KR20100046658A

KR20100046658A - 항세균제를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100046658A
Application number: KR1020080105604A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 최경자; 최용호; 장경수; 권혁란
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2008-10-28
Filing date: 2008-10-28
Publication date: 2010-05-07
Also published as: KR101032150B1; WO2010050665A3; WO2010050665A2

Abstract

본 발명은 항세균활성 물질 또는 항세균활성 물질과 살선충활성물질의 합제를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 및 상기 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 처리하여 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 항세균제를 단독으로 사용하여도 기존 약제보다 훨씬 저렴한 경비로 소나무재선충병을 방제할 수 있을 뿐만 아니라, 선충약제와 함께 사용할 경우 더 효과적으로 방제할 수 있으므로, 소나무재선충병의 방제에 있어 커다란 효과를 가지고 올 것으로 기대된다.

항세균활성 물질, 소나무재선충병, 방제 조성물, 예방, 치료

Description

항세균제를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 및 이의 용도{Composition for controlling pine wilt disease comprising antibacterial agents as active components and uses thereof}

본 발명은 옥솔린산 등의 항세균 약제를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

현재 우리나라에는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 의해 발생하는 소나무재선충병에 의해 소나무와 잣나무가 심각한 피해를 입고 있다. '소나무에이즈'라고도 불리우는 이 식물병은 한번 감염되면 치료가 되지 않고 거의 모든 소나무가 고사된다. 우리나라의 경우 남부지방에서는 주로 소나무가 피해를 입고 있고, 중부지방에서는 잣나무가 주로 피해를 입고 있다.

소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 분류학상으로 후생동물아계(Metazoa), 진정후생동물(Eumetazoa), 좌우대칭동물(Bilateria), 의체강동물(Pseudocoelomata), 선충문(Nematoda, Nemata)에 속하는 동물로서 실모양을 하고 있다. 길이는 1 mm도 안되지만 번식력은 놀라워 한 쌍이 20일만에 20만 마리로 늘 어날 정도이다. 재선충은 스스로 나무에 침입하거나 나무 사이를 이동할 수 없고 반드시 매개충을 통해야만 가능하다. 매개충인 솔수염하늘소(Monochamus alternatus) 또는 북방솔수염하늘소(M. saltuarius)는 주로 병든 소나무나 잣나무를 선택해 알을 낳는데, 바로 재선충에 감염된 나무에 낳은 매개충의 알이 봄에 번데기로 될 때 재선충이 주위에 모이게 되고, 매개충이 5월 중순~7월 하순 동안 우화(羽化)할 때 몸에 붙어 있는 재선충도 함께 이동한다. 목질부를 탈출한 매개충은 건전한 나무의 새로 자란 가지(1~2년생 가지)를 주로 갉아 먹으며, 이때 생긴 상처를 통하여 소나무재선충을 감염시킨다. 병든 소나무의 경우 잎 전체가 갈색으로 변하면서 보통 1년 안에 말라 죽고 만다.

1905년 일본에서 처음으로 발병한 소나무재선충병의 원인은 오랜 세월 규명이 되지 않다가 1970년에 이르러 비로소 원인이 밝혀졌다. 일본의 경우 이 병에 의해 역사적 가치가 높은 조경수를 제외하곤 대부분의 소나무 자생림이 사라졌다. 우리나라의 경우에는 1988년 부산 금정산에서 처음으로 발생하였는데, 초기에는 항공살포에 의한 매개충 박멸, 감염목의 조기 발견 및 제거, 감염목 주변나무들의 적극적인 수간 주입 등으로 부산 일대에서만 발병할 뿐 잠잠했다. 하지만 살충제의 항공살포에 의한 꿀벌 등의 유익충에 대한 피해, 환경 오염 등의 이유로 인한 환경단체 중심의 항의 시위 및 국민들의 피해목 이동 등으로 효과적인 방제가 진행되지 못하였고, 결국에는 전국에 걸쳐서 소나무재선충병이 발병하게 되었다.

소나무재선충은 소나무속(Pinus) 뿐만 아니라 전나무속(Abies), 가문비나무속(Picea), 잎갈나무속(Larix)의 일부 수종 등도 가해하는 것으로 알려져 있다. 우 리나라의 경우 경상도, 전라도 및 강릉 지역은 주로 소나무에서 발병된 반면에 강원도 서부 지역과 경기도에서는 주로 잣나무에서 발병이 되었다. 남부지방과 중부지방의 수목 피해종의 이러한 차이는 소나무재선충을 매개하는 매개충의 차이에 의한 것으로 알려져 있다. 남부지방의 경우 솔수염하늘소의 밀도가 높고, 중부지방의 경우 북방솔수염하늘소의 밀도가 높은데, 이들 매개충이 선호하는 식물체가 서로 다르기 때문인 것으로 추정되고 있다.

