQ65416.1
PG0218 무명의 단백질 OM 2.10 1.59 2 (ED) AAQ65449 AAQ65449.1
PG0914 무명의 단백질 OM 2.23 2.91 2 (EF) AAQ66051 AAQ66051.1
PG1304 무명의 단백질 (보존됨) OM 2.80 2.93 2 (EF) AAQ66377 AAQ66377.1
PG1382 무명의 단백질 (보존됨) OM 1.89 4.43 2 (EF) AAQ66444 AAQ66444.1
PG1493 무명의 단백질 (보존됨) OM 1.85 2.20 1 (EE) AAQ66538 AAQ66538.1
PG2167 면역활성 53 kDa 항원 PG123 OM 2.84 2.26 1 (EE) AAQ67117 AAQ67117.1
PG2168 무명의 단백질 (보존됨) UN 4.90 2.04 2 (FE) AAQ67118 AAQ67118.1
에너지 대사
PG1614 푸마르산 환원효소, 철-황 단백질 (frdB) UN 0.15 0.19 1(AA) AAQ66642 AAQ66642.1
PG1615 푸마르산 환원효소, 플라보단백질 서브유니트 (frdA) UN 0.06 - NA AAQ66643 AAQ66643.1
* 이러한 등록번호는 본 명세서에서 언급된 P. gingivalis 단백질에 대한 서열을 제공한다. 상기 등록번호에 대응하는 서열은 참조로서 포함된다.
헴-과잉에 비교하여 헴-제한에서 성장한 P. gingivalis의 프로테오믹 및 전사체 분석. 굵은 글씨로 표시한 것은 오페론에 암호화된 것으로 예측되는 단백질을 나타냄.
번호 Tigr Acc# 선별된 단백질 및 펩티드 서열 점수1 N2 n- ICAT3 단백질체 배수변화4 SD (±) 전사체 배수변화 전사체
P-값
철 수송 및 관련 단백질
13 PG0644 6 HtrE ( Tla ) TonB -결합 수용체 2.05 1.54E-04
18 PG1552 HmuR
. MNSDELFEEITYPGYTIC *R
25/15 		1 1 4.0 - 3.13 0.003
21 PG1019 이론적 단백질
. TYMIDTNDSENDC * IAR
70/14 		2 1 25.0 - 2.57 0.003
22 PG1020 6 보존된 이론적 단백질; 잠재적 외막 수용체 단백질 3.36 3.0E-04
다른 단백질
33 PG1874 6 보존된 이론적 단백질 1.52 0.05
34 PG1875 6 Hemolysin A 1.40 0.05
1 가장 높은 점수를 나타낸 펩티드 점수/한계치 점수 (P=0.05)
2 각각의 단백질에 대한 독립된 펩티드 선별 시행의 합계
3 각각의 단백질에 대해 선별된 고유한 ICAT-표지 펩티드의 수
4 배수 변화에 있어서 각각의 단백질에 대한 모든 정량된 펩티드의 평균 비율(헴-제한/과잉)
5 NS 통계학적으로 유의적인 변화가 관찰되지 않음
6 오직 마이크로어레이 분석에서 선별됨
C* ICAT-변형된 시토신을 나타냄

Claims (11)

  1. AAQ65462, AAQ65742, AAQ66991, AAQ65561, AAQ66831, AAQ66797, AAQ66469, AAQ66587, AAQ66654, AAQ66977, AAQ65797, AAQ65867, AAQ65868, AAQ65416, AAQ65449, AAQ66051, AAQ66377, AAQ66444, AAQ66538, AAQ67117 및 AAQ67118로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 등록번호에 상응하는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 항원성 또는 면역원성 부위를 면역 반응을 증가시키는데 유효한 양으로 포함하는, 개체 내의 포르피노모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)에 대한 면역반응 증진용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 부위는 상기 폴리펨티드 중 하나의 적어도 50개 아미노산과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 AAQ65462, AAQ66991, AAQ65561 및 AAQ66831로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 등록번호에 상응하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 등록번호 AAQ65742에 상응하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. P. 진지발리스(P. gingivalis)에 의해 발현되는 폴리펩티드와 적어도 50개 아미노산이 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며 CELLO 프로그램을 통해 세포외의 것으로 예측되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 면역반응을 증진시키는데 유효한 양으로 포함하는, 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 면역반응 증진용 조성물.
