KR20100047742A - 사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포치료제 연구에 활용되고 있는 사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하는 조성 개발에 관한 것이다. 본 발명에 따른 멜라닌세포 분화 유도 조성은 백반증 및 피부 흑화를 포함한 기타 피부질환에 도움을 줄 수 있다.

줄기세포, 멜라닌세포, 포스콜린, 줄기세포인자, 엔도셀린-3

Description

사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하는 조성물{Defining the composition for the generation of melanocytes from human stem cells}

사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하는 조성물을 개발하여 치료목적으로 사용하고자하는 기술분야

생명과학의 발달은 현대의학으로도 치료가 어려운 난치병 및 불치병에 대한 접근을 가능하게 하였다. 줄기세포는 후생동물의 조직 분화 과정에서 볼 수 있는 세포로 뼈, 뇌, 근육, 피부 등 신체의 어떤 기관으로 전환할 수 있는 전능세포이다. 줄기세포는 유래하는 조직의 위치에 따라서 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나눈다. 배아줄기세포는 배반포의 세포 안에서 발견되는 반면 성체줄기세포는 이미 발달된 기관에서 발견된다. 이러한 줄기세포는 여러 가지 다른 세포로 대체될 수 있는 전능성을 가지고 있으므로 피부질환의 중심에 있는 멜라닌의 조절을 통해 멜라닌세포의 후천적 사멸로 발생하는 난치성 피부질환인 백반증이나 과도한 흑화로 인한 피부질환에 도움을 줄 수 있다. 피부색을 나타내는 중요한 역할을 하는 멜라닌세포는 기저층(진피의 아래 부분에 있으며, 세포분열을 하는 층)에 위치하여 피 부색을 결정하는 역할을 하는데, 피부색을 결정하는 것에는 멜라닌 색소의 양, 그리고 멜라닌 색소를 만드는 멜라닌세포의 크기가 중요하며 검은 피부는 흰 피부보다 큰 멜라닌 형성세포를 지니고 있다. 멜라닌 색소는 멜라닌세포에서 생성되며 피부 바깥쪽으로 이동하여 각질층에 분포됨으로써 외부로 보이는 피부색을 결정한다. 또한 멜라닌세포는 단파장의 자외선을 흡수하여 피부에 해가 되는 자외선이 진피 내로 침입하는 것을 막아준다. 멜라닌 색소는 한 달을 주기로 피부에서 생성되어 탈락되는 일련의 과정을 반복하게 되는데, 건강한 피부의 경우 색소 침착이 생겼다 하더라도 피부의 신진대사를 통해 한 달에서 두 달 정도를 주기로 해서 새로 자란 피부가 바깥으로 나오게 되어 색소 침착된 기미, 주근깨, 잡티 등이 자연적으로 없어지고 예전의 피부로 돌아오게 되지만 이런 자연적인 피부의 신진대사에도 불구하고 과도하게 침착된 경우는 기미, 주근깨, 잡티 등이 여전히 남아 있게 된다.

멜라닌 색소에는 eumelanin, pheomelanin 두 종류가 있다. Eumelanin은 색상이 더 진하고 어두우며 황인이나 흑인의 피부에 많으며, pheomelanin은 더 연하고 백인의 피부에 많다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌세포에서 tyrosine이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성된다. 멜라닌은 tyrosine이 3,4-dihydroxyphenylalanine(dopa)으로 hydroxylation되는 과정을 시작으로 dopaquinone, dopachrome의 과정을 거쳐 멜라닌으로 합성되는데 dopachrome은 자연히 decarboxylation되어 DHI(dihydroxyindole)가 되며 빠르게 산화되어 indole-5, 6-quinone이 된다. 그러나 특정한 금속이온과 효소가 있는 경우 carboxylated intermediate인 DHICA(dihyduoxyinkole carboxylic acid)가 만들어지며 DHICA- oxidase의 작용을 받아 indole-5, 6-quinone-2-carboxylic acid가 되며 이후 eumelanin이 형성된다. 그러나 dopaquinone이 cysteine이나 glutathione과 같은 SH 화합물을 만나게 되며 cysteinyldopa가 만들어지고 결국에는 pheomelanin이 만들어진다. 멜라닌의 합성과정은 산화반응이므로 과거에는 tyrosinase라는 한 가지 효소에 의해서만 멜라닌 색소가 형성된다고 생각되었다. 그러나 분자생물학이 발전하면서 tyrosinase와 유사한 유전자가 몇 가지 발견되었는데, 이들은 tyrosinase-related protein(TRP)이라고 불리게 되었으며 TRP-1 및 TRP-2 등이 알려져 있다.