이 식물병을 방제하기 위한 방법으로는, 1) 건전한 나무에 살선충약제의 예방적인 수간 주입, 2) 매개충 방제를 위한 합성 살충제 또는 길항 미생물의 항공 살포, 3) 감염목이 있는 재선충과 매개충을 방제하기 위한 감염목의 파쇄, 연소 및 훈증 등의 방법이 있다. 하지만 수간 주입법과 감염목 방제 방법은 비용이 많이 들고 높은 산악지대에 있는 소나무림에 대한 방제의 어려움 등으로 인하여 효과적인 방법이 되지 못한다. 합성 살충제의 경우 매개충이 주로 활동하는 5월 내지 7월에 약제를 항공살포할 경우 가장 효과적인 방법이기는 하나, 합성 살충제의 부작용으로 인하여 도시 및 인근 지역에 살포할 수 없다는 문제점이 있다. 길항 미생물의 살포에 의한 친환경적인 매개충 방제 방법도 있지만, 아직 합성살충제에 비하여 효과가 떨어져 그다지 효과적이지 못한 실정이다.

소나무재선충병이 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 의해 발병이 된다는 사실은 확인이 되었지만, 정확한 발병기작에 대해서는 아직 완전히 규명되지 않았다. Oku 등(1980; J. For. Res. 67:198-199)은 소나무재선충의 숫자가 크게 늘기도 전에 소나무가 생리적으로나 조직적으로 많은 변화가 일어나는 사실을 발견 하고, 세균이 소나무재선충병의 발병에 관련되어 있을지도 모른다고 하였다. 그들은 또한 재선충과 동반하는 세균이 phytotoxin을 생성함으로서 소나무재선충병의 발병에 관여하는 것으로 추정하였다. 이후에 Kawazu 등(1996; Biosci. Biotech. Biochem. 60:1410-1412)은 재선충으로부터 분리한 Bacillus 속 균주가 생산하는 phytotoxin (phenyl acetic acid)이 소나무에 시들음 증상을 야기한다고 하였다. 중국의 Zhao 교수 연구 그룹도 재선충에 동반하는 phytotoxin을 생산하는 세균들이 소나무재선충과 함께 소나무재선충병을 일으킨다고 보고하였다(Guo 등, 2000, J. Nanjing For. Univ. 4:69-71; Zhao 등, 2003, Nematology 6:899-906; Zhao, 2005, For. Pathol. 29:339-345).

하지만 지금까지 소나무재선충병을 예방하기 위하여 사용하는 수간주입용 약제들은 모두 재선충을 치사시키는 약제들로서, 병원성과 관련이 있는 세균을 치사함으로서 효과를 보이는 약제는 개발된 적이 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 소나무재선충병과 관련이 있는 세균들에 활성을 보이는 옥솔린산 등의 항세균제들이 단독으로 또는 살선충약제와 혼용할 경우 높은 방제효과를 보인다는 사실을 발견함으로서, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 옥솔린산 등의 항세균제를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병을 효과적으로 방제하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 소나무재선충병 방제용 조성물을 이용하여 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 항세균활성 물질인 옥솔린산은 소나무재선충병에 대하여 높은 방제효과를 보였다. 이것은 옥솔린산 이외에 다른 항세균활성 물질도 소나무재선충병을 방제하는데 효과가 있을 수 있는 가능성을 나타내며, 이는 새로운 개념의 소나무재선충병 방제제 개발의 가능성을 매우 높일 수 있다. 또한 소나무재선충병을 방제하기 위하여 주로 사용하고 있는 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate)와 아바멕틴(abamectin) 등의 아버멕틴(avermectin) 계열의 물질들은 천연물질이기 때문에 원제의 가격이 kg 당 110$ 내지 500$로서 매우 비싼데 비하여, 옥솔린산의 경우 이들 가격의 1/10 밖에 안되므로 지금까지 나와 있는 약제에 비하 여 저렴하면서도 고약효를 보이는 소나무재선충병 방제제를 개발할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항세균활성 물질을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 소나무재선충병의 발병 기작을 규명하는 연구를 진행하는 중에, 세균이 소나무재선충병에 있어 매우 중요한 역할을 하며, 재선충과 공생하는 세균을 치사시키는 약제, 즉 항세균제를 처리하여도 소나무재선충병을 방제할 수 있다는 사실을 발견하였다. 이러한 사실은 세계 최초로 발견한 사실로서, 항세균제를 단독으로 사용하여도 기존 약제보다 훨씬 저렴한 경비로 소나무재선충병을 방제할 수 있을 뿐만 아니라, 선충약제와 함께 사용할 경우 더 효과적으로 방제할 수 있다.