  6. 마우스 또는 토끼에서 면역반응을 유발하는 폴리펩티드의 적어도 50개 아미노산이 실질적으로 동일하게 선별된 아미노산 서열을 가지는 적어도 하나의 폴리펩티드를 면역반응을 증가시키는데 유효한 양으로 포함하는, 개체 내의 P. 진지발리스에 대한 면역반응 증진용 조성물.
  7. 유효한 양의 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체에서 치주질환을 예방, 억제 또는 치료 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 P. 진지발리스 감염의 예방 또는 치료 방법.
  9. 등록번호 AAQ65462, AAQ65742, AAQ66991, AAQ65561, AAQ66831, AAQ66797, AAQ66469, AAQ66587, AAQ66654, AAQ66977, AAQ65797, AAQ65867, AAQ65868, AAQ65416, AAQ65449, AAQ66051, AAQ66377, AAQ66444, AAQ66538, AAQ67117 및 AAQ67118에 상응하는 폴리펩티드 중 어느 하나와 적어도 50개 아미노산이 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 항원성 부위에 의해 증가된 항체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 AAQ65462, AAQ66991, AAQ65561 및 AAQ66831로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 등록번호에 상응하는 것을 특징으로 하는 항체.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 등록번호 AAQ65742에 상응하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 항체.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPO652897A0 (en) 1997-04-30 1997-05-29 University Of Melbourne, The Synthetic peptide constructs for the diagnosis and treatment of periodontitis
US8129500B2 (en) 1997-12-10 2012-03-06 Csl Limited Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides
JP2009544279A (ja) 2006-06-27 2009-12-17 オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド 歯周病の予防に有用なポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチド
US8241611B2 (en) 2007-07-12 2012-08-14 Oral Health Austrailia Pty. Ltd. Biofilm treatment
KR101721904B1 (ko) 2008-08-29 2017-04-11 오럴 헬스 오스트레일리아 피티와이 엘티디 Ｐ．진지발리스 감염의 예방, 치료 및 진단
EP2462160A4 (en) * 2009-08-02 2013-04-24 Sanofi Pasteur Ltd Porphyromonas gingivalis POLYPEPTIDES
US8140041B2 (en) * 2009-08-27 2012-03-20 Mediatek Inc. Tunable capacitive device with linearization technique employed therein
CN105418758A (zh) * 2015-12-03 2016-03-23 沈阳惠民生物技术有限公司 一种抗牙周病抗体的制备方法及其应用
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
CN113005069B (zh) * 2021-01-28 2023-09-26 广东海洋大学 一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210035A (en) * 1980-05-19 1993-05-11 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Non-reventing live vaccines
US4735801A (en) * 1982-09-07 1988-04-05 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting salmonella live vaccines
US4837151A (en) 1980-05-19 1989-06-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5830710A (en) 1988-09-08 1998-11-03 University Of Florida Cloned porphyromonas gingivalis genes and probes for the detection of periodontal disease
WO1994027606A1 (en) 1993-05-28 1994-12-08 Unisearch Limited Method of treating helicobacter pylori infection
WO1995000110A1 (fr) * 1993-06-28 1995-01-05 Lion Corporation Composition pour la cavite buccale
US5475097A (en) * 1993-10-21 1995-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Lysine-specific Porphyromonas gingivalis proteinase
EP0717747B1 (en) 1993-09-10 2003-06-04 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Porphyromonas gingivalis arginine-specific proteinase coding sequences
US6017532A (en) * 1993-09-10 2000-01-25 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Porphyromonas gingivalis arginine-specific proteinase
US5523390A (en) * 1993-09-10 1996-06-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Porphyromonas gingivalis arginine-specific proteinase
JPH0797395A (ja) 1993-09-28 1995-04-11 Kyowa Medex Co Ltd ポルフイロモナス・ジンジバリス線毛蛋白質の配列を含有するペプチド類及びその用途
DE69527514T2 (de) 1994-03-29 2003-04-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Gen eines zelloberflächenpolypeptids
