KR20100042432A - Ｔｍｐｒｓｓ４―특이적인 인간항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TMPRSS4(Transmembrane protease, serine 4)-특이적인 인간항체에 관한 것으로, 구체적으로 TMPRSS4에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유도된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)과 프레임 워크 영역(framework region, FR)으로 구성된 인간 항체에 관한 것이다. 본 발명의 여러 종류의 암세포에서 발현하는 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체는 상기 암의 진단, 질환의 분류, 영상화, 치료 및 예후 판정 등에 이용될 수 있다.
TMPRSS4, 인간항체, 대장암

Description

ＴＭＰＲＳＳ４―특이적인 인간항체{TMPRSS4―specific human antibody}
본 발명은 TMPRSS4(Transmembrane protease, serine 4)-특이적인 인간항체에 관한 것이다.
포유동물 조직의 발생과 항상성에 중요한 역할을 수행하는, 세포내의 많은 분자 중에서 단백질 분해 활성을 지닌 프로테아제는 소화, 보체 활성(complement activation) 및 혈액 응고(blood coagulation)를 포함한 다양한 생물학적인 프로세스의 진행에 중요하며, 이외에도 종양 및 암 질환에 있어서도 중요한 인자로서 그 중요성이 점점 대두되고 있다. 최근에 세포 표면 관련(cell-surface-associated) 프로테아제의 새로운 구성원로 알려진 TTSPs(type II transmembrane serine proteases)의 일부 패밀리들 역시 이러한 관점에서 암의 발생에 관련된 그들의 대두된 효과(emerging effect)에 관심이 고조되고 있다. 최근까지 알려진 20개 이상의 TTSPs 구성원 중 인간의 종양과 직간접적으로 연관성있는 이러한 효소들의 가능한 기능들에 많은 암 연구들이 주목하고 있는 것도 사실이다. 특히 암 세포는 프 로테아제의 다양한 단백질 분해 활성 및 세포 신호전달 조절을 통해 세포 성장, 신혈관생성(angiogenesis), 침윤(invasion), 이동, 전이, 생존, 확장(expansion), 진행(progression) 등이 이루어지는 것으로 알려져 있다(Andreasen PAJ Cancer 72(1):1-22, 1997; Stetler-Stevenson WG et al. Semin Cancer Biol 11(2):143-152, 2001; Deryugina EI et al. Cancer Metastasis Rev 25(1):9-34, 2006). 이 중 가장 대표적인 특징은 MMP(matrix metalloproteinases)와 uPA(urokinase plasminogen activator)등의 세린 프로테아제(serine protease)를 포함하여 세포외 단백질 분해효소(extracellular proteolytic enzymes)들과 같은 비조절 단백질 분해효소(unregulated protease)에 의해 세포간극기질 및 기저막(basement membrane)을 구성하는 ECM(extracellular matrix)의 분해(degradation), 리모델링(remodeling) 등이 있고, 이를 통해 암 세포는 주변 조직을 국소적으로 침윤하고 또한 멀리 떨어진 곳으로 전이하게 된다(Duffy MJ Clin Cancer Res 2(4):613-618, 1996). 암세포의 침윤 및 전이는 암환자의 치료예후를 결정함으로써 임상적으로 매우 중요하다. 암세포의 전이력을 조절하거나 이와 관련된 유전자들은 임상 진단 마커로서 사용될 수 있을 뿐 아니라 암 치료 타겟으로서도 매우 중요하다.
TTSP는 다양한 범위의 종양 침윤(tumor invasion)과 전이(metastasis)를 포함한 다양한 범위의 세포 기능을 매개하는 세포 표면 단백질 분해효소이다(Parr C. et al. Clin Cancer Res 13(12):3568-3576, 2007). 구조적인 특징을 보면, TTSPs의 모든 구성원들은 기본적으로 아미노산 서열 간의 동일성이 높은 세포외 영역의 카복시 말단 세린 프로테아제 도메인(carboxy terminal serine protease domain), 짧은 아미노 말단 세포질 꼬리(short amino terminal cytoplasmic tail), 소수성 잔기(hydrophobic residue)로 구성된 세포막-스패닝 막횡단 영역(membrane-spaning transmembrane region)과 스템 지역 구조 도메인(stem-region structural domains)등과 같이 일반적인 구조적 특징을 공유하고 있으나 각각의 독특한 구조는 조금씩 다르다. 또한, 대부분의 세린 프로테아제는 분비 단백질이나 TTSP의 경우 세포막에 끼어있는 도메인(intergral transmembrane domain)이 존재함으로써 구조적으로 별개의 아형(subclass)을 가능하게 한다. 세포질 꼬리의 존재는 TTSPs가 세포골격(cytoskeleton) 및 세포 신호전달 분자(signaling molecules)와의 상호작용이 가능함을 암시해주며, 또한 TTSPs의 다중 도메인 구조는 잘 알려진 uPA/uPAR 시스템과 마찬가지로, 다중 파트너 분자와 '시그날로좀 유사 복합체(signalosome-like complex)'의 부분을 형성할 수 있음을 암시한다. TTSPs의 다양한 종류의 도메인으로 이루어진 시스템 영역에서 가장 공통적인 구조 도메인은 LDL(low-density lipoprotein) 수용체 클래스 A 도메인으로 corin/TMPRSS10은 8개, MT-SP1(membrane-type serine protease-1)/매트립타아제(matriptase)은 4개, 엔테로키나제/엔테로펩티다아제(enteokinase/enteropeptidase)는 2개와 TMPRSS2/에피테리아신(epitheliasin)과 TMPRSS4/MT-SP2는 각각 1개를 가지며(Hooper JD et al. J Biol Chem 276(2):857-860, 2001), 이들의 기능은 아직 명확하게 알려져 있진 않지만, 세포 표면에서 Ca+2 이온과 결합하여 세린 프로테아제 억제 복합체와 지질 단백질을 포함한 거대 분자의 내재화를 매개한다는 보고들이 있으며(Brown MS et al. Nature 388(6643):629-30, 1997; Nykjaer A et al. Embo J 16(10):2610-2620, 1997; Kounnas MZ et al. J Biol Chem 271(11):6523-6529, 1996), MT-SP1/매트립타아제와 같은 일부 구성원들에선 인테그린(integrin)과의 상호작용을 가능케 하는 RGD 도메인도 존재한다고 보고되며(Takeuchi T et al. J Biol Chem 275(34):26333-26342, 2000), 스템 영역의 다른 6종류의 구조 도메인의 경우도 단백질간 상호작용 또는 단백질-리간드 간 상호작용에 관련이 있다고 여겨지고 있다.