본 발명의 상기 소나무재선충병 방제용 조성물에서, 상기 항세균활성 물질은 바람직하게는 퀴놀론(quinolone)계 물질일 수 있다. 항세균활성을 갖는 퀴놀론계 물질의 예로는 날리딕스산(nalidixic acid), 아미플록사신(amifloxacin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 에녹사신(enoxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 노르플록사신(norfloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 페플록사신(pefloxacin), 스파르플록사신(sparfloxacin), 테마플록사신(temafloxacin) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 항세균활성을 갖는 퀴놀론계 물질은 가장 바람직하게는 화학식 1의 옥솔린산(oxolinic acid)이다.

[화학식 1]

본 발명의 소나무재선충병 방제용 조성물은 살선충활성물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 살선충활성물질은 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성 물질, 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate), 메설펜포스(mesulfenfos), 레바미솔(levamisol) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성물질은 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 아바멕틴(abamectin), 밀베멕틴(milbemectin), 이버멕틴(ivermectin) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법에서, 소나무재선충병 방제용 조성물은 전술한 바와 같이, 항세균활성 물질을 유효성분으로 함유하거나 또는 항세균활성 물질과 살선충활성물질을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명의 방법은 소나무재선충병 방제가 필요한 수목이면 제한되지 않으며, 예를 들면, 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 본 발명 의 조성물을 처리할 수 있다. 처리 방법은 수간주입 등 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 소나무재선충 관련 세균의 분리 및 동정

강릉, 진주, 문산 등지에서 발생한 감염된 소나무 조직으로부터 분리한 소나무재선충으로부터 소나무재선충병 관련 세균을 분리하기 위하여 Botrytis cinerea에서 키운 소나무재선충을 멸균수로 수확하였다. 루브리아-버타니(Lubria-Bertani agar; LBA) 배지와 영양한천 배지(Nutrient agar; NA)가 담긴 플레이트(지름 8.5 cm)에 플레이트당 약 1,000마리의 선충을 도말하였다. 이 때 배지에는 B. cinerea 균의 생장을 억제하기 위하여 cycloheximide를 50 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. 30℃에서 배양하면서 자라나는 서로 다른 세균 5개의 세균을 분리한 후 새로운 배지에서 다시 단콜로니 분리를 실시하였다. 이렇게 분리한 5개의 세균을 동정하기 위하여 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 16S rDNA homology는 염기서열을 비교 분석하여 계산하였으며, gap 부분은 분석에서 제외하였다. Evolutionary distance matrices는 DNADIST의 알고리즘을 사용하여 계산하였으며, 분자계통도는 거리행렬법 중의 하나인 neighbour-joining method(Saitou & Nei, 1987, Mol. Biol. Evol. 4(4): 406-425)를 사용하여 구성한 결과, 5개의 균주는 각각 Enterobacter sp., Burkholderia arboris, Erwingella americana, Serratia marcescens 및 Bacillus simplex로 동정되었다. 이들 5개의 세균들의 phylogenetic tree는 도 1 내지 도 5와 같다.

일본(Kawazu 등, 1996; Biosci. Biotech. Biochem. 60:1410-1412)과 중국 연구팀의 연구보고(Guo 등, 2000, J. Nanjing For. Univ. 4:69-71; Zhao 등, 2003, Nematology 6:899-906; Zhao, 2005, For. Pathol. 29:339-345)에 의하면 소나무 재선충 및 재선충병 병반 조직에서 분리된 세균이 Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida 및 Burkholderia cepacia 등으로 동정되었으며, 이들은 병원성과 밀접한 관계가 있다고 보고되었다.