전 인구의 약 1%에서 나타나는 백반증은 극히 난치성이어서 만족할만한 치료효과를 크게 기대하지 못하는 질환으로 인식되어 왔다. 이 질환은 멜라닌세포의 결핍으로 인하여 백색반들이 피부에 나타나는 가장 흔한 후천적 탈색소 피부질환 중 하나이다. 정확한 원인은 아직 미상이나 상염색체성 우성유전을 요인으로 들 수 있으며, 스트레스 등의 정신적 요인 및 육체적 장애나 일광 화상 등이 백반증 발생의 보조적 요인으로 작용할 수 있다.　현재까지 설명되는 원인으로서는 면역설, 신경체액설, 멜라닌 자가파괴설 등의 세 가지가 가장 유력하다.　

첫째, 면역설로는 백반증 환자에게서 부신, 갑상선, 위벽세포, 췌장세포 등에 대한 자가항체의 발생빈도가 높고 자가면역질환을 동반하는 경우가 많다. 또한 자가면역질환 환자에게서 백반증이 나타나는 빈도는 10-15%로 보고되어 일반인의 발생빈도보다 현저히 높다.　최근에는 자가항체의 혈중치가 백반증의 발생이나 탈색소의 범위와 비례한다는 주장도 있다. 또한 멜라닌세포에 세포독성을 나타내는 특이 항체의 발견, 세포독성 임파구나 활성화된 임파구가 분비한 물질에 의한 멜라닌세 포의 파괴 등을 보이기도 한다.

둘째, 신경체액설로는 멜라닌세포가 신경에서 기원하며 신경절에 따른 분포를 보이는 백반증이 발생한다는 것이다. 또한 신경손상이나 정신적 긴장 후에 발병하는 증례 등은 신경체액설을 뒷받침하고 있다. 즉 멜라닌세포 근처에 유리된 신경화학 매개물질의 과다로 멜라닌세포의 생성과정을 억제하여 세포파괴를 초래한다고 설명한다.　

셋째, 멜라닌 자가파괴설은 멜라닌 형성과정에서 생긴 중간물질이나 대사물질인 페놀복합체가 멜라닌세포 내에 축적되어 멜라닌세포를 파괴하게 된다는 것이다.　

그러나 이 세 학설이 독립적으로 작용하기보다는 복합적으로 작용하여 백반증을 일으키는 것으로 설명되고 있다. 증상은 국한형, 전신형 및 복합형으로　분류할 수 있고 인종이나 지역의 차이 없이 발생한다. 발생 연령은 출생 직후부터 노년까지 다양하지만 대개 10-30세 사이가 가장 많다.　그리고 약 40%에서는 가족력이 발견된다. 피부 병변은 다양한 크기의 원형 내지는 불규칙한 모양의 탈색반으로 시작되는데, 경계는 명확하면서 경계부를 따라 과색소 침착을 나타내기도 하며 때로는 홍반성 경계를 띠면서 소양증을 느끼기도 한다. 이러한 탈색 외에 다른 표피의 이상은 없고 자각증상도 없어서 단지 미용상의 결함을 호소하여 내원하는 것이 대부분이다. 백색반 부위의 모발도 탈색되어 보이는 경우도 많아서 특히 머리카락, 눈썹 같은 경우 백모증으로 처음 발견되기도 한다. 백반증은 피부의 어디에나 올 수 있으나 특히 손가락이나 발가락, 무릎, 팔꿈치 등의 뼈가 돌출한 부위, 입 주위, 코 주위, 등, 다리 앞부분, 겨드랑이, 손목의 접히는 부위, 꼬리뼈 부위 등에 호발하며 점막에도 올 수 있고 상처를 자주 받는 부위에도 발생할 수 있다. 백반증의 분포는 대칭적으로 나타나기도 하며 신경절을 따른 분포를 보이기도 한다.　단순히 피부의 탈색을 초래하는 경우 외에 눈의 홍채와 망막의 색소 이상이 동반될 수 있고 당뇨병, 악성빈혈, 갑상선 기능 저하 혹은 항진증, 간장질환 등이 여러 전신질환과 동반될 수 있으며 특히 자가면역질환과 동반될 가능성이 높다.　