다른 세포 표면 관련 프로테아제 시스템과 유사하게 TTSPs 또한 원형질(plasma) 막에 위치해 이러한 지역화의 장점으로, 이러한 세린 프로테아제들이 PARs(cell-membrane protease-activated receptor), 성장인자와 싸이토카인과 같은 세포 표면 단백질과 수용성 단백질을 단백질 분해로 활성화하고 액상의 여러 리간드와 상호 작용 하도록 하는 단백질 분해 케스케이드를 활성화힐 수 있는 가능성이 있다고 보여지며(Takeuchi T et al. J Biol Chem 275(34):26333-26342, 2000),이러한 점에서 암 진행에 있어 이들의 중요성이 인식되어 오고 있다. 현재까지 약 20종 이상의 TTSP가 확인되었는데, 이 중 암과 관련 있는 TTSP의 구성원으로는 TMPRSS4/MT-SP2 및 corin/TMPRSS10를 비롯하여, hepsin/TMPRSS1, 엔테로키나제/엔테로펩티다아제, MT-SP1/매트립타아제, TMPRSS2/에피테리아신, TMPRSS3/TADG-12, TMPRSS6/매트립타아제-2(Velasco G et al. J Biol Chem 277(40):37637-37646, 2002)와 DESC1/TMPRSS11E(Lin CY et al. J Biol Chem 274(26):18231-182316, 1999; Takeuchi T et al. Proc Natl Acad Sci U S A 96(20):11054-11061, 1999; Magee JA et al. Cancer Res 61(15):5692-5696, 2001; Wallrapp C et al. Cancer Res 60(10):2602-2606, 2000; Lang JC et al. Br J Cancer 84(2):237-243. 2001)등이 있으며, 이러한 TTSPs의 발현이 종양 성장 및 진행 동안 조절이 곤란해 진다는 연구들이 활발히 되어 오고 있다(Netzel-Arnett S. et al. Cancer Metastasis Rev 22(2-3):237-258, 2003). 그러나 암 진행에 있어서 TTSP 구성원들의 역할에 대한 정보는 제한적이다. 이 중, MT-SP1/매트립타아제는 유방암에서 주요 젤라린 융해성 활성(major gelatinolytic activity)으로 처음 기술되었고(Lin CY et al. J Biol Chem 272(14):9147-9152, 1997; Shi YE et al. Cancer Res 53(6):1409-1415, 1993), 전립선암, 대장암, 유방암, 대장암, 폐암,간암, 신장암과 췌장암 등과 같이 다양한 종양에서 현저하게 시종일관 발현되기 때문에 암 분야에서 집중적인 관심을 받아오고 있는 TTSPs중의 하나이다(Uhland K. Cell Mol Life Sci 63(24):2968-2978, 2006). TTSP의 새로운 구성원으로 추가된, 초기엔 TMPRSS3로도 언급되었던 TMPRSS4/MT-SP2(Wallrapp C et al. Cancer Res 60(10):2602-2606, 2000)은 폐암, 간암, 대장암, 췌장암과 위암과 대장암에서 그 유전자가 현저히 상향조절되어 발현되고, 대다수의 췌장암 세포주에서 높게 과발현됨이 확인되었고, 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)에서 과발현되어 이런 유형의 종양에서 진단 및 예후 평가 마커로서 제안되었다(Kebebew E et al. Ann Surg 242(3):353-361, 2005; Kebebew E et al. Cancer 106(12):2592-2597, 2006). TMPRSS4가 췌장암 침윤 및 전이에 관여할 가능성이 예상되지만, 재조합 TMPRSS4 단백질 발현이 in vitro 및 in vivo 췌장암 모델에서 종양 침윤 및 암 진행에 영향을 주지 않은 결과가 보고된 바 있다. 그러나 TMPRSS4의 암에서의 생물학적 기능은 최근에서야 밝혀지고 있는 데(Jung H et al. Oncogene 17;27(18):2635-2647, 2007), 이에 따르면 TMPRSS4가 침윤, 전이, 이동 및 유착과 인간 상피성 종양 세포(human epithelial cancer cells)에서의 EMT(epithelial mesenchymal transition)에 중요한 매재가이고 TMPRSS4가 암에 대한 새로운 치료용 표적 가능성을 설명하고 있다. TMPRSS4에 대한 연구는 그리 많지 않지만 강력하고 독립적인 예후 마커로서의 가능성과 이데 대한 저해제의 개발이 침윤 및 전이억제 타겟으로서 가능성이 크므로 항암 타겟으로서의 TMPRSS4에 대한 항체의 개발할 필요성 역시 대두되고 있다.
상기 TMPRSS4는 폐암, 간암, 대장암, 췌장암과 위암과 대장암에서 그 유전자가 현저히 상향조절되어 발현되고, 대다수의 췌장암 세포주에서 높게 과발현됨이 확인되었고, 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)에서 과발현되어 이런 유형의 종양에서 진단 및 예후 평가 마커로서 제안되었다(Kebebew E et al., Ann Surg 242(3):353-361, 2005; Kebebew E et al., Cancer 106(12):2592-2597, 2006)
이에, 본 발명자들은 대장암세포주의 표면에서 발현하는 TMPRSS4에 특이적으로 결합하는 13종의 인간 항체를 선별하고, 상기 인간 항체가 기존의 비인간 유래 항체와 유사한 수준의 결합능을 가지는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 인간 중쇄의 불변영역을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 인간 경쇄의 불변영역을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 TMPRSS4에 특이적인 인 간 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체 또는 형질전환체를 포함하는, TMPRSS4가 과발현되는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암을 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 단편의 진단적 유효량을 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 암의 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 TMPRSS4가 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 암의 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 생체내 TMPRSS4가 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용하는 암 치료의 예후 평가 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 7 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역(이하, HCDR) 1, 서열번호 19 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 2 및 서열번호 32 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄 또는 그의 단편; 및,
서열번호 58 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR) 1, 서열번호 71 내지 83로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 2 및 서열번호 84 내지 96로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체를 포함하는, TMPRSS4가 과발현되는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체를 TMPRSS4가 과발 현되는 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 암의 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 TMPRSS4가 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,
2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 TMPRSS4가 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 대장암 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 종양 세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 대장암 치료 환자의 예후 평가 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
"가변영역"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변영역에는 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다.
"상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
"패닝(panning)"은 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 7 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역(이하, HCDR) 1, 서열번호 19 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 2 및 서열번호 32 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄 또는 그의 단편; 및,
서열번호 58 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR) 1, 서열번호 71 내지 83로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 2 및 서열번호 84 내지 96로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체를 제공한다.
바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 45 내지 57으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 97 내지 109로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항 체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명에서는 TMPRSS4에 대한 인간 항체를 파지 표출 기술(Phage Display Technology)을 이용하여 scFv 형태로 수득하였으며, 단일 파지 클론(mono phage clone) 형태로 스크리닝(screening)함으로써 TMPRSS4에 특이적인 13종의 단일 클론 파아지(monoclone phage)를 수득하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 재조합 기술로 수득한 TMPRSS4(도 1 및 도 2 참조)의 활성을 확인한 후(도 3 및 도 4 참조), 다클론 항체(도 5 참조) 및 단일클론 항체의 제조에 이용하였다. 상기 TMPRSS4를 다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포(human naive scFv library cell)로부터 제조한 라이브러리 파지와 반응하여 패닝(panning)시킨 후, TMPRSS4 항원에 강하게 결합하는 단일 클론을 스 크리닝(screening)하였다(표 2, 3 및 도 6 참조). 상기 선별된 단일 클론들을 핑거프린팅(fingerprinting)으로 확인한 후(도 7 참조), 각각의 서열을 분석하여 항체의 VH와 VL의 CDR 부위(region)를 확인하였다(표 6 및 도 8 참조). 상기 항체와 생식 계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 확인한 결과(표 7 참조), 13종의 TMPRSS4에 특이적인 파아지 항체를 얻었다. 상기 선별된 단일 클론 항체는 다클론 항체에 비해 신호의 세기는 작았지만, 비특이적 결합없이 깨끗하게 약 30 KDa의 항원 단백질을 검출할 수 있었고(도 9 참조), TMPRSS4가 과다 발현된 대장암 세포주에서 TMPRSS4를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있었다(도 10 참조).
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 재조합 기술로 수득한 TMPRSS4를 이용하여, TMPRSS4 항원에 강하게 결합하는 단일 클론을 스크리닝(screening)하였다(표 2, 3 및 도 6 참조). 상기 선별된 단일 클론들을 핑거프린팅으로 확인한 후(도 7 참조 ), 각각의 서열을 분석하여 항체의 VH와 VL의 CDR 부위(region)를 확인하였다(표 6 및 도 8 참조). 상기 항체와 생식 계열 항체군의 유사성을 확인한 결과(표 7 참조), 13종의 TMPRSS4에 특이적인 파아지 항체를 얻었다. 상기 선별된 단일 클론 항체는 비특이적 결합없이 깨끗하게 약 30 KDa의 항원 단백질을 검출할 수 있었고(도 9 참조), TMPRSS4가 과다 발현된 대장암 세포주에서 TMPRSS4를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있었다(도 10 참조).
본 발명의 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.
상기 발현벡터의 제작 시에는, 상기 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단 편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 단일 클론 파아지의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 수득하여 각각 벡터에 연결한 후, 상기 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 발현된 전체 IgG 형태의 인간 항체를 확인하였다(도 12 참조). 상기 전체 IgG 형태의 인간 항체를 정제한 후(도 13 참조), TMPRSS4에 대한 결합력을 FACS로 확인하였다(도 14 참조).
본 발명에 따른 상기 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 동물 세포는 자가 또는 동종 이계 동물 세포일 수 있다. 자가 또는 동종 이계 동물 세포에 도입하여 제조된 형질전환체는 개체에 투여되어 암을 치료하는 세포치료 등에 이용될 수도 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로,
1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양액으로부터 상기 인간 항체를 정제하는 단계를 포함하는 TMPRSS4 에 특이적인 인간 항체의 제조방법을 제공한다.