<실시예 2> 무균재선충 제조

소나무재선충병의 발병에 있어서 세균의 역할을 규명하기 위하여, 강릉에서 분리한 선충(KN-1 strain)을 이용하여 무균재선충을 만들고자 하였다. 중국 남경임업대학교의 Han 등(2003, J. Phytopathology 151:683-689)이 보고한 방법과 같이 penicillin G, streptomycin 및 fungicidin의 혼합액을 이용하여 무균재선충을 제조하고자 하였으나 실패하였다. KN-1 strain에는 상기 5개의 세균들 중에 B. arboris만이 존재하여, B. arboris 균의 생장을 효과적으로 억제하는 항생물질을 조사하기 위하여 30개의 항생물질을 이용하여 스크리닝하였다. 스크리닝 방법은 NA배지상에 B. arboris 균을 도말한 다음 표 1에서와 같이 각각의 항생제를 일정량 포함하고 있는 paper disc를 치상한 다음 30℃에서 1일간 배양하였다. 1일 후 paper disc 주위에 나타난 생육저지원의 지름(paper disc의 직경(0.8 cm)를 제외한)을 측정하였다. 그 결과 표 1과 같이 총 13개의 항생물질이 B. arboris의 생장을 억제하는 것으로 나타났다. 이 중에서도 클로람페니콜, 카나마이신, 날리딕스산, 옥솔린산 등이 가장 효과가 우수한 것으로 나타났으며, 특히 옥솔린산의 경우 2 ㎍에서도 1.69 cm의 큰 저지원을 나타내 매우 활성이 우수한 것으로 나타났다.

항생물질	처리량(㎍)	저지원(cm)	항생물질	처리량(㎍)	저지원(cm)
Amidinocillin	10	0	Nalidixic acid	30	2.12
Ampicillin	10	0	neomycin	30	0.50
Ampicillin/ Sulbactin	10/10	0	Novobiocin	5	1.44
Azlocillin	75	1.24	Oxacillin	1	0
Bacitracin	10U	0	옥솔린산	2	1.69
Carbenicillin	100	0	Oxytetracycline	30	0
Cefazolin	30	0	penicillin	10U	0
Cefoxitin	30	0	Polymyxin B	300U	0
Chlorampenicol	30	1.76	Rifampin	5	0.68
Cloxacillin	1	0	Streptomycin	10	0
Doxycycline	30	0.37	Surfisoxazole	250	1.01
Erythromycin	15	0	Tetracycline	30	0
Gentamycin	10	0.50	Tobramycin	10	0.45
Kanamycin	30	1.77	Triple Sulfa	250	1.34
Moxalactam	30	0	Vancomycin	30	0

활성이 우수한 4개의 항생물질들의 B. arboris에 대한 최소저해농도를 측정한 결과, 옥솔린산은 1.6 ㎍/㎖ 이하였으며, 클로람페니콜, 날리딕스산 및 카나마이신 등은 각각 3.7 ㎍/㎖, 3.7 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이었다. 한편, Han 등이 사용한 페니실린과 스트렙토마이신은 B. arboris에 대하여 거의 생육저해활성이 없는 것으로 나타났다.

무균 재선충을 제조하기 위하여 멸균수로 소나무재선충을 수확한 다음 800 g(5분)로 3회 원심분리하여 소나무재선충을 세척한 다음 0.9% NaCl을 포함하고 있는 항생물질 혼합액(클로람페니콜, 카나마이신, 날리딕스산, 페니실린 및 스트렙토마이신은 각각 10 mg/ml 수준으로, fungicidin은 5 mg/ml 수준으로 용해되어 있음)으로 6회 반복하여 현탁과 원심분리(800 g, 5 분)의 과정을 반복하였다. 6회째 원심분리 후에 0.9% NaCl 용액으로 3회 세척한 다음 획득한 소나무재선충 현탁액 100 ㎕을 취하여 NA 배지상에 도말하여 세균의 생장여부를 확인하였다. 30℃ 배양기에서 배양하면서 7일동안 세균의 존재를 관찰한 결과 세균은 자라지 않는 것으로 확인되었다. 획득한 무균재선충을 B. cinerea 균체에 접종하여 증식하였다.

<실시예 3> Burkholderia arboris 가 재선충의 증식에 미치는 영향

선충 KN-1 strain으로부터 분리한 세균인 B. arboris의 소나무재선충의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 무균 재선충 100마리에 세균의 수를 달리하여 B. cinerea 균총 위에 접종한 다음, 25℃에서 5일간 배양하였다. 배양후 멸균수로 재선충을 수확한 다음 광학현미경하에서 수를 조사하였다. 그 결과, 도 6과 같이 B. arboris는 무균 재선충의 증식을 촉진시키는 것으로 나타났다. 여러 가지 조합 중에서 세균과 무균 재선충의 밀도가 1:10일 때 가장 재선충의 밀도(1,938±230)가 높았으며, 이는 무처리(unsterilized, US) 재선충의 밀도(2,238±475)와 가장 유사한 것으로 나타났다. 이 실험의 결과 재선충과 함께 존재하는 세균인 B. arboris는 재선충의 증식에 큰 기여를 하는 것으로 나타났으며, 최근 일본의 논문(Wang et al., 2005, Nematology 7:459-467)의 결과, 즉 병원성이 강한 재선충이 병원성이 약한 재선충보다 증식속도가 훨씬 높다는 보고와 연관하여 생각할 때, 공생관계에 있는 세균이 재선충의 밀도 증식에 기여하고, 이에 따라 재선충의 병원성이 증가된다고 추정할 수 있다.