피부 흑화현상 역시 대표적인 피부질환 중의 하나이다. 피부가 검어지는 병, 흑화의 원인은 다양하다. 강렬한 자외선과 대기오염 등 외부의 자극이 주요한 원인으로 작용하는데, 강한 자외선은 잡티와 기미, 주근깨의 원인이 되는데다 피부 탄력성을 유지하는 콜라겐과 탄력 성분 등을 위축시켜 주름을 만든다. 또한 피부에 피로와 각질화를 누적시켜 피부 노화를 촉진한다. 이처럼 자외선은 피부를 검게 만드는데다 기미나 주근깨 같은 피부병을 새로 생기게 하기도 하고 이미 있던 기미나 주근깨 등을 심하게 만들기도 하는데 이를 피부 흑화라고 한다. 자외선에 의한 피부 변화는 크게 붉게 변하는 홍반에 의한 색소 침착과 검게 변하는 흑화에 의한 색소 침착으로 나뉜다. 피부에 조사된 자외선은 피부 층의 경계에서 직접 반사(표피반사, 진피반사) 내지 피부조직 내에서 세포, 섬유, 입자 등에 부딪힌 후 산란되거나, 흡수, 투과되는 4가지 경로를 거치게 된다. 이 중 흡수된 광선만이 광화학 반응을 일으켜 피부 병변(lesion, 병의 과정에서 나타나는 생체의 국소변화)을 일으키는데, 파장이 길어 진피 깊숙이 침투하는 자외선 A(UVA)는 주로 흑화현상을 유발하고 파장이 짧아서 침투도가 떨어지는 자외선 B(UVB)는 홍반현상의 주원인이 되며 색소 침착도 촉진시킨다. 한국인을 포함한 동양인의 피부 유형은 홍반과 흑화가 동시에 나타나는 유형이 가장 많고, 특히 한국인은 UVA에 의한 흑화 등의 색소침착 현상을 보이는 피부 유형이 비교적 많은 편이다. 이러한 자외선에 의한 피부 흑화현상은 심할 경우 피부암에까지 이르게 된다.

이처럼 멜라닌세포의 결핍으로 인한 백색반들이 피부에 나타나는 백반증과 과도한 멜라닌세포의 축적에 의한 피부흑화의 중심에는 멜라닌이 존재한다. 백반증에 있어서 기존의 치료방안으로는 자외선 요법, 스테로이드 치료법, 외과적 치료법 등의 외과적 수술이 있다. 첫째, 장파장의 자외선을 이용하는 자외선 치료법은 1주 2-3회 정도의 빈도로 적어도 100회 이상의 장기치료가 시행되어야 하고 둘째, 스테로이드 치료법 또한 국소 주사와 전신 투여를 통한 장기치료가 필요하다. 셋째, 외과적 치료법은 피부이식, 흡입수포술 등의 방법이 있다. 그러나 기존의 치료방안으로는 심각한 스테로이드 부작용을 포함해서 다양한 부작용을 유발할 수 있는 단점이 있다. 피부 중 전체 상피층 세포의 3-5%를 차지하는 멜라닌세포는 인간의 세포 가운데 가장 느리게 성장하고 분화하는 세포이다. 이런 특성 때문에 백반증의 연구 및 치료는 쉽지 않다. 멜라닌세포의 활동력도 치료에 영향을 미친다. 즉, 피부색은 멜라닌세포의 수가 많고 적은 것보다는 세포의 활동력에 의해 결정된다. 그러므로 흑인과 백인의 피부색 차이는 멜라닌세포 수 때문이 아니라 멜라닌세포가 얼마나 많은 색소를 만들어 내느냐의 차이인 것과 같다.

기존의 백반증 치료방안 중, 외과적 수술법에 표피이식 외에 배양된 멜라닌세포 이식법이 있다. 표피를 벗겨낸 백반증 부위에 멜라닌세포를 이식하게 되면 멜라 닌색소가 살아나는 방법으로 10여년 전부터 사용되어 오는 방법이다. 그러나 심은 멜라닌세포의 색소생존율이 낮고 세포배양 과정에서 여러 가지 유해물질에 노출될 위험이 있어서 널리 사용되진 않는다.