AUPN627595A0 (en) * 1995-10-30 1995-11-23 University Of Melbourne, The Diagnostics and treatments of periodontal disease
JP2000507245A (ja) 1996-03-22 2000-06-13 ユニバーシティー オブ ジョージア リサーチ ファウンデーション，インコーポレイテッド Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓペプチドを含む免疫原性組成物および方法
AUPN901296A0 (en) * 1996-03-29 1996-04-26 University Of Melbourne, The Porphyromonas gingivalis antigens for the diagnosis and treatment of periodontitis
US7341727B1 (en) * 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
AUPO652897A0 (en) * 1997-04-30 1997-05-29 University Of Melbourne, The Synthetic peptide constructs for the diagnosis and treatment of periodontitis
AUPP083997A0 (en) * 1997-12-10 1998-01-08 Csl Limited Porphyromonas gingivalis nucleotides
ES2419664T3 (es) * 1997-12-10 2013-08-21 Csl Limited Polipéptidos y polinucleótidos de Porphyromonas gingivalis
US8129500B2 (en) * 1997-12-10 2012-03-06 Csl Limited Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides
US6444799B1 (en) * 1997-12-31 2002-09-03 Csl Limited P. gingivalis polynucleotides and uses thereof
AUPP893999A0 (en) * 1999-03-01 1999-03-25 Csl Limited Synthetic peptides containing protective epitopes for the treatment and prevention of periodontitis associated with porphyromonas gingivalis
US7090973B1 (en) * 1999-04-09 2006-08-15 Oscient Pharmaceuticals Corporation Nucleic acid sequences relating to Bacteroides fragilis for diagnostics and therapeutics
GB9913437D0 (en) 1999-06-09 1999-08-11 Medical Res Council Fusion proteins
AUPQ485999A0 (en) * 1999-12-24 2000-02-03 Csl Limited P. gingivalis antigenic composition
AUPQ718200A0 (en) * 2000-04-28 2000-05-25 Csl Limited Porphyromonas gingivalis recombinant proteins and truncations
US6576226B1 (en) * 2000-11-17 2003-06-10 Gary R. Jernberg Local delivery of agents for disruption and inhibition of bacterial biofilm for treatment of periodontal disease
US20030083287A1 (en) 2000-11-30 2003-05-01 Burgess Nicola A. ginS
GB2381449A (en) 2001-10-31 2003-05-07 Smithkline Beecham Plc Oral hygiene compositions comprising an electron acceptor
JP2003192616A (ja) 2001-12-27 2003-07-09 Univ Nihon 歯周病用ｄｎａワクチン
JP2003286191A (ja) 2002-03-27 2003-10-07 Univ Nihon 歯周病用粘膜免疫ワクチン
US20070036734A1 (en) 2003-03-17 2007-02-15 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for periodontal disease
JP2007529195A (ja) * 2003-08-15 2007-10-25 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インク． 歯周病の診断，治療，およびモニタリングのためのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ毒性ポリヌクレオチドの同定
US7424370B2 (en) * 2004-02-06 2008-09-09 Council Of Scientific And Industrial Research Computational method for identifying adhesin and adhesin-like proteins of therapeutic potential
WO2006032104A1 (en) * 2004-09-23 2006-03-30 The University Of Melbourne Antigenic complex for the diagnosis and treatment of porphyromonas gingivalis infection
WO2008016385A2 (en) * 2006-01-20 2008-02-07 The University Of Washington Deacylase polypeptides, deacylase polynucleotides, and methods of use thereof
JP2009544279A (ja) * 2006-06-27 2009-12-17 オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド 歯周病の予防に有用なポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチド
WO2008124646A2 (en) 2007-04-06 2008-10-16 The Government Of The U.S.A, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Use of amyloid proteins as vaccine scaffolds
US8241611B2 (en) * 2007-07-12 2012-08-14 Oral Health Austrailia Pty. Ltd. Biofilm treatment
US20110104179A1 (en) * 2009-06-19 2011-05-05 Oral Health Australia Pty Ltd Protease inhibitory peptides

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