<실시예 4> 무균재선충과 Burkholderia arboris 균주의 병원성 시험

소나무재선충에서 세균의 역할을 규명하기 위하여 무균재선충을 단독으로 또는 세균과 혼합하여 소나무에 접종하여 무처리(US) 재선충과 병원성을 비교하였다. 대상 식물로는 2-3년생의 해송(Pinus thunbergii), 낙엽송(Larix leptolepis), 전나무(Abies hollophylla)를 이용하였고, 나무당 1,000마리의 재선충을 접종하였다. 세균과 무균 재선충의 혼합구의 경우 B. arboris와 무균 재선충을 10:1로 B. cinerea 균총 위에 함께 접종한 다음 1주일 간격으로 한달간 계대배양한 다음 재선충을 수확하여 나무당 1,000마리씩 접종하였다.

그 결과 도 7에서 보는 바와 같이 무처리 재선충(KN-1), 세균과 무균 재선충 혼합처리구, 무균 재선충 순으로 병원성이 강한 것으로 나타났다. 특히 전나무의 경우 접종 90일이 경과하여도 무균 재선충의 경우 전혀 병든 식물이 없는 반면에 무처리 재선충의 경우에는 5그루 중 4그루의 나무가 고사하였다.

동일한 실험을 해송(P. thunbergii)에 대하여 실시하여 접종 65일 후에 관찰한 결과, 그림 8과 같이 무균 재선충(a)은 5그루의 나무 중 한 그루에 대하여 병원성을 나타내었고, 무균 재선충과 세균의 혼합처리구(b)는 60%, 그리고 무처리 재선충(c)은 80%의 병원성을 나타내었다. 이상의 결과, B. arboris과 같은 재선충과 공생관계에 있는 세균은 소나무재선충병 발병에 큰 영향을 미친다는 사실을 확인하였다.

<실시예 5> 세균 증식억제를 통한 소나무재선충병 방제 약제 개발

상기 실험의 결과, 재선충과 공생관계가 있는 B. arboris와 같은 세균은 소나무재선충병 발병에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 따라서 소나무재선충병을 효과적으로 방제할 수 있는 고약효 약제의 개발을 위하여 세균을 억제할 수 있는 약제를 선발하고, 이를 단독으로 또는 재선충 방제제와 합제를 개발하고자 하였다.

이를 위하여 기존의 작용기작에 따라 6개의 대표적인 항생제, 즉 옥솔린산(quinolone 계 항생제; DNA gyrase억제), oxytetracycline(tetracycline계 항생제; 단백질 생합성 억제), streptomycin sulfate(aminoglycoside계 항생제; 단백질 생합성 저해), spiramycin(macrolide계 항생제; 단백질 합성 저해), polymyxin B(polymyxin계 항생제; 세포막 기능 및 구조 저해) 및 aztreonem(monobactam계 항생제; 세포벽 합성 억제)를 선발하여 이들 항생제들이 소나무재선충으로부터 분리한 B. arboris, Enterobacter sp., Bacillus simplex, Erwingella americana 및 Serratia marcescens 등 5개 세균의 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 각각의 항생물질을 에탄올(oxytetracycline, spiramycin), 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO; aztreonem), 또는 멸균수(옥솔린산, streptomycin sulfate, polymyxin B sulfate)에 용해한 후 영양배지(nutrient broth; NB)에 농도를 달리하여 첨가한 다음 세균을 접종한 후 30℃에서 24시간 배양한 다음 600 nm에서 OD값을 측정하였다.

그 결과, 그림 9에서와 같이 옥솔린산은 모든 세균의 생장을 매우 낮은 농도에서 억제한 반면에 다른 항생제들은 균주에 따라 다른 활성을 보였다. 옥솔린산의 경우 실험한 5개의 모든 세균에 대하여 매우 높은 생육저해활성을 보였다. Oxytetracycline의 경우에는 Enterobacter sp.와 E. americana에는 옥솔린산과 유사한 활성을 보였으나, 다른 3개의 세균에 대해서는 옥솔린산보다는 약한 활성을 보였으나, 다른 항생물질보다는 비교적 높은 활성을 보였다. Streptomycin sulfate, spiramycin 및 polymyxin B는 B. arboris와 Enterobacter sp. 에는 효과가 미약하였으나, 다른 3개의 세균에 대해서는 비교적 높은 활성을 보였다. Aztreonem는 B. arboris에 대해서만 약한 활성을 보였다.