상기 배양 배지로는 당업자에게 공지된 배양 배지 중 형질전환체에 적합한 배지를 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 상기 항체 정제 방법은 당업자에게 공지된 어떠한 정제 방법도 사용 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 단일 클론 파아지의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 수득하여 각각 벡터에 연결한 후, 상기 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 발현된 전체 IgG 형태의 인간 항체를 확인하였다(도 12 참조). 상기 전체 IgG 형태의 인간 항체를 단백질 A-친화도 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제한 후(도 13 참조), TMPRSS4에 대한 결합력을 FACS로 확인하였다(도 14 참조).
또한, 본 발명은 상기 인간 항체를 포함하는, TMPRSS4가 과발현되는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 TMPRSS4가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, TMPRSS4 단일클론 항체는 대장암 세포주에서 래빗 및 인간 정상 IGg에 비해 50% 이상 뚜렷한 침윤의 저해를 나타내었고(도 15 및 도 16 참조), TMPRSS4에 의해 야기된 대장암 세포주의 이동을 TMPRSS4 특이적인 다클론 항체 및 단일클론 항체로 저해한 것을 확인하였다(도 17 내지 19 참조). 아울러, 본 발명의 단일클론 항체가 TMPRSS4가 과발현된 대장암 세포주의 증식을 억제하도록 유발한 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 TMPRSS4가 과발현된 암 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체 또는 상기 형질전환체를 선택적으로 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 위해서 상기에 기재된 유효성분 이외에 추가로 약제학적 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합 하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 세포에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 세포에 특이적인 항체 또는 기타 리간드를 상기의 담체와 함께 결합시켜 사용할 수 있다. 아울러, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 약학적 조성물은 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 주사용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결-건조 기술을 이용하여 냉동건조된 형태로 제조될 수 있다. 냉동건조된 약학적 조성물은 전형적으로 약 4℃에서 유지되며, 보조제를 함유하거나 함유하지 않은 안정화 용액, 예를 들면, 식염수 또는/및 HEPES에 의해 복원될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 약학적 조성물의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 환자의 체중이 증가할 수록 본 발명의 약학적 조성물을 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 TMPRSS4가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
바람직한 치료용 방사선 동위원소의 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합을 포함한다. 상기 치료용 방사선 동위원소는 인간 항체와 결합되거나 인간 항체가 결합된 운반체에 포함되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체를 TMPRSS4가 과발현되는 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암을 치 료하는 방법을 제공한다.
상기 TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 TMPRSS4가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, TMPRSS4 단일클론 항체는 대장암 세포주에서 침윤, 이동 및 증식을 저해하는 것을 확인하였다(도 15 내지 19 참조). 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 TMPRSS4가 과발현된 암 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명이 적용가능한 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
본 발명의 인간 항체의 투여방법은 사용목적에 따라 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 등에 투여하는 방법)로 할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 투여가 바람직하다. 경우에 따라 고형암에 대한 투여에서는 항체의 접근을 빠르고 용이하게 하기 위하여 국부적인 투여가 바람직할 수도 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1회 투여량은 약 5 내지 500 ㎎/m2의 양으로 일 단위 또는 주 단위로 투여될 수 있다. 상기 유효량은 상기 환자를 치료 하는 의사의 재량에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 암환자의 치료를 위하여 단독 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병행하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 검출용 조성물을 제공한다.
상기 TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 TMPRSS4가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 단일클론 TMPRSS4 항체는 TMPRSS4가 과다 발현된 대장암 세포주에서 TMPRSS4를 특이적으로 인식하고 결합한 것을 확인하였다(도 10 참조). 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 검출용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편은 치료용 방사선 동위원소, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 또는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출가능한 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나 연결된다. 바람직한 치료용 방사선 동위원소의 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 TMPRSS4가 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공한다.
상기 TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 TMPRSS4가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 단일클론 TMPRSS4 항체는 TMPRSS4가 과다 발현된 대장암 세포주에서 TMPRSS4를 특이적으로 인식하고 결합한 것을 확인하였다(도 10 참조). 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 검출용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 검출용 조성물은 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
또한, 암세포는 상기 검출용 조성물과 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 상기 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,
2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 TMPRSS4가 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공한다.
상기 TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 TMPRSS4가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 단일클론 TMPRSS4 항체는 TMPRSS4가 과다 발현된 대장암 세포주에서 TMPRSS4를 특이적으로 인식하고 결합한 것을 확인하였다(도 10 참조). 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 검출용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 검출영상은 근적외광 이미징, PET, MRI 또는 초음파 이미징에 의해 수득되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공한다.
상기 TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 TMPRSS4가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, TMPRSS4 단일클론 항체는 대장암 세포주에서 침윤, 이동 및 증식을 저해하는 것을 확인하였다(도 15 내지 19 참조). 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 TMPRSS4가 과발현되는 암 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 대장암 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 종양 세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 암 치료 환자의 예후 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 대장암세포에서 발현하는 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체는 상기 TMPRSS4가 과발현된 암의 진단, 질환의 분류, 영상화, 치료 및 예후 판정 등에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> TMPRSS4 항원단백질 제조
<1-1> TMPRSS4 유전자 클로닝
한국생명공학연구원 인간유전체기능연구사업단의 KUGI(Korean UniGene Information)에서 인간 TMPRSS4 유전자를 함유하고 있는 플라스미드(IRAU-61-E06; 클론 ID: hMU011286)를 분양받았다. 상기 플라스미드를 주형 DNA로 하고, 상기 TMPRSS4의 프로테아제 도메인(aa205~434)만을 발현시키기 위해서 정방향 프라이머(서열번호 1: 5'-GAGGAGCATATGGATTATAAAGATCATGATATTGATTATAAAGATGATGATGATAAAGTGGTGGGTGGGGAGGAG-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 2: 5'-GAGGAGCTCGAGCAGCTCAGCCTTCCAGAC-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, NdeI과 XhoI으로 처리한 후, 라이게이즈를 이용하여 pET21c(Novagen, USA)에 서브클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, 94℃ 2 분, 94℃ 30 초, 55℃ 30 초, 72℃ 1분 30초로 30 사이클, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다. 아울러, 상기 서브클로닝된 벡터의 염기서열을 확인하였다(도 1).
<1-2> TMPRSS4 단백질 발현 및 정제
상기 서브클로닝된 벡터를 BL21(DE3)로 형질전환시킨 후, LB(+amp)배지에 접종하여 밤새 배양한 다음, 500 ㎖ LB(+amp) 배지에 1/100로 희석하여 접종하였다. 37℃에서 2시간 정도 OD=0.5까지 추가로 배양한 후, IPTG를 1 mM 농도로 처리한 후 4시간 동안 배양하였다. 대장균을 5000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 후, Bug buster 용액 10 ㎖에 현탁한 후 15분간 깬 후 12000rpm에서 30분간 원심분리하여 수용성 분획과 불용성 분획을 분리하였다. 이를 SDS-PAGE로 분석한 결과, TMPRSS4 단백질은 불용성 분획에 존재하였다. 불용성 분획을 8M 우레아 용액(8 M urea, 0.1 M NaH2PO4, 0.01 M TrisCl pH7.9)으로 녹인 후, Ni-NTA 레진(Qiagen, 미국) 1 ㎖에 결합시킨 후, 10 ㎖의 세척 완충용액(8 M urea, 0.1 M NaH2PO4, 0.01 M TrisCl pH5.9)으로 씻어주고, 5 ㎖의 용리 완충용액(8 M urea, 0.1 M NaH2PO4, 0.01M TrisCl pH4.5)으로 용리하였다. 용리한 TMPRSS4 단백질(TMPS4-FLAG)은 PBS(+10% glycerol)용액으로 투석하여 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 쿠마시 염색하여 약 35 kDa의 크기를 확인하였다(도 2).
상기 정제된 TMPS4-FLAG 단백질 1 ㎎을 도 3a에서 나타낸 바와 같이, 40 ng 엔테로키나제(Enterokinase; NEB, 미국)로 6시간 동안 실온에서 반응시킨 후, Ni-NTA 레진을 이용하여 TMPRSS4만을 정제하였다(TM-EK). 상기 정제된 단백질을 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 쿠마시 염색하여 약 31 kDa의 크기를 확인하였다(도 3b).