따라서 본 발명은 여러 가지 멜라닌 관련 피부질환에 있어서 전능성을 가진 줄기세포를 이용하여 멜라닌세포 분화 유도 조성물을 개발하고자 하였다. 즉, 사람 줄기세포를 이용하여 멜라닌세포로 분화 유도하는 과정에서 생성된 세포배양액을 피부에 존재하는 줄기세포에 적용하여 줄기세포를 활성화시킴으로써 멜라닌세포로 분화 유도하고자 한다. 따라서 피부에 외용의 형태로 적용할 경우, 피부에 존재하는 줄기세포의 멜라닌세포로의 분화 및 멜라닌색소 생성에 도움이 될 것으로 사료된다. 본 발명은 이 점에 착안하여 위의 세포배양액이 적정량 포함된 피부외용제나 팻취 적용 시에 피부의 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하여 멜라닌색소 생성에 효과가 있음을 확인하고자 하였다.

본 발명의 목적은 다음과 같다.

1. 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시키고 분화과정에서 얻어진 세포배양액을 소재화하는 것.

2. 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도한 다음, MITF의 발현량의 관찰을 통해서 백반증 개선이나 피부 흑화 개선을 위한 스크리닝 시스템을 개발하는 것.

3. 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시키고 분화과정에서 얻어진 세포배양액을 원료로 다양한 피부개선용 외용제로 만들어 백반증 개선용 조성물 또는 자외선에 의한 피부암 억제용 셀프탠닝 조성물을 제공하는 것.

본 발명에서는 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하는 과정에서 생성된 세포배양액을 적절한 외용제로 만들어 경피에 적용함으로써 그 가능성을 검증하였다. 실험 결과 멜라닌세포로 분화 유도하는 과정에서 생성된 세포배양액이 포함된 크림을 도포한 피검자에서 3개월 동안 전체적으로 색소가 재형성되는 정도를 2주 간격으로 관찰하였다. 그 결과 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액이 포함된 크림을 도포한 한쪽 손에서 3개월 경과 후 증세가 호전되는 것을 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 의하면 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시킨 각각의 그룹에서 세포의 모양뿐만 아니라 멜라닌세포에 specific한 MITF-M 유전자의 발현이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 또한 멜라닌세포로 분화 유도한 후에 얻어진 세포배양액을 수확하여 B16 멜라닌세포에 첨가한 경우 멜라닌 함유량이 증가되었음을 확인할 수 있었으며, 분화 유도한 후의 세포배양액을 함유한 크림을 백반증 피검자의 한 손에 도포한 경우 세포배양액의 %가 증가함에 따라 농도-의존적으로 백반증 개선도가 향상됨을 확인할 수 있었다. 또한 MITF 발현량의 관찰을 통해서 백반증 개선이나 피부 흑화 개선을 위한 스크리닝 시스템으로의 개발도 가능함을 시사한다. 그러므로 본 발명은 멜라닌세포 분화 유도를 통해서 백반증 및 피부 흑화를 포함한 기타 피부질환에 도움을 줄 수 있다.

본 발명은 사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하고자 한다. 본 발명에 사용된 분화 유도인자는 줄기세포인자(stem cell factor; SCF), 엔도셀린-3(endothelin-3; ET-3), 포스콜린(forskolin; FK) 3가지이다.

1. 본 발명은 줄기세포에 분화 유도인자들을 처리하여 멜라닌세포로 분화하고자 한다. 본 발명에 사용된 세포는 사람 줄기세포이며 분화 유도 전 날, 15% FBS와 1% 항생제가 포함된 정상적인 세포배양조건 하에서 배양한다. 다음 날, 멜라닌세포 배양액인 M254 배지를 이용하여 SCF+ET-3 실험군, SCF+ET-3+FK 실험군, FK 단독군 으로 나누어 30일간 처리한 다음, real-time PCR 방법을 통해서 멜라닌세포 표지자들을 확인하는 실험을 수행하였다. 멜라닌세포에서 발견되는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)는 미백관련 유전자의 대표적인 조절인자 단백질로서 중추적 멜라닌세포 조절자로불려지며, 멜라닌세포의 장기간 생존과 적절한 발달을 위해 매우 중요하다. MITF 유전자가 피부의 색소 생산을 담당하는 멜라닌세포 발달을 조절하는 정상적인 기능을 갖는다는 사실은 이미 알려져 있다. 본 발명에서 real-time PCR을 수행한 결과, MITF 유전자의 발현량이 정상 줄기세포보다 현저히 증가되었음을 관찰할 수 있었다.