<실시예 6> 항세균물질과 이버멕틴과의 합제에 의한 in vitro 살선충 활성

상기 실시예 5에서 가장 항세균활성이 우수한 것으로 나타난 옥솔린산의 소나무재선충에 대한 살선충 활성 여부와 avermectin계열의 살선충 물질인 이버멕틴과 합제시 상승효과 여부를 조사하였다. 옥솔린산의 경우 상기 실시예 5에서와 같이 옥솔린산-sodium salt를 증류수로 1,000, 500, 250 ㎍/ml로 용해하였고, 이버멕틴의 경우 DMSO로 100, 50, 25 ㎍/ml으로 용해하였다. 감자 덱스트로스 한천배지(potato dextrose agar, PDA)상에서 자란 보트라이티스 씨네레아(Botrytis cinerea)를 먹이로 일주일 동안 25℃에서 키운 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus, 국립산립과학원)을 멸균수로 수확한 후 1000 g로 1분간 원심 분리한 다음 트리톤 엑스-100(Triton X-100, 100 ㎍/ml) 용액으로 ml당 1,000 마리로 희석하였다. 이 소나무재선충 현탁액 100 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣은 후 메탄올 추출물 용액 1 ㎕를 첨가하였다. 25℃에서 48시간 동안 배양한 후 선충의 치사율을 측정하였다. 무처리구의 경우 1%의 DMSO를 처리하였다.

물질	살충율(%)
이버멕틴(Ivermectin)	1 ㎍/ml	0.5 ㎍/ml	0.25 ㎍/ml
이버멕틴(Ivermectin)	99	99	97
옥솔린산	10 ㎍/ml	5 ㎍/ml	2.5 ㎍/ml
옥솔린산	31	18	6

표 2에서 보는 바와 같이 옥솔린산의 경우 10 ㎍/ml에서 31%의 살선충활성을 보였지만, 이버멕틴과 비교할 때 살선충활성은 매우 약한 것으로 나타났다.

두 물질의 상승효과 여부를 조사하기 위하여 옥솔린산과 이버멕틴을 혼합하여 처리하였다. 이 때 옥솔린산은 10 ㎍/ml으로 일정하게 처리하고, 이버멕틴만 농도를 1/3씩 희석하면서 농도를 낮추었다. 무치리의 경우 DMSO만 1% 처리하였다.

이버멕틴의 농도 (㎍/ml)	이버멕틴	이버멕틴+옥솔린산
1.0	99	100
0.33	97	97
0.11	88	97
0.037	47	84
0.012	7	81
0.004	2	61
0	0	31

표 3에서 보는 바와 같이 이버멕틴과 옥솔린산은 소나무제선충에 대한 살선충활성에 대하여 상승작용이 있는 것으로 나타났다.

<실시예 7> 온실에서 옥솔린산의 소나무재선충병에 대한 예방효과

상기 실시예 5에서 in vitro test에서 B. arboris에 대하여 가장 활성이 우수한 옥솔린산에 대하여 소나무 유묘를 이용한 in vivo test에서의 소나무재선충병에 대한 방제효과를 조사하였다. 2년생 소나무 유묘(직경 5.5 mm 내외 그리고 키가 약 35 cm)를 이용하여 실험하였으며, 옥솔린산은 메탄올 20%와 Tween 20 250 ㎍/ml을 포함한 수용액에 3과 30 mg/ml 수준으로 용해한 다음 소나무당 1 ml씩 주입하였다. 약제 주입은 소나무 줄기의 아랫부분부터 약 4 cm 위치에 드릴로 상처를 낸 다음 실시하였다. 접종 1주일 후에 소나무 줄기의 아랫부분부터 약 30 cm 위치에 상처를 내고 주 당 2,000마리의 소나무 재선충(KN-1)을 접종하고 약제의 방제효과를 실험하였다. 발병도는 다음과 같은 index로 조사하였다(0: 시들음 증상이 없음, 1: 일부 가지에만 병이 발생, 2: 50% 이상 시든 상태, 3: 완전 고사된 상태).