<실시예 2> TMPRSS4 단백질에 의한 효소 활성 측정
TMPRSS4의 세포외 도메인의 트립신 유사 단백질 분해 활성을 측정하기 위하여, TMPS4-FLAG단백질(2.25 ㎍)에 형광 펩티드 트립신 기질인 Boc-Gln-Ala-Arg-AMC(t-butyloxycarbonylv(t-Boc)-Gln-Ala-Arg-7amido-4-methylcoumarin; B4153, Sigma, USA)와 칼리크레인 기질인 Z-Phe-Arg-AMC(Z-Phe-Arg7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride; C9521, Sigma, USA)를 각각 기질 완충용액(50 mM tris, 10 mM CaCl2, 1 μM ZnCl2)에 100 μM의 농도로 녹여서 TMPS4-FLAG 단백질과 섞은 다음 엔테로키나아제(0.09 ng)을 첨가하여 시간별로 Victor3 plate reader(PerkinElmer, USA)를 사용하여 380/460 ㎚에서 펩티드 기질의 가수분해에 의한 형광 신호를 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 엔테로키나아제에 의한 TMPRSS4의 활성형(TM-EK)의 트립신 유사 활성에 의한 기질의 가수분해가 대조군 대비 시간별로 활성을 나타남을 확인할 수 있었으며, 따라서 표적 항원으로서 TMPRSS4가 성공적으로 합성되었음을 확인하였다.
<실시예 3> 라이브러리 파아지의 제조
다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포 2.7 × 1010를 2×YT CM[Tryptone(CONDA, 1612.00) 17 g, Yeast extract(CONDA, 1702.00) 10 g, NaCl(sigma, S7653-5 ㎏) 5 g, chloramphenicol(sigma, C0857) 34 ㎍/㎖)], 2% glucose(sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2(sigma, M2393)을 포함하는 배지(3 L)에서 37℃에서 2~3시간 동안 배양한 후(OD600=0.5~0.7), 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 2×YTCMK[2×YT CM, Kanamycin(sigma, K1876) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(ELPISBIO, IPTG025)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG(Fluka, 81253) 6000과 3% NaCl(sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응하였다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10 분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 4℃에서 보관하였다.
<실시예 4> 다클론 항체의 제조
TMPS4-FLAG을 항원으로 에이비프런티어(한국)에 의뢰하여 두 마리 토끼에게서 3번 반복 주사하여 다클론 항체 혈청을 얻었고, 이를 다시 항원 특이적 친화도 정제를 수행하여 TMPS4-FLAG에 특이적으로 결합하는 다클론 항체 2 ㎎/㎖의 농도로 1 ㎖를 수득하였다. 상기 수득한 다클론 항체를 비-환성성 조건으로 10% SDS-PAGE로 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 정제된 항체를 확인하였다. 이후, 이를 양성 대조군으로 사용하였다.
<실시예 5> 단일 클론 항체의 제조
<5-1> 패닝 ( Panning ) 과정
실시예 2에서 수득한 정제된 TMPRSS4 항원(TMPS4-FLAG와 TM-EK) 각 30 ㎍을 Immunosorb 튜브(Nunc 470319)에 4 ㎖의 코팅 완충용액[coating buffer; Na2CO3(sigma, S7795) 1.59 g, NaHCO3(sigma, S8875) 2.93 g, NaN3(sigma, S2002), 0.2 g]으로 4℃에서 16시간 정도 회전기(rotator)로 코팅한 후, 실온에서 2시간 동안 PBS에 녹여 skim milk[(BD,232100)-4% in 1XPBS]를 사용하여 면역튜브(immunotube)에서 차단하였다. 면역튜브에 실시예 3에서 제조한 라이브러리 파아지 2 ㎖을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰고 PBST(0.05%)로 5회, PBS로 2회 세척하였다. 세척 후 특이적으로 결합한 scFv-파아지들만 100 mM TEA(Sigma T-0886)로 용리하여, 용출된 파아지들을 대장균(XL1-Blue, stratagene, 200249)에 감염시켜 증폭했다. 첫 번째 패닝에서 증폭된 파아지를 PBST 세척 횟수만 늘려서(2차: 13번, 3차: 23번) 동일한 방법으로 2차 및 3차 패닝을 수행하였다.
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이 3차에서 항원에 대한 파아지의 콜로니 역가가 100배 이상 증폭됨을 확인하였다.
표적 항원 패닝 횟수 초기 파아지수 결합한 파아지수
TMPRSS4-FLAG 1st 4 x 1013 4.6 x 106
2nd 7.7 x 1012 5 x 107
3rd 7.2 x 1012 1.9 x 109
TM-EK 1st 2.3 x 1013 5 x 106
2nd 1.2 x 1013 4.8 x 106
3rd 1.24 x 1013 2.96 x 108
<5-2> 파아지 ELISA 에 의한 파아지 항체 탐색
<5-2-1> 패닝 결과 확인
1차부터 3차까지 패닝하여 얼려두었던 세포 저장물(stock)을 5 ㎖의 2×YTCM, 2% Glucose, 5 mM MgCl2 배지에 OD600=0.1이 되게 넣어준 다음, 37℃에서 2~3시간(OD600=0.5~0.7) 배양하였다. 이후 M1 헬퍼 파아지를 감염시키고 2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 1 mM IPTG 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 세포를 원심분리한 후(4500 rpm, 15 분, 4℃) 상등액(1차~3차 패닝 poly scFv-파아지)을 새 튜브로 옮겼다. 96웰 면역 플레이트(NUNC 439454)에 두 종류의 항원을 웰 당 100 ng 씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, PBS에 녹인 skim milk(4 %)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰 마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 씻어준 다음 1차~3차 패닝 poly scFV-파아지를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 세척한 후 이차 항체인 항-M13-HRP(Amersham 27-9421-01)를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 세척한 후에 OPD tablet(Sigmap 8787-TAB)을 PC 완충용액[C6H8O7·H2O(sigma, C0706) 5.1 g, Na2HPO4(sigma, S7907) 7.3 g]에 녹인 기질 용액을 만들어 웰당 100 ㎕씩 넣어 10분 동안 발색시킨 다음 490 ㎚에서 흡광도를 Spectrophotometer(MolecularDevice, 미국)로 측정하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 3차에서 항원에 대한 특이적인 결합능이 증강(enrichment)됨을 확인하였다.
<5-2-2> 단일 클론 항체 선별
상기 결합능이 큰 다클론 파아지 항체군(3차 패닝)에서 얻은 콜로니를 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지 1 ㎖이 포함된 96-deep 웰 플레이트(바이오니아 90030)에서, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 OD600 값이 0.1이 되도록 100~200 ㎕를 취해 1㎖의 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지에 희석한 다음, 96-deep 웰 플레이트에서 37℃에서 OD600 값이 0.5~0.7 되도록 2~3시간 배양하였다. M1 헬퍼 파아지를 MOI값이 1:20이 되도록 감염시킨 후, 2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 1 mM IPTG 배지에 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15 분, 4℃)한 후, 상등액을 취해 4% PEG 6000과 3% NaCl을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃) 한 후 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10분, 4℃)하여 상등액을 취해 새 튜브에 옮겨 3차 패닝하여 얻은 단일 클론 scFv-phage를 4℃에서 보관하였다.
이후, 96웰 면역 플레이트에 두 가지 항원을 웰당 100 ng씩을 넣어 4℃에서 16시간 동안 코팅한 후 PBS에 녹인 skim milk(4%)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 세척한 다음 3차 패닝하여 얻은 단일클론 scFv-파아지(each 100 scFv-phage)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 씻어준 후 2차 항체인 anti-M13-HRP를 1/2000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖로 세척한 후에 발색하여 흡광도 490 ㎚에서 측정하였다.
그 결과, 각 항원에 대한 결합능이 강한 단일 파아지 클론들은 TMPS4-FLAG에 대해 15개(표 2)와 TMPS4-EK에 대해 35개(표 3)등 총 50개의 단일 파아지 클론을 선별하였다.