2. 다른 하나의 양태로서, 피부줄기세포는 점착성 분자 성장 요소(adhesion molecules growth factors)로 이루어진 일종의 미세환경에 자리잡고 있는데, 미세환경(Niche)은 소위 줄기 세포의 모든 특징을 표현하는 줄기세포성(stemness)을 유지하는데 있어서 핵심적인 역할을 한다. 줄기세포의 이러한 영역은 입지(location), 점착성(adhesiveness), 귀소성(homing), 휴면성(quiescence), 활동성(activation)을 유지하고 조정하는 역할을 하고 있다. 즉 피부줄기세포가 다른 곳으로 이동, 분화, 자살을 막고 보호해주는 역할을 하는데 주요한 환경이라고 볼 수 있다. 건강하게 보존된 피부줄기세포(모세포)는 일정한 주기로 세포분화를 거듭하여 자세포(daughter cell)를 생산하고 자세포는 계속된 분화를 거듭하여 피부 재생에 있어 주요 요소인 케라틴 생성 세포를 만듦으로써 피부재생 효과를 낳게 된다. 따라서 본 발명은 사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하는 과정을 통해서 얻어진 세포배양액이 피부줄기세포의 피부재생 효과에도 도움을 줄 것으로 예상한 다.

3. 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도하는 과정을 통해서 백반증 개선 및 피부 흑화 개선을 위한 스크리닝 시스템을 제공하는 것이다. 중추적 멜라닌세포 조절자로 알려진 MITF는 멜라닌세포의 장기간 생존과 적절한 발달을 위해 매우 중요하다. MITF는 멜라닌세포 발달을 조절하는 정상적인 기능을 가지며, MITF 유전자 복사체가 정상보다 많이 존재한다는 것은 형성되는 멜라닌세포의 양이 증가한다는 것을 의미한다. 즉, 본 발명은 줄기세포를 멜라닌세포로 분화 유도한 다음, MITF의 발현량의 관찰을 통해서 백반증 개선이나 피부 흑화 개선을 위한 스크리닝 시스템을 통하여 효과가 있는 물질들을 선별할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.　 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 분화 유도인자를 이용하여 사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화

사람 수정란유래 줄기세포, 지방줄기세포, 피부줄기세포 및 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 줄기세포인자(stem cell factor; SCF), 엔도셀린-3(endothelin-3; ET-3), 포스콜린(forskolin; FK)과 같은 분화유도인자를 처리하였다. 본 실험은 5 % CO₂ 및 37 ℃ 하에서 15%의 FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 줄기세포를 3 x 10⁵개로 6 well plate에 접종하여 안착시킨 후, 다음 날 멜라닌세포 배양액인 M254 배지를 이용하여 SCF+ET-3 실험군, SCF+ET-3+FK 실험군, FK 단독군으로 나누어 30일간 처리하였다. 30일 경과 후, 도 1에서와 같이 대조군 줄기세포와 비교하여 분화 유도인자를 처리한 실험군, 특히 SCF+ET-3+FK 실험군에서의 세포모양이 멜라닌세포-like한 모양으로 분화하였음을 관찰할 수 있었다. 본 실험결과 사진은 탯줄유래 중간엽줄기세포에서 얻어진 결과를 보여주나 나머지 줄기세포군에서도 같은 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 2: 분화 유도인자를 이용하여 줄기세포를 멜라닌세포로 분화

사람 줄기세포를 이용하여 줄기세포인자(stem cell factor; SCF), 엔도셀린-3(endothelin-3; ET-3), 포스콜린(forskolin; FK)과 같은 분화유도인자를 처리하였다. 본 실험은 5 % CO₂ 및 37 ℃ 하에서 15%의 FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 줄기세포를 3 x 10⁵개로 6 well plate에 접종하여 안착시킨 후, 다음 날 멜라닌세포 배양액인 M254 배지를 이용하여 SCF+ET-3 실험군, SCF+ET-3+FK 실험군, FK 단독군으로 나누어 30일간 처리하였다. Real-time PCR 방법을 통해서 멜라닌세포 표지자들을 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시킨 각각의 그룹에서 멜라닌세포에 specific한 MITF-M 유전자의 발현이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포 배양액이 B16 멜라닌세포의 멜라닌 함유량에 미치는 영향