그 결과, 표 4에서 보는 바와 같이 옥솔린산 3 mg과 30 mg를 2년생 소나무에 수간 주입하였을 경우 각각 78%와 56%의 방제효과를 나타내었다. 이와 같이 항세균활성물질만 처리하여도 소나무제선충병을 방제할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

약제주입량 (mg/나무)	7일 예방효과
약제주입량 (mg/나무)	이병율(%)	방제가(%)
3	13	78
30	27	56
무처리	60	-

<실시예 8> 온실에서 옥솔린산과 이버멕틴 합제의 소나무재선충병에 대한 예방효과

항세균제인 옥솔린산이 살선충 약제인 이버멕틴과의 합제시 상승효과 여부를 조사하기 위하여 두 약제를 혼합하여 소나무재선충병에 대한 예방효과를 조사하였다. 이버멕틴의 약제 제조는 상기 실시예 4에서 옥솔린산과 마찬가지로 메탄올 20%와 Tween 20 250 ㎍/ml이 포함된 수용액에 용해한 후 실험에 이용하였다. 이버멕틴 단제 처리구의 경우 소나무당 3.6 mg을 주입하였으며, 옥솔린산 단제 처리의 경우 10 mg을 주입하였다. 그리고 두 약제 합제의 경우 이버멕틴 1.8 mg, 옥솔린산 5 mg을 혼합하였다. 나머지 방법은 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다.

표 5에서 보는 바와 같이 이버멕틴 단제와 옥솔린산 단제를 수간 주입한 경우에는 각각 67%와 56%를 보인 반면에 두 약제를 단제 처리보다 1/2배 낮은 농도로 혼합처리한 경우에는 89%의 높은 방제효과를 보여 두 약제간에 상승효과가 있었다.

처리(약량, mg/나무)	7일 예방효과
처리(약량, mg/나무)	이병율(%)	방제가(%)
옥솔린산(10)	20	67
이버멕틴(3.6)	27	56
옥솔린산(5) + 이버멕틴(1.8)	7	89

<실시예 9> 온실에서 옥솔린산과 이버멕틴 합제의 소나무재선충병에 대한 치료효과

옥솔린산의 소나무재선충병에 대한 치료효과를 조사하기 위하여 5년생 소나무(직경 9 mm 내외이고 키가 약 55 cm)를 사용하여 접종 2일 후 약제처리에 의한 치료효과를 실험하였다. 잿빛곰팡이병균 위에서 배양한 소나무 재선충을 수확하여 소나무에 접종하였는데, 접종은 5년생 소나무의 어린 가지에 드릴로 상처를 내고 소나무 재선충이 3,000마리가 포함된 현탁액 300 ㎕를 소나무에 수간주입 하여 실시하였으며 접종한 후 온실(25±5℃)에서 재배하면서 발병을 유도하였다. 접종 2일 후에, 5년생 소나무의 지제부로부터 약 7 cm 위치에 드릴로 상처를 내고 약제 용액을 2 ml 씩 수간주입 하였으며, 무처리구는 약제 없이 메탄올 20%와 Tween 20 250 ppm 수용액 2 ml를 수간주입 하였다. 약제용액은 다음과 같은 방법으로 준비하였는데, 옥솔린산 20 mg, 이버멕틴 7.2 mg, 이버멕틴 3.6 mg+옥솔린산 10 mg을 각각 메탄올에 용해하고 최종농도가 20%가 되도록 Tween 20 250 ppm 수용액에 첨가하였다.

접종 3개월 후에 이병주율로 병조사를 실시한 결과, 이버멕틴+옥솔린산(OA) (3.6 mg+10 mg) 처리구에서는 거의 효과가 없는 것으로 나타났는데 비하여, 옥솔린산(20 mg) 단독 처리구에서는 60%의 방제효과를 보였다(표 6). 그리고 이버멕틴 (7.2 mg) 단독 처리구는 40%의 방제활성이 보였다. 이와 같이 옥솔린산의 단독 처리구가 소나무재선충병에 대하여 가장 높은 치료효과를 보였다.

약제	주 당 처리량	이병주율(%)	방제가(%)
이버멕틴	7.2 mg	50%	40
OA	20 mg	33%	60
이버멕틴+OA	3.6+10 mg	67%	19
Control		83%	-