Figure 112008072026896-PAT00001
Figure 112008072026896-PAT00002
<5-3> 단일 클론 파아지 분류 및 검사
<5-3-1> 핑거 프린팅에 의한 검증
1차 선별된 단일 클론 50개 단일 클론 세포 1 ㎕와 Taq.DNA polymerase(젠닥스 5U/㎕) 0.2 ㎕, 50 p/㎕의 정방향 프라이머(pelB5, 서열번호 5:5'-CTAGATAACGAGGGCAAATCATG-3') 및 역방향 프라이머(cla3, 서열번호 6:5'-CGTCACCAATGAAACCATC-3') 0.2 ㎕, 10X 완충용액 3 ㎕, 10 mM dNTP mix 0.6 ㎕, 증류수 24.8 ㎕를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. PCR 프로그램의 조건은 하기 표 4와 같다.
온도 시간 사이클(cycle)
95℃ 5 min
95℃ 30 sec 30 사이클
56℃ 30 sec
72℃ 1 min
72℃ 10min
4℃
상기 콜로니 PCR 산물은 1% 아가로스 겔(Seakem LE, CAMERES 50004)에서 확인하였고, BstNI(Roche11288075001, 10 U/㎕) 0.2 ㎕를 취해 37℃에서 2~3시간 반응하였다. 반응 조건은 하기 표 5와 같다. 상기 절단된 산물을 8% DNA 폴리아크릴 아마이드 겔에서 확인하였다.
10X Buffer 3 ㎕
콜로니 PCR 산물 10 ㎕
BstNI(10U/㎕) 0.2 ㎕
증류수 16.8 ㎕
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 BstNI에 의해 잘려진 단일 클론 파아지 항체들의 단편들에 대해 다양성이 확인되었다.
<5-3-2> 염기서열 분석에 의한 검증
상기 50 종의 단일 파아지 클론을 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지(5 ㎖)에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 클론으로부터 DNA 정제 키트(Nuclogen 5112)를 이용하여 DNA를 수득한 후, 서열번호 5의 pelB5 프라이머를 이용한 서열 분석을 의뢰하였다(솔젠트, 한국).
그 결과, 표 6 및 도 8에서 나타난 바와 같이 선별된 항체의 VH와 VL의 CDR 영역을 확인하였다.
이들 항체와 생식세포 계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 조사한 결과 13종의 TMPRSS4에 특이적인 파아지 항체를 얻었고 이는 하기 표 7에서 정리하여 제시하였다.
Heavy Chain Light Chain
그룹 클론명 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
2 T1-11G RYTMH : 서열번호 7 VISSDGSKKYYGDSVKG: 서열번호 19 GGGKGHWLDT : 서열번호 32 RASQSISKWLA : 서열번호 58 AASNLQS : 서열번호 71 LQSNSLPIT: 서열번호 84
3 T1-12C NYGMH : 서열번호 8 VISYDGSTKYYADSVRG: 서열번호 20 GSDVAY : 서열번호 33 RSSQSLVYSDGNTYLN : 서열번호 59 KVSNRDS : 서열번호 72 MQSLRTPLT: 서열번호 85
3 T2-9G NYGMH : 서열번호 8 VISYDGSTKYYADSVRG: 서열번호 20 GSDVAY : 서열번호 33 RSSQSLVYSDGNTYLN : 서열번호 59 KVSNRDS : 서열번호 72 MQSLRTPLT: 서열번호 85
4 T1-9F SYAMS : 서열번호 9 AITGSGGSTFYADSVKG: 서열번호 21 GGNLDV : 서열번호 34 RSSQSLVHSNGNTYLT : 서열번호 60 KISKRFS : 서열번호 77 MQLTQFPLT: 서열번호 86
4 T2-12F SYAMS : 서열번호 9 AITGSGGSTFYADSVKG: 서열번호 21 GGNLDV : 서열번호 34 RSSQSLVHSNGNTYLT : 서열번호 60 KISKRFS : 서열번호 77 MQLTQFPLT : 서열번호 86
9 T2-8F NYAMN : 서열번호 10 AISGSGGSTYYADSVKG: 서열번호 22 LRGAFDI: 서열번호 35 RSSQSLLHSNGYNYLD : 서열번호 64 LGSKRAA : 서열번호 74 MQALQTPT : 서열번호 87
12 T2-12C RYGIH : 서열번호 11 VISYDGNIKYYADSVKG: 서열번호 23 LWRQSAADAFDI : 서열번호 36 TGTSSDVGGSSYVS : 서열번호 62 DVTRRPS : 서열번호 75 ASYAGSHYL: 서열번호 88
5 T2-3A SYAMH : 서열번호 12 SISWSSNNIRYADSVKG: 서열번호 24 RAAAKAFDI : 서열번호 37 TGTSTDIGGYNYVS : 서열번호 63 DVNNRPS : 서열번호 76 SSYTSSSFV : 서열번호 89
8 T2-7B DSVAWN: 서열번호 13 RTYYKSKWYNDYAVSVRS: 서열번호 25 GGGKGMDV : 서열번호 38 TGTSGDIGGFNYVS : 서열번호 64 DVSRRPS : 서열번호 77 ASYAGTKFWL: 서열번호 90
7 T2-6G NYGMH : 서열번호 8 VISYDGSKKYYADSVKG: 서열번호 26 GTTMDV : 서열번호 39 SGSNSNIGSNTVN : 서열번호 65 GHNQRPS : 서열번호 78 ASWDDTVSGPKWV: 서열번호 91
10 T2-10E DYAMH : 서열번호 14 GISWNSGSIGYADSVKG: 서열번호 27 GLRGLRYRNYYYGMDV : 서열번호 40 QASQDITNYLN : 서열번호 66 AASSLHT : 서열번호 79 QQSHSPPFT : 서열번호 92
11 T2-6C DYAIH : 서열번호 15 GISWNSEIVGYGDSVKG: 서열번호 28 GSSGRAFDI : 서열번호 41 RASQSISTYLN : 서열번호 67 GATSLQS : 서열번호 80 QQSYNLPRT : 서열번호 93
1 T1-5G DHYMS : 서열번호 16 YISNRGYSIYYADSVKD: 서열번호 29 DLRSSDAHTWGGVDAFDI : 서열번호 42 RASQSISSWLA : 서열번호 68 KASSLES : 서열번호 81 QQFNNNLFS : 서열번호 94
6 T2-6A SYDVH : 서열번호 17 WVNPNSGNADYAQKFQG: 서열번호 30 GRFGAFDV : 서열번호 43 RASQGISRWLA : 서열번호 69 AASNLQS : 서열번호 82 QQANSFPLT: 서열번호 95
13 T2-12A NYAMS: 서열번호 18 AISGSGASTNYAD SVKG : 서열번호 31 LGREQYLAR GYFEH : 서열번호 44 QGDSLRSYYAS : 서열번호 70 GKNNRPS : 서열번호 83 SSRDSSGNH LV : 서열번호 96
Figure 112008072026896-PAT00003
<실시예 6> TMPRSS4에 대한 인간항체의 특성 분석
<6-1> 파아지 웨스턴 블랏 분석
상기 항원 TMPRSS4-FLAG이 각 웰에 0.1 내지 200 ng씩 로딩된 10% SDS-PAGE 젤 2장을 100 V로 2시간 정도 전기영동한 후, NC 막(millipore Cat. No. HATF00010)에 85 V로 2시간 동안 전달하였다. 이후, 막을 4% skim milk in TBST로 4℃에서 밤새도록 차단하였다. 이후, 실시예 4에서 제조한 다클론 α-TMPRSS4 항체(1 ㎎/㎖)를 4% skim milk in TBST에 1:2000으로 희석하였고, 실시예 5에서 선별된 단일 클론 파아지 항체의 상등액을 4% skim milk in TBST에 1:50으로 희석하여 상온에서 1 시간 30분 동안 반응하였다. TBST로 10분에 한 번씩 5번 세척한 후, 각각 항-마우스 IgG-HRP(Sigma)와 항-M13-HRP(Amersham bioscience)를 사용하여 4% skim milk in TBST에 1:3000으로 희석하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, 같은 방법으로 세척하였다. 세척 후, 현상(Intron, Cat. No. 12145)하여 다클론 항체와 단일 파아지 항체가 검출할 수 있는 항원 단백질의 양을 비교하였다.
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 TE-6C 파아지 항체의 경우, 다클론 항체에 비해 신호의 세기는 작았지만, 비특이적 결합없이 깨끗하게 약 30 KDa의 항원 단백질을 검출할 수 있었다.