사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시켜 수확한 세포배양액이 정상 멜라닌세포가 가지는 멜라닌 함유량에 미치는 영향을 관찰하였다. 줄기세포를 분화 유도인자들을 이용하여 멜라닌세포로 분화시키는 실험을 수행한 다음 얻어진 멜라닌세포의 세포배양액(melanocyte-secreted supernatant, MS)을 수확하여 이를 정상적인 세포배양조건에서 자란 B16 멜라닌세포에 조건별로 첨가하고 72 시간 후 멜라닌 함유량을 확인하였다. (도 3)에 나타낸 바와 같이, 정상군(혈청이 정상적으로 포함된 배지)을 100%로 환산하였을 시, 정상적인 혈청포함 배지 99.99%-90%-80%-70%와 멜라닌세포의 세포배양액 0.01%-10%-20%-30%가 각각 혼합된 실험군에서 정상군에 비해 멜라닌 함유량이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포 배양액을 이용한 백반증 개선용 외용조성물

분화된 멜라닌세포 배양액을 포함한 크림의 조성은 다음과 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하여 용해시킨 다음 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 분화된 멜라닌세포 배양액 및 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다. 중간엽줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포 배양액을 함유한 크림의 조성은 하기 표 1과 같다.

중간엽줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포 배양액을 포함한 크림의 성분 및 성분 함량

성분	함량 (중량%)
분화된 멜라닌세포 배양액	0.01, 0.1 또는 10
호호바 오일	5.0
유동 파라핀	7.0
세틸아릴 알코올	2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
스쿠알란	3.0
프로필렌글리콜	4.0
글리세린	5.0
트리에탄올 아민	0.3
카르복시 비닐폴리머	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제, 향	미량
정제수	잔량
합계	100

실시예 5: 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포 배양액의 백반증 개선효과

사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시켜 수확한 세포배양액의 백반증 개선효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 본 실험은 사람에 대한 실험이기 때문에 세포배양과정과 분화과정에 사용된 배지를 무균상태에서 작업하여 항생제를 철저히 배제한 후 무항생제 배지만을 사용하여 진행되었다. 또한 광우병의 위험을 없애기 위해 광우병 프리 혈청만을 엄선하여 사용하였다. 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액(melanocyte-secreted supernatant, MS)을 0.01%, 0.1% 및 10% 함유한 크림을 백반증 피검자의 한 손에 도포하였다. 다른 한 손에는 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액이 결여되어 있는 크림을 도포하였다. 3개월 동안 전체적으로 색소가 재형성되는 정도를 2주 간격으로 관찰하였다. 그 결과 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액이 포함된 크림을 도포한 한 손에서 3개월 경과 후 증세가 호전되는 것을 확인할 수 있었다. 백반증 개선의 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40%로 일정하게 유지되는 조건에서 백반증을 가진 환자(20명)를 대상으로 (표 1)의 크림 3종류와 비교 제조예의 크림을 각각 백반증 환자의 한쪽 손에 1일/2회 6개월 동안 사용하게 한 후, 백반증 개선 효과를 측정하였다. 판정기준은 전혀 변화가 없는 경우를 0, 변화가 있는 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다.　 시험결과는 하기 (표 2)에 나타내었다.

(표 2)에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 크림이 비교 제조예의 크림에 비해 백반증 개선 효과가 있었으며, 멜라닌세포 배양액의 %가 증가함에 따라 농도-의존적으로 백반증 개선도가 향상됨을 알 수 있었다.