<실시예 10> 포장에서의 옥솔린산의 소나무재선충병 방제효과

포장에서의 옥솔린산의 소나무재선충병에 대한 효과를 조사하기 위하여 옥솔린산을 단독으로 또는 avermectin계 살선충활성물질과 동시에 처리를 하였다. 진주 남부산림과학연구소 연습림에서 흉고직경이 20 cm 안팎의 적송을 이용하여 실험을 실시하였다. 옥솔린산은 옥솔린산-Na salt 10.0%, 메틸 알코올 20.0%, 소르비톨 10.0% 및 물 60.0%의 비율로 제제를 한 다음 단독 처리의 경우 소나무 흉고 직경 1 cm당 2 ml씩 수간주입하였다. 아바멕틴과 이버멕틴은 공히 원제 2.0%, 계면활성제로서 polyoxyethylene(15 mole) polyoxypropylene(3 mole)tristyrylphenylether(CROPOL TP1503) 15.0%, dipropyleneglycol 20.0%, propylene glycolmonomethylether 63%로 제제한 다음, 단독 처리구의 경우 흉고 직경 1 cm당 1 ml씩 주입하였다. 혼합처리의 경우 옥솔린산과 avermectin의 합제의 경우 흉고직경 1 cm당 옥솔린산제제(10%)는 1 ml, 아바멕틴 제제(2%)와 이버멕틴 제제(2%)는 0.5 ml씩 주입하였다. 수간 주입은 지표면에서 약 30 내지 50 cm 위에 직경 7 mm의 드릴로 구멍을 낸 다음 약제를 5 ml씩 주입한 다음 parafilm으로 입구를 막았다. 수간 주입은 2008년 2월 20일에 실시하였고, 소나무재선충의 접종은 2008년 5월 20일에 실시하였다. 접종원은 자연감염된 소나무조직에서 바이에른법을 이용하여 수확하여 10,000마리/ml로 희석한 다음 가슴높이에 7 mm 직경의 드릴로 구멍을 낸 후 1 ml씩 주입하였다. 각 처리당 30개의 소나무를 사용하였으며, 무처리구의 경우 약제 수간주입 없이 소나무재선충만을 접종하였고, 접종 4개월 후(2008년 9월 17일)에 이병주율을 조사하였다.

처리구	이병주율(%)	방제가(%)
옥솔린산(OA)	10	87
아바멕틴(Abamectin)	0	100
이버멕틴	0	100
OA+아바멕틴	0	100
OA+이버멕틴	0	100
무처리구	77	-

표 7에서 보는 바와 같이 옥솔린산은 포장에서 큰 소나무를 대상으로 실험을 수행했을 때에도 소나무재선충병에 대하여 강한 방제효과를 나타내었다. 특히 아바멕틴과 이버멕틴과의 1/2의 낮은 농도로 합제를 하였을 경우에도 강한 방제효과를 보였다.

도 1은 Enterobacter sp.의 16S rDNA 서열 비교를 통한 계통분류학적 위치를 보여준다.

도 2는 Burkholderia arboris의 16S rDNA 서열 비교를 통한 계통분류학적 위치를 보여준다.

도 3은 Erwingella americna의 16S rDNA 서열 비교를 통한 계통분류학적 위치를 보여준다.

도 4는 Serratia marcescens의 16S rDNA 서열 비교를 통한 계통분류학적 위치를 보여준다.

도 5는 Bacillus simplex의 16S rDNA 서열 비교를 통한 계통분류학적 위치를 보여준다.

도 6은 Burkholderia arboris가 무균 재선충의 증식에 미치는 영향을 나타낸다(BF: bacterium-free nematode, Bc: Burkholderia arboris, US: unsterilized nematode).

도 7은 해송(Pinus thunbergii)(a), 낙엽송(Larix leptolepis)(b) 및 전나무(Abies holophylla)(c)에 대한 무처리 재선충(US: unsterilized nematode), 무균 재선충(BF: bacterium-free nematode) 및 무균 재선충과 Burkholderia arboris 혼합처리구(BF+BC)의 병원성 시험 결과를 나타낸다.

도 8은 해송(Pinus thunbergii)에 대한 무균 재선충(a), 무균 재선충과 Burkholderia arboris 혼합처리구(b) 및 무처리 재선충(c)의 병원성 시험 결과를 나타낸다.

도 9는 6개 항생물질의 소나무재선충관련 세균들의 생장에 미치는 영향(OA: 옥솔린산, ST: streptomycin sulfate, OT: oxytetracycline, SP: spiramycin, PM: polymyxin B, AT: aztreonem)을 보여준다.

Claims

항세균활성 물질을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항세균활성 물질은 퀴놀론(quinolone)계 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 퀴놀론계 물질은 화학식 1의 옥솔린산(oxolinic acid)인 것을 특징으로 하는 조성물.

[화학식 1]
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 살선충활성물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 살선충활성 물질은 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성 물질, 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate), 메설펜포스(mesulfenfos) 및 레바미솔(levamisol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성물질은 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 아바멕틴(abamectin), 밀베멕틴(milbemectin) 또는 이버멕틴(ivermectin)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법.
제4항에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물을 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법.