<6-2> 파아지 FACS 분석
100 ㎜ 플레이트에서 TMPRSS4를 과다 발현한다고 알려진 대장암 세포주(colo205; ATCC) 세포주를 PBS로 2번 세척한 후, 무효소 PBS 기반-해리 완충용액(Gibco)을 첨가해서 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 이후, 세포를 스크래퍼로 모은 후, 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리해서 펠렛을 2% PBF(2% FBS가 든 1XPBS)용액으로 두 번 세척한 후, 2% PBF 용액을 넣어 재현탁하여 ≥5×105 세포의 농도로 준비하였다. 본 발명의 단일 클론 파아지 항체 100 ㎕를 PEG로 10배 농축한 다음 1/2로 희석하여 상기 세포에 섞어주었다. 얼음에서 1시간 동안 반응한 후, 1300 rpm으로 4℃에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 200 ㎕의 2% PBF 용액으로 3번 세척한 후, 2% PBF 용액에 1:200으로 희석시킨 항-g8p 항체(Abcam) 100 ㎕를 넣어 잘 섞어주고, 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 1300 rpm으로 4℃에서 3분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 200 ㎕의 2% PBF 용액으로 3번 세척하였다. 2% PBF 용액에 1:1000으로 희석시킨 FITC-연결된 항-마우스 IgG 100 ㎕를 각각의 시료에 섞어준 후, 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 추가로 세척한 다음, 500 ㎕의 2% PBF 용액을 첨가하여 FACS 용 튜브(Falcon)에 시료를 옮겨서 볼텍싱 한 후, 염색된 세포들을 유세포분석기(Beckman Coulter)로 분석하였다. 매번 실험시 단일 파아지항체를 동일한 조건으로 시료에 처리하여 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다. 데이터는 WINMDI2.9 software(//facs.scripps.edu/software.html, The Scripps Research Institute)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 TMPRSS4가 과다 발현된 대장암 세포주에서 TMPRSS4를 특이적으로 인식하고 결합하는 단일클론 파아지 항체 T2-6G, T2-12A ALC T1-9F 등을 선별하였다. 이외에도, T2-6C, T2-3A, T2-8F 등도 선별하였으나, 결과는 본 명세서에 따로 기재하지 않았을 뿐이다.
<6-3> 전체 IgG 변환 분석
TMPRSS4에 대한 단일 클론 파아지 항체들을 파아지에서 IgG 전체 벡터로 전환하기 위해 중쇄는 단일 클론 DNA 1 ㎕와 10 pmole/㎕ 표 8의 중쇄 정방향 프라이머와 중쇄 역방향 프라이머, 10X buffer 5 ㎕,10 mM dNTP mix 1 ㎕, pfu DNA 중합효소(솔젠트, 2.5 U/㎕) 0.5 ㎕,증류수를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. 또한, 경쇄는 표 8의 경쇄 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 동일한 방법으로 콜로니 PCR을 수행하였다.
클론명 Heavy Chain Light Chain
Forward primer (Sfi I) Reverse primer (Nhe I) Forward primer (Sfi I) Reverse primer (Bgl II)
T2- 3A NATVH1-2: 서열번호 110 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGATGCAGCTGGTGCAGTC NATJH-ALL : 서열번호 114 GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA NATVL4 : 서열번호 115 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCC NATJL1-R : 서열번호 119 GAGGAGAGATCTTAGGACGGTGACCTTGGTCCC
T2- 6C NATVH1-2: 서열번호 111 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGATGCAGCTGGTGCAGTC NATVK1-1 : 서열번호 116 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTC NATJK-R5 : 서열번호 120 GAGGAGAGATCTTTTGATTTCCAGCTTGGT
T2- 6G NATVH3-2: 서열번호 112 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC NATVL4 : 서열번호 117 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCC NATJL2-R : 서열번호 121 GAGGAGAGATCTTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC
T2- 8F NATVH3-2: 서열번호 113 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC NATVK3 : 서열번호 118 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGATATTGTGATGACCCAGACTCC NATJK-R4 : 서열번호 4 GAGGAGAGATCTTTTGATTTCCACCTTGGT
PCR 결과 수득한 중쇄 유전자를 DNA-겔 추출 키트(Qiagen)로 정제한 후, pNATAB H 벡터(도 11a) 1 ㎕(10 ng), 중쇄(100~200 ng) 15 ㎕, 10 X Buffer 2 ㎕, Ligase (1 U/㎕) 1 ㎕, 증류수를 혼합하여 실온에서 1~2시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다. 상기 벡터를 형질전환용 세포(XL1-blue)와 함께 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃에서 90초간 열충격을 주어 형질도입하였다. 다시 얼음에 5분간 방치한 후, LB 배지 1 ㎖을 주입하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. LB Amp(ampicillin) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 LB Amp 액체배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-prep. 키트(Nuclogen)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
또한, 경쇄는 pNATAB L 벡터(도 11b)를 사용하여 상기와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다.
상기 수득한 DNA의 CMV-proF 프라이머(서열번호 3: AAA TGG GCG GTA GGC GTG)를 이용한 염기서열 분석을 의뢰하였다(솔젠트).
그 결과, 전체 IgG로 전환한 TMPRSS4에 대한 4개의 클론 파아지의 중쇄와 경쇄의 서열이 파아지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.
<6-4> 전체 IgG의 검증
293E 세포(Invitrogen)에 PEI(Cat# 23966, Polysciences, Inc) 40 ㎍과 전체 형태(Whole form) 항체 중쇄 DNA 10 ㎍, 경쇄 DNA 10 ㎍을 넣어 공동-형질감염을 하여 얻은 상등액을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 대조군으로는 정상 인간 IgG(Jackson Lab)을 이용하였다.
그 결과, 도 12에서 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 4개의 클론 파아지가 전체 IgG 형태로 전환되었음을 확인하였다.
상기 4개의 클론 파아지 중 T2-6C와 T2-6G 전체 형태 IgG를 단백질 A-친화도 크로마토그래피 컬럼(Pharmacia, GE, USA)을 이용하여 정제한 후(도 13), 실시예 6-2의 방법으로 TMPRSS4에 대한 결합력을 FACS로 확인하였다(도 14).
<실시예 7> TMPRSS4 인간항체가 대장암 세포주의 침윤 및 이동에 미치는 영향 연구
<7-1> Colo205 세포 침윤(invasion) 분석
트립신(trypsin)(Gibco 25300)으로 Colo205 세포를 채취한 다음, RPMI 침윤 배양액(invasion media)(RPMI, 10 mM HEPES, 0.5% BSA)으로 두 번 세척한 후, 침윤 배양액에 세포를 2 × 106/㎖의 농도로 현탁하여 준비하였다. 정제된 TMPRSS4 다클론 항체 및 단일클론 T2-6C 항체를 침윤 배양액에 각각 30 및 75 ng/50 ㎖로 희석하여 세포 현탁액 50 ㎕와 TMPRSS4 항체 용액 50 ㎕를 혼합한 후, 37℃에서 두 시간 전배양(pre-incubation)하였다. 24-웰 트랜스웰 플레이트(well transwell plate)(8 ㎛ pore size, costar 3422)는 매트리겔(matrigel)(BD 354234)을 1 ㎎/㎖로 무혈청 배지(serum-free media)(RPMI, 10 mM HEPES)에 희석하여 인서트(insert)의 위쪽 면에 실온에서 한 시간 동안 코팅하였다. 한 시간이 지난 후, 인서트에 남아있는 매트리겔을 제거하고 무혈청 배지로 한번 세척하였다. 그런 다음, 5% FBS가 첨가된 RPMI 침윤 배양액 600 ㎕를 챔버(chamber)에 넣었다. 소독된 포셉(forceps)을 사용하여 인서트를 배양액이 들어있는 챔버에 넣은 다음, 미리 반응시켜둔 세포와 항체의 혼합물을 인서트 안에 100 ㎕ 넣고 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 매트리겔을 통과한 침윤된 세포를 측정하기 위해 인서트의 위쪽 면을 PBS에 적신 면봉으로 닦아내고 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 500 ㎕(Sigma HT50)가 들어있는 챔버에 인서트를 넣어서 실온에서 30분간 고정하였다. 그런 다음, 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)(Sigma C3886)/100 mM NaBorate(Sigma S9640) 500 ㎕에 30분간 염색하고 물로 세척한 후에 건조시켜서 현미경으로 x100 배율에서 세포를 카운팅(counting)하였다.