중간엽줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포 배양액을 포함한 크림의 함량

시험항목	비교 제조크림 (control/no MS)	MS 0.01% 함유 크림	MS 0.1% 함유 크림	MS 10% 함유 크림
개선도	0.0 ± 0.0	2.1 ± 0.3	2.3 ± 0.2	3.5 ± 0.3

[멜라닌세포 배양액을 포함한 크림의 개선도]

실시예 6: 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포 배양액의 피부 자극 시험

사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시켜 수확한 세포배양액의 피부 자극에 대한 반응 정도를 측정하였다. 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액을 정제수를 이용하여 0.01%, 0.1% 및 10%로 희석하여 준비한다. 준비된 시료 20 ml를 fin chamber 내에 적하시킨 후 팔 안쪽 부위에 얹어 micrppore tape로 고정시켜 48시간 첩포한 다음 제거한다. Skin marker로 시험 부위를 표시하고 1 시간, 24 시간 경과 후에 각각의 시험 부위를 관찰하였다. 피부 반응은 (표 3) 피부 자극 판정기준에 따라서 다음과 같이 평가하였다. 결과는 (표 4)에 나타내었다.

피부 자극 판정기준

기 호	Grade	판 정
+	1	Slight erythema, either spotty or diffuse
++	2	Moderate uniform erythema
+++	3	Intense erythema with edema
++++	4	Intense erythema with edema & vesicles

[Modified by Frosch & Kligman, CTFA guidelines]

피부 자극 시험 결과 (n=15)

번 호	시 험 물 질	1 시간 경과 후				24 시간 경과 후
		1	2	3	4	1	2	3	4
1	정제수 (vehicle)	_	_	_	_	_	_	_	_
2	MS 0.01%	_	_	_	_	_	_	_	_
3	MS 0.1%	_	_	_	_	_	_	_	_
4	MS 10%	_	_	_	_	_	_	_	_

실시예 7: 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포 배양액의 경구 독성 시험

사람 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시켜 수확한 세포배양액을 이용하여 동물에서 급성 경구 독성 정도를 측정하여 독성 유무를 판단하였다. 시험물질로는 줄기세포로부터 분화된 멜라닌세포의 세포배양액(melanocyte-secreted supernatant, MS) 원액을 사용하였다. 실험동물은 한국생명공학연구원에서 유지, 관리되고 있는 특정병원체부재(specific pathogen free: SPF) 상태의 5-6주령 암컷 ICR 마우스를 사용하였다. 실험동물은 온도 22±1℃, 습도 55±5%, 조명 12L/12D의 동물실 내에서 유지하였다. 마우스는 실험에 사용하기 전 1주일 동안 순화시켰다. 실험동물용 사료 및 음수는 멸균한 후 공급하였다.

투여방법은 각 실험군 별로 10마리씩 나눈 뒤 0.2 ml/20 g 체중으로 경구 투여하였다. 시료는 1회 경구 투여하였으며, 투여 후 10일 동안 마우스 몸무게 변화 및 사망 여부를 관찰하였다. 투여 10일 째에 동물을 안락사하여 해부한 후 내부 장기를 검사하였다. 그 결과 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시켜 수확한 세포배양액을 동물에 경구 투여하였을 경우 체중 감소도 없었으며 경구 독성이 관찰되지 않았다. 결과는 (표 5)에 나타내었다.

경구 독성 시험 결과 (n=15)

시 료	성 별	마리 수	치사동물의 수 (일)
			1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
정제수	female	15	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
MS	female	15	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

도 1은 중간엽줄기세포에서 멜라닌세포로의 분화를 현미경으로 관찰하였다 (SCF: stem cell factor, FK: forskolin, ET-3: endothelin-3)

도 2는 Real-time PCR 방법을 통한 멜라닌세포 표지자 인 MITF의 증가를 확인한 결과이다 (S: stem cell factor, E: endothelin-3, F: forskolin).

도 3은 분화된 멜라닌세포 배양액이 B16 멜라닌세포의 멜라닌 함유량에 미치는 영향을 살펴본 실험이다 (CM: control media, MS: 분화된 멜라닌세포 배양액)

Claims (6)

1. 줄기세포를 특정의 분화 유도인자를 처리하여 멜라닌세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는 것.
2. 제 1 항의 줄기세포는 사람 유래 줄기세포를 특징으로 하는 것.
3. 제 1 항의 분화 유도인자에 FK 단독 및 FK 이외에 SCF, ET-3를 포함하는 것.
4. 제 1 항에 있어서, 줄기세포를 멜라닌세포로 분화시킨 후 그 세포배양액을 포함하는 백반증 개선용 조성물
5. 제 4 항의 조성물이 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 샴푸, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 균으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물
6. 제 5 항에 있어서, 세포배양액의 전체 조성물에 대하여 0.01 내지 30%를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 화장료 조성물

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