그 결과, 도 15 및 도 16에서 나타낸 바와 같이 대장암 세포주인 Colo205에서 정제된 다클론 및 TMPRSS4 단일클론 항체는 대조군으로 사용된 래빗(도 15) 및 인간 정상 IGg(도 16)에 비해 50% 이상 뚜렷한 침윤의 저해를 나타내었다.
<7-2> Colo205 세포 이동(migration) 분석
TMPRSS4를 과발현하는 것으로 알려진 Colo205 세포주 및 TMPRSS4를 저발현하는 것으로 알려진 Sw480(ATCC, CCL-228) 세포주를 트립신으로 채취한 다음, RPMI 이동 배양액(migration media)(RPMI, 10 mM HEPES, 0.5% BSA)으로 두 번 세척한 후에 8 × 105/㎖의 농도로 현탁하여 준비하였다. 세포 현탁액 50 ㎕와 세 가지 농도(0, 1 및 2 μM)로 희석해둔 다클론 TMPS4 항체 용액, 및 단일클론 T2-6C 및 T2-6G 항체 50 ㎕(TMPRSS4 항체를 이동 배양액에 희석하여 1000 ng/50 ㎕로 제조)를 각각 섞고 37℃에서 두 시간 동안 전배양하였다. 24-웰 트랜스웰 플레이트는 삽입 아래쪽 면에 0.05% 젤라틴(gelatin)(Sigma G1393)을 사용하여 실온에서 한 시간 동안 코팅하였다. 한 시간이 지난 후, 인서트에 남아있는 젤라틴을 제거하고 PBS로 한번 세척하였다. 상기 과정이 끝난 후 5% FBS가 첨가된 RPMI 이동 배양액 600 ㎕를 챔버에 넣었다. 소독된 포셉을 사용하여 인서트를 챔버에 넣은 다음, 미리 반응시켜둔 세포와 항체의 혼합물을 인서트 안에 100 ㎕를 넣고 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 세포의 이동을 측정하기 위해 먼저 인서트의 위쪽 면을 PBS에 적신 면봉으로 닦아내고 3.7% 파라포름알데하이드 500 ㎕가 들어있는 챔버에 인서트를 넣어서 실온에서 30분간 고정하였다. 그런 다음, 1% 크리스탈 바이올렛/100 mM NaBorate 500 ㎕에 30분간 염색하고 물로 세척한 후에 건조시켜서 현미경으로 x100 배율에서 세포를 카운팅하였다.
그 결과, 도 17에서 보는 바와 같이 두 대장암 세포주의 이동에 뚜렷한 차이를 보였으며, 표적 항원인 TMPRSS4에 의해 야기된 이동을 TMPRSS4 특이적인 다클론 항체로 저해한 것을 확인하였다. TMPRSS4에 대한 다클론 항체 뿐 아니라 정제된 단일클론 T2-6C(도 18) 및 T2-6G(도 19) 항체도 TMPRSS4가 과발현된 대장암 세포주인 colo205에서 대조군으로 사용된 인간 정상 IgG에 비교하여 둘다 각각 약 50% 이상의 뚜렷한 이동의 저해를 나타내었다.
<7-3> Colo205 증식(proliferation) 분석
트립신으로 Colo205 세포를 채취한 다음, 2% FBS가 첨가된 RPMI 배양액으로 두 번 세척한 후에 무혈청 배양액(RPMI, 10mM HEPES)에 세포를 2 × 105/㎖로 현탁하여 준비하였다. 정제된 TMPRSS4 항체를 무혈청 배양액에 250, 500 및 1000 ng/40 ㎕로 희석하여 세포 현탁액 50 ㎕와 TMPRSS4 T2-6C 항체 용액 40 ㎕를 섞고 37℃에서 두 시간 동안 전배양하였다. 반응을 마친 세포와 항체의 혼합물 90 ㎕에 10 ㎕의 FBS를 첨가하여 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 37℃/5% CO2에서 24, 48 및 72시간 배양하였다. 각각의 시간점(time point)에 맞춰서 PreMix WST-1 세포 증식용액(cell proliferation solution)(takara, MK400)을 10 ㎕ 첨가하여 두 시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, VERSA max 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)에서 440 ㎚로 샘플의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 정제된 TMPRSS4 T2-6C 항체가 Colo205 세포 증식의 현저한 저해를 유발한 것을 확인하였다(데이타는 기재하지 않았음).
<실시예 8> 결합능 측정
TMPRSS4에 대한 항체들의 항원에 대한 결합력을 ELISA로 측정하여, GraphPad PRISM 4.0 프로그램으로 분석해 본 결과, 결합상수 K D값이 약 1.03 × 10-9 M로 확인되었다.
도 1은 TMPRSS4-FLAG 발현 벡터의 개열지도이다.
도 2는 정제된 2XFLAG-TMPRSS4를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 FLAG가 제거되어 정제된 TM-EK를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: TM-EK 제조 모식도; 및,
b: 정제된 TM-EK를 SDS-PAGE로 확인한 결과.
도 4는 TMPRSS4의 단백질 분해 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 정제된 항-TMPS4-FLAG 다클론 항체를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 패닝 1 내지 3차에서의 파아지 항체 탐색 결과를 나타낸 도이다:
a: TMPS4-EK; 및,
b: TMPS4-FLAG.
도 7은 TMPRSS4에 대한 단일 파아지 클론 항체 다양성을 핑거프린팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 TMPRSS4에 대한 단일 파아지 클론 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR에서 사용되고 있는 폴리펩티드를 분석한 결과를 나타낸 도이다:
a: 중쇄; 및,
b: 경쇄.
도 9는 TMPRSS4 다클론 항체와 단일클론 항체의 결합 특이성을 비교한 결과를 나타낸 도이다:
a: 다클론 항체; 및,
b: 단일클론 항체.
도 10은 TMPRSS4 다클론 항체와 단일클론 항체가 대장암 세포주에 특이적으로 결합하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: 다클론 항체;
b: 단일클론 항체 T2-6G;
c: 단일클론 항체 T2-12A; 및,
d: 단일클론 항체 T1-9F.
도 11은 pNATAB H 벡터 및 pNATAB L 벡터의 개열지도를 나타낸 도이다:
a: pNATAB H 벡터; 및,
b: pNATAB L 벡터.
도 12는 전체 형태 IgG를 발현 및 정제하여 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: 단일클론 항체 T2-6C; 및,
b: 단일클론 항체 T2-6G, T2-3A 및 T2-8F.
도 13은 정제된 단일클론 항체 T2-6C 및 T2-6G를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 TMPRSS4 다클론 항체와 정제된 단일클론 항체 T2-6C 및 T2-6G가 대장암 세포주에 특이적으로 결합하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: 다클론 항체;
b: 단일클론 항체 T2-6C; 및,
c: 단일클론 항체 T2-6G.
도 15는 TMPRSS4 다클론 항체가 대장암 세포주 colo205의 침윤을 저해하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 단일클론 항체 T2-6C가 대장암 세포주 Colo205의 침윤을 저해하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 TMPRSS4 과발현 세포주 Colo205 및 저발현 세포주 Sw480의 이동에 TMPRSS4 다클론 항체가 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 단일클론 항체 T2-6C가 TMPRSS4 과발현 세포주 Colo205의 이동을 저해하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 단일클론 항체 T2-6G가 TMPRSS4 과발현 세포주 Colo205의 이동을 저해하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> TMPRSS4 specific human antibody <130> 8P-09-60 <160> 121 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMPRSS4 forward primer <400> 1 gaggagcata tggattataa agatcatgat attgattata aagatgatga tgataaagtg 60 gtgggtgggg aggag 75 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMPRSS4 reverse primer <400> 2 gaggagctcg agcagctcag ccttccagac 30 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-proF primer <400> 3 aaatgggcgg taggcgtg 18 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R4 <400> 4 gaggagagat cttttgattt ccaccttggt 30 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB5 <400> 5 ctagataacg agggcaaatc atg 23 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cla3 <400> 6 cgtcaccaat gaaaccatc 19 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-11G VH CDR 1 <400> 7 Arg Tyr Thr Met His 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-12C VH CDR 1 <400> 8 Asn Tyr Gly Met His 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-9F VH CDR 1 <400> 9 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-8F VH CDR 1 <400> 10 Asn Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-12C VH CDR 1 <400> 11 Arg Tyr Gly Ile His 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-3A VH CDR 1 <400> 12 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-7B VH CDR 1 <400> 13 Asp Ser Val Ala Trp Asn 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-10E VH CDR 1 <400> 14 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-6C VH CDR 1 <400> 15 Asp Tyr Ala Ile His 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-5G VH CDR 1 <400> 16 Asp His Tyr Met Ser 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-6A VH CDR 1 <400> 17 Ser Tyr Asp Val His 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-12A VH CDR 1 <400> 18 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-11G VH CDR 2 <400> 19 Val Ile Ser Ser Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-12C VH CDR 2 <400> 20 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-9F VH CDR 2 <400> 21 Ala Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-8F VH CDR 2 <400> 22 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-12C VH CDR 2 <400> 23 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-3A VH CDR 2 <400> 24 Ser Ile Ser Trp Ser Ser Asn Asn Ile Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-7B VH CDR 2 <400> 25 Arg Thr Tyr Tyr Lys Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Arg Ser <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-6G VH CDR 2 <400> 26 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-10E VH CDR 2 <400> 27 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-6C VH CDR 2 <400> 28 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Glu Ile Val Gly Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-5G VH CDR 2 <400> 29 Tyr Ile Ser Asn Arg Gly Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Asp <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-6A VH CDR 2 <400> 30 Trp Val Asn Pro Asn Ser Gly Asn Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-12A VH CDR 2 <400> 31 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ala Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-11G VH CDR 3 <400> 32 Gly Gly Gly Lys Gly His Trp Leu Asp Thr 1 5 10 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-12C VH CDR 3 <400> 33 Gly Ser Asp Val Ala Tyr 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-9F VH CDR 3 <400> 34 Gly Gly Asn Leu Asp Val 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-8F VH CDR 3 <400> 35 Leu Arg Gly Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial 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Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 20 25 30 Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala 85 90 95 Asn Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115 120 125 Glu Asp Leu 130 <210> 99 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1-12C light chain <400> 99 Ser Gly Val Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe His Gln 35 40 45 Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 50 55 60 Asp Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Met Gln Ser Leu Arg Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 105 110 Lys Val Asp Ile Lys Arg Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln 115 120 125 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 135 <210> 100 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1- 9F light chain <400> 100 Ser Gly Val Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser 1 5 10 15 Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Gln Gln 35 40 45 Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Lys Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Met Gln Leu Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 105 110 Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln 115 120 125 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 135 <210> 101 <211> 136 <212> PRT 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Leu Gln 35 40 45 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Lys Arg 50 55 60 Ala Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 100 105 110 Val Asp Ile Lys Arg Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys 115 120 125 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 135 <210> 103 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-12A light chain <400> 103 Ser Gly Val Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser 1 5 10 15 Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu 20 25 30 Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr 65 70 75 80 Gly Thr Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp 85 90 95 Ser Ser Gly Asn His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 110 Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser 115 120 125 Glu Glu Asp Leu 130 <210> 104 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-12C light chain <400> 104 Ser Gly Val Gly Ser Gln Phe Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser 20 25 30 Asp Val Gly Gly Ser Ser Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Thr Arg Arg Pro Ser Gly 50 55 60 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu 65 70 75 80 Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Tyr Ala Gly Ser His Tyr Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile 115 120 125 Ser Glu Glu Asp Leu 130 <210> 105 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2- 3A light chain <400> 105 Ser Gly Val Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr 20 25 30 Asp Ile Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Ser Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly 50 55 60 Val Ser His Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu 65 70 75 80 Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile 115 120 125 Ser Glu Glu Asp Leu 130 <210> 106 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2- 7B light chain <400> 106 Ser Gly Val Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Gly 20 25 30 Asp Ile Gly Gly Phe Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly 35 40 45 Arg Ala Pro Lys Ile Ile Ile Tyr Asp Val Ser Arg Arg Pro Ser Gly 50 55 60 Val Pro Asn Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu 65 70 75 80 Thr Val Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Ser Tyr Ala Gly Thr Lys Phe Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 105 110 Thr Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu 115 120 125 Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 <210> 107 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2- 6G light chain <400> 107 Ser Gly Val Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser 1 5 10 15 Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser 20 25 30 Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Gln Leu Leu Ile Phe Gly His Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ser 65 70 75 80 Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Ala Ser 85 90 95 Trp Asp Asp Thr Val Ser Gly Pro Lys Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr 100 105 110 Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln 115 120 125 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 135 <210> 108 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2-10E light chain <400> 108 Ser Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln 20 25 30 Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Thr Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Thr Asn Met Leu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 85 90 95 His Ser Pro Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115 120 125 Glu Asp Leu 130 <210> 109 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2- 6C light chain <400> 109 Ser Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val 1 5 10 15 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 20 25 30 Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Arg Gly Leu Gln Pro Asp Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 85 90 95 Tyr Asn Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115 120 125 Glu Asp Leu 130 <210> 110 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH1-2 <400> 110 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagatgcagc tggtgcagtc 50 <210> 111 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH1-2 <400> 111 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagatgcagc tggtgcagtc 50 <210> 112 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH3-2 <400> 112 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tggtggagtc 50 <210> 113 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH3-2 <400> 113 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tggtggagtc 50 <210> 114 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJH-ALL <400> 114 gaggaggcta gctgaggaga cggtga 26 <210> 115 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVL4 <400> 115 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagtctgccc tgactcagcc 50 <210> 116 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVK1-1 <400> 116 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg gacatccaga tgacccagtc 50 <210> 117 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVL4 <400> 117 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagtctgccc tgactcagcc 50 <210> 118 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVK3 <400> 118 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg gatattgtga tgacccagac tcc 53 <210> 119 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJL1-R <400> 119 gaggagagat cttaggacgg tgaccttggt ccc 33 <210> 120 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R5 <400> 120 gaggagagat cttttgattt ccagcttggt 30 <210> 121 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJL2-R <400> 121 gaggagagat cttaggacgg tcagcttggt ccc 33

Claims (32)

  1. 서열번호 7 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역(이하, HCDR) 1, 서열번호 19 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 2 및 서열번호 32 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄 또는 그의 단편; 및,
    서열번호 58 내지 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR) 1, 서열번호 71 내지 83로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 2 및 서열번호 84 내지 96로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 45 내지 57으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 97 내지 109로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
  4. 제 1항의 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 1항의 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  7. 제 5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  8. 제 6항의 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체.
  9. 제 7항의 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체.
  10. 제 6항 및 제 7항의 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체.
  11. 1) 제 10항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    2) 상기 배양액으로부터 제 1항의 인간 항체를 정제하는 단계를 포함하는 TMPRSS4에 특이적인 인간 항체의 제조방법.
  12. 제 1항의 인간 항체를 포함하는, TMPRSS4가 과발현되는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양(malignant thyroid neoplasms)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 화학적 요법과 병행하여 투여하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제 1항의 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 방사선면역 치료용 약학적 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, [암의 종류 기재]으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제 15항 또는 제 17항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 인간 항체와 결합되거나 인간 항체가 결합된 운반체에 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 약학적으로 유효한 양의 제 1항의 인간 항체를 TMPRSS4가 과발현되는 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 치료방법.
  20. 제 19항에 있어서, TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 치료방법.
  21. 제 1항의 인간 항체, 상기 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 검출용 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 단편은 치료용 방사선 동위원소, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 또는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출가능한 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나 연결된 것을 특징으로 하는 암의 검출용 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징으로 하는 암의 검출용 조성물.
  25. 제 21항의 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 TMPRSS4가 과발현되는 암의 면역검출 방법.
  26. 제 25항에 있어서, TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역검출 방법.
  27. 1) 제 21항의 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,
    2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 TMPRSS4가 과발현되는 암의 영상화 방법.
  28. 제 27항에 있어서, TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 영상화 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 검출영상은 근적외광 이미징, PET, MRI 또는 초음파 이미징에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 영상화 방법.
  30. 1) 제 21항의 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
    3) 상기 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 TMPRSS4가 과발현되는 암의 생체내 치료 방법.
  31. 제 30항에 있어서, TMPRSS4가 과발현되는 암은 대장암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암 및 악성 갑상선 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 생체내 치료 방법.
  32. 1) 제 21항의 검출용 조성물을 대장암 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
    3) 단계 2)에서 종양세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 암 치료 환자의 예후 평가 방법.
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